KR20210015789A - 다능성 줄기세포 유래 결막세포의 유도 방법 - Google Patents

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Abstract

다능성 줄기세포의 콜로니를 EGF(Epidermal Growth Factor) 시그널 전달 활성화 인자를 포함하는 배지에서 배양하여 분화 유도시키는 것을 특징으로 하는, 결막상피세포, 결막배상세포 및 결막상피줄기·전구 세포의 유도 방법.
본 발명에 의해, iPS 세포를 포함하는 다능성 줄기세포로부터 결막상피세포, 결막배상세포, 결막상피줄기·전구 세포를 유도할 수 있으므로, 결막상피세포, 결막배상세포의 기초 연구, 난치성 눈 표면 질환에 대한 재생치료나 상기 질환과 관련된 연구 등에 극히 유용하다.

Description

다능성 줄기세포 유래 결막세포의 유도 방법
본 발명은, 다능성 줄기세포 유래 결막세포의 유도 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 다능성 줄기세포로부터 결막세포를 유도하는 방법 및 그 사용에 관한 것이다.
눈 표면은 결막상피 및 각막상피로 피복되어 있고, 결막상피는 눈물 중으로의 뮤신 분비, 눈 표면의 배리어 기능 등, 각막상피는 광의 투과·굴절, 안구보호 등의 역할이 있다. 즉, 눈 표면의 항상성 유지에는 어느 것도 빠뜨릴 수 없는 중요한 역할을 담당하고 있다.
인간 각막상피에 관한 연구는 비교적 발전되어 있으며, 예를 들면, 본원의 발명자들은, 각막상피줄기세포 피폐증 등의 위독한 각막질환에 대한 신규치료법으로서, iPS 세포로부터 각막상피세포 시트를 제작하는 기술을 개발하여, 동물 모델을 사용하여 그 유효성 등을 확인한 것을 보고하고 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 1, 2 참조).
그러나, 인간 결막상피에 대해서는 불분명한 점이 많다. 그 이유로서, 인간 결막상피의 입수가 곤란한 것, 및 결막상피의 in vitro에서의 배양이 곤란한 점을 예로 들 수 있다.
한편, 생체 중의 결막상피는, 결막상피세포 및 결막배상세포로 구성되어 있고, 이 세포는 기저부(基底部)에 존재하는 결막상피줄기·전구 세포로부터 분화되는 것으로 보고되어 있다(비특허문헌 3).
WO2016/114285호
Hayashi et al., Nature Protocols, 2017, 12(4), 683-696, doi: 10.1038/nprot.2017.007 Hayashi et al., Nature.2016 Mar 17, 531, 376-80, doi: 10.1038/nature17000 Gipson.I.K., Progress in Retinal and Eye Research, 2016, 54, 49-63
그러나, 결막상피줄기·전구 세포로부터 2종의 세포(결막상피세포 및 결막배상세포)로의 상세한 분화 기구(機構)는 불분명하며, 또한 이들 2종의 세포(특히 결막배상세포)를 유지 가능한 배양법도 확립되어 있지 않다.
결막상피에 관한 연구는, 인간 유래의 세포를 사용한 연구가 곤란하므로, 동물실험에 의지하지 않을 수 없는 것이 현재 실정이다. 그러나, 마우스나 토끼의 결막상피는 인간의 것과는 성상(性狀)이 크게 다르므로, 동물로부터 얻어진 결과를 그대로 인간에게 외삽(外揷)하는 것은 곤란하다. 또한 실제의 의료현장에서도, 결막배상세포의 감소에 의한 뮤신 결핍형 안구 건조증은 최근 문제가 되고 있지만, 유효한 치료약은 한정되어 있다. 이와 같이 결막상피에 관한 연구는, 기초 연구 및 임상 연구의 양쪽으로부터 주목받고 있다.
본 발명은, 재생 의료 등에 적용 가능한 다능성 줄기세포 유래 결막세포의 유도 방법 및 그 사용에 관한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해 예의(銳意) 검토한 결과, 본 발명자들은 비특허문헌 1에 기재된 방법에 따라 얻어지는 동심원형의 띠형 구조(a self-formed ectodermal autonomous multi-zone: SEAM)를 형성할 때, 특정 조건 하에서 배양함으로써, 결막상피세포, 결막배상세포 및 결막상피줄기·전구 세포가 우위한 상태로 분화 유도할 수 있는 것에 처음으로 성공하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
또한, 분화 유도 후의 세포 집단을 SSEA-4, CD200, ITGβ4의 3종의 항체로 염색 후, FACS에 의해 얻어진 각 획분을 상세하게 분석함으로써, 이들 세포가 출현하는 획분을 특정하고, 단리·농축하는 것에 성공했다. 또한, 단리된 세포를 배양함으로써, in vitro에서 결막배상세포를 유지하면서 결막상피세포를 배양하는 것에 처음으로 성공했다.
즉, 본 발명은, 이하의 [1]∼[11]에 관한 것이다.
[1] 다능성 줄기세포의 콜로니를 EGF(Epidermal Growth Factor) 시그널 전달 활성화 인자를 포함하는 배지에서 배양하여 분화 유도시키는 것을 특징으로 하는, 결막상피세포, 결막배상세포 및 결막상피줄기·전구 세포의 유도 방법.
[2] 다능성 줄기세포의 콜로니를 EGF 시그널 전달 활성화 인자를 포함하는 배지에서 배양하고, SEAM 세포 집단(self-formed ectodermal autonomous multi-zone 세포 집단)을 형성시키는, 상기 [1]에 기재된 유도 방법.
[3] 다능성 줄기세포의 콜로니를 EGF(Epidermal Growth Factor) 시그널 전달 활성화 인자를 포함하는 배지에서 배양하여 SEAM 세포 집단(self-formed ectodermal autonomous multi-zone 세포 집단)을 형성시키고, 상기 SEAM 세포 집단으로부터, ITGβ4, SSEA-4 및 CD200의 항체 발현 정도를 지표로 하여 세포를 단리하는 것을 특징으로 하는, 결막상피세포, 결막배상세포 및 결막상피줄기·전구 세포의 제조 방법.
[4] 단리된 세포가 CD200 음성인, 상기 [3]에 기재된 제조 방법.
[5] 단리된 세포가 SSEA-4 약양성/ITGβ4 양성 세포인, 상기 [3] 또는 [4]에 기재된 제조 방법.
[6] 단리된 세포가 결막상피줄기·전구 세포인, 상기 [5]에 기재된 제조 방법.
[7] 단리된 세포가 SSEA-4 약양성/ITGβ4 음성 세포 및 SSEA-4 양성/ITGβ4 음성 세포로부터 선택되는, 상기 [3] 또는 [4]에 기재된 제조 방법.
[8] 단리된 세포가 결막상피세포 및/또는 결막배상세포인, 상기 [7]에 기재된 제조 방법.
[9] 상기 [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어진 결막상피줄기·전구 세포를 KGF(Keratinocyte Growth Factor)를 포함하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는, 결막상피세포 시트의 제조 방법.
[10] 상기 [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어진 결막상피줄기·전구 세포를 FGFR2b(Fibroblast Growth Factor Receptor 2b) 활성화 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는, 결막상피세포 시트의 제조 방법.
[11] 상기 [1]∼[8] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어진 결막상피세포, 결막배상세포 및/또는 결막상피줄기·전구 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 결막과 관련된 질환의 약제 스크리닝 방법.
본 발명에 의하면, 다능성 줄기세포로부터 결막상피세포나 결막배상세포 및 결막상피줄기·전구 세포를 대량으로 제작하는 것이 가능하게 되어, 결막상피의 기초 연구나 임상 연구에 크게 공헌할 수 있다. 또한, 기능적인 결막상피조직을 재구성하는 것이 가능하게 되고, 나아가서는, 시트 이식 등을 사용하여, 안구 건조증 등의 결막세포 자체의 이상(異常)에 기인하는 질환의 근본적인 재생 치료 방법이나 차세대의 치료 방법을 제공할 수 있다.
또한, 지금까지 결막세포의 입수가 곤란하여 실시되어 오지 않은, 결막세포를 타겟으로 한 약제 스크리닝 등에도 응용 가능하다.
도 1은, iPS 세포로부터 결막세포로의 유도 과정의 모식적인 일례를 나타낸 도면이다.
도 2는, SEAM 세포 집단을 소팅(sorting)한 결과의 일례를 나타낸 도면이다.
도 3은, iPS 세포로부터 분화 유도한 각 획분에 포함되는 세포에서의 유전자발현분석의 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는, iPS 세포 유래 결막배상세포 및 결막상피세포의 면역형광염색과 PAS염색의 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는, iPS 세포 유래 결막상피줄기·전구 세포에 의한 시트화를 검토한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은, iPS 세포 유래 결막상피세포 시트와 인간 정상세포에서의 유전자발현분석의 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은, iPS 세포 유래 결막상피세포 시트의 면역형광염색(평면표본)의 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은, iPS 세포 유래 결막상피세포 시트의 면역형광염색(절편표본)의 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는, iPS 세포 유래 결막상피세포 시트의 면역형광염색(평면표본)의 결과를 나타낸 도면이다(EGF 이외의 EGF 시그널 활성화 인자에서 유도한 iPS 세포 유래 결막상피줄기·전구 세포를 사용한 결막상피세포 시트).
도 10은, iPS 세포 유래 결막상피세포 시트의 유전자발현분석의 결과를 나타낸 도면이다(KGF 이외의 FGFR2b 활성화 인자인 FGF10을 포함하는 배지에서 성숙시킨 결막상피세포 시트).
본 발명자들은, 지금까지, iPS 세포로부터 눈 전체의 발생을 재현시킨 세포 집단(a self-formed ectodermal autonomous multi-zone: SEAM)을 취득하고, 얻어진 세포 집단으로부터 특정한 전구 세포를 단리 후, 상기 세포로 분화 유도, 필요에 따라 성숙 배양을 행함으로써 고순도의 세포 집단, 예를 들면, 각막상피 세포 등을 조제하고 있었다. 여기서, 각막상피세포로 분화 유도할 때는, iPS 세포의 콜로니를 형성시킨 후, KGF(Keratinocyte Growth Factor) 등의 성장 인자를 포함하는 분화 배지에서 배양하여 SEAM 세포 집단을 형성하고, 거기서부터 원하는 획분을 단리·배양하여 분화 유도하고 있었지만, 얻어지는 세포 집단에서의 각막상피세포의 비율이 높았으므로 그 외의 상피세포에 대해서는 아직 불분명한 점이 많았다. 이에, 본 발명자들은, 결막상피세포가 우위로 되는 분화 유도 방법에 대하여 예의 검토한 결과, 상기한 방법에 있어서 SEAM 세포 집단을 형성시킬 때, iPS 세포의 콜로니를 EGF(Epidermal Growth Factor) 시그널 전달 활성화 인자(이후, 간단히 EGF로 기재하기도 함)의 존재 하에서 배양함으로써, 그 중에, 분화된 결막상피세포와 결막배상세포뿐만 아니라, 미분화 상태의 결막상피줄기·전구 세포가, 주체로서 분화 유도할 수 있는 것을 발견하였다. 이와 같이, 동일한 종류의 눈 표면 상피세포가 유도되는 iPS 세포의 콜로니에 대하여 KGF를 첨가한 계와 EGF를 첨가한계로 별도 분화 배양함으로써, 유도되는 상피세포의 종류가 상이한 것은 본 발명자들이 처음으로 찾아낸 것이다.
본 발명은, 결막세포의 분화 유도 방법을 제공하는 것으로서, 다능성 줄기세포로부터 SEAM 세포 집단(self-formed ectodermal autonomous multi-zone 세포 집단)을 형성시킬 때, 얻어진 다능성 줄기세포의 콜로니를 특정 배지에서 배양하는 것에 특징을 가진다. 구체적으로는, 다능성 줄기세포를 자율적으로 분화시켜 콜로니를 형성시킨 후, EGF 시그널 전달 활성화 인자를 포함하는 배지에서 배양하여 분화 유도하고, SEAM 세포 집단을 형성시킨다. 이로써, 얻어진 SEAM 세포 집단에 있어서는, ITGβ4, SSEA-4 및 CD200의 항체 발현 정도를 지표로 하여, 결막상피세포, 결막배상세포 및 결막상피줄기·전구 세포를 단리할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 먼저, 다능성 줄기세포로부터 SEAM 세포 집단용의 콜로니를 조제한다.
본 발명에서의 다능성 줄기세포란, 생체에 존재하는 모든 세포로 분화 가능한 다능성을 가지고, 또한, 증식능도 함께 가지는 줄기세포이다. 구체적으로는, 예를 들면, 배아줄기세포(ES 세포), 핵이식에 의해 얻어지는 클론 배아 유래의 배아줄기세포(ntES 세포), 정자줄기세포(GS세포), 배아생식세포(EG세포), 인공다능성 줄기세포(iPS 세포), 배양 섬유아세포나 골수줄기세포 유래의 다능성세포(Muse 세포) 등이 있다. 바람직하게는, ES 세포, ntES 세포 및 iPS 세포이며, 보다 바람직하게는 iPS 세포이다. 다능성 줄기세포는, 포유동물의 다능성 줄기세포인 것이 바람직하다. 포유동물은 특별히 한정되지 않고, 인간, 마우스, 래트(rat), 소, 돼지 등을 예로 들 수 있다. 그 중에서도 인간이 바람직하다. 인간 다능성 줄기세포를 사용함으로써, 인간의 재생 의료에 사용 가능한 안전한 세포종에 따른 세포 집단을 취득할 수 있다.
SEAM 세포 집단용의 콜로니는, 다능성 줄기세포를 무혈청 배지에서 피더(feeder) 세포를 사용하지 않고 2차원 배양함으로써 얻어지는, 상이한 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원형의 층으로 이루어지는 콜로니이다.
구체적으로는, 예를 들면, 인간 iPS 세포를, 동물세포의 배양에 사용할 수 있는 공지의 배지(예를 들면, DMEM 배지, BME 배지 등)이며, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 배지를 사용하여, 2차원 배양함으로써 얻어진다. 이 때, 배양 용기로서는, 2차원의 세포 배양에 사용되는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 용기의 내표면은 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트 등으로 코팅되어 있는 것이 바람직하다. 그리고, 배양 조건은 특별히 한정되지 않고, 기술상식에 따라 적절하게 설정할 수 있다.
이와 같이 배양하여 얻어진 SEAM 세포 집단용의 콜로니는, 분화 유도제나 분화 유도 촉진제 등의 외부로부터의 자극을 받지 않고, 세포 스스로가 자율적으로 분화되어 형성된 것이며, 외배엽계 세포종으로 구성되는 층형(層形)의 콜로니를 형성한다. 콜로니는, 중심부로부터 주변부를 향하여, 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원형의 층으로 이루어지고, 제1층(신경외배엽계열 세포), 제2층(신경능계열 세포/눈배(胚)계열세포), 제3층(눈 표면 외배엽계열 세포) 및 제4층(표면 외배엽계열 세포)을 포함한다. 그리고, 상기한 조제 방법으로서는, 예를 들면, 비특허문헌 1, 2 및 특허문헌 1에 기재된 방법을 참조할 수 있다.
얻어진 콜로니는, 각 층에 포함되는 세포종은 상이한 계열이므로, 이것을 사용하여, 특정한 층에 포함되는 세포를 분리하여 사용할 수도 있고, 콜로니 전체를 그대로 사용할 수도 있다.
이와 같이, 본원 명세서에서의 SEAM 세포 집단용의 콜로니로서는, 예를 들면, 다능성 줄기세포를, 라미닌 511E8로 코팅한 플레이트에, 100∼700 cells/cm2의 밀도로 파종하고, 8∼10 일간, StemFit(등록상표) 배지(아지노모토)에서 유지 후, 분화 배지[DM; 10% knockout serum replacement(KSR, Life Technologies), 1mM sodium pyruvate(Life Technologies), 0.1mM non-essential amino acids(Life Technologies), 2mM l-glutamine(Life Technologies), 1% penicillin-streptomycin solution(Life Technologies) 및 55μM 2-mercaptoethanol(Life Technologies)을 함유시킨 GMEM 배지(Life Technologies)]에서 4주일 배양하여 자율적으로 분화 유도시켜 얻어지는 세포 집단이 있다.
다음으로, 얻어진 SEAM 세포 집단용의 콜로니를 특정한 분화 배지에서 배양한다. 그리고, 여기서 사용하는 배지를, 결막용 분화 배지로 기재하기도 한다.
결막용 분화 배지는, EGF 시그널 전달 활성화 인자를 포함한다. EGF 시그널 전달 활성화 인자로서는, EGF 리셉터를 통하여 작용하는 인자라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, epidermal growth factor(EGF), transforming growth factorα(TGFα), amphi-regulin(AR), cripto, vaccinia virus growth factor(VVGF), heparin-binding EGF-like growth factor(HB-EGF), neu differentiation factor/heregulin(NDF/HRG) 등이 있다. 배지 중의 농도는, 통상, 0.01∼1000 ng/mL, 바람직하게는 0.1∼100 ng/mL이다.
결막용 분화 배지는, EGF 시그널 전달 활성화 인자 외에, Rock 저해제 등을 포함한다. 기본 배지는, 자율적 분화에서 사용한 배지 등, 상피세포의 배양에서 사용할 수 있는 배지(무혈청 배지)라면 모두 사용할 수 있다. 그리고, 「Rock 저해제」는, Rho 키나제(ROCK: Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase)를 저해하는 물질을 의미하고, 예를 들면, N-(4-피리딜)-4β-[(R)-1-아미노에틸]시클로헥산-1α-카르복사미드(Y-27632), Fasudil(HA1077), (2S)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)술포닐]헥사하이드로-1H-1,4-디아제핀(H-1152), 4β-[(1R)-1-아미노에틸]-N-(4-피리딜)벤젠-1α카르복사미드(Wf-536), N-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4β-[(R)-1-아미노에틸]시클로헥산-1α카르복사미드(Y-30141), N-(3-{[2-(4-아미노-1,2,5-옥사디아졸-3-일)-1-에틸-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일]옥시}페닐)-4-{[2-(4-모르폴리닐)에틸]-옥시}벤즈아미드(GSK269962A), N-(6-플루오로-1H-인다졸-5-일)-6-메틸-2-옥소-4-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-3,4-디하이드로-1H-피리딘-5-카르복사미드(GSK429286A)를 이용할 수 있다.
상기 배지에서의 배양은, 36∼38 ℃, 바람직하게는 36.5∼37.5 ℃로, 1%∼25% O2, 1%∼15% CO2의 조건 하에서 행해진다. 또한, 배양 기간은 적어도 1∼8 주일, 바람직하게는 2∼6 주일, 보다 바람직하게는 3∼5주일이다. 그리고, 배양 용기 등은, 자율적 분화에서 사용한 것과 동일한 것을 사용할 수 있다.
이 배양에 의해, 눈 표면 상피줄기세포가 출현하게 된다. 이 눈 표면 상피줄기세포를, 피펫팅 등에 의해 분리하고, 또한 결막상피용 유지 배지에서 배양한다.
결막상피용 유지 배지는, 결막상피전구세포로의 분화 유도를 촉진시키기 위하여, 결막용 분화 배지에 혈청대체물을 더 포함할 수 있다. 「혈청대체물」로서는, 예를 들면, 알부민(예를 들면, 지질 리치 알부민), 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량원소(예를 들면, 아연, 셀렌), B27(등록상표) 서플리먼트, N2 서플리먼트 등이 있다. 배지 중의 농도는, B27 서플리먼트의 경우, 0.01∼10 중량%, 바람직하게는 0.5∼4 중량%이다.
상기 배지에서의 배양은, 결막용 분화 배지에서의 배양과 동일하게 행할 수 있고, 36∼38 ℃, 바람직하게는 36.5∼37.5 ℃로, 1%∼25% O2, 1%∼15% CO2의 조건 하에서 행해진다. 또한, 배양 기간은 적어도 3일간∼12주일, 바람직하게는 1∼8 주일, 보다 바람직하게는 2∼6 주일이다. 그리고, 배양 용기 등은, 자율적 분화에서 사용한 것과 동일한 것을 사용할 수 있다.
또한, 결막용 분화 배지나 결막상피용 유지 배지에는, 상기한 것 이외에, 세포의 유지 증식에 필요한 각종 영양원이나 분화 유도에 필요한 각 성분이 적절하게 포함되어 있어도 된다. 예를 들면, 영양원으로서는, 글리세롤, 글루코오스, 과당, 자당, 유당, 벌꿀, 전분, 덱스트린 등의 탄소원, 또한, 지방산, 유지(油脂), 레시틴, 알코올류 등의 탄화 수소류, 황산 암모늄, 질산 암모늄, 염화 암모니아, 요소, 질산 나트륨 등의 질소원, 식염, 칼륨염, 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염 등의 무기염류(예를 들면, 인산 일칼륨, 인산 이칼륨, 황산 마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 몰리브덴산 나트륨, 텅스텐산 나트륨, 황산 망간), 각종 비타민류, 아미노산류 등을 포함할 수 있다. 이들 성분 함유량은, 기술 상식에 따라 조정할 수 있다.
이렇게 하여, 다능성 줄기세포로부터, 결막세포, 즉 결막상피세포, 결막배상세포 및 결막상피줄기·전구 세포가 우위한 SEAM 세포 집단을 형성시킬 수 있다.
상기한 유도 방법에 있어서 형성된 SEAM 세포 집단으로부터는, ITGβ4, SSEA-4 및 CD200의 항체 발현 정도를 지표로 하여, 결막상피세포, 결막배상세포 및 결막상피줄기·전구 세포를 단리할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 결막상피세포, 결막배상세포 및 결막상피줄기·전구 세포의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 결막상피세포, 결막배상세포 및 결막상피줄기·전구 세포의 제조 방법에 있어서는, 본 발명의 유도 방법에 의해, 결막상피세포, 결막배상세포 및 결막상피줄기·전구 세포가 우위한 SEAM 세포 집단을 형성시키고, 상기 SEAM 세포 집단으로부터 원하는 세포를 단리한다.
단리방법으로서는, 상기 마커의 발현을 지표로 하여 SEAM으로부터 세포를 단리할 수 있으면 특별히 한정되지 않고, 통상적인 방법에 따라 각 마커에 특이적인 항체를 사용하여 용이하게 실시할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 항체로 표지된 자기 비즈, 항체를 고상화한 컬럼, 형광 표지된 항체를 사용한 셀 소터(FACS)에 의한 분리를 사용하여 단리하면 된다. 항체는, 시판하고 있는 것을 이용해도 되고, 통상적인 방법에 따라 제작한 것을 이용해도 된다. 본 발명에 있어서는, 이러한 단리 방법에 있어서, 상기 마커의 발현 정도에 따라 세포를 선택하므로, 이하에, 상기 선택 방법의 일례로서, FACS에 의해 선택하는 경우를 예로 들어 설명한다.
먼저, 얻어진 SEAM 세포 집단으로부터, CD200에 의한 음성 선택을 행한다(도 2의 좌측). 다음으로, CD200 음성 세포에 대하여, ITGβ4, SSEA-4의 발현을 조사한다(도 2의 우측, 가로축이 SSEA-4, 세로축이 ITGβ4). 여기서, 각 마커에 대하여 발현의 유무를 판정하지만, 그 발현 정도에 따라, SSEA-4 음성/ITGβ4 양성 세포(P1 획분), SSEA-4 약양성/ITGβ4 양성 세포(P2 획분), SSEA-4 양성/ITGβ4 양성 세포(P3 획분), SSEA-4 음성/ITGβ4 음성 세포(P4 획분), SSEA-4 약양성/ITGβ4 음성 세포(P5 획분), SSEA-4 양성/ITGβ4 음성 세포(P6 획분)로 분획한다. 본 발명에서는, 이 중에서, SSEA-4 약양성/ITGβ4 음성 세포(P5 획분), SSEA-4 양성/ITGβ4 음성 세포(P6 획분)의 획분[이들에 포함되는 세포를 정리하여, SSEA-4 양성∼약양성/ITGβ4 음성 세포(P5·P6 획분)로 기재함]과 SSEA-4 약양성/ITGβ4 양성 세포(P2 획분)에 포함되는 세포를 선택하여 단리한다. 그리고, 약양성이란, 정상세포와 비교하여 발현량이 다소 낮은 것을 의미하고, 본 발명에 있어서는, 양성과 음성의 중간 정도의 발현량을 나타낸 것을 포함한다.
선택한 SSEA-4 양성∼약양성/ITGβ4 음성 세포는, MUC5AC(결막배상세포 마커), K13(결막상피세포 마커) 및 PAX6(눈세포 마커)를 고발현하고 있고, P5·6 획분에는 결막상피세포나 결막배상세포가 유도되어 있다고 할 수 있다.
또한, SSEA-4 약양성/ITGβ4 양성 세포는, p63(상피계 줄기세포 마커)을 고발현하고, 또한, K13(결막상피세포 마커) 및 PAX6(눈세포 마커)를 중정도 발현하고 있으므로, P2 획분에는 결막상피줄기·전구 세포가 유도되어 있다고 할 수 있다.
이와 같이 단리된 세포는, 그대로 공지의 배양 배지에서 배양하여 사용할 수 있고, 예를 들면, 상기한 결막용 배지나 결막상피용 유지 배지에서 배양해도 되고, 그 외의 성장 인자를 포함하는 배양 배지에서 배양해도 된다.
얻어진 세포는, 다양한 용도에 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, P5·6 획분의 세포는 이미 분화된 상태이므로, 결막상피세포 및 결막배상세포의 상세한 분석이나 최적 배양 조건의 검토, 약제 스크리닝 시험 등, 기초 연구 분야에서의 적용을 고려할 수 있다. 또한, P2 획분의 세포는 배양함으로써 결막상피세포나 결막배상세포로 분화 유도하는 것이 가능하게 되므로, 이식용 결막상피세포 시트의 제작이나 결막상피조직의 최적 배양 조건의 검토에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 유도 방법에 의해 얻어진 결막상피줄기·전구 세포를 배양하는 공정을 포함하는 결막상피세포 시트의 제조 방법을 제공한다. 구체적인 태양으로서, 예를 들면, 본 발명의 유도 방법에 의해 얻어진 결막상피줄기·전구 세포를 배양하는 공정을 포함하는 이식용 결막상피세포 시트의 제조 방법이 있다. 얻어진 결막상피세포 시트는, 결막상피의 기능부전과 관련된 안질환(예를 들면, 뮤신 감소형 안구 건조증)으로의 적용을 기대할 수 있다. 그리고, 상기 결막상피줄기·전구 세포를 배양하기 위한 배지에 첨가되는 성장 인자로서는, 특별히 제한되지 않지만, 적어도 KGF를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, FGFR2b(Fibroblast Growth Factor Receptor 2b) 활성화 인자(예를 들면, FGF10 등)를 첨가해도 된다. 상기 성장 인자의 배지 중의 농도는, 통상, 0.1∼1000 ng/mL, 바람직하게는 1∼100 ng/mL이다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 유도 방법에 의해 얻어진 결막상피세포 및 결막배상세포, 혹은 본 발명의 유도 방법에 의해 얻어진 결막상피줄기·전구 세포를 분화 유도하여 얻어진 결막상피세포 및 결막배상세포에 의해 구성되는 결막상피조직을 사용하여, 스크리닝하는 방법을 제공한다. 구체적으로는, 예를 들면, 상기 결막상피조직에 있어서, 기능 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 기능 단백질의 활성을 지표로 하여, 발현의 촉진 또는 활성의 촉진을 하는 물질을, 결막과 관련된 질환을 치료하기 위한 후보 화합물로서 선택하는 태양이 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 피험물질을 접촉시킨 결막상피조직에 있어서, 기능 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량 또는 기능 단백질의 활성값을 측정하고, 피험물질을 접촉시키지 않는 대조 세포에서의 발현량 또는 활성값보다 향상되어 있는 경우에, 피험물질이 결막과 관련된 질환을 치료하기 위한 후보 화합물로 선택할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 일례이며, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다. 그리고, 이후에 있어서, 실온은 25℃를 나타낸다.
실시예 1 눈 표면줄기세포의 유도
iPS 세포로부터의 분화 유도에는, self-formed ectodermal autonomous multi-zone(SEAM)법을 사용했다(Hayashi et al. Nature.2016 Mar 17; 531(7594): 376-80., Hayashi et al., Nature Protocols, 2017, 12(4), 683-696, doi: 10.1038/nprot.2017.007).
구체적으로는, 라미닌 511E8으로 코팅한 플레이트에, 인간 iPS 세포주(201B7)를 300∼700 cells/cm2의 밀도로 파종하고, 8∼10 일간, StemFit(등록상표) 배지(아지노모토)에서 유지 후, 분화 배지[DM; 10% knockout serum replacement(KSR, Life Technologies), 1mM sodium pyruvate(Life Technologies), 0.1mM non-essential amino acids(Life Technologies), 2mM l-glutamine(Life Technologies), 1% penicillin-streptomycin solution(Life Technologies) 및 55μM 2-mercaptoethanol(Life Technologies)을 함유시킨 GMEM 배지(Life Technologies)]에서 4주일 배양했다. 다음으로, 결막용 분화 배지[CjDM; 10ng/mL EGF(R&D Systems), 10μM Y-27632(Wako) 및 1% penicillin-streptomycin solution을 함유시킨 DM 배지와 Cnt-20 또는 Cnt-PR 배지(EGF 및 FGF2 불함유, CellnTEC Advanced Cell Systems)의 1:1(v/v) 혼합 배지]에서 4주일 배양한 후, 결막상피용 유지 배지[CjEM; 2% B27 Supplement(Life Technologies), 1% penicillin-streptomycin solution, 10ng/mL EGF, 10μM Y-27632을 함유시킨 DMEM/F-12(2:1(v/v) 배지(Life Technologies)]로 교환 후 2∼4 주 정도 더 배양하여 분화 유도했다. 타임 스케줄을 도 1에 나타낸다.
실시예 2 FACS에 의한 목적세포의 추출
실시예 1에서 얻어진 SEAM 세포 집단으로부터, 셀 소터 SH800(SONY)에 의해 소팅하고 CD200 음성 세포를 추출 후, SSEA-4, ITGβ4로 전개하고, 도 2에 나타낸 6개의 획분으로 분획했다. 각 획분의 정의는, SSEA4-음성/ITGβ4 양성 세포(P1 획분), SSEA-4 약양성/ITGβ4 양성 세포(P2 획분), SSEA-4 양성/ITGβ4 양성 세포(P3 획분), SSEA-4 음성/ITGβ4 음성 세포(P4 획분), SSEA-4 약양성/ITGβ4 음성 세포(P5 획분), SSEA-4 양성/ITGβ4 음성 세포(P6 획분)와 같다.
실시예 3 유전자 발현 분석
실시예 2에서 얻어진 6개의 획분 각각을, QIAzol Lysis Reagent(QIAGEN)을 사용하여 회수하고, RT-qPCR에 제공하여, 각종 마커 발현을 평가했다. 결과를 도 3에 나타낸다. 그리고, 도면 중, P4 획분 유래 세포(n=3), 그 외의 획분 유래 세포(n=5)의 결과이며, 에러바는 표준오차를 나타내었다.
도 3으로부터, P2 획분에 있어서, p63(상피계 줄기세포 마커)이 고발현, K13(결막상피세포 마커) 및 PAX6(눈세포 마커)이 중정도 발현, K12(각막상피세포 마커)이 저발현이며, 결막상피줄기·전구 세포의 표현계가 확인되었다. 또한, P5·6 획분에 있어서, MUC5AC(결막배상세포 마커), K13 및 PAX6이 고발현, p63이 저발현이며, 결막배상세포 및 결막상피세포의 표현계가 확인되었다.
실시예 4 면역형광염색
실시예 2에서 추출된 P5·6 획분 유래 세포를, BD Cytofix/Cytoperm(등록상표) Kit(554714, BD Biosciences)로 고정, 막투과 처리 후, DMEM/F12 배지에 50,000cells/mL로 되도록 현탁하고, 200μL/컬럼으로서, 사이트 스핀(A78300003, Thermo Fisher Scientific)으로 슬라이드에 세포 표본을 제작했다. 계속해서, 5% NST(5% Normal Donkey Serum, 0.3% Triton을 포함하는 TBS; T903, TaKaRa Bio)로 블록킹(실온, 1시간) 후에, 항MUC5AC항체(1:200; sc-21701, Santa Cruz Biotechnology), 항K13항체(1:200; ab16112, abcam), 항K12항체(1:200; sc-17098, Santa Cruz Biotechnology), 항PAX6항체(1:300; PRB-278P, COVANCE)를 사용하여 1차 항체반응(4℃, overnight)을 행하였다. TBS로 5분간, 2회 세정 후, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 또는 Alexa Fluor 647로 표지한 2차 항체(1:200; Life Technologies) 및 Hoechst33342(1:100; H3570, Molecular Probes)로 처리(실온, 1시간) 후, 형광현미경으로 관찰했다. 결과를 도 4에 나타낸다.
또한, P5·6 획분 유래 세포를, BD Cytofix/Cytoperm(등록상표) Kit으로 고정, 막투과 처리 후, PAS 염색 키트(101646, Merck KGaA)를 사용하여 염색하고, 도립현미경으로 관찰했다. 결과를 도 4에 나타낸다.
도 4로부터, P5·6 획분에 있어서, K13+, K12- 그리고 PAX6+인 결막상피세포(도 4의 b), MUC5AC+ 그리고 PAX6+인 결막배상세포(도 4의 c)가 확인되었다. 또한, PAS+세포(도 4의 d)도 확인되었다.
실시예 5 인간 iPS 세포 유래 결막상피줄기·전구 세포의 배양
실시예 2와 동일하게 하여 얻어진 P2 획분 유래 세포를, 라미닌 511E8 플래그먼트(0.5μg/cm2)로 코팅한 세포배양용 인서트 상에서 2∼3 주일 배양했다. 배양에는, KGF 배지[10ng/mL KGF(Wako), 10μM Y-27632 및 2% B27 Supplement, 및 1% penicillin-streptomycin solution을 함유시킨 DMEM/F-12] 또는 EGF 배지[10ng/mL EGF, 10μM Y-27632 및 2% B27 Supplement, 및 1% penicillin-streptomycin solution을 함유시킨 DMEM/F-12]를 사용했다.
FACS에 의해 추출한 P2 획분(도 5의 a)에 대하여, 배양 후의 위상차현미경 사진에서는 어느 배양 조건에서도 세포의 시트화를 확인할 수 있었다(도 5의 b).
또한, 배양 전후의 P2 획분 유래 세포 및 정상 인간 세포에서의 유전자발현분석을 실시예 3을 참조로 하여 행한 결과, P2 획분 유래 세포를 KGF 배지에서 배양한 경우에 있어서만, 배양 전과 비교하여 MUC5AC 발현 상승이 인정되었다. 또한, P2 획분 유래 세포는, K13 고발현, PAX6 중정도 발현, K12 저발현이며, 정상 인간 결막세포와 동등한 표현계를 나타낸 것이 확인되었다(도 6). 그리고, 도면 중, P2 획분 유래 배양 전 세포(n=5), P2 획분 유래 배양 후 세포(n=4), 정상 인간 세포(n=1)의 결과이며, 에러바는 표준오차를 나타내었다.
다음으로, 세포배양용 인서트 상에서 배양한 P2 획분 유래 세포 시트를 회수 후, 평면표본용에 메탄올(131-01826, Wako)로 고정(실온, 20분) 후, 염색을 행하였다. 또한, 절편표본용에 O.C.T.컴파운드(4583, Tissue-Tek 중에 포매하고, -80℃에서 보존 후, 크라이오스탯으로 5㎛의 절편을 제작하고, 실온에서 30분 이상 건조시킨 후, 메탄올로 고정(실온, 20분) 후, 염색을 행하였다. 염색은, 5% NST로 블록킹(실온, 1시간) 후에, 항MUC5AC항체(1:200), 항K13항체(1:200), 항K12항체(1:200), 항PAX6항체(1:300)를 사용하여 1차 항체반응(4℃, overnight)을 행하였다. TBS로 5분간, 2회 세정 후, Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 568로 표지한 2차 항체(1:200) 및 Hoechst33342(1:100)로 처리(실온, 1시간) 후, 형광현미경으로 관찰했다.
평면표본의 면역형광염색에서는, KGF 배지에서 배양한 경우에만 MUC5AC+세포가 확인되었다(도 7). 또한, 절편표본의 면역형광염색에서는, KGF 배지에서 배양 한 경우에만, MUC5AC+, K13+, PAX6+ 그리고 K12-와 같은 결막상피세포의 표현계가 확인되었다(도 8).
실시예 6 EGF 시그널 전달 활성화 인자의 검토
실시예 1에 있어서, 결막용 분화 배지에서의 EGF를, transforming growth factorα(TGFα) 또는 amphi-regulin(AR)로 변경한 점 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 분화 유도를 행하였다. 그 후, 실시예 2와 동일하게 하여 P2 획분 유래 세포를 추출 후, 실시예 5과 동일하게 하여 KGF 배지에서 배양하고, 얻어진 세포 시트의 염색을 행하여 MUC5AC의 발현을 확인했다.
결과, EGF 이외의 EGF 시그널 전달 활성화 인자를 사용해도, MUC5AC 양성 세포를 포함하는 결막상피세포 시트를 제작할 수 있는 것을 확인할 수 있었다(도 9).
실시예 7 결막상피줄기·전구 세포의 성장 인자의 검토
실시예 5에 있어서, 결막상피줄기·전구 세포의 배양 배지에서의 KGF를, FGFR2b 활성화 인자(FGF10)로 변경한 점 이외에는, 실시예 5과 동일하게 하여 배양하고, 얻어진 세포 시트를 실시예 3과 동일하게 하여 RT-qPCR에 제공하고, MUC5AC의 발현량을 평가했다.
결과, FGF10을 사용해도, MUC5AC를 발현하고 있는 결막상피세포 시트를 제작할 수 있는 것으로 나타났다(도 10).
[산업상 이용가능성]
본 발명에 의해, iPS 세포를 포함하는 다능성 줄기세포로부터 결막상피세포, 결막배상세포, 결막상피줄기·전구 세포를 유도할 수 있으므로, 결막상피세포, 결막배상세포의 기초 연구, 난치성 눈 표면 질환에 대한 재생치료나 상기 질환과 관련된 연구 등에 극히 유용하다.

Claims (11)

  1. 다능성 줄기세포의 콜로니를 EGF(Epidermal Growth Factor ) 시그널 전달 활성화 인자를 포함하는 배지에서 배양하여 분화 유도시키는, 결막상피세포, 결막배상세포 및 결막상피줄기·전구 세포의 유도 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    다능성 줄기세포의 콜로니를 EGF 시그널 전달 활성화 인자를 포함하는 배지에서 배양하여, SEAM 세포 집단(self-formed ectodermal autonomous multi-zone 세포 집단)을 형성시키는, 유도 방법.
  3. 다능성 줄기세포의 콜로니를 EGF(Epidermal Growth Factor) 시그널 전달 활성화 인자를 포함하는 배지에서 배양하여 SEAM 세포 집단(self-formed ectodermal autonomous multi-zone 세포 집단)을 형성시키고, 상기 SEAM 세포 집단으로부터, ITGβ4, SSEA-4 및 CD200의 항체 발현 정도를 지표로 하여 세포를 단리하는, 결막상피세포, 결막배상세포 및 결막상피줄기·전구 세포의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    단리된 세포가 CD200 음성인, 제조 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    단리된 세포가 SSEA-4 약양성/ITGβ4 양성 세포인, 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    단리된 세포가 결막상피줄기·전구 세포인, 제조 방법.
  7. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    단리된 세포가 SSEA-4 약양성/ITGβ4 음성 세포 및 SSEA-4 양성/ITGβ4 음성 세포로부터 선택되는, 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    단리된 세포가 결막상피세포 및/또는 결막배상세포인, 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 결막상피줄기·전구 세포를 KGF(Keratinocyte Growth Factor)를 포함하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는, 결막상피세포 시트의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 결막상피줄기·전구 세포를 FGFR2b(Fibroblast Growth Factor Receptor 2b) 활성화 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는, 결막상피세포 시트의 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 결막상피세포, 결막배상세포 및/또는 결막상피줄기·전구 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 결막과 관련된 질환의 약제 스크리닝 방법.
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