CN117778321A - 利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增 - Google Patents
利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117778321A CN117778321A CN202311831446.4A CN202311831446A CN117778321A CN 117778321 A CN117778321 A CN 117778321A CN 202311831446 A CN202311831446 A CN 202311831446A CN 117778321 A CN117778321 A CN 117778321A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- corneal
- primary
- supernatant
- human
- cornea
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 26
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 52
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 101000922131 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase CSK Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 23
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 37
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 claims description 30
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 28
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 102000055892 human CSK Human genes 0.000 claims description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 9
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 8
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 8
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 8
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 claims description 6
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 5
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 claims description 5
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 5
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims description 5
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 claims description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 4
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 claims description 4
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 3
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 claims 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 7
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 208000021921 corneal disease Diseases 0.000 abstract 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 abstract 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 abstract 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 24
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 7
- 210000003239 corneal fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102100026605 Aldehyde dehydrogenase, dimeric NADP-preferring Human genes 0.000 description 3
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 3
- 101000717964 Homo sapiens Aldehyde dehydrogenase, dimeric NADP-preferring Proteins 0.000 description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102100040069 Aldehyde dehydrogenase 1A1 Human genes 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 101000890570 Homo sapiens Aldehyde dehydrogenase 1A1 Proteins 0.000 description 2
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 229940091258 selenium supplement Drugs 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 1
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 208000006069 Corneal Opacity Diseases 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 229920000288 Keratan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 102100021497 Keratocan Human genes 0.000 description 1
- 101710153980 Keratocan Proteins 0.000 description 1
- 102000011681 Lumican Human genes 0.000 description 1
- 108010076371 Lumican Proteins 0.000 description 1
- 102000027307 Mimecan Human genes 0.000 description 1
- 108091013859 Mimecan Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 210000000399 corneal endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003683 corneal stroma Anatomy 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- -1 duodenal-C Proteins 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N keratan Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H](O)[C@@H]3O)O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]2O)COS(O)(=O)=O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种利用小切口透镜取出术手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞分离和扩增的新方法。角膜移植手术是治疗角膜疾病的主要方法，但角膜供体严重匮乏、供应不足导致许多患者等待手术机会。因此，寻找新的角膜来源成为必要的，细胞治疗和组织工程策略有望成为治疗替代方法。角膜基质细胞是角膜中重要的细胞类型，但其体外培养和扩增具有挑战性。本发明利用SMILE手术中本会丢弃的透镜作为CSKs来源，通过在特定组分中分离细胞、特定细胞培养基中传代培养，成功实现了CSKs的扩大化培养。该方法有望解决角膜组织来源不足的问题，具有应用于角膜组织工程和细胞治疗的巨大潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法。
背景技术
角膜是眼球前部的透明组织，对保持眼球形状和聚焦光线至关重要。角膜由五个层次的结构组成，其中基质层占据了角膜厚度的90％。角膜基质由胶原和角膜基质细胞(CSKs)组成，形成类似于胶原基质的网状结构。这种结构提供支持给角膜上皮细胞和角膜内皮细胞，同时维持角膜的透明性和形状。角膜受到感染、瘢痕、黄斑变性等问题的影响时，可能导致角膜盲，全球约有4000万人受到这些问题的困扰，成为全球卫生挑战。角膜移植是目前角膜盲主要的治疗方法，但依赖于人眼捐赠，角膜严重供应不足。此外，随着社会老龄化加剧，年龄相关的角膜失明患者数量也在增加，许多患者需要等待数年才能获得手术机会。因此，寻找新的角膜来源变得非常必要。
细胞治疗和组织工程策略成为有希望的治疗替代方法。最近的研究表明，通过向角膜注射CSKs，可以进行基质细胞治疗，促进角膜内功能性基质细胞的再生，从而治疗角膜混浊。CSKs是角膜中非常重要的细胞类型，具有独特的特征。生理状态下的CSK呈现为静止细胞和树突状细胞。它们通常表达分化簇34(CD34)、基质晶体蛋白(ALDH3A1)和硫酸角质素蛋白聚糖(KSPG)，包括lumican、keratocan和mimecan等，这些蛋白有助于维持角膜的透明性。因此，在体外扩增CSKs可以增加其数量，实现“一位供体供多位受体”的策略，从而大大增加人角膜供体库的规模，有望解决当前由于供体角膜短缺而无法进行角膜移植的问题。
然而，CSKs通常处于静止状态，这使得体外培养和扩增具有挑战性。为了获得大量用于组织工程或细胞治疗的CSKs，通常需要从角膜基质组织中分离原始细胞，并在胎牛血清(FBS)的存在下进行培养。然而，这种培养条件会导致CSKs分化为基质成纤维细胞(Stromal fibroblasts，SFs)。SFs失去了CSKs的表型特征，并且具备增殖和迁移的能力。此外，SFs表现出应激蛋白和纤维化相关的特征，以及修复型细胞外基质(ExtracellularMatrix，ECM)蛋白的上调，如纤维连接蛋白、十二指肠蛋白-C和III型胶原。这些改变会影响角膜的透明度。尽管在体外无血清条件下，SFs可以向CSKs转化，并且可以部分恢复CSKs的表型特征，但是在许多转化实例中，CSKs常常会失去树突状形态，并且细胞会呈细长的成纤维细胞状。CSKs的这些缺陷限制了其体外扩增作为供体角膜的潜力。
到本发明出现前，现有的技术方法在培养人CSKs不容易保持CSKs的特性，易分化为SFs，从而限制了扩大培养以用于储存和备用目的的能力。基于此，本申请提供了利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法。
发明内容
为了克服既有方法的缺陷，本发明提供了一种利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增方法，也为其在角膜组织工程和细胞治疗中的潜在应用提供可能性。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，步骤包括：
(1)提取并培养人原代CSKs：将角膜透镜浸于青霉素-链霉素的平衡盐溶液中冲洗消毒，置于倒置显微镜下，将透镜剪成组织块后移到培养皿中，使组织块完全侵泡于裂解液中后，将组织块和裂解液收集至离心管中，离心弃除上清；加入PBS重悬后离心弃除上清；将组织块和分离出的细胞收集到培养皿中，培养后离心去除裂解液，用CSK完整培养基重悬并加入培养皿中培养；
(2)原代人CSKs传代方法：吸出培养基，用PBS清洗两次；加入细胞解离试剂，室温孵育；加入PBS收集离心弃上清；加入PBS重悬离心弃上清后培养，每2-3天更换一次CSK完整培养基。
进一步地，所述所述CSK完整培养基成分为：在低糖DMEM/F-12培养基基础上添加胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、非必需氨基酸溶液、维生素溶液、青链霉素、氨基酸溶液、IGF-1、Y-27632、L-ascorbic 2-phosphate、羊膜上清液、热灭活FBS、视黄酸。
进一步地，所述羊膜上清液是通过以下方法制备得到的：将冷冻羊膜解冻，在冰上用PBS冲洗羊膜3-5次，以去除血液或甘油；用无菌镊子向下挤压羊膜排出PBS；；将羊膜放入的细胞培养皿中，用剪刀剪成组织块；向研钵和研杵中加入液氮，使其冷却；将羊膜放入冷却的研钵中，加入液氮；将冷却后的羊膜片用研杵磨成粉末状；称量羊膜粉末使得每克羊膜粉末加入3ml PBS；旋转器旋转后过滤；取上清液离心，收集干净的上清保存即得羊膜上清液。
进一步地，所述平衡盐溶液为含100U/ml青霉素-100U/ml链霉素的平衡盐溶液。
进一步地，所述细胞解离试剂为StemProTMAccutaseTM细胞解离试剂。
进一步地，所述细胞解离试剂加入量为每孔加入200μl/24孔板或400μl/6孔板。
进一步地，所述步骤(2)中加入PBS重悬离心弃上清后培养方法为：将弃上清后的材料加入24孔板中，每孔1ml培养基，在温度为37℃、5％CO2条件下进行培养。
进一步地，还包括原代人CSKs冻存步骤。
进一步地，所述原代人CSKs冻存步骤包括：吸出培养基，用PBS清洗两次；加入细胞解离试剂；室温孵育后加入PBS后并通过上下移液冲洗孔以分离细胞，将细胞悬液收集后离心弃上清；加入PBS重悬离心弃上清；用CSK完全培养基重悬细胞；在细胞悬液中加入DMSO，将细胞悬浮液转入冻存管中，置于程序降温盒中于-80℃至少24h；将冻存管置于液氮下长期存放。
本发明的有益效果在于：
第一、本发明以透镜为来源分离人CSKs的方法，用胶原酶I和分散酶消化透镜的ECM成分，然后在低血清含量(0.5％FBS)的CSK完全培养基中使细胞重新获得静止状态，树突状形态和独特的CSKs表型；这些细胞具有独特的表型，包括ALDH3A1的表达，降低的CSKs特异性蛋白(角蛋白和蜡样蛋白)的表达，以及不表达成纤维细胞相关蛋白(纤维连接蛋白和十二烷基硫酸钠-C)；
第二、本发明提供的培养基为低糖DMEM/F12和视黄酸的混合物，该种培养基为在低糖DMEM/F-12培养基基础上添加胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、非必需氨基酸溶液、维生素溶液、青链霉素、氨基酸溶液、IGF-1、Y-27632、L-ascorbic 2-phosphate、羊膜上清液、热灭活FBS、视黄酸；该培养基可以很好的使细胞重新获得静止状态，树突状形态和独特的CSK表型使细胞重新获得静止状态，树突状形态和独特的CSK表型。
第三、本发明建立了一套高效可行的人CSKs获取的方案，能够得到静止状态、树突状形态的人CSKs，可以以很小的概率产生成纤维细胞，体外能传9～10代；本发明中提供的该种可行的方法，即通过特定的酶消化方法从角膜中分离出角质细胞；利用适当的培养基和生长因子在体外成功地维持CSKs的生长和增殖；本发明进一步验证了这些细胞的表型和功能，也为人CSKs的分离和培养提供了一种有效的方法，有望在角膜组织工程和细胞治疗中发挥重要的作用，为进一步用于临床奠定了实验基础。
附图说明
图1为人原代角膜基质细胞(CSKs)与人原代角膜成纤维细胞(SFs)的形态；CSKs与SFs是在从同一供体扩增的细胞中捕获的，其中，a：人CSKs贴壁培养至P5，b：人SFs传代培养至P5；
图2为角膜基质角质细胞(CSKs)和角膜成纤维细胞(SFs)的ALDH1A1蛋白表达；a：CSKs在无血清条件下培养14天后；b：SFs在添加10％FBS的培养基中。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。下面用更为详细的实施例对本发明进行说明：
实施例1
本实施例中利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，步骤包括：
(1)提取并培养人原代CSKs：将20-25片角膜透镜浸于含100U/ml青霉素-100U/ml链霉素的平衡盐溶液中冲洗消毒，置于倒置显微镜下，用无菌手术剪刀将透镜剪成1mm×1mm组织块；将组织移到35mm培养皿中，加入2ml分散酶Dispase II(1mg/ml)，使组织块完全侵泡于裂解液中；在37℃5％CO2培养箱中消化1h后，将组织块和裂解液收集至离心管中，室温下离心7min，弃除上清；加入3ml PBS重悬，350g室温下离心7min，弃除上清；将组织块和分离出的细胞收集到培养皿中，加入2ml胶原酶Collagenase I(1mg/ml)，在37℃、5％CO2培养箱中培养4-6h；离心去除裂解液，用CSK完整培养基重悬并加入培养皿中37℃、5％CO2培养箱中培养。
所述CSK完整培养基成分为：在低糖DMEM/F-12(1000mg/L glucose)培养基基础上添加胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(其中胰岛素1mg/ml、转铁蛋白0.55mg/ml、硒0.67ug/ml)、青霉素100U/ml、链霉素0.1mg/ml、氨基酸溶液、非必需氨基酸溶液、维生素溶液、IGF-1(10ng/ml)、Y-27632(10uM)、L-ascorbic2-phosphate(0.5mM)、羊膜上清液(5ug/ml)、热灭活FBS(0.5％)、视黄酸(0.5uM)；
所述羊膜上清液是通过以下方法制备得到的：将冷冻羊膜放在4℃过夜解冻，在冰上用PBS冲洗羊膜3-5次，以去除血液或甘油，随后冷冻保存羊膜；如果羊膜上仍有血迹，就必须进行更多的清洗；用无菌镊子向下挤压羊膜排出PBS；重复3-5次，尽可能多地去除PBS，以便以后更容易地研磨，这是由于当用液氮冷却时，PBS的保留会导致羊膜组织结冰，导致研磨困难；将羊膜放入60mm的细胞培养皿中，用剪刀剪成1mm×1mm组织块；向研钵和研杵中加入液氮，使其冷却；将5-8片羊膜放入冷却的研钵中，加入液氮；将冷却后的羊膜片用研杵磨成粉末，羊膜不会完全粉末状，由于膜保留了水分，加入液氮后组织会变硬，不易研磨，在膜开始变得太软之前及时补充液氮，不要让薄膜完全融化；称量含有羊膜粉末的50ml离心管；每克羊膜粉末加入3ml PBS；将管在旋转器上以100转/分的速度旋转，温度控制在4℃，48小时后70μm过滤后3000rpm、4℃条件下离心15分钟；取上清液装入1.5EP管中，12,000g、4℃离心15分钟；收集干净的上清液(含AME)，将上清液每100ul分装到新的1.5mEP管中，保存在-80℃；
一旦细胞达到70％融合度时，激活的CSKs必须传代；一旦合流度超过80％，细胞形态趋于成纤维细胞；
(2)原代人CSKs传代方法：吸出培养基，用PBS清洗两次；加入StemProTMAccutaseTM细胞分离试剂，所述细胞解离试剂加入量为每孔加入200μl/24孔板或400μl/6孔板；室温孵育3min；加入至少3倍体积的PBS，收集到15ml离心管中；350g室温下离心7min，弃上清；加入3ml PBS重悬；350g室温下离心7min，弃上清；加入24孔板中，每孔1ml培养基；37℃、5％CO2条件下培养，为了转化为CSKs，每2-3天更换一次CSK完整培养基，活化的CSKs在P3-P6时达到70％融合度时，在完全培养基(不含0.5％胎牛血清)中维持7-21天，每3-4天观察细胞形态。
本发明中得到的人CSKs可以作为种子细胞用于组织工程角膜的构建及移植。
(3)原代人CSKs冻存方法：当细胞数量过低时，如小于6孔板的4孔或小于250000个细胞，不建议冷冻细胞；当细胞数目充足可以冻存时，吸出培养基，用PBS清洗两次；每孔加入200μl/24孔板或400μl StemProTMAccutaseTM细胞解离试剂/6孔板；室温孵育3分钟，不要将StemProTMAccutaseTM细胞解离试剂处理过长时间；如果需要更长时间的培养，每1分钟在显微镜下检查一次，当90％的细胞分离后停止分离反应；向孔中加入至少3倍体积的PBS，并通过上下移液冲洗孔以分离细胞，将细胞悬液收集到15ml离心管中；350g室温下离心7min，弃上清；加入3ml PBS重悬；350g室温下离心7min，弃上清；用450μl的CSK完全培养基重悬细胞；在细胞悬液中加入50μl的DMSO，得到最终浓度为10％的DMSO；将细胞悬浮液转入2ml冻存管中，置于程序降温盒中于-80℃至少24h；将冻存管置于液氮下长期存放。
在上述实施例的基础上，步骤原代人CSKs传代方法中，一旦细胞达到70％融合度时，激活的CSKs必须传代。一旦合流度超过80％，细胞形态趋于成纤维细胞。将人原代角膜基质细胞与人原代角膜成纤维细胞作为对比：
图1为人原代角膜基质细胞(CSKs)与人原代角膜成纤维细胞(SFs)的形态；CSKs与SFs是在从同一供体扩增的细胞中捕获的，其中，a：人CSKs贴壁培养至P5，在倒置显微镜下观察，细胞呈细长、树突状形态；b：人SFs传代培养至P5，细胞呈长梭形，具有更大的细胞体。
图2为角膜基质角质细胞(CSKs)和角膜成纤维细胞(SFs)的ALDH1A1蛋白表达；a：CSKs在无血清条件下培养14天后ALDH3A1强烈表达；b：SFs在添加10％FBS的培养基中，不表达或仅表达少量ALDH3A1标记。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的产品及详细制备方法，但本发明并不局限于上述产品和详细制备方法，即不意味着本发明必须依赖上述产品和详细制备方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅料成分的添加，具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单的变形。这些简单变形均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，步骤包括：
(1)提取并培养人原代CSKs：将角膜透镜浸于青霉素-链霉素的平衡盐溶液中冲洗消毒，置于倒置显微镜下，将透镜剪成组织块后移到培养皿中，使组织块完全侵泡于裂解液中后，将组织块和裂解液收集至离心管中，离心弃除上清；加入PBS重悬后离心弃除上清；将组织块和分离出的细胞收集到培养皿中，培养后离心去除裂解液，用CSK完整培养基重悬并加入培养皿中培养；
(2)原代人CSKs传代方法：吸出培养基，用PBS清洗两次；加入细胞解离试剂，室温孵育；加入PBS收集离心弃上清；加入PBS重悬离心弃上清后培养，每2-3天更换一次CSK完整培养基。
2.根据权利要求1所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述所述CSK完整培养基成分为：在低糖DMEM/F-12培养基基础上添加胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、非必需氨基酸溶液、维生素溶液、青链霉素、氨基酸溶液、IGF-1、Y-27632、L-ascorbic2-phosphate、羊膜上清液、热灭活FBS、视黄酸。
3.根据权利要求2所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述羊膜上清液是通过以下方法制备得到的：将冷冻羊膜解冻，在冰上用PBS冲洗羊膜3-5次，以去除血液或甘油；用无菌镊子向下挤压羊膜排出PBS；；将羊膜放入的细胞培养皿中，用剪刀剪成组织块；向研钵和研杵中加入液氮，使其冷却；将羊膜放入冷却的研钵中，加入液氮；将冷却后的羊膜片用研杵磨成粉末状；称量羊膜粉末使得每克羊膜粉末加入3mlPBS；旋转器旋转后过滤；取上清液离心，收集干净的上清保存即得羊膜上清液。
4.根据权利要求1所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述平衡盐溶液为含100U/ml青霉素-100U/ml链霉素的平衡盐溶液。
5.根据权利要求1所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述细胞解离试剂为StemProTMAccutaseTM细胞解离试剂。
6.根据权利要求5所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述细胞解离试剂加入量为每孔加入200μl/24孔板或400μl/6孔板。
7.根据权利要求2所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述旋转器旋转速度为90-110转/分。
8.根据权利要求1所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入PBS重悬离心弃上清后培养方法为：将弃上清后的材料加入24孔板中，每孔1ml培养基，在温度为37℃、5％CO2条件下进行培养。
9.根据权利要求1所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，还包括原代人CSKs冻存步骤。
10.根据权利要求9所述的利用SMILE手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增的方法，其特征在于，所述原代人CSKs冻存步骤包括：吸出培养基，用PBS清洗两次；加入细胞解离试剂；室温孵育后加入PBS后并通过上下移液冲洗孔以分离细胞，将细胞悬液收集后离心弃上清；加入PBS重悬离心弃上清；用CSK完全培养基重悬细胞；在细胞悬液中加入DMSO，将细胞悬浮液转入冻存管中，置于程序降温盒中于-80℃至少24h；将冻存管置于液氮下长期存放。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311831446.4A CN117778321A (zh) | 2023-12-28 | 2023-12-28 | 利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311831446.4A CN117778321A (zh) | 2023-12-28 | 2023-12-28 | 利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117778321A true CN117778321A (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=90392354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311831446.4A Pending CN117778321A (zh) | 2023-12-28 | 2023-12-28 | 利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117778321A (zh) |
-
2023
- 2023-12-28 CN CN202311831446.4A patent/CN117778321A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1675944B1 (en) | Human corneal endothelial cells and methods of obtaining and culturing cells for corneal cell transplantation | |
| US20240141298A1 (en) | Method of isolating mesenchymal stem cells from the amniotic membrane of the umbilical cord, a mesenchymal stem cell population isolated from the amniotic membrane of the umbilical cord and a cell culture medium for isolating mesenchymal stem cells from the amniotic membrane of the umbilical cord | |
| WO2012117333A1 (en) | Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof | |
| WO2000073421A2 (en) | Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells | |
| KR20070015519A (ko) | 생체 조직 시트, 그것의 제조 방법, 및 그것을 이용한 이식방법 | |
| WO2014104366A1 (ja) | ヒト角膜内皮細胞シート | |
| JP7541730B2 (ja) | 間葉系幹細胞の創傷治癒特性を誘導するまたは改善する方法 | |
| CN106938059B (zh) | 一种体外构建组织工程角膜内皮的方法 | |
| CN109749997B (zh) | 一种角膜缘干细胞无血清培养基及其培养方法 | |
| WO2007043255A1 (ja) | 培養角膜内皮シート及びその作製方法 | |
| WO2007099556A2 (en) | Conjunctival tissue system | |
| CN110179826B (zh) | 人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法 | |
| Insler et al. | Heterologous transplantation versus enhancement of human corneal endothelium | |
| JPWO2005087285A1 (ja) | 角膜上皮シート及びその作製方法、並びに同シートを用いる移植方法 | |
| CN111560348A (zh) | 一种角膜缘上皮干细胞分离培养方法 | |
| CN111793596A (zh) | 一种人羊膜上皮干细胞的分离方法和制备方法 | |
| RU2409663C1 (ru) | Способ получения дедифференцированных клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека | |
| US20090047738A1 (en) | Feeder cell derived from tissue stem cell | |
| CN109439628B (zh) | 角膜缘干细胞原代培养方法 | |
| CN117778321A (zh) | 利用smile手术中获得的角膜透镜进行人原代角膜基质细胞的分离和扩增 | |
| RU2764077C1 (ru) | Способ выделения фибробластов из стромы роговицы | |
| EP3867357B1 (en) | Methods of isolating and using descemet's membrane and compositions including isolated descemet's membrane | |
| KR101645901B1 (ko) | 양막 슬라이드 지지체를 이용한 윤부줄기세포 배양방법 | |
| CN111849884B (zh) | 一种人胎盘羊膜干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法 | |
| RU2783992C2 (ru) | Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины с применением клеточной культуральной среды |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |