CN110408673A - 研究Hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复ESC中的作用机制的方法 - Google Patents

研究Hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复ESC中的作用机制的方法 Download PDF

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孙宝兰
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Abstract

本发明公开了一种研究Hsa_circ_0111659在WJ‑MSCs修复ESC中的作用机制的方法。本发明研究发现hsa_circ_0111659在WJ‑MSCs修复损伤的间质细胞中起着正向调控作用，敲低hsa_circ_0111659可降低ESC的增殖能力，增加ESC的凋亡细胞数。hsa_circ_0111659/miR‑20b‑5p/VEGF这一靶向轴在内膜的修复中起着重要作用，hsa_circ_0111659为子宫内膜间质细胞的修复提供一条新的思路。

Description

研究Hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复ESC中的作用机制的 方法
技术领域
本发明涉及一种Hsa_circ_0111659的用途的研究其作用机制的方法。
背景技术
子宫内膜功能的完整性对于女性生殖功能意义重大。宫腔内的机械性损伤或感染引起的子宫内膜修复障碍已成为宫腔粘连、闭经、不孕的重要原因，严重影响了女性月经周期和正常妊娠。目前研究认为，正常月经周期的维持主要依赖于子宫内膜的基底层。而子宫内膜基底层的损伤可改变正常月经周期中子宫内膜规律的生长、脱落，基底层损伤导致新生血管生成困难从而导致内膜难以实现自我修复。由于基底层细胞损伤后自身无法获得再生，通过内源性或外源性途径修复或产生新的基底层细胞成为目前子宫内膜损伤后修复的主要途径。
近年来的研究发现，人脐带间充质干细胞(WJ-MSCs)这种来源于脐带组织的干细胞因易于分离、纯度高、无肿瘤细胞污染被人们大量应用于再生医学领域。研究发现WJ-MSCs具有强大的组织修复，主要通过俩种途径发挥作用一是通过定向分化为某种特定的细胞如成骨细胞、脂肪细胞、神经元细胞、胰岛素生成细胞、子宫内膜间质细胞等来达到组织修复的功能，二是通过分泌大量的细胞因子如血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞因子(bFGF)达到修复作用。WJ-MSCs应用于子宫内膜损伤修复中的研究报道还甚少。
近年来，非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)作为一种重要的调控因子，受到研究者的普遍关注。ncRNA是一类不编码蛋白质却能同时调控体内多个基因而参与生物发育、生长、疾病过程的RNA分子。随着二代测序技术和生物信息学的快速发展，继微小RNA(microRNA，miRNA，miR)和长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)之后，对RNA分子结构和生物学功能的研究逐渐从miRNA向环状RNA(circular RNA，circRNAs)转移。circRNAs是一种新的内源性非编码RNA，产生于RNA剪切过程，呈闭合环状结构，无3’帽子结构和5’poly尾，广泛存在于真核细胞中，具有稳定性、进化保守性以及细胞、组织特异性。研究表明，circRNAs参与细胞内RNA调控网络，其表达变化与疾病的发生、发展有密切关联。circRNAs作为RNA家族的新成员正成为RNA调节网络中的热门领域。通过大量研究表明circRNAs广泛参与了不同原因导致的损伤修复病理进程，并在转录或转录后水平发挥其调控功能，揭开了基因表达调控和转录后调控的新层面。然而，在子宫内膜损伤修复过程中，circRNAs是否也参与其中并发挥其转录调控作用，迄今未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种机制确切的Hsa_circ_0111659在制备WJ-MSCs修复受损子宫内膜制剂中的应用。
本发明的目的还在于提供一种研究Hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复受损子宫内膜中的作用机制的方法。
本发明的技术解决方案是：
一种Hsa_circ_0111659在制备WJ-MSCs修复受损子宫内膜制剂中的应用。
一种研究Hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复受损子宫内膜中的作用机制的方法，其特征是：包括下列步骤：
(A)取正常足月剖宫产新生儿脐带，进行华通氏胶的剥离并采用组织植块法培养原代人脐带间充质干细胞；收集全子宫切除的内膜组织，采用酶消化法培养原代子宫内膜间质细胞；
(B)构建体外子宫内膜间质细胞(Endometrial stromal cells，ESC)损伤模型，运用transwell建立WJ-MSCs和损伤ESC共培养模型，共培养48小时后通过CCK8，流式AnnexinV-FITC/PI双染观察WJ-MSCs对损伤ESC的修复作用；并收集损伤共培养和损伤未共培养的ESC进行基因芯片和生物信息分析；通过qRT-PCR验证基因芯片的分析结果，根据生物学功能及表达量挑选出hsa_circ_0111659作为后续分子，作为功能分析；
(C)建立损伤的ESC与WJ-MSCs共同培养体系，构建shRNA对hsa_circ_0111659进行敲低，并通过CCK8检测对细胞增殖能力的影响，通过流式Annexin V-FITC/PI双染测细胞凋亡率；
(D)运用生物信息学软件预测分析hsa_circ_0111659的下游靶点并运用RNA荧光原位杂交实验和荧光素酶实验验证其与下游靶点的结合作用；
(E)应用CCK8、流式双染、Western blot法进一步验证和探索hsa_circ_0111659对miR-20b-5p/VEGF信号通路的调控作用。
步骤(A)的具体方法是：
(一)WJ-MSCs的原代培养：
(1)取足月剖宫产的健康新生儿脐带长约7-15cm，尽量挤净脐带中的血液，放入含有双抗的培养基中，于冰盒保存；
(2)于超净台取出，用PBS充分洗涤脐带中的血液；
(3)将脐带剪成约2cm的小段，再次充分漂洗，剖开脐带，剔除脐静脉、脐动脉后开始剥离华通氏胶；
(4)将华通氏胶剪成适当组织块大小，离心去上清，用完全培养基重悬，使组织块均匀铺于75的细胞瓶内，放置于37℃含5％CO2培养箱中培养；
(5)每3天将组织块吸出，洗涤细胞瓶，洗涤组织块离心去上清重悬后均匀铺于75的细胞瓶内；
(6)待间充质干细胞生长至70％-80％融合后，去除组织块，进行细胞传代养至P3代备用；
(二)ESC的原代培养：
(1)离体后的子宫置于无菌台纵行剖开宫体，轻柔刮取内膜置于含有双抗的培养基中，于冰盒保存；
(2)于超净台取出，用PBS充分洗涤内膜组织；
(3)将子宫内膜组织剪成1-2mm3大小的碎块，1000r/min离心3-5min，去上清；
(4)在含组织的离心管内加入5倍体积终浓度为0.1％的Ⅰ型胶原酶吹打混匀，在培养箱中进行首次消化，每10min震荡一次，60min后取出；
(5)将消化液摇匀，分别用100μm和40μm孔径的细胞滤网过滤，收集过滤液以1000r/min离心5min，弃上清用完全培养基重悬后均匀接种于细胞培养瓶中；
(6)收集首次消化完的内膜组织重复上述(4)和(5)的步骤，可得到2次消化的间质细胞。
步骤(B)的具体方法是：
(一)细胞培养
(1)用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面；
(2)在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶；
(3)取出细胞培养瓶，打开瓶盖，吸掉旧培养液；
(4)用PBS洗涤细胞一至二次；
(5)加入trypsin-EDTA溶液，洗细胞皿底部；吸掉trypsin-EDTA溶液，放入37℃培养箱1-3分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，拍培养瓶壁使大部分细胞脱落，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用；
(6)以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，补足3nml培养基，依稀释比例转移至新的培养瓶中；其中n为传代瓶数；
(7)将细胞悬液分装入细胞瓶内，将细胞瓶放入37℃含5％CO2的培养箱内培养，换液的时间由细胞生长速度情况而定；
(二)人子宫内膜间质细胞体外损伤模型以及与WJ-MSCs共培体系的建立：
(1)以1×105/ml的密度将间质细胞种植于6孔板中，每孔加2ml的完全培养基，置于37℃含5％CO2培养箱中培养；
(2)继续培养24h后以终浓度为60umol/L加入米非司酮溶液，米非司酮预先用无水乙醇溶解后用低血清培养基稀释成最终浓度；
(3)米非司酮作用48h后，显微镜观察细胞形态，全量更换培养基为新鲜的低血清培养基，继续用于后续实验；
(4)利用Transwell 0.4um小室建立共培养体系：
以1.0-1.5×105个细胞/孔将消化好的P3代WJ-MSCs细胞悬液1.5ml加入上层小室中，下层加入完全培养基2.6ml，置于37℃含5％CO2培养箱中；
细胞贴壁后全量更换为低血清培养基，继续培养24h后，取出种植有WJ-MSCs的小室，放入下层种植有间质细胞的培养板共培养，从而建立共培养体系；
(三)CCK8
(1)使用24孔板建立共培养体系，细胞予处理或不处理后，每孔细胞更换500ul新低血清培养基后再加入50ul的CCK8；
(2)避光置于37℃含5％CO2培养箱中2h；
(3)放置酶标仪中在450nm处测吸光度，取3次均值；
(四)FISH检测原位杂交：
Day0：
WJ-msc细胞培养，爬片；
Day 1：
(1)PBS漂洗爬片3次，每次5min；
(2)加0.5％TritonX-100，室温孵育15min；
(3)加4％多聚甲醛，固定5min，PBS洗3次，每次5min；
(4)尽量吸干PBS，加100％乙醇，1min后吸弃乙醇，晾干；
(5)取适量杂交液按1:50稀释探针；
(6)探针变性：将探针置于PCR仪上，88℃变性5min，4℃平衡3min；
(7)在爬片上完全干燥后，将变性好的探针加在培养孔中浸没爬片；
(8)盖好培养孔，用封口胶封口，保湿，37℃孵育过夜(12-18h)；
Day 2(直标)：
(1)吸去杂交探针液，用2×ssc漂洗爬片3次，每次5min，第一次42℃，后两次室温洗涤；
(2)取干净的载玻片，加50ul DAPI-Antifade溶液，将爬片轻轻盖于DAPI-Antifade液滴上，有细胞的一面朝下，避免产生气泡；
(3)用rubber cement封片，放于暗处20min以上，镜下观察；
Day 2(二抗)：
(1)吸去杂交探针液，用2×ssc漂洗爬片3次，每次5min，第一次42℃，后两次室温洗涤；
(2)滴加3％BSA，37℃封闭30min；
(3)加入稀释好的地高辛荧光二抗，37℃孵育1h；
(4)洗涤液洗3次，每次5min；
(5)取干净的载玻片，加50ul DAPI-Antifade溶液，将爬片轻轻盖于DAPI-Antifade液滴上，有细胞的一面朝下，避免产生气泡；
(6)用rubber cement封片，放于暗处20min以上，镜下观察；
(五)质粒miRNA共转染
转染前一晚以1x105个细胞接种于24孔板，确保转染时细胞汇合度达到70-80％；
(六)腺病毒及慢病毒转染
转染前一晚以1.5x105个细胞接种于6孔板，确保转染时细胞汇合度达到70-80％；
(七)荧光素酶报告基因检测
(1)用Luciferase Reaction Buffer充分溶解冻干状态的Luciferase ReactionSubstrate 5ml+1vial配成Luciferase Reaction Reagent，分装后避光保存，避免反复冻融；
(2)按1:50的比例将Luciferase Reaction Substrate II同LuciferaseReaction Buffer II混合配成Luciferase Reaction Reagent II，分装后避光保存，避免反复冻融；
(3)按1:4的比例将5x Cell Lysis Buffer同ddH2O混合备用；
(4)裂解细胞：转染后48h，吸弃培养基，用PBS洗涤细胞2遍，每孔加入100ul 1xCell Lysis Buffer，室温充分裂解10min；
(5)充分裂解后，取裂解液于1.5ml离心管，4℃12000×g离心10min，取上清用于测定；
(6)按仪器操作说明书开启荧光测定仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒；
(7)萤火虫荧光素酶活性检测：取适量Luciferase Reaction Reagent平衡至室温，取样品20ul，加入100ul Luciferase Reaction Reagent，轻弹混匀后测定RLU(relative light unit)；以报告基因细胞裂解液为空白对照；
(8)海肾荧光素酶活性检测：取适量Luciferase Reaction Reagent II平衡至室温，在完成上述测定萤火虫荧光素酶活性检测步骤后，每管加入100ul LuciferaseReaction Reagent II，涡旋混匀后测定RLU(relative light unit)；
(9)在以萤火虫荧光素酶为内参的情况下，用海肾荧光素酶测定得到的RLU值除以萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值；根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度；
(八)RNA提取步骤
(1)细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；
(2)按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置5min；
(3)4℃，12,000g离心15min；
(4)吸取上层水相，移至另一离心管中；
(5)按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置10min；
(6)4℃，12,000g离心10min，弃上清；
(7)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
(8)4℃7,500g离心5min，尽量弃上清；
(9)室温晾干5-10min，加入20μl DEPC水溶解沉淀；
(九)逆转录
a.配制第一链cDNA合成反应液
b.按下列条件进行第一链cDNA合成反应
(十)qPCR实验
a.qPCR反应体系配制
b.qPCR反应程序设置
(十一)Western blot检测相关蛋白表达
(1)根据每孔细胞数加入适量的细胞裂解液，置于冰上裂解10-15分钟；
(2)收集细胞裂解液转移至EP管中于4℃低温离心机离心，吸取上清至新的EP管中测定蛋白浓度；
(3)按标本：蛋白上样缓冲液＝4:1的比例向EP管中加入5×蛋白上样缓冲液，枪头混匀，沸水中煮沸5min后冷却以备用；
(4)按照说明书配置不同浓度的分离胶和5％的浓缩胶；
(5)凝胶板固定于电泳槽，倒入预冷的电泳液后每孔加入等量的蛋白样品最左最右孔加入彩虹marker；
(6)恒压调节，起始电压为80V，待待溴酚蓝进入分离胶后，改为100V直至溴酚蓝跑至分离胶的底部关闭电源；
(7)根据目的蛋白的大小来切割凝胶，剪取和凝胶适当大小的PVDF膜并置于PVED活化液中活化；
(8)从正极到负极依次放好好海绵垫、厚滤纸、分离胶、PVDF膜、厚滤纸、海绵垫；
(9)将转膜装置放置冰盒中进行转膜，设定恒流300mv,根据分子大小设置转膜时间；
(10)转膜完成后将PVDF膜置于封闭液中，一般室温约封闭2h；
(11)用预先配置好的PBST洗膜，每次5min，共3次；
(12)一抗按适当比例用一抗稀释液稀释，将PVDF膜完全置于一抗中并于4℃过夜；
(13)过夜后用预先配置好的PBST洗膜，每次5min，共3次。回收一抗；
(14)按1:1000的比例用2抗稀释液稀释2抗，将配置好的二抗滴于PVDF膜，室温孵育2h；
(15)用预先配置好的PBST洗膜，每次5min，共3次；
(16)按ECL试剂盒说明书将A、B液等体积混合，在膜上滴加配好的显影液；凝胶成像系统拍照、保存；
(十二)流式细胞术测凋亡
(1)收集各实验孔内的培养基至相应的离心管内；
(2)用预冷的PBS洗涤细胞2次，洗涤液也回收至相应的离心管内；
(3)加入适量的不含EDTA的胰酶消化5min，加入完全培养基终止消化；轻柔的吹打细胞，并收集至离心管内；
(4)用预冷的PBS洗涤细胞2次，用1×的缓冲液重悬细胞1×106/ml；
(5)取每实验管内的100ul的细胞悬液至流式管内；
(6)每管内分别各加入5ul的FITC Annexin V和5ul的PI；
(7)于室温下避光15min后，每管加入400ul的1×的缓冲液重悬细胞，于1h内上机检测；
(十三)统计学分析
统计学处理运用Graphed Prism 7.0软件进行数据分析，以p＜0.05表示数据有统计学意义，所有实验重复3次；
(十四)CCK8测ESC的增殖能力
通过CCK8实验检测各实验组ESC的增殖能力，通过检测24h、48h、72h这3个时间点的OD值，研究发现损伤的ESC较正常未损伤的ESC增殖能力显著降低，具有统计学差异，p<0.01，损伤的ESC与WJ-MSCs共培养后发现可部分恢复损伤的ESC的增殖能力，具有统计学差异，P<0.05，但未恢复正常ESC的增殖能力；CCK8可说明WJ-MSCs对受损的ESC有一定的修复作用；
(十五)流式测凋亡
通过流式双染法测ESC的凋亡率。通过统计各图的右上象限和右下象限占整个象限的比值来计算各实验组的ESC的凋亡率。损伤组与正常组相比较细胞凋亡率可显著增加，具有统计学差异，p<0.01；损伤组与干细胞共培养48h后发现凋亡率较单纯损伤组有所下降，具有统计学差异，P<0.05，但较正常组相比较仍有较高的凋亡率；流式实验发现WJ-MSCs与损伤的ESC共培养后可减少ESC的凋亡，但较难恢复到正常状态；
(十六)基因芯片分析及qRT-PCR验证基因芯片的分析结果
通过CCK8和流式双染法可见WJ-MSCs对损伤的ESC有一定的修复能力；通过对损伤共培养和损伤未共培养的ESC进行芯片分析，筛选在WJ-MSCs促进间质细胞修复过程中差异表达的circRNAs发现表达显著上调的circRNAs有5000多个，显著下调的有2000多个；根据生物学功能及表达量挑选出hsa_circ_0111659作为后续分子作为功能研究；
通过qRT-PCR检测hsa_circ_0111659在ESC和WJ-MSCs的中的24h、48h、72h表达量，显示hsa_circ_0111659随时间的发展呈现一个下降趋势，可能是在细胞增殖过程中CircRNA中被降解稀释有关；并且发现hsa_circ_0111659在WJ-MSCs中的表达量低于在ESC的表达量，这可能是因为除了WJ-MSC分泌的circRNA之外，ESC还可以分泌一小部分circRNA；
步骤(C)的具体方法是：
敲低hsa_circ_0111659在WJ-MSCs中的表达对WJ-MSCs修复受损ESC的影响：
在WJ-MSCz中转染病毒观察转染效率；通过绿色荧光观察病毒转染效率，目的病毒转染和空载体病毒转染；通过qRT-PCR验证3条shRNA的敲低效率：实验显示shRNA1与对照组相比无统计学差异，P>0.05，shRNA2和shRNA3与对照组相比有统计学差异，P<0.01，且以shRNA3效果最佳；选取干扰效果最佳的shRNA3进行后续实验；
敲低hsa_circ_0111659后对ESC增殖能力及凋亡的影响；观察24h、48h、72h 3个时间点敲低后的WJ-MSCs对损伤ESC的增殖情况的影响；与对照组及正常共培养组相比较，CCK8显示hsa_circ_0111659敲低组ESC的细胞增殖能力下降与对照组相比较P<0.05；同时通过流式双染发现敲低hsa_circ_0111659后使WJ-MSCs与损伤的ESC共培养48h与对照组相比可使细胞凋亡数目增加，P<0.01；通过CCK8和流式双染实验我们发现hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复受损的ESC具有一定的生物学功能。
步骤(D)的具体方法是：
(1)hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF的靶向作用
运用生物信息学软件预测分析hsa_circ_0111659与miR-20b-5p有结合位点，miR-20b-5p与VEGF有结合位点；使用293T工具细胞进行质粒的转染，在转染克隆有野生型hsa_circ_0111659片段的质粒的实验，miR-20b-5p组与空白组相比较(P<0.05)，miR-20b-5p组与NC组相比(P<0.05)，都显著影响荧光活性，说明miR-20b-5p能通过结合载体3’UTR区的WThsa_circ_0111659基因序列影响其荧光活性改变，hsa_circ_0111659和miR-20b-5p可能存在相互作用；在转染克隆有突变型hsa_circ_0111659片段的质粒的实验中，miR-20b-5p组与空白组相比较P<0.05，miR-20b-5p组与NC组相比(P<0.05)，都显著影响荧光活性，说明miR-20b-5p能通过结合载体3’UTR区的mut hsa_circ_0111659基因序列影响其荧光活性改变，突变位点可能不完全，可能存在其它结合位点；
在转染克隆有野生型VEGFA-3’UTR质粒的实验中miR-20b-5p组与空白组相比较，(P<0.05)，miR-20b-5p组与NC组相比(P<0.01)，都显著影响荧光活性，说明miR-20b-5p能通过结合载体3’UTR区的wt VEGFA-3‘UTR影响其荧光活性改变，VEGFA-3‘UTR和miR-20b-5p可能存在相互作用；在转染克隆有突变型VEGFA-3’UTR质粒的实验中，miR-20b-5p组与空白组和NC组相比较(P>0.05)荧光活性均未有改变，均无统计学差异，说明miR-20b-5p不能通过结合载体3’UTR区的mut VEGFA-3‘UTR影响其荧光活性改变，结合位点突变完全；
(2)hsa_circ_0111659和miR-20b-5p的定位
WJ-MSCs细胞fish检测hsa_circ_0111659和miR-20b-5p的细胞定位；发现hsa_circ_0111659主要定位于细胞质中，这一定位说明它主要起着海绵吸附功能，结合荧光素酶报告实验我们可断定hsa_circ_0111659起着miR-20b-5p海绵吸附体的作用；
(3)hsa_circ_0111659敲低后的miR-20b-5p的表达
通过前面的研究步骤，可初步断定hsa_circ_0111659起着海绵吸附体的作用，通过qRT-PCR我们发现敲低hsa_circ_0111659后miR-20b-5p的表达量与对照组相比较可显著上升，具有统计学差异(P<0.01)；其表达量与hsa_circ_0111659的表达呈负相关性；通过对miR-20b-5p的表达的测定，可近一步断定hsa_circ_0111659通过吸附miR-20b-5p实现对下游靶基因的调控。
步骤(E)的具体方法是：
(1)子宫内膜修复过程中hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF调控通路
通过荧光素酶实验发现3者之间的结合；为了近一步验证3者之间的调控，在蛋白水平检测了在内膜修复中具有重要作用的VEGF以及相关受体的表达情况；显示转染了shRNA使hsa_circ_0111659敲低后的WJ-MSCs与损伤的ESC共培养，即敲低组与正常共培养组即对照组相比较，发现实验组的VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表达都较对照组相比有着显著的下降(P<0.01)；然而在敲低组中加入miR-20b-5p阻断剂后能部分恢复VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表达与敲低组相比具有统计学差异(P<0.01)，其中VEGF、VEGFR1与对照组相比仍有一定的差异，未能恢复到正常共培养状态；因此通过检测VEGF及其受体的蛋白的表达，发现敲低hsa_circ_0111659后可见VEGF及其受体蛋白表达下降，而这种作用可由miR-20b-5p阻断剂实现部分逆转；
(2)hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路对ESC的增殖能力的影响
结果显示在WJ-MSCs修复受损的ESC中存在hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路；但这条通路是否对ESC的增殖能力有一定的影响；通过CCK8实验我们发现hsa_circ_0111659敲低组与对照组及正常共培养组相比ESC的增殖能力有所下降(P<0.05)，然而在敲低组中加入miR-20b-5p阻断剂后可部分逆转ESC的增殖能力虽未完全恢复至对照组状态但与对照组相比无统计学差异(P>0.05)；因此hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路可调控ESC的增殖；
(3)hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路对ESC凋亡的影响
计算各实验组的ESC的凋亡率；流式术结果显示hsa_circ_0111659敲低组的ESC凋亡数目较对照组有所增加，具有统计学差异(P<0.05)；说明hsa_circ_0111659可调控ESC的凋亡，同样的加入miR-20b-5p阻断剂后可抑制ESC的凋亡率，并可恢复至对照组的状态，差异无统计学意义(P>0.05)；实验研究发现hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路可调控ESC的凋亡。
本发明研究发现hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复损伤的间质细胞中起着正向调控作用，敲低hsa_circ_0111659可降低ESC的增殖能力，增加ESC的凋亡细胞数。hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF这一靶向轴在内膜的修复中起着重要作用，hsa_circ_0111659为子宫内膜间质细胞的修复提供一条新的思路。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是原代培养的WJ-MSCs(A、B×100 C、D×200)示意图。
图2是ESC的原代培养(×200)示意图。
图3是CCK8测ESC增殖能力示意图。
图4是流式双染法检测ESC凋亡示意图。
图5、图6分别是hsa_circ_0111659在ESC(图6:A)和WJ-MSCs(图6:B)中的表达量示意图。
图7是WJ-MSCs病毒转染示意图。
图8是qRT-PCR检测hsa_circ_0111659的相对表达量示意图。
图9是敲低后hsa_circ_0111659检测ESC的增殖示意图。
图10是流式双染检测ESC的凋亡数目示意图。
图11是生物学预测靶向性结合示意图。
图12是hsa_circ_0111659/miR-20b-5p的靶向性验证示意图。
图13是miR-20b-5p/VEGF的靶向验证示意图。
图14是hsa_circ_0111659和miR-20b-5p的双定位(FISH)示意图。
图15是miR-20b-5P的相对表达量示意图。
图16是检测VEGF、VEGFR1、VEGFR2的蛋白表达示意图。
图17是CCK8测ESC增殖能力示意图。
图18是流式双染检测ESC凋亡示意图。
具体实施方式
一种Hsa_circ_0111659在制备WJ-MSCs修复受损子宫内膜制剂中的应用。
材料与方法
2.1研究资料及仪器设备
2.1.1细胞组织来源
(1)脐带组织：来源于正常足月剖宫产新生儿。(由南通大学附属医院提供)
(2)子宫内膜：来源于因患子宫肌瘤(粘膜下肌瘤除外)患者术前月经周期规则、未放置宫内节育器、术前六个月未接受激素类药物治疗、未合并其他内外科疾病以及术后病理确证无内膜病变。(由南通大学附属医院提供)
2.1.2主要仪器
(1)立式压力蒸汽灭菌机(日本SANYO公司)
(2)超低温冷冻冰箱(日本SANYO公司)
(3)CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)
(4)超净工作台(日本AIRTECK公司)
(5)倒置相差显微镜(日本Olympus公司)
(6)室温离心机及低温冷冻离心机(美国Eppendorff公司)
(7)流式细胞仪(美国BD公司)
(8)制冰机(日本SANYO公司)
(9)超纯水仪(美国Millipore公司)
(10)电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad公司)
(11)倒置荧光相差显微镜及照相系统(德国Leica公司)
(12)Onedrop超微量分光光度计(瑞士Mettler Toledo公司)
(13)多功能酶标仪(美国BioTeck公司)
(14)PCR基因扩增仪(美国Eppendorff公司)
(15)Step OneTM Realtime PCR体系(美国AB公司)
(16)移液器(美国Eppendorf公司)
(17)细胞培养瓶及培养皿美国(Corning公司)
(18)离心管(美国BD公司)
(19)Transwell小室(美国Corning公司)
(20)PCR八连管(瑞士Roche公司)
(21)无酶离心管、枪头(美国axygen公司)
(22)激光共聚焦显微镜(TCS SP2 AOBS)
(23)荧光照度计(Turner Biosystems instrument)
(24)PVDF膜(美国Millipore公司)
2.1.3细胞培养及冻存
(1)DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)
(2)胎牛血清(美国Hyclone公司)
(3)I型胶原酶(美国Sigma公司)
(4)Tryple酶(美国Gibco公司)
(5)0.25％胰酶/EDTA(1x)(美国Gibco公司)
(6)0.25％胰酶(不含EDTA)(美国Gibco公司)
(7)青霉素/链霉素双抗溶液(美国Gibco公司)
(8)二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)
(9)PBS(美国Gibco公司)
(10)细胞冻存液：70％的DMEM/F12，20％的FBS，10％的DMSO。
(11)完全培养基：90％的DMEM/F12，10％的FBS，混匀置于4度保存备用。
(12)低血清培养基：98％的DMEM/F12，2％的FBS，混匀置于4度保存备用。
2.1.4子宫内膜损伤模型
(1)米非司酮(美国Sigma公司)
(2)无水乙醇(上海生工生物技术工程有限公司)
2.1.5 CCK8
CCK8试剂盒(日本同仁公司)
2.1.6流式凋亡
流式Annexin-V凋亡检测试剂盒(美国BD公司)
2.1.7细胞转染
(1)lipofectamine2000(汉恒生物)
(2)hsa_circ_0111659腺病毒(汉恒生物)
(3)MiR-20b-5p海绵封闭(汉恒生物)
2.1.8 qPCR
(1)Trizol总RNA提取液(美国Invitrogen公司)
(2)第一链cDNA合成试剂盒(瑞士Roche公司)
(3)FS Universal SYBR Green Master(瑞士Roche公司)
(4)异丙醇(上海生工生物技术工程有限公司)
(5)氯仿(上海生工生物技术工程有限公司)
(6)PCR引物(上海生工生物技术工程有限公司)
hsa_circ_0111659上游：GGCTGAGTGATTTACTGCCTTGT
下游：GGTCTTTTCCTGCAGAGGTGTT
GAPDH上游：CTG GGC TAC ACT GAG CAC C
下游：AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG
miR-20b-5p上游：GCTGCAAAGTGCTCATAGTG
下游：GCAGGGTCCGAGGTATTC
U6上游：CTCGCTTCGGCAGCACA
下游：AACGCTTCACGAATTTGCGT
2.1.9 Western blot
(1)兔抗人VEGF多克隆抗体(英国Abcam公司)
(2)兔抗人VEGFR1单克隆抗体(英国Abcam公司)
(3)兔抗人VEGFR2多克隆抗体(英国Abcam公司)
(4)Western及IP细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)
(5)上样缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)
(6)SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(内含：30％Acr-Bis、1M Tris-HCL PH6.8及8.8、10％SDS、AP、TEMED)(上海碧云天生物技术有限公司)
(7)WB marker(美国Thermo公司)
(8)Western一抗稀释液(上海碧云天生物技术有限公司)
(9)Western二抗稀释液(上海碧云天生物技术有限公司)
(10)PVDF活化液(上海碧云天生物技术有限公司)
(11)TritonX-100(北京索莱宝科技有限公司)
(12)封闭液(上海碧云天生物技术有限公司)
(13)Western及IP细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)
(14)转膜液，电泳液(上海碧云天生物技术有限公司)
2.2实验流程及方法
2.2.1 WJ-MSCs的原代培养
(1)取足月剖宫产的健康新生儿脐带长约7-15cm，尽量挤净脐带中的血液，放入含有双抗的培养基中，于冰盒保存。
(2)于超净台取出，用PBS充分洗涤脐带中的血液。
(3)将脐带剪成约2cm的小段，再次充分漂洗，剖开脐带，剔除脐静脉、脐动脉后开始剥离华通氏胶。
(4)将华通氏胶剪成适当组织块大小，离心去上清，用完全培养基重悬，使组织块均匀铺于75的细胞瓶内，放置于37℃含5％CO2培养箱中培养；
(5)每3天将组织块吸出，洗涤细胞瓶，洗涤组织块离心去上清重悬后均匀铺于75的细胞瓶内，
(7)待间充质干细胞生长至70％-80％融合后，去除组织块，进行细胞传代养至P3代备用。
2.2.2 ESC的原代培养
(1)离体后的子宫置于无菌台纵行剖开宫体，轻柔刮取内膜置于含有双抗的培养基中，于冰盒保存。
(2)于超净台取出，用PBS充分洗涤内膜组织。
(3)将子宫内膜组织剪成1-2mm3大小的碎块，1000r/min离心3-5min，去上清；
(4)在含组织的离心管内加入5倍体积终浓度为0.1％的Ⅰ型胶原酶吹打混匀，在培养箱中进行首次消化，每10min震荡一次，60min后取出。
(5)将消化液摇匀，分别用100μm和40μm孔径的细胞滤网过滤，收集过滤液以1000r/min离心5min，弃上清用完全培养基重悬后均匀接种于细胞培养瓶中。
(6)收集首次消化完的内膜组织重复上述(4)和(5)的步骤，可得到2次消化的间质细胞。
2.2.3细胞培养
(1)用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
(2)在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
(3)取出细胞培养瓶，打开瓶盖，吸掉旧培养液。
(4)用PBS洗涤细胞一至二次。
(5)加入适量trypsin-EDTA溶液，轻洗细胞皿底部。吸掉trypsin-EDTA溶液，放入37℃培养箱1-3分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，轻拍培养瓶壁使大部分细胞脱落，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用。
(6)以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，补足3n(n为传代瓶数)ml培养基，依稀释比例转移至新的培养瓶中。
(7)将细胞悬液分装入细胞瓶内，将细胞瓶放入37℃含5％CO2的培养箱内培养，换液的时间由细胞生长速度情况而定。
2.2.4人子宫内膜间质细胞体外损伤模型以及与WJ-MSCs共培体系的建立
(1)以1×105/ml的密度将间质细胞种植于6孔板中，每孔加2ml的完全培养基，置于37℃含5％CO2培养箱中培养；
(2)继续培养24h后以终浓度为60umol/L加入米非司酮溶液，米非司酮预先用无水乙醇溶解后用低血清培养基稀释成最终浓度。
(3)米非司酮作用48h后，显微镜观察细胞形态，全量更换培养基为
新鲜的低血清培养基，继续用于后续实验；
(4)利用Transwell(0.4um)小室建立共培养体系：
以1.0-1.5×105个细胞/孔将消化好的P3代WJ-MSCs细胞悬液1.5ml加入上层小室中，下层加入完全培养基2.6ml，置于37℃含5％CO2培养箱中。
细胞贴壁后全量更换为低血清培养基，继续培养24h后，取出种植有WJ-MSCs的小室，放入下层种植有间质细胞的培养板共培养，从而建立共培养体系。
2.2.5 CCK8
(1)使用24孔板建立共培养体系，细胞予处理或不处理后，每孔细胞更换500ul新低血清培养基后再加入50ul的CCK8
(2)避光置于37℃含5％CO2培养箱中2h
(3)放置酶标仪中在450nm处测吸光度，取3次均值。
2.2.6 FISH检测原位杂交：
Day0
WJ-MSC细胞培养，爬片。
Day 1
(1)PBS漂洗爬片3次，每次5min。
(2)加0.5％TritonX-100，室温孵育15min。
(3)加4％多聚甲醛，固定5min，PBS洗3次，每次5min。
(4)尽量吸干PBS，加100％乙醇，1min后吸弃乙醇，晾干。
(5)取适量杂交液按1:50稀释探针。
(6)探针变性：将探针置于PCR仪上，88℃变性5min，4℃平衡3min。
(7)在爬片上完全干燥后，将变性好的探针加在培养孔中浸没爬片。
(8)盖好培养孔，用封口胶封口，保湿，37℃孵育过夜(12-18h)。
Day 2(直标)
(1)吸去杂交探针液，用2×ssc漂洗爬片3次，每次5min，第一次42℃，后两次室温洗涤。
(2)取干净的载玻片，加50ul DAPI-Antifade溶液，将爬片轻轻盖于DAPI-Antifade液滴上(有细胞的一面朝下)，避免产生气泡。
(3)用rubber cement封片，放于暗处20min以上，镜下观察。
Day 2(二抗)
(1)吸去杂交探针液，用2×ssc漂洗爬片3次，每次5min，第一次42℃，后两次室温洗涤。
(2)滴加3％BSA，37℃封闭30min。
(3)加入稀释好的地高辛荧光二抗，37℃孵育1h。
(4)洗涤液洗3次，每次5min。
(5)取干净的载玻片，加50ul DAPI-Antifade溶液，将爬片轻轻盖于DAPI-Antifade液滴上(有细胞的一面朝下)，避免产生气泡。
(6)用rubber cement封片，放于暗处20min以上，镜下观察。
2.2.7质粒miRNA共转染
(1)转染前一晚以1x105个细胞接种于24孔板，确保转染时细胞汇合度达到70-80％。
2.2.8腺病毒及慢病毒转染
(1)转染前一晚以1.5x105个细胞接种于6孔板，确保转染时细胞汇合度达到70-80％。
2.2.9荧光素酶报告基因检测
(1)用Luciferase Reaction Buffer充分溶解冻干状态的Luciferase ReactionSubstrate(5ml+1vial)配成Luciferase Reaction Reagent，分装后避光保存，避免反复冻融。
(2)按1:50的比例将Luciferase Reaction Substrate II同LuciferaseReaction Buffer II混合配成Luciferase Reaction Reagent II，分装后避光保存，避免反复冻融。
(3)按1:4的比例将5x Cell Lysis Buffer同ddH2O混合备用。
(4)裂解细胞：转染后48h，吸弃培养基，用PBS洗涤细胞2遍，每孔加入100ul 1xCell Lysis Buffer，室温充分裂解10min。
(5)充分裂解后，取裂解液于1.5ml离心管，4℃12000×g离心10min，取上清用于测定。
(6)按仪器操作说明书开启荧光测定仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。
(7)萤火虫荧光素酶活性检测：取适量Luciferase Reaction Reagent平衡至室温，取样品20ul，加入100ul Luciferase Reaction Reagent，轻弹混匀后测定RLU(relative light unit)。以报告基因细胞裂解液为空白对照。
(8)海肾荧光素酶活性检测：取适量Luciferase Reaction Reagent II平衡至室温，在完成上述测定萤火虫荧光素酶活性检测步骤后，每管加入100ul LuciferaseReaction Reagent II，涡旋混匀后测定RLU(relative light unit)。
(9)在以萤火虫荧光素酶为内参的情况下，用海肾荧光素酶测定得到的RLU值除以萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。
2.2.10 RNA提取步骤
(1)细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；
(2)按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置5min；
(3)4℃，12,000g离心15min；
(4)吸取上层水相，移至另一离心管中；
(5)按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置10min；
(6)4℃，12,000g离心10min，弃上清；
(7)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
(8)4℃7,500g离心5min，尽量弃上清。
(9)室温晾干5-10min，加入20μl DEPC水溶解沉淀。
2.2.11逆转录
a.配制第一链cDNA合成反应液
b.按下列条件进行第一链cDNA合成反应
2.2.12 qPCR实验
a.qPCR反应体系配制
b.qPCR反应程序设置
2.2.13 Western blot检测相关蛋白表达
(1)根据每孔细胞数加入适量的细胞裂解液，置于冰上裂解10-15分钟。
(2)收集细胞裂解液转移至EP管中于4℃低温离心机离心，吸取上清至新的EP管中测定蛋白浓度。
(3)按标本：蛋白上样缓冲液＝4:1的比例向EP管中加入5×蛋白上样缓冲液，枪头混匀，沸水中煮沸5min后冷却以备用。
(4)按照说明书配置不同浓度的分离胶和5％的浓缩胶。
(5)凝胶板固定于电泳槽，倒入预冷的电泳液后每孔加入等量的蛋白样品最左最右孔加入彩虹marker
(6)恒压调节，起始电压为80 V,待待溴酚蓝进入分离胶后，改为100V直至溴酚蓝跑至分离胶的底部关闭电源。
(7)根据目的蛋白的大小来切割凝胶，剪取和凝胶适当大小的PVDF膜并置于PVED活化液中活化。
(8)从正极到负极依次放好好海绵垫、厚滤纸、分离胶、PVDF膜、厚滤纸、海绵垫。
(9)将转膜装置放置冰盒中进行转膜，设定恒流300mv,根据分子大小设置转膜时间。
(10)转膜完成后将PVDF膜置于封闭液中，一般室温约封闭2h。
(11)用预先配置好的PBST洗膜，每次5min，共3次。
(12)一抗按适当比例用一抗稀释液稀释，将PDF膜完全置于一抗中并于4℃过夜。
(13)过夜后用预先配置好的PBST洗膜，每次5min，共3次。回收一抗。
(14)按1∶1000的比例用2抗稀释液稀释2抗，将配置好的二抗滴于PVDF膜，室温孵育2h。
(15)用预先配置好的PBST洗膜，每次5min，共3次。
(16)按ECL试剂盒说明书将A、B液等体积混合，在膜上滴加配好的显影液；凝胶成像系统拍照、保存。
2.2.14流式细胞术测凋亡
(1)收集各实验孔内的培养基至相应的离心管内。
(2)用预冷的PBS洗涤细胞2次，洗涤液也回收至相应的离心管内。
(3)加入适量的不含EDTA的胰酶消化5min，加入完全培养基终止消化。轻柔的吹打细胞，并收集至离心管内。
(4)用预冷的PBS洗涤细胞2次，用1×的缓冲液重悬细胞1×106/ml。
(5)取每实验管内的100ul的细胞悬液至流式管内。
(6)每管内分别各加入5ul的FITC Annexin V和5ul的PI。
(7)于室温下避光15min后，每管加入400ul的1×的缓冲液重悬细胞，于1h内上机检测。
2.2.15统计学分析
统计学处理运用Graphed Prism 7.0软件进行数据分析，以p＜0.05表示数据有统计学意义，所有实验重复3次。
3.结果
3.1 WJ-MSCs的原代及传代培养
组织植块法培养14天后，可以观察到细胞大面积融合(图1：A)，去除组织块后可进行细胞传代(图1:C)，传代后的细胞生长较原代生长较迅速，P3代细胞可呈典型的长梭形(图1：B和D)
3.2原代ESC的培养
经2次酶消化法可得到较多的ESC，24h后发现可发现细胞完全贴壁，原代的ESC呈三角形。细胞融合后传代后的ESC呈长梭形。ESC可稳定传5-6代。
3.3 CCK8测ESC的增殖能力
通过CCK8实验检测各实验组ESC的增殖能力，通过检测24h、48h、72h这3个时间点的OD值，研究发现损伤的ESC较正常未损伤的ESC增殖能力显著降低，具有统计学差异(p<0.01)，损伤的ESC与WJ-MSCs共培养后发现可部分恢复损伤的ESC的增殖能力，具有统计学差异(P<0.05)，但未恢复正常ESC的增殖能力。CCK8可说明WJ-MSCs对受损的ESC有一定的修复作用。
3.4流式测凋亡
通过流式双染法测ESC的凋亡率。通过统计各图的右上象限和右下象限占整个象限的比值来计算各实验组的ESC的凋亡率。损伤组与正常组相比较细胞凋亡率可显著增加，具有统计学差异(p<0.01)。损伤组与干细胞共培养48h后发现凋亡率较单纯损伤组有所下降，具有统计学差异(P<0.05)，但较正常组相比较仍有较高的凋亡率。流式实验发现WJ-MSCs与损伤的ESC共培养后可减少ESC的凋亡，但较难恢复到正常状态。
3.5基因芯片分析及qRT-PCR验证基因芯片的分析结果
通过CCK8和流式双染法可见WJ-MSCs对损伤的ESC有一定的修复能力。通过对损伤共培养和损伤未共培养的ESC进行芯片分析，筛选在WJ-MSCs促进间质细胞修复过程中差异表达的circRNAs发现表达显著上调的circRNAs有5000多个，显著下调的有2000多个。根据生物学功能及表达量挑选出hsa_circ_0111659作为后续分子作为功能研究。
通过qRT-PCR检测hsa_circ_0111659在ESC(T:与WJ-MSCs共培养的损伤的ESC N：损伤的ESC)(图5)和WJ-MSCs(T：与损伤的ESC共培养的WJ-MSCs N：正常的WJ-MSCs)(图6)的中的24h、48h、72h表达量，实验结果显示hsa_circ_0111659随时间的发展呈现一个下降趋势，可能是在细胞增殖过程中CircRNA中被降解稀释有关。并且我们发现hsa_circ_0111659在WJ-MSCs中的表达量低于在ESC的表达量，这可能是因为除了WJ-MSC分泌的circRNA之外，ESC还可以分泌一小部分circRNA。
3.6敲低hsa_circ_0111659在WJ-MSCs中的表达对WJ-MSCs修复受损ESC的影响
在WJ-MSCz中转染病毒观察转染效率。通过绿色荧光观察病毒转染效率，目的病毒转染(图7：A)和空载体病毒转染(图7：B)。通过qRT-PCR验证3条shRNA的敲低效率(图8)：实验显示ShRNA1与对照组相比无统计学差异(P>0.05),shRNA2和shRNA3与对照组相比有统计学差异(P<0.01)且以shRNA3效果最佳。选取干扰效果最佳的shRNA3进行后续实验。
敲低hsa_circ_0111659后对ESC增殖能力及凋亡的影响。观察24、48、72h、3个时间点敲低后的WJ-MSCs对损伤ESC的增殖情况的影响。与对照组及正常共培养组相比较，CCK8(图9)显示hsa_circ_0111659敲低组ESC的细胞增殖能力下降与对照组相比较(P<0.05)。同时通过流式双染(图10)发现敲低hsa_circ_0111659后使WJ-MSCs与损伤的ESC共培养48h与对照组相比可使细胞凋亡数目增加(P<0.01)。通过CCK8和流式双染实验我们发现hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复受损的ESC具有一定的生物学功能。
3.7 hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF的靶向作用
运用生物信息学软件预测分析hsa_circ_0111659与miR-20b-5p有结合位点，miR-20b-5p与VEGF又结合位点(图11)。使用293T工具细胞进行质粒的转染，在转染克隆有野生型hsa_circ_0111659片段的质粒的实验，miR-20b-5p组与空白组相比较(P<0.05)，miR-20b-5p组与NC组相比(P<0.05)，都显著影响荧光活性，说明miR-20b-5p能通过结合载体3’UTR区的WT hsa_circ_0111659基因序列影响其荧光活性改变，hsa_circ_0111659和miR-20b-5p可能存在相互作用；在转染克隆有突变型hsa_circ_0111659片段的质粒的实验中，miR-20b-5p组与空白组相比较(P<0.05)，miR-20b-5p组与NC组相比(P<0.05)，都显著影响荧光活性，说明miR-20b-5p能通过结合载体3’UTR区的mut hsa_circ_0111659基因序列影响其荧光活性改变，突变位点可能不完全(可能存在其它结合位点)。(图12)
在转染克隆有野生型VEGFA-3’UTR质粒的实验中miR-20b-5p组与空白组相比较，(P<0.05)，miR-20b-5p组与NC组相比(P<0.01)，都显著影响荧光活性，说明miR-20b-5p能通过结合载体3’UTR区的wt VEGFA-3‘UTR影响其荧光活性改变，VEGFA-3‘UTR和miR-20b-5p可能存在相互作用；在转染克隆有突变型VEGFA-3’UTR质粒的实验中，miR-20b-5p组与空白组和NC组相比较(P>0.05)荧光活性均未有改变，均无统计学差异，说明miR-20b-5p不能通过结合载体3’UTR区的mut VEGFA-3‘UTR影响其荧光活性改变，结合位点突变完全。(图13)
3.8 hsa_circ_0111659和miR-20b-5p的定位
WJ-MSCs细胞fish检测hsa_circ_0111659和miR-20b-5p的细胞定位。绿色(图14：A)：hsa_circ_0111659，红色(图14:B)：miR-20b-5p，：蓝色(图14:C)：DAPI染色核定位，右下(图14:D):以上三张重叠图。我们可以从图中发现hsa_circ_0111659主要定位于细胞质中这一定位说明它主要起着海绵吸附功能，结合荧光素酶报告实验我们可断定hsa_circ_0111659起着miR-20b-5p海绵吸附体的作用。
3.9 hsa_circ_0111659敲低后的miR-20b-5p的表达
通过前面的研究我们可初步断定hsa_circ_0111659起着海绵吸附体的作用，通过qRT-PCR我们发现敲低hsa_circ_0111659后miR-20b-5p的表达量与对照组相比较可显著上升，具有统计学差异(P<0.01)(图15)。其表达量与hsa_circ_0111659的表达呈负相关性。通过对miR-20b-5p的表达的测定，我们可近一步断定hsa_circ_0111659通过吸附miR-20b-5p实现对下游靶基因的调控。
3.10子宫内膜修复过程中hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF调控通路
通过荧光素酶实验我们发现3者之间的结合。为了近一步验证3者之间的调控，我们在蛋白水平检测了在内膜修复中具有重要作用的VEGF以及相关受体的表达情况。我们的研究显示转染了shRNA使hsa_circ_0111659敲低后的WJ-MSCs与损伤的ESC共培养即敲低组与正常共培养组即对照组相比较我们可以发现实验组的VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表达都较对照组相比有着显著的下降(P<0.01)。然而在敲低组中加入miR-20b-5p阻断剂后能部分恢复VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表达与敲低组相比具有统计学差异(P<0.01)，其中VEGF、VEGFR1与对照组相比仍有一定的差异，未能恢复到正常共培养状态(图16)。因此通过检测VEGF及其受体的蛋白的表达，我们发现敲低hsa_circ_0111659后可见VEGF及其受体蛋白表达下降，而这种作用可由miR-20b-5p阻断剂实现部分逆转。
3.11 hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路对ESC的增殖能力的影响
我们的研究结果显示在WJ-MSCs修复受损的ESC中存在hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路。但这条通路是否对ESC的增殖能力有一定的影响。通过CCK8实验我们发现hsa_circ_0111659敲低组与对照组及正常共培养组相比ESC的增殖能力有所下降(P<0.05)，然而在敲低组中加入miR-20b-5p阻断剂后可部分逆转ESC的增殖能力虽未完全恢复至对照组状态但与对照组相比无统计学差异(P>0.05)(图17)。因此hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路可调控ESC的增殖。
3.12 hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路对ESC凋亡的影响
通过统计各图的右上象限和右下象限占整个象限的比值来计算各实验组的ESC的凋亡率。流式术结果显示hsa_circ_0111659敲低组的ESC凋亡数目较对照组有所增加，具有统计学差异(P<0.05)。说明hsa_circ_0111659可调控ESC的凋亡，同样的加入miR-20b-5p阻断剂后可抑制ESC的凋亡率，并可恢复至对照组的状态，差异无统计学意义(P>0.05)(图18)。实验研究发现hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路可调控ESC的凋亡。
4.讨论
环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种新的内源性非编码RNA，广泛存在于真核细胞中，具有稳定性、进化保守性以及细胞、组织特异性。随着二代测序技术和生物信息学的快速发展，circRNA逐渐被研究者们所了解。研究表明，circRNA参与细胞内RNA调控网络，其表达变化与疾病的发生、发展有密切关联，现有的研究表明环状RNA在调控组织修复中起着关键的作用，大多起着海绵吸附作用来调控下游靶基因的表达。
子宫内膜功能的完整性对女性生育有着重要的意义，由于宫腔内机械性操作可导致子宫内膜的严重受损如宫腔黏连，破坏子宫内膜的基底层时可导致闭经、不孕等一系列问题严重影响女性的生理和心理健康。关于子宫内膜的自我修复机制目前主要有3种理论：一是基底层的腺上皮分化为腔上皮后再生；二是间质细胞转化为上皮细胞；三是内膜干细胞分化为腔上皮后再生。子宫内膜的自我修复主要依赖于基底层的完整性一旦基底层破坏后，内膜很难完成自我的修复。因此寻求安全，有效的治疗措施来达到内膜的修复已成为人们关注的焦点。
目前WJ-MSCs在再生医学中已取得广泛的应用，以往的大量研究已表明WJ-MSCs在神经系统疾病、心血管疾病、血液病、糖尿病、肌肉变性病、肝脏疾病及慢性疼痛等的治疗研究中取得了良好的疗效。Ling L等人发现通过局部注射MSCs可改善大鼠卵巢早衰，显著改善卵巢的功能。MSC注射改善卵巢局部微环境，导致卵巢细胞Bax表达下降，Bcl-2和内源性VEGF表达增加，抑制化疗诱导的细胞凋亡，促进血管生成，调节卵泡发育。Huan Ting Ong等人在研究慢性伤口愈合时发现MSC可通过旁分泌VEGF来促进伤口的愈合。大量的研究表明了MSC对组织损伤有着强大的修复作用。本课题组在前期的研究中也已证实了WJ-MSCs可修复损伤的子宫内膜且VEGF起着重要的作用。本实验的主要目的在于探讨环状RNA在WJ-MSCs修复受损的子宫内膜中的作用并通过何种机制发挥作用。
我们通过构建WJ-MSCs与损伤子宫内膜间质细胞共培养模型，采用circRNAs基因芯片初步发现在WJ-MSCs促进间质细胞修复过程中表达显著上调的cirRNA有5000多个，显著下调的有2000多个。我们在上调的cirRNAs中选择了hsa_circ_0111659作为后续分子进行研究。因为hsa_circ_0111659是经qRT-PCR验证和芯片结果一致，且表达量在WJ-MSCs和ESC中都较高的cirRNA。研究发现hsa_circ_0111659在损伤共培养中的表达量明显高于未损伤共培养中的表达量。由此我们推测hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复损伤的间质细胞中可能起着重要的作用。首先我们在敲低hsa_circ_0111659的表达后发现WJ-MSCs对损伤的间质细胞得修复作用有所减弱较未敲低组相比，通过CCK8发现ESC增殖能力下降，流式细胞术检测子宫内膜间质细胞凋亡数目增加，这些实验可初步验证hsa_circ_0111659具有一定的生物学功能。
为进一步探讨其中的研究机制我们通过生物信息学软件发现miR-20b-5p与hsa_circ_0111659和VEGF都有相应的结合位点，由此推测hsa_circ_0111659是否通过吸附miR-20b-5p来调控VEGF的表达从而达到修复子宫内膜的作用。通过fish实验我们发现hsa_circ_0111659和miR-20b-5p在细胞质中均有大量的表达可初步说明hsa_circ_0111659起着海绵吸附作用。双荧光素酶实验报告近一步表明hsa_circ_0111659和miR-20b-5p以及miR-20b-5p和VEGF的靶向性。既往的研究表明miR-20b-5p与VEGF呈负相调节，Luo Y等人的研究中表明在肝癌细胞中miR-20b-5p表达是显著下调的，VEGF的表达是上调的，它俩呈现一个负相关调控。VEGF作为内皮血管生长因子可显著促进血管的生成进而促进肿瘤细胞的增殖。本研究发现在WJ-MSCs中敲低hsa_circ_0111659后miR-20b-5p的表达量是上调的，从蛋白水平检测VEGF其表达量呈现下调趋势。本实验同时也检测了相关受体的表达发现VEGFR1和VEGFR2的表达量均有下降，VEGFR2的下降更显著，通过回复实验发现在加入miR-20b-5p的阻断剂后可部分逆转VEGF、VEGFR1、VEGFR2的下调。通过CCK8及流式Annexin V-FITC/PI双染我们均可发现加入miR-20b-5p的阻断剂后可部分逆转了间质细胞的增殖能力和显著减少子宫内膜间质细胞凋亡数目。
总之我们的研究发现hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复损伤的间质细胞中起着正向调控作用，敲低hsa_circ_0111659可降低ESC的增殖能力，增加ESC的凋亡细胞数。hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF这一靶向轴在内膜的修复中起着重要作用，hsa_circ_0111659的发现为子宫内膜间质细胞的修复提供一条新的思路。
5.结论
1、共培养组与单纯损伤的ESC组及单纯WJ-MSCs组相比较，hsa_circ_0111659在共培养模型中表达呈现上调趋势。
2、hsa_circ_0111659敲低可抑制WJ-MSCs对受损子宫内膜间质细胞的修复作用。
3、hsa_circ_0111659靶向作用于miR-20b-5p，并与之呈现负向调控关系。
4、hsa_circ_0111659通过吸附miR-20b-5p调控VEGF发挥作用，从而调控ESC的增殖、凋亡和修复。

Claims (7)

1.一种研究Hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复ESC中的作用机制的方法，其特征是：包括下列步骤：
(A)取正常足月剖宫产新生儿脐带，进行华通氏胶的剥离并采用组织植块法培养原代人脐带间充质干细胞；收集全子宫切除的内膜组织，采用酶消化法培养原代子宫内膜间质细胞；
(B)构建体外ESC损伤模型，运用transwell建立WJ-MSCs和损伤ESC共培养模型，共培养48小时后通过CCK8，流式Annexin V-FITC/PI双染观察WJ-MSCs对损伤ESC的修复作用；并收集损伤共培养和损伤未共培养的ESC进行基因芯片和生物信息分析；通过qRT-PCR验证基因芯片的分析结果，根据生物学功能及表达量挑选出hsa_circ_0111659作为后续分子，作为功能分析；
(C)建立损伤的ESC与WJ-MSCs共同培养体系，构建shRNA对hsa_circ_0111659进行敲低，并通过CCK8检测对细胞增殖能力的影响，通过流式Annexin V-FITC/PI双染测细胞凋亡率；
(D)运用生物信息学软件预测分析hsa_circ_0111659的下游靶点并运用RNA荧光原位杂交实验和荧光素酶实验验证其与下游靶点的结合作用；
(E)应用CCK8、流式双染、Western blot法进一步验证和探索hsa_circ_0111659对miR-20b-5p/VEGF信号通路的调控作用。
2.根据权利要求1所述的研究Hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复受损子宫内膜中的作用机制的方法，其特征是：步骤(A)的具体方法是：
(一)WJ-MSCs的原代培养：
(1)取足月剖宫产的健康新生儿脐带长约7-15cm，尽量挤净脐带中的血液，放入含有双抗的培养基中，于冰盒保存；
(2)于超净台取出，用PBS充分洗涤脐带中的血液；
(3)将脐带剪成约2cm的小段，再次充分漂洗，剖开脐带，剔除脐静脉、脐动脉后开始剥离华通氏胶；
(4)将华通氏胶剪成适当组织块大小，离心去上清，用完全培养基重悬，使组织块均匀铺于75的细胞瓶内，放置于37℃含5％CO2培养箱中培养；
(5)每3天将组织块吸出，洗涤细胞瓶，洗涤组织块离心去上清重悬后均匀铺于75的细胞瓶内；
(6)待间充质干细胞生长至70％-80％融合后，去除组织块，进行细胞传代养至P3代备用；
(二)ESC的原代培养：
(1)离体后的子宫置于无菌台纵行剖开宫体，轻柔刮取内膜置于含有双抗的培养基中，于冰盒保存；
(2)于超净台取出，用PBS充分洗涤内膜组织；
(3)将子宫内膜组织剪成1-2mm3大小的碎块，1000r/min离心3-5min，去上清；
(4)在含组织的离心管内加入5倍体积终浓度为0.1％的Ⅰ型胶原酶吹打混匀，在培养箱中进行首次消化，每10min震荡一次，60min后取出；
(5)将消化液摇匀，分别用100μm和40μm孔径的细胞滤网过滤，收集过滤液以1000r/min离心5min，弃上清用完全培养基重悬后均匀接种于细胞培养瓶中；
(6)收集首次消化完的内膜组织重复上述(4)和(5)的步骤，可得到2次消化的间质细胞。
3.根据权利要求1所述的研究Hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复受损子宫内膜中的作用机制的方法，其特征是：步骤(B)的具体方法是：
(一)细胞培养
(1)用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面；
(2)在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶；
(3)取出细胞培养瓶，打开瓶盖，吸掉旧培养液；
(4)用PBS洗涤细胞一至二次；
(5)加入trypsin-EDTA溶液，洗细胞皿底部；吸掉trypsin-EDTA溶液，放入37℃培养箱1-3分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，拍培养瓶壁使大部分细胞脱落，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用；
(6)以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，补足3ml培养基，依稀释比例转移至新的培养瓶中；其中n为传代瓶数；
(7)将细胞悬液分装入细胞瓶内，将细胞瓶放入37℃含5％CO2的培养箱内培养，换液的时间由细胞生长速度情况而定；
(二)人子宫内膜间质细胞体外损伤模型以及与WJ-MSCs共培体系的建立：
(1)以1×105/ml的密度将间质细胞种植于6孔板中，每孔加2ml的完全培养基，置于37℃含5％CO2培养箱中培养；
(2)继续培养24h后以终浓度为60umol/L加入米非司酮溶液，米非司酮预先用无水乙醇溶解后用低血清培养基稀释成最终浓度；
(3)米非司酮作用48h后，显微镜观察细胞形态，全量更换培养基为新鲜的低血清培养基，继续用于后续实验；
(4)利用Transwell 0.4um小室建立共培养体系：
以1.0-1.5×105个细胞/孔将消化好的P3代WJ-MSCs细胞悬液1.5ml加入上层小室中，下层加入完全培养基2.6ml，置于37℃含5％CO2培养箱中；
细胞贴壁后全量更换为低血清培养基，继续培养24h后，取出种植有WJ-MSCs的小室，放入下层种植有间质细胞的培养板共培养，从而建立共培养体系；
(三)CCK8试验
(1)使用24孔板建立共培养体系，细胞予处理或不处理后，每孔细胞更换500ul新低血清培养基后再加入50ul的CCK8；
(2)避光置于37℃含5％CO2培养箱中2h；
(3)放置酶标仪中在450nm处测吸光度，取3次均值；
(四)FISH检测原位杂交：
Day0：
WJ-msc细胞培养，爬片；
Day1：
(1)PBS漂洗爬片3次，每次5min；
(2)加0.5％TritonX-100，室温孵育15min；
(3)加4％多聚甲醛，固定5min，PBS洗3次，每次5min；
(4)尽量吸干PBS，加100％乙醇，1min后吸弃乙醇，晾干；
(5)取适量杂交液按1:50稀释探针；
(6)探针变性：将探针置于PCR仪上，88℃变性5min，4℃平衡3min；
(7)在爬片上完全干燥后，将变性好的探针加在培养孔中浸没爬片；
(8)盖好培养孔，用封口胶封口，保湿，37℃孵育过夜；
Day2：
(1)吸去杂交探针液，用2×ssc漂洗爬片3次，每次5min，第一次42℃，后两次室温洗涤；
(2)取干净的载玻片，加50ul DAPI-Antifade溶液，将爬片轻轻盖于DAPI-Antifade液滴上，有细胞的一面朝下，避免产生气泡；
(3)用rubber cement封片，放于暗处20min以上，镜下观察；
Day3：
(1)吸去杂交探针液，用2×ssc漂洗爬片3次，每次5min，第一次42℃，后两次室温洗涤；
(2)滴加3％BSA，37℃封闭30min；
(3)加入稀释好的地高辛荧光二抗，37℃孵育1h；
(4)洗涤液洗3次，每次5min；
(5)取干净的载玻片，加50ul DAPI-Antifade溶液，将爬片轻轻盖于DAPI-Antifade液滴上，有细胞的一面朝下，避免产生气泡；
(6)用rubber cement封片，放于暗处20min以上，镜下观察；
(五)质粒miRNA共转染
转染前一晚以1x105个细胞接种于24孔板，确保转染时细胞融合度达到70-80％；
(六)腺病毒及慢病毒转染
转染前一晚以1.5x105个细胞接种于6孔板，确保转染时细胞融合度达到70-80％；
(七)荧光素酶报告基因检测
(1)用Luciferase Reaction Buffer充分溶解冻干状态的Luciferase ReactionSubstrate5ml+1vial配成Luciferase Reaction Reagent，分装后避光保存，避免反复冻融；
(2)按1:50的比例将Luciferase Reaction Substrate II同Luciferase ReactionBuffer II混合配成Luciferase Reaction Reagent II，分装后避光保存，避免反复冻融；
(3)按1:4的比例将5x Cell Lysis Buffer同ddH2O混合备用；
(4)裂解细胞：转染后48h，吸弃培养基，用PBS洗涤细胞2遍，每孔加入100ul1x CellLysis Buffer，室温充分裂解10min；
(5)充分裂解后，取裂解液于1.5ml离心管，4℃12000×g离心10min，取上清用于测定；
(6)按仪器操作说明书开启荧光测定仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒；
(7)萤火虫荧光素酶活性检测：取适量Luciferase Reaction Reagent平衡至室温，取样品20ul，加入100ul Luciferase Reaction Reagent，轻弹混匀后测定RLU；以报告基因细胞裂解液为空白对照；
(8)海肾荧光素酶活性检测：取适量Luciferase Reaction Reagent II平衡至室温，在完成上述测定萤火虫荧光素酶活性检测步骤后，每管加入100ul Luciferase ReactionReagent II，涡旋混匀后测定RLU；
(9)在以萤火虫荧光素酶为内参的情况下，用海肾荧光素酶测定得到的RLU值除以萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值；根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度；
(八)RNA提取步骤
(1)细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；
(2)按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置5min；
(3)4℃，12,000g离心15min；
(4)吸取上层水相，移至另一离心管中；
(5)按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置10min；
(6)4℃，12,000g离心10min，弃上清；
(7)按1ml75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
(8)4℃7,500g离心5min，尽量弃上清；
(9)室温晾干5-10min，加入20μl DEPC水溶解沉淀；
(九)逆转录
a.配制第一链cDNA合成反应液
b.按下列条件进行第一链cDNA合成反应
(十)qPCR实验
a.qPCR反应体系配制
b.qPCR反应程序设置
(十一)Western blot检测相关蛋白表达
(1)根据每孔细胞数加入适量的细胞裂解液，置于冰上裂解10-15分钟；
(2)收集细胞裂解液转移至EP管中于4℃低温离心机离心，吸取上清至新的EP管中测定蛋白浓度；
(3)按标本：蛋白上样缓冲液＝4:1的比例向EP管中加入5×蛋白上样缓冲液，枪头混匀，沸水中煮沸5min后冷却以备用；
(4)按照说明书配置不同浓度的分离胶和5％的浓缩胶；
(5)凝胶板固定于电泳槽，倒入预冷的电泳液后每孔加入等量的蛋白样品最左最右孔加入彩虹marker；
(6)恒压调节，起始电压为80V，待待溴酚蓝进入分离胶后，改为100V直至溴酚蓝跑至分离胶的底部关闭电源；
(7)根据目的蛋白的大小来切割凝胶，剪取和凝胶适当大小的PVDF膜并置于PVED活化液中活化；
(8)从正极到负极依次放好好海绵垫、厚滤纸、分离胶、PVDF膜、厚滤纸、海绵垫；
(9)将转膜装置放置冰盒中进行转膜，设定恒流300mv,根据分子大小设置转膜时间；
(10)转膜完成后将PVDF膜置于封闭液中，一般室温约封闭2h；
(11)用预先配置好的PBST洗膜，每次5min，共3次；
(12)一抗按适当比例用一抗稀释液稀释，将PDF膜完全置于一抗中并于4℃过夜；
(13)过夜后用预先配置好的PBST洗膜，每次5min，共3次。回收一抗；
(14)按1:1000的比例用2抗稀释液稀释2抗，将配置好的二抗滴于PVDF膜，室温孵育2h；
(15)用预先配置好的PBST洗膜，每次5min，共3次；
(16)按ECL试剂盒说明书将A、B液等体积混合，在膜上滴加配好的显影液；凝胶成像系统拍照、保存；
(十二)流式细胞术测凋亡
(1)收集各实验孔内的培养基至相应的离心管内；
(2)用预冷的PBS洗涤细胞2次，洗涤液也回收至相应的离心管内；
(3)加入适量的不含EDTA的胰酶消化5min，加入完全培养基终止消化；轻柔的吹打细胞，并收集至离心管内；
(4)用预冷的PBS洗涤细胞2次，用1×的缓冲液重悬细胞1×106/ml；
(5)取每实验管内的100ul的细胞悬液至流式管内；
(6)每管内分别各加入5ul的FITC Annexin V和5ul的PI；
(7)于室温下避光15min后，每管加入400ul的1×的缓冲液重悬细胞，于1h内上机检测；
(十三)统计学分析
统计学处理运用Graphed Prism 7.0软件进行数据分析，以p＜0.05表示数据有统计学意义，所有实验重复3次；
(十四)CCK8测ESC的增殖能力
通过CCK8实验检测各实验组ESC的增殖能力，通过检测24h、48h、72h这3个时间点的OD值，研究发现损伤的ESC较正常未损伤的ESC增殖能力显著降低，具有统计学差异，p<0.01，损伤的ESC与WJ-MSCs共培养后发现可部分恢复损伤的ESC的增殖能力，具有统计学差异，P<0.05，但未恢复正常ESC的增殖能力；CCK8可说明WJ-MSCs对受损的ESC有一定的修复作用；
(十五)流式测凋亡
通过流式双染法测ESC的凋亡率。通过统计各图的右上象限和右下象限占整个象限的比值来计算各实验组的ESC的凋亡率。损伤组与正常组相比较细胞凋亡率可显著增加，具有统计学差异，p<0.01；损伤组与干细胞共培养48h后发现凋亡率较单纯损伤组有所下降，具有统计学差异，P<0.05，但较正常组相比较仍有较高的凋亡率；流式实验发现WJ-MSCs与损伤的ESC共培养后可减少ESC的凋亡，但较难恢复到正常状态；
(十六)基因芯片分析及qRT-PCR验证基因芯片的分析结果
通过CCK8和流式双染法可见WJ-MSCs对损伤的ESC有一定的修复能力；通过对损伤共培养和损伤未共培养的ESC进行芯片分析，筛选在WJ-MSCs促进间质细胞修复过程中差异表达的circRNAs发现表达显著上调的circRNAs有5000多个，显著下调的有2000多个；根据生物学功能及表达量挑选出hsa_circ_0111659作为后续分子作为功能研究；
通过qRT-PCR检测hsa_circ_0111659在ESC和WJ-MSCs的中的24h、48h、72h表达量，显示hsa_circ_0111659随时间的发展呈现一个下降趋势，可能是在细胞增殖过程中CircRNA中被降解稀释有关；并且发现hsa_circ_0111659在WJ-MSCs中的表达量低于在ESC的表达量，这可能是因为除了WJ-MSC分泌的circRNA之外，ESC还可以分泌一小部分circRNA；
4.根据权利要求1所述的研究Hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复受损子宫内膜中的作用机制的方法，其特征是：步骤(C)的具体方法是：
敲低hsa_circ_0111659在WJ-MSCs中的表达对WJ-MSCs修复受损ESC的影响：
在WJ-MSCs中转染病毒观察转染效率；通过绿色荧光观察病毒转染效率，目的病毒转染和空载体病毒转染；通过qRT-PCR验证3条shRNA的敲低效率：实验显示shRNA1与对照组相比无统计学差异，P>0.05，shRNA2和shRNA3与对照组相比有统计学差异，P<0.01，且以shRNA3效果最佳；选取干扰效果最佳的shRNA3进行后续实验；
敲低hsa_circ_0111659后对ESC增殖能力及凋亡的影响：观察24h、48h、72h3个时间点敲低后的WJ-MSCs对损伤ESC的增殖情况的影响；与对照组即正常共培养组相比较，CCK8显示hsa_circ_0111659敲低组ESC的细胞增殖能力下降，P<0.05；同时通过流式双染发现敲低hsa_circ_0111659后使WJ-MSCs与损伤的ESC共培养48h与对照组相比可使细胞凋亡数目增加，P<0.01；通过CCK8和流式双染实验我们发现hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复受损的ESC具有一定的生物学功能。
5.根据权利要求1所述的研究Hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复受损子宫内膜中的作用机制的方法，其特征是：步骤(D)的具体方法是：
(1)hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF的靶向作用
运用生物信息学软件预测分析hsa_circ_0111659与miR-20b-5p有结合位点，miR-20b-5p与VEGF有结合位点；使用293T工具细胞进行质粒的转染，在转染克隆有野生型hsa_circ_0111659片段的质粒的实验，miR-20b-5p组与空白组相比较，miR-20b-5p组与NC组相比，都显著影响荧光活性，说明miR-20b-5p能通过结合载体3’UTR区的WT hsa_circ_0111659基因序列影响其荧光活性改变，hsa_circ_0111659和miR-20b-5p可能存在相互作用；在转染克隆有突变型hsa_circ_0111659片段的质粒的实验中，miR-20b-5p组与空白组相比较P<0.05，miR-20b-5p组与NC组相比，都显著影响荧光活性，说明miR-20b-5p能通过结合载体3’UTR区的mut hsa_circ_0111659基因序列影响其荧光活性改变，突变位点可能不完全，可能存在其它结合位点；
在转染克隆有野生型VEGFA-3’UTR质粒的实验中miR-20b-5p组与空白组相比较，miR-20b-5p组与NC组相比，都显著影响荧光活性，说明miR-20b-5p能通过结合载体3’UTR区的wtVEGFA-3‘UTR影响其荧光活性改变，VEGFA-3‘UTR和miR-20b-5p可能存在相互作用；在转染克隆有突变型VEGFA-3’UTR质粒的实验中，miR-20b-5p组与空白组和NC组相比较荧光活性均未有改变，均无统计学差异，说明miR-20b-5p不能通过结合载体3’UTR区的mut VEGFA-3‘UTR影响其荧光活性改变，结合位点突变完全；
(2)hsa_circ_0111659和miR-20b-5p的定位
WJ-MSCs细胞Fish检测hsa_circ_0111659和miR-20b-5p的细胞定位；发现hsa_circ_0111659主要定位于细胞质中，这一定位说明它主要起着海绵吸附功能，结合荧光素酶报告实验我们可断定hsa_circ_0111659起着miR-20b-5p海绵吸附体的作用；
(3)hsa_circ_0111659敲低后的miR-20b-5p的表达
通过前面的研究步骤，可初步断定hsa_circ_0111659起着海绵吸附体的作用，通过qRT-PCR我们发现敲低hsa_circ_0111659后miR-20b-5p的表达量与对照组相比较可显著上升，具有统计学差异；其表达量与hsa_circ_0111659的表达呈负相关性；通过对miR-20b-5p的表达的测定，可近一步断定hsa_circ_0111659通过吸附miR-20b-5p实现对下游靶基因的调控。
6.根据权利要求1所述的研究Hsa_circ_0111659在WJ-MSCs修复受损子宫内膜中的作用机制的方法，其特征是：步骤(E)的具体方法是：
(1)子宫内膜修复过程中hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF调控通路
通过荧光素酶实验发现3者之间的结合；为了近一步验证3者之间的调控，在蛋白水平检测了在内膜修复中具有重要作用的VEGF以及相关受体的表达情况；显示转入了shRNA使hsa_circ_0111659敲低后的WJ-MSCs与损伤的ESC共培养，即敲低组与正常共培养组即对照组相比较，发现实验组的VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表达都较对照组相比有着显著的下降；然而在敲低组中加入miR-20b-5p阻断剂后能部分恢复VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表达与敲低组相比具有统计学差异，其中VEGF、VEGFR1与对照组相比仍有一定的差异，未能恢复到正常共培养状态；因此通过检测VEGF及其受体的蛋白的表达，发现敲低hsa_circ_0111659后可见VEGF及其受体蛋白表达下降，而这种作用可由miR-20b-5p阻断剂实现部分逆转；
(2)hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路对ESC的增殖能力的影响
结果显示在WJ-MSCs修复受损的ESC中存在hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路；但这条通路是否对ESC的增殖能力有一定的影响；通过CCK8实验我们发现hsa_circ_0111659敲低组与对照组即正常共培养组相比ESC的增殖能力有所下降，然而在敲低组中加入miR-20b-5p阻断剂后可部分逆转ESC的增殖能力虽未完全恢复至对照组状态，但与对照组相比无统计学差异；因此hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路可调控ESC的增殖；
(3)hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路对ESC凋亡的影响
计算各实验组的ESC的凋亡率；流式术结果显示hsa_circ_0111659敲低组的ESC凋亡数目较对照组有所增加，具有统计学差异；说明hsa_circ_0111659可调控ESC的凋亡；加入miR-20b-5p阻断剂后可抑制ESC的凋亡率，并可恢复至对照组的状态，差异无统计学意义；实验研究发现hsa_circ_0111659/miR-20b-5p/VEGF通路可调控ESC的凋亡。
7.一种Hsa_circ_0111659在制备WJ-MSCs修复受损子宫内膜制剂中的应用。
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