KR102208889B1 - 다능성줄기세포의 분화 제어 방법 - Google Patents

Abstract

다능성줄기세포(pluripotent stem cell)와의 결합 친화성, 여기서 결합 친화성은 세포 생착율 및 세포의 이동성을 경시(經時) 관찰함으로써 판단할 수 있지만, 이것을 지표로 하여 라미닌 또는 그의 프래그먼트(fragment)를 선택하고, 상기 라미닌 또는 그의 프래그먼트의 존재 하에 다능성줄기세포를 분화 유도하는 것을 특징으로 하는, 다능성줄기세포의 분화 제어 방법. 본 발명에 의해, 분화 유도 세포의 비율을 임의로 변화시킨 세포 집단을 다능성줄기세포로부터 간편하게 제조할 수 있다. 상기한 제조 방법에 의해 얻어지는 세포 집단은, 세포 의료에 의한 질환의 치료에 극히 유용하다.

Description

다능성줄기세포의 분화 제어 방법

본 발명은, 다능성줄기세포의 분화 제어 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 다능성줄기세포의 분화를 제어함으로써, 원하는 다능성줄기세포 유래 눈 세포 원기(原基)를 선택적으로 유도하는 방법 및 그의 사용에 관한 것이다.

인간 ES세포나 인간 iPS세포 등의 인간 다능성줄기세포는, 그것의 재생의료 로의 응용이 세계적으로 주목받고 있다. 인간 다능성줄기세포를 재생의료에 응용하기 위해서는, 이들 줄기세포를 고효율로 또한 안정적으로 체세포로 분화 유도하는 기술의 개발이 필요하며, 인간 다능성줄기세포로부터 임의의 체세포로의 선택적 분화 유도 방법에 대하여 각종 검토가 행해지고 있다.

예를 들면, 각막상피 줄기세포 피폐증 등의 위독한 각막 질환에 대한 신규 치료법으로서, 본원의 발명자들은 iPS세포로부터 각막상피세포 시트를 제작하는 기술을 개발하여, 동물 모델을 사용하여 그 유효성을 확인하였다(비특허문헌 1). 비특허문헌 1에 기재된 분화 유도법에 의해 iPS세포로부터 생성되는 세포는, 눈 주위의 다양한 세포를 포함하는 세포 집단이므로, 각막상피세포 시트의 제작에 사용하기 위해서는, 사용하는 세포를 각막상피세포로 순화할 필요가 있다. 이에 따라, 비특허문헌 1에서는, 각막상피세포 특이적인 세포 표면 마커에 대한 항체를 사용하여, FACS 소팅(sorting)에 의해 순화를 행하고 있다.

FACS 소팅은, 항체 염색한 세포를 액류(液流)로 흐르게 하고, 레이저 조사(照射)에 의해 세포 표면 항원의 발현을 확인하고, 특정한 세포를 분취하는 기술이지만, 세포가 통과하는 전체 유로의 무균성을 담보하는 것이 곤란하여, 세포의 오염이 우려되는 문제가 있다. 또한, FACS 소팅은, 회수한 세포의 데미지가 큰 문제가 있다. 또한, FACS 소팅은, 사용하는 기기의 유지보수에 전문적인 지식이나 기술을 요한다. 이 때문에, FACS 소팅은, 이식용 각막상피세포 시트의 제작에 사용하기 위한 세포를 대량으로 조제하는 경우에는, 반드시 이상적인 방법은 아니며, 비특허문헌 1의 기술을 실용화 및 산업화하기에는 과제가 남아있다.

Hayashi et al., Nature.2016 Mar 17; 531(7594): 376-80. doi: 10.1038/nature17000. Epub 2016 Mar 9.

본 발명은, 다능성줄기세포를 분화 유도하여 얻어진 세포 집단으로부터 특정한 세포를 분취하는 것이 아니라, 다능성줄기세포를 눈 세포 원기로 분화 유도할 때 미리 분화의 방향성을 제어함으로써, 얻어지는 세포 집단에서의 세포비율을 제어할 수 있는, 다능성줄기세포의 분화 제어 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 세포비율을 제어함으로써, 예를 들면, 이식용 각막상피세포 시트의 제작에 사용 가능한 각막상피세포 집단이나 상기 각막상피세포 이외의 눈 주위의 세포로 특화한 세포 집단을 간편하게 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 얻어지는 세포 집단의 사용에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 다능성줄기세포의 눈 세포 원기로의 분화 유도 시에 분화의 방향성을 제어할 수 있는, 상기한 세포의 분화 제어제에 관한 것이다.

전술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 iPS세포의 분화 유도 조건에 대하여 예의(銳意) 검토한 결과, 분화 유도 시에 존재시키는 라미닌의 종류를 변경함으로써, 얻어지는 세포 집단에서의 분화 세포의 비율을 제어할 수 있는 것을 발견하였다. 선택적 분화 유도에 있어서는, 배지에 첨가하는 증식 인자와 세포외 매트릭스의 선택이 각각 중요하지만, 라미닌의 복수의 아이소폼이 동일한 분화 유도 방법에 있어서 분화 유도되는 세포의 방향성을 각 방향으로 제어할 수 있는 것은 본 발명자들이 처음으로 발견한 것이다.

즉, 본 발명은, 하기 [1]∼[10]에 관한 것이다.

[1] 다능성줄기세포와의 결합 친화성을 지표로 하여 라미닌 또는 그의 프래그먼트를 선택하고, 상기 라미닌 또는 그의 프래그먼트의 존재 하에 다능성줄기세포를 분화 유도하는 것을 특징으로 하는, 다능성줄기세포의 분화 제어 방법.

[2] 라미닌 332 또는 라미닌 332E8 프래그먼트의 존재 하에 각막상피세포로의 분화를 제어하는, 상기 [1]에 기재된 분화 제어 방법.

[3] 라미닌 111 또는 라미닌 111E8 프래그먼트의 존재 하에 신경 세포로의 분화를 제어하는, 상기 [1]에 기재된 분화 제어 방법.

[4] 라미닌 211 또는 라미닌 211E8 프래그먼트의 존재 하에 신경능 세포(neural crest cell)로의 분화를 제어하는, 상기 [1]에 기재된 분화 제어 방법.

[5] 라미닌 411 또는 라미닌 411E8 프래그먼트의 존재 하에 망막세포로의 분화를 제어하는, 상기 [1]에 기재된 분화 제어 방법.

[6] 라미닌 411 또는 라미닌 411E8 프래그먼트의 존재 하에 신경능 세포로의 분화를 제어하는, 상기 [1]에 기재된 분화 제어 방법.

[7] 상기 [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 분화 제어 방법에 의해 유도된 다능성줄기세포의 분화 세포를 배양하는, 눈 주위 세포 집단의 제조 방법.

[8] 얻어지는 세포 집단이 각막상피세포 집단인, 상기 [7]에 기재된 제조 방법.

[9] 상기 [8]에 기재된 제조 방법에 의해 얻어진 각막상피세포 집단을 사용하는 것을 특징으로 하는, 이식용 각막상피세포 시트의 제조 방법.

[10] 라미닌 111, 라미닌 211, 라미닌 332, 라미닌 411 및 라미닌 511로 이루어지는 군으로부터 선택되는 라미닌 또는 그의 E8 프래그먼트를 함유하여 이루어지는, 다능성줄기세포의 분화 제어제.

또한, 본 발명의 일태양으로서, 하기 [11]∼[12]도 포함한다.

[11] 다능성줄기세포의 분화를 제어하기 위한, 라미닌 111, 라미닌 211, 라미닌 332, 라미닌 411 및 라미닌 511로 이루어지는 군으로부터 선택되는 라미닌 또는 그의 E8 프래그먼트의 사용.

[12] 다능성줄기세포의 분화 제어에 있어서 사용하기 위한, 라미닌 111, 라미닌 211, 라미닌 332, 라미닌 411 및 라미닌 511로 이루어지는 군으로부터 선택되는 라미닌 또는 그의 E8 프래그먼트.

본 발명에 의하면, 다능성줄기세포를 분화 유도하여 얻어진 세포 집단으로부터 별도로 원하는 세포를 분취하는 것이 아니고, 간편한 조작으로, 예를 들면, 눈 주위의 세포 집단 중으로부터, 이식용 각막상피세포 시트의 제작에 사용 가능한 각막상피세포 집단을 선택적으로 대량으로 제조할 수 있다.

도 1은, iPS세포로부터 눈 주위 세포로 분화 유도하는 방법의 개략도를 나타낸 도면이다.
도 2는, iPS세포 유래 분화 세포의 경시적(經時的)인 형태 변화의 일례를 나타낸 도면이다.
도 3은, iPS세포 유래 분화 세포에 발현하는 마커 단백질의 일례를 나타낸 도면이다.
도 4는, iPS세포 유래 분화 세포의 경시적인 유전자 발현 분석의 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는, iPS세포의 콜로니 형성 과정의 타임 랩스(time lapse) 분석의 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은, iPS세포의 콜로니에서의 Hippo 경로에 관여하는 전사 공역 인자 YAP의 국재(局在)와 신경외배엽 분화의 관계를 나타낸 도면이다.
도 7은, iPS세포로부터 분화 유도한 세포의 각막상피 마커 양성율을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은, 분화 유도 과정에서의 미분화 마커의 유전자 발현 분석과 분화 유도 6주에서의 iPS세포 유래 각막상피세포 시트의 단면을 나타내는 도면이다.
도 9는, 분화 유도로 형성된 SEAM 구조 중의 눈 주위 세포의 각 라미닌 아이소폼 상에서의 상대 세포 생존율을 나타낸 도면이다.
도 10은, 분화 유도된 세포 집단에서의 분화 세포의 존재 비율을 나타낸 도면이다.
도 11은, 분화 세포의 Wnt 시그널 타깃 유전자의 발현 분석의 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는, 라미닌의 코팅 농도에 의한 분화 제어를 나타낸 도면이다.
도 13은, 라미닌의 종류 및 코팅 농도에 의한 iPS세포 유래 각막상피세포의 분화 효율에 대한 영향을 나타낸 도면이다.
도 14는, 각 라미닌 상의 분화 세포에서의 신경능 세포 마커 유전자 발현량을 나타낸 도면이다.
도 15는, 211 위에서 분화된 세포에서의 눈 주위 신경능 세포 마커의 발현을 나타낸 도면이다.
도 16은, 각 라미닌 상에서 분화된 세포에서의 Wnt 시그널 경로 관련 유전자 발현량을 나타낸 도면이다.
도 17은, 라미닌 211 또는 511 상에서, 분화 개시로부터 3일간, Wnt 시그널의 촉진제 또는 활성화제로 처리한 후, 2주일 분화시킨 세포에서의 신경능 마커의 FACS 분석의 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은, 라미닌 211 또는 라미닌 511 상에서의 신경능 세포로의 분화에 있서의 Wnt 시그널 경로의 영향을 검토한 면역 염색의 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는, 라미닌에 의한 iPS세포 콜로니의 인산화 MLC의 국재에 대한 영향을 검토한 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은, 라미닌에 의한 iPS세포 콜로니의 인산화 MLC의 발현량과 세포간 상호 작용에 대한 영향을 검토한 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은, 라미닌에 의한 iPS세포 콜로니 내부·외측 에지부의 세포 밀도에 대한 영향을 검토한 결과를 나타낸 도면이다.
도 22는, 라미닌에 의한 iPS세포의 YAP 활성에 대한 영향을 검토한 결과를 나타낸 도면이다.
도 23은, 라미닌 농도에 의한 iPS세포 콜로니의 응축과 신경외배엽 분화의 관계를 검토한 결과를 나타낸 도면이다.
도 24는, iPS세포 콜로니에서의 YAP 전사 활성과 신경외배엽 분화의 관련을 검토한 결과를 나타낸 도면이다.

비특허문헌 1에 있어서, 발명자들은, iPS세포로부터 라미닌 511E8 프래그먼트를 사용하여 눈 전체의 발생을 재현시킨 세포 집단을 취득하고, 얻어진 세포 집단으로부터 각막상피 (전구)세포만을 FACS로 회수하여 순화함으로써 고순도의 세포 집단을 조제하였다. 여기서, 눈 전체의 발생을 재현시킨 세포 집단이란, 발생기의 눈을 구성하는 다양한 세포군, 예를 들면, 각막상피세포, 망막세포, 수정체상피세포, 신경능 세포 등을 포함하는 것이며, 세포마다 대응하는 눈의 부위에서의 재생의료의 개발에 기여할 가능성이 숨겨져 있다. 그러나, 전술한 방법에 따라 눈 전체의 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 목적하는 세포를 고순도로 포함하는 세포 집단을 조제하고자 해도, 유도 효율이 낮은 iPS세포주도 존재하며, 특히 각막상피세포에 관해서는, 보다 단기간에 안정적으로 생산할 수 있는 기술에 대한 개량이 요구되고 있었다. 이에, 본 발명자들은, 다능성줄기세포로부터 예를 들어, 눈 세포 발생에 영향을 미치는 인자로서, 라미닌의 아이소폼에 착안하여 검토를 행한 바, 아이소폼의 상이에 따라 얻어지는 세포 집단에서의 세포 구성이 크게 변화하는, 즉 아이소폼의 상이에 따라, 다능성줄기세포로 분화 유도되는 세포 원기나 분화 세포의 종류가 상이한 것을 발견하였다. 이러한 선택적인 분화 유도가 행해지는 메커니즘으로서는, 아이소폼의 다능성줄기세포와의 결합 친화성의 상이에 의해, 세포 유주, 세포 골격, 접착 또는 부유 상태 등이 변화되고, 아이소폼 의존적인 다능성줄기세포 콜로니의 극성이 발생하는 것에 의해, 분화에 관한 전사 인자나 시그널 전달 경로가 변화하는 것이 밝혀졌다. 이에서, 이에 수반하여 상이한 세포의 자율적 분화가 제어되고, 또한 아이소폼과 특이적으로 결합하기 쉬운 인테그린 서브유닛을 가지는 세포 원기나 분화 세포가 선택적으로 증식함으로써, 얻어지는 세포 집단의 세포 구성이 변화하는 것으로 여겨진다. 따라서, 예를 들면, 동일한 증식 인자가 배지에 첨가되어 있었다 하더라도, 다능성줄기세포와의 결합 친화성을 지표로 하여 선택한 아이소폼을 사용함으로써 선택적인 분화 유도가 행해지는 것으로 여겨진다. 또한, 전술한 바와 같은 원기가 형성된 후, 상기 원기에 있어서의 인테그린의 종류에 따라 아이소폼을 선택하면, 증식을 선택적으로 더욱 촉진할 수 있는 것으로 여겨진다. 다만, 이러한 추측은, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

본 발명은, 다능성줄기세포의 분화를 제어하는 방법을 제공하는 것으로서, 다능성줄기세포로부터 분화 세포로 유도할 때, 원하는 분화 세포의 종류에 따라 배양 시에 존재시키는 라미닌 또는 그의 프래그먼트의 종류를 선택하는 것에 특징을 가진다. 구체적으로는, 원하는 분화 세포의 종류에 따라 다능성줄기세포와의 결합 친화성을 지표로 하여 선택한 특정한 라미닌 또는 그의 프래그먼트의 존재 하에, 다능성줄기세포를 분화시킴으로써, 얻어지는 세포 집단이, 예를 들면, 눈 주위 세포를 유도시키는 증식 인자로서 동일한 것을 존재시키고 있어도, 각막상피세포를 고함유하는 세포 집단이거나, 신경능 세포를 고함유하는 세포 집단이거나 하여, 사용하는 라미닌 또는 그의 프래그먼트에 의해 분화의 방향성을 제어할 수 있는 것이다. 바꾸어 말하면, 선택하는 라미닌 또는 그의 프래그먼트에 의해, 동일한 다능성줄기세포로부터 각종 분화 세포로 구분하여 만들 수 있다. 따라서, 본 발명의 다능성줄기세포의 분화 제어 방법은, 다능성줄기세포로부터 분화 세포로의 선택적인 분화 유도 방법이기도 하며, 분화 세포의 선택 방법, 혹은, 목적 세포를 고함유하는 세포 집단의 제조 방법이기도 하다. 여기서, 특정 세포를 고함유하는 세포 집단은, 사용하는 라미닌 또는 그의 프래그먼트가 존재하지 않는 점 이외에는 동일한 조건 하에서 분화 유도했을 때 얻어지는 세포 집단에 비해, 특정 세포의 존재 비율이 높은 것이라면 그 정도는 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에서의 다능성줄기세포란, 생체에 존재하는 모든 세포로 분화 가능한 다능성을 가지고, 또한, 증식 능력도 함께 가지는 줄기세포이다. 구체적으로는, 예를 들면, 배아줄기세포(ES세포), 핵이식에 의해 얻어지는 클론 배아 유래의 배아줄기세포(ntES세포), 정자줄기세포(GS세포), 배아생식세포(EG세포), 인공다능성줄기세포(iPS세포), 배양 섬유아세포나 골수줄기세포 유래의 다능성세포(Muse세포) 등이 있다. 바람직하게는, ES세포, ntES세포 및 iPS세포이며, 보다 바람직하게는 iPS세포이다. 다능성줄기세포는, 포유동물의 다능성줄기세포인 것이 바람직하다. 포유동물은 특별히 한정되지 않고, 인간, 마우스, 래트(rat), 소, 돼지 등을 예로 들 수 있다. 그 중에서도 인간이 바람직하다. 인간 다능성줄기세포를 사용함으로써, 인간의 재생의료에 이용 가능한 안전한 세포종에 따른 세포 집단을 취득할 수 있다.

라미닌은, α쇄, β쇄 및 γ쇄의 3개의 서브유닛쇄로 이루어지는 헤테로 3량체 분자이다. α쇄는 α1∼α5의 5종류, β쇄는 β1∼β3의 3종류, γ쇄는 γ1∼γ3의 3종류가 알려져 있고, 이들의 조합에 의해 적어도 12종류 이상의 아이소폼이 존재한다(표 1 참조). 본 발명에서 사용할 수 있는 라미닌으로서는, 어떤 아이소폼이라도 되고, 원하는 분화 세포에 따라, α1∼α5로부터 선택되는 1종의 α쇄, β1∼β3로부터 선택되는 1종의 β쇄, γ1∼γ3로부터 선택되는 1종의 γ쇄을 적절하게 조합한 것을 선택할 수 있다. 그리고, 본 명세서에 있어서, 예를 들면, α쇄가 α1, β쇄가 β1, γ쇄가 γ1인 아이소폼을, 라미닌 111로 표기하고, 다른 아이소폼에 대해서도 동일하게 표기하기도 한다.

[표 1]

라미닌의 유래는 특별히 한정되지 않고, 각종 생물 유래의 라미닌을 사용할 수 있다. 바람직하게는 포유동물 유래의 라미닌이다. 포유동물로서는, 예를 들면, 인간, 마우스, 래트, 소, 돼지 등이 있지만, 한정되지 않는다. 또한, 사용하는 다능성줄기세포와 동종인 것이 바람직하고, 예를 들면, 인간의 재생의료의 재료를 얻기 위해 인간 줄기세포를 배양하는 경우에는, 인간 유래의 라미닌을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용할 수 있는 라미닌은 전장(全長)이라도 되고, 그의 프래그먼트라도 된다. 즉, 전장 α쇄, 전장 β쇄 및 전장 γ쇄로 이루어지는 전장 라미닌이라도 되고, α쇄, β쇄 및 γ쇄의 1개 이상이 전장보다 짧은 프래그먼트로 이루어지는 라미닌 프래그먼트라도 된다. 다만, 라미닌 프래그먼트는 헤테로 3량체를 형성하고 있는 것을 필요로 한다. 또한, 라미닌 프래그먼트는 인테그린 결합 활성을 가지고 있는 것이 바람직하다.

라미닌 프래그먼트로서는, 예를 들면, 상기한 라미닌의 E8 프래그먼트를 사용할 수 있다. 라미닌 E8 프래그먼트(이하, 「라미닌 E8」 또는 「E8」이라고 함)란, 마우스 라미닌 111을 엘라스타아제로 소화하여 얻어진 헤테로 3량체를 형성하고 있는 프래그먼트이며, 강한 세포 접착 활성을 가지는 프래그먼트로서 동정(同定)된 것이다(Edgar D et al., J. Cell Biol., 105: 589-598, 1987). 마우스 라미닌 111 이외의 라미닌에 대해서도 엘라스타아제로 소화했을 때 마우스 라미닌 111 E8에 상당하는 프래그먼트의 존재가 추정되지만, 마우스 라미닌 111 이외의 라미닌을 엘라스타아제로 소화하여 E8을 분리, 동정한 보고는 없다. 따라서, 본 발명에 사용하는 라미닌 E8은, 라미닌의 엘라스타아제 소화산물인 것을 요하는 것이 아니며, 마우스 라미닌 111 E8과 동일한 세포 접착 활성을 가지고, 유사한 구조를 가지는 라미닌 프래그먼트이면 된다.

라미닌 E8은, α쇄의 C말단 프래그먼트로부터 구상(球形) 도메인 4 및 5가 제거된 프래그먼트(α쇄 E8), β쇄의 C말단 프래그먼트(β쇄 E8) 및 γ쇄의 C말단 프래그먼트(γ쇄 E8)가 3량체를 형성한 프래그먼트이다. 3량체의 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 통상 약 150∼약 170 kDa이다. γ쇄 E8의 C말단부로부터 3번째 글루타민산 잔기는 라미닌 E8의 인테그린 결합 활성에 필수적이다(Hiroyuki Ido et al., The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007).

그리고, 라미닌 및 라미닌 프래그먼트가, 헤테로 3량체를 형성하고 있는 것이나 인테그린 결합 활성을 가지고 있는 것은, 공지의 방법에 의해 확인할 수 있다. 예를 들면, SDS-PAGE에 제공하여 밴드수를 검출하는 것 등에 의해 헤테로 3량체인 것을 확인할 수 있다. 또한, 예를 들면, ELISA법 등에 의해 인테그린 결합 활성을 확인할 수 있다.

라미닌은 천연형이라도 되고,그 생물학적 활성을 유지한 채, 1개 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 수식된 수식형이라도 된다. 라미닌 프래그먼트도 동일하다. 라미닌의 제조 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 라미닌 고발현 세포로부터 정제하는 방법이나, 재조합 단백질로서 제조하는 방법 등을 예로 들 수 있다. 라미닌 프래그먼트의 제조 방법도 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 전장 라미닌을 엘라스타아제 등의 단백질 분해 효소로 소화하고, 목적으로 하는 프래그먼트를 분취, 정제하는 방법이나, 재조합 단백질로서 제조하는 방법 등을 예로 들 수 있다. 제조량, 품질의 균일성, 제조 비용 등의 관점에서, 라미닌 및 라미닌 프래그먼트의 양자 모두, 재조합 단백질로서 제조하는 것이 바람직하다.

재조합 라미닌, 재조합 라미닌 프래그먼트는, 공지의 유전자 재조합 기술을 적절하게 사용함으로써 제조할 수 있다. 재조합 라미닌, 재조합 라미닌 프래그먼트의 제조 방법으로서는, 예를 들면, α쇄, β쇄 및 γ쇄의 각 전장 단백질을 코딩하는 DNA, 또는 재조합 라미닌 프래그먼트로서, 예를 들면, 재조합 라미닌 E8을 제조하는 경우에는 각 쇄의 E8 프래그먼트를 코딩하는 DNA를 각각 취득하고, 이것을 각각 발현 벡터에 삽입하고, 얻어진 3종류의 발현 벡터를 적절한 숙주 세포에 공도입하여 발현시키고, 3량체를 형성하고 있는 단백질을 공지의 방법으로 정제함으로써 제조할 수 있다. 재조합 라미닌(전장)의 제조 방법으로서는, 예를 들면, 이도 등(Hiroyuki Ido et al., The Journal of Biological Chemistry, 279, 10946-10954, 2004)의 방법 등을 예로 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 재조합 라미닌 E8의 제조 방법으로서는, 예를 들면, 이도 등(Hiroyuki Ido et al., The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007)의 방법을 예로 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다.

주요한 포유동물의 라미닌을 구성하는 α쇄, β쇄, γ쇄를 코딩하는 유전자의 염기서열 정보 및 각 쇄의 아미노산서열 정보는, 공지의 데이터베이스(GenBank 등)로부터 취득할 수 있다. 표 2에, 인간의 라미닌을 구성하는 각 쇄의 액세션 번호를 나타낸다. 이들 이외의 각종 생물의 라미닌 구성쇄의 염기서열 정보 및 아미노산서열 정보도 동일하게 공지의 데이터베이스(GenBank 등)로부터 취득할 수 있다.

[표 2]

본 발명에 있어서는, 상기한 라미닌 및 라미닌 프래그먼트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이면, 원하는 분화 세포의 종류에 따라 다능성줄기세포와의 결합 친화성을 지표로 하여 선택한 것을, 단독으로, 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 즉, 본 발명에서는, 원하는 분화 세포의 종류에 따라, 라미닌 및 라미닌 프래그먼트를 선택하지만, 그 선택 지표로서 다능성줄기세포와의 결합 친화성을 사용한다. 본 명세서에 있어서, 세포와의 결합 친화성은, 세포생착율 및 세포의 이동성을 경시(經時) 관찰함으로써 판단할 수 있다. 또한, ELISA법 등에 의해 인테그린결합 활성을 확인함으로써 판단할 수 있다. 혹은, 참고 문헌 1(Matrix Biol.2006 Apr; 25(3): 189-97. Epub 2006 Jan 18.)에는, 라미닌 아이소폼에 대한 재조합 인테그린의 해리상수가 게재되어 있고(표 3 참조), 이것을 참고로 하여 판단할 수 있다. 예를 들면, 이하에, 참고 문헌 1에 기초하여, iPS세포에 발현하는 라미닌 결합형 인테그린의 해리승수로부터 결합 친화성을 판단한 것을 나타낸다. 하기 표와 대비함으로써, 그 외의 라미닌 아이소폼의 결합 친화성을 판단할 수 있다.

[표 3]

상기와 같이 하여 판단된 결합 친화성에 기초하여, 중추신경, 망막세포와 같은 분화 세포를 얻는 경우에는, 다능성줄기세포와의 결합 친화성이 강한 아이소폼을 선택하면 되고, 각막상피세포, 표피세포, 수정체상피세포와 같은 상피세포를 얻는 경우에는, 다능성줄기세포와의 결합 친화성이 중간 정도인 아이소폼을 선택하면 되고, 신경 세포, 신경능 세포와 같은 분화 세포를 얻는 경우에는, 다능성줄기세포와의 결합 친화성이 약한 아이소폼을 선택하면 된다. 이와 같이 원하는 분화 세포가 결정되어 있으면, 사용하는 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트의 종류를 결정할 수 있고, 이렇게 하여 선택된 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트의 존재 하에, 다능성줄기세포를 배양함으로써 원하는 세포나 세포 원기가 형성된다.

다능성줄기세포의 분화 유도 방법으로서는, 상기한 라미닌 또는 그의 프래그먼트의 존재 하에 분화 유도 가능한 것이면, 공지의 방법으로부터 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명자들이 개발한 다능성줄기세포를 눈 주위 세포로 분화 유도하는 방법(비특허문헌 1)을 바람직하게 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 배양용 샬레 등의 배양기의 배양면에 상기한 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트를 코팅하고, 거기에 인간 iPS세포를 파종하여, 수일간 콜로니 형성시킨 후, KnockOut 혈청 대체르 포함하는 배지로 배양한 후, 인간 케라티노사이트 성장 인자(Keratinocyte Growth Factor: KGF) 및 인간 섬유아세포성장 인자-2(Fibroblast Growth Factor-2: FGF-2)를 포함하는 배지로 배양하는 방법이다. 여기서, 콜로니를 형성시키는 배양을 「콜로니 형성 배양」, 그 이후의 배양을 「분화 배양」 또는 「분화 유도」로 기재하기도 한다. 또한, 예를 들면, 비즈 등의 담체에 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트를 코팅하고, 이 담체를 세포현탁액에 투입하여 배양하는 방법이 있다. 혹은, 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트를 그대로 배양액에 첨가하여 배양하는 방법도 예로 들 수 있다. 그리고, 본 발명에 있어서, 배지를 교환할 때 존재시키는 라미닌 또는 그의 프래그먼트는, 그 양이나 종류는 동일해도 되고 상이해도 된다.

라미닌 또는 라미닌 프래그먼트의 사용 농도는, 사용하는 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트의 종류에 따라, 즉 다능성줄기세포와의 결합 친화성에 따라, 목적을 달성할 수 있는 농도를 적절하게 선택하여 설정하면 된다. 예를 들면, 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트를 코팅하여 존재시키는 경우에는, 약 0.1∼약 10 μg/cm²의 범위로부터 선택할 수 있다. 또한, 라미닌 E8을 코팅하는 경우에는, 약 0.25∼약 2.0 μg/cm²라도 되고, 약 0.5∼약 1.5 μg/cm²라도 되고, 약 0.5∼약 1.0μg/cm²라도 된다. 배양액 중에 첨가하는 경우에도, 사용하는 배양 기재의 면적에 따라 상기 코팅 시와 동일한 정도의 양이 되도록 설정할 수 있다. 예를 들면, 다능성줄기세포와의 결합 친화성이 강한 것이라도 저농도로 사용함으로써, 결합 친화성을 조정하여 분화 유도를 제어할 수 있다. 그리고, 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트의 기재로의 고정화 방법(코팅 방법)으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 적절한 완충액 중에서 고상(固相)과 접촉시킴으로써 고정화할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 배지는, 특별히 한정되지 않고, 세포 배양에 필요한 성분을 혼합하여 제작된 공지의 배지를 사용할 수 있고, 예를 들면, 시판하고 있는 배지를 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 이들 배지는 그 본래의 구성 성분 이외에 그 외의 성분을 포함할 수도 있다.

구체적으로는, 예를 들면, 원하는 분화 세포의 종류에 따른 증식 인자를 포함할 수 있다. 증식 인자로서는, 공지 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있고, 예를 들면, KGF, FGF-2, BMP4 등을 예시할 수 있다.

배양 시작 시의 세포수로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 바람직하게는 10∼1×10⁸ cells/mL, 보다 바람직하게는 1×10²∼5×10⁷ cells/mL, 더욱 바람직하게는 1×10³∼2×10⁷ cells/mL가 예시된다. 또한, 접착 배양의 경우에는, 바람직하게는 10∼2500 cells/cm², 보다 바람직하게는 100∼1000 cells/cm², 더욱 바람직하게는 300∼700 cells/cm²의 범위가 예시된다. 배양 조건에 특별히 한정은 없으며, 통상의 세포 배양에 사용되는 조건을 사용할 수 있다. 예를 들면, 37℃, 5% CO₂ 등의 조건에서 배양할 수 있다. 또한, 적절한 시간 간격으로 세포 배양액을 신선한 배지를 가하여 희석하거나, 배지를 교환하거나, 혹은 세포배양용 기재를 교환할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용할 수 있는 세포배양용 기재로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 샬레(플레이트), 플라스크, 백, 대형배양조, 바이오리액터(bioreactor) 등을 사용할 수 있다. 그리고, 백으로서는, 세포배양용 CO₂ 가스 투과성 백을 사용할 수 있다. 또한, 공업적으로 대량의 세포 집단을 제조하는 경우에는, 대형배양조를 사용할 수 있다. 또한, 배양은 개방계, 폐쇄계 중 어느 것에서도 실시할 수 있지만, 바람직하게는 얻어지는 세포 집단의 안전성의 관점에서 폐쇄계로 배양을 행하는 것이 바람직하다.

라미닌 또는 라미닌 프래그먼트의 존재 하에 다능성줄기세포를 배양하는 시간은 특별히 한정되지 않으며, 사용한 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트의 종류나 그 양에 따른 목적을 달성할 수 있는 시간을 적절하게 선택하면 된다. 또한, 배양 시간 중인 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트가 존재하는 시간은, 배양 기간의 전체 기간이라도 되고, 임의의 일부의 기간이라도 된다. 바람직하게는, 전체 배양 기간 중의 적어도 초기 단계에 있어서, 바람직하게는 배양 시작 시에, 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트의 존재 하에 배양을 실시하고 있으면 된다.

또한, 본 발명에 있어서는, 다능성줄기세포를 상기한 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트의 존재 하에 배양하고 세포 원기를 얻은 후, 상기한 원기가 형성된 후, 상기 원기에 있어서의 인테그린의 종류에 따라 아이소폼을 선택함으로써, 증식을 선택적으로 촉진시킬 수 있다. 본 발명은 이와 같은 태양의 분화 유도도 포함하는 것이다. 구체적으로는, 예를 들면, 신경능 세포의 경우에는 라미닌 211 또는 그의 프래그먼트, 상피세포의 경우에는 라미닌 332 또는 그의 프래그먼트, 망막세포나 신경능 세포의 경우에는 라미닌 411 또는 그의 프래그먼트를 사용하여 세포 원기를 배양하여 유도할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 필요에 따라, 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트 이외의 그 외의 성분을 첨가하여 배양을 행해도 된다. 그 외의 성분으로서는, 예를 들면, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 콜라겐, 매트리젤(matrigel), 젤라틴, 폴리-L-라이신 등이 있다.

또한, 상기한 것 이외에도, 원하는 분화 세포의 종류에 따라, 예를 들면, 신경능 세포의 분화 유도를 촉진시키는 경우, Wnt 시그널 경로 촉진제를 첨가해도 된다.

이렇게 하여, 다능성줄기세포를 원하는 세포에 따른 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트의 존재 하에 분화 유도하여 원하는 세포 집단을 선택적으로 얻을 수 있다.

분화 유도되는 세포로서는, 특별히 한정되지 않고, 다능성줄기세포로 분화 유도 가능한 모든 체세포를 예시할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 외배엽 유래의 세포로서는, 각막세포, 도파민 발생 신경 세포, 운동신경세포, 말초 신경 세포, 색소상피세포, 피부세포, 내이세포 등이 있다. 내배엽 유래의 세포로서는, 간세포, 췌장 전구 세포, 인슐린 발생 세포, 담관세포, 폐포상피세포, 장관상피세포 등이 있다. 중배엽 유래의 세포로서는, 심근세포, 골격근세포, 혈관내피세포, 혈액세포, 뼈세포, 연골세포, 신장전구세포, 신장상피세포 등을 예로 들 수 있다. 그리고 체세포에는 최종 분화한 성숙 세포뿐만 아니라, 최종 분화에 이르지 않은 분화 도중의 세포도 포함된다.

얻어진 세포 집단에 있어서의 목적으로 하는 세포의 존재 비율은, 사용한 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트의 종류나 배양 조건에 따라 일률적으로 규정할 수는 없다.

또한, 얻어진 세포 집단으로부터 원하는 세포를 회수하는 방법으로서는, 특별히 한정되지 않는다. 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트에 접착하고 있지 않은 세포(비접착 세포)를 회수하는 방법으로서는, 예를 들면, 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트를 코팅한 배양기를 사용한 경우에는, 회수한 배지 및 코팅 표면을 PBS 등으로 수회 세정한 세정액에 포함되는 세포를 원심분리 등에 의해 회수할 수 있다. 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트를 코팅한 담체를 세포현탁액에 투입한 경우에는, 담체를 회수한 세포현탁액에 남아있는 세포를 원심분리 등에 의해 회수할 수 있다.

라미닌 또는 라미닌 프래그먼트에 접착한 세포(접착 세포)를 회수하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 접착 세포를 박리하는 공지의 방법을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트를 코팅한 배양기를 사용한 경우에는, 예를 들면, 비접착 세포를 제거한 후, 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트의 코팅면에 EDTA액, 트립신액 등의 공지의 세포박리용 용액을 첨가하여 피펫팅 등을 행함으로써 세포를 박리시켜, 회수할 수 있다. 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트를 코팅한 담체를 사용한 경우에는, 세포박리용 액에 담체를 투입하고 피펫팅 등을 행함으로써 세포를 박리시켜, 회수할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 다능성줄기세포의 분화 제어 방법에 의해, 다능성줄기세포로부터 원하는 세포로의 분화 유도를, 사용하는 라미닌의 종류에 따라 컨트롤하는 것이 가능하게 되고, 원하는 세포를 고비율로 함유하는 세포 집단이 얻어지는 우수한 효과를 얻을 수 있다. 또한, 다능성줄기세포로부터 원하는 세포가 직접 얻어지므로, 비특허문헌 1의 방법에 비해, 공정수가 적고, 생산성이 높은 방법이라고 할 수 있다. 또한, 라미닌은 인테그린을 통하여 세포의 아포토시스(apoptosis)를 억제하여 세포의 생존을 유지하는 동시에 세포 증식을 촉진시키는 세포내 시그널 전달 경로를 활성화하는 것이 알려져 있다(Gu J et al. The Journal of Biological Chemistry 277: 19922-19928, 2002). 따라서, 본 발명에 있어서는, 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트의 존재 하에 세포를 분화 유도하므로, 높은 바이어빌리티를 유지한 상태의 세포 집단을 얻을 수 있는 큰 이점도 가진다.

이하에, 예를 들면, 눈 주위 세포를 선택적으로 분화 유도하는 방법에 대하여 설명한다. 구체적으로는, 예를 들면, 라미닌 111, 라미닌 211, 라미닌 332, 라미닌 411 및 라미닌 511로 이루어지는 군으로부터 선택되는 라미닌 또는 그의 E8 프래그먼트을 사용하는 예이다. 그리고, 배양 조건은 사용하는 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트의 종류가 상이한 점 이외에는, 모든 경우가 동일하며, 전술한 것을 참조할 수 있다.

라미닌 111은 α쇄가 α1, β쇄가 β1, γ쇄가 γ1인 아이소폼이며, 「라미닌 1」, 「라미닌 α1β1γ1」으로 표기되는 경우도 있다. 라미닌 111은 태아 조직의 기저막 발현하는 것이 알려져 있지만, 라미닌 111 또는 그의 E8 프래그먼트를 사용한 경우에는, 신경세포, 신경망막, 수정체상피세포를 바람직하게 유도할 수 있다.

라미닌 211은 α쇄가 α2, β쇄가 β1, γ쇄가 γ1인 아이소폼이며, 「라미닌 2」, 「라미닌 α2β1γ1」으로 표기되는 경우도 있다. 라미닌 211은 근조직이나 신경조직의 기저막에 특이적으로 발현하는 것이 알려져 있지만, 라미닌 211 또는 그의 E8 프래그먼트를 사용한 경우에는, 신경세포, 신경능 세포를 바람직하게 유도할 수 있다. 라미닌 211 또는 그의 E8 프래그먼트는, 다능성줄기세포와의 결합 친화성이 대단히 약하지만, 생착 가능하기 때문에, 신경 세포 유도에 사용되는 부유 배양과 매우 유사한 상태에서 접착 배양할 수 있다. 이에 따라, Wnt 시그널이 활성화하고, 신경 세포나 접착하여 세포 유주를 행하는 신경능 세포로 분화하는 것으로 여겨진다. 또한 이 때, Wnt 시그널 경로 촉진제를 존재시킴으로써, 신경능 세포로의 분화가 보다 촉진하는 것으로 여겨진다. 이와 같은 신경 세포, 신경능 세포로의 분화를 촉진하는 라미닌 211 위치의 iPS세포에서는, VinculinY822의 인산화가 항진(亢進)하고, 세포간 접착이 우위하게 되어 있다.

라미닌 332는 α쇄가 α3, β쇄가 β2, γ쇄가 γ2인 아이소폼이며, 「라미닌 5」, 「라미닌 α3β3γ2」로 표기되는 경우도 있다. 라미닌 332는 피부 등의 중층상피조직의 기저막에 특이적으로 발현하는 것으로 알려져 있다. 라미닌 332는 다능성줄기세포가 바람직하게 생착하므로 콜로니 형성 배양에 사용할 수 있지만, 콜로니 형성 시에, 그 적절한 결합의 강도에 의해, 세포의 집단 운동이 활발한 상태에서 콜로니 형성이 일어나므로 세포의 밀도는 상대적으로 낮아진다. 이로써, 신경외배엽으로의 분화를 촉진하는 경로의 활성화가 일어나지 않고, 표면외배엽으로의 분화가 하기 쉬워진다. 또한, 분화한 신경이나 신경망막 등의 세포와의 결합 친화성이 낮고, 상피세포와의 친화성이 높으므로, 상피세포, 그 중에서도 각막상피세포를 바람직하게 유도할 수 있는 것으로 여겨진다.

라미닌 411은 α쇄가 α4, β쇄가 β1, γ쇄가 γ1인 아이소폼이며, 「라미닌 8」, 「라미닌 α4β1γ1」으로 표기되는 경우도 있다. 라미닌 411은 혈관내피 등의 기저막에 특이적으로 발현하는 것으로 알려져 있지만, 라미닌 411 또는 그의 E8 프래그먼트를 사용한 경우에는, 신경망막세포나 신경능 세포 등을 바람직하게 유도할 수 있다. 고농도 존재 하에서는 라미닌 511과 마찬가지로, 다능성줄기세포와의 결합의 강도에 의해, 세포의 집단 운동이 일어나지 않고, 콜로니 내의 세포 밀도가 상대적으로 높아지고, 콜로니의 중앙부에서 신경외배엽으로의 분화를 촉진하는 경로가 활성화하여, 신경외배엽계보로의 분화가 일어나기 쉽다. 한편, 상피세포와의 결합 친화성보다 신경능 세포나 망막세포와의 결합 친화성이 높으므로, 그 후의 망막 증식이 촉진되는 것으로 여겨진다.

라미닌 511은 α쇄가 α5, β쇄가 β1, γ쇄가 γ1인 아이소폼이며, 「라미닌 10」, 「라미닌 α5β1γ1」으로 표기되는 경우도 있다. 라미닌 511은 신장, 폐, 췌장, 혈관 등의 기저막에 특이적으로 발현하는 것이 알려져 있지만, 라미닌 511 또는 그의 E8 프래그먼트를 사용한 경우에는, 신경, 망막, 상피세포 등을 양호한 밸런스로 유도할 수 있는 것이 알려져 있다. 그러나, 보다 고농도로 되면, 다능성줄기세포와의 결합의 강도에 의해, 세포의 집단 운동이 일어나지 않고, 콜로니내, 그 중에서도 콜로니 중앙부에 걸쳐 세포 밀도가 상대적으로 높아지고, 콜로니의 중앙부에서 신경외배엽으로의 분화를 촉진하는 경로가 활성화하고, 신경외배엽계보로의 분화가 일어나기 쉽다. 한편, 저농도로 함으로써, 세포의 집단 운동을 촉진시켜, 상피세포를 바람직하게 유도할 수도 있다. 또한, 고농도에서는, MLC의 인산화도 인정을 되어 콜로니 외주(外周)에 수축이 일어나기 쉽다.

이와 같이, 라미닌 111, 라미닌 211, 라미닌 332, 라미닌 411 및 라미닌 511로 이루어지는 군으로부터 선택되는 라미닌 또는 그의 E8 프래그먼트를 사용함으로써, 동일한 눈 주위 세포라도, 종류가 상이한 세포를 고함유하는 세포 집단을 각각 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한, 상기 본 발명의 다능성줄기세포의 분화 제어 방법을 사용하여, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 눈 주위 세포를 함유하는 적어도 1개의 세포 집단을 제조하는 방법을 제공한다.

세포 집단(1): 망막세포 함유율이 높은 세포 집단

세포 집단(2): 신경능 세포 함유율이 높은 세포 집단

세포 집단(3): 신경세포 함유율이 높은 세포 집단

세포 집단(4): 각막상피세포 함유율이 높은 세포 집단

본 발명의 세포 집단의 제조 방법으로서는, 본 발명의 다능성줄기세포의 분화 제어 방법을 하는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 다능성줄기세포를 라미닌 332 또는 라미닌 332E8의 존재 하에서 배양함으로써, 각막상피세포 함유율이 높은 세포 집단을 제조할 수 있다. 그리고, 배양의 구체적인 조작이나 조건 등에 대해서는, 본 발명의 분화 제어 방법의 항을 참조할 수 있다.

또한, 라미닌 332 또는 라미닌 332E8을 사용한 경우에는, 다능성줄기세포와의 적절한 결합 강도에 의해, 세포의 집단 운동이 일어나기 쉽고 콜로니 형성 과정에 있어서 세포 밀도가 상대적으로 낮아지므로, Hippo 경로는 활성화하기 어렵고, 각막상피나 표피의 원기가 되는 표면외배엽이 분화하기 쉽게된다. 다능성줄기세포와의 결합성이 강한 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트를 사용한 경우, 예를 들면, 비특허문헌 1에 기재된 라미닌 511E8을 사용한 경우와 비교하면, 상피세포로의 분화 유도가 촉진되어 분화 유도에 필요로 하는 기간을 반감할 수 있는 효과도 얻을 수 있다. 또한, 분화 유도가 촉진되는 것에 의해 얻어지는 세포에 있어서의 미분화 상태의 세포나 조종양성(造腫瘍性)이 있는 세포의 비율이 적어지게 되므로, 보다 바람직하다. 따라서, 본 발명의 제조 방법에 의해, 생산성이 높고, 각막상피세포를 제조할 수 있는 우수한 효과도 얻을 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 의해 제조한 세포 집단은, 예를 들면, 세포 집단(4)은 그대로 배양하면 이식용 각막상피세포 시트를 제작할 수 있는 고순도의 각막상피세포 집단이다. 여기서, 「이식용 각막상피세포 시트를 제작하기 위한 각막상피세포 집단」은, 적어도 일안(한쪽 눈)용의 각막상피세포 시트의 제작에 필요한 1×10⁵개 이상의 세포로 구성되는 세포 집단일 필요가 있다. 다만, 본 발명의 산업상 이용을 고려하면, 「이식용 각막상피세포 시트를 제작하기 위한 각막상피세포 집단」은 복수눈 용의 각막상피세포 시트의 제작에 필요한 세포수를 가지는 것이 바람직하다. 따라서, 「이식용 각막상피세포 시트를 제작하기 위한 각막상피세포 집단」을 구성하는 세포수는, 2×10⁵cells 이상, 4×10⁵cells 이상, 6×10⁵cells 이상, 8×10⁵cells 이상, 1×10⁶cells 이상인 것이 바람직하다. 또한, 「이식용 각막상피세포 시트를 제작하기 위한 각막상피세포 집단」은, 불순 세포의 함유율이 50% 미만인 것이 바람직하고, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만인 것이 바람직하다.

이식용 각막상피세포 시트는, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조한 세포 집단을, 6웰 플레이트를 사용하는 경우에는 1.5×10⁵∼6.0×10⁵ cells/well로 파종하고, 12웰 플레이트를 사용하는 경우에는 0.5×10⁵∼1.0×10⁵ cells/well로 파종하여, 콘플루언트(confluent)로 될 때까지 5∼12 일간 배양함으로써 제작할 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 각막상피세포 집단은, 그대로 이식용 각막상피세포 시트의 제조 원료로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에는, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 각막상피세포 집단을 배양하는 공정을 포함하는 이식용 각막상피세포 시트의 제조 방법이 포함된다. 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 각막상피세포 집단으로부터 이식용 각막상피세포 시트를 제조하기 위한 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조한 세포 집단을, 6웰 플레이트를 사용하는 경우에는 1.5×10⁵∼6.0×10⁵ cells/well로 파종하고, 12웰 플레이트를 사용하는 경우에는 0.5×10⁵∼1.0×10⁵ cells/well로 파종하여, 콘플루언트로 될 때까지 5∼12 일간 배양함으로써 제작할 수 있다. 배지 교환은 2일에 1회의 비율로 행하는 것이 바람직하다. 플레이트에는 통상의 세포배양용 플레이트를 사용할 수 있다. 또한, 세포 시트 회수용 온도응답성 세포 배양(셀시드사에서 제조한 「Up Cell(상품명)」)을 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 세포 집단은, 특정 세포를 고비율로 함유하므로, 예를 들면, 안질환의 치료제의 약효 평가나 발증 메커니즘의 분석 등에 크게 공헌할 수 있다.

또한, 본 발명은, 라미닌 111, 라미닌 211, 라미닌 332, 라미닌 411 및 라미닌 511로 이루어지는 군으로부터 선택되는 라미닌 또는 그의 프래그먼트를 함유하는, 다능성줄기세포의 분화 제어제를 제공한다. 본 발명의 분화 제어제는, 다능성줄기세포를 상기 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트를 사용함으로써 원하는 세포로 선택적으로 유도할 수 있다. 상세한 것은, 본 발명의 분화 제어 방법의 항을 참조할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 일례이며, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다. 그리고, 이후에는, 실온은 25℃를 나타낸다.

실시예 1 눈 주위 세포로의 분화 유도

iPS세포로부터 눈 주위 세포로의 분화 유도에는, self-formed ectodermal autonomous multi-zone(SEAM)법을 사용했다(Hayashi et al. Nature.2016 Mar 17; 531(7594): 376-80.). 분화 유도의 공정을 도 1에 개략적으로 나타낸다. 그리고, 사용한 라미닌 아이소폼은, 라미닌 111의 E8 프래그먼트(라미닌 111E8), 라미닌 211의 E8 프래그먼트(라미닌 211E8), 라미닌 332의 E8 프래그먼트(라미닌 332E8), 라미닌 411의 E8 프래그먼트(라미닌 411E8) 및 라미닌 511의 E8 프래그먼트(라미닌 511E8)이며, 모두 공지 기술에 따라 조제한 것이다.

구체적으로는, 각 라미닌 아이소폼의 E8단편에서0.5∼1.0μg/cm²농도로 코팅한 플레이트에, 인간 iPS세포주(201B7)를 300∼700 cells/cm²의 밀도로 파종하고, 8∼10 일간, StemFit(등록상표) 배지(아지노모토)에서 배양한 후, 분화 배지(DM; 10% knockout serum replacement(KSR, Life Technologies), 1mM sodium pyruvate(Life Technologies), 0.1mM non-essential amino acids(Life Technologies), 2mM l-glutamine(Life Technologies), 1% penicillin-streptomycin solution(Life Technologies) 및 55μM 2-mercaptoethanol(Life Technologies)를 함유시킨 GMEM 배지(Life Technologies)에서 4주일 배양했다. 다음으로, 각막 분화 배지(CDM; 20ng/mL KGF(Wako), 10μM Y-27632(Wako) 및 1% penicillin-streptomycin solution을 함유시킨 DM 배지와 Cnt-20 또는 Cnt-PR 배지(EGF 및 FGF2 불함유, CellnTEC Advanced Cell Systems)의 1:1(V/V) 혼합 배지)에서 4주일 배양한 후, 각막상피 유지 배지(CEM; 2% B27 supplement(Life Technologies), 1% penicillin-streptomycin solution, 20ng/mL KGF, 10μM Y-27632를 함유시킨 DMEM/F-12(2:1(V/V)) 배지(Life Technologies)로 교환한 후 2∼5 주 더 배양하여 분화 유도했다. 그리고, 라미닌 511E8을 사용한 샘플은, 비특허문헌 1과 동일하게 행하여 분화 유도한 예이다.

각 라미닌 아이소폼에 대하여, 분화 유도 과정의 세포 형태의 위상차도를 Axio Observer. D1(Carl Zeiss)에서 취득했다. 결과를 도 2에 나타낸다. 그리고, 도면 중, 「111」은 라미닌 111E8을, 「211」은 라미닌 211E8을, 「332」은 라미닌 332E8을, 「411」은 라미닌 411E8을, 「511」은 라미닌 511E8을 사용한 예이며, 이후의 실시예에 있어서도, 동일하게 표기했다.

도 2로부터, 비특허문헌 1에 있어서의 「511」을 사용한 경우에 형성되는SEAM은, 제1층(도면 중의 1st), 제2층(도면 중의 2nd), 제3층(도면 중의 3rd), 제4층(도면 중의 4th)으로 이루어지는 4층 구조가 되며, 각각이, 중추신경, 망막, 각막상피, 각막 이외의 상피세포를 구성한다. 한편, 「111」을 사용하면, 제1·제2층(1st/2nd), 「211」을 사용하면, 제1층(1st), 「332」를 사용하면, 제3·4층 (3rd/4th)이 6주 후에는 유도되어 있는 것을 알 수 있다. 또한, 「411」을 사용하면, 「511」을 사용한 구조와 유사하지만, 제3·4층(3rd/4th)이 형성되지 않아 「511」과는 상이하였다. 이상으로부터, 아이소폼에 의해 다양한 눈 주위 세포가 분화하는 다능성줄기세포로부터 눈 세포로의 분화 유도에 대하여, 아이소폼을 사용함으로써, 특정한 층을 선택적으로 유도할 수 있었다.

실시예 2 분화 유도 세포에 있어서의 마커 단백질의 발현

실시예 1과 동일한 방법으로 분화 유도하고, 개시로부터 적절한 기간 배양한 세포를, 배양액을 제거하고, PBS로 세정한 후, 4% paraformaldehyde/PBS 또는 냉 메탄올로 고정했다. 다음으로, TBS로 3회 세정하고, 5% 당나귀 정상(正常) 혈청 및 0.3% Triton-X100 함유 TBS로 실온에서 1시간 블록킹한 후, 1차 항체를 가하고 실온에서 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후, TBS로 3회 세정한 후, 2차 항체를 가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 그리고, 1차 항체로서, 신경능 세포의 검출에는, 항p75항체(Mouse monoclonal; ME20.4, ADVANCED TRGETING SYSTEMS) 및 항SOX10항체(Goat polyclonal; N-20, Santa Cruz Biotechnology)를 사용했다. 신경 세포의 검출에는, 항TUBB3항체(Rabbit polyclonal; T2200, Sigma-Aldrich)를 사용했다. 상피세포 및 망막세포의 검출에는, 각각, 항E-cadherin항체(Mouse monoclonal; 180215, R&D systems) 및 항CHX10항체(Goat polyclonal; N-18,Santa Cruz Biotechnology)를 사용했다. 각막상피세포의 검출에는, 항PAX6항체(Rabbit polyclonal; ab97866, Abcam) 및 항p63항체(Mouse monoclonal; 4A4, Santa Cruz Biotechnology)를 사용했다. 2차 항체에는, Alexa Fluor(등록상표) 488, 567 또는 647 표지 항마우스, 토끼 또는 양 IgG항체(Invitrogen)를 사용했다. 항체는 모두 1% 당나귀 정상 혈청 및 0.3% Triton-X100 함유 TBS로 희석하여 사용했다. 핵의 염색은, 100배 희석 농도의 Hoechst 33342로 실온에서 10분간 처리함으로써 행하였다. 관찰 시에는 Axio Observer. D1(Carl Zeiss)을 사용했다. 결과를 도 3에 나타낸다.

신경능 세포는 p75/SOX10 공양성 세포로서 정의할 수 있다. 배양 2주째에 있어서는, 「511」 상에서는 구형의 p75/SOX10 공양성 세포가 검출되지만, 그 외의 아이소폼에서도 p75/SOX10 공양성의 신경능 세포를 검출할 수 있었다. 특히 「211」을 사용하면, 신경능 세포의 확대 및 유주가 촉진되었다. 또한, 「511」을 사용한 종래의 방법에서는 배양 4주째에 있어서는, p75/SOX10 공양성의 신경능 세포는 소실되지만, 「211」에서는 계속 검출되었다.

신경 세포의 마커 TUBB3은, 대조군의 「511」 상에서는, 제1층, 제2층에 있어서 그 발현이 확인되었다. 또한, 「111」, 「211」 상에서는 양성 세포가 섬유를 형성하고 있었다. 「411」에서는 TUBB3 양성의 제2층째가 「511」과 비교하여 확대되어 있었다. 한편, 「332」에서는 TUBB3 양성의 신경 세포 출현이 인정되지 않았다.

신경망막의 마커 CHX10은, 대조군의 「511」에서는 제2층에 그 발현이 인정되지만, 「411」에서는 CHX10 양성의 신경망막세포가 크게 확대하고 있었다. 그 외의 아이소폼에서는 신경망막의 발현을 인정할 수 없었다. 한편, 상피 마커의 E-cadherin은, 대조군의 「511」에서는 3층보다 외측에서 인정되지만, 「332」에서는 E-cadherin 양성의 상피 세포가 크게 확대되어 있었다. 「111」이나 「211」에서는 E-cadherin 양성 세포는 적었다.

각막상피세포는 PAX6/p63 공양성 세포로서 정의할 수 있다. 「332」를 사용함으로써, PAX6/p63 공양성 세포의 각막상피세포의 분화가 확대되어 있는 것이 인정되었다.

이로써, 「111」은 신경 세포, 「211」은 신경 세포 및 신경능 세포, 「332」는 각막상피세포나 그 외의 상피세포, 「411」은 망막세포의 분화를 각각 특이적으로 촉진시켰다.

실시예 3 분화 세포의 경시적 유전자 발현 분석

실시예 1과 동일한 방법으로 분화 유도하고, 분화 배양의 개시 직전(0주), 4, 6, 12 주 후의 세포에 대하여, 배양액을 제거하고, PBS로 세정한 후, QIAzol Lysis Reagent(QIAGEN)를 사용하여 정제하고, 총량 20μL의 반응계에서, SuperScript(등록상표) III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT- PCR(Invitrogen)에 의해 역전사를 행하고, 제작한 cDNA를 주형에 사용하고, ABI Prism 7500 Fast Sequence Detection System(Life Technologies)에 의해 정량적(定量的) 실시간 PCR(qRT-PCR)을 행하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.

신경 마커의 SOX2의 유전자 발현은 「332」를 사용한 경우에 저하되었다. 신경능 마커의 SOX10 및 p75는 제4 주에 있어서 「211」을 사용한 경우에 그 유전자 발현이 상승하였지만, 눈의 주요한 전사인자인 PAX6의 발현은 낮았다. 망막의 마커인 RAX, VSX2는 「411」 및 「511」을 사용한 경우에 높았다. 상피세포 마커의 E-cadherin(Ecad), TP63, K14는 「332」로 높았다. 이로써, 실시예 2의 정성적인 아이소폼에 의한 분화의 방향 전환이, 정량적으로 확인되었다.

실시예 4 iPS세포의 콜로니 형성 과정의 타임 랩스 분석

「332」 또는 「511」(모두 0.5μg/cm²)로 코팅한 배양 용기에, iPS세포를 파종하고, IncuCyte(등록상표) Live Cell Analysis System(Essen BioScience)으로 타임 랩스 촬영 후의 각 배양 일수의 위상차상을 취득했다. 결과를 도 5에 나타낸다.

iPS세포는, 「332」 상에서는 방사형으로 세포 집단 운동이 빈번하게 일어나, 면적이 넓은 콜로니를 형성한 것에 비해, 「511」 상에서는 집단 운동이 일어나지 않아, 밀도가 높은 콜로니를 형성하는 것이 확인되었다.

실시예 5 iPS세포의 콜로니에 있어서의 Hippo 경로에 관여하는 전사공역인자 YAP의 국재와 신경외배엽 분화의 관계

「332」 또는 「511」(모두 0.5μg/cm²)로 코팅한 배양 용기에 iPS세포를 파종하고, 10일간 StemFit(등록상표) 배지(아지노모토)에서 배양한 후의 세포 또는 10일간의 StemFit(등록상표) 배지에서 배양한 후에 실시예 1에서 사용한 분화 배지(DM)와 동일한 배지로 교환하여 3일간 배양한 세포를, 배양액을 제거한 후, TBS로 세정하고, 4% paraformaldehyde/PBS 또는 냉 메탄올로 고정했다. 다음으로, TBS로 세정한 후, 막투과 처리를 위해, 1% NST/TBS(1% normal donkey serum, 0.3% Triton-X100)로 교환한 후, 4℃에서 하룻밤 정치(靜置)했다. 또한, 5% 당나귀 정상 혈청 및 0.3% Triton-X100 함유 TBS로 실온에서 1시간 블록킹한 후, 1차 항체를 가하고 실온에서 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후, PBS로 3회 세정한 후, 2차 항체를 가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 1차 항체는, 항YAP항체(Mouse monoclonal; 63.7, Santa Cruz Biotechnology) 및 항N-cadherin항체(Rabbit monoclonal; EPR1791-4, Abcam)를 사용했다. 2차 항체에는, Alexa Fluor(등록상표) 488 또는 594 표지의 항마우스 또는 토끼 IgG항체(Invitrogen)를 사용했다. 항체는 모두 1% NST/TBS로 희석하여 사용했다. 핵의 염색은, Hoechst 33342로 실온에서 10분간 처리함으로써 행하였다. 관찰 시에는 Axio Observer. D1(Carl Zeiss)을 사용했다. 결과를 도 6에 나타낸다. 좌측이 iPS세포 배양 10일 후의 YAP의 염색 결과, 우측이 분화 배양 3일 후의 것이며, 상단(上段)이 YAP의 염색 결과, 중단이 N-cadherin의 염색 결과, 하단이 양자를 중첩한 결과이다.

iPS세포를 「511」 상에서 배양하면, 콜로니의 외주는 YAP가 핵내에 국재하는 것에 비해, 밀도가 높은 콜로니 중앙부는 YAP가 핵외에 국재하고, Hippo 시그널이 활성화하고 있는 것이 시사되었다. 분화 배지로 교환 후 3일 배양하면 콜로니 중앙부의 YAP가 핵외에 국재하는 영역, 즉 Hippo 경로 활성화 영역만에서 신경외배엽 분화를 나타내는 N-cadherin 양성 세포 분화가 일어났다. 한편, 「332」를 사용하여 iPS세포 콜로니의 밀도를 작게 함으로써, 콜로니의 전역(全域)에 있어서, YAP를 핵내에 국재시키는, 즉 Hippo 경로를 불활화시킴으로써, N-cadherin 양성의 신경외배엽으로의 분화를 저해하고, 이후의 각막상피의 전구에 해당하는 표면 외배엽세포로의 분화를 촉진할 수 있었다.

실시예 6 분화 유도한 세포의 각막상피 마커 양성율의 분석

「111」, 「211」, 「332」, 「411」 또는 「511」(모두 0.5μg/cm²)로 코팅한 배양 용기에 iPS세포를 파종하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 분화 유도한 세포를, Accutase(Life Technologies)로 처리한 후, KCM 배지(5% FBS(Japan Bio Serum), 0.4μg/mL hydrocortisone succinate(Wako), 2nM 3,3',5-Triiodo-l-thyronine sodium salt(MP biomedicals), 1nM cholera toxin(List Biological Laboratory), 2.25μg/mL 1 bovine transferrin HOLO form(Life Technologies), 2mM l-glutamine, 0.5% insulin transferrin selenium solution(Life Technologies), 1% penicillin-streptomycin을 함유시킨 DMEM without glutamine/Nutrient Mixture F-12 Ham 배지(3:1(V/V), Life Technologies))에 재현탁하고, 셀스트레이너(cell strainer)(40㎛, BD Biosciences)를 통과시킨 후, 항SSEA-4항체(MC813-70, Biolegend), CD104항체(ITGB4; 58XB4, Biolegend 또는 624024, BD Pharmingen) 및 CD200항체(624052, BD Pharmingen)로 빙상에서 1시간 염색 후, PBS로 세정한 후, 셀소터 SH800(SONY) 또는 FACS Verse(BD Biosciences)로 해석을 행하였다. 데이터 분석 시에는 FlowJo(TreeStar)를 사용했다. 결과를 도 7에 나타낸다.

각막상피 (전구)세포는 비특허문헌 1에 의해 SSEA4/ITGB4 공양성 세포로 정의할 수 있지만, 「332」를 사용함으로써, SSEA4/ITGB4 공양성 세포의 비율을, 「511」을 사용한 경우와 비교하여 3배 정도 상승시킬 수 있었다. 또한, 「511」을 사용한 경우에는, 수동 피펫팅 조작에 의해 제1층과 제2층을 물리적으로 제거하는 공정이 필요하지만, 재생의료로의 응용을 상정(想定)한 경우, 노동력이 들고, 인적오류(human error)로 이어질 우려가 있다. 한편, 「332」를 사용함으로써, 피펫팅에 의한 비상피세포의 제거와 같은 조작을 생략하는 것이 가능하게 되어, 보다 유효한 것으로 시사된다.

실시예 7 분화 유도 과정에서의 미분화 마커의 유전자 발현 분석과 분화 유도 6주에서의 iPS세포 유래 각막상피세포 시트의 평가

「332」 또는 「511」(모두 0.5μg/cm²)로 코팅한 배양 용기에 iPS세포를 파종하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 분화 유도 후 4, 6, 12 주 후의 세포 중의 미분화 마커 LIN28A의 유전자 발현을 실시예 3에 기재된 방법으로 분석했다.

또한, 동일하게 6주 후의 분화 세포로부터 실시예 6에 기재된 항체로 염색한 후, 비특허문헌 1에 기재된 SSEA4, ITGB4 공양성 세포를 셀소터 SH800(SONY)로 소팅하고, 셀컬쳐인서트(cell culture inserts)(BD Falcon)에 파종하고, CEM 배지에서 3주일 배양한 후, 메스로 멤브레인마다 잘라내고 OCTcompund로 포매(包埋)·동결한 후, 크라이오스탯(cryostat)(라이카사)을 사용하여 절편(切片)을 제작했다. 절편 작성 후, 풍건(風乾)하고, 5% 당나귀 정상 혈청 및 0.3% Triton-X100 함유 TBS로 실온에서 1시간 블록킹한 후, 1차 항체를 가하고 실온에서 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후, TBS로 3회 세정한 후, 2차 항체를 가가호 실온에서 1시간 반응시켰다. 1차 항체에는, 항PAX6항체(Rabbit polyclonal; ab97866, Abcam) 및 항K12항체(Goat polyclonal; N-16, Santa Cruz Biotechnology)를 사용했다. 2차 항체에는, Alexa Fluor(등록상표) 488 또는 567 표지 항마우스 또는 토끼 IgG항체(Invitrogen)를 사용했다. 항체는 모두 1% 당나귀 정상 혈청 및 0.3% Triton-X100 함유 TBS로 희석하여 사용했다. 핵의 염색은, 100배 희석 농도의 Hoechst 33342로 실온에서 10분간 처리함으로써 행하였다. 관찰 시에는 Axio Observer. D1(Carl Zeiss)을 사용했다. 결과를 도 8에 나타낸다.

iPS세포 유래 분화 세포의 임상응용을 상정한 경우에는, 미분화 세포의 혼입에 의한 조종양성의 문제가 우려되지만, 미분화 마커의 혼입에 대해서는 LIN28A가 유용한 마커인 것으로 보고되어 있다. 「332」를 사용함으로써, 분화 유도의 각 단계에 있어서 분화 마커 LIN28A의 발현량을 「511」에 비해 모두 2배 이상 억제할 수 있었다. 또한, 통상적으로 각막상피 시트를 제작할 때는, 분화 유도를 12주일 정도 행하고, 그로부터 FACS로 각막상피세포만을 단리하지만, 6주일의 분화 유도 세포로부터 제작한 시트에 있어서, 「511」 상에서 분화된 것에 대해서는, 각막상피 마커인 PAX6, K12의 발현이 불충분한 것에 비해, 「332」 상에서 분화 유도한 세포로부터 채취하여 제작한 각막상피 시트는 이들 마커를 충분히 발현하고 있었다. 이로써, 「332」를 사용함으로써, 분화 유도의 기간을 절반인 6주로 단축할 수 있었다.

실시예 8 각 라미닌 아이소폼 상에서의 눈 주위 세포의 세포생존율

실시예 1과 동일한 방법으로 「511」을 사용하여 iPS세포로부터 분화 유도 6주 후에 형성된 SEAM 구조 중의 제1∼4층의 세포를 수동 피펫팅으로 회수한 후, StemPro(등록상표) Accutase(등록상표)(Thermo Fisher Scientific)로 해리 또는 실시예 7에 기재된 FACS sorting으로 단리한 것을, 동일 세포수마다, 「111」, 「211」, 「332」, 「411」 또는 「511」(모두 0.5μg/cm²)로 코팅한 세포배양 플레이트에 파종했다. 파종 후의 세포는 CDM 배지에서 6주일 배양한 후, 세포수를 Cell Counting Kit-8(도진화학)에 의해 측정하고, 「511」에 대한 상대 세포생존율로서 산출했다. 결과를 도 9에 나타낸다.

「332」 상에서는, 1층(신경)과 2층(망막)의 세포가 그다지 증가하지 않는 것에 비해, 3층(각막상피), 4층(그 외의 상피)의 세포의 증식이 인정되었다. 따라서, 「332」는 SEAM 구조 중의 3층와 4층의 세포를 특이적으로 증식시키는 것이 시사되었다.

실시예 9 각 라미닌 아이소폼 상에서의 분화 세포의 비율

실시예 3에 있어서 분화 유도 세포에 있어서의 유전자 발현을 검토했지만, 그 때의 발현량에 대하여 상세하게 대비를 행하였다. 구체적으로는, 분화 유도 4주째의 신경능 마커 유전자 발현 결과에 대하여, 「211」 상에서 분화 유도한 것과 「511」 상에서 분화 유도한 것을 추출했다. 또한, 동일하게 분화 유도 12주에서의 N-cadherin 유전자의 「411」과 「511」의 발현 분석 결과를 추출했다. 또한, 실시예 6에 있어서 정량한 각막상피 마커 양성율을 대비한 결과도 추출했다. 결과를 도 10에 정리하여 나타낸다.

「211」 상에서는 「511」과 비교하여, 분화 유도 4주째에서의 신경능 마커의 SOX10이 약 17배, p75가 약 2배 정도 상승했다. 또한, 「411」 상에서는 망막(CHX10 양성 세포) 영역이 확대하는 것을 이미 도 3에 나타내었으나, N-cadherin의 발현비는 1.25배 정도로 상승하고, 상피세포가 차지하는 비율에 대하여, 망막세포가 차지하는 비율이 「411」 상에서 높아지고 있는 것을 나타낸다. 한편, 「332」 상에서 분화 유도함으로써, 각막상피 마커 양성 세포의 비율이 「511」에 비해서 2배 이상 높아져 있었다.

실시예 10 Wnt 시그널 타깃 유전자의 발현 분석

「111」, 「211」, 「332」, 「411」 또는 「511」(모두 0.5μg/cm²)로 코팅한 배양 용기에 iPS세포를 파종하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 분화 유도 3일째의 iPS 유래 세포의 Wnt 시그널의 표적 유전자의 발현 분석을 행하였다. 결과를 도 11에 나타낸다.

「211」 상에서 분화 유도함으로써, Wnt 시그널의 표적 유전자인, AXIN2 및 LEF-1의 유전자 발현이 상승했다. 따라서, 「211」 상에서는 신경능의 분화를 촉진시키는 Wnt 시그널이 다른 아이소폼 상에서의 분화 유도와 비교하여, 활성화하고 있는 것이 시사되었다.

실시예 11 라미닌의 코팅 농도에 의한 분화 조절

「511」의 코팅 농도를 0.5, 1.0, 1.5(μg/cm²)로 한 상태에서, 실시예 1과 동일한 방법으로 분화 유도를 행하고 12주 후의 유전자 발현 분석을 행하였다. 결과를 도 12에 나타낸다.

「511」의 코팅 농도 의존적으로 중층 상피줄기세포 마커 TP63의 유전자 발현은 저하되고, 한편, 신경망막 마커 VSX2의 유전자 발현은 상승했다. 이상으로부터, iPS세포와의 상호 작용이 강하면 강할수록, 망막의 분화를 촉진시키고, 중간 정도이면 상피화를 촉진하는 것이 시사되었다.

실시예 12 각 라미닌 아이소폼의 코팅 농도에 의한 각막상피세포로의 분화 유도

「111」, 「211」, 「332」, 「411」, 「511」 또는 「VN」의 코팅 농도를 0.5, 1.0, 1.5(μg/cm²)로 한 상태에서, 실시예 1과 동일한 방법으로 분화 유도를 행하고, 실시예 6과 동일하게 하여 FACS 분석으로, 각막상피세포 획분을 정량했다. 결과를 도 13에 나타낸다.

「332」를 사용함으로써, 각막상피세포를 각 농도에 있어서 안정적으로 또한 고효율로 유도할 수 있었다. 또한, 「511」을 사용한 경우에는, 농도가 높아지면 유도 효율이 저하되는 것을 알았다.

실시예 13 신경능 세포 마커 유전자의 발현 분석

「111」, 「211」, 「332」, 「411」 또는 「511」의 코팅 농도를 0.5∼1.0(μg/cm²)로 한 상태에서, 실시예 1과 동일한 방법으로 분화 유도 3일째의 iPS 유래 세포로부터, 공지의 방법에 따라 RNA를 회수했다. 얻어진 RNA는, RNeasy Plus micro kit(Qiagen)을 사용하여 정제하고, Sure Print G3 human 8×60K slides(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 마이크로어레이 분석을 행하고(다카라바이오), GeneSpring GX software(Agilent Technologies)를 사용하여, 신경능 세포 마커 유전자의 히트 맵을 제작했다. 결과를 도 14에 나타낸다.

「211」을 사용한 경우에는, 각종 신경능 마커의 발현량이 많은 분화 세포가 얻어지므로, 「211」을 사용함으로써 신경능 세포로의 분화 제어를 양호하게 행할 수 있는 것을 나타낸다.

실시예 14 신경능 세포 마커의 발현 분석

「211」의 코팅 농도를 0.5∼1.0(μg/cm²)로 한 상태에서, 실시예 1과 동일한 방법으로 4주일 분화 유도한 세포를, 실시예 2와 동일한 방법으로 항체와 반응시켰다. 1차 항체에는, 항PITX2항체(Abcam, Ab55599) 및 항FOXC1항체(Cell Signaling Technology, 8758)를 사용했다. 2차 항체에는, Alexa Fluor(등록상표) 488, 594 표지 항마우스 또는 토끼I gG항체(Invitrogen)를 사용했다. 항체는 모두 1% NST/TBS(1% normal donkey serum, 0.3% Triton-X100 함유 TBS)로 희석하여 사용했다. 핵의 염색 및 세포의 관찰은, 실시예 2와 동일한 방법으로 행하였다. 결과를 도 15에 나타낸다.

「211」 상에서의 분화 유도에 의하여, 눈 주위 신경능 마커 PITX2, FOXC1 양성 세포가 출현했다.

실시예 15 Wnt 시그널 경로 관련 유전자의 발현 분석

「111」, 「211」, 「332」, 「411」 또는 「511」로 코팅한 배양 용기를 사용하고, 실시예 13과 동일한 방법으로, Wnt 시그널 경로 관련 유전자의 히트 맵을 제작했다. 결과를 도 16에 나타낸다.

「211」을 사용한 경우에는, Wnt 시그널 경로 관련 유전자 발현이 상승하고 있는 것을 나타낸다.

실시예 16 Wnt 시그널과 신경능 세포로의 분화(Ⅰ)

「211」을 1.0μg/cm² 또는 「511」을 0.5μg/cm²로 코팅한 배양 용기를 사용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 2주일 분화 유도할 때, 최초의 3일간 Wnt 시그널 경로 저해제인 IWP-2 또는 Wnt 시그널 경로 촉진제인 CHIR99021로 처리를 행하고, 실시예 6과 동일한 방법으로 FACS 분석을 행하였다. FACS는, CD271(p75, C40-1457; BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA)과 CD40d(ITGA4, 9F10; BioLegend)에 대한 항체를 사용하여 행하였다. 그리고, 각 Control에는 DMSO를 첨가한 계(系)를 사용했다. 결과를 도 17에 나타낸다. 그리고, 도면 중, 상단에는 본실시예에서의 분화 유도 과정의 개략도를 나타낸다.

「211」 상에서의 분화 유도에 의해, 매우 높은 비율로 신경능 세포가 출현했다(43%). 그러나, Wnt 저해제의 첨가에 의해, 「211」 상에서의 신경능 세포 분화는 저해되었다. 한편, 「511」 상에서의 분화 유도에서는, 신경능 세포의 비율은 0.35%에 그쳤지만, Wnt 촉진제로 처리함으로써, 그 비율이 6.2%로 상승했다. 따라서, Wnt 시그널 경로는 신경능 세포 분화에 중요한 것으로 나타났다.

실시예 17 Wnt 시그널과 신경능 세포로의 분화(Ⅱ)

실시예 16에서 분화 유도된 세포에 대하여, p75항체(ADVANCED TRGETING SYSTEMS, AB-N07)와 SOX10항체(Santa Cruz Biotechnology, sc-17342)를 사용하여, 실시예 2과 동일한 방법으로 면역 염색을 행하였다. 결과를 도 18에 나타낸다.

「211」 상에서의 분화 유도에 의해, p75, SOX10 공양성의 신경능 세포가 출현했지만(DMSO), Wnt 저해에 의해 공양성 세포가 감약(減弱)했다(IWP). 한편, 「511」 상에서의 분화 유도에 의해, 출현하는 p75, SOX10 공양성의 신경능 세포는, Wnt 촉진에 의해 그 출현이 증가하였다(DMSO와 CHIR의 대비). 화살표는 p75, SOX10 공양성의 신경능 세포를 나타낸다.

실시예 18 MLC(Myosin light chain)의 인산화 분석

「211」을 1.0μg/cm², 「332」를 0.5μg/cm² 또는 「511」을 0.5μg/cm²로 코팅한 배양 용기를 사용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 3일간 iPS세포를 배양하고, 고정한 후, Myosin light chain(phospo S20) 항체(Abcam, ab2480)를 사용하여, 실시예 2과 동일한 방법으로 면역 염색을 행하였다. 결과를 도 19에 나타낸다.

「511」 상에서, iPS세포 콜로니의 외주부에 MLC의 인산화가 인정되었고(도면 중의 화살표 부분), 콜로니 외주에 수축이 작용하고 있는 것으로 나타났다. 한편, 라미닌 「211」 상에서는 iPS세포 콜로니 외주에 가해지는 수축의 정도는 약한 것으로 나타났다.

실시예 19 MLC와 Vinculin의 인산화 분석

실시예와 18과 동일한 방법으로 10일간 배양한 후의 iPS세포에 대하여, RIPA buffer(Thermo)로 세포 추출 후, Pierce(등록상표) BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 단백질량을 정량한 후, 동일한 단백질량이 되도록 SDS-PAGE를 행하였다. SDS-PAGE 후에는, iBlot system(Invitrogen, Waltham, MA, USA)을 사용하여 멤브레인에 전사하고, p-MLC(ab2480, 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), p-Vinculin(V4889, 1:1,000; Sigma-Aldrich) Vinculin(ab18058; Abcam) 또는GAPDH(ab8245, 1:5,000; Abcam)에 대한 1차 항체, horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG(ab6789, 1:5,000; Abcam) 또는 anti-rabbit IgG(ab97051, 1:5,000; Abcam)에 대한 2차 항체를 사용하여 항체 반응을 행하였다. ECL Prime reagent(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)를 사용하여 검출하고, ChemiDoc XRS+ imaging system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 스캔했다. 결과를 도 20에 나타낸다.

MLC의 인산화는 「511」에서 강하며, 「211」에서 약했다. 한편, 세포간 접착을 인식하는 Vinculin의 Y822의 인산화는 「211」(J Cell Biol.2014 Apr 28; 205(2): 251-63. doi: 10.1083/jcb.201309092. Epub 2014 Apr 21.)에서 특히 강했다. 이상으로부터, 「511」 상에서는 iPS세포에 강한 수축이 가해지고, 「211」에서는 세포간 접착이 우위한 것으로 나타났다.

실시예 20 iPS 콜로니 내의 세포 밀도

「332」를 0.5μg/cm² 또는 「511」을 0.5μg/cm²로 코팅한 배양 용기를 사용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 10일간 배양한 iPS세포에 대하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 블록킹과 핵 염색을 행하고, 세포수를 카운트하여, 1mm²당의 세포 밀도를 산출했다. 결과를 도 21에 나타낸다.

「511」 상의 iPS 콜로니의 중앙부에서 세포 밀도가 가장 높았다.

실시예 21 YAP 활성의 상이

「332」를 0.5μg/cm² 또는 「511」을 0.5μg/cm²로 코팅한 배양 용기를 사용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 10일간 배양한 iPS세포에 대하여, 실시예 3과 동일한 방법으로 유전자 발현을 분석했다. 결과를 도 22에 나타낸다.

「332」와 비교하여 「511」 상의 iPS세포는 YAP 표적 유전자(CTGF, CYR61)의 발현량이 낮으므로, 「511」 상에서는 YAP의 활성이 억제되어 있는 것으로 나타났다.

실시예 22 콜로니의 응축과 신경외배엽 분화

「511」을 0.25∼1 μg/cm²로 코팅한 배양 용기를 사용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 10일간 배양한 iPS세포에 대하여, 콜로니의 직경을 EVOS FL Auto system(Life Technologies)으로 정량했다. 또한, 상기와는 별도로, 그대로 분화 유도시킨 분화 3일째의 세포에 대하여, 실시예 2과 동일한 방법으로 면역 염색을 행하였다. 결과를 도 23에 나타낸다.

「511」의 코팅 농도에 의존하여 iPS세포 콜로니는 응축했다. 또한, 콜로니의 응축에 의해, PAX6은 코팅 농도 의존적으로 발현이 상승했다. 따라서, 「511」은 콜로니의 응집과 신경외배엽 분화를 촉진하는 것으로 나타났다.

실시예 23 YAP 활성화와 신경외배엽 분화

「511」을 0.5μg/cm²로 코팅한 배양 용기를 사용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 10일간 iPS세포를 배양한 후, Verteporfin(VP) 또는 DMSO를 첨가한 분화 배지에서 3일간 배양하고, 항PAX6항체(BioLegend, PRB-278P)를 사용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 면역 염색을 행하였다. 또한, 실시예 21과 동일한 방법으로 유전자 발현도 분석했다. 결과를 도 24에 나타낸다.

YAP-TEAD 저해제인 VP 처리에 의하여, PAX6나 RAX 등 신경외배엽 마커의 발현이 상승했다. 따라서, 초기 분화에 있어서의 YAP의 불활화는 신경외배엽 분화를 촉진하는 것으로 나타났다. 이상으로부터, 「511」은 iPS 콜로니를 응축하고, 세포 밀도를 상승시키며, YAP의 불활화를 촉진함으로써, 신경외배엽 분화를 촉진하는 것으로 나타났다.

[산업상 이용가능성]

본 발명에 의해, 분화 유도 세포의 비율을 임의로 변화시킨 세포 집단을 다능성줄기세포로부터 간편하게 제조할 수 있다. 상기한 제조 방법에 의해 얻어지는 세포 집단은, 세포 의료에 의한 질환의 치료에 극히 유용하다.

Claims (12)

1. 삭제
2. 라미닌 332 또는 라미닌 332E8 프래그먼트(fragment)의 존재 하에 다능성 줄기세포를 분화 유도하여 각막상피세포로의 분화를 유도하는, 다능성 줄기세포의 분화 유도 방법.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제2항에 기재된 분화 유도 방법에 의해 유도된 각막상피세포를 배양하는, 각막상피세포 집단의 제조 방법.
8. 삭제
9. 제7항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어진 각막상피세포 집단을 사용하는, 이식용 각막상피세포 시트의 제조 방법.
10. 라미닌 332 또는 그의 E8 프래그먼트를 함유하여 이루어지는, 다능성 줄기세포를 각막상피세포로 분화 유도하기 위한 분화 유도제.
11. 삭제
12. 삭제

Images