CN109913419A - 一种糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型、建立方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于一种细胞模型，具体是涉及到一种糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型、建立方法及应用，包括向四重突触共培养体系中加入葡萄糖和皮质酮，干预得到；所述四重突触共培养体系包括混合胶质细胞，位于混合胶质细胞上的海马神经元，所述混合胶质细胞包括星形胶质细胞和小胶质细胞的混合细胞，本发明用于糖尿病并发抑郁症相关疾病的病理生理研究、发病机制研究及体外药物筛选等。

Description

一种糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型、建立方法 及应用

技术领域

本发明属于一种细胞模型，具体是涉及到一种糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型、建立方法及应用。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，随着我国人口老龄化程度的不断加剧，其发病率日趋上升。据国际糖尿病联盟2017年数据统计显示，全球现有糖尿病患者约4.25亿，中国现有1.144亿，预计2045年全球糖尿病患者可达6.29亿之多，其中我国糖尿病患者约1.198亿，位居全球之首。糖尿病并发抑郁症(DiabetesMellitus with Depression，DD)以认知功能障碍为主要临床表现，是DM的常见慢性并发症之一。据最新研究结果显示，DM患者伴抑郁情绪者高达60-75％，其中重度抑郁者占10％-35％，DD患者的死亡率明显高于单纯DM患者，其正在成为严重危害人类身心健康的疾病之一。

随着研究的不断深入，我们发现DD的发病机制并不仅仅局限于单一的细胞内途径或细胞类型，其还与神经系统其他细胞之间存在紧密的联系。“Quad Partite”(四重突触)为DD的病理生理和发病机制的深入研究提供了更全面的治疗靶点，该概念的提出旨在突出突触前膜、突触后膜、星形胶质细胞和小胶质细胞在结构上紧密相连、生理条件下相互作用、病理条件下相互影响的状态，并将其置于同一个微小的三维环境中研究，为整体研究神经元损伤及保护机制、寻找临床治疗的新靶点提供了理论依据。但目前暂无一种对应的四重突触复合细胞模型用以模拟人类的临床症状与体征，极大地限制了DD的病理生理研究、发病机制研究、体外药物筛选及评价研究等的进一步开展。

中国专利申请号为201510919049.1的发明专利公开了一种糖尿病并发抑郁症的细胞模型及建立方法和应用，其采用向培养海马神经元的培养基中加入葡萄糖和皮质酮，干预培养所述的海马神经元18-24h，得到所述的细胞模型。本申请的细胞模型仅仅考察了糖尿病并发抑郁症中海马神经元的反应，体内环境的仿真度不够，难以真实反应体内的变化。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型、建立方法及应用，以用于糖尿病并发抑郁症相关疾病的病理生理研究、发病机制研究及体外药物筛选等。

本发明的内容包括包括向共培养体系中加入葡萄糖和皮质酮，干预得到；所述四重突触共培养体系包括混合胶质细胞，位于混合胶质细胞上的海马神经元，所述混合胶质细胞包括星形胶质细胞和小胶质细胞的混合细胞。

所述混合胶质细胞为星形胶质细胞和小胶质细胞融合至72-75％的混合细胞。

所述葡萄糖的浓度为150mM，所述皮质酮的浓度为200μM。

一种糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型的建立方法，包括如下步骤，首先通过体外培养海马神经元，待细胞生长至5-7天后，备用；待混合胶质细胞生长至72-75％融合后，移去孔内的大部分培养液，仅留部分培养液，将上述接种5-7d的成熟海马神经元的细胞爬片倒扣，置于细胞培养板上，最后共培养3d，即获得共培养体系；向上述共培养体系中加入葡萄糖和皮质酮，干预18-24h，得到糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型。

所述混合胶质细胞的培育方法为，取适量蜡块置于玻璃注射器内，加热使其熔化后缓慢滴加在12孔培养板内，每孔滴加三处即可，紫外照射30min，备用；

将纯化的星形胶质细胞用PBS缓冲液洗涤细胞两遍，加入0.25％胰蛋白酶消化5min，见细胞大部分收缩变圆时终止消化，1000r/min离心5min，弃上清后重悬，调整细胞密度至5×10⁵个/mL，接种于预包被的12孔培养板内，每孔内加入适量含15％FBS缓冲液的完全培养基，培养箱内继续培养3d备用；

将纯化的小胶质细胞用预冷PBS缓冲液洗涤两遍，加入0.25％胰蛋白酶消化5min后终止消化，离心，重悬，调整细胞密度至5×10⁵个/mL，接种于种有星形胶质细胞的12孔培养板内，1d后换用含5％FBS的完全培养基继续培养，得到混合胶质细胞。

所述海马神经元的培育方法为，将受孕16-18d SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉，取胎鼠全脑，解剖镜下夹取海马，并剥净残余脑膜及血管，剪碎后加胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化，离心，重悬，计数，接种于预先包被L-多聚赖氨酸的细胞培养板中，置于培养箱中4h后全量换成维持液，第3日半量更换维持液。

鉴定方法为：待神经元生长至第5日，用预冷PBS洗3次×5min，4％多聚甲醛室温固定30min，清洗后加0.25％TritonX-100溶液作用15min，再加5％BSA封闭30min，清洗，滴加兔抗大鼠神经元特异烯醇化酶(NSE)和小鼠抗大鼠β-tublin相关抗原抗体(1∶100)，4℃湿盒过夜，清洗，加FITC标记的二抗，37℃孵育1h，清洗，加细胞核染色剂DAPI室温孵育20min，清洗，最后每孔加入50μL PBS，用HCA系统观察分析。

所述星形胶质细胞的培育方法为，将新生3d的SD大鼠乳鼠处死，于75％体积浓度的酒精中消毒3-5min，无菌取出大脑后于预冷D-Hank's液中洗净血丝，仔细去除血管和脑膜，保留皮质，漂洗后剪碎成直径1mm大小并移入15mL离心管中，1000r/min离心5min后弃上清；按2:1加入0.25％胰蛋白酶37℃消化15min，以含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化后反复轻柔吹打，过150目筛网，吸取滤液并离心，再用新鲜培养液重悬，接种于25cm²细胞培养瓶中，于饱和湿度、37℃、5％CO₂培养箱中静置培养30min，翻转培养瓶吸出培养液，置于25cm²细胞培养瓶中继续培养；以后每3d换液一次；待细胞长满后将培养瓶置于水平摇床上，220r/min恒温37℃条件下振荡2h，换液以弃除脱落细胞，正常培养条件下再培养30min后，重新置于水平摇床相同条件振摇一次，弃掉培养液，正常培养基继续培养。

鉴定方法为：将培养至第2代、密度为5×10⁵个/mL的细胞混悬液接种到96孔cell-barrier培养板中。待生长基本融合后，用预冷PBS洗3次×5min，4％多聚甲醛室温固定30min，清洗后加0.25％TritonX-100溶液作用15min，再加5％BSA封闭30min，清洗，滴加兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(GFAP)相关抗原抗体(1:200)，4℃湿盒过夜，清洗，加FITC标记的二抗，37℃孵育1h，清洗，加细胞核染色剂DAPI室温孵育20min，清洗，最后每孔加入50μLPBS，用Operetta型高内涵成像分析系统观察拍照并分析。

所述小胶质细胞的培育方法为，将新生3d的SD大鼠乳鼠处死，酒精消毒，于无菌条件下迅速取全脑，置于预冷PBS缓冲液中反复清洗以去除血污，洗净后转移至另一培养皿中，于解剖镜下去除脑膜、血管、脑干、小脑、海马，去除出血点；将脑组织充分剪碎，加入500μL胶原酶、500μL 0.25％胰酶，37℃下消化15min，消化至无明显组织沉淀，终止酶消化后并转移至15mL离心管中，过筛，1500r/min离心5min，弃上清；重悬后过筛得到细胞重悬液，接种于预先包被的培养瓶中，于培养箱中培养；混合胶质细胞培养至第7-9天细胞充分分层生长后，PBS缓冲液洗2遍，加1.5mL 0.05％胰酶消化3min，细胞明显固缩，终止消化，不吹不拍，于37℃恒温摇床中150r/min振荡30min，镜下观察，待大量细胞悬浮后收集细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀重悬，调整细胞密度为4×105/cm，接种于预先包被的培养板中先涂布多聚赖氨酸的培养板中，30min后完全换液一次，以去除未贴壁细胞；之后每隔3天半量更换维持液得到。

将培养至第2代，密度为4×10⁵个/mL的细胞混悬液接种到96孔cell-barrier培养板中。待细胞状态好转后，弃掉孔内培养液用预冷的PBS洗3遍，4％多聚甲醛室温固定30min，清洗后加0.25％TritonX-100溶液作用15min，再加5％BSA封闭30min，清洗，滴加兔抗大鼠Iba-1相关抗体(1:200)，4℃湿盒过夜，清洗，加FITC标记的二抗，37℃孵育1h，清洗，加细胞核染色剂DAPI室温孵育20min，清洗，最后每孔加入50μL PBS，用Operetta型高内涵成像分析系统观察并分析。

1、海马神经元的种植

在进行原代取材前，将盖玻片(d＝15mm)置于24孔培养板内，提前用多聚赖氨酸包被好，临使用前移去多聚赖氨酸，并用适量PBS冲洗2次，晾干备用；采用上述取材方法后可获得神经元原代细胞的消化稀释液，将其种植在放有盖玻片的板孔内，置于培养箱中4h后全量换成维持液，第3日半量更换维持液，培养至7d用于建立共培养模型。

2、星形胶质细胞的种植

取适量蜡块置于玻璃注射器内，加热使其熔化后缓慢滴加在12孔培养板内，每孔滴加三处即可，紫外照射30min，备用。

将纯化的星形胶质细胞用PBS洗涤细胞两遍，加入0.25％胰蛋白酶消化5min，见细胞大部分收缩变圆时终止消化，1000r/min离心5min，弃上清后重悬，调整细胞密度至5×105个/mL，接种于预包被的12孔培养板内，每孔内加入适量含15％FBS的完全培养基，培养箱内继续培养3d备用。

3、小胶质细胞的种植

将纯化的小胶质细胞用预冷PBS洗涤两遍，加入0.25％胰蛋白酶消化5min后终止消化，离心、重悬，调整细胞密度至5×105个/mL，接种于种有星形胶质细胞的12孔培养板内，1d后换用含5％FBS的完全培养基继续培养，备用。

4、“Quad Partite”突触体外共培养体系的建立

待混合胶质细胞生长至70-80％融合后，移去孔内的大部分培养液，仅留蜡柱高度的培养液，将上述接种5-7d成熟海马神经元的细胞爬片倒扣，置于细胞培养板的蜡柱上，最后共培养3d，便可完成“Quad Partite”突触体外共培养体系。

5、糖尿病并发抑郁症四重突触复合细胞模型的建立

将共培养3d后的细胞模型随机分为正常对照组、高糖组、皮质酮组、模型组，每组均设置多个复孔，根据上述分组详情加入对应的干预药物，其中高糖组加入终浓度为50mM-200mM的葡萄糖，皮质酮组加入终浓度为100μM-400μM的皮质酮，高糖联合皮质酮组则加入终浓度为50mM-200mM的葡萄糖和100μM-400μM的皮质酮，干预18-24h，以建立糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型。

糖尿病并发抑郁症Quad Partite复合细胞模型的验证

本发明通过以下指标来进行模型验证及评价：(1)一般形态学观察。在倒置光学显微镜下对上述干预条件下的海马神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞进行一般形态学观察。(2)细胞内单胺类神经递质检测。采用酶联免疫吸附测定(Elisa)检测细胞内神经递质NE、DA、5-HT的含量，以评价受试细胞是否呈现抑郁样指标特征。(3)海马神经元活性检测。采用MTT比色法检测上述干预条件下细胞的增殖能力，以评价受试细胞的造模损伤程度。(4)海马神经元突触可塑性检测。采用高内涵细胞成像分析技术(HCA)检测海马神经元内突触可塑性相关蛋白SYN、PSD-95表达情况，以评价抑郁功能的变化。(5)海马神经元细胞凋亡。采用TUNEL染色法检测上述干预条件下细胞的凋亡情况。

所述四重突触复合细胞模型在糖尿病并发抑郁症相关疾病的病理生理研究、发病机制研究或体外药物筛选方面的应用。

本发明的有益效果是，本发明建立一种糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型，以用于糖尿病并发抑郁症相关疾病的病理生理研究、发病机制研究及体外药物筛选等。本发明提供一种稳定、简便、可模拟糖尿病并发抑郁症环境的四重突触复合细胞模型，实现了在体外构建一种能在立体或平面空间上实现海马神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞两两接触的新模型，这将能更科学且真实地在体外再现大脑中的相互联络，更为糖尿病并发抑郁症等相关基本疾病的病理生理研究、发病机制研究及体外药物筛选提供了一个更好的平台。

附图说明

图1为各组Quad Partite中细胞形态学变化(100×)。

(a)星形胶质细胞细胞和小胶质细胞(b)海马神经元

A.正常对照组，B.高糖组，C.皮质酮组，D.高糖联合皮质酮组。

图2为各组神经元中突触可塑性相关蛋白SYN荧光信号的变化(标尺为50μm)。

A.正常对照组，B.高糖组，C.皮质酮组，D.高糖联合皮质酮组。

图3为各组神经元中突触可塑性相关蛋白PSD-95荧光信号的变化(标尺为50μm)。

A.正常对照组，B.高糖组，C.皮质酮组，D.高糖联合皮质酮组。

图4为各组神经元凋亡情况。

A.正常对照组，B.高糖组，C.皮质酮组，D.高糖联合皮质酮组。

具体实施方式

实施例1

将共培养3d后的细胞模型随机分为正常对照组、高糖组、皮质酮组、模型组，每组均设置多个复孔，根据上述分组详情加入对应的干预药物，其中高糖组加入终浓度为150mM的葡萄糖，皮质酮组加入终浓度为200μM的皮质酮，高糖联合皮质酮组则加入终浓度为150mM的葡萄糖和200μM的皮质酮，干预18h，然后在倒置光学显微镜下对上述干预条件下的海马神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞分别进行一般形态学观察。

实验结果显示，在正常对照组中，NE胞体圆润透亮，光泽度及折光性好，突起纵横交错，细小分支众多，相互连接形成均匀的神经元网络；AS胞体光滑圆润，多呈圆形或卵圆形，折光性较好，突起较丰富；MG胞体较小，呈椎体形，可见明显的突起和分支。而高糖组、皮质酮组、高糖联合皮质酮组均出现不同程度的NE胞体裂解破碎、树突网络不完整，AS融合度降低、细胞碎片较多，而MG被激活、相互融合呈片状，且高糖联合皮质酮组细胞损伤更明显。(详见图1)。

实施例2

采用酶联免疫吸附测定(Elisa)检测海马神经元胞内神经递质NE、DA、5-HT的含量，以评价受试细胞是否产生抑郁样指标特征。具体操作如下所述：共培养3d后的细胞模型，将细胞分为正常对照组、高糖组、皮质酮组、高糖联合皮质酮组，每组设4个复孔，按以上分组详情加入药物，其中高糖组加入终浓度为150mM的葡萄糖，皮质酮组加入终浓度为200μM的皮质酮，高糖联合皮质酮组则加入终浓度为150mM的葡萄糖和200μM的皮质酮，干预24h，预冷PBS洗涤3次，加入含PMSF的RIPA细胞裂解液，于4℃无菌冰盒上作用1小时，12000离心15min，收集上清液，然后严格按照Elisa试剂盒说明测定细胞内神经递质NE、DA、5-HT的含量。

结果提示，与正常对照组比较，葡萄糖组海马神经元细胞内5-HT含量降低，差异无统计学意义(P>0.05)，DA、NE含量降低，差异有统计学意义(P<0.01)；皮质酮组、葡萄糖联合皮质酮组海马神经元细胞内DA、NE、5-HT含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与葡萄糖组比较，皮质酮组、葡萄糖联合皮质酮组海马神经元细胞内DA、NE、5-HT含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。(详见表1)。

表1各组海马神经元细胞内5-HT、DA、NE含量比较(n＝3)

注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01；与葡萄糖组比较#P<0.05，##P<0.01。

实施例3

将海马神经元接种至96孔板中，同时将混合胶质细胞接种至另一个96孔板中，待细胞长至5-7天，神经网络与胶质细胞分别生长至约80％融合程度时，除空白对照组给予等量维持培养液外，向其余各组胶质细胞中加入相应浓度的高糖(150mM)和皮质酮(200μM)，每组设3个复孔，造模干预18h后，取其上清液至神经元中，再于37℃培养箱中孵育18h。每孔加入20μL MTT，作用4h，弃液，每孔加入150μL DMSO，于水平摇床上震摇15min，最后用酶标仪于492nm波长下测定各孔OD值，并计算各组细胞的相对存活率。

结果显示，当细胞给予单独高糖(150mM)、皮质酮(200μM)或两者联用造模干预18h后，各组神经元细胞存活率明显降低，分别为53.1％、64.3％和56.7％，且与空白对照组相比，均有显著性差异(P<0.01)，这提示上述造模能明显降低海马神经元活性。(详见表2)

表2各组海马神经元细胞存活率比较(n＝3)

注：与正常组比较**P<0.01

实施例4

将共培养3d后的细胞模型，除正常对照组给予等量维持培养液外，其余各组分别加入对应体积的高糖(150mM)和皮质酮(200μM)，待高糖、皮质酮对共培养体系干预18h后，用预冷PBS洗3次×5min，4％多聚甲醛室温固定30min，PBS清洗3次×5min，加0.25％TritonX-100溶液作用15min，PBS清洗3次×5min后，再加5％BSA封闭30min，清洗，向神经元中滴加兔来源的一抗和山羊抗兔β-tublin相关抗原抗体(1∶100)，向混合胶质细胞中滴加小鼠来源的一抗和山羊抗小鼠β-actin相关抗原抗体(1∶100)，4℃湿盒过夜，清洗，加FITC或R-PE标记的二抗，37℃孵育1h，清洗，加细胞核染色剂DAPI室温孵育20min，清洗，最后每孔加入50μL PBS，用高内涵成像分析系统观察分析。

实验结果提示，正常对照组海马神经元胞体圆润透亮，光泽度及折光性好，突起纵横交错，细小分支众多，SYN和PSD-95蛋白的荧光信号分布均匀。在给予高糖和(或)皮质酮后，海马神经元之间树突断裂或减少，网络连接明显减少，神经元内SYN和PSD-95蛋白平均荧光强度显著降低，提示突触可塑性功能显著减低。(详见图2-3)

实施例5

待高糖、皮质酮对共培养体系干预18h后，将贴附有海马神经元的玻璃爬片依次转移至另一个新的24孔板内；用适量PBS浸洗1次×5min；4％多聚甲醛固定25min；PBS浸洗2次，每次5min；0.2％Triton X-100处理5min；PBS浸洗2次，每次5min；吸去PBS后，加50μLTunel反应混合液(TdT：荧光素标记的dUTP液＝1：9)于标本上，加封口膜后置于湿盒内37℃环境下反应1h；PBS漂洗3次；再加1滴PBS在荧光显微镜下观察，计数凋亡细胞数量。

各组大鼠神经元的Tunel染色结果显示，正常组神经元Tunel阳性表达率低，几乎无阳性信号；高糖组和皮质酮组神经元丢失明显，存在细胞破碎现象，Tunel阳性率明显升高；且高糖联合皮质酮组的细胞凋亡现象更明显。(详见图4)

Claims (9)

1.一种糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型，其特征是，包括向四重突触共培养体系中加入葡萄糖和皮质酮，干预得到；所述四重突触共培养体系包括混合胶质细胞，位于混合胶质细胞上的海马神经元，所述混合胶质细胞包括星形胶质细胞和小胶质细胞的混合细胞。

2.如权利要求1所述的糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型，其特征是，所述混合胶质细胞为星形胶质细胞和小胶质细胞融合至72-75％的混合细胞。

3.如权利要求1所述的糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型，其特征是，所述葡萄糖的浓度为150mM，所述皮质酮的浓度为200μM。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型的建立方法，其特征是，包括如下步骤，首先通过体外培养海马神经元，待细胞生长至5-7天后，备用；待预先接种至蜡柱中的混合胶质细胞生长至72-75％融合后，移去孔内的大部分培养液，仅留部分培养液，将上述接种5-7d的成熟海马神经元的细胞爬片倒扣，置于细胞培养板的蜡烛上，最后共培养3d，即获得四重突触共培养体系；向上述共培养体系中加入葡萄糖和皮质酮，干预18-24h，得到糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型。

5.如权利要求4所述的建立方法，其特征是，所述混合胶质细胞的培育方法为，取适量蜡块置于玻璃注射器内，加热使其熔化后缓慢滴加在12孔培养板内，每孔滴加三处即可，紫外照射30min，备用；

将纯化的星形胶质细胞用PBS缓冲液洗涤细胞两遍，加入0.25％胰蛋白酶消化5min，见细胞大部分收缩变圆时终止消化，1000r/min离心5min，弃上清后重悬，调整细胞密度至5×10⁵个/mL，接种于预包被的12孔培养板内，每孔内加入适量含15％FBS缓冲液的完全培养基，培养箱内继续培养3d备用；

将纯化的小胶质细胞用预冷PBS缓冲液洗涤两遍，加入0.25％胰蛋白酶消化5min后终止消化，离心，重悬，调整细胞密度至5×10⁵个/mL，接种于种有星形胶质细胞的12孔培养板内，1d后换用含5％FBS的完全培养基继续培养，得到混合胶质细胞。

6.如权利要求4或5所述的建立方法，其特征是，所述海马神经元的培育方法为，将受孕16-18d SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉，取胎鼠全脑，解剖镜下夹取海马，并剥净残余脑膜及血管，剪碎后加胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化，离心，重悬，计数，接种于预先包被L-多聚赖氨酸的细胞培养板中，置于培养箱中4h后全量换成维持液，第3日半量更换维持液。

7.如权利要求4或5所述的建立方法，其特征是，所述星形胶质细胞的培育方法为，将新生3d的SD大鼠乳鼠处死，于75％体积浓度的酒精中消毒3-5min，无菌取出大脑后于预冷D-Hank's液中洗净血丝，仔细去除血管和脑膜，保留皮质，漂洗后剪碎成直径1mm大小并移入15mL离心管中，1000r/min离心5min后弃上清；按2:1加入0.25％胰蛋白酶37℃消化15min，以含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化后反复轻柔吹打，过150目筛网，吸取滤液并离心，再用新鲜培养液重悬，接种于25cm²细胞培养瓶中，于饱和湿度、37℃、5％CO₂培养箱中静置培养30min，翻转培养瓶吸出培养液，置于25cm²细胞培养瓶中继续培养；以后每3d换液一次；待细胞长满后将培养瓶置于水平摇床上，220r/min恒温37℃条件下振荡2h，换液以弃除脱落细胞，正常培养条件下再培养30min后，重新置于水平摇床相同条件振摇一次，弃掉培养液，正常培养基继续培养。

8.如权利要求4或5所述的建立方法，其特征是，所述小胶质细胞的培育方法为，将新生3d的SD大鼠乳鼠处死，酒精消毒，于无菌条件下迅速取全脑，置于预冷PBS缓冲液中反复清洗以去除血污，洗净后转移至另一培养皿中，于解剖镜下去除脑膜、血管、脑干、小脑、海马，去除出血点；将脑组织充分剪碎，加入500μL胶原酶、500μL 0.25％胰酶，37℃下消化15min，消化至无明显组织沉淀，终止酶消化后并转移至15mL离心管中，过筛，1500r/min离心5min，弃上清；重悬后过筛得到细胞重悬液，接种于预先包被的培养瓶中，于培养箱中培养；混合胶质细胞培养至第7-9天细胞充分分层生长后，PBS缓冲液洗2遍，加1.5mL 0.05％胰酶消化3min，细胞明显固缩，终止消化，不吹不拍，于37℃恒温摇床中150r/min振荡30min，镜下观察，待大量细胞悬浮后收集细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀重悬，调整细胞密度为4×105/cm，接种于预先包被的培养板中先涂布多聚赖氨酸的培养板中，30min后完全换液一次，以去除未贴壁细胞；之后每隔3天半量更换维持液得到。

9.一种如权利要求1、2或3所述的四重突触复合细胞模型的应用，其特征是，所述四重突触复合细胞模型在糖尿病并发抑郁症相关疾病的病理生理研究、发病机制研究或体外药物筛选方面的应用。