CN113528425A - 一种用于乳腺上皮干细胞的培养基和培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于培养乳腺上皮干细胞的培养基，其含有TGF‑β抑制剂、B27和/或N2、胰岛素、受体酪氨酸激酶配体、Rock激酶抑制剂、P38信号转导抑制剂、骨形态发生蛋白抑制剂、以及MST1/2激酶抑制剂。本发明还提供采用上述乳腺上皮干细胞培养基培养细胞的方法，以及采用所述培养方法得到的扩增细胞群或类器官在药物筛选、毒性测试和再生医疗中的应用和方法。

Description

一种用于乳腺上皮干细胞的培养基和培养方法
技术领域
本发明涉及用于体外培养上皮干细胞、尤其是乳腺上皮干细胞的培养基以及用于培养包含所述干细胞的类器官的培养基和培养方法。本发明还涉及用本发明的培养基和培养方法所培养的细胞后代和类器官在药物的疗效评估和筛选、毒性测定和再生医学中的用途。
背景技术
乳腺疾病，特别是乳腺癌，是影响女性健康的最主要的疾病之一。近年来，尽管人们对乳腺疾病的分类和发病机制的研究取得了很多进展，目前针对乳腺疾病，特别是乳腺癌的标准治疗药物仍相当匮乏，更缺乏个性化的精准用药指导。导致这一问题的关键在于目前尚缺乏体外可持续扩增且能够代表乳腺疾病患者自身生物学特性的细胞模型来进行药物的疗效评估和筛选、毒性测定等。
近年来，研究发现在人体的许多组织内，位于组织基底层的上皮干细胞及前体细胞具有无限自我更新的能力并携带个体的生物学特性(Blanpain C.等，Science，344(6189)：1242281,2014；Donati G.等，Cell Stem Cell，16(5),465-476，2015)。然而，由于CDKN2A依赖性的细胞周期阻滞机制，体外可持续培养上皮干细胞较难实现。
目前有两种体外培养上皮干细胞的技术在药物的疗效评估和筛选、毒性测定、再生医学领域发展得相对成熟。一种是使用经辐射的饲养细胞和ROCK激酶抑制剂Y27632来促进上皮细胞的生长以考察个体患者的药物敏感性的技术，即细胞条件重编程技术(Liu等，Am J Pathol，180:599-607，2012)。另一种技术是体外3D培养成体干细胞从而获得类似于组织器官的类器官技术(Hans Clevers等，Cell，172:1-14,2018)。
然而，这两种技术都存在一定的局限性。细胞重编程技术是一种将患者自体原代上皮细胞与鼠源性饲养细胞共培养的技术。然而，在对患者细胞进行药物疗效评估或信号通路分析时，这些鼠源性饲养细胞的存在会干扰患者自体细胞的检测、分析及下游应用(Lipsitz Y.等，Nat.Biotechnol.，34，393-400,2016)；但如果撤除鼠源性饲养细胞，病人自体原代细胞就脱离了重编程环境，细胞的增殖速率和细胞内信号通路会发生明显的改变(Liu等，Am J Pathol，183(6):1862-1870，2013；Liu等，Cell Death Dis.，9(7):750，2018)。类器官技术是将患者自体原代上皮细胞包埋在细胞外基质内进行体外三维立体培养的技术，其技术原理主要是通过在培养基中添加特定的上皮干细胞标志物Lgr5和(或)Lgr6的配体，例如Wnt激动剂和R-海绵硬蛋白(R-spondin)家族蛋白，从而激动细胞内的Wnt信号通路，进而促进上皮干细胞的体外自我更新(Sato等，Gastroenterology，141:1762-1772，2011)。该技术无需饲养细胞，因此不存在鼠源性饲养细胞的干扰问题，但是类器官技术的培养基内需添加多种特定的因子，特别是该培养基的必需成分Wnt蛋白和R-spondin家族蛋白，导致类器官培养及检测成本昂贵，不适于普及到临床进行大规模应用。此外，该技术在培养和检测全过程都需要将类器官包埋在基质胶内，且所形成的类器官大小尺寸不易控制，导致该技术的可操作性和可重复性不强，从而限制了该技术在临床体外药物疗效和评估、高通量药物筛选和毒性测试上的大规模应用(Nick Barker等，Nat Cell Biol，18(3):246-54，2016；Huch M.等，Development，144,938-941，2017)。
鉴于以上技术的局限性，临床上亟待开发一种体外可持续培养乳腺上皮干细胞的培养技术，其培养可持续，成本可控，操作便捷，不受外源性细胞干扰。
本发明人曾在专利(PCT/CN2019/119116)中记载了一种无需饲养细胞、成本可控、操作便捷的体外培养乳腺上皮干细胞的方法。这是首个无需饲养细胞，培养成分中不含Wnt蛋白、R-spondin家族蛋白等Wnt激动剂的二维体外培养乳腺上皮干细胞的培养系统。这个培养系统可维持乳腺上皮细胞至少1个月的体外持续增殖。本发明人在原有发明的基础上，意外地发现将MST1/2激酶抑制剂应用于培养乳腺上皮干细胞可实现明显地促进乳腺上皮干细胞可持续增殖的效果，且将该技术应用于构建病人源性乳腺细胞模型时，所培养的乳腺上皮细胞能代表乳腺疾病患者自身的生物学特性。
发明内容
本发明旨在提供一种改进的用于培养乳腺上皮干细胞的培养基及使用该培养基的培养方法。采用本发明的培养基和培养方法，能够达到体外培养可持续、成本可控、操作便捷并不受外源性细胞干扰的目的。在该技术应用于构建病人源性乳腺细胞模型时，能够获得具有乳腺疾病患者自身生物学特性的细胞，并能够应用于药物疗效评估和筛选、毒性测试和再生医学等领域。
本发明的一个方面在于提供一种用于培养病人源性乳腺上皮干细胞和/或包含乳腺上皮干细胞的类器官的培养基，其含有TGF-β抑制剂、B27和/或N2、胰岛素、受体酪氨酸激酶配体、Rock激酶抑制剂、P38信号转导抑制剂、骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、以及MST1/2激酶抑制剂。其中，该MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物。
Figure BDA0002451468000000031
其中，
R1选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C2-C6螺环烷基、以及任选地被1-2个独立地R6取代的芳基(例如苯基和萘基等)、芳基C1-C6烷基(例如苯甲基等)和杂芳基(例如噻吩基等)；
R2和R3各自独立地选自C1-C6烷基，优选C1-C3烷基，更优选甲基；
R4和R5各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C1-C6烷基羟基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、和C3-C6杂环基C1-C6烷基(所述杂环基选自例如哌啶基、四氢吡喃基等)；
R6选自卤素(优选氟和氯，更优选氟)、C1-C6烷基(优选甲基)、C1-C6烷氧基(优选甲氧基)、和C1-C6卤代烷基(优选三氟甲基)。
优选的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，
Figure BDA0002451468000000041
其中，
R1选自C1-C6烷基、任选地被1-2个独立地R6取代的苯基、任选地被1-2个独立地R6取代的噻吩基、和任选地被1-2个独立地R6取代的苯甲基，R1更优选为任选地被1-2个独立地R6取代的苯基；
R5选自氢、C1-C6烷基、和C3-C6环烷基，R5更优选为氢；
R6各自独立地选自卤素、C1-C6烷基、和C1-C6卤代烷基，R6更优选为氟、甲基或三氟甲基。
优选地，所述MST1/2抑制剂是选自以下化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物中的至少一种。
Figure BDA0002451468000000042
Figure BDA0002451468000000051
Figure BDA0002451468000000061
Figure BDA0002451468000000071
Figure BDA0002451468000000081
MST1/2激酶抑制剂优选上述化合物1和化合物25。
MST1/2激酶抑制剂在培养基中的浓度是100nM以上且10μM以下，进一步优选300nM以上且3μM以下。
进一步优选地，本发明的培养基还含有：糖、烟酰胺(Nicotinamide)和N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine)中的一种或多种。
其中，所述TGF-β抑制剂可以是选自A8301、SB431542、Repsox、SB505124、SB525334、SD208、LY36494、和SJN2511的至少一种。TGF-β抑制剂优选A8301。TGF-β抑制剂的浓度较好是50nM以上且100μM以下，更好是100nM以上且50μM以下，进一步优选100nM以上且10μM以下。
其中，所述B27和/或N2以1:25～1:100的终浓度稀释至培养基中；优选地，B27以1:50倍稀释至培养基中，N2以1:100倍稀释至培养基中。
胰岛素以终浓度2～20μg/ml，优选5μg/ml～10μg/ml添加至培养基中；例如，将市售产品(10mg/ml)以1:500～1:5000倍稀释添加至培养基中，优选地，以1:1000～1:2000倍稀释添加至培养基中。。
其中，所述受体酪氨酸激酶配体选自表皮生长因子(EGF)、双向调节素(Amphiregulin)、转化生长因子-α(TGF-α)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、神经调节素1(Neuregulin1)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)以及成纤维细胞生长因子10(FGF10)中的至少一种。受体酪氨酸激酶配体优选包括EGF、Neuregulin1和FGF7。其中，受体酪氨酸激酶配体的终浓度为1ng/ml至1000ng/ml，优选5ng/ml至500ng/ml，进一步优选10ng/ml～100ng/ml。
其中，所述Rock激酶抑制剂选自Y27632、法舒地尔、H-1152中的至少一种。优选的Rock抑制剂为Y27632。其中所述Rock抑制剂的终浓度为1μM至100μM，优选2μM至50μM，更优选5μM至10μM。
其中，所述P38信号转导抑制剂选自SB202190、SB203580、VX-702、VX-745、PD169316、RO4402247、和BIRB796的至少一种。P38信号转导抑制剂优选SB202190。所述P38信号转导抑制剂的浓度较好是50nM以上且100μM以下，更好是100nM以上且50μM以下，进一步优选100nM以上且10μM以下。
其中，所述BMP抑制剂选自包括头蛋白(Noggin)、格雷林、腱蛋白、腱蛋白结构域的腱蛋白样蛋白，包括卵泡抑素、卵泡抑素结构域的卵泡抑素相关蛋白，包括DAN、DAN半胱氨酸结构域的DAN样蛋白，硬骨素/SOST、核心蛋白聚糖、α2-巨球蛋白、及DMH1中的至少一种。BMP抑制剂优选头蛋白。其中，BMP抑制剂的终浓度为1ng/ml至1000ng/ml，优选10ng/ml至500ng/ml，更优选20ng/mL至100ng/mL。
作为本实施方式的细胞培养基所含的糖，可例举例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等。其中，作为糖，较好是葡萄糖，特别好是D-葡萄糖(右旋糖)。糖在培养基内的终浓度为10mM～100mM，优选15mM～40mM。
烟酰胺在培养基内的终浓度为1mM～10mM，优选2mM～5mM。N-乙酰半胱氨酸在培养基内的终浓度为0.1mM～5mM，优选0.5mM～2mM。
实质上，本发明培养基不含类器官培养基内的必加成分Wnt蛋白、R-spondin家族蛋白中的任何蛋白。此外，本发明培养基也不含胎牛血清(fetal bovine serum(FBS)或fetal calf serum)、牛垂体提取物(BPE)等不确定的成分。
本发明的第二方面涉及培养正常乳腺组织来源或病变乳腺组织来源的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任一种的组织或类器官的培养方法，其中，该培养方法包括：(1)制备细胞外基质的步骤；(2)使上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任一种的组织粘附于所述细胞外基质上或包埋于细胞外基质的步骤；(3)添加上述第一方面所述的培养基，对所述上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含所述这些细胞中的至少任一种的组织进行培养，得到扩增的、相应的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞后代或类器官后代的步骤。
其中，上述培养方法中的细胞外基质使用低生长因子型细胞外基质胶，例如，可采用市售的MatrigelTM(BD Biosciences公司制)或BME(Trevigen公司制)。更具体而言，用无血清的培养基稀释细胞外基质胶，培养基可以是本发明的上皮干细胞培养基，也可以是DMEM/F12(Corning公司制)、DMEM培养基(Corning公司制)和RPMI1640培养基(Corning公司制)，也可以是改良的DMEM/F12培养基(Thermo公司制)或改良的RPMI1640培养基(Thermo公司制)等。细胞外基质胶的稀释比例为1:50-400，优选为1:50-200。
在所述培养方法中，在培养上皮干细胞或类器官步骤中，在氧浓度0.1％～25％的条件下进行，优选20％的正常氧气条件，或0.1％～15％的低氧条件。
本发明的第三方面涵盖使用本发明的培养基和培养方法获得扩增的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞后代或类器官后代，并应用于药物的疗效评估和筛选的方法和用途，特别是抗肿瘤药物的体外疗效评估和筛选的方法和用途。
优选地，本发明涉及一种乳腺癌药物的疗效评估或筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用本发明的培养基和培养方法培养乳腺上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞；
(2)选定需要检测的药物并按照所需浓度梯度进行稀释；
(3)对(1)中培养得到的细胞添加稀释后的所述药物；和
(4)进行细胞活性测试。
本发明的有益效果包括：
(1)延长原代乳腺上皮细胞培养的体外可持续增殖的代数和时间，培养代数达到10代以上，优选12代以上，体外细胞扩增时间可持续至少3个月，并且可长期维持分化能力，体外培养过程中发生基因突变的频率极低；
(2)保持体外培养的乳腺上皮细胞能够维持细胞来源病人的病理表型和异质性，可应用于再生医学领域；
(3)所培养的乳腺上皮干细胞不受成纤维细胞、脂肪细胞等间质细胞的干扰，能得到纯化的乳腺上皮干细胞及其后代；
(4)培养基成分不含血清、牛垂体提取物等不确定成分，所以不受不同批次血清或牛垂体提取物的质量和数量的影响；
(5)扩增乳腺上皮细胞效率高，只要有104级别的细胞数量就可在两周左右时间内成功扩增出106数量级的乳腺上皮细胞，扩增出的乳腺上皮细胞还可以持续传代扩增；
(6)培养成本可控：原代乳腺癌培养基无需加入价格昂贵的Wnt激动剂蛋白、R-spondin家族蛋白等成分，是对已有乳腺上皮细胞及类器官培养基的简化和改进，大大节约了乳腺上皮干细胞培养基的成本；
(8)操作便捷，该技术相比条件重编程技术，无需培养饲养细胞并对饲养细胞进行辐射，避免了不同批次饲养细胞的质量和数量影响原代细胞培养效率的问题，药物筛选的铺板和检测的对象只有乳腺上皮细胞，而不受细胞条件重编程技术所述的共培养体系中饲养细胞的干扰；相比类器官技术，本发明采用的细胞外基质胶的包被方法，培养器皿可预先准备，无需像类器官技术一样将细胞包埋于基质胶内，所述技术操作步骤简便易行；若使用本技术培养乳腺类器官，由于培养基成分已简化且成本大大降低，所以该技术比类器官技术更适合体外大规模应用和推广；
(9)所述技术培养获得的乳腺上皮细胞数量大，均一化程度高，成本可控，比细胞条件重编程技术和类器官技术更适合应用于高通量筛选新候选化合物和为病人提供高通量药物体外敏感性功能测试等药物疗效的评估、筛选以及毒性测试领域。
采用本实施方式的细胞培养基，可培养来源于包括人的或其他哺乳动物的乳腺上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任一种的组织，得到扩增的、相应的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞后代。此外，还可从所述细胞和所述组织中的至少一方形成类器官。
另外，通过本实施方式的培养方法获得的细胞可应用于再生医疗、毒性测试、乳腺上皮细胞的基础医学研究、药物应答的筛选、药物体外代谢稳定性和代谢谱的测定和针对乳腺疾病的新药研发等。
附图说明
图1A至1C是用于说明MST1/2激酶抑制剂延长人源性乳腺癌肿瘤细胞的培养代数的效果的附图。
图2是用于说明不同浓度的MST1/2激酶抑制剂在体外对人源性乳腺癌肿瘤细胞的增殖促进效果的附图。
图3A和3B是用于说明MST1/2激酶抑制剂在体外对乳腺癌肿瘤细胞的增殖持续促进效果的附图。
图4A和4B是用于说明本发明培养基中，MST1/2激酶抑制剂主导的对乳腺癌肿瘤细胞的持续的且可逆的促增殖作用的附图。
图5A是用于说明本发明的培养基对正常乳腺上皮细胞的增殖持续促进效果的附图；图5B是用于说明本发明的培养基在缺氧条件下对乳腺癌肿瘤细胞的增殖持续促进效果的附图；图5C是用于说明本发明的培养基对乳腺肿瘤类器官的培养效果的附图。
图6A至6C是用于说明MST1/2激酶抑制剂对人源性乳腺上皮细胞内干性标志物表达以及MST激酶介导的信号通路的影响的附图。
图7A和7B是用于说明采用本发明技术培养获得的乳腺癌肿瘤细胞和对应细胞来源的原始组织的基因拷贝数变异一致性分析的附图。
图8是用于说明采用本发明技术培养获得的乳腺癌肿瘤细胞和对应细胞来源的原始组织的基因突变一致性分析的附图。
图9是用于说明采用本发明技术培养获得的乳腺癌肿瘤细胞的免疫组化结果与该组织样本自身原始的组织切片的免疫组化结果对比的附图。
图10A和10B是用于说明采用本发明技术培养的乳腺癌肿瘤细胞对不同药物的剂量-效应曲线图。
具体实施方式
本说明书中，上皮细胞包括从上皮组织获取的已分化的上皮细胞及上皮干细胞。“上皮干细胞”是指具有长期的自我更新能力和向上皮细胞分化的细胞，是指来源于上皮组织的干细胞。作为上皮组织，可例举例如角膜、口腔粘膜、皮肤、结膜、膀胱、肾小管、肾脏、消化器官(食道、胃、十二指肠、小肠(包括空肠及回肠)、大肠(包括结肠))、肝脏、胰脏、乳腺、唾液腺、泪腺、前列腺、毛根、气管、肺等。其中，本实施方式的细胞培养基较好是用于来源于乳腺上皮细胞的培养。
此外，本说明书中，“上皮肿瘤细胞”是指来源于上述的上皮组织的细胞肿瘤化而得的细胞。
本说明书中，“类器官”是指通过使细胞在受控的空间内高密度地自发组织和聚集而成的三维立体的、类似于器官的细胞组织体。
本实施方式的培养基除了包括MST1/2激酶抑制剂以外，还包含选自TGF-β抑制剂、B27和/或N2、胰岛素、受体酪氨酸激酶配体、Rock激酶抑制剂、P38信号转导抑制剂、骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、葡萄糖、烟酰胺和N-乙酰半胱氨酸中的一种或多种或全部。包含所述成分的哪一种或哪几种可根据培养的细胞或组织的种类等适当选择。以下，对本实施方式的乳腺干细胞培养基的构成成分进行详细说明。
细胞培养基本培养基
本实施方式的乳腺上皮干细胞培养基中包含任意的无血清的细胞培养基本培养基。本实施方式的细胞培养基较好是用于动物细胞或人的细胞。作为所述的无血清的基本培养基，可使用例如用碳酸类缓冲液缓冲化至pH7.2以上且pH7.6以下的规定的合成培养基等。更具体来说，无血清的基本培养基选自，例如DMEM/F-12(Corning公司制)培养基。此外，作为替代还可使用RPMI1640培养基(Corning公司制)、DMEM培养基(Corning公司制)、以及改良型DMEM/F-12(Thermo公司制)和改良型RPMI1640培养基(Thermo公司制)等。
MST1/2激酶抑制剂
哺乳动物不育系20样激酶1和2(Mammalian Sterile 20-like Kinase，MST1/2)激酶是分子量为56-60KD的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的上游调控因子，可调节多种细胞进程，包括增殖、凋亡、迁移和细胞骨架重排。MST1基因是1995年在研究酿酒酵母Ste20与人的同系物时通过PCR从淋巴cDNA文库中克隆出来的，其编码产物与酵母Ste20的结构和功能类似，因此命名为MST1。MST1还有MST2、MST3和MST4三个旁系同源物(Dan等，Trends Cell Biol.11,220-230,2001)。MST2和MST1蛋白的同源性有76％，目前其生理功能并不明确，有研究认为MST2对MST1介导的功能可能有代偿作用(Wu S.等，Cell，114，445-456，2003)。
研究表明，MST1/2是果蝇Hippo(Hpo)的直系同源蛋白，后者是Hippo信号转导通路中的一种核心调节蛋白。这种在进化方面较保守的程序可通过调控细胞增殖、凋亡及干细胞自我更新来控制组织生长和器官大小。哺乳动物Hippo信号转导通路涉及一个激酶级联反应，其中，MST1/2激酶和SAV1支架蛋白会形成一个磷酸化并激活LATS1/2的复合体。LATS1/2激酶会磷酸化YAP和TAZ，进而促进对这些转录共激活因子在细胞质的滞留以及功能抑制(Zhao.B等，Nat Cell Biol，13，877-883，2011)。
本说明书中，MST1/2激酶抑制剂是指直接或间接地对MST1/2信号传导进行负调节的任意的抑制剂。一般来说，MST1/2激酶抑制剂例如与MST1/2激酶结合并降低其活性。由于MST1和MST2的结构具有相似性，MST1/2激酶抑制剂也可以是例如与MST1或MST1/2结合并降低其活性的化合物。
MST1/2激酶抑制剂与不存在该抑制剂的条件下的MST1/2活性水平相比，具有较好是50％以上、更好是70％以上、进一步更好是80％以上、特别好是90％以上的抑制活性。MST1/2抑制剂产生的抑制效果可通过本领域技术人员公知的方法进行评价。作为所述的评价体系，可例举MST1的Thr183磷酸化位点的特异性抗体检测方法、重组蛋白激酶体外实验、MST1/2激酶抑制剂用的DiscoverRx高通量筛选平台、MST1/2激酶活性检测试剂盒(Promega公司制)等。
作为本实施方式的上皮干细胞或类器官培养用的培养基所含的MST1/2抑制剂，可包含式(I)的化合物或其药学可接受的盐或溶剂化物，
Figure BDA0002451468000000151
其中，
R1选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C2-C6螺环烷基、以及任选地被1-2个独立地R6取代的芳基(例如苯基和萘基等)、芳基C1-C6烷基(例如苯甲基等)和杂芳基(例如噻吩基等)；
R2和R3各自独立地选自C1-C6烷基，优选C1-C3烷基，更优选甲基；
R4和R5各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C1-C6烷基羟基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、和C3-C6杂环基C1-C6烷基(所述杂环基选自例如哌啶基、四氢吡喃基等)；
R6选自卤素(优选氟和氯，更优选氟)、C1-C6烷基(优选甲基)、C1-C6烷氧基(优选甲氧基)、和C1-C6卤代烷基(优选三氟甲基)。
优选的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，
Figure BDA0002451468000000161
其中，
R1选自C1-C6烷基、任选地被1-2个独立地R6取代的苯基、任选地被1-2个独立地R6取代的噻吩基、和任选地被1-2个独立地R6取代的苯甲基，R1更优选为任选地被1-2个独立地R6取代的苯基；
R5选自氢、C1-C6烷基、和C3-C6环烷基，R5更优选为氢；
R6各自独立地选自卤素、C1-C6烷基、和C1-C6卤代烷基，R6更优选为氟、甲基或三氟甲基。
优选地，所述MST1/2抑制剂是选自以下化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物中的至少一种。
Figure BDA0002451468000000162
Figure BDA0002451468000000171
Figure BDA0002451468000000181
Figure BDA0002451468000000191
Figure BDA0002451468000000201
MST1/2激酶抑制剂优选上述化合物1和化合物25。
所述培养基所含的MST1/2激酶抑制剂的浓度较好是100nM以上且10μM以下，进一步优选300nM以上且3μM以下。
上皮干细胞和类器官的培养中，较好是每2天向培养基中添加MST1/2激酶抑制剂一次，或每4天一次将培养基更换为新鲜的培养基。
TGF-β抑制剂
转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是生长因子的一种，在肾脏、骨髓、血小板等几乎所有的细胞中产生。TGF-β存在五种亚型(β1～β5)。此外，已知TGF-β促进成骨细胞的增殖以及如胶原等结缔组织的合成及增殖，对上皮细胞的增殖和破骨细胞起到抑制性作用。一般来说，TGF-β抑制剂例如为阻止或抑制TGF-β对TGF-β受体的结合，是为了形成中和TGF-β活性的复合物而结合于TGF-β的化合物。此外，TGF-β抑制剂例如为与TGF-β受体结合，阻止或抑制TGF-β对受体的结合，是作为拮抗剂或反向激动剂发挥作用的化合物。
TGF-β抑制剂与不存在该抑制剂的条件下的TGF-β活性水平相比，具有较好是50％以上、更好是70％以上、进一步更好是80％以上、特别好是90％以上的抑制活性。TGF-β抑制活性可通过本领域技术人员公知的方法进行评价。作为所述评价体系，可例举利用荧光素酶报告基因的人PAI-1启动子或使用含Smad结合部位的报告构建体稳定转染细胞的细胞实验(De Gouville等,Br J Pharmacol,145(2):166-177,2005)。
作为本实施方式的乳腺上皮干细胞培养用培养基所含的TGF-β抑制剂，可例举A8301、SB431542、Repsox、SB505124、SB525334、SD208、LY36494、及SJN2511中的至少一种。作为本实施方式的乳腺上皮干细胞培养用细胞培养基所含的TGF-β抑制剂，其中较好是A8301。
本实施方式的培养基所含的TGF-β抑制剂的浓度较好是50nM以上且100μM以下，更好是100nM以上且50μM以下，进一步优选100nM以上且10μM以下。
上皮干细胞的培养中，较好是每2天向培养基中添加TGF-β抑制剂一次，或者每4天一次将培养基更换为新鲜的培养基。
受体酪氨酸激酶配体
作为本实施方式的培养基所含的受体酪氨酸激酶配体，可例举例如选自表皮生长因子(EGF)、双向调节素(Amphiregulin)、转化生长因子-α(TGF-α)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、神经调节素1(Neuregulin1)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)以及成纤维细胞生长因子10(FGF10)中的至少一种。受体酪氨酸激酶配体优选包括EGF、Neuregulin1和FGF7。其中，受体酪氨酸激酶配体的终浓度为1ng/ml至1000ng/ml，优选5ng/ml至500ng/ml，进一步优选10ng/ml～100ng/ml。
EGF是针对各种培养外胚层性细胞及中胚层性细胞的强力的分裂增殖因子，对部分的成纤维细胞的特异性细胞分化具有显著的影响。EGF前体通过蛋白质分解被切割，作为使刺激细胞的53-氨基酸肽激素生成的膜结合分子存在。
作为本实施方式的培养方法中使用的培养基所含的受体酪氨酸激酶配体，其中较好是EGF。本实施方式的细胞培养基所含的EGF的浓度较好是1ng/mL以上且1000ng/mL以下，更好是5ng/mL以上且500ng/mL以下，进一步优选5ng/mL以上且100ng/mL以下。
此外，本实施方式的细胞培养基中较好是EGF与双向调节素(Amphiregulin)或者神经调节素1(Neuregulin1)或者肝细胞生长因子(HGF)或者成纤维细胞生长因子7(FGF7)或者成纤维细胞生长因子10(FGF10)的组合，或者更优选包括EGF、Neuregulin1和FGF7的生长因子组合。
使用多种受体酪氨酸激酶配体，较好是较好是1ng/mL以上且1000ng/mL以下，更好是5ng/mL以上且500ng/mL以下，进一步更好是10ng/mL以上且100ng/mL以下。
在本实施方式的乳腺上皮干细胞的培养中，较好是每2天向培养基中添加受体酪氨酸激酶配体一次，或者每4天一次将培养基更换为新鲜的培养基。
P38信号转导抑制剂
本说明书中，“p38信号转导抑制剂”或“p38抑制剂”是指直接或间接地对p38信号传导进行负调节的任意的抑制剂。一般来说，p38信号传导抑制剂例如与p38结合并降低其活性。p38蛋白激酶是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的一部分。MAPK是对环境压力及炎症细胞因子等细胞外刺激进行应答、条件基因表达、有丝分裂、分化、增殖、及细胞生存/程序性死亡等各种细胞活性的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶。p38MAPK作为α、β、β2、γ、及δ同源异构体存在。此外，p38信号传导抑制剂也是例如与至少一种p38同源异构体结合并降低其活性的药剂。
p38信号传导抑制剂与不存在该抑制剂的条件下的p38活性水平相比，具有较好是50％以上、更好是70％以上、进一步更好是80％以上、特别好是90％以上的抑制活性。p38信号传导抑制剂产生的抑制效果可通过本领域技术人员公知的方法进行评价。作为所述的评价体系，可例举Thr180/Tyr182磷酸化的磷酸化部位特异性抗体检测方法、生化学重组激酶试验、肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌试验、p38抑制剂用的DiscoverRx高通量筛选平台、p38活性试验试剂盒(Sigma-aldrich公司制)等。
作为本实施方式的培养基所含的p38信号传导抑制剂，可例举例如SB202190、SB203580、VX-702、VX-745、PD169316、RO4402247、以及BIRB796中的至少一种。P38信号转导抑制剂优选SB202190。
所述培养基所含的p38信号传导抑制剂的浓度较好是50nM以上且100μM以下，更好是100nM以上且50μM以下，进一步更好是100nM以上且10μM以下。
上皮干细胞的培养中，较好是每2天向培养基中添加p38信号传导抑制剂一次，或者每4天一次将培养基更换为新鲜的培养基。
BMP抑制剂
骨形态发生蛋白(Bone Morphogeneitc Protein，BMP)作为二聚体配体与由2种不同的受体丝氨酸/苏氨酸激酶、I型及II型受体形成的受体复合物结合。II型受体将I型受体磷酸化，因而该受体激酶被激活。该I型受体接着将特异性受体底物(SMAD)磷酸化，因而通过信号传导通路产生转录活性。一般来说，BMP抑制剂例如为阻止或抑制BMP分子对BMP受体的结合，是为了形成中和BMP活性的复合物而结合于BMP分子的药剂。此外，BMP抑制剂例如为与BMP受体结合，阻止或抑制BMP分子对受体的结合，是作为拮抗剂或反向激动剂发挥作用的药剂。
BMP抑制剂与不存在该抑制剂的条件下的BMP活性水平相比，具有较好是50％以上、更好是70％以上、进一步更好是80％以上、特别好是90％以上的抑制活性。BMP抑制活性可通过使用本领域技术人员公知的方法(Zilberberg等,BMC Cell Biol,8:41,2007)测定BMP的转录活性来进行评价。
作为本实施方式的培养基所含的BMP抑制剂，较好是天然的BMP结合蛋白质，可例举例如包括头蛋白(Noggin)、格雷林(Gremlin)、腱蛋白(Chordin)、腱蛋白结构域等的腱蛋白样蛋白，包括卵泡抑素(Follistatin)、卵泡抑素结构域等的卵泡抑素相关蛋白，包括DAN、含DAN半胱氨酸结构域等的DAN样蛋白，硬骨素/SOST、核心蛋白聚糖(Decorin)、和α2-巨球蛋白等。也可为小分子抑制剂，例如DMH1。
作为本实施方式的培养基所含的BMP抑制剂，其中较好是腱蛋白样蛋白或DAN样蛋白，更好是腱蛋白样蛋白。作为腱蛋白样蛋白，较好是头蛋白。腱蛋白样蛋白和DAN样蛋白是扩散性蛋白质，以各种亲和度与BMP分子结合，可抑制BMP分子向信号传导受体的接近。通过将这些BMP抑制剂添加至上皮干细胞培养用细胞培养基中，可妨碍干细胞的丢失。
本实施方式的培养基所含的BMP抑制剂的浓度较好是1ng/ml至1000ng/ml，优选10ng/ml至500ng/ml，优选20ng/mL以上且100ng/mL以下。
干细胞的培养中，较好是每2天向培养基中添加BMP抑制剂一次，或者每4天一次将培养基更换为新鲜的培养基。
其他成分
本实施方式的细胞培养基可还包含Rock激酶(Rho-激酶)抑制剂。作为Rock激酶抑制剂，可以选择例如Y27632、法舒地尔、H-1152中的至少一种，较好的是使用Y27632。其中所述Rock抑制剂的终浓度为1μM至100μM，优选2μM至50μM，更优选5μM至10μM。在使用Y27632的情况下，较好是在呈单细胞分散的干细胞的培养的最初2天添加。本实施方式的培养基所含的Y27632的终浓度优选为1μM至100μM，较好的是2μM至50μM，更好是5μM至10μM。
本实施方式的细胞培养基可还包含纯化的、天然的、半合成的和/或合成的刺激细胞增殖的补充物，且不包含组分不明确成分，例如血清。本实施方式的乳腺上皮干细胞培养用细胞培养基所含的补充物可使用市售的补充物，例如B27(Gibco公司制)和/或N2(Gibco公司制)，优选以1:25～1:100的终浓度添加，更优选以1:50～1:100的终浓度添加。
本实施方式的细胞培养基还包含胰岛素。胰岛素是已公认的维持细胞体外生长的必须成分。本实施方式的培养基所含的胰岛素可使用市售的胰岛素，例如纯化的人胰岛素溶液(Sigma公司制)，或包含胰岛素的补充剂，例如胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS-X，Thermo Fisher Scientific公司制)。其中胰岛素在培养基内的终浓度为2μg/ml～20μg/ml；优选浓度为5μg/ml～10μg/ml。
本实施方式的细胞培养基可还包含至少一种可成为碳能量源的糖。作为本实施方式的细胞培养基所含的糖，可例举例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等。其中，作为糖，较好是葡萄糖，特别好是D-葡萄糖(右旋糖)。本实施方式的乳腺上皮干细胞培养用细胞培养基所含的糖在培养基内的终浓度为10mM～100mM，优选15mM～40mM。
本实施方式的细胞培养基可还包含烟酰胺和/或N-乙酰半胱氨酸。烟酰胺在本实施方式中的作用为抗氧化剂，有利于类器官的形成。本实施方式的改良类器官培养基所含的烟酰胺在培养基内的终浓度为1mM～10mM，优选2mM～5mM。N-乙酰半胱氨酸为促类器官增殖刺激物，也具有促进类器官生长的作用。本实施方式的改良类器官培养基所含的N-乙酰半胱氨酸在培养基内的终浓度为0.1mM～5mM，优选0.5mM～2mM。
[实施方式1]
本发明的实施方式1所涉及的培养方法是用于培养正常乳腺组织来源或病变乳腺组织来源的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任一种的组织的培养方法。
其中，所述方法包括以下步骤：
(1)制备细胞外基质；
(2)将上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任一种的组织与细胞外基质粘附，添加于所述细胞外基质上或包埋于细胞外基质中；
(3)采用本发明的培养基对所述上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任一种的组织进行培养，得到扩增的、相应的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞后代或类器官后代。
如果采用本实施方式的培养方法，可长期培养来源于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任一种的组织，得到扩增的、相应的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞后代或类器官后代。
以下，对本实施方式的培养方法中的各步骤进行详细说明。
细胞外基质的制备
一般来说，“细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)”是指生物中存在于细胞外的超分子结构。该ECM成为用于上皮干细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞的组织增殖的基础。
ECM包含各种各样的多糖、水、弹性蛋白、及糖蛋白。作为糖蛋白，可例举例如胶原、巢蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等。作为多糖，可例举例如蛋白多糖、糖胺多糖等。作为弹性蛋白可例举弹力纤维等。
本实施方式的ECM可使用市售的ECM。例如细胞外基质蛋白质(Invitrogen公司制)、来源于Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的基底膜制备物(MatrigelTM(BD生物科技公司制))等。可使用ProNectin(SigmaZ378666)等合成ECM。此外，可使用天然ECM和合成ECM的混合物。本实施方式优选来源于EHS小鼠肉瘤细胞的基底膜制备物(MatrigelTM(BD生物科技公司制))。
使用ECM来培养上皮干细胞的情况下，可强化干细胞的长期生存及未分化干细胞的持续存在。在不存在ECM的条件下，无法长期培养干细胞培养物，观察不到未分化干细胞的持续存在。另外，如果存在ECM，则可培养在不存在ECM的条件下无法培养的上皮干细胞。
ECM可与上皮干细胞混匀并将细胞包埋于ECM内部。通常ECM沉于悬浮有细胞的培养皿的底部。例如，ECM在37℃凝固时，可加入上述的上皮干细胞培养基，使其扩散于ECM中使用。培养基中的细胞可通过与ECM的表面结构相互作用，例如通过与整联蛋白相互作用而固定于ECM。
ECM可包被于培养容器的表面使用。更具体而言，用无血清的培养基稀释细胞外基质胶，培养基可以是本发明的细胞培养基，也可以是上述的细胞培养基本培养基。细胞外基质胶的稀释比例为例如1:20～400，进一步更好的范围为1:50～200。包被方法为将稀释后的细胞外基质胶加入培养器皿内，使其完全覆盖培养器皿底部。在37℃条件下静置，包被时间为至少30分钟，进一步更好的范围为30～60分钟。包被结束后吸弃多余的细胞外基质胶稀释液，培养器皿备用。
细胞与ECM的粘附
接着，准备乳腺上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任一种的组织。
作为从乳腺上皮组织分离上皮细胞的方法，可例举本技术领域中公知的方法。例如，乳腺上皮细胞可以来源于乳腺癌组织样本和癌旁组织样本。乳腺癌组织样本例如来源于进行过说明并获得同意的乳腺肿瘤患者手术切除癌组织样本，癌旁组织样本采集自离乳腺癌组织距离至少5cm以上的乳腺组织。在患者手术切除或活检后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，切取非坏死部位的组织样本，其体积在0.5cm3以上，将其置于预冷的10～50mL DMEM/F12培养基中，培养基盛在塑料无菌带盖离心管内，冰上运输至实验室；其中，DMEM/F12培养基中含有50～200U/mL(例如100U/mL)青霉素和50～200μg/mL(例如100μg/mL)链霉素(以下简称运输液)。
在生物安全柜内，将组织样本转移至细胞培养皿内，用运输液润洗组织样本，将组织样本表面的血细胞清洗掉，并剔除组织样本表面的皮肤、筋膜等不需要的组织。
将润洗后的组织样本转移至另一个新的培养皿内，加入5～25mL运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为直径小于1mm3的组织碎块。
将组织样本碎块转移至离心管内，用台式离心机以至少1000转/分钟离心3～10分钟；然后用移液器小心移除离心管内上清，再用5～25mL含胶原酶II(0.5～5mg/mL，例如1mg/mL)和胶原酶IV(0.5～5mg/mL，例如1mg/mL)的无血清DMEM/F12培养基重悬，置37℃恒温摇床上进行振荡消化，时间为至少1小时(消化时间取决于样本大小；如果样本大于1g，则消化时间增至1.5～2小时)；之后用台式离心机以至少300g/分钟离心3～10分钟，弃去上清液，消化后的组织细胞用5～25mL含例如10％小牛血清的DMEM/F12培养基重悬，研磨过筛，细胞筛孔径为40～100μm(例如100μm)，将过筛的细胞悬液收集于离心管中；用血细胞计数板计数。
然后将细胞悬液在离心机中以至少300g/分钟离心3～10分钟，弃去上清，再用本发明的原代细胞培养基重悬。
将通过上述的方法分离的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任一种的组织接种至所述制备步骤中得到的细胞外基质上并静置。接种的细胞可通过与ECM的表面结构相互作用，例如通过与整联蛋白相互作用而粘附于ECM。
细胞培养
接着，细胞接种后，在细胞未干燥之前，添加本发明的培养基进行培养。培养温度较好是30℃以上且40℃以下，更好是37℃左右。培养时间可根据使用的细胞适当调整。培养开始起1～2周左右后，可得到扩增的、相应的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞后代或类器官后代。此外，对于以往仅可维持培养1个月的细胞，通过本实施方式的培养方法，即可达到3个月以上的较长培养时间，也可进行细胞的维持培养。使用本实施方式的培养方法培养上皮干细胞的情况下，可长期维持细胞的自我更新和分化能力，体外培养发生基因突变的频率极低。
此外，本实施方式的细胞培养步骤，不但可在常氧条件下，还可在低氧条件下进行培养。通过在低氧条件下进行，可由包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织得到扩增的、相应的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞后代或类器官后代。
本实施方式中的低氧条件下是指氧浓度较好是0.1％以上且15％以下，更好是0.3％以上且10％以下，进一步更好是0.5％以上且5％以下。
类器官
通过本发明的实施方式1所涉及的培养方法可获得类器官。
本实施方式的类器官可应用于再生医疗、上皮细胞的基础医学研究、药物应答的筛选、使用来源于疾病的上皮类器官的新药研发等。
用途
本实施方式中，本发明提供用于药物应答的筛选、毒性试验、或者再生医疗的上述的上皮干细胞的用途。
药物应答的筛选中，使用上述培养方法培养的上皮干细胞的情况下，将上述上皮干细胞在例如96孔板或384孔板等多孔板中进行培养。使用分子库，鉴定对该上皮干细胞产生影响的分子。作为分子库，可例举例如抗体片段库、肽噬菌体展示库、肽库(例如LOPAP(商标)，Sigma-Aldrich公司制)、脂质库(BioMol公司制)、合成化合物库(MCE公司制)或者天然化合物库(Specs，TimTec公司制)等。另外，可使用基因文库。作为基因文库，可例举例如cDNA文库、反义文库、siRNA、或者其他非编码RNA文库等。作为具体方法，可例举将培养获得的细胞在试验药剂的多个浓度暴露一定的时间，暴露时间结束时，对培养物进行评价的方法。此外，本实施方式获得的上皮干细胞也可用于鉴定特异性靶向上皮肿瘤细胞，但不靶向正常细胞的药物。
另外，本实施方式获得的上皮干细胞可在新候选药物或者已知或新的营养补充食品的毒性实验中代替Caco-2细胞等细胞株使用。
另外，本实施方式获得的上皮干细胞可用于培养目前没有适当的组织培养或动物模型的例如诺如病毒等病原体。
此外，本实施方式获得的上皮干细胞可用于再生医疗中，例如应用于放射线照射后或术后的乳腺组织修复中。
以下，通过实施例对本发明进行说明，但本发明并不受到以下的实施例的限制。
[实施例1]
1.MST1/2激酶抑制剂化合物1的制备
4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯 磺酰胺1
Figure BDA0002451468000000301
2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A2)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸(2.0克)后加入甲醇(30毫升)，随后冰浴下滴加二氯亚砜(1.2毫升)。反应体系在85℃反应过夜。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得白色固体，直接用于下一步。
2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A3)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2克)后加入丙酮(30毫升)和碳酸钾(2.2克)，然后用冰盐浴使体系冷却到-10℃，接着缓慢加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶(3.1克)的丙酮溶液。反应体系在室温搅拌过夜。反应结束后，过滤，滤液在减压下除去溶剂，残留物经加压硅胶柱层析提纯后得化合物A3。LC/MS：M+H 359.0。
2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A4)：在圆底烧瓶中加入2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2.5克)后加入醋酸(50毫升)和铁粉(3.9克)。反应体系在60℃搅拌两小时。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得物用饱和碳酸氢钠中和至碱性。乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A4。LC/MS：M+H 297.0。
2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A5)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(2克)和N,N-二甲基乙酰胺(10毫升)，冷却至-35℃，加入碘甲烷(0.9毫升)，随后加入氢化钠(615毫克)，反应体系继续搅拌两小时。反应结束后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A5。LC/MS：M+H325.0。
4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(1)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(100毫克)、磺胺(53毫克)、对甲苯磺酸(53毫克)和仲丁醇(5毫升)。反应体系在120℃搅拌过夜。反应结束后，过滤，甲醇和乙醚洗涤得化合物1。LC/MS：M+H 461.1。
2.化合物25及本发明的其他MST1/2抑制剂化合物的制备4-((5,8-二甲基-6-氧 代-7-(邻甲苯基)-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯磺酰胺25
Figure BDA0002451468000000311
化合物25的合成通过使用类似于化合物1中所述的步骤完成。MS(ESI)m/z(M+1)+：439.15。
本发明的其他MST1/2抑制剂化合物按照与化合物1类似的方法合成，其结构及质谱数据如下表所示。
Figure BDA0002451468000000312
Figure BDA0002451468000000321
Figure BDA0002451468000000331
Figure BDA0002451468000000341
Figure BDA0002451468000000351
3.乳腺上皮干细胞培养用细胞培养基的制备
首先，向市售的DMEM/F-12培养基(Corning公司制)以最终浓度10μg/ml加入胰岛素(Sigma-Aldrich公司制，市售产品浓度10mg/mL，以1:1000的体积比加入培养基)，以1:50的终浓度加入B27，以100ng/mL的条件添加头蛋白(Noggin，R&D公司制)，以最终浓度500nM条件添加TGF-β抑制剂A8301(MCE公司制)，以最终浓度500nM条件添加P38信号转导抑制剂SB202190(MCE公司制)，以最终浓度10μM条件添加ROCK激酶抑制剂Y27632(MCE公司制)。
然后，添加最终浓度20ng/mL的表皮生长因子EGF(R&D公司制)、最终浓度5ng/mL的成纤维细胞生长因子7FGF7(R&D公司制)、最终浓度10ng/mL的神经调节素1Neuregulin1(Peprotech公司制)、最终浓度15.8mM的葡萄糖(Peprotech公司制)，制备成培养乳腺上皮干细胞的基础培养基。(以下也称“基础培养基”或“基培”)。
接着，以最终浓度1μM条件添加化合物1或化合物25。制备构成成分为以下组合的培养基。
·基础培养基+化合物1
4.来源于乳腺肿瘤的上皮肿瘤细胞的培养
基于中国科学院合肥物质科学研究院医学伦理委员会认可的伦理研究计划，从进行说明并获得同意的乳腺肿瘤患者的乳腺癌组织中获取病变组织样本(HMFL-XN26)。接着，按照实施方式1中的步骤获得新鲜分离的上皮肿瘤细胞。然后，将上皮肿瘤细胞接种至包被有MatrigelTM(BD Biosciences公司制)的24孔板。包被方式为用无血清的培养基稀释Matrigel，培养基可以是本发明的原代细胞培养基，也可以是DMEM/F12(Corning：R10-092-CV)。Matrigel的稀释比例为1:50-400，优选为1:100-200。将稀释后的Matrigel加入培养器皿内，使其完全覆盖培养器皿底部，静置包被30分钟以上，优选在37℃条件下静置包被，优选包被30～60分钟。包被结束后吸弃多余的Matrigel稀释液，培养器皿备用。
向接种了上述上皮肿瘤细胞的孔中分别添加基础培养基、基础培养基+化合物1的培养基各1mL，在37℃以氧浓度20％的条件进行培养。培养开始后每2天进行一次培养基的更换。待培养6天后，弃去原24孔板内的培养基上清，加入0.5mL 0.05％胰酶(ThermoFisher公司制)对细胞进行消化，37℃下孵育15分钟后，用含有10％(v/v)小牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液5mL重悬消化处理后的细胞并收集至离心管内，以300g/分钟转速离心5分钟。使用本发明的培养基重悬离心后的细胞沉淀，细胞计数板对细胞悬液进行计数。按4×104个/孔密度将细胞分别接种至另一包被有MatrigelTM(BDBiosciences公司制)的24孔培养板中继续培养。
当传代后的细胞在培养板内继续生长至铺满培养板底部约80％后，再次按上述操作方法消化收集所培养获得的细胞并计数。同样按4×104个/孔密度接种并持续培养。
图1A是表示样本HMFL-XN26分别在各培养条件下自初代培养(传代0)开始后培养第4代、第5代、第6代和第7代的细胞镜下照片对比(100倍倒置相差显微镜下)。样本HMFL-XN26在基础培养基的条件下培养至第6代则出现生长停滞现象。而采用基础培养基+化合物1的培养基在细胞培养至第6代后仍然能够对乳腺上皮细胞持续进行培养。图1B是对各培养基中的乳腺肿瘤细胞的培养代数定量化而得的图表。图1C是以培养天数为横坐标，群体倍增数为纵坐标，采用Graphpad Prism7.0软件绘制的各培养条件下乳腺肿瘤细胞的生长曲线。群体倍增数的计算公式为：
群体倍增数＝[log(N/X0)]/log2
其中，N为传代时的细胞数目，X0为初始接种时的细胞数目(Greenwood等，EnvironMol Mutagen 2004，43(1):36-44)。根据图1A～C确认，与基础培养基相比，将化合物1添加至培养基中，乳腺上皮细胞在体外可持续培养的代数至少提高一倍。
[实施例2]
1.根据实施例1相同的方式制备基础培养基。
2.按照实施方式1中的步骤获得新鲜分离的上皮肿瘤细胞样品(HMFL-XN40)。然后，将上皮肿瘤细胞接种至包被有MatrigelTM(BD Biosciences公司制)的6孔板。向接种了上述上皮肿瘤细胞的孔中添加基础培养基，在37℃以氧浓度20％的条件进行培养。按实施例1的4的步骤进行消化、传代、培养和计数并持续培养3代。在进行第4代肿瘤细胞接种时，将上皮肿瘤细胞按3×104个/孔的细胞密度均匀地接种至包被有MatrigelTM(BDBiosciences公司制)的24孔板的各孔中。接种，分别向各孔加入含基础培养基+DMSO和含基础培养基+化合物1的培养基各1mL，化合物1的在培养基内的浓度由低到高分别是0.1μM、0.3μM、1μM、3μM和10μM。
图2是HMFL-XN40自第4代持续培养至第6代，每一代的乳腺肿瘤细胞在各培养条件下的细胞计数结果。根据图2确认，与基础培养基+溶剂对照(DMSO)组相比，将0.3μM～3μM的化合物1添加至培养基中，乳腺上皮细胞在体外持续扩增的效果较为明显；10μM的化合物1则不能实现促进乳腺肿瘤细胞体外持续扩增的效果，可能是化合物在培养基内的浓度过高影响了细胞内其他蛋白靶点所致。
[实施例3]
1.根据与实施例1相同的方式制备基础培养基和构成成分为以下组合的培养基。
·基础培养基+1μM化合物1
·基础培养基+1μM化合物25
2.根据实施例1之4进行来源于乳腺肿瘤细胞的培养
基于中国科学院合肥物质科学研究院医学伦理委员会认可的伦理研究计划，分别获取两例进行说明并获得同意的乳腺肿瘤患者的癌组织样本(HMFL-XN34和HMFL-XN35)。接着，按照实施方式1中的步骤获得上皮肿瘤细胞。然后，将由HMFL-XN34获得的上皮肿瘤细胞接种至包被有MatrigelTM(BD Biosciences公司制)的24孔板。向接种了上述上皮肿瘤细胞的孔中分别添加基础培养基、基础培养基+化合物25(终浓度为1μM)的培养基各1mL，在37℃以氧浓度20％的条件进行培养。HMFL-XN35按同样的方式接种于24孔板中，分别添加基础培养基、基础培养基+化合物1(终浓度为1μM)的培养基，在37℃以氧浓度20％的条件进行培养。分别在培养开始后每2天进行一次培养基的更换。
按实施例1之4的步骤进行消化、传代、培养和计数。
图3A是表示源自HMFL-XN34的乳腺上皮细胞分别在添加或不添加化合物25的培养条件下自初代培养(传代0)开始后第4代(共培养34天)的细胞镜下照片对比(100倍倒置相差显微镜下)，以及源自HMFL-XN35的乳腺上皮细胞分别在添加或不添加化合物1的培养条件下自初代培养(传代0)开始后第6代(共培养42天)的细胞镜下照片对比(100倍倒置相差显微镜下)。图3B是对各培养条件下培养的不同的乳腺肿瘤细胞的细胞计数结果进行归一化后的统计结果。
根据图3A和B确认，与基础培养基相比，将化合物1或化合物25添加至培养基中，能实现体外对乳腺癌肿瘤细胞增殖的持续促进的效果。
[实施例4]
1.根据与实施例1相同的方法制备基础培养基和构成成分为以下组合的培养基：
·基础培养基+1μM化合物1
2.根据实施例2之2进行来源于HMFL-XN35的乳腺肿瘤细胞的培养、消化、传代和计数。
图4A的1和2号图分别表示的是源自HMFL-XN35的乳腺上皮细胞在添加化合物1的培养条件下自初代培养(传代0)开始后不断传代持续培养至第18代后，将细胞进行常规消化，并按3×104密度再次传代接种，接种时将细胞分别培养在原培养基(基础培养基+1μM化合物1，图4A之1号图)和撤去化合物1的培养基(基础培养基，图4A之2号图)中，继续培养8天后的细胞镜下照片。图4A的3号图是表示在2号图中的细胞中，又重新添加化合物1入培养基中，再培养8天后的细胞镜下照片(100倍倒置相差显微镜下)。图4B是对各培养条件下培养的不同的乳腺肿瘤细胞的细胞计数结果进行归一化后的统计结果，其中以基础培养基+1μM化合物1进行培养8天的细胞计数结果为基准100％，撤去化合物1的培养基在培养8天后产生的细胞计数低于基准的50％，而重新将化合物1加入培养基再培养8天后，细胞计数得以显著增加。
根据图4A和B确认，MST1/2激酶抑制剂化合物1是实现本发明的培养基在体外保持乳腺上皮细胞持续增殖的必须成分，且化合物1实现体外对乳腺癌肿瘤细胞增殖的持续促进的效果是可逆的。
[实施例5]
1.根据与实施例1相同的方法制备基础培养基和构成成分为以下组合的培养基：
·基础培养基+1μM化合物1
2.制备改良类器官培养基
向市售的DMEM/F-12培养基(Corning公司制)以最终浓度10μg/ml加入胰岛素(Sigma-Aldrich公司制)，以1:50的终浓度加入B27，以最终浓度100ng/mL的条件添加头蛋白(Peprotech公司制)，以最终浓度1μM条件添加化合物1，以最终浓度500nM条件添加A8301(MCE公司制)，以最终浓度500nM条件添加SB202190(MCE公司制)，以最终浓度10μM条件添加Y27632(MCE公司制)。然后，添加最终浓度5ng/mL的表皮生长因子(EGF)(R&D公司制)、最终浓度5ng/mL的FGF7(R&D公司制)、最终浓度5ng/mL的FGF10(R&D公司制)、最终浓度10ng/mL的Neuregulin1(Peprotech公司制)、最终浓度1.25mM的N-乙酰半胱氨酸(Sigma-Aldrich公司制)、最终浓度5mM的烟酰胺(Sigma-Aldrich公司制)，制备成培养乳腺类器官的培养基。由于该培养基内没有加入公认的类器官培养基中的必加成分R-海绵硬蛋白这个昂贵的成分，从而降低了类器官成本。以下也称“改良类器官培养基”。
3.基于中国科学院合肥物质科学研究院医学伦理委员会认可的伦理研究计划，从进行说明并获得同意的乳腺肿瘤患者的癌旁组织中获取乳腺组织样本(HMFL-XN28)。作为正常的乳腺组织采集距离乳腺肿瘤至少5cm以上的部分。接着，按照实施方式1中的相同步骤获得新鲜分离的正常乳腺上皮细胞，然后按照实施例2之2的步骤进行体外培养。
图5A是表示源自HMFL-XN28的癌旁组织的正常乳腺上皮细胞在基础培养基+化合物1的培养条件下自初代培养(传代0)开始后培养至第2天和持续培养至第18天的细胞镜下照片(100倍倒置相差显微镜下)。
4.根据实施例2之2分离得到来源于HMFL-XN34的乳腺肿瘤细胞并接种于包被有MatrigelTM(BD Biosciences公司制)的24孔板。接着，在接种了上述上皮肿瘤细胞的孔中添加基础培养基+化合物1的培养基1mL，在37℃以低氧浓度2％的条件进行培养。图5B是表示源自HMFL-XN34的乳腺肿瘤细胞在基础培养基+化合物1的培养条件下自初代培养(传代0)开始后培养至第4天和培养至第32天的细胞镜下照片(100倍倒置相差显微镜下)。
根据图5A和B可以确认，本发明的培养基能实现体外对正常乳腺上皮细胞增殖的持续促进效果并且在缺氧条件下也能够持续培养乳腺肿瘤细胞。
5.根据实施例2之2分离得到来源于HMFL-XN35的乳腺肿瘤细胞。接着，将上皮肿瘤细胞与40μL的MatrigelTM(BD Biosciences公司制)一起接种至24孔板。向接种了上述上皮肿瘤细胞的孔中添加改良类器官培养基，在37℃以氧浓度20％的条件进行培养。培养开始后每2天进行一次培养基的更换。图5C是表示自初代培养(传代0)的培养开始后第4天的以及第38天的图像(100倍倒置相差显微镜下)。
根据图5C可以确认，本发明的改良类器官培养基能实现体外对乳腺肿瘤类器官的高效培养。
[实施例6]
1.根据与实施例1相同的方法制备基础培养基和构成成分为以下组合的培养基。
·基础培养基+化合物1
·基础培养基+化合物25
2.按照实施方式1中的步骤获得新鲜分离的上皮肿瘤细胞样品(HMFL-XN40)。然后，将上皮肿瘤细胞接种至包被有MatrigelTM(BD Biosciences公司制)的6孔板。向接种了上述上皮肿瘤细胞的孔中分别添加基础培养基、基础培养基+化合物25的培养基各3mL，化合物25的浓度由低到高分别是1μM和3μM。在37℃以氧浓度20％的条件进行培养。培养开始后每2天进行一次培养基的更换。待培养72小时后，收集各组细胞，采用公认的免疫印迹法检测化合物25对MST1/2的直接底物MOB1的磷酸化，以及对干细胞标志物Lgr5的影响。结果如图6A所示。检测结果显示，MST1/2激酶抑制剂化合物25能够剂量依赖性地抑制MST1/2激酶直接底物的磷酸化，并且对乳腺肿瘤细胞的干性标志物Lgr5有明显上调。
由于Lgr5是Wnt-依赖性干细胞标志物(Barker等，Mol Cell Biol，22:1184-93，2002)，且Lgr5对乳腺细胞的自我更新和持续增殖具有重要作用(Plaks等，Cell Reports，3，70-78，2013)，这一结果提示化合物25能够通过抑制乳腺肿瘤细胞的MST1/2介导的信号通路，从而维持了乳腺癌细胞干性增殖的特性，并起到在体外持续促进乳腺癌细胞增殖的作用。
3.按照实施例1中的步骤获得新鲜分离的上皮肿瘤细胞样本(HMFL-XN41)。将分离得到的上皮肿瘤细胞分成三等分。第一等分直接收集；第二和第三等分的上皮肿瘤细胞分别接种至包被有MatrigelTM(BD Biosciences公司制)的6孔板。向接种了上述上皮肿瘤细胞的孔中分别添加基础培养基、添加化合物1基础培养基各3mL，化合物1的浓度为1μM。在37℃以氧浓度20％的条件进行培养。培养开始后每2天进行一次培养基的更换。待培养96小时后，收集各组细胞，采用公认的免疫印迹法检测化合物1对乳腺肿瘤细胞内的MST1/2、MST1/2的直接底物MOB1、以及下游和细胞生长增殖相关的激酶ERK1/2的磷酸化的影响，同时检测对乳腺癌干细胞标志物Lgr5和其同家族与Lgr5功能类似的干性标志物Lgr4和Lgr6的影响。结果如图6B所示。检测结果显示，这例新鲜分离的乳腺肿瘤细胞(HMFL-XN41)在基础培养基中培养96小时后，MST1/2激酶介导的信号通路发生活化，而与细胞生长和增殖相关的ERK激酶受到抑制，干性标记物Lgr5及其相关蛋白也受到抑制，表明基础培养基导致了MST1/2激酶介导的细胞凋亡通路的激活。添加化合物1后能够明显抑制MST1/2激酶介导的信号通路的活化，刺激促增殖信号分子ERK的活化，并且对乳腺肿瘤细胞的干性标志物家族成员Lgr4、Lgr5和Lgr6均有明显地上调。这表明化合物1和化合物25一样，能够抑制乳腺肿瘤细胞的MST1/2介导的信号通路并能够促进肿瘤细胞的持续增殖。
4.按照上述步骤获得新鲜分离的上皮肿瘤细胞样本(HMFL-XN42)。将分离得到的上皮肿瘤细胞分成五等分。第一等分直接收集；第二和第三等分的上皮肿瘤细胞分别接种至包被有MatrigelTM(BD Biosciences公司制)的6孔板。向接种了上述上皮肿瘤细胞的孔中分别加入的基础培养基各3mL，分别培养48小时和96小时后收集；第四和第五等分的上皮肿瘤细胞分别接种至包被有MatrigelTM(BD Biosciences公司制)的6孔板，并向孔中分别加入添加了1μM化合物1的基础培养基各3mL，分别培养48小时和96小时后收集。在37℃以氧浓度20％的条件进行培养。培养开始后每2天进行一次培养基的更换。待培养48和96小时后，分别收集各组细胞，采用公认的免疫印迹法检测化合物1在不同时间点对乳腺肿瘤细胞内的Wnt信号通路下游的重要信号分子TCF4/TCF7L2的影响，同时检测对乳腺癌干细胞标志物Lgr5和其同家族与Lgr5功能类似的干性标志物Lgr4和Lgr6的影响。结果如图6C所示。检测结果显示，这例新鲜分离的乳腺肿瘤细胞(HMFL-XN42)在基础培养基中分别培养48小时和96小时后，干性标记物Lgr5及其相关蛋白Lgr4和Lgr6可时间依赖性地表达上调，同时Wnt下游的重要信号分子TCF4/TCF7L2的表达也上调，提示基础培养基本身对这一例病人源性乳腺肿瘤细胞的干性增殖有一定的促进作用。在添加化合物1后，乳腺肿瘤细胞的干性标志物家族成员Lgr4、Lgr5和Lgr6以及TCF4/TCF7L2呈现时间依赖性地上调，且对乳腺组织的自我更新和持续增殖具有重要作用的Lgr5上调得比不加化合物1时更加明显。这表明化合物1能够时间依赖性的促进肿瘤细胞在体外的持续增殖。
[实施例7]
1.根据与实施例1相同的方法制备基础培养基和构成成分为以下组合的培养基：
·基础培养基+1μM化合物1
2.采用与实施例3的相同步骤分别将乳腺肿瘤细胞样本(HMFL-XN32和HMFL-XN33)进行体外持续培养。将体外培养并传代10次的乳腺癌肿瘤细胞(HMFL-XN32，P10)和乳腺癌病人直接来源的肿瘤组织，分别使用DNeasy blood&tissue kit(QIAGEN公司制)提取细胞和相应组织的基因组DNA。收集细胞来源患者的外周血2mL，采用同样的方法提取基因组DNA作为背景对照。随后，对细胞和血液样本的基因组DNA进行全外显子组测序(具体操作步骤参见Hans Clevers等，Cell，11；172(1-2):373-386，2018)，并对测序结果进行基因拷贝数变异分析。HMFL-XN33(P12)及相应组织的数据采用和上述同样的方法获得。图7A和B表示体外培养的乳腺肿瘤细胞和对应组织的全外显子组的基因拷贝数变异的散点图。
经图7A和B可以确认，体外持续培养的乳腺肿瘤细胞的基因拷贝数的获得和缺失的位置和数目与病人原始肿瘤组织基本保持一致。
图8表示按照上述步骤对另外4例乳腺癌组织样本培养获得的乳腺肿瘤细胞(HMFL-XN34、HMFL-XN35、HMFL-XN38和HMFL-XN39)与相应肿瘤组织的全外显子组数据进行肿瘤高频基因突变数目分析比对的结果。分析结果使用https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html软件制作。经图8可以确认培养的癌组织来源的乳腺癌肿瘤细胞和相对应的肿瘤组织内的的高频突变基因基本一致，说明本发明的培养基和培养方法所培养出的乳腺肿瘤细胞能够保持病人癌组织内原始的基因突变特性。
[实施例8]
1.根据实施例1之4的同样步骤获得HMFL-XN35的乳腺肿瘤组织样本。从乳腺癌患者的样本中取出约黄豆粒大小的癌组织，浸泡在10mL 4％多聚甲醛中固定，用于下面的苏木素-伊红(HE)染色法和免疫组织化学(IHC)法检测。其余组织使用实施例3的步骤将HMFL-XN35持续培养至第10代，培养基为基础培养基+1μM化合物1，同样进行下面的(HE)染色法和免疫组织化学(IHC)法检测。
2.采用苏木素-伊红(HE)染色法和免疫组织化学(IHC)法检测HMFL-XN35细胞及细胞来源的原始组织内乳腺癌细胞形态及与乳腺癌相关的重要生物标记物的表达情况。
4％多聚甲醛固定后的组织，经石蜡包埋，用切片机切成4μm厚的组织切片。随后进行常规的HE染色和IHC检测。HE染色使用HE染色试剂盒(Solarbio公司制)操作。具体实验步骤参照试剂盒的使用说明书。
免疫组织化学检测(IHC)具体步骤参见Yu等，Science，345(6193):216-220，2014。IHC所用的一抗为ER(Cell Signaling Technology公司制)、PR(Cell SignalingTechnology公司制)、HER2(Cell Signaling Technology公司制)。所用的二抗为SignalStain Boost IHC Detection Reagent(HRP,Rabbit)(Cell Signaling Technology公司制)、SignalStain Boost IHC Detection Reagent(HRP,Mouse)(Cell SignalingTechnology公司制)。其中，ER、PR是预测患者是否可接受内分泌治疗的重要指标；HER2是预测患者是否可接受抗HER2靶向治疗的重要指标，目前这些指标也是临床上用于乳腺癌的分子分型病理诊断的重要依据。
HE染色是临床上用于乳腺癌病理诊断的重要依据。分别拍摄原始组织和培养至第10代的细胞的HE染色情况和ER、PR、HER2的表达情况(200倍生物显微镜下)。结果如图9所示。其中，HE染色结果显示组织内的细胞和体外培养的细胞形态较为一致，均为乳腺癌细胞。免疫组化结果显示原始患者的分子分型为ER(-)、PR(-)、HER2(+)，培养至第10代时的乳腺癌细胞的分子分型也为ER(-)、PR(-)、HER2(+)。
由图9可以确认，采用本发明技术培养至第10代时细胞与原始组织内细胞病理形态保持一致，细胞上与乳腺癌相关的生物标记物的表达情况与原始组织的标记物表达情况一致。说明采用本发明技术所培养的乳腺肿瘤细胞保持了乳腺癌病人原始的病理特性。
[实施例9]
下面以乳腺癌患者手术切除样本为例，说明由病人来源的乳腺癌肿瘤样本培养得到的乳腺癌肿瘤细胞可以用于检测病人肿瘤细胞对不同药物的敏感性。
1.根据与实施例1相同的方法制备构成成分为以下组合的培养基：
·基础培养基+1μM化合物1
2.乳腺癌肿瘤细胞的铺板：将通过实施例3的步骤培养得到的乳腺癌肿瘤细胞(HMFL-XN38第10代和HMFL-XN39第11代)的单细胞悬液，按3000～5000个/孔密度接种于384孔板中，使细胞贴壁过夜。
3.药物梯度实验：
(1)采用浓度梯度稀释的方法配制药物贮存板：取待测药物母液(药物母液浓度按20μM配制)，按照1:3稀释，依次得到7种浓度的药物。将不同浓度的药物按10μL体积加入384孔药物储存板中。溶剂对照组各孔加入等体积的DMSO。本实施例中，待测药物为阿法替尼(MCE公司制)、拉帕替尼(MCE公司制)、多西他赛(MCE公司制)和他莫昔芬(MCE公司制)。
(2)使用高通量自动化工作站(购自Perkin Elmer公司)将384孔药物贮存板内的不同浓度药物和溶剂对照加入到铺有乳腺癌肿瘤细胞的384孔细胞培养板中，药物组和溶剂对照组都各设3个复孔。每孔加入药物体积为100nL。
(3)细胞活性检测：给药72小时后，用Cell Titer-Glo检测试剂(Promega公司制)检测加药培养后细胞的化学发光数值，化学发光数值的大小反映细胞活力以及药物对细胞活力的影响，每孔加入配制好的Cell Titer-Glo检测液，混匀后使用酶标仪检测化学发光数值。
使用Graphpad Prism 7.0软件作图并计算半数抑制率IC50。
图10A和B分别表示从两个不同的乳腺癌患者的手术切除癌组织样本所培养获得的乳腺癌肿瘤细胞样本(HMFL-XN38和HMFL-XN39)对化疗药物多西他赛、内分泌治疗药物他莫昔芬、和靶向药物拉帕替尼以及阿法替尼的敏感性。结果显示，同一病人的细胞对不同药物具有不同的敏感性，不同病人的细胞对同一药物的敏感性也不同。
其中，源自激素受体阴性、HER2受体阳性的乳腺癌患者的乳腺癌肿瘤细胞(HMFL-XN38)对HER2靶向药物拉帕替尼和阿法替尼敏感；而对内分泌药物他莫昔芬的敏感性较低。而另一例三阴性乳腺癌患者的乳腺癌肿瘤细胞(HMFL-XN39)则对化疗药物多西他赛敏感，而对三种所测试的靶向药物均不敏感。
根据图10确认，本发明技术所培养的乳腺癌病人癌组织来源的乳腺癌肿瘤细胞对化疗药物和靶向药物的敏感性测试结果与病人临床的分子分型相符，提示本发明技术所培养得到的乳腺癌肿瘤细胞在预测乳腺癌患者临床药物疗效方面具有应用潜力。
虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (19)

1.一种乳腺上皮干细胞培养基，其特征在于：
含有TGF-β抑制剂、B27和/或N2、胰岛素、受体酪氨酸激酶配体、Rock激酶抑制剂、P38信号转导抑制剂、骨形态发生蛋白抑制剂、以及MST1/2激酶抑制剂。
2.如权利要求1所述的乳腺上皮干细胞培养基，其中所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，
Figure FDA0002451467990000011
其中，
R1选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C2-C6螺环烷基、以及任选地被1-2个独立地R6取代的芳基、芳基C1-C6烷基和杂芳基；
R2和R3各自独立地选自C1-C6烷基；
R4和R5各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C1-C6烷基羟基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、和C3-C6杂环基C1-C6烷基；
R6选自卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和C1-C6卤代烷基。
3.如权利要求2所述的乳腺上皮干细胞培养基，其中
R1选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C2-C6螺环烷基、以及任选地被1-2个独立地R6取代的苯基、萘基、苯甲基和噻吩基；
R2和R3各自独立地选自C1-C3烷基；
R4和R5各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C1-C6烷基羟基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、哌啶基C1-C6烷基、和四氢吡喃基C1-C6烷基；
R6选自卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和C1-C6卤代烷基。
4.如权利要求2所述的乳腺上皮干细胞培养基，其中所述MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，
Figure FDA0002451467990000021
其中，
R1选自C1-C6烷基、任选地被1-2个独立地R6取代的苯基、任选地被1-2个独立地R6取代的噻吩基、和任选地被1-2个独立地R6取代的苯甲基；
R5选自氢、C1-C6烷基、和C3-C6环烷基；
R6各自独立地选自卤素、C1-C6烷基、和C1-C6卤代烷基。
5.如权利要求4所述的乳腺上皮干细胞培养基，其中
R1为任选地被1-2个独立地R6取代的苯基；
R5为氢；
R6优选为氟、甲基或三氟甲基。
6.如权利要求1所述的乳腺上皮干细胞培养基，其中所述MST1/2激酶抑制剂选自以下化合物或其药学可接受的盐中的至少一种：
Figure FDA0002451467990000031
Figure FDA0002451467990000041
Figure FDA0002451467990000051
Figure FDA0002451467990000061
Figure FDA0002451467990000071
7.根据权利要求1～6中任一项所述的乳腺上皮干细胞培养基，其中所述MST1/2激酶抑制剂在所述乳腺上皮干细胞培养基中的浓度是100nM以上且10μM以下，优选300nM以上且3μM以下。
8.如权利要求1～6中任一项所述的乳腺上皮干细胞培养基，其中所述TGF-β抑制剂选自A8301、SB431542、Repsox、SB505124、SB525334、SD208、LY36494、和SJN2511中的至少一种。
9.如权利要求1～6中任一项所述的乳腺上皮干细胞培养基，其中所述受体酪氨酸激酶配体选自表皮生长因子、双向调节素、转化生长因子-α、碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经生长因子、神经调节素1、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子7、和成纤维细胞生长因子10中的至少一种；所述受体酪氨酸激酶配体优选包括表皮生长因子、神经调节素1、和成纤维细胞生长因子7。
10.如权利要求1～6中任一项所述的乳腺上皮干细胞培养基，其中所述Rock激酶抑制剂选自Y27632、法舒地尔、H-1152中的至少一种。
11.如权利要求1～6中任一项所述的乳腺上皮干细胞培养基，其中所述P38信号转导抑制剂选自SB202190、SB203580、VX-702、VX-745、PD169316、RO4402247、和BIRB796中的至少一种。
12.如权利要求1～6中任一项所述的乳腺上皮干细胞培养基，其中所述骨形态发生蛋白抑制剂选自包括头蛋白、格雷林、腱蛋白、腱蛋白结构域的腱蛋白样蛋白，包括卵泡抑素、卵泡抑素结构域的卵泡抑素相关蛋白，包括DAN、DAN半胱氨酸结构域的DAN样蛋白，硬骨素/SOST、核心蛋白聚糖、α2-巨球蛋白、和DMH1中的至少一种。
13.如权利要求1～6中任一项所述的乳腺上皮干细胞培养基，其中
所述TGF-β抑制剂在所述乳腺上皮干细胞培养基中的浓度是50nM以上且100μM以下，更好是100nM以上且50μM以下，进一步优选100nM以上且10μM以下；
所述B27和/或所述N2在所述乳腺上皮干细胞培养基中的浓度是1:25～1:100，优选1:50～1:100；
所述胰岛素在所述乳腺上皮干细胞培养基中的浓度是2μg/ml～20μg/ml，优选5μg/ml～10μg/ml；
所述受体酪氨酸激酶配体在所述乳腺上皮干细胞培养基中的浓度是1ng/ml至1000ng/ml，优选5ng/ml至500ng/ml，进一步优选10ng/ml～100ng/ml；
所述Rock激酶抑制剂在所述乳腺上皮干细胞培养基中的浓度是1μM至100μM，优选2μM至50μM，更优选5μM至10μM；
所述P38信号转导抑制剂在所述乳腺上皮干细胞培养基中的浓度是50nM以上且100μM以下，更好是100nM以上且50μM以下，进一步优选100nM以上且10μM以下；
所述骨形态发生蛋白抑制剂在所述乳腺上皮干细胞培养基中的浓度是1ng/ml至1000ng/ml，优选10ng/ml至500ng/ml，更优选20ng/mL至100ng/mL。
14.如权利要求1～6中任一项所述的乳腺上皮干细胞培养基，其还包括选自糖、烟酰胺和N-乙酰半胱氨酸中的一种或多种，其中所述糖选自葡萄糖、半乳糖、甘露糖、和果糖。
15.如权利要求14所述的乳腺上皮干细胞培养基，其中所述糖在所述乳腺上皮干细胞培养基中的浓度为10mM～100mM，优选15mM～40mM；
所述烟酰胺在所述乳腺上皮干细胞培养基中的浓度为1mM～10mM，优选2mM～5mM；
所述N-乙酰半胱氨酸在所述乳腺上皮干细胞培养基中的浓度为0.1mM～5mM，优选0.5mM～2mM。
16.如权利要求1～6中任一项所述的乳腺上皮干细胞培养基，其特征在于：用于培养正常乳腺组织来源或病变乳腺组织来源的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任一种的组织或类器官。
17.一种培养正常乳腺组织来源或病变乳腺组织来源的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任一种的组织或类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备细胞外基质；
(2)将上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任一种的组织粘附于所述细胞外基质上或包埋于细胞外基质中；
(3)添加如权利要求1～16中的任一项所述的乳腺上皮干细胞培养基，对所述上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任一种的组织进行培养，得到扩增的、相应的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞后代或类器官后代。
18.如权利要求17所述的培养方法，其中，在培养上皮干细胞或类器官步骤中，在氧浓度0.1％～25％的条件下进行培养，优选的正常氧气条件，或0.1％～15％的低氧条件。
19.一种乳腺癌药物的疗效评估或筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用权利要求17或18所述的培养方法培养乳腺上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞；
(2)选定需要检测的药物并按照所需浓度梯度进行稀释；
(3)对(1)中培养得到的细胞添加稀释后的所述药物；和
(4)进行细胞活性测试。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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