CN105219703A - 一种角膜缘干细胞的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及一种角膜缘干细胞的分离方法。本发明将中性蛋白酶和IV胶原酶组合，使角膜缘组织在复合酶的共同作用下酶解，从而保证短时间内酶解获得细胞、减少对细胞的损伤，增大细胞得率，提高了所得细胞的纯度。该方法操作简便，不需要高端的仪器设备，对细胞的损伤也较小。实验表明，采用本发明提供的方法，每1cm³角膜缘组织能够获得8.4×10⁵个～9.0×10⁵个角膜缘干细胞，细胞中抗体CX43的阳性率为57.4％±10.6％，AE5的阳性率为56.5％±18.1％，BrdU的阳性率为21.5％±18.1％，PCNA的阳性率为69.3％±7.2％。该效果显著优于现有技术。

Description

一种角膜缘干细胞的分离方法

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及一种角膜缘干细胞的分离方法。

背景技术

角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分，与角膜鉴别的标志是Bowman氏膜的终止处；与结膜的鉴别标志是不含杯状细胞，宽约1mm，此处仅有上皮层和基质层，其上皮细胞层超过10层，排列不规则，细胞呈小的圆柱状，核深染，其深部基底细胞为一层小圆柱状或立方形细胞，细胞核为卵圆形，与表面平行.在基底部乳头形成，形成特殊的“栅栏”样上皮结构，其中含有色素和丰富的血管网，并与基底膜联系紧密。

角膜缘干细胞是角膜缘细胞的一个亚群，具有独特的生物学特性：生存期长，分化度低，细胞周期长，DNA合成期短，具有高度的分化和增殖潜能等。干细胞分裂产生两个子细胞，一个保持母细胞表型，继续成为干细胞，另一个演化为具有细胞功能的上皮细胞。在自身更新的组织内干细胞被认为是细胞谱系的起源，同时也是细胞增殖和分化的源泉。

目前开展的角膜缘干细胞移植，包括自体或异体角膜缘组织移植和体外培养的角膜缘干细胞移植。自体角膜缘组织移植，当取供眼角膜缘组织超过2/3周，可导致供眼角膜缘干细胞缺陷，继而引起眼表病变。而且，如果当自体眼已处于亚临床状态时，取材后供眼眼表病变则会加重，进而引起视力下降。此外，自体角膜缘组织移植不适合双眼角膜缘病变的患者。异体角膜缘组织移植存在排斥反应。因此，采用体外培养的角膜缘干细胞移植联合穿透性角膜移植治疗严重的角膜病变，近年来成为人们关注的热点。

角膜缘干细胞的分化阶段大体上分为：角膜缘干细胞(LimbalStemCells，LSCs。在角膜缘基底部的最基层)→短暂扩充细胞(TranscientAmplifyingCell，TAC。在角膜缘的基底部)→有丝分裂后细胞(PostMitoticCells，PMS。位于角膜上皮大多数非表面的区域)→终末分化细胞(TerminallyDifferentiatedCell，TDC。上皮细胞主要位于角膜的浅表)。现在普遍认为，角膜上皮细胞的更新是通过垂直向前的运动和水平向心的运动的方式共同作用实现的，而角膜缘干细胞LSCs则成为其再生的最终源泉。

对于角膜缘干细胞的原代获取，目前已有的分离方法主要有两种：(1)酶消化法。用胰蛋白酶对用含双抗PBS漂洗干净并获取角膜缘组织进行消化，直至细胞分离出来，过筛，离心并接种培养。(2)组织块贴壁法。分别用含双抗的PBS漂洗干净人角膜缘组织，眼科剪把角膜缘组织剪碎成2×2mm³组织块，用培养基接种于培养皿中进行培养。

现有的角膜缘干细胞的原代分离方法中的酶消化法技术，虽然能在短时间内获得数量较多的细胞，但是胰蛋白酶对细胞的贴壁产生影响，在后期分离过程中导致成纤维细胞不易贴壁，使其混在为贴壁的角膜缘细胞中，降低了细胞的纯度。并且，成纤维细胞及其分泌的产物可促进上皮细胞的增殖，刺激角膜缘干细胞向上皮细胞分化，降低了细胞的纯度。

因此，应当进一步开发分离效率高，所得细胞纯度高的角膜缘干细胞的分离方法。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种角膜缘干细胞的分离方法，本发明提供的方法分离效率高，所得细胞纯度良好。

本发明提供的角膜缘干细胞的分离方法，包括以下步骤：

步骤1：将胎儿角膜缘组织以复合酶酶解；

步骤2：将酶解后的产物以培养液培养20h～30h，取未贴壁细胞；

步骤3：将未贴壁细胞以培养液培养、传代；

培养液为含有FBS的DMEM培养液；

复合酶包括中性蛋白酶和IV胶原酶。

本发明将中性蛋白酶和IV胶原酶组合，使角膜缘组织在复合酶的共同作用下酶解，从而保证短时间内酶解获得细胞、减少对细胞的损伤，增大细胞得率。并且，采用本发明提供的复合酶对角膜缘组织进行酶解，对成纤维细胞贴壁效果的影响较小，从而提高了所得细胞的纯度。该方法仅酶解一次，避免了多次酶解多次离心对细胞造成的损伤。

在本发明的实施例中，胎儿角膜缘干细胞取自死亡的胎儿。

在本发明的实施例中，胎儿为兔、大鼠或人类胎儿。

在一些实施例中，胎儿为人类胎儿。

在一些实施例中，人类胎儿的胎龄为3个月～7个月。

在本发明的实施例中，复合酶中中性蛋白酶和IV胶原酶的质量比为3:2～2:1。

在一些实施例中，复合酶中中性蛋白酶和IV胶原酶的质量比为3:2。

在本发明的实施例中，复合酶中中性蛋白酶的质量分数为0.75％～0.8％；IV胶原酶的质量分数为0.4％～0.5％。

在一些实施例中，复合酶中中性蛋白酶的质量分数为0.75％；IV胶原酶的质量分数为0.5％。

在本发明的实施例中，复合酶与胎儿角膜缘组织的体积比为1:5。

在本发明的实施例中，复合酶酶解的温度为37℃，时间为10min～20min。

在一些实施例中，复合酶酶解的时间为15min。

在本发明的实施例中，复合酶以PBS配制，pH值为7.2。

在一些实施例中，PBS溶液各组分的含量为：NaCl7.9g/L，KCl0.2g/L，KH₂PO₄0.24g/L和K₂HPO₄1.8g/L。

在本发明的实施例中，复合酶酶解的终止液为含有FBS的PBS。

在一些实施例中，复合酶酶解的终止液中FBS的体积分数为10％。

在本发明的实施例中，步骤2中所述培养的接种密度为1×10⁵cell/ml。

在一些实施例中，步骤2中所述培养的条件为5％CO₂、37℃、湿度95％。

在一些实施例中，步骤2中所述培养的时间为24h。

本发明利用成纤维细胞与眼角膜干细胞的贴壁时间不一致，去除成纤维细胞，提高细胞纯度。该方法操作简便，不需要高端的仪器设备，对细胞的损伤也较小。

在本发明的实施例中，步骤3中所述培养的接种密度为1×10⁵cell/ml。

在一些实施例中，步骤3中所述培养的条件为5％CO₂、37℃、湿度95％。

在一些实施例中，步骤3中所述培养至细胞汇合度为80％。

在本发明的实施例中，培养液中FBS的体积分数为10％。

在本发明的实施例中，传代具体为：以胰蛋白酶消化细胞后，以含有10％FBS的DMEM培养基培养。

本发明将中性蛋白酶和IV胶原酶组合，使角膜缘组织在复合酶的共同作用下酶解，从而保证短时间内酶解获得细胞、减少对细胞的损伤，增大细胞得率。并且，采用本发明提供的复合酶对角膜缘组织进行酶解，对成纤维细胞贴壁效果的影响较小，从而提高了所得细胞的纯度。本发明利用成纤维细胞与眼角膜干细胞的贴壁时间不一致，去除成纤维细胞，提高细胞纯度。该方法操作简便，不需要高端的仪器设备，对细胞的损伤也较小。

实验表明，采用本发明提供的方法，每1cm³角膜缘组织能够获得8.4×10⁵个～9.0×10⁵个角膜缘干细胞，细胞中抗体CX43的阳性率为57.4％±10.6％，AE5的阳性率为56.5％±18.1％，BrdU的阳性率为21.5％±18.1％，PCNA的阳性率为69.3％±7.2％。该效果显著优于现有技术。

具体实施方式

本发明提供了一种角膜缘干细胞的分离方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

复合酶液：以PBS配制，0.75％中性蛋白酶+0.50％Ⅳ胶原酶，pH7.2

培养基：90％DMEM培养基+10％FBS

将胎龄为3～7个月死亡胎儿的眼球于无菌环境中用含双抗(青霉素-链霉素，1×)的PBS浸泡3min，再用不含双抗的PBS冲洗干净。

在手术显微镜下，用组织镊和角膜剪剪取人角膜缘组织，再用剪刀把组织剪碎成约1mm³大小的块状。

根据组织块的体积，每1cm³组织块加入5ml复合酶液，37℃消化15min，每1ml消化液加入含10％FBS的PBS中止消化，用100um网筛过滤，1000rpm离心5min，弃除上清，加入培养基，以1×10⁵cell/ml的密度接种至培养皿中，置于37％℃，含5％CO2培养箱中培养。

每个细胞培养皿底层汇合度至80％，去除培养皿上的上清培养液，加入胰蛋白酶，消化5～10min，每1ml消化液加入含10％FBS的PBS中止消化，以加入培养基，以1×10⁵cell/ml的密度接种至新的培养皿中，置于37％℃，含5％CO₂培养箱中传代培养。

实施例2

复合酶液：以PBS配制，0.8％中性蛋白酶+0.4％Ⅳ胶原酶，pH7.2

培养基：90％DMEM培养基+10％FBS

将胎龄为3～7个月死亡胎儿的眼球于无菌环境中用含双抗(青霉素-链霉素，1×)的PBS浸泡3min，再用不含双抗的PBS冲洗干净。

在手术显微镜下，用组织镊和角膜剪剪取人角膜缘组织，再用剪刀把组织剪碎成约1mm³大小的块状。

根据组织块的体积，每1cm³组织块加入5ml复合酶液，37℃消化10min，每1ml消化液加入含10％FBS的PBS中止消化，用100um网筛过滤，1000rpm离心5min，弃除上清，加入培养基，以1×10⁵cell/ml的密度接种至培养皿中，置于37％℃，含5％CO2培养箱中培养。

每个细胞培养皿底层汇合度至80％，去除培养皿上的上清培养液，加入胰蛋白酶，消化5～10min，每1ml消化液加入含10％FBS的PBS中止消化，以加入培养基，以1×10⁵cell/ml的密度接种至新的培养皿中，置于37％℃，含5％CO₂培养箱中传代培养。

实施例3

复合酶液：以PBS配制，0.78％中性蛋白酶+0.45％Ⅳ胶原酶，pH7.2

培养基：90％DMEM培养基+10％FBS

将胎龄为3～7个月死亡胎儿的眼球于无菌环境中用含双抗(青霉素-链霉素，1×)的PBS浸泡3min，再用不含双抗的PBS冲洗干净。

在手术显微镜下，用组织镊和角膜剪剪取人角膜缘组织，再用剪刀把组织剪碎成约1mm³大小的块状。

根据组织块的体积，每1cm³组织块加入5ml复合酶液，37℃消化20min，每1ml消化液加入含10％FBS的PBS中止消化，用100um网筛过滤，1000rpm离心5min，弃除上清，加入培养基，以1×10⁵cell/ml的密度接种至培养皿中，置于37％℃，含5％CO2培养箱中培养。

每个细胞培养皿底层汇合度至80％(约96h)，去除培养皿上的上清培养液，加入胰蛋白酶，消化5～10min，每1ml消化液加入含10％FBS的PBS中止消化，以加入培养基，以1×10⁵cell/ml的密度接种至新的培养皿中，置于37％℃，含5％CO₂培养箱中传代培养。

对比例1～6

培养基皆采用：DMEM培养基+10％FBS

酶解消化液分别为：

对比例1：0.25％胰蛋白酶(以PBS溶液配制，pH值为7.2)，消化15min；

对比例2:1.25％中性蛋白酶(以PBS溶液配制，pH值为7.2)，消化15min；

对比例3:1.25％胶原酶(以PBS溶液配制，pH值为7.2)，消化15min；

对比例4：先使用1％中性蛋白酶(以PBS溶液配制，pH值为7.2)消化16小时后，再使用0.1％Ⅳ胶原酶(以PBS溶液配制，pH值为7.2)消化18小时；

对比例5：先使用0.75％中性蛋白酶(以PBS溶液配制，pH值为7.2)消化15min后，再使用0.5％Ⅳ胶原酶(以PBS溶液配制，pH值为7.2)消化15min；

对比例6：先使用0.5％Ⅳ胶原酶(以PBS溶液配制，pH值为7.2)消化15min后，再使用0.75％中性蛋白酶(以PBS溶液配制，pH值为7.2)消化15min；

将胎龄为3～7个月死亡胎儿的眼球于无菌环境中用含双抗(青霉素-链霉素，1×)的PBS浸泡3min，再用不含双抗的PBS冲洗干净。

在手术显微镜下，用组织镊和角膜剪剪取人角膜缘组织，再用剪刀把组织剪碎成约1mm³大小的块状。

根据组织块的体积，每1cm³组织块加入5mL酶解消化液，37℃消化，每1ml消化液加入含10％FBS的PBS中止消化，用100um网筛过滤，1000rpm离心5min，弃除上清，加入培养基，以1×10⁵cell/ml的密度接种至培养皿中，置于37％℃，含5％CO2培养箱中培养。

每个细胞培养皿底层汇合度至80％(约96h)，去除培养皿上的上清培养液，加入胰蛋白酶，消化5～10min，每1ml消化液加入含10％FBS的PBS中止消化，以加入培养基，以1×10⁵cell/ml的密度接种至新的培养皿中，置于37％℃，含5％CO₂培养箱中传代培养。

实施例4

对实施例1～3及对比例1～6传代前的细胞(即P0代)进行计数；每组计数重复3次，平均值记录如表1：

表1实施例1～3、对比例1～6分离的P0代细胞计数

注：同行肩标不同字母示p<0.01

结果显示，本发明提供的方法获得的细胞数量显著高于对比方法。

实施例5

对实施例1～3及对比例1～6传代培养1次后的细胞进行流式细胞检测表面标志物的阳性表达率，流式检测检测细胞表面标志物具体方法为：

1.取同一批次的P2代细胞，三个样品的平行试验，进行、消化，终止、重悬，取1×10⁶cells，平均分至2个EP管中，一管作为对照，1500rpm/min离心5min，弃上清。

2.加入1mL染色缓冲液(含10％FBS的PBS)重悬细胞，1500rpm/min离心5min，弃上清。重复以上步骤1次。

3.弃上清后，每管加入200μL染色缓冲液重悬，样本组分别加入2μL特异性识别的碱性角蛋白抗体(AE5)、缝隙连接蛋白抗体(CX43抗体)、DNA聚合酶δ的辅助蛋白抗体(PCNA)和BrdU抗体。避光孵育20min。

4.加入500μL染色缓冲液重悬，1500rpm/min离心5min洗掉剩余抗体。

5.弃上清，加入500μL上样缓冲液(10％FBS+1640培养基)，过200目筛，上机检测。结果如表2：

表2实施例1～3、对比例1～6分离的P2代细胞流式检测

注：同行肩标不同字母示p<0.01

抗体AE5角膜成纤维细胞的表面标志性抗体，CX43角膜干细胞为阴性表达，PCNA抗体阳性证明该细胞具有很强的增殖能力，间接表明角膜干细胞的极强的增殖力，BrdU抗体阳性表明细胞具有长生长周期，符合角膜干细胞低分化长周期的特点。综上所述，实施例1-3中分离出的细胞为角膜缘干细胞。而数据无差异性证明该保护参数范围内，均能有效分离出角膜缘干细胞。实施例组和对比例1-6中的数据均有明显差异(P<0.01)，证明对比例的方法中不能有效分离出角膜缘干细胞或者掺杂着其他细胞。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种角膜缘干细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将胎儿角膜缘组织以复合酶酶解；

步骤2：将所述酶解后的产物以培养液培养20h～30h，取未贴壁细胞；

步骤3：将所述未贴壁细胞以培养液培养、传代；

所述培养液为含有FBS的DMEM培养液；

所述复合酶包括中性蛋白酶和IV胶原酶。

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述复合酶中，中性蛋白酶和IV胶原酶的质量比为3:2～2:1。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述复合酶中，中性蛋白酶的质量分数为0.75％～0.8％；IV胶原酶的质量分数为0.4％～0.5％。

4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述复合酶与胎儿角膜缘组织的体积比为1:5。

5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述复合酶酶解的温度为37℃，时间为10～20min。

6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述复合酶以PBS配制，pH值为7.2。

7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述复合酶酶解的终止液为含有FBS的PBS。

8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤2中所述培养的接种密度为1×10⁵cell/ml。

9.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤3中所述培养的接种密度为1×10⁵cell/ml。

10.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述培养液中FBS的体积分数为10％。