CN111560348A - 一种角膜缘上皮干细胞分离培养方法 - Google Patents

一种角膜缘上皮干细胞分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种角膜缘干细胞的分离培养方法，通过本发明获得的角膜缘上皮干细胞具有较高的细胞活性，较强的细胞增殖能力，该培养方法简单有效且排斥反应低。原代培养的细胞个数为9.5✕105个，流式细胞检测表面标志物的阳性表达率，结果为抗体AE5角膜成纤维细胞的表面标志性抗体阴性表达，CX43角膜干细胞为阴性表达，PCNA抗体阳性表达，BrdU抗体阳性表达。

Description

一种角膜缘上皮干细胞分离培养方法
技术领域
本发明属于细胞分离培养技术领域，具体地涉及一种角膜缘上皮干细胞分离培养方法。
背景技术
角膜缘干细胞是指角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分，位于角膜缘上皮细胞基底层内，主要功能是更新修复角膜上皮，是角膜上皮更新的源泉，维持角膜完整性。
培养角膜缘干细胞是基于对角膜缘干细胞的深入认识和对传统方法的重大革新，具有良好的发展前景。
培养后的角膜干细胞分化及生理生化的变化、如何选择安全可靠的载体、培养的干细胞如何效果会更好、异体移植后如何降低排斥反应的发生等一延系列问题都亟待解决。
角膜缘干细胞移植术是治疗眼表疾病、重建角膜结构的有效手段。我国每年所实施的角膜移植例数远不及每年递增的角膜病患者。
角膜缘组织极少，对供眼无潜在威胁；培养的细胞可冰存用于二次手术；能抑制眼表急性病变的发展迅速恢复术眼正常的眼表结构；可避免使用异体移植而导致的免疫排斥反应；解决了供体来源不足的难题。这一方法是最有前途的研究方向，一旦该方法研究成熟，可解决角膜缘干的来源。
由于干细胞对角膜创伤的愈合及透明性维持等方面具有重要作用，通过对体外培养的角膜缘干细胞增殖分化特性的研究可以加深对干细胞的认识，为将来进行异体干细胞移植准备条件。目前对于角膜缘干细胞没有简单有效且排斥反应低的分离培养方法。
公开号为CN109423474A的中国发明专利申请揭露一种培养人类角膜缘干细胞的方法，其步骤包含：预处理一滋养细胞；将滋养细胞接种于一多孔膜；将多孔膜置入一容器中，使容器分隔为第一培养室以及第二培养室，其中，滋养细胞位于第二培养室；于容器中注入培养基；以及将人类角膜缘干细胞置于第一培养室。该发明需要将滋养细胞置于设有连个培养室的容器中，培养过程较繁琐。
发明内容
为解决现有技术问题中的不足，本发明提供一种角膜缘干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
（1）无菌条件下获取角膜并清洗；
（2）减除残留的巩膜、结膜和虹膜；
（3）加入中性蛋白酶II4°C过夜消化，轻微搅动，中性中性蛋白酶II消化作用温和快速，并且可以获得完整的角膜上皮层，成纤维细胞污染发生率低；
（4）将加入中性蛋白酶II的角膜放人4°C摇床摇30min。
（5）用DMEM/F-12/GASP清洗角膜；
（6）解剖显微镜下，小心去除角膜中央的上皮细胞并除去角膜缘包含有Vogt栅栏区的色素上皮细胞，去除过程中多数的中央上皮细胞已经剥脱；
（7）用胰蛋白酶/EDTA消化角膜缘上皮细胞片；
（8）加入等体积DMEM/F-12/2FB/GASP；
（9）离心，弃上清；
（10）用DMEM/F 12/GASP清洗，离心，弃上清；
（11）加入LSC培养基，将细胞拍散并用血细胞计数板计数；
（12）将细胞以一定密度接种至铺有3T3饲养层的组织培养皿或准备好的人羊膜上，每三天更换一次培养基；
（13）当细胞汇合度达到90%时用胰蛋白酶消化传代。
（14）细胞收集，冻存。
优选的是，所述角膜清洗液为CMF-Saline G，清洗3✕5min。
上述任一方案优选的是，所述中性蛋白酶II加入2-3ml。
上述任一方案优选的是，步骤（5）角膜清洗液为CMF-Saline G，清洗3✕5min。
上述任一方案优选的是，步骤（7）消化时间为3-5min。
上述任一方案优选的是，步骤（9）离心条件为400g离心10 min。
上述任一方案优选的是，步骤（11）中培养基配方具体为：5mL 100×双抗、10～20ng/ml人重组EGF、10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、皮质醇(Hydrocortisone)0.5μg/m、5-10ng/ml白介素-6、15～20％胎牛血清、余量为DMEM/F12。
上述任一方案优选的是，步骤（12）中细胞密度为1✕104 /cm2 。
上述任一方案优选的是，步骤（13）胰蛋白酶消化时间为3-5min。
上述任一方案优选的是，步骤（13）的传代过程为：
a.弃掉培养基；
b.用CMF-Saline G洗一遍；
c.加入胰蛋白酶/EDTA 37℃，10min；
d.当细胞收缩，加入等体积的DMEM/F 12/GASP；
e.400g离心10min，计数；
f.弃上清，加入足量新鲜培养基，接种密度1✕ 104 /cm2。
通过本发明获得的角膜缘上皮干细胞的分离培养方法培养的角膜上皮干细胞简单有效且排斥反应低。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明做进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1：
（1）无菌条件下获取角膜并清洗；角膜清洗液为CMF-Saline G，清洗3✕5min。
取因各种原因死亡的婴幼儿及儿童的眼球，均无眼部疾患，于死后24h内取材；将人眼球置于洁净工作台上，严格无菌下操作，沿角巩膜缘灰白交界后1mm处剪切，取下包括角膜缘在内的眼前段组织，将眼前段组织小心移至另一盛有培养液的平皿中，解剖显微镜下去除虹膜、晶状体等附属组织，再撕去角膜内皮层及后弹力层；然后，沿透明角膜内1mm环状剪取约2.0～2.5mm宽的角膜缘组织，并将其分成2mm×2mm×2mm的组织块。整个操作中注意尽量避免钳夹培养组织块。
（2）减除残留的巩膜、结膜和虹膜；
（3）加入中性蛋白酶II4°C过夜消化，轻微搅动，中性蛋白酶II消化作用温和快速，并且可以获得完整的角膜上皮层，成纤维细胞污染发生率低, 中性蛋白酶II加入2ml；
（4）将加入中性蛋白酶II的角膜放人4°C摇床摇30min。
（5）用DMEM/F-12/GASP清洗角膜；
（6）解剖显微镜下，小心去除角膜中央的上皮细胞并除去角膜缘包含有Vogt栅栏区的色素上皮细胞，去除过程中多数的中央上皮细胞已经剥脱；
（7）用胰蛋白酶/EDTA消化3min角膜缘上皮细胞片；
（8）加入等体积DMEM/F-12/2FB/GASP；
（9）离心，弃上清, 离心条件为400g离心10 min。；
（10）用DMEM/F 12/GASP清洗，离心，弃上清；
（11）加入LSC培养基，将细胞拍散并用血细胞计数板计数；
（12）将细胞1✕104 /cm2接种至铺有3T3饲养层的组织培养皿，每三天更换一次培养基；
（13）当细胞汇合度达到90%时用胰蛋白酶消化3min传代。
（14）细胞收集，冻存。
步骤（11）中培养基配方具体为：5mL 100×双抗、10～20ng/ml人重组EGF、10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、5-10ng/ml白介素-6、皮质醇0.5μg/m、15～20％胎牛血清、余量为DMEM/F12。
其中，碱性成纤维细胞生长因子可以有效地促进角膜缘干细胞的增殖，极大地增加干细胞的数量，且可以保证角膜缘干细胞的活性。
传代过程为：
a.弃掉培养基；
b.用CMF-Saline G洗一遍；
c.加入胰蛋白酶/EDTA 37℃，10min；
d.当细胞收缩，加入等体积的DMEM/F 12/GASP；
e.400g离心10min，计数；
f.弃上清，加入足量新鲜培养基，接种密度1✕104 /cm2。
实施例2
（1）无菌条件下获取角膜并清洗；
（2）减除残留的巩膜、结膜和虹膜；
（3）加入中性蛋白酶II4°C过夜消化，轻微搅动，中性蛋白酶II
消化作用温和快速，并且可以获得完整的角膜上皮层，成纤维细胞污染发生率低, 中性蛋白酶II加入2ml；
（4）将加入中性蛋白酶II的角膜放人4°C摇床摇30min。
（5）用DMEM/F-12/GASP清洗角膜；
（6）解剖显微镜下，小心去除角膜中央的上皮细胞并除去角膜缘包含有Vogt栅栏区的色素上皮细胞，去除过程中多数的中央上皮细胞已经剥脱；
（7）用胰蛋白酶/EDTA消化3min角膜缘上皮细胞片；
（8）加入等体积DMEM/F-12/2FB/GASP；
（9）离心，弃上清, 离心条件为400g离心10 min。；
（10）用DMEM/F 12/GASP清洗，离心，弃上清；
（11）加入LSC培养基，将细胞拍散并用血细胞计数板计数；
（12）将细胞1✕104 /cm2接种至人羊膜上，每三天更换一次培养基；
（13）当细胞汇合度达到90%时用胰蛋白酶消化5min传代。
（14）细胞收集，冻存。
步骤（11）中培养基配方具体为：5mL 100×双抗、10～20ng/ml人重组EGF、10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、5-10ng/ml白介素-6、15～20％胎牛血清、余量为DMEM/F12。
实施例3
（1）无菌条件下获取角膜并清洗；
（2）减除残留的巩膜、结膜和虹膜；
（3）加入中性蛋白酶II4°C过夜消化，轻微搅动，中性蛋白酶II
消化作用温和快速，并且可以获得完整的角膜上皮层，成纤维细胞污染发生率低, 中性蛋白酶II加入2ml；
（4）将加入中性蛋白酶II的角膜放人4°C摇床摇30min。
（5）用DMEM/F-12/GASP清洗角膜；
（6）解剖显微镜下，小心去除角膜中央的上皮细胞并除去角膜缘包含有Vogt栅栏区的色素上皮细胞，去除过程中多数的中央上皮细胞已经剥脱；
（7）用胰蛋白酶/EDTA消化3min角膜缘上皮细胞片；
（8）加入等体积DMEM/F-12/2FB/GASP；
（9）离心，弃上清, 离心条件为400g离心10 min。；
（10）用DMEM/F 12/GASP清洗，离心，弃上清；
（11）加入LSC培养基，将细胞拍散并用血细胞计数板计数；
（12）将细胞1✕104 /cm2接种至生物羊膜上，每三天更换一次培养基；所用生物羊膜可从市场上购得。
（13）当细胞汇合度达到80-90%时用胰蛋白酶消化5min传代。
（14）细胞收集，冻存。
步骤（11）中培养基配方具体为：5mL 100×双抗、10～20ng/ml人重组EGF、10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、5-10ng/ml白介素-6、15～20％胎牛血清、余量为DMEM/F12。
对比例1
具体的培养方法同实施例1，不同的是所述培养基中不包含人重组EGF。
对比例2
具体的培养方法同实施例1，不同的是所述培养基中不包含碱性成纤维细胞生长因子。
对比例3
具体的培养方法同实施例1，不同的是所述培养基中不包含白介素-6。
对实施例1～3以及对比例1-3传代前的细胞(即P0代)进行计数；每组计数重复3次。
实施例1平均细胞数为9.0✕10 5个；
实施例2平均细胞数为9.5✕10 5个；
实施例3平均细胞数为8.5✕10 5个。
对比例1平均细胞数为7.0✕10 5个；
对比例2平均细胞数为7.5✕10 5个；
对比例3平均细胞数为8.0✕10 5个。
培养基中不包含细胞生长因子的干细胞细胞状态不佳，细胞数量较少。
对实施例1～3传代培养1次后的细胞进行流式细胞检测表面标志物的阳性表达率，流式检测检测细胞表面标志物具体方法为：
1..取实施例1-3的P2代细胞，三个样品的平行试验，进行、消化，终止、 重悬，取1×106cells，平均分至2个EP管中，一管作为对照，1500rpm/min 离心5min，弃上清。
2.加入1mL染色缓冲液(含10％FBS的PBS)重悬细胞，1500rpm/min 离心5min，弃上清。重复以上步骤1次。
3.弃上清后，每管加入200μL染色缓冲液重悬，样本组分别加入2μL 特异性识别的碱性角蛋白抗体(AE5)、缝隙连接蛋白抗体(CX43抗体)、DNA 聚合酶δ的辅助蛋白抗体(PCNA)和BrdU抗体。避光孵育20min。
4.加入500μL染色缓冲液重悬，1500rpm/min离心5min洗掉剩余抗体。
5.弃上清，加入500μL上样缓冲液(10％FBS+1640培养基)，过200 目筛，上机检测。
三个实施例的结果均显示：抗体AE5角膜成纤维细胞的表面标志性抗体阴性表达，CX43角膜干细胞为阴性表达，PCNA抗体阳性表达， BrdU抗体阳性表达。
证明该细胞具有很强的增殖能力，间接表明角膜干细胞的极强的增殖力表明细胞具有长生长周期。
实施例4
具体的培养方法同实施例1，不同的是选取实验兔眼角膜。将细胞1✕104 /cm2接种至羊膜上，并对原代培养的角膜缘细胞进行移植术。
将含有干细胞的羊膜片移植到有眼疾的兔眼角膜上，兔眼术后观察40天，结果显示，角膜缘干细胞羊膜移植术后，移植片可以在受体植床上存在并与巩膜和结膜完全融合为一体，羊膜逐渐被受体组织吸收，角膜透明度增加，无明显的免疫排斥反应，兔眼视力得到不同程度的提高。
本领域技术人员不难理解，本发明的一种角膜缘上皮细胞的分离方法包括上述发明说明书的发明内容和具体实施方式部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的方案一一描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种角膜缘干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
（1）无菌条件下获取角膜并清洗；
（2）减除残留的巩膜、结膜和虹膜；
（3）加入中性蛋白酶II4°C过夜消化，轻微搅动；
（4）将加入中性蛋白酶II的角膜放人4°C摇床摇30min；
（5）用DMEM/F-12/GASP清洗角膜；
（6）解剖显微镜下，小心去除角膜中央的上皮细胞并除去角膜缘包含有Vogt栅栏区的色素上皮细胞，去除过程中多数的中央上皮细胞已经剥脱；
（7）用胰蛋白酶/EDTA消化角膜缘上皮细胞片；
（8）加入等体积DMEM/F-12/2FB/GASP；
（9）离心，弃上清；
（10）用DMEM/F 12/GASP清洗，离心，弃上清；
（11）加入LSC培养基，培养基配方具体为：5mL 100×双抗、10～20ng/ml人重组EGF、10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、皮质醇(Hydrocortisone)0.5μg/mg、5-10ng/ml白介素-6、15～20％胎牛血清、余量为DMEM/F12，将细胞拍散并用血细胞计数板计数；
（12）将细胞以一定密度接种至铺有3T3饲养层的组织培养皿或准备好的人羊膜上，每三天更换一次培养基，流式细胞检测表面标志物的阳性表达率；
（13）当细胞汇合度达到90%时用胰蛋白酶消化传代；
（14）细胞收集，冻存。
2.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述角膜清洗液为CMF-Saline G，清洗3✕5min。
3.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述中性蛋白酶II加入2-3ml。
4.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（5）角膜清洗液为CMF-Saline G，清洗3✕5min。
5.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（7）消化时间为3-5min。
6.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（9）离心条件为400g离心10 min。
7.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（12）中细胞密度为1✕104 /cm2 。
8.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（13）胰蛋白酶消化时间为3-5min。
9.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（13）的传代过程为：
a.弃掉培养基；
b.用CMF-Saline G洗一遍；
c.加入胰蛋白酶/EDTA 37℃，10min；
d.当细胞收缩，加入等体积的DMEM/F 12/GASP；
e.400g离心10min，计数。
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