JP2016539641A - ラミニンの角膜内皮細胞培養への応用 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)角膜内皮細胞において発現するラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子を含む、角膜内皮細胞の培養または増殖のための組成物。
(2)前記ラミニンは、ラミニン511(α5β1γ1)およびラミニン521(α5β2γ1)を含む、項目1に記載の組成物。
(3)前記フラグメントは、角膜内皮細胞の細胞接着能を有する、項目1または2に記載の組成物。
(4)前記因子は、ラミニン511、ラミニン521またはラミニン511−E8フラグメントである、項目1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
(5)前記角膜内皮細胞はヒトのものである、項目1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
(6)項目1〜5のいずれか1項に記載の組成物を含む、角膜内皮細胞の培養用培地。
(7)項目1〜5のいずれか1項に記載の組成物をコーティングした角膜内皮細胞の培養容器。
(8)項目1〜5のいずれか1項に記載の組成物を用いる工程を包含する、角膜内皮細胞の培養方法。
(9)項目6に記載の培地を用いる工程を包含する、角膜内皮細胞の培養方法。
(10)項目7に記載の培養容器を用いる工程を包含する、角膜内皮細胞の培養方法。
本明細書において「角膜内皮細胞」とは当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。角膜とは、眼を構成する層状の組織の一つであり透明であり、最も外界に近い部分に位置する。角膜は、ヒトでは外側(体表面)から順に5層でできているとされ、外側から角膜上皮、ボーマン膜、固有層、デスメ膜(角膜内皮基底膜)、および角膜内皮で構成される。特に、特定しない限り、上皮および内皮以外の部分は「角膜実質」とまとめて称することがあり、本明細書でもそのように称する。本明細書において「HCEC」(human corneal endothelial cells)とは、ヒト角膜内皮細胞の略称である。本発明で使用される角膜内皮細胞は、天然に存在する細胞のほか、幹細胞から分化した細胞、例えばiPS等からの誘導分化細胞を用いることができることが理解される。
(a)配列番号1に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号1に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンα5鎖の有する活性をいう。α5鎖については、Doi M et al.,J.Biol.Chem. 277(15),12741−12748,2002;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)〜(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンα5鎖の有する活性をいう。α5鎖については、Doi M et al.,J.Biol.Chem. 277(15),12741−12748,2002;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号3に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ1鎖の有する活性をいう。β1鎖については、Pillarainen et al.,J.Biol.Chem.262(22),10454−10462,1987;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号4に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)〜(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ1鎖の有する活性をいう。β1鎖については、Pillarainen et al.,J.Biol.Chem.262(22),10454−10462,1987;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号5に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ2鎖の有する活性をいう。β2鎖については、Wewer UM et al.,Genomics. 1994 Nov 15;24(2):243−52.,1987;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号6に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号6に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号5に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号6に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)〜(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ2鎖の有する活性をいう。β2鎖については、Wewer UM et al.,Genomics. 1994 Nov 15;24(2):243−52.,1987;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号7に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンγ1鎖の有する活性をいう。γ1鎖については、Pillarainen et al.,J.Biol.Chem.263(14),6751−6758,1988;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号8に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号8に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号7に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号8に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)〜(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンγ1鎖の有する活性をいう。γ1鎖については、Pillarainen et al.,J.Biol.Chem.263(14),6751−6758,1988;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al.(1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F. M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M. A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F. M. (1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F. M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M. A. et al.(1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J. J. et al.(1999).PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F.(1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R. L. et al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al.(1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G. M. et al.(1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G. T. (I996). Bioconjugate Techniques, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されている。角膜内皮細胞については、Nancy Joyceらの報告{Joyce, 2004 #161} {Joyce, 2003 #7}がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じるため、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。また、任意の実施形態が組み合わせ得ることも理解されるべきである。
1つの局面において、本発明は、角膜内皮細胞において発現するラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子を含む、角膜内皮細胞の培養または増殖のための組成物を提供する。
別の局面において、本発明は、本発明の組成物を用いた、角膜内皮細胞の培養方法を提供する。すなわち、本発明は、本発明の因子(ラミニン、そのフラグメント等)を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を培養する、培養または増殖する方法を提供する。本発明の方法において用いられる因子(ラミニン、そのフラグメント等)は、本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。また、本発明の方法において使用されうる培養成分は、角膜内皮の培養に用いられうる成分であればどのようなものでも用いることができ、本明細書において説明される任意の形態のものを例示することができる。
本発明は、本発明の方法で培養して生産される角膜内皮細胞を提供する。本発明は、通常の培養を行い継代しても、正常に培養または増殖した細胞である点で従来の細胞に無い性質を有するということができる。そして、最も重要な性質は、機能としては正常な角膜内皮の性質を有しているという点である。したがって、本発明が提供する角膜内皮細胞は、製剤として提供されうることから、本発明は、角膜内皮製剤を提供するということになる。したがって、本発明は、本発明の因子もしくは組成物を含む培養液または本発明の因子もしくは組成物がコーティングされた容器を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を含む、角膜内皮製剤の製造方法を提供する。
(1)細胞層が単層構造である。これは生体の角膜内皮細胞層が備える特徴の一つである。
(2)細胞層における細胞密度は約1,000〜約4,000細胞/mm2である。特に、成人をレシピエント(移植者)とする場合には約2,000〜約3,000細胞/mm2であることが好ましい。
(3)細胞層を構成する細胞の平面視形状が略六角形である。これは生体における角膜内皮細胞層を構成する細胞が備える特徴の一つである。本発明の製剤は生体の角膜内皮細胞層に類似し、生来の角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮するとともに、生体内で増殖能も発揮することができる。
(4)細胞層において細胞が規則正しく整列している。生体の角膜内皮細胞層においてはそれを構成する細胞は規則正しく整列しており、これによって角膜内皮細胞の正常な機能と高い透明性が維持され、また角膜の水分調整機能が適切に発揮されると考えられている。したがって、このような形態的な特徴を備えることにより、本発明の製剤は、生体における角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮することが期待される。
角膜内皮細胞はレシピエント自身または適切なドナーの角膜から常法で採取される。本発明における移植条件を考慮すれば、同種由来の角膜内皮細胞を準備すればよい。例えば、角膜組織のデスメ膜と内皮細胞層を角膜実質から剥離した後、培養皿に移し、ディスパーゼなどで処理する。これによって角膜内皮細胞はデスメ膜より脱落する。デスメ膜に残存している角膜内皮細胞はピペッティングなどによって脱落させることができる。デスメ膜を除去した後、本発明の培養液中で角膜内皮細胞を培養する。培地または培養液としては例えば市販のDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(例えば、INVITROGEN、カタログ番号:12320等を)にFBS(ウシ胎仔血清)(例えば、BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)、b−FGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)(例えば、INVITROGEN、カタログ番号:13256−029)、およびペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を適宜添加し、さらに本発明の培養正常化剤の成分を添加したものを使用することができる。本発明の因子をコーティングして培養を行うことで角膜内皮細胞の培養容器表面への接着が促され、良好な増殖が行われる。また、培養液にラミニンを添加して培養する場合は、培養皿の表面にI型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンまたはウシ等の角膜内皮細胞の細胞外マトリックスなどをコーティングしてあるものを使用することが好ましい。あるいは、通常の培養容器をFNC coating mix(登録商標)(50ml(AES−0407)、ATHENA、カタログ番号:0407)等の市販のコーティング剤で処理したものを用いてもよい。角膜内皮細胞を培養する際の温度条件は、角膜内皮細胞が生育する限りにおいて特に限定されないが、例えば約25℃〜約45℃、増殖効率を考慮すれば好ましくは約30℃〜約40℃、さらに好ましくは約37℃である。培養方法は、通常の細胞培養用インキュベーター内で、加湿下、約5〜10%のCO2濃度の環境下で行われる。
培養に供された角膜内皮細胞が増殖した後に継代培養を行うことができる。好ましくはサブコンフルエントないしコンフルエントになった時点で継代培養を行う。継代培養は次のように行うことができる。まずトリプシン−EDTA等で処理することによって細胞を培養容器表面から剥がし、次いで細胞を回収する。回収した細胞に本発明の培養正常化剤または培地を加えて細胞浮遊液とする。細胞を回収する際、あるいは回収後に遠心処理を行うことが好ましい。かかる遠心分離処理によって細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。好ましい細胞密度は、約1〜2×106個/mLである。尚、ここでの遠心分離処理の条件としては、例えば、500rpm(30g)〜1000rpm(70g)、1〜10分を挙げることができるがこれらに限定されない。
細胞浮遊液は、コラーゲンシート等の基材上に播種され、培養に供される。この際、最終的に製造される角膜内皮製剤において所望の細胞密度の細胞層が形成されるように播種する細胞数が調整される。具体的には細胞密度が約1,000〜約4,000細胞/mm2の細胞層が形成されるように細胞を播種する。培養は上記の初期培養などと同様の条件で行うことができる。培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば3〜30日間である。
本発明は、角膜内皮細胞の培養または増殖のための方法(この方法は、本発明の因子、組成物、もしくは培地または容器を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する)によって生産された角膜内皮細胞を含む、角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための医薬を提供する。本発明の因子、組成物、もしくは培地または容器は本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解され、例えば、(角膜内皮細胞の培養または増殖のための組成物)、(角膜内皮細胞を培養する方法)、(角膜内皮細胞および角膜内皮製剤)等の本明細書に記載された事項を参酌することができる。また、医薬として使用される角膜内皮細胞は、本明細書において使用される任意の形態をとり得ることが理解され、例えば、(角膜内皮細胞および角膜内皮製剤)に記載された事項を参酌することができる。
それぞれ、12個のヒトドナー角膜は、SightLifeTMアイバンクから入手し、全ての角膜を、初代培養前に14日未満の期間にわたり、保存培地(Optisol;Chiron Vision Corporation,Irvine,CA)中、4℃で保存した。
2サンプルの比較の平均値における統計的有意差(P値)は、スチューデントのt検定を用いて決定した。複数のサンプルセットの比較における統計的有意差は、ダネットの多重比較検定を用いて解析した。グラフに示す値は平均±SEを表す。
本実施例では、角膜内皮細胞の基底膜であるデスメ膜におけるラミニン鎖の発現を観察した。
ラミニン鎖mRNAの発現はPCR法にて行った。なお、データは示さないがタンパク質の発現についても免疫染色にて確認している。
PCR法にて使用したラミニン鎖のプライマーの配列は以下の表1に示す。PCR法にて使用したインテグリン鎖のプライマーの配列は以下の表2に示す。これらのプライマーはライフテクノロジーズジャパン株式会社(カタログ番号:10336022) から入手した。
・GAPDH-F:GAGTCAACGGATTTGGTCGT (配列番号85)
・GAPDH-R:TTGATTTTGGAGGGATCTCG (配列番号86)
デスメ膜(角膜内皮細胞基底膜)におけるラミニン鎖の発現をみたところ、ラミニンα5鎖、ラミニンβ1鎖、ラミニンγ1鎖、の発現が著明であり、他方、ラミニンα1鎖、ラミニンα2鎖、ラミニンα3鎖における発現は明らかでなかった(データ示さず)。
本実施例では、ラミニン等を培養容器にコーティングしたものを用いて、ヒト角膜内皮細胞の細胞接着がなされるかどうかを確認した。
・ラミニン511(株式会社ベリタス、LN511)
・ラミニン521(株式会社ベリタス、LN521)
・ラミニン511−E8フラグメント(株式会社ニッピ、382-02413)
・FNC coating mix(登録商標)(50ml(AES−0407)、ATHENA、カタログ番号:0407)
・ゼラチン(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社、G1890-500G)
・容器(CORNING、3526)
同様に各種基質でコーティングしたHCECのBrdUとり込みをELISA法により評価した。96ウェル培養プレートに、5,000個/ウェルの播種密度で播種し一晩培養した。その後、培地に5-ブロモ-2’-デオキシウリジン(BrdU)を添加し、一晩培養した。培地を除去し、固定溶液(Amersham cellproliferation biotrak ELISA system, version2)を加えて30分間室温でインキュベートした。次いで、固定溶液を除去し、ブロッキング溶液(Amersham cellproliferation biotrak ELISA system, version2)を加えて30分間、室温で静置した。次いで、ブロッキング溶液を除去し、ペルオキシダーゼ結合抗BrdU抗体を添加し、室温で90分静置した。洗浄バッファーで3回プレートを洗浄し、TMB(3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン)基質(Amersham cell proliferationbiotrak ELISA system, version2)を加えて5〜30分間静置した。1M 硫酸で反応を停止し、プレートリーダーで450nmにおける吸光度を測定した。結果は5回の測定の平均値±標準誤差として示した。
図4に示すように、ラミニン511および521の存在下では、角膜内皮細胞の接着、伸展が良好であるのに対して、それ以外の条件では、増殖が良好ではないことが示される。
本実施例では、ラミニン511および521はヒト角膜内皮細胞の細胞培養における機能付与分析を行った。
・ヒト角膜内皮細胞(HCEC、入手先および培養方法):HCECの培養は、以下のように行った。簡単に述べると、シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より、角膜内皮細胞を含むデスメ膜を剥離し、角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離して、コラゲナーゼ(ROCHE カタログ番号:10 103 586 001)を用いて基底膜よりはがして(代表的には、1mg/mLコラゲナーゼA(Roche Applied Science)を用いて37℃にて2時間処理した。)回収後、初代培養を行った。初代培養時に、ラミニン511、ラミニン521、ラミニン211、FNC Coating Mix(登録商標)でコーティングした12ウェルプレートの1ウェルにプレーティングした。培地は実施例1と同様のものを用いた。細胞観察は経時的に位相差顕微鏡にて行った。
図8に示されるように、ラミニン511および521はヒト角膜内皮細胞の細胞培養を効率化することを示す。写真は初代培養2日後の位相差顕微鏡写真である。
本実施例では、製剤例として、本発明の因子を含有する角膜内皮シート調製用培養液を以下のようにして製造する。
ラミニン511、ラミニン521および/またはそれらのフラグメント(0.75μg/cm2)
ウシ胎仔血清(FBS) 10mL
ペニシリン−ストレプトマイシン溶液 1mL
FGF basic 200ng
DMEM 適量
全量 100mL
本実施例では、製剤例として、本発明の因子を含む、容器コーティング用溶液を以下のように製造する。
ラミニン511、ラミニン521および/またはそれらのフラグメント(0.75μg/cm2)
適宜の緩衝液 適量
全量 100mL
各成分は、実施例4と同様に入手することができる。
配列番号:2 ラミニンα5鎖アミノ酸配列(NP_005551)
配列番号:3 ラミニンβ1鎖核酸配列(NM_002291)
配列番号:4 ラミニンβ1鎖アミノ酸配列(NP_002282)
配列番号:5 ラミニンβ2鎖核酸配列(NM_002292)
配列番号:6 ラミニンβ2鎖アミノ酸配列(NP_002283)
配列番号:7 ラミニンγ1鎖核酸配列(NM_002293)
配列番号:8 ラミニンγ1鎖アミノ酸配列(NP_002284)
配列番号:9 ラミニンα1鎖sense プライマー配列:5'-GAGTCCGTCTCTCTGGACATAG-3'
配列番号:10 ラミニンα1鎖アンチセンスプライマー配列:5'-CGTGGCATTCACAGGGTTGAC-3'
配列番号:11 ラミニンα2鎖sense プライマー配列:5'-TGCTAGAATTTACCTCCGCTCG-3'
配列番号:12 ラミニンα2鎖アンチセンスプライマー配列:5'-GATCAAGTGGACAAGCCCTG-3'
配列番号:13 ラミニンα3鎖sense プライマー配列:5'-CTCCAAAGGCCCAACTCAAG-3'
配列番号:14 ラミニンα3鎖アンチセンスプライマー配列:5'-CCATAACTGCCTCCTTAGTCTC-3'
配列番号:15 ラミニンα4鎖sense プライマー配列:5'-CTTACGCAACACCACCGGATTC-3'
配列番号:16 ラミニンα4鎖アンチセンスプライマー配列:5'-CCTTCTTCCAAGCATTCTCCG-3'
配列番号:17 ラミニンα5鎖sense プライマー配列:5'-GAGGACTGAAGTGAAAACTCAA-3'
配列番号:18 ラミニンα5鎖アンチセンスプライマー配列:5'-CCACTGAAGTTGTAAATGGTG-3'
配列番号:19 ラミニンβ1鎖sense プライマー配列:5'-GATGGTGAACTTGATGAAAAGT-3'
配列番号:20 ラミニンβ1鎖アンチセンスプライマー配列:5'-GGCTTATATCCTTTAGGAGTGA-3'
配列番号:21 ラミニンβ2鎖sense プライマー配列:5'-GATGATCGCATCCAAGGGAC-3'
配列番号:22 ラミニンβ2鎖アンチセンスプライマー配列:5'-GTCCAGAGTAGGGAGTCTCAG-3'
配列番号:23 ラミニンβ3鎖sense プライマー配列:5'-CCCAGATGGAGGAAGATGTC-3'
配列番号:24 ラミニンβ3鎖アンチセンスプライマー配列:5'-GTAGCTGAGTCTGTGGGCAG-3'
配列番号:25 ラミニンβ4鎖sense プライマー配列:5'-GGCAGGCTACTTTGGATTTC-3'
配列番号:26 ラミニンβ4鎖アンチセンスプライマー配列:5'-GCTTGAGGGATCATCTGGAC-3'
配列番号:27 ラミニンγ1鎖sense プライマー配列:5'-GATGAGATGGTGACAGATCAAG-3'
配列番号:28 ラミニンγ1鎖アンチセンスプライマー配列:5'-TTTCCAGTCTCTTCAATGGTAT-3'
配列番号:29 ラミニンγ2鎖sense プライマー配列:5'-ATCGAAGGTTACTGCGGAATC-3'
配列番号:30 ラミニンγ2鎖アンチセンスプライマー配列:5'-GTAGCCAGAAGCACAATCCTG-3'
配列番号:31 ラミニンγ3鎖sense プライマー配列:5'-GGGATACAAGAGGGAGATGC-3'
配列番号:32 ラミニンγ3鎖アンチセンスプライマー配列:5'-CATAGAAACCTGGCAAACAGC-3'
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配列番号:37 インテグリン α3鎖sense プライマー配列:5'-gctctgcctttggtttatctgt-3'
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配列番号:39 インテグリン α4鎖sense プライマー配列:5'-atattcagtcggagctggtcat-3'
配列番号:40 インテグリン α4鎖アンチセンスプライマー配列:5'-gcatatttgtcacttccaacga-3'
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配列番号:79 インテグリン β6鎖sense プライマー配列:5'-tgtgactgtggtgaatgtgtgt-3'
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配列番号:85 GAPDH-F: GAGTCAACGGATTTGGTCGT
配列番号:86 GAPDH-R: TTGATTTTGGAGGGATCTCG
Claims (10)
- 角膜内皮細胞において発現するラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子を含む、角膜内皮細胞の培養または増殖のための組成物。
- 前記ラミニンは、ラミニン511(α5β1γ1)およびラミニン521(α5β2γ1)を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記フラグメントは、角膜内皮細胞の細胞接着能を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記因子は、ラミニン511、ラミニン521またはラミニン511−E8フラグメントである、請求項1に記載の組成物。
- 前記角膜内皮細胞はヒトのものである、請求項1に記載の組成物。
- 請求項1に記載の組成物を含む、角膜内皮細胞の培養用培地。
- 請求項1に記載の組成物をコーティングした角膜内皮細胞の培養容器。
- 請求項1に記載の組成物を用いる工程を包含する、角膜内皮細胞の培養方法。
- 請求項6に記載の培地を用いる工程を包含する、角膜内皮細胞の培養方法。
- 請求項7に記載の培養容器を用いる工程を包含する、角膜内皮細胞の培養方法。
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