CN112618708A - 一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗 - Google Patents

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Abstract

一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，以hACE2基因敲除的RNA干扰干细胞取代传统新型冠状病毒疫苗的腺病毒载体。所述RNA干扰干细胞，为一种在敲除新冠病毒易感基因ACE2、转染永生化基因SV40LT和/或hTERT的基础上重组新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰基因shRNA的干细胞。这种RNA干扰干细胞具有抵抗新冠病毒感染、无限传代、抑制新冠病毒在干细胞内复制的功能，可按姓名、ABO血型或HLA分型长期预存于‑196℃干细胞库备用，不但可取同型干细胞个体化治疗COVID‑19，还可取代具有免疫源性的腺病毒载体，将新冠病毒抗体产生基因S1‑RBD插入RNA干扰干细胞DNA中，制备能产生新冠病毒中和抗体的RNA干扰干细胞载体疫苗。

Description

一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗
技术领域
本发明涉及一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，属于生物医学领域的传染病防治技术。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)已对全球公众健康构成严重威胁。SARS-CoV-2的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)。其中S蛋白在感染过程中被宿主蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，S1亚基由N 端的结构域(S1-NTD)和受体结合域(S1-RBD)组成，S1-RBD负责识别并结合宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，S2亚基介导病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合，使病毒进入细胞引起感染。N蛋白为RNA合成所必需，在病毒组装和RNA转录中起着至关重要的作用，同时也参与宿主细胞对病毒感染的反应。M和E蛋白在病毒装配中起重要作用。
目前的新冠病毒疫苗主要以S蛋白或其RBD为靶点设计开发。在新冠病毒载体疫苗的制备中，人腺病毒5型(Ad5)是应用最广泛的病毒载体。人腺病毒含有26-45kb的双链线性DNA基因组，基因组中含有4个早期转录基因区(E1-E4)和1个晚期转录基因区，两端各有 1段约100bp的反向未端重复序列(ITR)。第一代腺病毒载体删除了E1和E3区基因，第二代腺病毒载体删除了E1-E4区基因，Ad5为第三代腺病毒载体，删除了所有病毒编码基因，仅保留5’和3’端ITR及包装信号，可容纳36kb外源基因。虽然Ad5的细胞毒性和免疫源性减弱，外源基因表达时效提高，可感染的细胞多而应用广，但易引起非特异性感染而不适用于靶向治疗，临床应用中易产生副作用。Ad5不与宿主细胞DNA整合，虽较安全但使目的基因表达不稳定，进入宿主细胞后易被网状内皮细胞吞噬而失去作用。同时由于Ad5无法复制，会使体内重组病毒越来越少，所以不适用于临床慢性疾病的长期治疗。Ad5本质为病毒，仍具有免疫源性和细胞毒性，宿主对病毒载体的免疫应答会干扰对目的抗原的免疫应答，大多数正常人已受过腺病毒感染，对病毒载体的预存免疫也会干扰疫苗的免疫效果。
目前用于临床治疗的干细胞，国内外主要聚焦在间充质干细胞(MSCs)和自然杀伤细胞 (NK)，其中应用最多的是MSCs。MSCs来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，能迁移到损伤的确切部位，定向分化为肺组织细胞和毛细血管内皮细胞等多种细胞系，产生多种细胞因子和分泌大量的含有miRNA的外泌体、囊泡，通过影响PI3K/AKT、NF-КB等信号通路来治疗肺损伤，通过调节免疫、抗纤维化、抑制炎性因子风暴等机制修复受损器官。干细胞具有非常强的抗病毒能力，能在病毒感染局部幸存并发挥作用，已初步表明MSCs在重症新冠肺炎治疗中的安全性和有效性，具有良好的临床应用前景。但尚未见以进一步改造的干细胞取代腺病毒载体制备新冠病毒载体疫苗的文献报道。
通常间充质干细胞在体外传代至15-30代就会出现衰老或死亡，而经猿猴病毒40大T抗原基因(SV40LT)转染的细胞系可在体外培养350代以上，并能基本保留原始细胞的分化表型和生物学特性，已广泛应用于人源性肝细胞、血管纹边缘细胞、软骨干细胞等的永生化。这为干细胞体外培养寿命的改良和产业化扩增提供了依据。文献报道，SARS-CoV能在ACE2 转染的293T细胞中复制，但不能在模拟转染的293T细胞中复制。目前报道SARS-CoV-2也通过ACE2受体感染宿主细胞，所以本发明拟将干细胞中的ACE2基因敲除。
RNA干扰(RNAi)是指特异性沉默外源基因的抗病毒作用。当将外源靶基因整合到宿主细胞基因组时，外源靶基因能利用宿主细胞转录dsRNA，dsRNA被宿主细胞质中的核酸内切酶 (Dicer)切割成具有特定长度和结构的多个小片段siRNA(大约21～23bp)，siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，由反义siRNA与体内的内切酶、外切酶和解旋酶结合，形成RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)。当外源基因入侵宿主细胞时，RISC与外源基因表达的mRNA的同源序列特异性结合，在结合部位切割同源mRNA，被切割的断裂mRNA 随即降解，从而诱发宿主细胞针对外源mRNA的降解作用。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶的作用下合成新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割成大量的次级siRNA，进而形成RISC而发挥作用，使RNAi的作用进一步放大，最终将外源靶mRNA完全降解。但尚未见以人工构建的具有RNA干扰功能的干细胞为载体制备新冠病毒疫苗的报道。
发明内容
基于目前治疗用干细胞和传统疫苗载体的上述问题，本发明人提出了本发明。
本发明的目的是要提供一种以敲除新冠病毒易感基因hACE2、装配新冠病毒RNA干扰基因shRNA、转染永生化基因hTERT和/或SV40LT的干细胞为载体的兼具干细胞固有治疗功能、人工改造的新冠病毒RNA干扰功能、无限传代的永生化功能、新冠病毒感染受体缺失特性以及新冠病毒中和抗体产生特性的RNA干扰干细胞载体疫苗，专用于个体化治疗COVID-19。
本发明的目的通过以下技术方案实施：
首先，获得间充质干细胞。例如，从产前诊断后剩余的样本中分离羊水成纤维细胞，制备所需的干细胞；或从干细胞样本库中获得间充质干细胞，诱导所需的干细胞。
进而，给干细胞装配永生化基因。例如，构建携带hTERT和/或SV40LT的重组载体，转染干细胞，使干细胞DNA整合上hTERT和/或SV40LT基因，从而获得能永久生存、无限传代的新功能，可再经鉴定或诱导获得肺干细胞系。
进而，敲除干细胞的hACE2基因。例如，从GenBank检索人ACE2核酸序列，下载其FASTA 文件，进入www.genome-engeering.org，上传文件并筛选出评分较高的单导向RNA(sgRNA) 序列，在每条sgRNA序列F链5’端添加CACC序列，R链5’端添加AAAC序列，与pX330质粒经Fast Diget Bbs I酶切后的粘性末端形成互补，合成sgRNA寡链核苷酸(oligo)序列，以 T4连接酶将双链sgRNA与pX330载体进行连接，然后转染干细胞，以敲除hACE2基因。
进而，给干细胞装配新冠病毒RNA干扰基因。例如，设计和优选新冠病毒(nCoV)的靶向干扰序列siRNA，合成shRNA模板，连接到慢病毒载体pHBLV或LV3，构建重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA或LV3-nCoV-N-shRNA，将重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA和包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体)或者将重组质粒LV3-nCoV-N-shRNA和包装质粒 (pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5)共转染293FT细胞，包装携带shRNA 的慢病毒，将慢病毒转染干细胞，使shRNA基因整合到干细胞DNA上，从而获得能干扰nCoV 在干细胞内复制的新功能。
进而，制成一种敲除hACE2基因、装配RNA干扰基因和永生化基因的RNA干扰干细胞。
进而，将RNA干扰干细胞作为新冠病毒疫苗载体，替换现有技术的腺病毒载体，制备干细胞载体疫苗。例如，根据GenBank分析SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列(RBD氨基酸为Gly319～Asn541)，采用氨基酸密码子同义置换，合成RBD肽段对应核酸的全基因(序列两端分别插入HindIII和Xho I的酶切位点)，将合成的RBD基因构建重组质粒(pGC-FU-RBD)，将重组质粒和包装质粒共转染293FT细胞，包装携带RBD的慢病毒，将慢病毒转染RNA干扰干细胞，使干细胞DNA整合上RBD，以获得能表达RBD蛋白和抗体的干细胞载体疫苗。
最终，制备一种兼具干细胞天然治疗功能、人工改良的永生化功能、新冠病毒感染受体缺失、新冠病毒RNA干扰功能及新冠病毒抗体产生功能的新型冠状病毒载体疫苗。
本发明的有益效果在于：
本发明将原本弃用的组织细胞改造为一种hACE2敲除RNA干扰干细胞，用于替换传统的腺病毒载体，应用于制备新型冠状病毒的干细胞载体疫苗。
本发明因装配了永生化基因(SV40LT和/或hTERT)而解决了超低温永久保存问题、可再生利用问题、需无限扩增的商业化问题。
本发明因装配了新冠病毒的RNA干扰基因而更易抑制病毒在干细胞内复制，使原本易被病毒杀灭的干细胞改造为易杀灭病毒的RNA干扰干细胞。
本发明因敲除hACE2基因而使新冠病毒难以通过hACE2受体感染干细胞，从而增强了干细胞对新冠病毒的抗感染能力。
敲除ACE2基因、装配新冠病毒RNA干扰基因的RNA干扰干细胞，前者可抵抗病毒进入干细胞内，后者干扰干细胞内病毒复制。用这种干细胞作为新冠病毒疫苗载体，可以替换具有免疫原性的腺病毒载体、可以选用与患者同型的疫苗载体，外源基因不进入宿主细胞内，所以用本发明的疫苗载体制备的疫苗使用较安全，而且还具有干细胞自身治疗的作用。
附图说明
图1是本发明所述的以G418和嘌呤霉素筛选得到的永生化干细胞克隆图。
图2是本发明所述的被SV40LT和hTERT转染的永生化干细胞克隆的传代培养图。
图3是本发明所述的被SV40LT和hTERT转染的永生化干细胞与分离的新冠病毒共培养 72小时的细胞生长状态。
图4是本发明所述的敲除ACE2基因并敲入新冠病毒靶向干扰基因的RNA干扰干细胞与分离的新冠病毒共培养72小时的细胞生长状态。
在图1中，因被SV40LT和hTERT转染的永生化细胞不会被G418和嘌呤霉素杀死而存活，存活的单个细胞生长后形成细胞克隆。
在图2中，被SV40LT和hTERT转染的细胞在传代中呈梭形贴壁生长，生长旺盛。
在图3中，细胞呈圆形、漂浮、死亡状态，说明病毒在细胞内繁殖、致细胞较快死亡。
在图4中，细胞仍呈梭形贴壁生长，说明敲除ACE2基因并敲入新冠病毒靶向干扰基因的 RNA干扰干细胞对新冠病毒具有较强的抵抗力。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方法作详细的描述，但这些范例性的描述并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
1.间充质干细胞的采集
间充质干细胞(MSC)来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，可从实验后剩余的或干细胞库保存的羊水细胞、羊膜组织、骨髓细胞、脐带血、脐带组织或胎盘组织中分离获得。
1.1.羊水间充质干细胞的采集
从各单位日常产前诊断后剩余的羊水细胞中分离间充质干细胞。羊水细胞为约19孕周胎儿的呼吸系统、消化系统等组织的脱落细胞，富含肺间充质干细胞和ips细胞。这些细胞经进一步的永生化后，寿命和活力更好，可制备成本发明的肺干细胞系。
具体方法如下：按各单位日常产前诊断流程采集待检孕妇的羊水细胞，进行常规细胞培养、实验诊断和结果报告。继续培养诊断结果为正常的剩余的羊水细胞，在倒置显微镜下筛选出梭形贴壁生长的成纤维羊水细胞或羊水间充质干细胞。
1.2.脐带间充质干细胞的采集
从液氮罐中取出冻存的脐带，置37℃水浴快速解冻，以无菌PBS清洗，去除残留的血迹，将脐带剪成大小约1mm3的组织块，置于铺有胎牛血清的培养皿中，在37℃放置6h后，加入10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃5％CO2培养箱中培养，3d后换液，1周后再次换液，此后每隔3d换液，观察贴壁组织周围的细胞生长情况，当细胞达到80％-90％融合度时，用胰酶消化传代，并将组织转移到新的培养瓶中，继续培养，获得间充质干细胞。
1.3.肺间充质干细胞的采集
无菌取流产胎儿肺脏组织，机械离散，0.25％胰蛋白酶消化后，用孔径为100um的纱布过滤，1 000r/min离心5min，弃上清液，添加DMEM培养液(0.1umolβ-巯基乙醇，100UI/mL 青链霉素，10％胎牛血清)。在37℃、5％CO2条件下培养。45min后换液，以去除尚未贴壁的细胞，后每48h换液。待细胞汇合度达80％后，0.25％胰蛋白酶消化传代。
1.4.干细胞诱导
参照有关文献，将羊水细胞、羊膜组织细胞、骨髓细胞、脐带血细胞、脐带组织或胎盘组织细胞诱导为所需的干细胞。
2.间充质干细胞的永生化性能改良
本发明将有限寿命的干细胞改良为无限传代的干细胞系，以体外产业化扩增干细胞。
2.1.SV40LT/pLXSN的构建
以SV40 DNA(strain 766)为模板，上游引物为5’-GCCCAGGATCCTTAACAACAACAACAAT-3’，下游引物为5’-ACGCTGAATTCCCTCTGAGCTAT-3’，进行SV40 LT高保真长片段的PCR扩增；SV40 LT的PCR产物与pLXSN反转录病毒载体均经EcoR I/BamH I酶切、连接、转化、筛选和测序验证，获得含SV40LT/pLXSN重组反转录病毒载体。
2.2.hTERT/pLPCX的构建
用EcoR I酶切PIRES2-EGFP-hTERT质粒得到hTERT cDNA片段，去磷酸化后亚克隆到 pLPCX反转录病毒载体EcoR I位点，用T4DNA连接酶置22℃条件下连接，转化至感受态E.coliDH5-alpha大肠埃希氏菌，37℃培养过夜，挑选无色菌落接种，纯化重组质粒，经酶切和测序鉴定后，扩大培养含hTERT的大肠埃希氏菌，用Endotoxin-Free的质粒纯化 pLPCX-hTERT重组克隆。
2.3.永生干细胞系的建立
将待转染的间充质细胞配成约8×105个细胞浓度接种，置5％CO2和37℃培养，24h后用含SV40LT基因的重组逆转录病毒感染(Polybrene浓度为8ug/mL)，1周后用500ug/mL的G418 筛选4周，待细胞克隆出现后，再用含hTERT基因的重组逆转录病毒感染(Polybrene浓度为8ug/mL)，1周后用2ug/mL的嘌呤霉素筛选，挑取细胞克隆接种于6孔板，扩大培养。筛选的细胞克隆和传代培养细胞分别见图1和图2。
2.4.永生干细胞系的鉴定
细胞系生物学特性：①细胞系为梭形、成纤维状。②Western检测可见分别在相对分子质量为120000和93000处出现白色条带。③细胞系的生长曲线呈典型的“S”生长特征。④细胞系的染色体核型为二倍体。⑤细胞系不能在软琼脂中生长。⑥裸鼠致瘤试验结果呈阴性。
细胞系永生性试验：本发明从产前诊断后剩余的羊水细胞中分离间充质干细胞，经SV40LT 基因转染后获得永生化细胞，已在体外传代至35代，未见细胞衰老现象。
干细胞性质鉴定：用流式细胞仪检测细胞膜表面分子，检测的阳性分子包括CD73-APC、 CD90-FITC、CD44-PE、CD105-Cy5.5，阴性分子包括CD11b-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、 HLA-DR-PE。通过鉴定，获得能在体外永久传代、无限扩增的永生化间充质干细胞系。
肺干细胞系鉴定：肺干细胞系包括①相差显微镜观察，呈梭形生长，排列成漩涡或栏栅状。②流式细胞仪检测细胞表面标志物为阳性，包括CD45、CD11a、CD14、CD90、CD34、CD71、 CD25、CD105、CD117、CD166和CD44。③共聚焦技术检测为角蛋白表达呈阴性，四个干性相关因子(c-Myc、Oct4、Nanog和Nestin)呈阳性；④间接免疫荧光检测示波形蛋白(vimentin)、 III型胶原(collagen III)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)表达呈阳性，而表面活性蛋白 C前体(pro-Surfactant protein C，proSP-C)、血管性血友病因子(vonWillebrand factor， vWF)及α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达呈阴性。
3.永生干细胞的hACE2基因敲除
3.1.用于hACE2基因敲除的CRISPR-Cas9质粒构建
3.1.1.sgRNA序列设计与合成
从GenBank检索人ACE2核酸序列，下载其FASTA文件，进入www.genome- engeering.org，上传文件并筛选出3组评分较高的单导向RNA(single guide RNA，sgRNA)序列(分别命名为oligo1，oligo2，oligo3，表1)。为了与pX330(pHBLV-U6-gRNA-EF1-cas9-PURO)质粒经 Fast Diget Bbs I酶切后的粘性末端形成互补，在每条sgRNA序列F链5’端添加CACC序列， R链5’端添加AAAC序列(如果F链5’端第1个碱基不是G，则在5’端CACC后面添加1个碱基G，相应的在5’端AAAC后面添加1个碱基C)。sgRNA寡链核苷酸(oligo)序列送公司合成。
表1 用于敲除hACE2的sgRNA序列
Figure BSA0000226452730000061
3.1.2.sgRNA退火形成互补双链
分别将合成的单链oligo1、oligo2、oligo3溶解，等比例混合互补链，于PCR扩增仪95℃退火5min；自然降至室温，形成用于敲除靶基因的互补双链。
3.1.3.酶切验证和胶回收质粒
以Fast Diget Bbs I酶切pX330和上述互补双链(37℃，1～16h)，使其线性化。以1％琼脂糖凝胶电泳进行pX330质粒的酶切验证。对酶切后的pX330进行回收，获得具有粘性未端的质粒。以超微量核酸蛋白测定仪(ND-2000，Thermo，美国)检测质粒浓度。
3.1.4.px330与敲除序列的连接及产物转化
以T4连接酶将线性化的pX330载体分别与双链sgRNA(oligo1，oligo2，oligo3)进行连接(37℃，16h)，获得3个重组质粒，分别命名为pX330-ACE2-1、pX330-ACE2-2、pX330-ACE2-3。
将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。取100μL菌液涂布于含Amp的LB固体培养板，37℃过夜培养。次日挑取培养板上的单克隆菌落，转入新鲜的含Amp的LB液体培养基，37℃振摇12h，作为菌种于4℃保存。
3.1.5.细菌扩增及质粒提取
连接成功的产物具有Amp抗性，挑取单菌落进行培养，菌种保存于4℃冰箱；取100μL 扩大培养，按照无内毒素质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取并测序。测序正确的质粒用于转染ACE2基因敲除的干细胞。
3.2.制备hACE2基因敲除的干细胞(制备hACE2敲除干细胞)
3.2.1.干细胞的质粒转染
按照Lipo3000操作手册，首先将Lipo3000转染试剂与0pti-MEM混合、重组质粒pX330-ACE2-1/2/3分别与0pti-MEM混合，室温孵育3min；然后混合上述2组混合物，室温孵育5min。将(永生化)干细胞接种于6孔板，待细胞生长至60％融合时，加入上述混合物。6h后换液，进行正常培养，48h后进行细胞消化与传代，接种于有玻片和无玻片的6 孔板。待无玻片6孔板中的细胞长满后，提取细胞总蛋白用于Western blot检测；待有玻片 6孔板中的细胞生长至40％融合时，将细胞固定，用于免疫荧光染色。
3.2.2.干细胞ACE2敲除效果鉴定
Western blot检测：对于对照和转染pX330-ACE2-1/2/3的干细胞，以RIPA裂解细胞并提取总蛋白。以GAPDH作为内参，进行常规Western blot检测，比较未敲除和敲除干细胞的 ACE2蛋白表达差异。
免疫荧光染色：对培养于6孔板中玻片上的对照和转染pX330-ACE2-1/2/3的干细胞，通过免疫荧光染色观察ACE2的分布，具体方法参照有关文献。
4.hACE2敲除干细胞的新冠病毒RNA干扰基因敲入
4.1.设计新冠病毒的siRNA基因
以Ambion公司(http：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNAtools.html)的shRNA在线设计软件，从SARS-CoV-2(NC_045512.2株ORFlab、3’UTR、S、E、M、N)的保守序列中筛选出多个siRNA备选序列，根据人类基因组数据库、RNA结合的Tm值及特异性的比对结果，分别优选3条与人类基因组没有同源性的保守siRNA序列(表1A)，同时设计1条无关的siRNA序列作为阴性对照(NC：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTAA-3’)。
表1A NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列
Figure BSA0000226452730000081
4.2.合成shRNA模板
靶序列确定以后，根据慢病毒干扰载体pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO(pSilencer4.1.CMV.neo)的多克隆酶切位点，设计shRNA模板，使每个模板由两条大部分互补的长度为52-60nt的单链DNA构成，寡核苷酸单链DNA的3’端有2-5个U字形突出，包括靶序列的正义序列、loop序列、靶序列的反义序列、转录终止信号以及酶切后的粘性末端序列，经退火互补后能形成带有BamH I和ECORI(BamH I和Hind III)酶切位点粘性末端的DNA双链(如用pSilencer4.1.CMV.neo，则用BamH I和Hind III)。如表1B，“斜体”表示酶切位点，“加粗”表示茎环结构，“下划线”表示正义链。
表1B 以表1A中的siRNA合成S、E、M、N基因相对应的shRNA模板
Figure BSA0000226452730000091
4.3.重组慢病毒干扰载体的构建
以新冠病毒N基因的靶向干扰序列(nCoV-N-siRNA-1/2/3)作为实施例，以T4连接酶将合成的shRNA模板与线性化的慢病毒载体pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO连接，构建慢病毒干扰载体pHBLV-nCoV-N-shRNA1/2/3，转化感受态E.coli DH5α。
4.4.慢病毒干扰载体的鉴定
取慢病毒干扰载体转化的感受态E.coli DH5α10μL，涂布于含50μg.mL-1嘌呤霉素的 LB平板抗性培养，筛选出阳性克隆，提取质粒，以PCR、BamH I和ECORI酶切或测序鉴定，培养测序正确的阳性克隆，按质粒抽提试剂盒抽提质粒。观察重组慢病毒干扰载体中3个靶向nCoV-N-siRNA1/2/3干扰基因与设计的干扰序列是否完全一致。
4.5.携带shRNA慢病毒的包装
取对数生长期的293FT细胞，以5×106cell·mL-1的密度接种于培养瓶，加入重组质粒和慢病毒包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体三质粒组成)各4μg，并与Lipofectamine200脂质体共转染，8h后更换为完全培养基，继续培养48h，然后收集富含慢病毒的上清液，离心，过滤，分装，置于-80℃保存。
4.6.慢病毒滴度的检测
①孔稀释法计数荧光细胞：取慢病毒原液10μL，用10％FBS的DMEM培养液10倍稀释为3-5个梯度，将293 FT细胞按每孔3×104个细胞的密度接种于96孔板，37℃5％CO2培养24h后，每孔更换为10％FBS的DMEM培养液150μL继续培养48h，用荧光显微镜计数荧光细胞，计算病毒滴度。结果在重组质粒pHBLV(LV3)-nCoV-N-shRNA转染293 FT细胞后，被包装成慢病毒颗粒，在荧光显微镜下293 FT细胞内呈现绿色荧光。②Real time定量PCR法测定：以10％FBS的DMEM培养液培养293 FT细胞，以待测定的慢病毒原液感染，根据Invitrogen 公司的TRIZOL操作说明抽提RNA，RT-qPCR测定所抽提RNA的浓度。
4.7.hACE2敲除干细胞的慢病毒转染
以每孔1×106个细胞密度将hACE2敲除干细胞接种于6孔板，待细胞融合至30％时，试验组分别加入5倍稀释的慢病毒原液，分别命名为pHBLV(LV3)-nCoV-N-shRNA1组、pHBLV (LV3)-nCoV-N-shRNA2组、pHBLV(LV3)-nCoV-N-shRNA3组。同时设立阴性对照组(仅转染慢病毒干扰载体的肺干细胞组)和空白对照组(未转染慢病毒干扰载体的正常肺干细胞组)。
4.8.筛选转染阳性的hACE2敲除干细胞
上述细胞培养24h后更换10％FBS的DMEM液，并加入最佳筛选浓度的嘌呤霉素(2.00μ g·mL-1)，维持嘌呤霉素浓度，隔天换液，直至空白对照组细胞完全死亡，筛选结束。未被嘌呤霉素杀死的hACE2敲除干细胞即为已被重组慢病毒干扰载体转染并已在DNA上整合了新冠病毒靶向干扰序列(nCoV-shRNA)的肺干细胞。这种ACE2(肺)干细胞能表达dsRNA，dsRNA 能干扰nCoV基因，从而产生干细胞内的抗病毒作用，下称基因沉默RNA干扰干细胞。
本发明包括选用慢病毒载体pSilencer4.1.CMV.neo、以EcoR I和Hind III酶切、构建重组载体LV3-nCoV-N-shRNA、将重组载体与包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、 pLV/helper-SL5)共转染293FT细胞、包装慢病毒、以氨苄青霉素筛选阳性克隆。
4.9.验证RNA干扰干细胞的shRNA表达
4.9.1.RT-PCR检测shRNA的mRNA表达
用Trizol试剂分别提取RNA干扰干细胞的nCoV-N-shRNA1、nCoV-N-shRNA2和nCoV-N-shRNA3组的总RNA，以GAPDH为内参照，设计表2所示的引物，PCR条件为：95℃ 3min变性，95℃12s，62℃40s，72℃30s，共40个循环。每组均设3个随机复孔。反应结束后，仪器自动记录每个样品管中Ct值，以GAPDH为内参照，计算目的基因的相对含量，用2-ΔCt表示。观察空白对照组、阴性对照组pHBLV(LV3)-nCoV-N的mRNA表达量以及pHBLV (LV3)-nCoV-N-shRNA1、pHBLV(LV3)-nCoV-N-shRNA2和pHBLV(LV3)-nCoV-N-shRNA3组这3个干扰组中mRNA表达量是否下降，推断3个特异性靶点对nCoV-N基因是否有沉默效果，与阴性和空白对照组有无统计学差异。结果以pHBLV-nCoV-N-shRNA2干扰效果最佳。
表2 新冠病毒S、E、M、N基因靶向干扰序列siRNA1～siRNA3扩增引物的设计
Figure BSA0000226452730000111
4.9.2.Western Blotting检测shRNA的蛋白表达
①抽提各组细胞裂解液的蛋白，BAC法蛋白定量，每组设置3个随机复孔。用10％SDS-PAGE 分离样品蛋白质，电转至硝酸纤维素膜上，以1∶400稀释的抗VDR抗体为一抗，用ECL化学发光试剂盒显像，用凝胶图像分析系统确定各蛋白条带的相对灰度值。②观察空白对照组、阴性对照组的pHBLV-(LV3)nCoV-N蛋白表达量以及pHBLV(LV3)-nCoV-N-shRNA1、pHBLV (LV3)-nCoV-N-shRNA2和pHBLV(LV3)-nCoV-N-shRNA3组这3个干扰组中重组慢病毒pHBLV (LV3)-nCoV-N蛋白的表达量，与阳性对照组和空白对照组间有无统计学差异。③结果为 pHBLV(LV3)-nCoV-N-shRNA2组能有效干扰nCoV-N基因的蛋白表达。
同理可筛选新冠病毒M、S、E基因的靶向干扰序列，制备各自的ACE2基因敲除干细胞、 shRNA(N)基因敲入干细胞、hACE2基因敲除的RNA干扰干细胞。
本发明涉及的载体还包括过表达载体如pHBLV-CMV-IRES-ZsGreen、pHBLV-CMV-EF1-RFP、、 pHBLV-CMV-IRES-Puro、pHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro、pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-Puro、 pHBLV-CMVIE-RFP-T2A-Puro、pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-Puro、pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-Luc、 pGC-FU，干扰载体如pHBLV-U6-ZSGreen、pHBLV-U6-ZSGreen-puro、pHBLV-U6-Puro、 pHBLV-U6-ZsGreen-T2A-Puro、pHBLV-U6-RFP-T2A-Puro、pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro、 pHBLV-U6-RFP、pHBLV-U6-ZsGreen-T2A-Luc、pHBLV-U6-RFP-T2A-luc，干扰过表达双框架载体如pHBAd-U6-CMV(用于构建同时表达两种基因的重组载体，例如表达shRNA和RBD的 pHBAd-U6/shRNA-CMV/RBD)。
5.RNA干扰干细胞的抗病毒功能检测
5.1.RNA干扰干细胞的体外抗病毒功能检测
5.1.1.样本采集
取COVID-19确诊患者的咽拭，按100∶1的比例加入双抗(10000IU的青霉素和10000μg 的链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100IU和100μg，置4℃过夜，备用。
5.1.2.病毒培养和分离
将Vero-E6接种至含(10％胎牛血清)DMEM培养液的12.5cm2培养瓶中，置36℃、5％CO2培养箱中培养成30％汇合度的单层细胞，吸去培养液，用DMEM清洗细胞2遍，然后在培养瓶中加入0.5mL经过双抗处理的COVID-19患者样本，置36℃、5％CO2培养箱中吸附90min后，吸去样本，加入3.5mL DMEM培养液(10％胎牛血清)，每天观察细胞病变效应(CPE)，经培养5～7d后，取病变细胞上清液蔗糖梯度超速离心，分离新冠病毒，用培养液配成103～105TCID50/ml病毒液(同时用于后述的动物试验)。
5.1.3.RNA干扰干细胞与病毒共培养
设立hACE2基因敲除干细胞组、shRNA(N)基因敲入干细胞组、hACE2基因敲除的RNA干扰干细胞组(敲除hACE2、敲入shRNA)、永生化干细胞组和空载体转染干细胞组，每组接种12孔板，使每孔含有2×105个细胞、2mL DMEM培养液(10％胎牛血清)，置36℃、5％CO2培养箱中培养至30％汇合度时，每孔各加病毒液0.5mL，然后分别于培养1、6、24、72小时后每组各取3孔的上清液，混合后以1∶4、1∶12、1∶36、1∶108、1∶324、1∶972、1∶2916、1∶8748倍稀释，进行RT-PCR检测。
5.1.4.实时荧光RT-PCR检测病毒RNA
核酸提取试剂盒(批号：2019004)、2019新型冠状病毒(ORF1ab/N)核酸检测试剂盒(批号：20200123)和DA3200核酸提取仪，购自中山大学达安基因股份有限公司，ABI 7500型PCR 仪器购自美国Thermo Fisher Scientific。按试剂盒说明书操作，扩增反应条件为：50℃15min； 95℃15min；94℃15s；55℃45s；共45个循环，在55℃采集荧光信号。
根据试剂盒说明，结果判断标准如下：①如果检测样本在ORF1ab和N基因通道无扩增曲线或Ct值＞38，判为SARS-CoV-2阴性；②如果检测样品在ORF1ab和N基因通道Ct值≤38，且有明显的扩增曲线，判为SARS-CoV-2阳性；③如果检测样品在ORF1ab或者N基因通道Ct值≤38，另一通道无扩增曲线，复检结果与原来结果一致，判为SARS-CoV-2阳性。
5.1.5.病毒RNA检测结果
检测结果见表4～9。如表4所示，hACE2基因敲除干细胞组、shRNA(N)基因敲入干细胞组、hACE2基因敲除的RNA干扰干细胞组、永生化干细胞组和空载体转染干细胞组分别培养1 小时的培养液RNA检测阳性的最大稀释度均为1∶4，被认为是外源加入病毒含量的检测结果。如表5～9所示，上述5组干细胞分别培养6h、24h、72h的培养液及干细胞内病毒RNA检测结果表明，ACE2基因敲除或shRNA(N)基因敲入的干细胞组均能增强抗病毒能力，其病毒RNA检测阳性滴度均低于未敲除ACE2基因或未敲入shRNA(N)基因的永生化干细胞组，但以敲除ACE2并敲入shRNA(N)的ACE2敲除RNA干扰干细胞组的抗病毒效果最好。
表4 干细胞与分离的新冠病毒共培养1小时培养液中病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226452730000131
表5 干细胞与分离的新冠病毒共培养6小时的培养液病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226452730000132
Figure BSA0000226452730000141
表6 干细胞与分离的新冠病毒共培养6小时的细胞内病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226452730000142
表7 干细胞与分离的新冠病毒共培养24小时培养液的病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226452730000143
表8 干细胞与分离的新冠病毒共培养72小时培养液的病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226452730000144
Figure BSA0000226452730000151
表9 干细胞与分离的新冠病毒共培养72小时的细胞内病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226452730000152
5.2.RNA干扰干细胞与病毒共培养的生长特点
未作基因改造的永生化干细胞与分离的病毒共培养72小时后，细胞变圆、漂浮、死亡(图 3)。而敲除hACE2基因并装配新冠病毒RNA干扰基因的RNA干扰干细胞与分离的病毒共培养 72小时后，细胞仍呈梭形贴壁生长，说明对病毒有较强的抵抗力(图4)。
5.3.RNA干扰干细胞的动物体内抗病毒功能检测
5.3.1.RNA干扰干细胞的准备
将试验细胞接种于10％FBS的DMEM完全培养液中进行细胞培养，每隔两三天更换培养液1次；5d左右细胞铺满瓶底约90％，0.25％胰酶消化2～3min，800r/min，离心半径12cm，离心5min，按1∶2接种于75cm2培养瓶中，于37℃、5％CO2恒温培养箱中扩增培养， 4～5d传代1次。
5.3.2.实验动物的分组
选择6-8周龄、40克左右的SPF级雌性BALB/c小鼠，随机分为RNA干扰干细胞组(用于感染NC_045512.2株、接种hACE2基因敲除的RNA干扰干细胞)、hACE2基因敲除干细胞组(用于感染NC_045512.2株、接种shRNA基因敲入的干细胞)，另设永生化干细胞组(用于感染NC_045512.2株、接种未敲除hACE2、未装配shRNA的永生化干细胞)、阳性对照组 (用于感染NC_045512.2株、接种生理盐水)和阴性对照组(仅接种生理盐水)。
5.3.3.实验动物的感染和接种
RNA干扰干细胞组、hACE2基因敲除干细胞组、永生化干细胞组和阳性对照组分别经鼻腔喷雾接种40μl的NC_045512.2株病毒液，滴度为105/mlTCID50，阴性对照组经鼻腔喷雾接种 40μl生理盐水。然后，在各组小鼠腹腔注射5％水合氯醛溶液(0.006mL/g或0.6mg/g)，肌肉松弛后固定于板上；颈部皮肤备皮，碘伏擦拭消毒，颈部皮肤剪开约1cm小口，组织镊子分离肌肉及结缔组织，暴露气管；将1×106个干细胞缓慢注入小鼠气管(阴性和阳性对照组注入生理盐水)，复位组织、缝合皮肤；每天观察小鼠的临床症状，在感染后第7天处死小鼠，进行肺组织的病毒检测。
5.3.4.试验结果的检测
①RT-PCR检测
按Trizol法取200μl DMEM制成的处死小鼠肺组织匀浆标本，加入800μl Trizol，室温放置5min使蛋白彻底的裂解，加入氯仿200μl，用手剧烈震荡15sec，室温放置3min，4℃， 12,000g离心15min，取上清至新的Eppendorf管，加入0.5ml异丙醇，室温放置10min， 4℃，12,000g离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，7,500g离心5min，弃上清，再重复漂洗1次，以30μl DEPC处理过的水溶解沉淀。按试剂盒进行引物设计、PCR扩增和产物电泳，为了比较不同实验组病毒复制量的不同，可同时扩增宿主基因β-actin作为内参，将目的基因与内参基因表达水平灰度值的比值作为各样品病毒的半定量分析。
②细胞病变效应(CPE)观察
将-70℃冰冻的肺组织解冻后用DMEM制成10％匀浆，3,000rpm离心20min，取100pl上清接种于长成单层VeroE6细胞的24孔培养板上，每份标本接种2个孔，37℃吸附1h，然后吸出标本液，用PBS(加2％双抗)洗3遍后加DMEM补充至1.5ml，置37℃、5％CO2培养箱培养，观察培养液的pH，如发现变黄或变蓝，及时调整pH或更换培养液，每天观察细胞病变效应(CPE)，记录是否出现CPE，连续观察7天，若不出现CPE进行盲传，传3～4代，观察结果。接种细胞产生病变的特点是细胞变圆、融合，透光性减弱，最终细胞死亡脱落。
③间接免疫荧光检测
将出现病变效应(CPE)的VeroE6细胞用胰酶消化和PBS清洗，按每孔10μl(107/ml)滴加于抗原载玻片上，待干燥后置冷丙酮中固定10min，用PBS冲洗(干燥后放-20℃保存)，在制备的抗原片上滴加抗S蛋白单抗(1∶200，PBS配置)，37℃湿盒中孵育30-40min，PBS冲洗三次后，滴加FITC标记的二抗(1∶500，0.02％伊文思蓝-PBS配制)，37℃湿盒中孵育20-30min， PBS冲洗3次后，用50％甘油-PBS封片，荧光显微镜下观察荧光。结果判定：在阴性对照和阳性对照成立的条件下，标本接种的VeroE6细胞均出现红色荧光判断小鼠未感染病毒；标本接种的VeroE6细胞细胞膜或细胞浆中出现绿色荧光判断为小鼠感染了病毒。
④细胞培养半数感染量(TCID50)的百分率
取每只处死小鼠(每组10只)肺组织匀浆上清100μl，以10倍递次稀释法稀释成不同的稀释度，分别接种经Hank氏液洗3次的组织培养单层VeroE6细胞96孔培养板，每孔细胞接种30μl，每个稀释度接种4个细胞孔，轻微振荡，使匀浆与细胞充分接触，放37℃吸附1min，以Hank氏液洗3次，加入细胞维持液，放37℃CO2培养箱培养，在普通倒置显微镜下观察记录细胞病变情况，连续观察10-14天，分别计算各组VeroE6细胞半数感染量(TCID50) 的百分率，然后比较各组TCID50百分率的差异，百分率越大病毒含量越多。从表10-15的结果可知，RNA干扰干细胞组和hACE2基因敲除干细胞组均具有较低的VeroE6细胞半数感染量。
表10 RNA干扰干细胞组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
Figure BSA0000226452730000171
表11 hACE2基因敲除干细胞组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
Figure BSA0000226452730000172
表12 永生化干细胞组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
Figure BSA0000226452730000173
表13 阳性对照组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
Figure BSA0000226452730000174
Figure BSA0000226452730000181
表14 阴性对照组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
Figure BSA0000226452730000182
表15 各组间10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率比较
Figure BSA0000226452730000183
6.hACE2敲除RNA干扰干细胞载体疫苗的制备
以hACE2敲除RNA干扰干细胞替代腺病毒载体，制备新冠病毒干细胞载体疫苗。
6.1.RNA干扰干细胞的RBD基因装配
6.1.1.RBD基因的合成
参照GenBank登录号(MN908947.3)对SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列进行分析，其RBD氨基酸为Gly319～Asn541，采用氨基酸密码子同义置换，对RBD肽段对应的核酸进行全基因组合成。合成前进行密码子优化，目的是提高基因组中G+C％的含量，增加mRNA在哺乳动物细胞中的稳定性或mRNA输入细胞质的速率，避免稀有tRNAs的损耗，增强蛋白表达，提高免疫原性。具体方法如下：统计分析NC_045512.2株病毒密码子和人类密码子的使用频率(http：www.kazusa.or.jp/codon)，使用人类偏好密码子对NC045512.2株病毒的S1-RBD 基因进行密码子优化，使其密码子使用频率与人类一致，同时在基因5’末端添加EcoR I的酶切识别序列GAATTC，在3’末端添加XhoI酶切识别序列CTCGAG。优化基因的G+C％由48％提高至70％，密码子第三位的G+C％则由39％提高到100％。优化的RBD基因序列765bp：ATGAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCA ACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCT CTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGAT TATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATT ACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAA TGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTA GTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCA ACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACAC TACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGTAA。
6.1.2.携带RBD基因的慢病毒表达载体构建
以T4连接酶将合成的S1-RBD基因与线性化的慢病毒表达载体进行连接，构建慢病毒表达载体(pGC-FU-RBD或pHBLV-RBD)，然后转化感受态E.coli DH5α，将其涂布于含50μg.mL-1氨苄青霉素的LB平板抗性培养，筛选出阳性克隆，提取质粒，进行PCR、酶切或测序鉴定，扩增培养测序正确的阳性克隆，按质粒抽提试剂盒抽提重组质粒。同理将能刺激宿主产生抗体的其他核酸序列构建慢病毒表达载体，制备相应的载体疫苗。
6.1.3.携带RBD基因的慢病毒包装
取对数生长期的293FT细胞，以5×106cell·mL-1的密度接种于培养瓶。将慢病毒表达载体(pGC-FU-RBD)、包装质粒(pHelper 1.0和pHelper 2.0)分别进行高纯度无内毒素抽提，按Invitmgen公司upofectamine 2000使用说明进行共转染293FT细胞。同时将DGC-FU(含 GFP基因)、包装质粒(pHelper 1.0和pHelper 2.0)共转染另一组293FT细胞，所获得的仅携带GFP基因的空载体(kntiviml～GFP)作为对照。转染8h后更换为完全培养基，继续培养48h，收集富含慢病毒的上清液，4℃，4000g离心10min，再以0.45μm滤器过滤，得到高滴度的慢病毒，分装，置于-80℃保存。
6.1.4.携带RBD基因的慢病毒滴度检测
①孔稀释法计数荧光细胞：取慢病毒原液10μL，用10％FBS的DMEM培养液10倍稀释为3-5个梯度，将293 FT细胞按每孔3×104个细胞的密度接种于96孔板，37℃5％CO2培养24h后，每孔更换为10％FBS的DMEM培养液150μL继续培养48h，用荧光显微镜计数荧光细胞，计算病毒滴度。结果在重组质粒pGC-FU-RBD转染293 FT细胞后，被包装成慢病毒颗粒，在荧光显微镜下293 FT细胞内呈现绿色荧光。②Real time定量PCR法测定：以10％FBS的 DMEM培养液培养293 FT细胞，以待测定的慢病毒原液感染，然后根据Invitrogen公司的 TRIZOL操作说明书抽提RNA，以做RT-qPCR测定所抽提RNA的浓度。
6.1.5.携带RBD基因的慢病毒转染RNA干扰干细胞
以每孔1×106个细胞密度将生长状态良好的RNA干扰干细胞接种于6孔板，待细胞融合至30％时，试验组细胞分别加入5倍稀释的慢病毒原液，同时设立阴性对照组(仅转染慢病毒载体)和空白对照组(未转染慢病毒载体)。上述细胞培养24h后更换10％FBS的DMEM液，并加入最佳筛选浓度的氨苄青霉素(2.50μg·mL-1)，维持氨苄青霉素浓度(氨苄青霉素筛选 pGC-FU-RBD、嘌呤霉素筛选筛选pHBLV-RBD)，隔天换液，直至空白对照组细胞完全死亡。未被杀死的细胞即为已被重组慢病毒转染并已在DNA上整合了新冠病毒S1-RBD的RNA干扰干细胞，即所述的RNA干扰干细胞载体疫苗。
6.1.6.RNA干扰干细胞载体疫苗的RBD基因检测
①RT-PCR检测RBD基因的mRNA转录
取RNA干扰干细胞载体疫苗，以1×106个细胞密度接种于6孔板，培养4d后，应用RT-PCR 检测RBD基因的转录水平。RT-PCR扩增RBD的引物序列为：RBD上游： 5’-GATTACTCATTCATTCGATATTAC-3’；下游：5’-ATATGCAACAGATGATCGGAAC-3’；β -actin上游：5’-TGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’；下游：5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’。 RT-PCR检测结果与对照组相比，显示1条额外的RBD转录的409bp条带。
②Western-Blot检测RBD基因的蛋白表达
抽提RNA干扰干细胞裂解液的蛋白，BAC法蛋白定量，每组设置3个随机复孔。用10％ SDS-PAGE分离样品蛋白质，电转至硝酸纤维素膜上，以1∶400稀释的抗VDR抗体为一抗，用ECL化学发光试剂盒显像，用凝胶图像分析系统确定各蛋白条带的相对灰度值。Western-Blot检测到RNA干扰干细胞组RBD基因的蛋白表达明显增加。
③免疫荧光检测RBD基因的蛋白表达
制备RNA干扰干细胞抗原片，以兔抗SARS-COV-2多克隆特异抗体作为第一抗体，以FITC 标记的羊抗兔IgG作为第二抗体进行间接免疫荧光(IFA)检测，RNA干扰干细胞中可以观察到 SARS-COV-2特异荧光颗粒，表明RBD基因在细胞中得到了表达。
6.2.RNA干扰干细胞载体疫苗的免疫功能检测
6.2.1.RNA干扰干细胞载体疫苗的准备
取RNA干扰干细胞载体疫苗接种于10％FBS的DMEM完全培养液中进行细胞培养，待细胞铺满瓶底约90％时，0.25％胰酶消化，进行传代、扩增培养。
6.2.2.实验动物的准备
选择6-8周龄、40克左右的SPF级雌性BALB/c小鼠，随机分为RNA干扰干细胞载体疫苗组(敲除hACE2基因、敲入shRNA和RBD基因的干细胞组)、RNA干扰干细胞对照组(敲除hACE2基因、敲入shRNA基因的干细胞组)，每组10只。
6.2.3.动物接种及标本采集
在各组小鼠的腹腔注射5％水合氯醛溶液(0.006mL/g或0.6mg/g)，肌肉松弛后固定于板上；颈部皮肤备皮，碘伏擦拭消毒，颈部皮肤剪开约1cm小口，组织镊子分离肌肉及结缔组织，暴露气管；将干细胞缓慢注入小鼠气管，复位组织、缝合皮肤；每天观察小鼠的临床症状，采集接种后1、2、4、6周的静脉血，3,000g离心10min，分离的血清于-20℃保存，用于测定 SARS-CoV-2特异性抗体IgG和IgM。
6.2.4.检测方法
①ELISA检测IgG：按试剂盒操作：每孔加入1∶10稀释的100μl待检血清，放37℃温箱孵育30min，用洗涤液充分洗涤；加入100μl HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶500)，放37℃温箱孵育30min，用洗涤液充分洗涤；加入底物液，放37℃温箱孵育10min，最后加入终止液 50μl，在450nm波长下测定OD值。
②ELISA检测IgM：按试剂盒操作：每孔加入1∶10稀释的100μl待检血清，放37℃温箱孵育30min，用洗涤液充分洗涤；加入100μl HRP标记的羊抗鼠IgM(1∶500)，放37℃温箱孵育30min，用洗涤液充分洗涤：加入底物液，放37℃温箱孵育10min，最后加入终止液 50μl，在450nm波长下测定OD值。
③中和抗体的测定：取抗体阳性血清标本100μl，56℃水浴30min灭活，以排除非特异性反应因素。将试验血清用0.22μm的过滤器过滤后进行倍比稀释，使之成为1∶2，1∶4， 1∶8……。然后将病毒稀释成每个细胞孔1/2接种量中含100TCID50(计算病毒稀释倍数的公式为：TCID50/0.2ml的对数减中和试验要求病毒含量/0.1ml的对数减病毒滴定时每孔细胞接种量与中和试验时每孔细胞接种病毒量之间倍数的对数，所得对数的反对数即为病毒应稀释的倍数)。将稀释好的病毒按每管200μl加入等量的稀释好的血清，充分混匀后，37℃水浴作用120min。每个样品4个复孔接种VeroE6细胞，除阴性细胞对照孔外，每孔100μl病毒- 血清混合物。阳性细胞对照：50μl病毒稀释液+50μl病毒+100μl细胞。阴性细胞对照：加100μl病毒稀释液。37℃，5％CO2培养箱孵育，逐日观察细胞病变效应(CPE)。
6.2.5.检测结果
①特异性抗体检测结果：RNA干扰干细胞载体疫苗组在接种后1、2、4、6周的IgG和IgM检测结果见表16。检测结果表明，经RNA干扰干细胞载体疫苗接种的小鼠外周血IgG、IgM阳性及其同时阳性的例次分别为13、14和8例，对照组的阳性例次分别为4、3和1例，说明RNA干扰干细胞载体疫苗组在接种后有较多例次产生了特异性抗体。
表16 RNA干扰干细胞载体疫苗组在接种小鼠后的特异性抗体检测结果
Figure BSA0000226452730000221
②中和抗体检测结果：将接种后第4周血清IgG阳性的5例小鼠血清，按本发明所述的中和抗体检测方法操作，结果阳性(对照组)的VeroE6细胞在培养3-5天内全部发生细胞病变效应(CPE)；而阴性(对照组)细胞呈贴壁生长(+)，均未发生CPE；5例小鼠血清在1∶16～64倍稀释后仍能抑制病毒对VeroE6细胞的攻击，但随着稀释倍数的增大，不能抑制病毒对细胞的攻击，使VeroE6细胞出现CPE。说明5例小鼠血清样本中的IgG具有中和病毒的作用，进而说明RNA干扰干细胞载体疫苗能刺激小鼠产生中和抗体，其效价为1∶16～64(表17)。
表17 RNA干扰干细胞载体疫苗的中和抗体致VeroE6细胞半数感染的试验结果
Figure BSA0000226452730000222
6.3.hACE2敲除RNA干扰干细胞载体疫苗的收藏和应用
将RNA干扰干细胞载体疫苗按姓名、ABO和/或HLA分型冻存于-196℃干细胞库，当某个体需要使用时，按自身、ABO或HLA同型、异型的次序选用干细胞载体疫苗。

Claims (9)

1.一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，以hACE2基因敲除的RNA干扰干细胞取代传统新冠病毒疫苗的腺病毒载体制备个体化治疗COVID-19疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，所述RNA干扰干细胞，包括敲除新冠病毒易感基因hACE2的干细胞和/或永生化干细胞、敲入新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰基因shRNA的干细胞和/或永生化干细胞；所述RNA干扰干细胞载体疫苗指将新冠病毒抗体产生基因敲入RNA干扰干细胞DNA。
3.根据权利要求1、2所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，所述RNA干扰干细胞载体疫苗，包括在同一干细胞中同时敲除新冠病毒易感基因hACE2、敲入新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰基因shRNA和新冠病毒抗体产生基因S1-RBD的干细胞和/或永生化干细胞。
4.根据权利要求1、2或3任一所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，所述干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、肺干细胞、诱导的干细胞或肺干细胞；所述永生化干细胞包括以SV40LT和/或hTERT基因转染的干细胞。
5.根据权利要求1所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，所述RNA干扰干细胞包括重组慢病毒载体的构建、重组慢病毒载体和包装质粒共转染293FT细胞进行慢病毒的包装、慢病毒转染、RNA干扰干细胞的筛选和鉴定。
6.根据权利要求1所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，所述重组慢病毒载体的构建包括将新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰序列shRNA和新冠病毒易感基因ACE2的互补双链克隆到慢病毒载体的多克隆位点。
7.根据权利要求1、6所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，所述新冠病毒M、N、E和/或S基因的siRNA序列见“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列”。
8.根据权利要求1所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，扩增所述hACE2基因的上游引物为：CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3；下游引物为：EF1-Rn：5’-GCCAGTACACGACATCACTT-3’；β-actin的上游和下游引物分别为：5’-TGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’、5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’。
9.根据权利要求1所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，按以下步骤制备：
(1)获得间充质干细胞：从干细胞样本库或日常实验后剩余的样本中分离间充质干细胞和/或羊水成纤维细胞，或经干细胞诱导获得干细胞、肺干细胞。
(2)给干细胞装配永生化基因：构建携带hTERT和/或SV40LT的重组载体，转染干细胞，使干细胞DNA整合上hTERT和/或SV40LT基因，从而获得能永久生存、无限传代的新功能，可再经鉴定或诱导获得肺干细胞系。
(3)敲除干细胞的hACE2基因：从GenBank检索人ACE2核酸序列，下载其FASTA文件，进入www.genome-engeering.org，上传文件并筛选出评分较高的单导向RNA(sgRNA)序列，在每条sgRNA序列F链5’端添加CACC序列，R链5’端添加AAAC序列，与pX330质粒经Fast DigetBbs I酶切后的粘性末端形成互补，合成sgRNA寡链核苷酸(oligo)序列，以T4连接酶将双链sgRNA与pX330载体进行连接，然后转染干细胞，以敲除hACE2基因。
(4)给干细胞装配新冠病毒RNA干扰基因：优选新冠病毒(nCoV)的靶向干扰序列siRNA，合成shRNA模板，连接到慢病毒载体pHBLV或LV3，构建重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA或LV3-nCoV-N-shRNA，将重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA和包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体)或者将重组质粒LV3-nCoV-N-shRNA和包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5)共转染293FT细胞，包装携带shRNA的慢病毒，将慢病毒转染干细胞，使shRNA基因整合到干细胞DNA上，使干细胞获得能干扰nCoV在胞内复制的新功能。
(5)制成一种敲除hACE2基因、敲入RNA干扰基因和永生化基因的RNA干扰干细胞。
(6)将RNA干扰干细胞用作新冠病毒疫苗载体，替换现有技术的腺病毒载体，制备干细胞载体疫苗：根据GenBank分析SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列(RBD氨基酸为Gly319～Asn541)，采用氨基酸密码子同义置换，合成RBD肽段对应核酸的全基因(序列两端分别插入HindIII和Xho I的酶切位点)，将合成的RBD基因构建重组质粒(pGC-FU-RBD)，将重组质粒和包装质粒共转染293FT细胞，包装携带RBD的慢病毒，将慢病毒转染RNA干扰干细胞，使干细胞DNA整合上RBD，以获得能表达RBD蛋白及其抗体的干细胞载体疫苗。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2023083315A1 (zh) * 2021-11-11 2023-05-19 翁炳焕 一种以RBD靶向递送shRNA的nCOVsiRNA药物及合成方法和应用

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