CN112626019A - 一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：S1，取样及转运；S2，漂洗；S3，消化；S4，终止消化及过滤；S5，裂解红细胞并过滤；S6，纯化及重悬细胞；S7，细胞计数及检测；本发明方法操作简便、耗时短、稳定性好，获得的单细胞悬液细胞总数多，获得角膜及角膜缘单细胞悬液内角膜的各类细胞具有高存活率，并且总体活性大于90％，适用于单细胞领域的相关实验和原代细胞的分离培养，为角膜及角膜缘单细胞转录组测序、V(D)J免疫组库测序和ATCT染色质开放区域测序等提供高效的活细胞，进而对测序获得的高通量数据进行系统的生物信息学分析和挖掘，揭示角膜及角膜缘细胞命运转变过程中各类细胞转录组的时空变化规律。
Description
技术领域
本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法。
背景技术
世界卫生组织(WHO)的统计数据显示，全球有超过4亿人患有视力障碍，约有4000万人失明，其中1000万人是由角膜疾病或损伤引起的。角膜由五层结构组成，即上皮、Bowman膜、基质、Descemet膜和内皮，角膜缘干细胞(Limbal Stem Cells,LSCs)位于上皮基底层，尤其是Vogt栅栏区乳头状结构中的角膜缘基底细胞层，其是一组具有高增殖潜能的细胞群，也是角膜上皮增殖和移行的动力来源，并且可以有效地修复角膜，维持角膜的光学特性。将自体LSC进行体外扩增、移植等治疗方式可以有效解决角膜资源不足、免疫排斥和终生免疫抑制药物的使用等限制。因此，研究眼部组织，特别是角膜的结构和功能有助于延缓和减少眼部疾病的发生，并提高眼疾的治愈率。随着单细胞技术在生物科学领域取得的巨大突破，生物学界用细胞异质性不断补充或颠覆用团块组织平均水平所诠释的生物学机制，在单细胞水平上更加精准地阐释机理。目前的研究过程中需要将眼角膜及角膜缘消化成单细胞悬液，然后通过单细胞测序，分析眼角膜及角膜缘的细胞异质性，为防盲治盲提供技术支撑。
目前针对眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法存在较大的缺陷，相关文献介绍的制备方法存在步骤繁琐、消化时间过长、细胞聚团、细胞总数少及细胞活性低等缺陷，理论上证明，部分细胞群体，如角膜缘干细胞只占细胞总数的3％，上述问题将造成丢失细胞过多、检查结果失真；并且眼角膜含有大量的胶原纤维，消化若没处理好，会堵塞管道，损坏精密仪器。这使得单细胞悬液制备成为眼角膜及角膜缘单细胞测序的技术难点。单细胞悬液制备不合格，达不到上机要求，将无法进行后续实验。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，主要用于解决对眼角膜进行单细胞转录组测序时单细胞悬液制备成功率低的问题，该技术可为单细胞转录组测序、V(D)J免疫组库测序、ATCT染色质开放性测序等提供优质的活细胞，然后进行生物信息学分析，揭示角膜及角膜缘单细胞的异质性，以揭示眼部发育和疾病发展的时空信息。
本发明的一个目的在于提供一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法。
所述制备方法包括如下步骤：
S1，取样及转运：将离体的眼角膜及角膜缘组织快速浸泡入装有人组织移植保存液中的容器中，所述容器置于冰上并加保温棉隔离保存运输，保存及转运时间不超过48h；
S2，漂洗：将步骤S1中的眼角膜及角膜缘组织用不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液清洗，去除所述眼角膜及角膜缘组织的周围组织和残渣；
S3，消化：将步骤S2中得到的眼角膜及角膜缘组织剪碎，并加入消化酶，放入摇床进行震荡消化；
S4，终止消化及过滤：向步骤S3中的组织消化液中加入含血清的PBS缓冲液终止消化，过滤、离心富集细胞，回收沉淀；
S5，裂解红细胞并过滤：向步骤S4中的沉淀中加入红细胞裂解液，待裂解充分后，进行过滤、离心，得到细胞沉淀；
S6，纯化及重悬细胞：将步骤S5中的细胞沉淀进行洗涤纯化过程，清除坏死细胞，然后用PBS缓冲液洗重悬细胞，制得眼角膜及角膜缘单细胞悬液。
S7，细胞计数及检测：取步骤S6中制得的眼角膜及角膜缘单细胞悬液加到Countstar细胞计数分析仪中进行检测，得到单细胞悬液的性能指标数据。
优选的，所述步骤S1中的移植保存液为含有质量浓度为10％胎牛血清的HBSS缓冲液或者角膜移植片保存液中的一种。
优选的，所述步骤S3中眼角膜及角膜缘组织剪碎具体操作如下：用生理盐水或者PBS缓冲液中的一种沾湿纱布并紧密包裹眼球巩膜部分，暴露角膜部分；用手术刀或者针头刺破角膜缘外缘，将角膜剪开、并深入该切口，沿角膜缘外缘剪下角膜，将所述角膜放入不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液中，剪碎成浆糊状。
优选的，所述步骤S3中消化具体步骤为：将剪碎的眼角膜及角膜缘组织加入到含有消化酶的缓冲液体系中，摇匀，置于摇床中震荡消化30-45分钟，摇床运行参数为37℃、150rpm。
优选的，所述步骤S4中过滤器的筛网粒径为40μm，所述离心的具体条件为：4℃、1200rpm，离心5min。
优选的，所述步骤S5中过滤器的筛网粒径为40μm，所述离心的具体条件为：4℃、1200rpm，离心5min。
优选的，所述步骤S6中重悬细胞具体操作过程为：用含有质量浓度为2％胎牛血清的PBS缓冲液重悬细胞沉淀，然后过滤、离心，重复2次，最后制得眼角膜及角膜缘单细胞悬液。
优选的，所述步骤S1-S6均在无菌条件下操作，制得单细胞悬液，所述单细胞悬液用于原代细胞的培养。
优选的，所述步骤S7中单细胞悬液的性能指标数据包括：细胞活率、总细胞浓度、活细胞浓度、死细胞浓度、总细胞个数、活细胞个数、死细胞个数、平均直径。
本发明的另一个目的在于提供一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液。
所述眼角膜及角膜缘单细胞悬液是根据权利要求1-9项中任一项所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法所制得。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1)本发明方法操作简便、耗时短、稳定性好，获得的单细胞悬液细胞总数多，获得角膜及角膜缘单细胞悬液内角膜的各类细胞具有高存活率，并且总体活性大于90％，适用于单细胞领域的相关实验和原代细胞的分离培养；
2)本发明确定了针对角膜及角膜缘有效的消化酶体系和作用时间，确保角膜及角膜缘单细胞悬液内各类细胞的高细胞总数和高活性率；
3)本发明制得的单细胞悬液活性高、符合细胞建库要求，为角膜及角膜缘单细胞转录组测序、V(D)J免疫组库测序和ATCT染色质开放区域测序等提供高效的活细胞，进而对测序获得的高通量数据进行系统的生物信息学分析和挖掘，揭示角膜及角膜缘细胞命运转变过程中各类细胞转录组的时空变化规律；
4)本发明方法获得的角膜及角膜缘单细胞具有高存活率，为单细胞各种测序提供有效性和准确性，为防盲致盲的基础与临床研究提供技术支撑，为阐述角膜疾病的发生发展提供至关重要的物质基础。
附图说明
图1为本发明制备的单细胞悬液荧光染色图，其中，BR谱图为倒置显微镜下明场(未加染色)观察的细胞、FL1谱图为活细胞AO荧光染色图、FL2谱图为死细胞PI荧光染色图、融合谱图为细胞融合AO/PI荧光染色图。
图2为本发明制备的单细胞悬液性能指标图，其中，直径分布图为不同单细胞直径大小分布情况、FL1荧光强度分布图为不同单细胞荧光强度情况、FL2荧光强度分布图为不同单细胞荧光强度情况。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，接下来结合实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述，应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。
本发明所使用的多组织消化酶试剂盒(Multi Tissue Dissociation Kit 2)、对比例所使用的多组织消化酶试剂盒(Multi Tissue Dissociation Kit 1)、除死细胞试剂盒(货号：130-090-101)、红细胞裂解液(RedBlood Cell Lysis Solution(10×)(货号：130-094-183))均购自美天旎公司；Countstar细胞计数分析仪购自上海睿钰生物科技有限公司；角膜移植片保存液来自意大利Alchimia；其他常规仪器设备或者试剂，如无特别说明，均可市售获得。
下面结合具体的实施例对眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法作进一步的描述。
实施例1
S1，取样及转运：准备适当大小泡沫冰盒和50mL离心管、并且离心管中加入足量质量浓度为10％胎牛血清的HBSS缓冲液，防止组织标本贴附于缓冲液平面上干涸；在冰盒内放入适量碎冰，预冷缓冲液，将离体的眼角膜及角膜缘组织快速浸泡入装有人组织缓冲液的离心管中，所述离心管置于冰上并加保温棉隔离保存运输，保存及转运时间不超过48h；
S2，漂洗：将步骤S1中的眼角膜及角膜缘组织用不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液清洗，去除所述眼角膜及角膜缘组织的周围组织和残渣；
S3，消化：将步骤S2中得到的眼角膜及角膜缘组织剪碎，具体操作为：用生理盐水或者PBS缓冲液中的一种沾湿纱布并紧密包裹眼球巩膜部分，暴露角膜部分；用手术刀或者针头刺破角膜缘外缘，将角膜剪开、并深入该切口，沿角膜缘外缘剪下角膜，将所述角膜放入不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液中，剪碎成浆糊状；配制消化酶体系：取一只干净的美天旎C管，加入2.3mL缓冲液X，62.5μL消化酶P，25μL缓冲液Y，100μL消化酶D，12.5μL消化酶A(所述消化酶配制、用量均按照多组织消化酶试剂盒(Multi Tissue Dissociation Kit 2)说明书来操作)，将剪碎的眼角膜及角膜缘组织加入到上述C管中，将所述C管倒置插入gentleMACS分离器(美天旎公司)上，运行一次E-intestinal-01程序后，将C管拿出并摇匀，置于摇床中震荡消化30-45分钟，摇床运行参数为37℃、150rpm转速；
S4，终止消化及过滤：向步骤S3中的组织消化液中加入10mL含有质量浓度为2％胎牛血清的PBS缓冲液终止消化，手动摇匀，使用一次性40μm过滤筛网，将上述消化液过滤至50mL离心管中，在4℃、1200rpm条件下离心5分钟，去上清液并回收沉淀；
S5，裂解红细胞并过滤：若步骤S4中的沉淀呈红棕色，则加入1mL红细胞裂解液，轻轻摇匀30s，静置2分钟，待裂解充分后，使用一次性40μm过滤筛网，将上述消化液过滤至50mL离心管中，在4℃、1200rpm条件下离心5分钟，直至细胞沉淀呈淡黄色；
S6，纯化及重悬细胞：使用除死细胞试剂盒，清除步骤S5中的细胞沉淀中的坏死细胞，然后用含有质量浓度为2％胎牛血清的PBS缓冲液重悬细胞沉淀，然后过滤、离心，重复2次，最后制得眼角膜及角膜缘单细胞悬液。
对比例1
该方法为某生物公司单细胞悬液制备方法，具体如下：
S1：用无菌剪刀或手术刀将组织切成粥状碎块；
S2：在冰上将碎组织加入适当的预冷缓冲液或平衡盐溶液中，清洗2-3次。此外为了减少细胞损伤，还可以根据情况添加FBS或者BSA缓冲液；
S3：加入适量的1u/mL消化酶dispase2，并在37℃下孵育适当的时间，并间歇的混匀，在温度为37℃条件下震荡消化15-45min，然后用质量浓度为0.25％胰蛋白酶消化20分钟，如组织块已分散而失去块的形状，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可以认为已消化充分；
S4：通过移液枪或研磨的方式轻轻分散细胞；
S5：通过40μm的滤网过滤细胞悬液；
S6：让细胞沉降并倒出多余的含酶液体；
S7：洗涤并重复2-3次，在适当的培养基或缓冲液中重悬细胞，细胞碎片可以在此步通过离心初步去除，300g或1000～1500rpm的条件下5min。
对比例2
该方法参照已经公开的文献(Kaplan N,Wang J,Wray B,et al.Single-Cell RNATranscriptome Helps Define the Limbal/Corneal Epithelial Stem/Early TransitAmplifying Cells and How Autophagy Affects This Population[J].InvestigativeOphthalmology,Visual Science,2019,60(10).)，具体如下：
S1，组织样品保存及转运：准备适当大小泡沫冰盒和50mL离心管、并且离心管中加入足量质量浓度为10％胎牛血清的HBSS缓冲液，防止组织标本贴附于缓冲液平面上干涸；在冰盒内放入适量碎冰，预冷缓冲液，将离体的眼角膜及角膜缘组织快速浸泡入装有人组织缓冲液的离心管中，所述离心管置于冰上并加保温棉隔离保存运输，保存及转运时间不超过48h；
S2，组织漂洗：将眼角膜及角膜缘用不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液清洗，去除所述眼角膜及角膜缘组织的周围组织和残渣；
S3，用含质量浓度为10％FBS、50μg/mL庆大霉素和1.25μg/mL两性霉素B的细胞培养基配制2mL 1mg/mL胶原酶A(Sigma公司)，在37℃下条件下，放入摇床震荡预消化角膜2小时；孵育2小时后，用不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液冲洗一次角膜，用质量浓度为0.25％胰蛋白酶(含1mM EDTA)在37℃下进一步消化20分钟，然后进行温和的吹打，以产生单细胞；
S4，终止消化及过滤：向S3组织消化液中加入含胎牛血清的细胞培养基终止消化；
S5，洗涤纯化细胞：用含质量浓度为0.04％BSA的PBS洗涤细胞两次，过滤、离心富集细胞，回收沉淀；
S6，重悬获取细胞：加入适量的含质量浓度为0.04％BSA的PBS，获得单细胞悬液。
对比例3
该方法与实施例1的制备方法相同，不同之处在于将实施例1步骤S3中的消化酶体系换成：取一只干净的美天旎C管，加入2.325mL缓冲液A，62.5μL消化酶R，100μL消化酶D，12.5μL消化酶A(所述消化酶配制、用量均按照多组织消化酶试剂盒(Multi TissueDissociation Kit 1)说明书来操作)。
对比例4
该方法与实施例1的制备方法相同，不同之处在缺少实施例1步骤S5这一过程。
需要说明的是，对比例1-4使用的眼角膜及角膜缘组织来源相同，所使用的眼角膜及角膜缘组织均分成5份，分别用于实施例1和对比例1-4中单细胞悬液的制备。
实施例2
取实施例1和对比例1-4中制备得到的单细胞悬液10μL，加入到Countstar细胞计数分析仪中进行检测，获得细胞存活率、总细胞浓度、活细胞浓度、死细胞浓度、总细胞个数、活细胞个数、死细胞个数、平均直径、细胞荧光染色图等指标，实施例1中制备的单细胞悬液在倒置显微镜下明场(未加染色)观察的细胞见图1中的BR谱图，实施例1中制备的单细胞悬液活细胞AO荧光染色图见图1中的FL1谱图，实施例1中制备的单细胞悬液死细胞PI荧光染色图见图1中的FL2谱图，实施例1中制备的细胞融合AO/PI荧光染色图见图1中的融合谱图，实施例1和对比例1-4中制备得到的单细胞悬液其他指标见表1：
表1单细胞悬液性质
同实施例1相比，根据对比例1方法解离得到的细胞浓度太低，比本发明浓度低一个数量级，其总体细胞活性＜90％，远远达不到单细胞研究上机建库要求；与本发明的制备方法相比存在以下缺点：该酶消化过后有大体积团状透明纤维聚集，不能够有效去除细胞碎片及杂质，从而严重影响细胞计数和活性。
同实施例1相比，根据对比例2方法解离得到的细胞浓度比较低，细胞活性较低，总体细胞活性＜90％，并且此方案得到的单细胞中红细胞比例及杂质偏多，而角膜及角膜缘细胞较少，测序研究可行性及结果准确性严重受限；与本发明的制备方法相比存在以下缺点：1.该方法操作过程需要自己摸索不同条件，如消化时间、过滤器大小及过滤次数等，费时费力。尤其是胰蛋白酶的消化效果剧烈，不容易掌握消化时间。2.推荐的消化时间相对较长，超过3小时容易导致消化过度，不适合眼角膜的消化解离。3.此方法中没有裂解红细胞的相关步骤，导致所得细胞悬液中红细胞比例过高，严重影响计数分析。4.此方案建议在消化的同时通过移液枪或研磨方式分散细胞，此操作方法会对细胞造成巨大破坏，影响细胞活性。5.组织处理欠佳，角膜缘无捣碎过程，整个碎块正常消化完毕需3小时以上，长时间消化则会导致消化不均匀和过度消化。
同实施例1相比，根据对比例3方法解离得到的细胞浓度太低，其总体细胞活性＜90％，远远达不到单细胞研究上机建库要求；与本发明相比，对比例3中使用的是另外一种消化酶体系，这种消化酶的消化能力没有本发明中的消化酶的消化能力强，因此，得到的细胞浓度低，整体细胞活性也比较低。
同实施例1相比，根据对比例4方法解离得到的细胞浓度比本发明高，这是因为对比实施例4得到的单细胞中红细胞比例及杂质偏多，虽然总体活性达到89.09％，但因为缺少红细胞裂解步骤，对比例中红细胞和杂质偏多，这些红细胞和杂质会干扰后续单细胞悬液的应用，因此，在制备单细胞悬液的过程中，需要有对红细胞去除步骤。
以上所述，仅为本发明较佳实施例但本发明绝不局限与此，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，取样及转运：将离体的眼角膜及角膜缘组织快速浸泡入装有人组织移植保存液中的容器中，所述容器置于冰上并加保温棉隔离保存运输，保存及转运时间不超过48h；
S2，漂洗：将步骤S1中的眼角膜及角膜缘组织用不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液清洗，去除所述眼角膜及角膜缘组织的周围组织和残渣；
S3，消化：将步骤S2中得到的眼角膜及角膜缘组织剪碎，并加入消化酶，放入摇床进行震荡消化；
S4，终止消化及过滤：向步骤S3中的组织消化液中加入含血清的PBS缓冲液终止消化，过滤、离心富集细胞，回收沉淀；
S5，裂解红细胞并过滤：向步骤S4中的沉淀中加入红细胞裂解液，待裂解充分后，进行过滤、离心，得到细胞沉淀；
S6，纯化及重悬细胞：将步骤S5中的细胞沉淀进行洗涤纯化过程，清除坏死细胞，然后用PBS缓冲液洗重悬细胞，制得眼角膜及角膜缘单细胞悬液；
S7，细胞计数及检测：取步骤S6中制得的眼角膜及角膜缘单细胞悬液加到Countstar细胞计数分析仪中进行检测，得到单细胞悬液的性能指标数据。
2.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的移植保存液为含有质量浓度为10％胎牛血清的HBSS缓冲液或者角膜移植片保存液中的一种。
3.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中眼角膜及角膜缘组织剪碎具体操作如下：用生理盐水或者PBS缓冲液中的一种沾湿纱布并紧密包裹眼球巩膜部分，暴露角膜部分；用手术刀或者针头刺破角膜缘外缘，将角膜剪开、并深入该切口，沿角膜缘外缘剪下角膜，将所述角膜放入不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液中，剪碎成浆糊状。
4.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中消化具体步骤为：将剪碎的眼角膜及角膜缘组织加入到含有消化酶的缓冲液体系中，摇匀，置于摇床中震荡消化30-45分钟，摇床运行参数为37℃、150rpm。
5.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中过滤器的筛网粒径为40μm，所述离心的具体条件为：4℃、1200rpm，离心5min。
6.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中过滤器的筛网粒径为40μm，所述离心的具体条件为：4℃、1200rpm，离心5min。
7.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中重悬细胞具体操作过程为：用含有质量浓度为2％胎牛血清的PBS缓冲液重悬细胞沉淀，然后过滤、离心，重复2次，最后制得眼角膜及角膜缘单细胞悬液。
8.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中单细胞悬液的性能指标数据包括：细胞活率、总细胞浓度、活细胞浓度、死细胞浓度、总细胞个数、活细胞个数、死细胞个数、平均直径。
9.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S1-S6均在无菌条件下操作，制得单细胞悬液，所述单细胞悬液用于原代细胞的培养。
10.一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液，其特征在于，所述眼角膜及角膜缘单细胞悬液是根据权利要求1-9项中任一项所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法所制得。
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