CN112522179A - 一种角膜内皮细胞的分离培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞的分离培养领域，本发明提供了一种角膜内皮细胞的分离培养方法。本发明提供的角膜内皮细胞的分离培养方法，采用胶原酶A和Liberase酶的混合酶对角膜进行消化，之后采用物理的方法分离角膜内皮层，以分离的角膜内皮层细胞为种子细胞进行原代培养和传代培养，获得角膜内皮细胞。该方法获得的角膜内皮细胞纯度较高，形态典型，未出现间质化现象，且细胞扩增能力强，细胞产量高。

Description

一种角膜内皮细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及细胞的分离培养的技术领域，尤其涉及一种角膜内皮细胞的分离培养方法。
背景技术
角膜内皮细胞(corneal endothelial cells，CECs)是位于角膜后表面的单层细胞，它通过物理屏障作用和主动液泵功能对维持角膜的半脱水状态、正常厚度及透明性起着关键性作用。然而人源角膜内皮细胞(human corneal endothelial cells,HCECs)属于终末细胞，在体内条件下仅具有极为有限的增殖能力。当HCECs数量受到年龄、疾病、眼内手术等因素的影响下降到其生理临界值以下时，便可导致角膜水肿，发生角膜盲。角膜盲是导致失明的第二大原因，仅次于白内障，角膜移植术是目前让角膜盲患者复明的唯一手术方式。尽管目前角膜移植手术技术已非常成熟，但由于供体角膜匮乏，仅1.3％患者可以得到有效治疗，且每年只有约5000例患者能够通过角膜移植来恢复视力或保留眼球，供体角膜不足限制了角膜内皮层移植的开展。因此，为满足广大患者的需求，亟需解决供体来源匮乏的问题，组织工程化角膜内皮细胞以及新型角膜内皮细胞注射液药物为解决眼科发展面临的问题提供了丰富的材料来源和崭新的解决思路。
体外培养HCECs首先要提取种子细胞，即角膜内皮细胞。目前从角膜中获取角膜内皮细胞的方法主要包括机械刮除法、组织贴块法、揭膜法、揭膜-消化两步法。最常用的方法是揭膜-消化两步法，即在显微镜下从角膜周边到中央部完整撕除后弹力层和角膜内皮层，然后利用胶原酶A、DispaseⅡ等进行消化，在显微镜下观察到细胞变圆、间隙变大时加入血清终止消化，经过漂洗、离心后获得种子细胞进行接种培养。该法优点是效率较高，缺点是揭膜时需要熟练的操作技巧，且可能会有角膜基质细胞混入。但是该方法针对的是正常直径大小，厚度适宜、粘连不是太紧的角膜组织，而对于那些直径较小，特别薄或粘连很紧的样本，则后弹力层很难揭下，甚至可能出现部分撕裂，因此难以采用揭膜-消化两步法。目前针对这些样本只能采用组织贴块法，但是该方式获得的细胞纯度较差，容易有其他细胞污染，除此之外尚无更好的分离方式分离这些样本。
目前对于正常角膜组织常用的角膜内皮细胞消化酶有胶原酶A(Collagenase)和DispaseⅡ。胶原酶A通过水解细胞间质的脯氨酸，从而使细胞离散。胶原酶A对胶原的消化作用很强，它仅对细胞间质有消化作用而对细胞损害不大，因此适于消化分离纤维性组织和较硬的癌组织。钙镁离子和血清不会对胶原酶A的活性及消化作用产生影响。DispaseⅡ，中文名称为中性蛋白酶，又称分散酶，是一种非特异性的金属蛋白酶，被用来从各种不同组织或器官中消化细胞外基质，释放并制备原代单细胞；或用于细胞培养中的细胞收获或接种转移；也被用于防止悬浮细胞培养时的细胞意外结团。此外有文献报道Liberase酶对组织也有很好的分离效果，其是一系列高度纯化酶的混合物，可提高组织解离的质量和可重复性，并提高分离细胞的活力和功能性，但是并没有报道Liberase酶消化角膜组织的应用和方法。这些酶虽然对正常角膜组织或非角膜组织都有很好的消化分离效果，但是在消化那些直径较小、厚度薄、粘连很紧的特殊角膜样本时，却没有取得较好的效果。申请人通过试验发现：胶原酶A处理特殊角膜样本时，会同时消化掉基质层，造成基质污染；DispaseⅡ酶处理时根本不能对角膜内皮层进行分离；Liberase酶虽然不会造成基质污染，但是难以分离。
发明内容
针对上述提到的特殊角膜样本，本发明提供了一种的角膜内皮细胞的分离培养方法。该方法采用混合酶对角膜进行消化，之后采用物理的方法分离角膜内皮层，以分离的角膜内皮层细胞为种子细胞进行原代培养和传代培养，获得角膜内皮细胞。具体技术方案如下：
本发明提供了一种角膜内皮细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
(1)用胶原酶A和Liberase酶的混合酶对角膜进行消化，然后分离得到角膜内皮层；
(2)将所述角膜内皮层接种到增殖培养基中，形成原代细胞，待原代细胞融合达到80％以上时，进行传代培养；
(3)当最后一次传代培养的细胞培养至细胞融合达到80％以上，将增殖培养基更换为维持培养基，培养7～10d，获得角膜内皮细胞。
优选的，所述角膜的直径为1～3mm。
优选的，所述角膜与混合酶的消化比例为1个:150～250微升。
优选的，所述胶原酶A的浓度为1.5～2.5mg/mL，所述Liberase酶的浓度为0.4～0.6mg/mL；所述混合液中胶原酶A和Liberase酶的体积比为10:1～1:1。
优选的，步骤(1)中所述消化的条件为：36～37℃消化20～40min。
优选的，步骤(2)中所述角膜内皮层与增殖培养基的接种量为1个：0.8～1.2mL。
优选的，所述传代培养的方法为：将消化的原代细胞接种到增殖培养基中进行第一次传代培养，待第一次传代培养的细胞融合达到80％以上时，消化后进行第二次传代培养，以此类推至传代到P3代。P3代细胞除了用增殖培养基培养只细胞融合外，还要经过维持培养基培养至少7～10d，以获得成熟的角膜内皮细胞。
优选的，所述传代培养的细胞接种密度为4500～5500个/cm2。
优选的，所述传代培养的次数为2～4次。
本发明提供的角膜内皮细胞的分离培养方法，适用性强，无论对于正常的角膜还是针对直径较小(1～3mm)、厚度薄、粘连紧的角膜均可以应用。该方法获得的角膜内皮细胞纯度较高，形态典型，未出现间质化现象，且细胞扩增能力强，细胞产量高。本发明提供的角膜内皮细胞的分离培养方法，为治疗角膜盲等内皮细胞疾病提供了有效途径。
附图说明
图1为实施例1中5:1组混合酶消化后撕下的角膜内皮层的形态；
图2为实施例1中5:1组培养的原代角膜内皮细胞的形态；
图3为实施例1中5:1组培养的角膜内皮细胞形态；
图4为实施例2中5:1组收获的角膜内皮细胞的荧光染色结果；
图5为本发明分离培养的角膜内皮细胞的产量计算结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例中采用的增殖培养基和维持培养基按下表配方进行配置：
表1增殖培养基配方
组分 含量
HamF12基础培养基 46mL
M199基础培养基 46mL
Insulin Transferrin Selenium(ITS) 1mL
抗坏血酸(ascorbic acid) 1mL
SB431542 1μM
Y27632 10μM
胎牛血清(FBS) 5mL
表2维持培养基配方
组分 含量
Opti MEM基本培养基 49mL
胎牛血清(FBS) 1mL
胶原酶A和Liberase酶母液配制：用5mL DPBS(-)溶解100mg的胶原酶A，用2mLDPBS(-)溶解10mg Liberase，分别使用0.22μm孔径的过滤器过滤除菌，然后分装到1.5mLEP管中，每支100微升，即为10×的母液。然后分别取一支，使用DPBS(-)进行10倍稀释，获得浓度为2mg/mL的胶原酶A工作液和0.5mg/mL的Liberase酶工作液。
本实施例在用2mg/mL的胶原酶A和0.5mg/mL的Liberase酶的混合酶对角膜进行消化时，使用了三种不同体积比的混合酶，分别为10:1、5:1和1:1。
将直径在1～3mm之间的3个角膜分别置于35mm的培养皿上，均是角膜内皮层朝上，使用胰岛素针向三个角膜中分别加入200μL的体积比为10:1、5:1和1:1的胶原酶A和Liberase酶的混合酶。然后置于37℃培养箱中进行消化，在体式显微镜下观察到角膜内皮层卷起，即加入DPBS缓冲液终止消化。然后在体式显微镜下分离角膜内皮层。
经过观察发现，10:1组消化20min，可以看到角膜内皮层卷起，容易分离，但会有极少量的基质细胞污染，造成边缘比较粘；1:1组消化时间较长需要40min，角膜内皮层卷起比较明显，比较容易分离，且对基质细胞基本没有消化作用，获得的细胞纯度较高；最优的是5:1组，该组消化的角膜内皮层细胞卷起最明显，分离效果最好，分离培养的细胞纯度最高，且消化时间较短为20min，分离后揭下的角膜内皮层见图1。
将分离的角膜内皮层转移到5mL增殖培养基中，然后1500rpm离心5min，弃上清，将沉淀用1mL增殖培养基重悬，之后接种到Cell-start(基质胶)预包被的12孔板中，每组接种一孔，分别标记为10:1组、5:1组和1:1组，培养10d，每2d换液一次。每天观察各组细胞形态，并进行拍照，图2为5:1组培养的原代细胞形态。
当原代细胞达到100％细胞融合后，进行传代培养。在12孔板中，每孔加入0.5mLAccutase酶(1×)消化原代细胞10min，然后1500rpm离心5min，弃上清，将沉淀用增殖培养基重悬，然后按照5000个细胞/cm2的接种密度接种到Cell-start(基质胶)预包被的T25培养瓶中，进行第一次传代培养，待第一次传代培养的细胞融合达到100％时，按照上述步骤进行第二次传代培养；以此类推，传代培养至第三代(P3代)。当P3代细胞融合达到100％时，倒掉T25瓶中的增殖培养基更换为维持培养基，继续培养10d，可以获得典型形态的角膜内皮细胞，如图3所示。对获得的角膜内皮细胞进行免疫荧光染色实验，染色结果如图4所示。图4表明本发明培养的角膜内皮细胞表达典型的角膜3内皮细胞标志物：ZO-1、N-cad、Na-KATPase。
本实施例还对角膜内皮细胞的产量进行了计算。一个样本(包括两个角膜)经分离培养，收获的原代角膜内皮细胞的数量介于20万到30万之间，后续每代按照5000个/cm2的密度进行接种，传代培养至细胞融合(100％)，计算角膜内皮细胞收获量可以扩增10倍；以此类推，传代到P3代能够收获的角膜内皮细胞的数量可以达到2亿～3亿个，如图5所示。按照一个病人需要100万个细胞计算，一个样本可以满足200个病人的需求，大大高于目前培养至P3代细胞的收获量(2000～3000万个)。
由以上实施例可知，本发明针对直径较小(1～3mm)、厚度薄、粘连紧的特殊角膜提供了一种角膜内皮细胞的分离培养方法，该方法获得的角膜内皮细胞纯度较高，形态典型，且细胞扩增能力强，细胞产量高，解决了角膜内皮细胞供体资源匮乏的问题。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用胶原酶A和Liberase酶的混合酶对角膜进行消化，然后分离得到角膜内皮层；
(2)将所述角膜内皮层接种到增殖培养基中，形成原代细胞，待原代细胞融合达到80％以上时，进行传代培养；
(3)当最后一次传代培养的细胞培养至细胞融合达到80％以上，将增殖培养基更换为维持培养基，培养7～10d，获得角膜内皮细胞。
2.如权利要求1所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述角膜的直径为1～3mm。
3.如权利要求1所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述角膜与混合酶的消化比例为1个:150～250微升。
4.如权利要求1或3所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述胶原酶A的浓度为1.5～2.5mg/mL，所述Liberase酶的浓度为0.4～0.6mg/mL；所述混合酶中胶原酶A和Liberase酶的体积比为10:1～1:1。
5.如权利要求1所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述消化的条件为：36～37℃消化20～40min。
6.如权利要求1所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述角膜内皮层与增殖培养基的接种量为1个:0.8～1.2mL。
7.如权利要求1所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述传代培养的方法为：将消化的原代细胞接种到增殖培养基中进行第一次传代培养，待第一次传代培养的细胞融合达到80％以上时，消化后进行第二次传代培养，以此类推至传代培养结束。
8.如权利要求1或7所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述传代培养的细胞接种密度为4500～5500个/cm2。
9.如权利要求1或7所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述传代培养的次数为2～4次。
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