CN108342322A - 建立原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种建立原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型的方法，其包括分离纯化子宫内膜腺上皮细胞、建立原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型与鉴定子宫内膜上皮细胞气液相培养模型，具体步骤：收集人子宫内膜，分离子宫内膜腺上皮细胞，收集子宫内膜上皮细胞，获得原代培养的子宫内膜腺上皮细胞，传代培养子宫内膜腺上皮细胞，人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型的建立及鉴定。通过本发明的方法建立的原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型，并对其进行鉴定，不仅可以用于其生理功能的研究，也可以用于子宫内膜异位症、功能失调性子宫出血、子宫内膜癌等多种疾病发病机制的进一步研究，对体外人子宫内膜上皮细胞的实验研究具有重要的意义。

Description

建立原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型的方法
技术领域：
本发明属于原代细胞分离培养技术领域，具体涉及一种用于原代人子宫内膜上皮细胞进行体外研究的气液相培养的方法与模型。
背景技术：
子宫内膜病变严重危害女性健康，如：子宫内膜癌、子宫内膜异位症、子宫内膜息肉、出血、不孕、宫腔粘连等常见疾病发病率正逐年增加，而子宫内膜上皮细胞与这些疾病的发病密切相关。正常情况下，子宫内膜更新和损伤修复所需要的新细胞必须是在正确的时间和空间产生准确程序化，且具备适宜分化功能的合适数量的细胞。而所有这些事件都是由子宫内膜干细胞或先组细胞控制。子宫内膜腺上皮细胞是目前公认的子宫内膜基底层的干/祖细胞增殖，其在子宫内膜损伤(创伤)修复及组织与功能稳态维持中发挥重要作用，且最近的研究也发现子宫内膜的修复与雌激素的作用密切相关。在正常的子宫内膜，雌激素可刺激子宫内膜基底层的干/祖细胞增殖，进而促进周期性的子宫内膜修复。
子宫内膜是性激素作用的靶器官，其功能细胞在月经、妊娠及子宫内膜疾病等生理与病理方面的作用机制尚未完全阐明。在整个女性成年的生殖生命中，人子宫内膜的功能层在下丘脑-垂体-卵巢(HPO)轴的控制下，每月循环再生、分化和脱落，次数超过400次。子宫内膜主要由腺上皮细胞和间质细胞构成。在雌激素主导的增殖期，黏膜重新生长，然后在孕酮主导的分泌期分化。由于伦理学问题，人体疾病的临床实验研究，尤其是创伤性检查和早期药物试验，很难在人体进行。随着分子生物技术的发展，子宫内膜细胞的体外培养为研究细胞生长、分化、代谢以及激素作用机制提供一个理想的试验模型。因此，建立一种可获得高纯度子宫内膜细胞的体外培养体系尤为重要。然而，人类原代子宫内膜腺上皮细胞在体外难以分离培养，表现为组织来源有限、细胞存活率低、增殖速度慢，缺乏上皮细胞表型分化能力等，目前尚无成熟的分离并传代方法。
近年来，干细胞研究成为现代医学和生物学领域的研究热点。细胞克隆研究的初步证据表明：成年干细胞可能存在于人类子宫内膜。而相关研究表明：子宫内膜干细胞或祖细胞在子宫内膜增生性疾病的起始阶段起着关键作用。因此，可应用子宫内膜干细胞特性对其进行分离培养，建立子宫内膜三维结构。以往的单层细胞培养往往会出现细胞脱分化现象，失去细胞原有的分化特征，大多数体外模型没有模拟内皮细胞经历的体内生理条件，包括细胞和血流动力学之间的双向旁分泌。一些研究也利用从子宫内膜癌患者中分离出的heca-1a细胞系建立子宫内膜三维培养模型模仿正常子宫内膜组织，但缺乏正常人体子宫内膜组织的特性。鉴于此，申请人借鉴肺脏上皮细胞气液相模型的方法，提供一种采用原代人子宫内膜腺上皮细胞建立的气液相培养模型及其方法。
发明内容：
本发明的目的旨在提供一种原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型及建立该模型的方法，为体外人子宫内膜上皮细胞实验研究提供一个理想的方法和实验模型。
为达到上述目的，本发明采取以下技术方案：
本发明原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型分为上室和下室，上室与下室之间由半透膜相隔，上室为种植有原代分离的人子宫内膜上皮细胞的气体界面，下室为液体USG培养基；所述半透膜为聚酯膜或者混合纤维素膜，膜的孔径为0.4μm；所述聚酯膜为Millicell悬挂式或者站立式培养皿。
本发明建立上述原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型的方法，包括分离纯化子宫内膜腺上皮细胞、建立原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型与鉴定子宫内膜上皮细胞气液相培养模型，具体步骤如下：
1.分离纯化子宫内膜腺上皮细胞
1)收集人子宫内膜：收集因宫腔黏连、子宫肌瘤、内膜增生等病因的患者，经宫腔镜下异物钳取粘连组织表面的少量内膜，剪碎至细小组织碎片于无菌离心管中，用预冷的PBS缓冲液进行旋转漂洗10次，5min/次后，弃去PBS缓冲液，备用；
2)分离子宫内膜腺上皮细胞：将于清洗好的组织碎片中加入3mg/mL胶原酶IV，在37℃条件下旋转消化10-15min后，再加入等体积Accumax细胞分散液继续混合，在37℃条件下旋转消化7-10min后，加入血清至终浓度为5％，得到达到终止消化的组织悬液；
3)收集子宫内膜上皮细胞：将上述获得的组织悬液通过200目的细胞滤筛进行过滤后，收集筛子上面的细胞团块(即子宫内膜腺上皮细胞)，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，沉淀的细胞用DMEM/F12培养基进行悬浮；
4)获得原代培养的子宫内膜腺上皮细胞：将悬浮的细胞接种至有胶原酶包被的培养皿中，并加入优化的培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，2-3d后进行换液，即得子宫内膜腺上皮细胞(P0)；
5)传代培养子宫内膜腺上皮细胞：待获得的原代培养的人子宫内膜腺上皮细胞的融合率达80-90％时，吸去培养基，用预热的PBS缓冲液漂洗后，加入优化培养基进行传代培养。
步骤1)中所述经宫腔镜下异物钳取粘连组织表面的少量内膜选择卵泡期进行检查，闭经患者则动态监测卵巢卵泡变化选择排卵前期。
步骤1)中所述PBS缓冲液为含有1％双抗和2.5μg/ml两性霉素B的溶液。
2.建立人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型
1)将上述分离纯化的P0代子宫内膜腺上皮细胞融合率达80-90％时，用Accusase上皮干细胞消化酶消化5-20min后，将收集的上皮细胞重悬在含ROCK优化的培养基中，并按一定密度植在胶原包被的6孔板支持膜(transwell)上，培养48小时后，吸去顶层培养基，换成液体USG培养基开始建立气液相培养模型，7-15天即得子宫内膜上皮细胞气液相培养模型(Air-liquid interface,ALI)。
上述收集的上皮细胞重悬在含ROCK优化的培养基中按1.6×106个/mL的密度植在胶原包被的6孔板支持膜(transwell)上。
上述下层培养基为含2％Ultroser G(USG)血清的无ROCK抑制剂的优化培养基。
上述液体USG培养基在建立气液相培养模型过程中，每2-4天进行一次USG血清的换液。
2)用Millicell-ERS跨膜电阻仪隔天测定一次培养的子宫内膜腺上皮细胞的电阻值，其中：子宫内膜腺上皮细胞的电阻值＝(测定值-空白值)×Millicell膜面积。每次测定前将电极用75％酒精浸泡30min后，再用培养皿浸泡10-15min备用。
测定子宫内膜上皮细胞的跨膜电阻值在前4天增值迅速，4天后子宫内膜上皮细胞气液相模型开始不漏液，此时的跨膜电阻值大于350Ω·cm2，4-19天子宫内膜上皮细胞的跨膜电阻维持稳定，电阻值维持在350-550Ω·cm2。
3.鉴定子宫内膜上皮细胞气液相培养模型
对获得的人子宫内膜上皮细胞气液相培养物通过透视电镜、免疫荧光染色分别在形态学和细胞特异标记上鉴定其细胞分化成熟程度，同时利用免疫印迹法鉴定在有无雌激素的情况下，雌激素受体与孕激素受体的变化。
本发明的有益效果在于：本发明建立的原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型以原代分离的人子宫内膜上皮细胞为模型，相比普通培养的细胞受雌激素的作用较大，不仅可以用于其生理功能的研究，也可以用于子宫内膜异位症、功能失调性子宫出血、子宫内膜癌等多种疾病发病机制的进一步研究，对体外人子宫内膜上皮细胞的实验研究具有重要的意义。
附图说明：
图1是本发明原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型的结构示意图；
图2是本发明原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型的扫描电镜和投射电镜结果；
图3是本发明原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型在孕酮刺激下免疫印迹结果。
具体实施方式：
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不仅限于此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用技术手段，在不脱离本发明上述基本技术思想的前提下，还可以做出其它多种形式的衍化、替换或变更。
1.实验材料
1.1标本来源：收集在某医科大学总医院妇科因宫腔黏连、子宫肌瘤、内膜增生等病因进行宫腔镜用异物钳取粘连组织表面的少量内膜。
2.主要试剂
DMEM高糖培养基(Gibco)、F-12NutrientMix培养基(Gibco)、胎牛血清(BI)、胶原酶IV(Sigma-Aldrich)、Accumax(细胞、组织消化液)(Gibco)、Accutase solution(细胞消化液)(Millipore)、hEGF(Sigma-Aldrich)、Hydrocrotisone(Sigma-Aldrich)、Millicell(Millipore)、USG气液相培养基(PALL)、Y-27632(Sigma-Aldrich)、Choleratoxin(Sigma-Aldrich)、DMH-1(Cot：HY-12273，MedChem Express)、I型鼠尾胶原(BD Biosiences)、DMSO(Panreac)、青霉素-链霉素(hyclone)、两性霉素B(Solarbio)、PH7.2-7.5的PBS缓冲液(Hyclone)。
3.主要器材和仪器：
CO2培养箱(Heal Force)、3D旋转消化仪(杭州米欧仪器有限公司)、倒置荧光显微镜(ZEISS)、生物安全柜(Nuaire)、普通离心机(赛洛捷克)、液氮罐(MVE xc47/11-10)、电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)、60mm细胞培养皿、15mL离心管、冻存管都购自Costar、数码恒温磁力搅拌器、计时器、程序化冻存盒、10ul、100ul、1000ul等规格精密微量加样枪，一次性微量加样管，一次性手套、口罩、帽子等。
4.试验方法与结果
4.1优化培养基的配置：按照表1的配方，进行配置，将配置好的培养基盖上盖子并用封口膜封口，锡箔纸包裹避光，4℃保存备用。
表1人气道上皮细胞优化培养基配方
4.250μg/mL的I型鼠尾胶原配置：吸取273μL 3.66mg/mL的I型鼠尾胶原放入还有20ml无菌水的血清瓶中，用无菌的磁力转子搅拌2h后，4℃保存备用。
4.3培养皿I鼠尾胶原的包被:取60mm的培养皿，加入浓度为50μg/mL的I型鼠尾胶原，加样量为100μL/cm2，室温包被24h后，用PBS缓冲液清洗3次，4℃放置备用。
4.4人子宫内膜腺上皮细胞分离、培养
4.4.1标本的获取：收集在某医科大学总医院妇科因宫腔黏连、子宫肌瘤、内膜增生等病因进行宫腔镜用异物钳取粘连组织表面的少量内膜；
4.4.2收集人子宫内膜：从因宫腔黏连、子宫肌瘤、内膜增生等病因的患者，经宫腔镜下异物钳取粘连组织表面的少量内膜(选择卵泡期进行检查，闭经患者则动态监测卵巢卵泡变化选择排卵前期)，剪碎至小于1毫米的细小组织碎片于无菌离心管中，在4℃条件下预冷无菌的含有1％双抗和2.5μg/ml两性霉素B的溶液进行旋转漂洗10次，5min/次后，弃去PBS缓冲液，备用；
4.4.3分离人子宫内膜上皮细胞：按离心管内组织体积的3倍于清洗好的组织碎片中加入3mg/mL胶原酶IV，在37℃条件下旋转消化10-15min后，再加入等体积的Accumax细胞分散液继续混合，在37℃条件下旋转消化7-10min后，加入血清至终浓度为5％，得到达到终止消化的组织悬液；
4.4.4收集子宫内膜上皮细胞：将组织悬液通过200目的细胞滤筛进行过滤后，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，沉淀的细胞用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基进行悬浮；
4.4.5培养贴壁细胞：将悬浮的细胞接种到无胶原包被的培养皿中进行培养，培养2-4小时后，差速贴壁发去除基质细胞；
4.4.6收集未贴壁的细胞；收集未贴壁的细胞悬液(即为子宫内膜腺上皮细胞或细胞团块)于离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清后，将沉淀的细胞用DMEM/F12培养基进行再悬浮；
4.4.7获得原代培养的子宫内膜腺上皮细胞(P0)：将收集悬浮的未贴壁的细胞接种于鼠尾胶原包被的细胞培养皿上，加入优化的培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养2-3d后，进行换液，即得子宫内膜腺上皮细胞(P0)；
4.4.8子宫内膜腺上皮细胞气液相培养模型的建立：待获得的原代培养的气道上皮细胞的融合率达80-90％时，吸去培养基，用预热的PBS缓冲液漂洗后，加入1mlAccutase细胞消化液，37℃消化5-10min后，显微镜观察待细胞变圆后，轻轻拍打培养皿的侧壁，使人子宫内膜腺上皮细胞全部悬浮于消化液中，随后加入3ml的10％FBS DMEM培养基，终止消化。收集细胞于15ml的离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，细胞沉淀用2mL优化的培养基悬浮，细胞计数，调整细胞浓度为1.6×106个/mL，吸取1mL细胞接种于鼠尾胶原包被的6孔板支持膜(transwell)上室中(图1)，下室加入1.5mL的优化的培养基，放置于37℃，5％CO2的培养箱中培养，48h后吸去上层的培养基，下层换成2％FBS USG培养基，继续培养24h，下层换成无血清的USG培养基，2-3天换液，1-2周可建立气液相培养模型(见图1)，收集2周后气液相模型，并利用扫描电镜方法对模型细胞形态进行鉴定。
如图2得知：通过扫描电镜(SEM)观察发现培养2周的人子宫内膜腺上皮细胞的气液相模型具有上皮细胞的特性，具有较深的沟壑，可见微绒毛和纤毛的存在。
4.4.9子宫内膜腺上皮细胞气液相培养模型功能的鉴定：向上述培养10天的子宫内膜气液相模型加入1μM的雌激素，继续培养24h、48h后收集气液相模型上的细胞，利用免疫印迹的方法，鉴定在雌激素的存在下，其子宫内膜上皮细胞雌激素受体和孕激素受体的表达情况。
如图3所示：(A)人子宫内膜上皮细胞气液相模型免疫印迹结果；(B)人子宫内膜上皮细胞普通培养免疫印迹结果。图中注：ER:estrogen receptor雌激素受体；PR:progesterone receptor孕激素受体；CD13:alanyl(membrane)aminopeptidase基质细胞的表面标记物；EPCAM:epithelial cell adhesion molecule上皮细胞表面标记物。
通过免疫印迹的结果发现：子宫内膜上皮细胞(EpCAM,Vimentin)和基质的表面标记物(Keratin、CD13)的标记都均有表达，证明人子宫内膜上皮细胞气液相模型培养的条件下，可以分化成基质细胞。在孕酮的刺激24h和48h后，相对于对照组，雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)显著增加，而在普通条件下培养的人子宫内膜腺上皮细胞，在孕酮的刺激下，ER、PR表达水平变化不明显。

Claims (10)

1.一种原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型，其特征在于：所述原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型分为上室和下室，上室与下室之间由半透膜相隔，上室为种植有原代分离的人子宫内膜上皮细胞的气体界面，下室为液体USG培养基；所述半透膜为聚酯膜或者混合纤维素膜。
2.根据权利要求1所述的原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型，其特征在于：所述半透膜的孔径为0.4μm。
3.根据权利要求1所述的原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型，其特征在于：所述聚酯膜为Millicell悬挂式或站立式培养皿。
4.建立如权利要求1～3中任一权利要求所述的原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型的方法，其特征在于：所述方法包括分离纯化子宫内膜腺上皮细胞、建立原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型与鉴定子宫内膜上皮细胞气液相培养模型，具体步骤如下：
1)收集人子宫内膜：收集因宫腔黏连、子宫肌瘤、内膜增生等病因的患者，经宫腔镜下异物钳取粘连组织表面的少量内膜，剪碎至细小组织碎片于无菌离心管中，用预冷的PBS缓冲液进行旋转漂洗10次，5min/次后，弃去PBS缓冲液，备用；
2)分离子宫内膜腺上皮细胞：将于清洗好的组织碎片中加入3mg/mL胶原酶IV，在37℃条件下旋转消化10-15min后，再加入等体积Accumax细胞分散液继续混合，在37℃条件下旋转消化7-10min后，加入血清至终浓度为5％，得到达到终止消化的组织悬液；
3)收集子宫内膜上皮细胞：将上述获得的组织悬液通过200目的细胞滤筛进行过滤后，收集筛子上面的子宫内膜腺上皮细胞，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，沉淀的细胞用DMEM/F12培养基进行悬浮；
4)获得原代培养的子宫内膜腺上皮细胞：将悬浮的细胞接种至有胶原酶包被的培养皿中，并加入优化的培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，2-3d后进行换液，即得子宫内膜腺上皮细胞(P0)；
5)传代培养子宫内膜腺上皮细胞：待获得的原代培养的人子宫内膜腺上皮细胞的融合率达80-90％时，吸去培养基，用预热的PBS缓冲液漂洗后，加入优化培养基进行传代培养；
6)建立人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型：将上述分离纯化的P0代子宫内膜腺上皮细胞融合率达80-90％时，用Accusase上皮干细胞消化酶消化5-20min后，将收集的上皮细胞重悬在含ROCK优化的培养基中，并按一定密度植在胶原包被的6孔板支持膜上，培养48小时后，吸去顶层培养基，换成液体USG培养基开始建立气液相培养模型，7-15天即得子宫内膜上皮细胞气液相培养模型；
7)用Millicell-ERS跨膜电阻仪隔天测定一次培养的子宫内膜腺上皮细胞的电阻值，其中：子宫内膜腺上皮细胞的电阻值＝(测定值-空白值)×Millicell膜面积。
8)鉴定子宫内膜上皮细胞气液相培养模型：对获得的人子宫内膜上皮细胞气液相培养物通过透视电镜、免疫荧光染色分别在形态学和细胞特异标记上鉴定其细胞分化成熟程度，同时利用免疫印迹法鉴定在有无雌激素的情况下，雌激素受体与孕激素受体的变化。
5.根据权利要求4所述的建立原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型的方法，其特征在于：步骤1)中所述经宫腔镜下异物钳取粘连组织表面的少量内膜选择卵泡期进行检查，闭经患者则动态监测卵巢卵泡变化选择排卵前期。
6.根据权利要求4所述的建立原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型的方法，其特征在于：步骤1)中所述PBS缓冲液为含有1％双抗和2.5μg/ml两性霉素B的溶液。
7.根据权利要求4所述的建立原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型的方法，其特征在于：步骤6)中所述收集的上皮细胞重悬在含ROCK优化的培养基中按1.6×106个/mL的密度植在胶原包被的6孔板支持膜上。
8.根据权利要求4所述的建立原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型的方法，其特征在于：步骤6)中所述下层培养基为含2％USG血清的无ROCK抑制剂的优化培养基。
9.根据权利要求4所述的建立原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型的方法，其特征在于：步骤6)中所述液体USG培养基在建立气液相培养模型过程中，每2-4天进行一次USG血清的换液。
10.根据权利要求4所述的建立原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型的方法，其特征在于：步骤7)中所述测定的子宫内膜上皮细胞的跨膜电阻值维持在350-550Ω·cm2。
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