CN114450418A - 细胞的分化状态的评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是有关于一种对自诱导性多能干细胞(iPS细胞)向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中的、细胞的分化状态进行评价的方法。进而，本发明是有关于一种对自胚胎干细胞(ES细胞)向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中的、细胞的分化状态进行评价的方法。

Description

细胞的分化状态的评价方法
技术领域
本发明是有关于一种对自人诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stemcells，iPS细胞)向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中的、细胞的分化状态进行评价的方法。进而，本发明是有关于一种对自人胚胎干细胞(Embryonic Stem cells，ES细胞)向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中的、细胞的分化状态进行评价的方法。
现有技术
高龄黄斑变性症为位于视网膜中心的黄斑部的功能降低的疾病，是发达国家中导致老年人失明的主要疾病之一。高龄黄斑变性有渗出型及萎缩型。视网膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium，RPE)细胞形成存在于有黄斑的视网膜的外侧的片状单层细胞层，对于维持视网膜的视细胞而言重要。于RPE细胞层的更外侧，存在富含血管的脉络膜。为了获得正常的视力，需要位于视网膜的外侧的RPE细胞及脉络膜正常地发挥功能。渗出型高龄黄斑变性为如下疾病：因高龄所致的RPE细胞的功能降低或损伤等，来自脉络膜的异常的新生血管贯穿视网膜色素上皮并形成于视网膜下，且因视网膜下的出血或血液成分的漏出等，视细胞的功能受到阻碍。萎缩型高龄黄斑变性为如下疾病：因老化而RPE细胞产生炎症，RPE细胞以及位于其上部的视细胞丢失，视力受到阻碍。
作为渗出型高龄黄斑变性的治疗，以抑制新生血管为目的，进行抗血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)抗体等VEGF抑制剂的眼内注射。但是，抗VEGF抗体的治疗效果的持续时间短，因此复发的病例多。对于萎缩型高龄黄斑变性，尚未获得有效的治疗方法。关于渗出型及萎缩型高龄黄斑变性的任一者，认为均是因RPE细胞的功能降低或损伤而引起的，因此尝试有如下治疗：自作为多能干细胞的ES细胞或iPS细胞分化诱导RPE细胞，并于去除新生血管后移植到视网膜。为此，开发有如下方法：自ES细胞或iPS细胞分化诱导为RPE细胞的方法、以及自进行了分化的RPE细胞制作片状视网膜色素上皮的方法(专利文献1、非专利文献1及非专利文献2)。
于对源自人iPS细胞的RPE细胞进行移植的临床研究中，并未充分弄清怎样的RPE细胞显示出高的移植效果。另一方面，RPE细胞的色素(黑色素(melanin))量与细胞的成熟度密切相关，因此，提出有通过色素沉着的观察或色素量的测定来筛选出适于移植的RPE细胞的方法(非专利文献3)。但是，于进行自iPS细胞向RPE细胞的分化且RPE细胞成熟后方可进行色素量的测定，因此，于色素进行沉着之前的阶段中，难以筛选出适于移植的可能性高的RPE细胞。自多能干细胞向RPE细胞进行分化诱导时，通常需要数十天的长期间的培养(非专利文献4及非专利文献5)。因此，就准备RPE细胞的移植的方面而言，重要的是于培养过程中预测是否可获得进行了分化的RPE细胞。非专利文献5中，报告有OTX1及OTX2作为存在自ES细胞向RPE细胞进行分化的可能性的前驱细胞的标记。但是，为了测定OTX1或OTX2表达量，需要对细胞进行破碎或溶解这一对于细胞的侵袭性处理，无法将预定移植的细胞设为评价对象。
现有技术文献
专利文献
[专利文献1]WO2014/030749
非专利文献
[非专利文献1]平见Y、小坂田F、高桥K等人，“自小鼠与人诱导性多能干细胞向视网膜细胞的产生”，“神经科学快报”(2009；458:126-131)(Hirami Y,Osakada F,TakahashiK,et al.Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotentstem cells.Neurosci Lett.2009；458:126-131.)
[非专利文献2]镰尾H、万代M、冈本S等人，“旨在临床应用的由人诱导性多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞片的表征”，“干细胞报告”(2014；2:205-218)(Kamao H,Mandai M,Okamoto S,et al.Characterization of human induced pluripotent stemcell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinicalapplication.Stem Cell Reports 2014；2:205-218.)
[非专利文献3]镰尾H、万代M、若宫S等人，“由人诱导性多能干细胞衍生的RPE的色素沉着程度的客观评价”，“眼科研究与视力学”(2014；55:8309-8318)(Kamao H,Mandai M,Wakamiya S,et al.Objective evaluation of the degree of pigmentation in humaninduced pluripotent stem cell-derived RPE.Invest Ophthalmol Vis Sci.2014；55:8309-8318.)
[非专利文献4]莱恩A、飞利浦LR、鲁班L等人，“自人多能干细胞向视网膜色素上皮的工程高效分化”，「干细胞转化医学」(2014；3:1295-1304)(Lane A,Philip LR,Ruban L,et al.Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation fromhuman pluripotent stem cells.Stem Cells Transl Med.2014；3:1295-1304.)
[非专利文献5]弗格A、凯尔AJ、劳伦斯J等人，“由HESC衍生RPE的现象阐述：细胞生成、扩张与视网膜移植的解剖”，“实验神经学”(2008；214:347-361)(Vugler A,Carr AJ,Lawrence J,et al.Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE：anatomy ofcell genesis,expansion and retinal transplantation.Exp Neurol.2008；214:347-361.)
发明内容
发明所欲解决的课题
于自人诱导性多能干细胞(iPS细胞)或人胚胎干细胞(ES细胞)向视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)进行分化的步骤中，即便为相同培养条件下的情况，亦会获得分化为成熟的RPE细胞的细胞与保持未分化的状态的细胞。本发明的目的为提供一种方法，其通过在观察到成为细胞的成熟度的指标的色素沉着之前，对细胞进行非侵袭性评价，而于早期判别自多能干细胞向RPE细胞进行分化的细胞与不分化的细胞。
解决课题的手段
即，本发明的目的可通过以下发明来达成。
〔1〕
一种方法，其对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中的、该多能干细胞的分化状态进行评价，所述方法包括：
(1)对多能干细胞的培养上清液中的指标物质的存在量进行测定的步骤；以及
(2)基于所述指标物质的存在量的变化，对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价的步骤，
所述指标物质为鸟氨酸及/或瓜氨酸。
〔2〕
如〔1〕所述的方法，其中于所述步骤(2)中，通过对培养上清液中的所述指标物质的存在量的经时变化进行分析，来评价多能干细胞的分化状态。
〔3〕
如〔2〕所述的方法，其中对所述经时变化进行分析的期间为将所述多能干细胞的培养基自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期设为第0天的、第0天至第20天为止的期间。
〔4〕
如〔2〕所述的方法，其中对所述经时变化进行分析的期间为将所述多能干细胞的培养基自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期设为第0天的、第3天至第12天为止的期间。
〔5〕
如〔2〕至〔4〕中任一项所述的方法，其中于判定为所述经时变化大的情况下，评价为进行自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞分化的可能性高。
〔6〕
如〔1〕所述的方法，其中于所述步骤(1)中，对作为所述指标物质的鸟氨酸及瓜氨酸的存在量进行测定，且于鸟氨酸及瓜氨酸的存在量的经时变化实质上相同的情况下，评价为进行自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞分化。
〔7〕
如〔2〕至〔4〕中任一项所述的方法，其中于所述步骤(2)中，基于与所述指标物质的存在量相关的变动系数的阈值，对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价。
〔8〕
如〔7〕所述的方法，其中于所述变动系数的阈值与鸟氨酸的存在量相关而为0.20以上及/或与瓜氨酸的存在量相关而为0.30以上的情况下，评价为进行自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞分化。
〔9〕
如〔1〕所述的方法，其进而包括：步骤(3)，对细胞的分化状态已知的对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量进行测定，并且
通过对所述步骤(1)中进行测定的所述多能干细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量、与所述步骤(3)中进行测定或已测定的所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量进行比较，来对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价。
〔10〕
如〔9〕所述的方法，其中基于所述多能干细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量、与所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量的比或差是否为预先规定的阈值以上、或者是否小于阈值，对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价。
〔11〕
如〔9〕所述的方法，其中通过对所述多能干细胞的培养上清液中的指标物质的存在量的经时变化、与所述对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量的经时变化进行比较，来对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价。
〔12〕
如〔9〕至〔11〕中任一项所述的方法，其中所述对照细胞为于自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中维持未分化的状态的细胞。
〔13〕
如〔1〕所述的方法，其进而包括：步骤(4)，将于自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中确认到细胞的分化的细胞设为对照细胞，并预先对该对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量进行测定，并且
通过对所述多能干细胞的培养上清液中的指标物质的存在量、与所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量进行比较，来评价细胞的分化状态。
〔14〕
如〔13〕所述的方法，其中基于根据所述对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量而规定的阈值，评价细胞的分化状态。
〔15〕
如〔1〕至〔14〕中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞为诱导性多能干细胞(iPS细胞)或胚胎干细胞(ES细胞)。
〔16〕
如〔1〕至〔15〕中任一项所述的方法，其中利用质谱法对所述指标物质的存在量进行测定。
〔17〕
一种自多能干细胞制造视网膜色素上皮细胞的方法，其使用如〔1〕至〔16〕中任一项所述的方法。
〔18〕
一种方法，其对自胚胎干细胞(ES细胞)向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中的、该ES细胞的分化状态进行评价，所述方法包括：
(1)对ES细胞的培养上清液中的指标物质的存在量进行测定的步骤；以及
(2)基于所述指标物质的存在量的变化，对自ES细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价的步骤，
所述指标物质为选自由谷胱甘肽、鸟氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、六氢烟碱酸、腐胺、脯氨酸、2-氨基己二酸、胞苷、脱氧胞苷、腺苷及肌苷所组成的群组中的至少一种。
〔19〕
一种方法，其对自胚胎干细胞(ES细胞)向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中的、该ES细胞的分化状态进行评价，所述方法包括：
(1)对ES细胞的培养上清液中的指标物质的存在量进行测定的步骤；以及
(2)基于所述指标物质的存在量的变化，对自ES细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价的步骤，
所述指标物质为选自由谷胱甘肽、鸟氨酸、瓜氨酸、六氢烟碱酸、2-氨基己二酸、胞苷及脱氧胞苷所组成的群组中的至少一种。
〔20〕
一种方法，其对自胚胎干细胞(ES细胞)向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中的、该ES细胞的分化状态进行评价，所述方法包括：
(1)对ES细胞的培养上清液中的指标物质的存在量进行测定的步骤；以及
(2)基于所述指标物质的存在量的变化，对自ES细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价的步骤，
所述指标物质为腺苷及/或肌苷。
〔21〕
如〔18〕至〔20〕中任一项所述的方法，其中于所述步骤(2)中，通过对培养上清液中的所述指标物质的存在量的经时变化进行分析，来评价所述ES细胞的分化状态。
〔22〕
如〔18〕至〔21〕中任一项所述的方法，其中利用质谱法对所述指标物质的存在量进行测定。
〔23〕
一种自ES细胞制造视网膜色素上皮细胞的方法，其使用如〔18〕至〔22〕中任一项所述的方法。
发明的效果
根据本发明，于自作为多能干细胞的诱导性多能干细胞(iPS细胞)或胚胎干细胞(ES细胞)向视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)进行分化的过程中，通过在成为分化为成熟的RPE细胞的指标的色素(黑色素)沉着产生之前，对培养上清液中的指标物质进行测定，可于早期判别向RPE细胞进行分化的细胞与不分化的细胞。自多能干细胞向RPE细胞进行分化诱导时，需要长时间的培养，但通过可于早期判别分化的成败，可于早期将因不分化而无法用于移植的细胞排除。该情况会削减不必要的培养成本与用于培养的劳力与时间。进而，本发明的方法于不需要对细胞进行破碎或溶解这一对于细胞的侵袭性处理的情况下对细胞上清液中的指标物质进行测定，因此，对于细胞而言为非侵袭性的，且关于实际预定移植的细胞其本身，可事先对分化诱导的成败进行评价。因此，可顺利地进行RPE细胞的移植准备。
附图说明
图1是将人iPS细胞于A(16035)、B(16040)、C(17005)及D(17010)的独立的培养容器中培养75天(A)、76天(B)、99天(C)及91天(D)，并利用反射型明视野观察装置进行拍摄的图。于A、C及D中，观察到色素沉着(表示为“Good(良好)(＝有色素沉着(Pigmentation))”，且观察到向视网膜色素上皮细胞的分化(未显示结果)。于B中，未观察到色素沉着(表示为“Bad(差)(＝无色素沉着)”，且未观察到向视网膜色素上皮细胞的分化。
图2是表示将人iPS细胞于独立的培养容器(16035、16040、17005及17010)中加以培养，并对各培养容器中的鸟氨酸的存在量进行测定而得的结果。培养容器16035、16040、17005及17010与图1中所示的培养容器相同。于最终观察到色素沉着的培养容器16035、17005及17010的iPS细胞中，在将自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期设为第0天的、第3天至第12天为止的期间内，确认到鸟氨酸的存在量显著增加，但于该期间内未观察到色素沉着。于16040中，未确认到鸟氨酸的存在量显著增加。
图3是表示将人iPS细胞于独立的培养容器(16035、16040、17005及17010)中加以培养，并对各培养容器中的瓜氨酸的存在量进行测定而得的结果。培养容器16035、16040、17005及17010与图1中所示的培养容器相同。于最终观察到色素沉着的培养容器16035、17005及17010的iPS细胞中，在将自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期设为第0天的、第5天至第12天为止的期间内，确认到瓜氨酸的存在量显著增加，但于该期间内未观察到色素沉着。于16040中，未确认到瓜氨酸的存在量显著增加。
图4是将人iPS细胞的鸟氨酸(A)及瓜氨酸(B)产生量的经时性变化以变动系数的形式加以表示的图。将iPS细胞于独立的培养容器(16035、16040、17005及17010)中加以培养，并对各培养容器中的鸟氨酸(A)及瓜氨酸(B)的存在量进行测定。培养容器16035、16040、17005及17010与图1中所示的培养容器相同。变动系数是将细胞的培养期间中的鸟氨酸或瓜氨酸的存在量的测定次数设为资料数，并基于各次测定的存在量的平均值及标准偏差来算出的。
图5是针对每一培养容器而以数值形式表示图4所示的鸟氨酸及瓜氨酸的存在量的变动系数的图。
图6a是表示对人ES细胞及人iPS细胞进行培养并对培养上清液中的指标物质的存在量进行测定而得的结果的图。(A)为鸟氨酸的测定结果、(B)为瓜氨酸的测定结果、(C)为谷胱甘肽的测定结果及(D)为半胱氨酸的测定结果。观察到所使用的人ES细胞向视网膜色素上皮细胞的分化，但人iPS细胞未分化。仅是不含细胞的培养基(空白)的情况下，几乎未观察到培养上清液中的指标物质的存在量的经时性变化。
图6b是表示对人ES细胞及人iPS细胞进行培养并对培养上清液中的指标物质的存在量进行测定而得的结果的图。(E)为六氢烟碱酸的测定结果、(F)为腐胺的测定结果、(G)为脯氨酸的测定结果及(H)为2-氨基己二酸的测定结果。观察到所使用的人ES细胞向视网膜色素上皮细胞的分化，但人iPS细胞未分化。仅是不含细胞的培养基(空白)的情况下，几乎未观察到培养上清液中的指标物质的存在量的经时性变化。
图6c是表示对人ES细胞及人iPS细胞进行培养并对培养上清液中的指标物质的存在量进行测定而得的结果的图。(I)为胞苷的测定结果、(J)为脱氧胞苷的测定结果、(K)为腺苷的测定结果及(L)为肌苷的测定结果。观察到所使用的人ES细胞向视网膜色素上皮细胞的分化，但人iPS细胞未分化。仅是不含细胞的培养基(空白)的情况下，几乎未观察到培养上清液中的指标物质的存在量的经时性变化。
具体实施方式
本发明提供一种对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中的该多能干细胞的分化状态进行评价的方法。该方法包括：(1)对多能干细胞的培养上清液中的指标物质的存在量进行测定的步骤；以及(2)基于所述指标物质的存在量的变化，对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价的步骤。另外，所述指标物质为鸟氨酸及/或瓜氨酸。
进而，本发明提供一种对自胚胎干细胞(ES细胞)向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中的、该ES细胞的分化状态进行评价的方法。该方法包括：(1)对ES细胞的培养上清液中的指标物质的存在量进行测定的步骤；以及(2)基于所述指标物质的存在量的变化，对自ES细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价的步骤。另外，所述指标物质为选自由谷胱甘肽、半胱氨酸、脱氧胞苷、2-氨基己二酸、瓜氨酸、六氢烟碱酸、腐胺、鸟氨酸、胞苷、腺苷、肌苷及脯氨酸所组成的群组中的至少一种。亦可将所述指标物质设为选自由谷胱甘肽、脱氧胞苷、2-氨基己二酸、瓜氨酸、六氢烟碱酸、鸟氨酸及胞苷所组成的群组中的至少一种。
于本发明的分化诱导步骤中，视网膜色素上皮细胞由多能干细胞制作。作为多能干细胞，可使用作为未分化细胞的iPS细胞(Induced Pluripotent Stem cells)或ES细胞(Embryonic Stem cells)。iPS细胞为人工干细胞，可通过将核酸、蛋白质或作为低分子化合物等的特定多能诱导因子导入体细胞内来制作(高桥K、山中D，“细胞”(2006；126:663-676)(Takahashi K.Yamanaka D.Cell,2006；126:663-676)；高桥K等人，“细胞”(2007；131:861-872)(Takahashi K.et al.Cell,2007；131:861-872)；WO2007/069666)。ES细胞可通过自哺乳动物的受精卵的胚胞取出内细胞团并对该内细胞团进行培养来制作(末守H等人，“生物化学与生物物理学研究通讯”(2006；345:926-932)(Suemori H.et al.BiochemBiophys Res Commun.2006；345:926-932))。iPS细胞及ES细胞可使用源自哺乳动物、例如人、猴子、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、猪、绵羊、山羊、兔子、仓鼠及豚鼠等的细胞，较佳为源自人的细胞。
于自作为多能干细胞的iPS细胞或ES细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中，首先，于细胞增殖用培养基中对所述干细胞进行培养，其次，置换为细胞分化用培养基来进行培养。使所述干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的培养条件及培养基可使用本领域技术人员公知的培养条件及培养基，本领域技术人员亦可适当地进行改变。亦可使用市售的培养基，作为细胞增殖用培养基，例如可列举伊森谢(Essential)8(注册商标)培养基，作为细胞分化用培养基，例如可列举伊森谢(Essential)6(注册商标)培养基。
作为对自iPS细胞或ES细胞向视网膜色素上皮细胞的分化进行确认的方法，报告有若干方法(日本厚生劳动省医药食品局审查管理课医药食品局医疗机器审查管理室发令0529第1号(2013年5月29日)附件1“与源自自体iPS细胞的视网膜色素上皮细胞相关的评价指标”)。例如，通过利用相位差显微镜观察等，对视网膜色素上皮细胞特有的茶褐色的色素(黑色素)沉着或者多边形或石板状细胞形态等的存在进行观察，可确认向视网膜色素上皮细胞的分化。另外，通过确认视网膜色素上皮细胞的特征性基因的表达，可确认向视网膜色素上皮细胞的分化。作为视网膜色素上皮细胞的特征性基因，可列举：RPE65、CRALBP、MERTK及BEST1等。关于iPS细胞或ES细胞(未分化细胞)的混合存在，可通过如下方式来评价：作为未分化标记的Oct3/4、Sox及TRA-1-60等的利用免疫染色进行的分析、或者未分化标记基因(OCT3/4、Nanog及Lin28等)的测定。
本发明的方法可于确认到自作为多能干细胞的iPS细胞或ES细胞向视网膜色素上皮细胞的分化之前，在早期判别进行分化的细胞或细胞集团。出于该目的，于本发明的步骤(1)中，对iPS细胞或ES细胞的培养上清液中的指标物质的存在量进行测定。所谓指标物质，为作为iPS细胞或ES细胞的代谢产物而释放于培养上清液中的化合物或分化用培养基中所含的培养基成分，较佳为作为氨基酸的一种的鸟氨酸(ornithine)及瓜氨酸(citrulline)。关于ES细胞，作为用于在早期判别自ES细胞向视网膜色素上皮细胞进行分化的细胞或细胞集团的指标物质，除了鸟氨酸及瓜氨酸以外，亦可进而选择谷胱甘肽(glutathione)、半胱氨酸(cysteine)、六氢烟碱酸(pipecolic acid)、腐胺(putrescine)、脯氨酸(proline)、2-氨基己二酸(2-aminoadipic acid)、胞苷(cytidine)、脱氧胞苷(deoxycytidine)、腺苷(adenosine)及肌苷(inosine)。这些可单独或将两种以上加以组合来评价细胞的分化状态。
本发明的步骤(2)为基于本发明的步骤(1)中已测定的、多能干细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量，对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价的步骤。于本发明的一实施方式中，通过对所述指标物质的存在量的经时变化进行分析，来评价多能干细胞的分化状态。所谓指标物质的存在量的经时变化，为随着多能干细胞的培养时间的经过的、培养上清液中的指标物质量的变化。培养上清液中的指标物质量可由培养液中的指标物质的浓度或绝对量、每单位细胞数的指标物质量及每一培养容器的总指标物质量等来表示，但并不限定于这些。于对培养上清液中的指标物质的存在量的经时变化进行分析时，包含在指标物质的存在量的经时变化的曲线或轮廓中检测出存在量的短暂性或持续性的增加或减少的情况。培养上清液中的指标物质的存在量的短暂性或持续性的增加或减少是作为存在量的经时变化的曲线或轮廓自基线(baseline)的变动而被识别的。
于本发明的一实施方式中，对培养上清液中的鸟氨酸及/或瓜氨酸的存在量的经时变化进行分析的期间较佳为将多能干细胞的培养基自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期设为第0天的、第0天至第20天为止的期间。经时变化的分析可于该期间的整个范围内进行，但只要可观察到变化，亦可于更短的期间、例如第3天至第12天内进行分析。于鸟氨酸的存在量的情况下，可于第4天至第12天为止的期间内进行分析，另外，于瓜氨酸的存在量的情况下，可于第8天至第12天为止的期间内进行分析。通常，自细胞增殖用培养基向细胞分化用培养基的置换较佳为于在细胞增殖用培养基中培养7天～10天后进行，可根据细胞的增殖程度来增减天数。
于本发明的一实施方式中，在判定为多能干细胞的培养上清液中的鸟氨酸或瓜氨酸的存在量的经时变化大的情况下，评价为进行自该多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞分化的可能性高。所谓判定为所述经时变化大的情况，是指鸟氨酸或瓜氨酸的存在量的经时变化的曲线或轮廓自基线(baseline)的变动或偏离大，鸟氨酸或瓜氨酸的存在量急速增加，然后减少的状态。其结果，于鸟氨酸或瓜氨酸的存在量的经时变化中，观察到明确的峰值。若为本领域技术人员，可通过参照经时变化的曲线或轮廓而容易地识别出该峰值。经时变化中的该峰值可为单峰性峰值，或者亦可为多峰性峰值。
为了作为多能干细胞的iPS细胞或ES细胞分化为视网膜色素上皮细胞并产生作为已进行分化的指标的色素沉着，通常需要30天～50天左右的培养时间。另一方面，于产生细胞中的色素沉着的时期之前观察培养上清液中的鸟氨酸或瓜氨酸的存在量的经时变化中的峰值。观察到该峰值的培养细胞通过之后继续进行培养而产生向视网膜色素上皮细胞进行分化的指标即色素沉着，因此评价为于观察到该峰值的时间点，进行自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞分化的可能性高。
于本发明的一实施方式中，在多能干细胞的培养上清液中的鸟氨酸及瓜氨酸的存在量的经时变化实质上相同的情况下，评价为进行自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞分化。由于是基于鸟氨酸及瓜氨酸的存在量的经时变化此两者进行评价，因此与单独使用鸟氨酸或瓜氨酸的存在量的经时变化的某一者进行评价的情况相比，评价结果的可靠性提高。所谓培养上清液中的鸟氨酸及瓜氨酸的存在量的经时变化实质上相同，是指该经时变化满足以下两个条件的情况。该条件为：(1)于如下方面共通，即于鸟氨酸及瓜氨酸的存在量的经时变化中观察到的峰值为存在量随着培养时间的经过而增加、然后减少这一形状的峰值；(2)即便所述峰值为多峰性，获得存在量最高的主峰值的培养时间亦大致共通。所谓大致共通，是指于鸟氨酸及瓜氨酸之间赋予主峰值位置的培养时间的差异为5天以内，较佳为3天以内，更佳为1天以内。
于本发明的一实施方式中，基于与作为指标物质的鸟氨酸及/或瓜氨酸的存在量相关的变动系数的阈值，评价自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态。所述变动系数通过用所述存在量的标准偏差除以所述存在量的平均值来算出。即，将多能干细胞的培养期间中的、指标物质的存在量的测定次数设为资料数，算出各次测定的存在量的平均值。其次，算出用各次测定的存在量的值与所述存在量的平均值的差的平方的合计值除以所述资料数而得的值的正的正方根作为标准偏差。用如此算出的标准偏差除以所述存在量的平均值，借此算出变动系数。变动系数为资料的偏差的大小的比率，所述变动系数越大，表示培养期间中所测定的指标物质的存在量的变动越大，相反，若所述变动系数小，则表示培养期间中所测定的指标物质的存在量的变动小。
于本发明的一实施方式中，在所述变动系数的阈值关于鸟氨酸的存在量而为0.20以上、较佳为0.25以上及/或关于瓜氨酸的存在量而为0.30以上的情况下，评价为进行自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞分化。即，于培养上清液中的鸟氨酸及/或瓜氨酸的存在量在培养期间中显示出一定的变动的情况下，评价为进行所述细胞分化。与鸟氨酸及/或瓜氨酸的存在量相关的变动系数的阈值为根据变动系数的算出值与自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞分化状态的对比而经验性地导出的值，若为本领域技术人员，则亦可根据进行对比的试验例或试验数来再次设定被推测为更适当的阈值。用于算出所述变动系数的培养期间若为多能干细胞的培养基自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期以后，则可任意规定。所述培养期间为将多能干细胞的培养基自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期设为第0天的、较佳为第0天至第20天为止的期间，更佳为第3天至第12天。于鸟氨酸的存在量的情况下，所述培养期间进而佳为第4天至第12天为止的期间，另外，于瓜氨酸的存在量的情况下，进而佳为第8天至第12天为止的期间。
于本发明的一实施方式中，提供一种方法，其进而包括：步骤(3)，对细胞的分化状态已知的对照细胞的培养上清液中的指标物质(鸟氨酸及/或瓜氨酸)的存在量进行测定，并且通过对本发明的步骤(1)中进行测定的所述多能干细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量、与所述步骤(3)中进行测定或已测定的所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量进行比较，来对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价。对对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量进行测定的所述步骤(3)可与所述步骤(1)同期执行，或者亦可独立于所述步骤(1)的执行而于执行所述步骤(1)之前实施。对照细胞可为源自如下细胞株的多能干细胞，所述细胞株与供于自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导的细胞相同，或者亦可为源自与供于分化诱导的细胞不同的多能干细胞株的细胞。所谓细胞的分化状态已知的对照细胞，为已知细胞为未分化的状态、抑或为已分化状态、且分化状态于培养期间中不会变化的细胞。未分化的状态例如可通过如下方式来确认：利用免疫染色来分析Oct3/4、Sox及TRA-1-60等未分化标记的存在；或者未分化标记基因(OCT3/4、Nanog及Lin28等)的测定。关于已分化的状态，例如若为视网膜色素上皮细胞，则可通过茶褐色的色素(黑色素)沉着或者多边形或石板状细胞形态的存在、或者通过测定RPE65、CRALBP、MERTK及BEST1等基因表达来确认。
于本发明的一实施方式中，提供一种方法，其中基于所述多能干细胞的培养上清液中的指标物质(鸟氨酸及/或瓜氨酸)的存在量、与所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量的比或差是否为预先规定的阈值以上、或者是否小于阈值，对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价。所述阈值可通过如下方式导出：关于确认到自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化的细胞以及未确认到分化的细胞的培养上清液，增加细胞培养的样品数，反复测定各样品中的鸟氨酸及瓜氨酸的存在量。即，所述阈值为经验性地导出的值，若为本领域技术人员，则可容易地设定。
于本发明的一实施方式中，提供一种方法，其中通过对所述多能干细胞的培养上清液中的指标物质(鸟氨酸及/或瓜氨酸)的存在量的经时变化、与所述对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量的经时变化进行比较，来对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化状态进行评价。所谓指标物质的存在量的经时变化，对于多能干细胞及对照细胞任一者而言，均是指随着培养时间的经过的培养上清液中的指标物质量的变化。指标物质量可由培养液中的指标物质的浓度或绝对量、每单位细胞数的指标物质量及每一培养容器的总指标物质量等来表示，但并不限定于这些。所谓对培养上清液中的指标物质的存在量的经时变化进行比较，是指掌握指标物质的存在量的经时变化的曲线或轮廓的类似性或者非类似性。
于本发明的一实施方式中，作为所述对照细胞，可使用于自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中维持未分化的状态的细胞。所谓于自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中维持未分化的状态，意味着未自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞进行分化，且是指维持未观察到色素(黑色素)沉着、或者未观察到RPE65、CRALBP、MERTK及BEST1等视网膜色素上皮细胞的特征性基因的表达的状态。将多能干细胞维持为未分化的状态可通过如下方式来达成：并不将多能干细胞的培养基置换为细胞分化用培养基，而是直接于细胞增殖用培养基中进行继代培养。
于本发明的一实施方式中，提供一种方法，其进而包括：步骤(4)，将于自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中确认到细胞的分化的细胞设为对照细胞，并预先对该对照细胞的培养上清液中的指标物质(鸟氨酸及/或瓜氨酸)的存在量进行测定，并且通过对所述多能干细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量、与所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量进行比较，来评价细胞的分化状态。该方法中，预先对确认到自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化的对照细胞测定培养上清液中的所述指标物质的存在量，并将该测定值设为用于判别已进行分化诱导的参照值或指标。根据该方法，可将所述参照值或指标作为基准，来判别培养的多能干细胞是否分化为视网膜色素上皮细胞。所述多能干细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量、与所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量的比较可通过某特定培养时间下的存在量的比较来进行。于本发明的一实施方式中，可基于根据所述对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量而规定的阈值，对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化状态进行评价。
于本发明的一实施方式中，可将与所述步骤(4)中获得的多种对照细胞的分化状态及该对照细胞的培养上清液中的指标物质(鸟氨酸及/或瓜氨酸)的存在量相关的信息记录为针对每个对照细胞的库(library)。若使用该库，则亦可通过将所述分化诱导步骤中的多能干细胞的培养上清液中的指标物质的存在量、和与所述分化诱导步骤中的多能干细胞相同的细胞株所对应的所述库中的存在量的相关信息加以对照，来评价细胞的分化状态。
所述多能干细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量、与所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量的比较亦可通过多个培养时间下的存在量的比较、即对存在量的经时变化的曲线或轮廓进行比较来进行。其原因在于：通过比较多个培养时间下的存在量，是否已进行分化的判别精度提高。是否已进行分化的判别可基于所述曲线或轮廓的类似性来进行。此处，所谓类似性，是指随着培养时间的经过的曲线或轮廓的形状类似。
于本发明中，作为对培养上清液中的所述指标物质的存在量进行定量测定的方法，可使用气相层析法(Gas Chromatography，GC)、液相层析法(Liquid Chromatography，LC)及质谱法(Mass Spectrometry，MS)等。进而，于指标物质的定量性测定中亦可适宜地使用液相层析质谱法(LC-MS)及气相层析质谱法(GC-MS)，但并不限定于这些。
利用LC-MS进行的分析可以如下方式进行。对于培养上清液试样100μL，添加0.5mM异丙基苹果酸水溶液20μL作为内部标准，混合后，添加乙腈或甲醇200μL，去除蛋白质。对所获得的试样，使用托弥(TOMY)精工制造的离心机，于15,000rpm下且于室温下离心分离15分钟，之后，回收上清液，利用超纯水(MiLLi-Q(注册商标)水，默克(Merck)股份有限公司)稀释10倍，供于LC-MS分析。LC-MS分析是依照岛津制作所制造的“LC/MS/分析方法包细胞培养剖析”(以下，简称为“MP”)中所收录的分析条件。MP中汇集有用于利用LC-MS对培养基中所含的化合物以及自细胞分泌的代谢物进行分析的分析条件参数。化合物的鉴定将如下情况作为基准来进行：MP中所注册的标准品的保持时间与试样中的化合物的保持时间的差为±0.3分钟以内、检测出定量离子及确认离子两者的峰值、以及强度值为1000以上。化合物的定量通过如下方法进行：对试样中的各化合物的特征性离子(定量离子)，算出质量层析图的面积。
利用GC-MS进行的分析可以如下方式进行。对于培养上清液试样100μL，添加0.5mg/mL异丙基苹果酸水溶液10μL作为内部标准，混合后，添加乙腈200μL，去除蛋白质。将所获得的试样于15,000rpm下且于室温下离心分离15分钟，之后，回收上清液100μL，进行减压干燥。于包含甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液中对各试样进行培育，借此进行试样中的化合物的甲肟化。进而，于各试样中添加MSTFA(N-甲基-三甲基硅烷基三氟乙酰胺)，使试样中的化合物三甲基硅烷化(衍生物化)。将如此进行了衍生物化处理的试样供于利用GC-MS进行的分析中。
于GC-MS分析中，使用岛津制作所制造的“智慧型代谢物资料库(SmartMetabolites Database)”(以下简称为“DB”)。该DB中汇集有利用GC-MS对进行了与所述衍生物化处理相同的处理的各种标准品进行分析而得的资料。化合物的鉴定将如下情况作为指标来进行：所述DB中所设定的保持指标(使保持时间相对化而成的数值)与试样中的衍生物化化合物的保持指标的差是否为±5以内、以及对于试样中的衍生物化化合物是否检测出所述DB中所设定的定量离子及确认离子此两者。另一方面，化合物的定量通过如下方法来进行：依照所述DB中所设定的条件，对试样中的各衍生物化化合物的特征性离子，算出质量层析图的面积。
作为培养上清液中的所述指标物质的存在量，例如于使用GC、LC、GC-MS或LC-MS的情况下，可使用根据这些测定方法中的所述指标物质的峰值面积值(Area)、或所述指标物质的峰值面积值(Area)来算出的培养上清液中的所述指标物质的浓度(Concentration)。进而，亦可使用利用细胞的汇合度(Confluency)进行修正(规格化)后的“Area/Confluency”或“Concentration/Confluency”、或者利用细胞数(Cell Number或CellCount)进行修正后的“Area/Cell Number”或“Concentration/Cell Number”。通过使用利用细胞的汇合度(Confluency)或细胞数(Cell Number或Cell Count)进行修正(规格化)后的值，于所述分化诱导步骤中的多能干细胞与所述对照细胞之间，即便细胞的增殖率存在差异的情况下，亦可于所述细胞间对每单位细胞数的所述指标物质的峰值面积值(Area/Confluency)或所述指标物质的浓度(Concentration/Confluency)进行比较。因此，可以高精度评价细胞的分化状态。
本发明提供一种自多能干细胞制造视网膜色素上皮细胞的方法，其包括对本发明的多能干细胞的分化状态进行评价的方法。多能干细胞包含iPS细胞及ES细胞。本发明的制造视网膜色素上皮细胞的方法可于自多能干细胞制造视网膜色素上皮细胞的步骤中，判别向视网膜色素上皮细胞进行分化的细胞、与不分化的细胞。本发明的制造视网膜色素上皮细胞的方法可包括将判断为不向视网膜色素上皮细胞进行分化的细胞或细胞集团去除的步骤。
实施例
其次，列举实施例来详细说明本发明，但本发明的范围不受这些实施例的限定。
实施例1
〔自人iPS细胞向视网膜色素上皮细胞的分化〕
将人iPS细胞接种到由玻连蛋白(vitronectin)涂布的组织培养用烧瓶中，使用伊森谢(Essential)8(英杰公司(Invitrogen)，注册商标)作为细胞增殖用培养基，并于5％CO2、37℃下进行培养。培养后7天时，将细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基(TeSR-E6，干细胞技术公司(STEMCELL Technologies))，进而于5％CO2、37℃下进行培养。培养后75天～99天内，利用反射型明视野观察装置观察细胞。培养容器16035(图1的(A))、17005(图1的(C))及17010(图1的(D))的细胞中，观察到色素沉着，显示出向视网膜色素上皮细胞进行了分化。但是，尽管于相同条件下进行培养，在培养容器16040(图1的(B))中，未观察到色素沉着，显示出未分化为视网膜色素上皮细胞。
实施例2
〔人iPS细胞的培养上清液中的鸟氨酸及瓜氨酸的测定〕
利用LC-MS对实施例1中所培养的人iPS细胞的培养上清液中的鸟氨酸量及瓜氨酸量进行经时性测定(分别为图2及图3)。分析装置使用LCMS-8050(岛津制作所)。于观察到色素沉着、显示出向视网膜色素上皮细胞的分化的培养容器16035、17005及17010的细胞的培养上清液中，在将自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期设为第0天的、第3天至第12天为止的期间内，确认到鸟氨酸存在量的单峰性峰值。另外，在将自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期设为第0天的、第5天至第15天为止的期间内，确认到瓜氨酸存在量的单峰性峰值。另一方面，于未观察到色素沉着、显示出保持未分化的状态的培养容器16040的细胞的培养上清液中，鸟氨酸存在量的变动少，在将自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期设为第0天的、至第40天为止的期间内，于鸟氨酸存在量的经时变化中未确认到明确的峰值。培养容器16040的细胞的培养上清液中的瓜氨酸量自将自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期设为第0天的、第25天附近起有渐增的倾向，但未确认到明确的峰值。
于培养容器16035、17005及17010的细胞中，在将自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期设为第0天的、第40天附近观察到色素沉着，相对于此，在此之前的、第3天至第12天为止的期间及第5天至第15天为止的期间内分别观察到鸟氨酸存在量及瓜氨酸存在量的峰值。其结果表示：通过对培养上清液中的鸟氨酸存在量及/或瓜氨酸存在量进行测定并加以分析，可于通过色素沉着确认到自iPS细胞向视网膜色素上皮细胞的分化之前，判别进行分化的细胞与不分化的细胞。相反，未赋予鸟氨酸存在量及瓜氨酸存在量的峰值的细胞表示即便继续进行培养，不分化的可能性亦高。根据这些情况，表示可通过对培养上清液中的鸟氨酸及/或瓜氨酸的存在量的经时变化进行分析，来预测细胞分化。
将人iPS细胞的培养上清液中的鸟氨酸量及瓜氨酸量的经时性变化以变动系数的形式来加以表示。将其结果分别示于图4的(A)及图4的(B)中。另外，将变动系数的数值的一览表示于图5中。图4以及图5中所示的培养时间(天)是将自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期表示为第0天。关于向视网膜色素上皮细胞进行了分化的培养容器16035、17005及17010的细胞的培养上清液中的鸟氨酸的存在量的变动系数，于鸟氨酸存在量的经时变化中赋予峰值的第0天至第20天为止的期间内的至少第4天至第12天为止的期间中，赋予0.20以上的数值。另一方面，于显示出保持未分化的状态的培养容器16040的细胞的培养上清液中，第6天至第20天为止的期间内的变动系数小于0.20。关于向视网膜色素上皮细胞进行了分化的培养容器16035、17005及17010的细胞的培养上清液中的瓜氨酸的存在量的变动系数，于瓜氨酸存在量的经时变化中赋予峰值的第0天至第20天为止的期间内的至少第8天至第12天为止的期间中，赋予0.60以上的数值。另一方面，于显示出保持未分化的状态的培养容器16040的细胞的培养上清液中，第8天至第12天为止的期间内的变动系数小于0.30。
实施例3
〔人ES细胞及人iPS细胞的培养上清液中的指标物质的比较〕
将人ES细胞及人iPS细胞接种到由玻连蛋白涂布的六孔板(6-well plate)(福鲁康(FALCON))中，以4mL/孔添加伊森谢(Essential)8(英杰公司(Invitrogen)，注册商标)作为细胞增殖用培养基，并于5％CO2、37℃下进行培养。于培养后10天以内，每天更换细胞增殖用培养基。于培养后第10天，将培养基更换为不含bFGF(碱性纤维母细胞生长因子)及TGF-β1(转化增殖因子-β1)的伊森谢(Essential)6(细胞分化用培养基)(4mL/孔)，于培养后80天以内，每周更换2次细胞分化用培养基，同时于5％CO2、37℃下进行培养。人ES细胞及人iPS细胞的培养上清液中的指标物质的存在量通过LC-MS经时性地测定。分析装置使用LCMS-8050(岛津制作所)。将培养开始后的各指标物质的存在量的经时变化示于图6a至图6c中：(A)鸟氨酸、(B)瓜氨酸、(C)谷胱甘肽、(D)半胱氨酸、(E)六氢烟碱酸、(F)腐胺、(G)脯氨酸、(H)2-氨基己二酸、(I)胞苷、(J)脱氧胞苷、(K)腺苷及(L)肌苷。
培养后的人ES细胞于培养后42天附近，细胞形态呈现为多边形或石板状，且观察到色素沉着，借此确认到向视网膜色素上皮细胞进行分化。另一方面，培养后的人iPS细胞未观察到色素沉着，判断为未进行细胞分化。于最终向视网膜色素上皮细胞进行了分化的人ES细胞、与未分化的人iPS细胞的比较中，得知各指标物质的存在量的经时变化的特征根据指标物质而不同。于人ES细胞中，谷胱甘肽(图6a的(C))及半胱氨酸(图6a的(D))的存在量于培养后5天以内急速增加，然后减少。其结果，于培养时间1天～10天时赋予存在量的峰值。尤其是，关于谷胱甘肽，于培养时间1天～10天内，人iPS细胞几乎未产生谷胱甘肽，与人ES细胞明显不同。于人ES细胞中，脱氧胞苷(图6c的(J))的存在量于培养后8天以内急速增加，然后减少。其结果，于培养时间5天～10天时赋予存在量的峰值。脱氧胞苷进而于培养时间20天～30天之间赋予存在量的峰值。关于鸟氨酸(图6a的(A))及瓜氨酸(图6a的(B))，得知于人ES细胞中，在培养时间15天～25天时赋予单峰性峰值，但于人iPS细胞中未观察到峰值，明显不同。关于六氢烟碱酸(图6b的(E))，于人ES细胞中，在培养时间15天～25天时赋予单峰性峰值，但于人iPS细胞中，在培养时间30天～45天时赋予峰值。另外，关于腐胺(图6b的(F))及2-氨基己二酸(图6b的(H))，于人ES细胞中，在培养时间15天～30天时赋予单峰性峰值，但同期的人iPS细胞中的腐胺的存在量低，并且未显示出明确的峰值。关于胞苷(图6c的(I))，于人ES细胞中，在培养时间20天～35天时赋予明了的单峰性峰值。于人iPS细胞中，虽亦确认到峰值状的胞苷存在量的增加，但与人ES细胞的情况相比，是峰值高度为四分之一左右的小峰值。这些指标物质的存在量的经时变化的特征为通过色素沉着确认到人ES细胞向视网膜色素上皮细胞的分化之前的变化，通过对这些指标物质进行测定，可预先判别是否进行分化。进而，通过将多种这些指标物质组合，可提高是否进行分化的预测精度。于未向视网膜色素上皮细胞进行分化的人iPS细胞中，未观察到向视网膜色素上皮细胞进行了分化的人ES细胞中的、所述各指标物质的存在量的经时变化的特征。
于培养时间42天附近，确认到培养后的人ES细胞向视网膜色素上皮细胞的分化。于该培养时间以后，发现显示出存在量的特征性经时变化的指标物质。关于腺苷(图6c的(K))及肌苷(图6c的(L))，于人ES细胞中，在确认到分化的培养时间42天以后，与人iPS细胞相比稳定地显示出高值。另一方面，关于脯氨酸(图6b的(G))，于人ES细胞中，在培养时间20天以后，显示出存在量的降低倾向。尤其是，于确认到分化的培养时间42天以后，成为不含细胞的培养基(空白)中的存在量水准以下。这些指标物质的特征性经时变化由于在未向视网膜色素上皮细胞进行分化的人ES细胞中未观察到，因此可用于确认人ES细胞向视网膜色素上皮细胞进行了分化。

Claims (23)

1.一种方法，其是在自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中，对所述多能干细胞的分化状态进行评价的方法，包括：
步骤1：对多能干细胞的培养上清液中的指标物质存在量进行测定的步骤；以及
步骤2：基于所述指标物质存在量的变化，对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价的步骤，
所述指标物质为鸟氨酸及/或瓜氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中于所述步骤2中，通过对培养上清液中的所述指标物质存在量的经时变化进行分析，来评价多能干细胞的分化状态。
3.根据权利要求2所述的方法，其中将所述多能干细胞的培养基自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期设为第0天时，对所述经时变化进行分析的期间为第0天至第20天为止的期间。
4.根据权利要求2所述的方法，其中将所述多能干细胞的培养基自细胞增殖用培养基置换为细胞分化用培养基的日期设为第0天时，对所述经时变化进行分析的期间为第3天至第12天为止的期间。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述经时变化判定为大的情况下，评价为进行自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞分化的可能性高。
6.根据权利要求1所述的方法，其中于所述步骤1中，对作为所述指标物质的鸟氨酸及瓜氨酸存在量进行测定，且于鸟氨酸及瓜氨酸存在量的经时变化实质上相同的情况下，评价为进行自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞分化。
7.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中于所述步骤2中，基于与所述指标物质存在量相关的变动系数的阈值，对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价。
8.根据权利要求7所述的方法，其中于所述变动系数的阈值与鸟氨酸存在量相关而为0.20以上及/或与瓜氨酸存在量相关而为0.30以上的情况下，评价为进行自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞分化。
9.根据权利要求1所述的方法，其进而包括：
步骤3：对已知细胞分化状态的对照细胞的培养上清液中的指标物质存在量进行测定的步骤，并且
通过对所述步骤1中进行测定的所述多能干细胞的培养上清液中的所述指标物质存在量、与所述步骤3中进行测定或已测定的所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质存在量进行比较，来对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价。
10.根据权利要求9所述的方法，其中基于所述多能干细胞的培养上清液中的所述指标物质存在量、与所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质存在量的比或差是否为预先规定的阈值以上、或者是否小于阈值，对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价。
11.根据权利要求9所述的方法，其中通过对所述多能干细胞的培养上清液中的指标物质存在量的经时变化、与所述对照细胞的培养上清液中的指标物质存在量的经时变化进行比较，来对自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述对照细胞为于自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中维持未分化的状态的细胞。
13.根据权利要求1所述的方法，其进而包括：
步骤4：将于自多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中确认到细胞的分化的细胞设为对照细胞，并预先对所述对照细胞的培养上清液中的指标物质存在量进行测定，并且
通过对所述多能干细胞的培养上清液中的指标物质存在量、与所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质存在量进行比较，来评价细胞的分化状态。
14.根据权利要求13所述的方法，其中基于根据所述对照细胞的培养上清液中的指标物质存在量而规定的阈值，评价细胞的分化状态。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞为诱导性多能干细胞或胚胎干细胞。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中利用质谱法对所述指标物质存在量进行测定。
17.一种自多能干细胞制造视网膜色素上皮细胞的方法，其使用根据权利要求1至16中任一项所述的方法。
18.一种方法，其是在自胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中，对所述胚胎干细胞的分化状态进行评价的方法，包括：
步骤1：对胚胎干细胞的培养上清液中的指标物质存在量进行测定的步骤；以及
步骤2：基于所述指标物质存在量的变化，对自胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价的步骤，
所述指标物质为选自由谷胱甘肽、鸟氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、六氢烟碱酸、腐胺、脯氨酸、2-氨基己二酸、胞苷、脱氧胞苷、腺苷及肌苷所组成的群组中的至少一种。
19.一种方法，其是在自胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中，对所述胚胎干细胞的分化状态进行评价的方法，包括：
步骤1：对胚胎干细胞的培养上清液中的指标物质存在量进行测定的步骤；以及
步骤2：基于所述指标物质存在量的变化，对自胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价的步骤，
所述指标物质为选自由谷胱甘肽、鸟氨酸、瓜氨酸、六氢烟碱酸、2-氨基己二酸、胞苷及脱氧胞苷所组成的群组中的至少一种。
20.一种方法，其是在自胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导步骤中，对所述胚胎干细胞的分化状态进行评价的方法，包括：
步骤1：对胚胎干细胞的培养上清液中的指标物质存在量进行测定的步骤；以及
步骤2：基于所述指标物质存在量的变化，对自胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞的细胞的分化状态进行评价的步骤，
所述指标物质为腺苷及/或肌苷。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中于所述步骤2中，通过对培养上清液中的所述指标物质存在量的经时变化进行分析，来评价所述胚胎干细胞的分化状态。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中利用质谱法对所述指标物质存在量进行测定。
23.一种自胚胎干细胞制造视网膜色素上皮细胞的方法，其使用根据权利要求18至22中任一项所述的方法。
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