CN105441391A - 一种糖尿病并发抑郁症的细胞模型及建立方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种糖尿病并发抑郁症细胞模型的建立方法：向培养海马神经元的培养基中加入终浓度为50-200mmol/L葡萄糖和100-400μmol/L皮质酮，干预培养所述海马神经元18-24h，即得所述细胞模型。通过一般形态学观察、HE染色、葡萄糖消耗量检测、细胞内神经递质检测、MTT法检测、流式细胞仪技术、Hoechst荧光染色法和TUNEL染色法对所述模型进行了评价，显示该模型效果良好，可用于糖尿病并发抑郁症的病理生理研究或发病机制研究或体外药物筛选或药物评价。

Description

一种糖尿病并发抑郁症的细胞模型及建立方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种糖尿病并发抑郁症的细胞模型及建立方法和应用。

背景技术

糖尿病是一种常见的慢性代谢性疾病，并发症多，2013年世界卫生组织调查显示，全世界约3.47亿糖尿病患者，糖尿病患者抑郁症的发生率为8.5％～71.4％，该比例为非糖尿病患者的2～3倍，糖尿病并发抑郁症(Diabetesmellituswithdepression,DD)患者自杀危险率高达10％，远高于普通人群的10-30/10万人，因此糖尿病并发抑郁症越来越被人们所关注，并开始成为严重危害人类健康的疾病之一。

但目前尚无一种其体外的细胞模型能够模拟人类DD的临床症状与体征，故极大限制了DD的病理生理研究、发病机制研究、体外药物筛选和药物评价等。

现有与糖尿病和/或抑郁症相关的细胞模型的技术介绍如下：

1、一种GLP-1受体稳定高表达细胞系的建立及其应用(申请号201210107064.2)：该发明涉及一种糖尿病的细胞模型，建立了一种GLP-1受体稳定高表达细胞系，并提供了一种筛选预防和/或治疗I型及II型糖尿病的药物的细胞模型。但该发明主要针对胰岛素调控的细胞模型，不能全面而整体模拟DD的特点，另只是局限于糖尿病单病的细胞模型。

2、一种用于筛选抗糖尿病药物的细胞模型(申请号200710203168.2)：该发明涉及一种用于筛选抗糖尿病药物的细胞模型，将分别装载有IR基因的编码序列、STAT5B基因的编码序列、2～10个串联的STAT5B应答元件DNA序列调控的报告基因编码序列的表达载体共转染哺乳动物细胞，经稳定筛选后得到上述细胞模型。但该发明主要用于抗糖尿病药物的筛选，另亦局限于糖尿病单病的细胞模型。

关于抑郁症的细胞模型和糖尿病并发抑郁症的细胞模型，迄今暂未见人报道或申请相关发明专利。因此，本领域急需建立一种糖尿病并发抑郁症的细胞模型，这对于DD的病理生理研究、发病机制研究、体外药物筛选和药物评价等，均具有广泛的意义。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷和不足，本发明的第一个目的是提供一种糖尿病并发抑郁症细胞模型。

本发明的第二个目的是提供上述糖尿病并发抑郁症细胞模型的建立方法。

本发明的第三个目的是提供上述糖尿病并发抑郁症细胞模型在糖尿病并发抑郁症的病理生理研究或发病机制研究或体外药物筛选或药物评价中的应用。

其中，糖尿病并发抑郁症细胞模型的建立方法为：向培养海马神经元的培养基中加入葡萄糖和皮质酮，干预培养所述海马神经元18-24h，即得所述细胞模型。

为了得到良好的细胞模型，所述葡萄糖的加入量优选为50-200mmol/L，所述皮质酮的加入量为100-400μmol/L。所述葡萄糖的加入量进一步优选为150mmol/L，所述皮质酮的加入量进一步优选为200μmol/L。

本发明所述海马神经元来自受孕大鼠的胎鼠，进一步优选受孕16-18天的SD大鼠的胎鼠。

所述海马神经元优选是在培养基中培养5-7天得到的。

本发明所述的海马神经元的分离、培养方法为本领域的常规技术手段，本发明提供一种改良的海马神经元原代细胞的体外培养方法，所述方法为：取受孕SD大鼠胎鼠的海马组织，并将所述海马组织机械分离成组织碎块，加入胰蛋白酶和胶原酶进行消化处理；向消化处理后的体系中加入终止培养基终止酶消化，并进行吹打处理收集上清液，过滤所述上清液收集细胞滤液，离心所述细胞滤液弃去上清液，重悬，过滤收集滤液，并向所述滤液中加入接种培养液重悬细胞，调整细胞浓度后接种于细胞培养板，培养3-5h后替换所述接种培养液为维持培养液培养，培养3-5天后，选择性加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞，继续培养至5-7天，即得。

其中，所述的终止培养基为本领域常规的培养基，本发明优选采用如下的培养基配方：体积分数89％DMEM/F12、10％FBS和1％双抗。

所述的接种培养基也为本领域常规的培养基，本发明优选采用如下的培养基配方：体积分数87％DMEM/F12、10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％B27和1％双抗。其中，所述FBS为胎牛血清。

所述的维持培养基也为本领域常规的培养基，本发明优选采用包含如下组分的培养基：Neurobasal、B27、Glutamax、双抗，进一步优选采用体积分数为96％Neurobasal、2％B27、1％Glutamax、1％双抗的培养基。采用此种培养基的优点是：用Glutamax代替传统培养基中的L-谷氨酰胺，可降低因培养过程中L-谷氨酰胺分解释放毒性胺类物质对神经元造成的损伤作用。

附图说明

图1为评价方法1的实验结果。图中：A为正常对照组；B为高糖组；C为皮质酮组；D为高糖联合皮质酮组。

图2为评价方法2的实验结果。图中：A为正常对照组；B为高糖组；C为皮质酮组；D为高糖联合皮质酮组。

图3为评价方法5的实验结果。

图4为评价方法6的实验结果。图中：A为阴性对照组；B为正常对照组；C为高糖组；D为皮质酮组；E为高糖联合皮质酮组。

图5为评价方法6的实验结果。

图6为评价方法7的实验结果。图中：A为正常对照组；B为高糖组；C为皮质酮组；D为高糖联合皮质酮组。

图7为评价方法8的实验结果。图中：A为正常对照组；B为高糖组；C为皮质酮组；D为高糖联合皮质酮组。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1海马神经元原代细胞的体外培养

实验前日将细胞培养板预先用40mg/ml的L-多聚赖氨酸包被，实验当日吸除培养板内的多聚赖氨酸，并以PBS轻轻冲洗3次，净化工作台内自然晾干，备用。将受孕18天的SD大鼠，用10％水合氯醛麻醉，迅速取胎鼠置于大培养皿中，75％乙醇充分消毒，眼科剪快速取全脑置于含预冷D-Hanks的小培养皿中，充分清洗干净，然后于体视显微镜下用弯头镊小心向外侧掀开大脑皮质表面，即可见清晰“弓形”海马，左右各一，小心夹取海马并将其从边缘组织分离。将新剥离的海马迅速投入另一含预冷DMEM/F12的小培养皿中，仔细剔除残留的脑膜和血管，将海马组织剪成1mm³左右的组织碎块，然后加入等体积的0.25％胰蛋白酶和0.2％胶原酶，混匀，37℃消化15～20min，每隔5min混匀一次，消化至无明显组织沉淀，加入终止培养液(体积分数89％DMEM/F12、10％FBS和1％双抗)终止酶消化，轻轻吹打30～50次，收集上清液，用100目筛网过滤，收集细胞滤液，1200r/min离心5min，弃上清，重悬，200目筛网过筛，加入接种培养液(体积分数87％DMEM/F12、10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％B27和1％双抗)中重悬细胞，调整细胞密度为3.0×105/mL，接种于96孔或24孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO₂三气细胞培养箱中培养，4h后全量换成维持培养液(体积分数96％Neurobasal、2％B27、1％Glutamax和1％双抗)，以后每隔3天半量更换维持培养液。同时于培养的3～5d后酌情加入终浓度为5μM的阿糖胞苷以抑制胶质细胞。并于接种后4h、24h、5day、8day分别观察海马神经元的基本形态结构，胞体、突起及神经网络情况，备用。

为了检验本发明糖尿病并发抑郁症细胞模型的优劣，以下分别通过建立不同模型，并对所述模型进行评价的方式进行论述。其中所述高糖联合皮质酮组即本发明所述的糖尿病并发抑郁症细胞模型组。所述终浓度为加入葡萄糖或皮质酮后，葡萄糖或皮质酮在培养体系中的浓度。

评价方法1：形态学观察

模型建立：取生长至5-7天的海马神经元，将细胞分为正常对照组、高糖组、皮质酮组、高糖联合皮质酮组，每组设3个复孔，按以上分组详情加入药物，其中高糖组加入终浓度为150mM的葡萄糖，皮质酮组加入终浓度为200μM的皮质酮，高糖联合皮质酮组则加入终浓度为150M的葡萄糖和200μM的皮质酮，干预24h，然后在倒置光学显微镜下对上述干预条件下的海马神经元细胞进行一般形态学观察。

实验结果显示：正常对照组海马神经元胞体呈类圆形，周围光晕明显，树突丰富，分叉较多，彼此连接形成丰富的神经元网络；而高糖组、皮质酮组、高糖联合皮质酮组均呈现不同程度的细胞胞体裂解破碎，立体感消失，细胞轮廓模糊，细胞碎片较多，神经网络大部分断裂，且高糖联合皮质酮组细胞损伤更明显(详见图1)

评价方法2：HE染色

模型建立：取生长至5-7天的海马神经元(预先将其均匀接种在放有14mm圆形盖玻片的24孔板中)，将细胞分为正常对照组、高糖组、皮质酮组、高糖联合皮质酮组，每组设3个复孔，按以上分组详情加入药物，其中高糖组加入终浓度为75mM的葡萄糖，皮质酮组加入终浓度为100μM的皮质酮，高糖联合皮质酮组则加入终浓度为75M的葡萄糖和100μM的皮质酮，干预24h。

HE染色：进行如下操作：①弃掉细胞孔内液体，PBS洗3次；②4％的多聚甲醛泡15min后，PBS洗2次，每次1min；③浸入苏木素染液，染色6min，PBS洗去多余染料；④盐酸酒精(0.5％)分色2秒，自来水洗2遍；⑤置于0.1％氨水中漂洗，直至肉眼观察玻片为蓝紫色；⑥伊红染液浸泡30秒，自来水清洗去多余染料；⑦置于空气中干燥，二甲苯透明，中心树胶封片；⑧倒置显微镜下观察细胞形态。

实验结果显示：经HE染色后，镜下观察发现，正常组海马神经元细胞细胞核成卵圆形，极少数成梭形，且细胞质、细胞核界线分明；葡萄糖组、皮质酮组及葡萄糖联合皮质酮组均有不同程度损伤，绝大多数细胞核呈梭形，后一组比前两组损伤更严重，近半数海马神经元细胞的细胞核、细胞质界线模糊。(详见图2)

评价方法3：葡萄糖消耗量

模型建立：采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(GOD-POD)法检测不同干预条件下海马神经元细胞葡萄糖消耗量，该指标可用于评价受试细胞是否产生胰岛素抵抗(InsulinResistance,IR)。操作步骤如下：①将分离好的大鼠海马神经元细胞接种至96孔板中，接种密度为2×10⁴个细胞/孔,每孔加入200uL细胞维持培养液(边缘孔用无菌DMEM/F12培养基填充)；②5％CO2，37℃孵育，至细胞完全贴壁，接种第7d，将细胞分为正常对照组、高糖组、皮质酮组、高糖联合皮质酮组，按实验分组要求对细胞进行药物干预，其中高糖组加入终浓度为75mM的葡萄糖，皮质酮组加入终浓度为100μM的皮质酮，高糖联合皮质酮组则加入终浓度为75M的葡萄糖和100μM的皮质酮，每组4个复孔；③5％CO2，37℃分别孵育2h、6h、12h、18h、24h，同时置于倒置显微镜下观察；④按照时间点收集各组细胞培养液，在37℃保温10min，用葡萄糖测定试剂盒在酶标仪上检测培养液OD505(理论计算公式：C样本＝△A样本/△A校准×C校准，其中:C校准＝5.55mM/L)。

在实验过程中，我们分别检测了葡萄糖和/或CORT刺激后五个时间点(2h、6h、12h、18h、24h)的培养上清葡萄糖浓度，结果显示：正常组(25mmo1/L)24h后葡萄糖浓度降低值为2.74mmo1/L，与2h时葡萄糖浓度相比明显降低(P<0.05)；其余三个组随时间的延长均有不同程度的降低，但降低程度各有不同。与正常组相比，葡萄糖组和葡萄糖联合皮质酮组在各个对应时间点葡萄糖浓度降低值皆有显著差异(P<0.01)，皮质酮组葡萄糖浓度降低值均小于同一时间点的正常组，但并不具有统计学差异(P>0.05)。与葡萄糖组、皮质酮组比较，除2h时外，葡萄糖联合皮质酮组其余各个对应时间点葡萄糖浓度降低值皆有显著差异(P<0.01)。(详见下述表1和表2)。

表1各组不同时间点培养基中葡萄糖浓度

注：与正常组比较*P﹤0.05，**P﹤0.01；与葡萄糖组比较#P≤0.05，##P≤0.01；与皮质酮组比较▲P≤0.05，▲▲P≤0.01

表2各组不同时间点培养基中葡萄糖浓度降低值(n＝4)

注：与正常组比较*P﹤0.05，**P﹤0.01；与葡萄糖组比较#P≤0.05，##P≤0.01；与皮质酮组比较▲P≤0.05，▲▲P≤0.01

评价方法4：细胞内神经递质检测

模型建立：采用酶联免疫吸附测定(Elisa)检测细胞内神经递质NE、DA、5-HT的含量，这些指标可用于评价受试细胞是否产生抑郁样指标特征。具体操作如下所述：取生长至5-7天的海马神经元，将细胞分为正常对照组、高糖组、皮质酮组、高糖联合皮质酮组，每组设4个复孔，按以上分组详情加入药物，其中高糖组加入终浓度为75mM的葡萄糖，皮质酮组加入终浓度为100μM的皮质酮，高糖联合皮质酮组则加入终浓度为75mM的葡萄糖和100μM的皮质酮，干预24h，预冷PBS洗涤3次，加入含PMSF的RIPA细胞裂解液，于4℃无菌冰盒上作用1小时，12000离心15min，收集上清液，然后严格按照Elisa试剂盒说明测定细胞内神经递质NE、DA、5-HT的含量。

实验结果提示：与正常组比较，葡萄糖组海马神经元细胞内5-HT含量降低，差异无统计学意义(P>0.05)，DA、NE含量降低，差异有统计学意义(P<0.01)；皮质酮组、葡萄糖联合皮质酮组海马神经元细胞内DA、NE、5-HT含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与葡萄糖组比较，皮质酮组、葡萄糖联合皮质酮组海马神经元细胞内DA、NE、5-HT含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。(详见下述表3)。

表3各组海马神经元细胞内5-HT、DA、NE含量变化

注：与正常组比较*P≤0.05，**P≤0.01；与葡萄糖组比较#P≤0.05，##P≤0.01；与皮质酮组比较▲P≤0.05，▲▲P≤0.01

评价方法5：神经元活性-MTT法检测

模型建立：将海马神经元接种至96孔板中，待细胞长至5-7天，神经网络约80％融合程度时，除空白对照组给予等量维持培养液外，各组分别加入相应浓度的高糖(150mM)和皮质酮(200μM)，每组设3个复孔，造模干预18h，每孔加入20μLMTT，作用4h，弃液，每孔加入150μLDMSO，于水平摇床上震摇15min，最后用酶标仪于492nm波长下测定各孔OD值，并计算各组细胞的相对存活率。

实验结果显示：当细胞给予单独高糖(150mM)、皮质酮(200μM)或两者联用造模干预18h后，各组神经元细胞存活率明显降低，分别为53.1％、64.3％和56.7％，且与空白对照组相比，均有显著性差异(P<0.01)，这提示上述造模能明显降低海马神经元活性(详见图3)。

评价方法6：细胞凋亡-流式细胞仪

模型建立：将海马神经元接种至24孔板中，待细胞长至5-7天，除空白对照组给予等量维持培养液外，其余各组分别加入相应浓度的高糖(150mM)和皮质酮(200μM)，造模干预18h，弃液，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，缓缓吹打并混匀细胞，转移至1.5ml离心管中，1200r/min离心5min，弃上清，加入100μL1×AnnexinBindingBuffer重悬细胞，然后加入5μL的PI和FITCAnnexinⅴ(阴性对照组除外)，常温并避光孵育15-20min。最后每组加入400μlAnnexinBindingBuffer，轻轻混匀，备用，各样本进行流式细胞仪上机检测。

实验结果显示：阴性对照组、正常对照组、高糖组、皮质酮组、两者联用组Q3比例分别为98.5％、71.6％、47.9％、53.6％和39.2％，见Fig.4。另上述各造模干预组Q2+Q4总比例分别为46.6％，40.4％，67.0％，且与正常对照组(24.4％)比较，均有显著性差异(P<0.01或P<0.05)(详见图4和图5)。

评价方法7：细胞凋亡-Hoechst荧光染色

模型建立：将海马神经元接种至PerkinElmer黑色96孔板中，待细胞长至5-7d后，除空白对照组给予等量维持培养液外，其余各组分别加入相应浓度的高糖(150mM)和皮质酮(200μM)，18h后弃掉孔内液体，冷0.01MPBS洗2min×3次。4％多聚甲醛固定30min，弃液，冷0.01MPBS洗5min×3次。0.25％Triton-100处理15min，弃液，冷0.01MPBS洗5min×3次。每孔加入100μLHoechst33258工作液，室温避光孵育20min，弃液，冷0.01MPBS洗5min×3次，最后每孔加入50μLPBS，于高内涵成像分析系统上进行荧光检测。

实验结果显示：各组细胞经Hoechst染色后，其中正常对照组细胞发出较均匀的淡蓝色荧光，细胞核无明显凋亡特征，而高糖组、皮质酮组、两者联用组，这三者海马神经元细胞核均出现不同程度的核染色质聚集、浓缩，并发出较强的蓝白色荧光，甚至核碎裂，其中以两者联用组的细胞凋亡最严重，呈现出典型的凋亡特征(详见图6)。

评价方法8：细胞凋亡-TUNEL染色法

模型建立：将海马神经元细胞均匀接种在放有14mm圆形盖玻片的24孔板中，培养7d后，将细胞分为正常对照组、高糖组、皮质酮组、高糖联合皮质酮组，按以上分组详情加入药物，其中高糖组加入终浓度为75mM的葡萄糖，皮质酮组加入终浓度为100μM的皮质酮，高糖联合皮质酮组则加入终浓度为75mM的葡萄糖和100μM的皮质酮，干预24h后，取出培养有细胞的盖玻片置于4％的中性甲醛中固定10min，用PBS缓冲液清洗2次,严格按照TUNEL染色试剂盒操作步骤进行染色。光镜下随机取15个高倍镜视野观察，并计算凋亡细胞的百分比。

实验结果显示：正常组TUNEL染色阳性细胞极为少见，在所选取的15个视野中只见1个阳性细胞；葡萄糖组、皮质酮组阳性细胞数量有所增加，每个高倍镜视野可见2～3个阳性细胞，细胞核染呈蓝黑色，形态不规则，有的呈花瓣状，凋亡率达20.3％；葡萄糖联合皮质酮组阳性细胞较多，每个高倍镜视野可见4～5个(详见图7)。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种糖尿病并发抑郁症细胞模型的建立方法，其特征在于，向培养海马神经元的培养基中加入葡萄糖和皮质酮，干预培养所述海马神经元18-24h，即得所述细胞模型。

2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：所述葡萄糖的加入量为50-200mmol/L，所述皮质酮的加入量为100-400μmol/L；优选所述葡萄糖的加入量为150mmol/L，所述皮质酮的加入量为200μmol/L。

3.根据权利要求1或2所述的建立方法，其特征在于：所述海马神经元来自受孕大鼠的胎鼠，进一步优选受孕16-18天的SD大鼠的胎鼠。

4.根据权利要求1-3任一所述的建立方法，其特征在于：所述海马神经元是在培养基中培养5-7天得到的。

5.根据权利要求1-4任一所述的建立方法，其特征在于：所述海马神经元是通过如下方式培养得到的：取受孕SD大鼠胎鼠的海马组织，并将所述海马组织机械分离成组织碎块，加入胰蛋白酶和胶原酶进行消化处理；向消化处理后的体系中加入终止培养基终止酶消化，并进行吹打处理收集上清液，过滤所述上清液收集细胞滤液，离心所述细胞滤液弃去上清液，重悬，过滤收集滤液，并向所述滤液中加入接种培养液重悬细胞，调整细胞浓度后接种于细胞培养板，培养3-5h后替换所述接种培养液为维持培养液培养，培养3-5天后，选择性加入阿糖胞苷以抑制胶质细胞，继续培养至5-7天，即得。

6.根据权利要求5所述的建立方法，其特征在于：所述维持培养液中包含如下组分：Neurobasal、B27、Glutamax、双抗；优选各组分的体积分数为96％Neurobasal、2％B27、1％Glutamax、1％双抗。

7.一种采用权利要求1-6任一所述的建立方法得到的糖尿病并发抑郁症的细胞模型。

8.权利要求1-6任一所述建立方法得到的糖尿病并发抑郁症细胞模型或权利要求7所述的糖尿病并发抑郁症的细胞模型在糖尿病并发抑郁症的病理生理研究或发病机制研究或体外药物筛选或药物评价中的应用。