RU2764077C1

RU2764077C1 - Способ выделения фибробластов из стромы роговицы

Info

Publication number: RU2764077C1
Application number: RU2021115802A
Authority: RU
Inventors: Валерий Вячеславович Черных; Мария Александровна Суровцева; Кристина Юрьевна Краснер; Ольга Владимировна Повещенко; Александр Николаевич Трунов; Ренат Шагитович Садрутдинов
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2022-01-13

Abstract

Изобретение относится к клеточной биологии и медицине, в частности к способу выделения фибробластов из стромы роговицы. Для осуществления способа используют стромальные лентикулы, полученные при лазерной коррекции зрения. Измельченные лентикулы обрабатывают 0,05-0,1%-ным раствором коллагеназы I типа, с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS) при 37°С в течение 18-20 часов. Затем из клеточной взвеси осаждают дебрис центрифугированием, собирают надосадок, осаждают из него клетки центрифугированием, клетки отмывают два раза буферным раствором. После чего осадок клеток ресуспендируют в среде DMEM/F12 и культивируют в среде DMEM/F12 с добавлением 10% FCS, 2 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина. Далее клетки культивируют при 37°С и 5% СO₂ до достижения необходимого пассажа клеток. Настоящее изобретение позволяет упростить способ получения клеток и повысить качество целевого продукта. 1 з.п. ф-лы, 2 пр.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, конкретнее к технологии получения клеток из роговицы глаза.

Клетки, выращенные in vitro, способны при культивировании в соответствующих условиях сохранять свои физиологические функции и могут использоваться при замещении, восстановлении, корректировке функций поврежденных тканей (в том числе стромальной ткани роговицы) или в косметических целях для омоложения или улучшения состояния кожи.

Строение стромы роговицы уникально, лишь на 3-5% она имеет клеточный состав и строгую пространственную ориентированность коллагеновых ламеллей. Это позволяет роговице поддерживать прозрачность, выполнять светопроводящую, светопреломляющую и защитно-опорную функции. Именно поэтому возрастает интерес к тканевой инженерии в офтальмологии, поскольку актуальными являются дефицит донорского материала и возможные осложнения, связанные с трансплантацией аллогенного клеточного заместителя, либо кератопротезов.

В патогенезе многих патологических изменений роговицы, таких как постожоговые, посттравматические, дистрофические и эктатические состояния (в том числе, кератоконус), особая роль отводится потере кератоцитов (снижение плотности клеток на единицу площади).

Кератоцит является митотически покоящейся мезенхимальной клеткой нервного гребня. Роль кератоцитов заключается в поддержании внеклеточного матрикса и постоянства окружающей среды, осуществлении фагоцитоза коллагеновых фибрилл, синтеза коллагена, гликозаминогликанов, коллагеназы, ростовых факторов и цитокинов, ингибиторов металлопротеиназ. При культивировании клеток стромы роговицы в присутствии сыворотки кератоциты приобретают фенотип фибробластов, что является физиологическим обратимым переходом для активации митотического цикла и возможности осуществления активного терапевтического эффекта.

Перспективной задачей клеточной терапии роговицы является получение «здоровой» однородной популяции клеток с целью восполнения утраченной толщины, продуцировании нового коллагена, создании «здорового клеточного микроокружения» в строме эктатической и поврежденной роговицы.

Известен способ выделения фибробластов для заместительной терапии, заключающийся в том, что фибробласты выделяют из биоптатов кожи человека путем ферментативной обработки раствором 0,2% диспазы/ 0,1 мг/мл коллагеназы I в среде DMEM с добавлением 5% ЭБС (эмбриональной телячьей сыворотки) при температуре 37°С в течение 1,5 ч в стерильных условиях, полученную суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 200 g, супернатант сливают, осевшие клетки ресуспендируют в среде DMEM с добавлением 10% ЭБС, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 100 ед/мл фунгизона и высевают на чашки, затем фибробласты переводят на длительное культивирование в среде с собственной сывороткой крови пациента: DMEM/10% ССКП, 100 ед/мл стрептомицина, 100 ед/мл фунгизона или в терапевтической среде AIM-V, перед введением пациентам клетки несколько раз отмывают в буфере Krebs-Ring, обрабатывают раствором 0,25%) трипсина/0,02%) ЭДТА для снятия клеток с подложки, добавляют 1 мл Krebs-Ringer, центрифугируют 5 мин при 200 g, супернатант сливают, клетки ресуспендируют в новой порции раствора Krebs-Ringer для введения пациентам. При этом, культивированные фибробласты дополнительно обрабатывают добавлением rhTGF-β1 в концентрации 5 нг/мл в среду культивирования (патент RU 2320720 С2, опубл. 27.03.2008).

Недостатками способа являются длительность и высокая стоимость целевого продукта из-за использования дорогостоящих импортных реактивов.

Известен способ получения трансплантата для лечения лимбальной недостаточности, включающий механическую очистку аллогенной склеры, ее замачивание в 6% растворе перекиси водорода и выдерживание 4 часа, затем промывание стерильной дистиллированной водой и замораживание при температуре -20°С в течение 2 часа. Затем после дефростации замачивают в водном растворе гидроксида аммония 10% на 2 часа при температуре 40°С. Далее отмывают стерильным физиологическим раствором, замачивают в 6% растворе перекиси водорода и выдерживают 6 часов. Далее промывают стерильным физиологическим раствором, разделяют на фрагменты шириной 2 мм и длиной 4 мм и вымачивают в физиологическом растворе в течение 20 минут. Фрагменты помещают в культуральные планшеты с 10 мл питательной среды DMEM/F12 с добавлением 15% эмбриональной сыворотки и добавляют 1 мл концентрированной клеточной суспензии ММСК и прогениторных клеток эпителия роговицы (0,5-0,6×10⁶ клеток /мл) и инкубируют в течение 5 суток (патент RU 2720470 С1, опубл. 30.04.2020).

Недостатками способа являются длительность и трудоемкость.

В настоящее время существует несколько способов выделения фибробластов роговицы, которые включают в себя механическую и длительную ферментативную дезагрегацию роговицы. Обычно для выделения клеток используют кадаверные и/или не пригодные для трансплантации роговицы человека.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ выделения клеток из роговицы, заключающийся в следующем. Из роговицы вырезают центральную часть, инкубируют в 0,2% трипсине в смеси 1:1 с DMEM/F-12, содержащий антибиотики (пенициллин, 100 единиц/мл; стрептомицин, 100 мг/мл; гентамицин, 50 мг/мл; амфотерицин В, 2,5 мг/мл) в течение 16 часов при 4°С, затем 30 минут при 37°С. На следующем этапе работы удаляют эпителиальные и эндотелиальные клетки роговицы соскабливанием пластиковым шпателем в холодном физиологическом растворе. Ткань промывают, измельчают бритвенным лезвием на кусочки размером 2-3 мм и встряхивают при 37°С, 70 об/мин в течение 2-3 часов в объеме 1 мл/стромы роговицы с 1% (мас./об.) раствором коллагеназы I типа в DMEM/F-12 с антибиотиками до полного разрушения ткани. Полученную суспензию клеток пропускают через нейлоновый сетчатый фильтр диаметром 70 мм, дважды промывают центрифугированием в среде DMEM/F-12 и высевают в матрасы для культивирования клеток в ростовой среде DMEM/F-12, с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FCS) и культивируют до достижения необходимого пассажа клеток [Chad J. Long, et al. Fibroblast Growth Factor-2 Promotes Keratan Sulfate Proteoglycan Expression by Keratocytes in Vitro. The J. of Biological Chemistry 2000,Vol. 275, No. 18, pp. 13918-13923].

Недостатками известного способа являются трудоемкость и недостаточная чистота целевого продукта, поскольку в результате получают смесь из клеток, содержащую неоднородную популяцию фибробластов из передних, средних и задних отделов стромы, а также примесь эпителиальных и эндотелиальных клеток соответствующих слоев роговицы.

Задачей изобретения является упрощение способа, а также получение «чистой» клеточной популяции передне-среднего отдела стромы роговицы in vitro.

Технический результат: упрощение способа и повышение качества целевого продукта за счет исключения побочных примесей клеток.

Поставленная задача достигается заявляемым способом, заключающимся в следующем.

Фибробласты роговицы выделяют ферментативным методом из стромальных лентикул, полученных при лазерной коррекции зрения методом ReLEx SMILe. Лентикулы промывают фосфатно-солевым буферным раствором (ЗФР), измельчают на кусочки размером 2-3 мм. Кусочки лентикул обрабатывают 0,05-0,1% раствором коллагеназы I типа, с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (FCS) при 37°С в течение 18-20 ч. Затем из клеточной взвеси осаждают дебрис центрифугированием при 1500 об/мин, в течение 30 сек. Собирают надосадок и осаждают из него клетки центрифугированием при 1500 об/мин, в течение 5-7 мин. Клетки отмывают два раза ЗФР, центрифугируя 10 мин при 1500 об/мин. Затем осадок клеток ресуспендируют в 1 мл среды DMEM/F12 и подсчитывали количество и жизнеспособность клеток в камере Горяева. Количество выделенных клеток из двух лентикул составило 30930±9854 клетки, жизнеспособность 98%-100%. После подсчета, клетки высаживали в 24-луночный планшет в культуральной среде DMEM/F12 с добавлением 10% FCS, 2 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина. Далее клетки культивируют при 37°С и 5% CO₂. до достижения необходимого пассажа клеток, обновляя культуральную среду каждые 3-4 дня. При пересеве клетки снимали с использованием смеси 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-го раствора ЭДТА.

Аутологичный стромальный материал лентикул роговиц позволяет получить «чистую» клеточную популяцию для трансплантирования с регенеративной целью при патологических состояниях стромы роговицы без последующей иммунной реакции «хозяин против трансплантата».

Предлагаемый способ позволяет упростить процесс выделения клеток фибробластов за счет сокращения сроков ферментативной обработки и исключения этапа механической обработки роговицы (удаление эпителиального и эндотелиального слоев роговицы), а также обеспечить качество целевого продукта за счет исключения побочных примесей клеток.

Определяющими отличиями предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1) Фибробласты роговицы выделяют из стромальных лентикул in vitro, полученных при лазерной коррекции зрения, что позволяет получить однородную клеточную популяцию. В известных способах фибробласты выделяют из цельной роговицы, поэтому полученная культура клеток на начальных этапах культивирования может содержать примесь эпителиальных и эндотелиальных клеток. Кроме этого, лентикулы являются более доступным биологическим материалом, по сравнению с кадаверными роговицами.

2) Лентикулы обрабатывают 0,05-0,1% раствором коллагеназы типа I, с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (FCS) при 37°С в течение 18-20 часов, что позволяет сократить длительность способа, за счет сокращения сроков ферментативной обработки лентикул, которые намного тоньше цельной нативной роговицы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1

Фибробласты роговицы выделяли из лентикул роговицы, полученных на заданной глубине роговицы - 120 микрон, при лазерной коррекции зрения методом ReLEx SMILe. Для этого, лентикулы, в количестве 2 штуки от каждого пациента, диаметром 6-6,5 мм, толщиной -120 мкм сразу после извлечения из глаза помещали в 2 мл ростовой среды DMEM/F12 и транспортировали в лабораторию на холоду. В лаборатории лентикулы промывали ЗФР (содержащим хлорид натрия, гидрофосфат натрия, хлорид калия и дигидрофосфат калия), измельчали ножницами на кусочки размером 2-3 мм. Кусочки лентикул обрабатывали 0,05%-м раствором коллагеназы {Clostridium histolyticum, тип I, «Sigma-Aldrich», США) с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (FCS, HyClone, «Thermo FisherScientific», США) при 37°С в течение 18 ч. Затем из клеточной взвеси цетрифугированием осаждали дебрис при 1500 об/мин, 30 сек. Собирали надосадок и осаждали из него клетки центрифугированием при 1500 об/мин, 5-7 мин. Клетки отмывали два раза ЗФР (1500 об/мин, 10 мин), ресуспендировали в 1 мл среды DMEM/F12 и подсчитывали количество и жизнеспособность клеток в камере Горяева. Количество выделенных клеток из двух лентикул составило 10263 клетки, жизнеспособность - 98%. После подсчета клетки высаживали в 24-луночный планшет в культуральной среде DMEM/F12 (Dullbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient F12 Ham, Gibco, «ThermoFisher Scientific)), США) с добавлением 10% FCS (HyClone, США), 2 мМ L-глютамина («Биолот», Санкт-Петербург), 40 мкг/мл гентамицина («Дальхимфарм», Хабаровск). Клетки культивировали при 37°С и 5% СО₂. Первые сутки культура представляла собой адгезированные к поверхности пластика клетки, округлой формы, одинакового размера. К 3 дню культивирования клетки приобретали морфологию фибробластоподобных клеток, имели вид вытянутых, веретеновидных клеток, адгезированных к поверхности культурального пластика, пролиферирующих с образованием колоний. Прилипающую фракцию культивировали до получения конфлюэнтного слоя в полной ростовой среде, которую обновляли каждые 3-4 дня. При пересеве клетки снимали с использованием смеси 0,25% -го раствора трипсина и 0,02%-го раствора ЭДТА («Биолот», Санкт-Петербург). Пассаж клеток №3, который использовали для морфофункциональной характеристики клеток, был получен через 21 день от момента выделения клеток из лентикул.

Пример 2

Фибробласты роговицы выделяли из лентикул роговицы, полученных при лазерной коррекции зрения методом ReLEx SMILe аналогично примеру 1, за исключением того, что ферментативную обработку кусочков лентикул осуществляли 0,1% раствором коллагеназы типа I, с добавлением 2% FCS при 37°С в течение 20 часов. Количество выделенных клеток из двух лентикул составило 38125 клетки, жизнеспособность - 100%. Первые сутки культура представляла собой адгезированные к поверхности пластика клетки, округлой формы, одинакового размера. К 4 дню культивирования клетки приобретали морфологию фибробластоподобных клеток, имели вид вытянутых, веретеновидных клеток, адгезированных к поверхности культурального пластика, пролиферирующих с образованием колоний. По достижению конфлюентности клетки закрывали поверхность пластика на 90% монослоем. Пассаж клеток № 3, который использовали для морфофункциональной характеристики, был получен через 18 дней от момента выделения клеток из лентикул.

Предлагаемый способ позволяет получать однородную клеточную популяцию фибробластов для трансплантации с регенеративной целью при патологических состояниях стромы роговицы без последующей иммунной реакции «хозяин против трансплантата».

Claims

1. Способ выделения фибробластов из стромы роговицы, включающий промывание исходной ткани роговицы, измельчение, обработку раствором коллагеназы I типа, с последующим центрифугированием полученной суспензии клеток и культивированием выделенных клеток в питательной среде, отличающийся тем, что для выделения фибробластов используют стромальные лентикулы, полученные при лазерной коррекции зрения, измельченные лентикулы обрабатывают 0,05-0,1% раствором коллагеназы I типа, с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (FCS) при 37°С в течение 18-20 часов, затем из клеточной взвеси осаждают дебрис центрифугированием, собирают надосадок, осаждают из него клетки, отмывают клетки два раза фосфатно-солевым буферным раствором, затем осадок клеток ресуспендируют в среде DMEM/F12 и культивируют в среде DMEM/F12 с добавлением 10% FCS, 2 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина, далее клетки культивируют при 37°С и 5% CO₂ до достижения необходимого пассажа клеток, обновляя культуральную среду каждые 3-4 дня.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетки осаждают центрифугированием при 1500 об/мин.