CN112189049B - 来源于多能干细胞的结膜细胞的诱导方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及结膜上皮干/祖细胞的诱导方法，其特征在于，使用含有EGF(表皮生长因子)信号转导活化因子的培养基培养多能干细胞的集落，并诱导分化。通过本发明，能够由包括iPS细胞的多能干细胞诱导为结膜上皮细胞、结膜杯状细胞、结膜上皮干/祖细胞，因此对结膜上皮细胞、结膜杯状细胞的基础研究、难治性眼表疾病的再生医疗或所述疾病相关的研究等方面极为有用。

Description

来源于多能干细胞的结膜细胞的诱导方法
技术领域
本发明涉及一种来源于多能干细胞的结膜细胞的诱导方法。更详细而言，涉及一种由多能干细胞诱导为结膜细胞的方法及其利用。
背景技术
眼表面覆盖有结膜上皮及角膜上皮，结膜上皮具有向泪液中分泌黏蛋白、眼表面的屏障功能等作用，角膜上皮具有光的透射/折射、保护眼球等作用。即，在眼表面的稳态维持中，结膜上皮和角膜上皮均发挥着不可欠缺的重要作用。
对人角膜上皮的研究比较有进展，例如本申请的发明人报道了，作为角膜上皮干细胞衰竭症等重度角膜疾病的新型治疗方法，开发了一种由iPS细胞制备角膜上皮细胞片(cell sheet)的技术，并使用动物模型确认了其有效性等(参考专利文献1、非专利文献1、2)。
然而，对于人结膜上皮，还有很多不清楚的地方。作为其理由，可列举出难以获得人结膜上皮、及结膜上皮在体外培养困难的点。
另一方面，报道了生物体中的结膜上皮由结膜上皮细胞及结膜杯状细胞构成，这些细胞由存在于基底部的结膜上皮干/祖细胞分化而成(非专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2016/114285号
非专利文献
非专利文献1：Hayashietal.,NatureProtocols,2017,12(4),683-696,doi:10.1038/nprot.2017.007
非专利文献2：Hayashietal.,Nature.2016Mar17,531,376-80,doi:10.1038/nature17000
非专利文献3：Gipson.I.K.,Progress inRetinal andEye Research,2016,54,49-63
发明内容
本发明要解决的技术问题
然而，由结膜上皮干/祖细胞分化为两种细胞(结膜上皮细胞及结膜杯状细胞)的详细机理尚未解明，且能够维持这两种细胞(特别是结膜杯状细胞)的培养方法也尚未建立。
目前，由于使用了人源细胞的研究较为困难，因此结膜上皮相关的研究不得不依赖于动物实验。然而，由于小鼠或兔的结膜上皮与人的结膜上皮的性状的差异较大，因此难以将由动物得到的结果直接推导于人。并且，在实际的医疗环境中，由结膜杯状细胞的减少引起的黏蛋白缺乏型干眼症也在近年来成为问题，但有效的治疗药有限。因此，结膜上皮相关的研究受到了基础研究以及临床研究这两者的关注。
本发明涉及一种可适用于再生医疗等的来源于多能干细胞的结膜细胞的诱导方法及其利用。
解决技术问题的技术手段
本申请的发明人为了解决上述技术问题进行了认真研究，其结果，在形成按照非专利文献1中记载的方法而得到的同心圆状的带状结构(自我形成的外胚层自主性多区，aself-formed ectodermal autonomous multi-zone：SEAM)时，通过在特定的条件下进行培养，首次成功地以结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及结膜上皮干/祖细胞占优势的状态进行了诱导分化，从而完成了本发明。
此外，在使用SSEA-4、CD200、ITGβ4这三种抗体对诱导分化后的细胞群体进行染色后，通过对利用FACS得到的各区域进行详细地分析，鉴定出这些细胞出现的区域，成功地进行了分离及浓缩。进一步，通过对分离的细胞进行培养，首次成功地在体外维持结膜杯状细胞并培养了结膜上皮细胞。
即，本发明涉及以下的[1]～[11]。
[1]一种结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及结膜上皮干/祖细胞的诱导方法，其特征在于，使用含有EGF(表皮生长因子)信号转导活化因子的培养基培养多能干细胞的集落，并诱导分化。
[2]根据所述[1]所述的诱导方法，其中，使用含有EGF信号转导活化因子的培养基培养多能干细胞的集落，形成SEAM细胞群体(自我形成的外胚层自主性多区细胞群体)。
[3]一种结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及结膜上皮干/祖细胞的制备方法，其特征在于，使用含有EGF(表皮生长因子)信号转导活化因子的培养基培养多能干细胞的集落，形成SEAM细胞群体(自我形成的外胚层自主性多区细胞群体)，并以ITGβ4、SSEA-4及CD200的抗体的表达水平为指标，从所述SEAM细胞群体中分离细胞。
[4]根据所述[3]所述的制备方法，其中，分离的细胞为CD200阴性。
[5]根据所述[3]或[4]所述的制备方法，其中，分离的细胞为SSEA-4弱阳性/ITGβ4阳性细胞。
[6]根据所述[5]所述的制备方法，其中，分离的细胞为结膜上皮干/祖细胞。
[7]根据所述[3]或[4]所述的制备方法，其中，分离的细胞选自SSEA-4弱阳性/ITGβ4阴性细胞及SSEA-4阳性/ITGβ4阴性细胞。
[8]根据所述[7]所述的制备方法，其中，分离的细胞为结膜上皮细胞和/或结膜杯状细胞。
[9]一种结膜上皮细胞片的制备方法，其包含使用含有KGF(角质细胞生长因子)的培养基培养通过所述[1]～[6]中任一项所述的方法得到的结膜上皮干/祖细胞的工序。
[10]一种结膜上皮细胞片的制备方法，其包含使用含有FGFR2b(成纤维细胞生长因子受体2b)活化因子的培养基培养通过所述[1]～[6]中任一项所述的方法得到的结膜上皮干/祖细胞的工序。
[11]一种结膜相关的疾病的药物筛选方法，其包含培养通过所述[1]～[8]中任一项所述的方法得到的结膜上皮细胞、结膜杯状细胞和/或结膜上皮干/祖细胞的工序。
发明效果
根据本发明，可由多能干细胞大量地制备结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及结膜上皮干/祖细胞，对结膜上皮的基础研究和临床研究做出很大贡献。此外，可重建功能性结膜上皮组织，进而能够提供一种使用片移植等、针对干眼症等的由结膜细胞自身异常而导致的疾病的根本性再生医疗方法或新时代的治疗方法。
此外，还可应用于迄今为止因难以获得结膜细胞而尚未实施的、以结膜细胞为靶标的药物筛选等。
附图说明
图1为示出了由iPS细胞诱导为结膜细胞的过程的示意性的一个实例的图。
图2为示出了对SEAM细胞群体进行分选的结果的一个实例的图。
图3为示出了由iPS细胞诱导分化而成的各区域中含有的细胞的基因表达分析的结果的图表。
图4为示出了来源于iPS细胞的结膜杯状细胞及结膜上皮细胞的免疫荧光染色与PAS染色的结果的图。
图5为示出了对基于来源于iPS细胞的结膜上皮干/祖细胞的片化进行研究的结果的图。
图6为示出了来源于iPS细胞的结膜上皮细胞片与人正常细胞的基因表达分析的结果的图表。
图7为示出了来源于iPS细胞的结膜上皮细胞片的免疫荧光染色(平面标本)的结果的图。
图8为示出了来源于iPS细胞的结膜上皮细胞片的免疫荧光染色(切片标本)的结果的图。
图9为示出了来源于iPS细胞的结膜上皮细胞片的免疫荧光染色(平面标本)的结果的图(使用了用除EGF以外的EGF信号活化因子诱导而成的来源于iPS细胞的结膜上皮干/祖细胞的结膜上皮细胞片)。
图10为示出了来源于iPS细胞的结膜上皮细胞片的基因表达分析的结果的图表(在含有除KGF以外的FGFR2b活化因子FGF10的培养基中成熟的结膜上皮细胞片)。
具体实施方式
迄今为止，本申请的发明人由iPS细胞取得了可再现整个眼睛的发育的细胞群体(自我形成的外胚层自主性多区：SEAM)，在从得到的细胞群体中分离特定的祖细胞后，通过对该细胞进行诱导分化，并根据需要进行成熟培养，制备高纯度的细胞群体，例如角膜上皮细胞等。在此，在诱导分化为角膜上皮细胞时，在形成了iPS细胞的集落后，使用含有KGF(角质细胞生长因子)等生长因子的分化培养基进行培养，形成SEAM细胞群体，从中分离并培养所需的区域，进行诱导分化，但由于得到的细胞群体中的角膜上皮细胞的比例高，因此对于其他的上皮细胞，尚有很多不清楚的点。因此，本申请的发明人对结膜上皮细胞占优势的诱导分化方法进行了认真研究，结果发现，在所述方法中，在形成SEAM细胞群体时，通过在EGF(表皮生长因子)信号转导活化因子(后文中有时简记作EGF)的存在下培养iPS细胞的集落，其中除了分化的结膜上皮细胞与结膜杯状细胞以外，作为主体，能够诱导分化为未分化状态的结膜上皮干/祖细胞。由此，本申请的发明人首次发现了，通过分别以添加了KGF的体系与添加了EGF的体系对会诱导为同种类的眼表上皮细胞的iPS细胞的集落进行分化培养，可使诱导的上皮细胞的种类不同。
本发明提供一种结膜细胞的诱导分化方法，其具有以下特征：在由多能干细胞形成SEAM细胞群体(自我形成的外胚层自主性多区细胞群体)时，用特定的培养基培养得到的多能干细胞的集落。具体而言，在使多能干细胞自发分化形成集落后，使用含有EGF信号转导活化因子的培养基培养，进行诱导分化，形成SEAM细胞群体。由此，在得到的SEAM细胞群体中，能够以ITGβ4、SSEA-4及CD200的抗体的表达水平为指标分离结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及结膜上皮干/祖细胞。
在本发明中，首先，由多能干细胞制备SEAM细胞群体用的集落。
本发明中的多能干细胞是指具有可分化为生物体中存在的所有细胞的多能性且同时具有增殖能力的干细胞。具体而言，例如可列举出精原干细胞(GS细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)、来源于培养成纤维细胞或骨髓干细胞的多能性细胞(Muse细胞)等。优选iPS细胞。多能干细胞优选为哺乳动物的多能干细胞。哺乳动物没有特别限定，可列举出人、小鼠、大鼠、牛、猪等。其中优选人。通过使用人多能干细胞，能够获得与可利用于人的再生医疗的安全的细胞种类对应的细胞群体。
SEAM细胞群体用的集落是指不使用饲养细胞，通过在无血清培养基中对多能干细胞进行二维培养而得到的、由不同的外胚层类细胞种类构成的同心圆状的层组成的集落。
具体而言，例如可通过使用无调整或不含有未纯化的血清的培养基对人源iPS细胞进行二维培养而得到，所述培养基为可用于动物细胞培养的公知培养基(例如DMEM培养基、BME培养基等)。此时，作为培养容器，只要可用于二维的细胞培养则没有特别限定，但优选用胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或层粘连蛋白片段等对容器的内表面进行包被。另外，培养条件没有特别限定，可根据技术常识进行适当设定。
通过上述方式培养得到的SEAM细胞群体用的集落为不受到来自分化诱导剂或分化诱导促进剂等外部的刺激，而是由细胞本身自发分化而形成的集落，形成由外胚层类细胞种类构成的层状集落。集落从中心部向周边部，由以各种不同的外胚层类细胞种类构成的同心圆状的层组成，包括第一层(神经外胚层类型细胞)、第二层(神经嵴类型细胞/眼杯类型细胞)、第三层(眼表面外胚层类型细胞)及第四层(表面外胚层类型细胞)。另外，作为所述制备方法，例如可参考非专利文献1、2及专利文献1中记载的方法。
由于得到的集落的各层中含有的细胞种类为不同的类型，因此可以利用这一点分离特定的层中含有的细胞而进行使用，也可直接使用整个集落。
由此，作为本申请说明书中的SEAM细胞群体用的集落，例如可列举出以下的细胞群体：以100～700个细胞/cm2的密度将多能干细胞接种于包被了层粘连蛋白511E8的培养板上，在StemFit(注册商标)培养基(AJINOMOTO CO.,INC.)中维持8～10天后，在分化培养基[DM；含有10％knockout血清替代物(KSR，Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(LifeTechnologies)、0.1mM非必需氨基酸(Life Technologies)、2mM L-谷氨酰胺(LifeTechnologies)、1％青链霉素混合液(Life Technologies)及55μM 2-巯基乙醇(LifeTechnologies)的GMEM培养基(Life Technologies)]中培养4周，使其自发诱导分化而得到的细胞群体。
然后，使用特定的分化培养基培养得到的SEAM细胞群体用的集落。另外，有时将在此使用的培养基记作结膜用分化培养基。
结膜用分化培养基含有EGF信号转导活化因子。作为EGF信号转导活化因子，只要为经由EGF受体发挥作用的因子则没有特别限定。例如可列举出表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、双调蛋白(AR)、cripto、痘苗病毒生长因子(VVGF)、肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)、neu分化因子/heregulin(NDF/HRG)等。培养基中的浓度通常为0.01～1000ng/mL，优选为0.1～100ng/mL。
除了EGF信号转导活化因子以外，结膜用分化培养基含有Rock抑制剂等。基础培养基只要为在自发分化中使用的培养基等的可用于培养上皮细胞的培养基(无血清培养基)，则可使用任意的培养基。另外，“Rock抑制剂”是指抑制Rho激酶(ROCK:Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶)的物质，例如可利用N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-甲酰胺(Y-27632)、Fasudil(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]六氢-1H-1,4-二氮杂卓(H-1152)、4β-[(1R)-1-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1α甲酰胺(Wf-536)、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α甲酰胺(Y-30141)、N-(3-{[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-吗啉基)乙基]-氧基}苯甲酰胺(GSK269962A)、N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-氧代-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氢-1H-吡啶-5-甲酰胺(GSK429286A)。
在所述培养基中的培养以36～38℃、优选以36.5～37.5℃，在1～25％O2、1～15％CO2的条件下进行。此外，培养时间至少为1～8周，优选为2～6周，更优选为3～5周。另外，培养容器等可使用与在自发分化中使用的容器相同的容器。
通过该培养，出现了眼表上皮干细胞。通过吹打等分离该眼表上皮干细胞，进一步使用结膜上皮用维持培养基进行培养。
对于结膜上皮用维持培养基，为了促进向结膜上皮祖细胞的诱导分化，可进一步在结膜用分化培养基中含有血清替代物。作为“血清替代物”，例如可列举出白蛋白(例如富含脂质的白蛋白)、转铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素(例如锌、硒)、B27(注册商标)补充剂、N2补充剂等。为B27补充剂时，其在培养基中的浓度为0.01～10重量％，优选为0.5～4重量％。
在所述培养基中的培养可以与在结膜用分化培养基中的培养相同的方式进行，以36～38℃、优选以36.5～37.5℃，在1～25％O2、1～15％CO2的条件下进行。此外，培养时间至少为3天～12周，优选为1～8周，更优选为2～6周。另外，培养容器等可使用与在自发分化中使用的容器相同的容器。
此外，除了所述成分以外，在结膜用分化培养基或结膜上皮用维持培养基中，可适当含有细胞的维持增殖所需的各种营养源或诱导分化所需的各成分。作为营养源，例如可含有丙三醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、蜂蜜、淀粉、糊精等碳源；以及脂肪酸、油脂、卵磷脂、醇类等烃类；硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、尿素、硝酸钠等氮源；食盐、钾盐、磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等无机盐类(例如磷酸钾、亚磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁、钼酸钠、钨酸钠、硫酸锰)；各种维生素类；氨基酸类等。这些成分的含量可根据技术常识进行调节。
由此，可由多能干细胞形成结膜细胞，即形成结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及结膜上皮干/祖细胞占优势的SEAM细胞群体。
能够以ITGβ4、SSEA-4及CD200的抗体的表达水平为指标，从在所述诱导方法中形成的SEAM细胞群体中分离结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及结膜上皮干/祖细胞。可见，本发明还提供一种结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及结膜上皮干/祖细胞的制备方法。
在本发明的结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及结膜上皮干/祖细胞的制备方法中，通过本发明的诱导方法形成结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及结膜上皮干/祖细胞占优势的SEAM细胞群体，从该SEAM细胞群体中分离所需的细胞。
作为分离方法，只要能够以所述标志物的表达为指标从SEAM中分离细胞则没有特别限定，可按照常规方法，使用各标志物的特异性抗体而容易地实施。具体而言，例如只要使用基于以抗体进行了标记的磁珠、固定有抗体的色谱柱、使用了经荧光标记的抗体的细胞分选仪(FACS)的分离而进行分离即可。对于抗体，可利用市售的抗体，也可利用按照常规方法制作的抗体。在本发明中，在该分离方法中，根据所述标志物的表达水平选择细胞，因此以下作为该选择方法的一个实例，对利用FACS进行选择的情况举例说明。
首先，对得到的SEAM细胞群体进行CD200的阴性选择(图2左)。然后，对于CD200阴性细胞，检测ITGβ4、SSEA-4的表达(图2右，横轴为SSEA-4，纵轴为ITGβ4)。其中，判断各标志物有无表达，根据该表达水平，划分为SSEA-4阴性/ITGβ4阳性细胞(P1区域)、SSEA-4弱阳性/ITGβ4阳性细胞(P2区域)、SSEA-4阳性/ITGβ4阳性细胞(P3区域)、SSEA-4阴性/ITGβ4阴性细胞(P4区域)、SSEA-4弱阳性/ITGβ4阴性细胞(P5区域)、SSEA-4阳性/ITGβ4阴性细胞(P6区域)。在本发明中，从其中选择并分离SSEA-4弱阳性/ITGβ4阴性细胞(P5区域)、SSEA-4阳性/ITGβ4阴性细胞(P6区域)的区域[将这些区域中含有的细胞统称为SSEA-4阳性～弱阳性/ITGβ4阴性细胞(P5及P6区域)]与SSEA-4弱阳性/ITGβ4阳性细胞(P2区域)中含有的细胞。另外，弱阳性是指表达量比正常细胞相比稍低，在本发明中，包含表现出介于阳性与阴性中间的表达量的性质。
经过选择的SSEA-4阳性～弱阳性/ITGβ4阴性细胞中高表达了MUC5AC(结膜杯状细胞标志物)、K13(结膜上皮细胞标志物)及PAX6(眼细胞标志物)，可以说在P5及P6区域中诱导为结膜上皮细胞和结膜杯状细胞。
此外，SSEA-4弱阳性/ITGβ4阳性细胞中高表达了p63(上皮类干细胞标志物)，且中度表达了K13(结膜上皮细胞标志物)及PAX6(眼细胞标志物)，因此可以说在P2区域中诱导为结膜上皮干/祖细胞。
由此，能够直接使用公知的培养用培养基培养经分离的细胞并进行使用，例如，可使用所述的结膜用培养基或结膜上皮用维持培养基进行培养，也可使用含有其他生长因子的培养用培养基进行培养。
得到的细胞可用于各种用途。具体而言，例如，由于P5及P6区域的细胞为已经分化的状态，因此可考虑将其适用于结膜上皮细胞及结膜杯状细胞的详细分析、最佳培养条件的研究、药物筛选试验等基础研究领域。此外，由于P2区域的细胞能够通过培养而诱导分化为结膜上皮细胞或结膜杯状细胞，因此其能够用于移植用结膜上皮细胞片的制备或结膜上皮组织的最佳培养条件的研究。因此，本发明还提供一种结膜上皮细胞片的制备方法，其包含培养通过本发明的诱导方法得到的结膜上皮干/祖细胞的工序。作为其具体方式，例如可列举出一种移植用结膜上皮细胞片的制备方法，其包含培养通过本发明的诱导方法得到的结膜上皮干/祖细胞的工序。可期待将得到的结膜上皮细胞片适用于结膜上皮功能障碍相关的眼部疾病(例如黏蛋白减少型干眼症)。另外，作为添加在用于培养所述结膜上皮干/祖细胞的培养基中的生长因子，没有特别限定，但优选至少含有KGF。此外，还可添加FGFR2b(成纤维细胞生长因子受体2b)活化因子(例如FGF10等)。所述生长因子在培养基中的浓度通常为0.1～1000ng/mL，优选为1～100ng/mL。
此外，本发明提供一种使用结膜上皮组织进行筛选的方法，所述结膜上皮组织由通过本发明的诱导方法得到的结膜上皮细胞及结膜杯状细胞、或将通过本发明的诱导方法得到的结膜上皮干/祖细胞诱导分化而得到的结膜上皮细胞及结膜杯状细胞构成。具体而言，例如可列举出以下方式：在所述结膜上皮组织中，将编码功能蛋白的基因的表达或功能蛋白的活性作为指标，选择促进表达或促进活性的物质作为用于治疗结膜相关的疾病的候补化合物。具体而言，例如，在接触被测物的结膜上皮组织中，测定编码功能蛋白的基因的表达量或功能蛋白的活性值，若其高于未接触被测物的对照细胞的表达量或活性值，则可选择被测物作为用于治疗结膜相关的疾病的候补化合物。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但这些实施例为本发明的一个实例，本发明并不受这些实施例的限定。另外，在后文中，室温表示25℃。
实施例1眼表干细胞的诱导
在由iPS细胞的诱导分化中，使用了自我形成的外胚层自主性多区(SEAM)法(Hayashietal.Nature.2016Mar17；531(7594):376-80.,Hayashietal.,NatureProtocols,2017,12(4),683-696,doi:10.1038/nprot.2017.007)。
具体而言，以300～700个细胞/cm2的密度将人源iPS细胞株(201B7)接种于包被了层粘连蛋白511E8的培养板上，在StemFit(注册商标)培养基(AJINOMOTO CO.,INC.)中维持8～10天后，使用分化培养基[DM；含有10％knockout血清替代物(KSR，LifeTechnologies)、1mM丙酮酸钠(Life Technologies)、0.1mM非必需氨基酸(LifeTechnologies)、2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)、1％青链霉素混合液(LifeTechnologies)及55μM 2-巯基乙醇(Life Technologies)的GMEM培养基(LifeTechnologies)]培养4周。然后，使用结膜用分化培养基[CjDM；含有10ng/mL EGF(R&DSystems)、10μM Y-27632(Wako)及1％青链霉素混合液的DM培养基与Cnt-20或Cnt-PR培养基(不含有EGF及FGF2，CellnTEC Advanced Cel l Systems)的1:1(v/v)混合培养基]培养4周后，更换为结膜上皮用维持培养基[CjEM；含有2％B27补充剂(Life Technologies)、1％青链霉素混合液、10ng/mL EGF、10μM Y-27632的DMEM/F-12(2:1(v/v))培养基(Life Technologies)]后进一步培养2～4周左右，进行诱导分化。将时间进度表示于图1。
实施例2利用FACS提取靶细胞
使用细胞分选仪SH800(SONY)进行分选，从实施例1中得到的SEAM细胞群体中提取CD200阴性细胞后，使用SSEA-4、ITGβ4进行展开，划分为图2所示的6个区域。各区域的定义为SSEA4-阴性/ITGβ4阳性细胞(P1区域)、SSEA-4弱阳性/ITGβ4阳性细胞(P2区域)、SSEA-4阳性/ITGβ4阳性细胞(P3区域)、SSEA-4阴性/ITGβ4阴性细胞(P4区域)、SSEA-4弱阳性/ITGβ4阴性细胞(P5区域)、SSEA-4阳性/ITGβ4阴性细胞(P6区域)。
实施例3基因表达分析
使用QIAzol裂解液(QIAGEN)分别回收实施例2中得到的6个区域，供于RT-qPCR，对各种标志物的表达进行评价。将结果示于图3。另外，图中为来源于P4区域的细胞(n＝3)、来源于其他区域的细胞(n＝5)的结果，误差条表示标准误差。
通过图3，在P2区域中，p63(上皮类干细胞标志物)为高表达，K13(结膜上皮细胞标志物)及PAX6(眼细胞标志物)为中度表达，K12(角膜上皮细胞标志物)为低表达，确认到了结膜上皮干/祖细胞的表现型。此外，在P5及P6区域中，MUC5AC(结膜杯状细胞标志物)、K13及PAX6为高表达，p63为低表达，确认到了结膜杯状细胞及结膜上皮细胞的表现型。
实施例4免疫荧光染色
使用BD Cytofix/Cytoperm(注册商标)试剂盒(554714，BD Biosciences)固定实施例2中提取的来源于P5及P6区域的细胞，进行膜通透处理，然后以成为50,000个细胞/mL的方式将其混悬于DMEM/F12培养基中，设为200μL/管(column)，使用Cytospin(A78300003，Thermo Fisher Scientific)在载玻片上制备细胞标本。然后，使用5％NST(含有5％正常驴血清、0.3％Triton的TBS；T903，TaKaRaBio)封闭(室温，1小时)后，使用抗MUC5AC抗体(1:200；sc-21701，Santa CruzBiotechnology)、抗K13抗体(1:200；ab16112,abcam)、抗K12抗体(1:200；sc-17098，Santa Cruz Biotechnology)，抗PAX6抗体(1:300；PRB-278P，COVANCE)进行第一抗体反应(4℃，过夜)。使用TBS清洗2次，每次5分钟，然后使用以AlexaFluor488、AlexaFluor568或AlexaFluor647标记的第二抗体(1:200；LifeTechnologies)及Hoechst33342(1:100；H3570，MolecularProbes)进行处理(室温，1小时)后，使用荧光显微镜进行观察。将结果示于图4。
此外，使用BD Cytofix/Cytoperm(注册商标)试剂盒固定来源于P5及P6区域的细胞，进行膜通透处理，然后使用PAS染色试剂盒(101646，MerckKGaA)进行染色，使用倒置显微镜进行观察。将结果示于图4。
通过图4，在P5及P6区域中确认到了K13+、K12-且PAX6+的结膜上皮细胞(图4的b)、MUC5AC+且PAX6+的结膜杯状细胞(图4的c)。此外，还确认到了PAS+细胞(图4的d)。
实施例5来源于人源iPS细胞的结膜上皮干/祖细胞的培养
将以与实施例2相同的方式得到的来源于P2区域的细胞在使用层粘连蛋白511E8片段(0.5μg/cm2)进行了包被的细胞培养用小室(insert)中培养2～3周。培养中使用了KGF培养基[含有10ng/mLKGF(Wako)、10μMY-27632、2％B27补充剂及1％青链霉素混合液的DMEM/F-12]或EGF培养基[含有10ng/mL EGF、10μMY-27632、2％B27补充剂及1％青链霉素混合液的DMEM/F-12]。
对于利用FACS提取的P2区域(图5的a)，在培养后的相差显微镜照片中，在所有培养条件下均确认到了细胞的片化(图5的b)。
此外，参考实施例3，进行培养前后的来源于P2区域的细胞及人正常细胞的基因表达分析，其结果发现，与培养前相比，仅在使用KGF培养基培养来源于P2区域的细胞时MUC5AC表达上调。进一步确认到，来源于P2区域的细胞为K13高表达、PAX6中度表达、K12低表达，表现出与人正常结膜细胞相同的表现型(图6)。另外，图中为来源于P2区域的培养前细胞(n＝5)、来源于P2区域的培养后细胞(n＝4)、人正常细胞(n＝1)的结果，误差条表示标准误差。
然后，回收细胞培养用小室中培养的来源于P2区域的细胞片后，对于平面标本用，使用甲醇(131-01826，Wako)进行固定(室温，20分钟)，然后进行染色。此外，对于切片标本用，将其包埋在O.C.T.冰冻切片包埋剂(4583，Tissue-Tek)中，于-80℃进行保存后，在低温恒温器中制作5μm的切片，在室温下干燥30分钟以上后，使用甲醇进行固定(室温，20分钟)，然后进行染色。对于染色，通过使用5％NST封闭(室温，1小时)后，使用抗MUC5AC抗体(1:200)、抗K13抗体(1:200)、抗K12抗体(1:200)、抗PAX6抗体(1:300)进行第一抗体反应(4℃，过夜)。在使用TBS清洗2次，每次5分钟，然后使用以AlexaFluor488或AlexaFluor568标记的第二抗体(1:200)及Hoechst33342(1:100)进行处理(室温，1小时)后，使用荧光显微镜进行观察。
在平面标本的免疫荧光染色中，仅在使用KGF培养基进行培养时确认到了MUC5AC+细胞(图7)。此外，在切片标本的免疫荧光染色中，仅在使用KGF培养基进行培养时，确认到了MUC5AC+、K13+、PAX6+且K12-的结膜上皮细胞的表现型(图8)。
实施例6EGF信号转导活化因子的研究
除了在实施例1中将结膜用分化培养基中的EGF变更为转化生长因子α(TGFα)或双调蛋白(AR)以外，以与实施例1相同的方式进行诱导分化。然后，以与实施例2相同的方式提取来源于P2区域的细胞后，以与实施例5相同的方式在KGF培养基中培养，对得到的细胞片进行染色。确认MUC5AC的表达。
结果确认到即使使用除EGF以外的EGF信号转导活化因子，也能够制备含有MUC5AC阳性细胞的结膜上皮细胞片(图9)。
实施例7结膜上皮干/祖细胞的生长因子的研究
除了将实施例5中的结膜上皮干/祖细胞的培养用培养基中的KGF变更为FGFR2b活化因子(FGF10)以外，以与实施例5相同的方式进行培养，将得到的细胞片以与实施例3相同的方式供于RT-qPCR，对MUC5AC的表达量进行评价。
结果显示即使使用FGF10，也能够制备表达了MUC5AC的结膜上皮细胞片(图10)。
工业实用性
通过本发明，能够由包括iPS细胞的多能干细胞诱导为结膜上皮细胞、结膜杯状细胞、结膜上皮干/祖细胞，因此对结膜上皮细胞、结膜杯状细胞的基础研究、难治性眼表疾病的再生医疗或所述疾病相关的研究等极为有用。

Claims (10)

1.一种结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及结膜上皮干/祖细胞的诱导方法，其特征在于，使用含有EGF(表皮生长因子)信号转导活化因子的培养基培养多能干细胞的集落，形成SEAM细胞群体(自我形成的外胚层自主性多区细胞群体)，所述方法包括以下步骤：
(1)以300～700个细胞/cm2的密度将多能干细胞接种于包被了层粘连蛋白511E8的培养板上，维持培养8～10天，使用不含有血清的动物细胞培养用培养基二维培养4周，使该多能干细胞自发诱导分化得到SEAM细胞群体用的集落；以及
(2)将得到的SEAM细胞群体用的集落在含有0.1～100ng/mL EGF(表皮生长因子)信号转导活化因子及Rock抑制剂的上皮细胞培养用培养基中培养3～5周，然后在含有0.1～100ng/mLEGF信号转导活化因子、Rock抑制剂及血清替代物的上皮细胞培养用培养基中培养2～6周，进行诱导分化，得到能够以ITGβ4、SSEA-4及CD200的表达水平为指标而分离结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及结膜上皮干/祖细胞的SEAM细胞群体，
其中所述EGF(表皮生长因子)信号转导活化因子选自表皮生长因子EGF，TGFα和双调蛋白AR。
2.一种结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及结膜上皮干/祖细胞的制备方法，其特征在于，使用含有EGF(表皮生长因子)信号转导活化因子的培养基培养多能干细胞的集落，形成SEAM细胞群体(自我形成的外胚层自主性多区细胞群体)，所述方法包括以下步骤：
(1)以300～700个细胞/cm2的密度将多能干细胞接种于包被了层粘连蛋白511E8的培养板上，维持培养8～10天，使用不含有血清的动物细胞培养用培养基二维培养4周，使该多能干细胞自发诱导分化得到SEAM细胞群体用的集落；以及
(2)将得到的SEAM细胞群体用的集落在含有0.1～100ng/mL EGF(表皮生长因子)信号转导活化因子及Rock抑制剂的上皮细胞培养用培养基中培养3～5周，然后在含有0.1～100ng/mLEGF信号转导活化因子、Rock抑制剂及血清替代物的上皮细胞培养用培养基中培养2～6周，进行诱导分化，以ITGβ4、SSEA-4及CD200的表达水平为指标，从得到的SEAM细胞群体中分离细胞，
其中所述EGF(表皮生长因子)信号转导活化因子选自表皮生长因子EGF，TGFα和双调蛋白AR。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，分离的细胞为CD200阴性。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，分离的细胞为SSEA-4弱阳性/ITGβ4阳性细胞。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，分离的细胞为结膜上皮干/祖细胞。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其中，分离的细胞选自SSEA-4弱阳性/ITGβ4阴性细胞及SSEA-4阳性/ITGβ4阴性细胞。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，分离的细胞为结膜上皮细胞和/或结膜杯状细胞。
8.一种结膜上皮细胞片的制备方法，其包含通过权利要求5所述的制备方法分离得到结膜上皮干/祖细胞的工序；以及使用含有KGF(角质细胞生长因子)的培养基培养所得到的结膜上皮干/祖细胞的工序。
9.一种结膜上皮细胞片的制备方法，其包含通过权利要求5所述的制备方法分离得到结膜上皮干/祖细胞的工序；以及使用含有FGFR2b(成纤维细胞生长因子受体2b)活化因子的培养基培养所得到的结膜上皮干/祖细胞的工序。
10.一种结膜相关的疾病的药物筛选方法，其包含通过权利要求5或7所述的制备方法分离得到结膜上皮细胞、结膜杯状细胞和/或结膜上皮干/祖细胞的工序；以及培养所得到的结膜上皮细胞、结膜杯状细胞和/或结膜上皮干/祖细胞的工序。
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