CN112553163A - 一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞 - Google Patents

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Abstract

一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，从干细胞样本库或日常实验后剩余的样本中获得间充质干细胞或羊水成纤维细胞，筛选、诱导成干细胞，然后将新冠病毒的易感基因ACE2插入干细胞DNA中，制备易被新冠病毒感染的易感干细胞；进而将新冠病毒M、N、E和/或S基因的RNA干扰序列shRNA插入所制易感干细胞DNA中，构建既能通过ACE2将新冠病毒吸入干细胞内又能通过shRNA靶向干扰新冠病毒在干细胞内复制的用于治疗COVID‑19的RNA干扰干细胞。

Description

一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞
技术领域
本发明涉及一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，属于生物医学领域的传染病防治技术。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)已对全球公众健康构成严重威胁。SARS-CoV-2的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)。其中S蛋白在感染过程中被宿主蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，S1亚基由N 端的结构域(S1-NTD)和受体结合域(S1-RBD)组成，S1-RBD负责识别并结合宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，S2亚基介导病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合，使病毒进入细胞引起感染。N蛋白为RNA合成所必需，在病毒组装和RNA转录中起着至关重要的作用，同时也参与宿主细胞对病毒感染的反应。M和E蛋白在病毒装配中起重要作用。
目前用于临床治疗的干细胞，国内外主要聚焦在间充质干细胞(MSCs)和自然杀伤细胞(NK)，其中应用最多的是MSCs。MSCs来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，能迁移到损伤的确切部位，定向分化为肺组织细胞和毛细血管内皮细胞等多种细胞系，产生多种细胞因子和分泌大量的含有miRNA的外泌体、囊泡，通过影响PI3K/AKT、NF-КB等信号通路来治疗肺损伤，通过调节免疫、抗纤维化、抑制炎性因子风暴等机制修复受损器官。干细胞具有非常强的抗病毒能力，能在病毒感染局部幸存并发挥作用，已初步表明MSCs在重症新冠肺炎治疗中的安全性和有效性，具有良好的临床应用前景。但尚未见以功能改造的干细胞治疗COVID的文献报道。
文献报道，SARS-CoV能在ACE2转染的293T细胞中复制，但不能在模拟转染的293T细胞中复制。目前报道SARS-CoV-2也通过ACE2受体感染宿主细胞。在传统观念上，通常不希望SARS-CoV-2通过ACE2受体感染机体细胞和治疗用干细胞，本发明以相反的思路，构建表达ACE2的重组载体，转染干细胞，以增强干细胞表达ACE2功能，从而增强干细胞对SARS-CoV-2 的易感性，使干细胞在治疗中与宿主细胞竞争吸入较多的新冠病毒，以减少机体正常组织感染机会，然后通过人工装配在干细胞DNA的RNA干扰基因抑制、杀灭被ACE2吸引入干细胞内的新冠病毒。
RNA干扰(RNAi)是指特异性沉默外源基因的抗病毒作用。当将外源靶基因整合到宿主细胞基因组时，外源靶基因能利用宿主细胞转录dsRNA，dsRNA被宿主细胞质中的核酸内切酶(Dicer)切割成具有特定长度和结构的多个小片段siRNA(大约21～23bp)，siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，由反义siRNA与体内的内切酶、外切酶和解旋酶结合，形成RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)。当外源基因入侵宿主细胞时，RISC与外源基因表达的mRNA的同源序列特异性结合，在结合部位切割同源mRNA，被切割的断裂mRNA 随即降解，从而诱发宿主细胞针对外源mRNA的降解作用。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶的作用下合成新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割成大量的次级siRNA，进而形成RISC而发挥作用，使RNAi的作用进一步放大，最终将外源靶mRNA完全降解。但尚未见以人工构建的具有RNA干扰功能的干细胞为载体制备新冠病毒疫苗的报道。
发明内容
基于目前治疗用干细胞的问题，本发明人提出了本发明。
本发明的目的是制备一种人工装配新冠病毒易感基因和RNA干扰基因的RNA干扰干细胞。
本发明的目的通过以下技术方案实施：
首先，获得间充质干细胞。例如，从干细胞样本库或日常实验后剩余的样本中获得间充质干细胞和/或羊水成纤维细胞，筛选或诱导成肺干细胞。
进而，给干细胞装配新冠病毒易感基因：将血管紧张素转换酶II基因连接慢病毒表达载体pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro或pGC-FU，分别构建重组质粒pHBLV-OE-ACE2或 pGC-FU-ACE2，将重组质粒pHBLV-OE-ACE2和包装质粒(psPAX2和pMD2G)或者将重组质粒 pGC-FU-ACE2和包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)分别共转染293FT细胞，包装携带ACE2 的重组慢病毒OE-ACE2或FU-ACE2，将重组慢病毒转染干细胞，使ACE2基因整合到干细胞DNA。
进而，给干细胞装配新冠病毒RNA干扰基因：优选新冠病毒(nCoV)的靶向干扰序列siRNA，合成shRNA模板，连接到慢病毒载体pHBLV或LV3，构建重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA或 LV3-nCoV-N-shRNA，将重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA和包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G 载体)或者将重组质粒LV3-nCoV-N-shRNA和包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4 和pLV/helper-SL5)共转染293FT细胞，包装携带shRNA的慢病毒，将慢病毒转染干细胞，使shRNA基因整合到干细胞DNA上，使干细胞获得能干扰nCoV在胞内复制的新功能。
进而，制成一种人工装配新冠病毒易感基因和RNA干扰基因的兼具干细胞天然治疗功能、新冠病毒易感功能、RNA干扰功能的RNA干扰干细胞。
本发明的有益效果在于：
将原本弃用的组织细胞改造为具有新功能的RNA干扰干细胞。
RNA干扰干细胞因装配了新冠病毒的RNA干扰基因而更易抑制病毒在干细胞内复制，使原本易被病毒杀灭的干细胞改造为易杀灭病毒的RNA干扰干细胞。
RNA干扰干细胞在装配RNA干扰基因的基础上装配新冠病毒易感基因(ACE2)，更易与宿主细胞竞争将病毒吸入干细胞内并在干细胞内进行RNA干扰，从而减少宿主细胞受感染机会。这种ACE2的应用方法克服了通常担心治疗用干细胞被病毒感染的传统偏见，而且RNA干扰干细胞中装配的ACE2基因能表达ACE2蛋白，这种蛋白能刺激宿主产生ACE2抗体，而ACE2抗体因能阻抑新冠病毒与ACE2受体结合而能阻止新冠病毒感染新的宿主细胞。
同时装配了ACE2基因和RNA干扰基因的RNA干扰干细胞，前者将病毒吸入干细胞内，后者抑制病毒在干细胞内复制，起到“引毒入胞、胞内杀毒”的作用，使具有组织损伤作用的抗病毒反应从宿主组织转移到干细胞内，从而可减轻宿主组织因抗病毒反应所致的损伤。
附图说明
图1是本发明所述的成纤维羊水间充质干细胞图。
图2是本发明所述的经转染ACE2基因和shRNA基因后的RNA干扰干细胞的传代培养图。
图3是重组ACE2的干细胞与分离的病毒共培养72小时的细胞生长状态。
图4是重组ACE2和shRNA的干细胞与分离的病毒共培养72小时的细胞生长状态。
在图1中，本发明筛选出的成纤维羊水细胞，在传代培养中呈梭形、贴壁生长。
在图2中，本发明将ACE2基因和shRNA基因同时转染图1所示的羊水间充质干细胞，获得能在传代培养中呈梭形、贴壁生长的RNA干扰干细胞。
在图3中，可见细胞呈圆形、漂浮、死亡状态，说明细胞内ACE2基因的表达有利于将病毒吸入胞内并在胞内繁殖、致细胞较快死亡。
在图4中，可见细胞仍呈梭形贴壁生长，说明shRNA的表达能干扰病毒在胞内复制，使重组ACE2和shRNA的干细胞能将病毒吸入胞内并在胞内杀灭。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方法作详细的描述，但这些范例性的描述并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
实施例一、RNA干扰干细胞的制备
1.间充质干细胞的采集
间充质干细胞(MSC)来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，可从各单位实验后剩余或干细胞库的羊水细胞、羊膜组织、骨髓细胞、脐带血、脐带组织或胎盘组织中获得。
1.1.羊水间充质干细胞的采集
从各单位日常产前诊断后剩余的羊水细胞中分离间充质干细胞。羊水细胞为约19孕周胎儿的呼吸系统、消化系统等组织的脱落细胞，富含肺间充质干细胞和ips细胞。这些细胞经进一步的永生化后，寿命和活力更好，可制备成本发明的肺干细胞系。
具体方法如下：按各单位日常产前诊断流程采集待检孕妇的羊水细胞，进行常规细胞培养、实验诊断和结果报告。继续培养诊断结果为正常的剩余的羊水细胞，在倒置显微镜下筛选出梭形贴壁生长的成纤维羊水细胞或羊水间充质干细胞。
1.2.脐带间充质干细胞的采集
从液氮罐中取出冻存的脐带，置37℃水浴快速解冻，以无菌PBS清洗，去除残留的血迹，将脐带剪成大小约1mm3的组织块，置于铺有胎牛血清的培养皿中，在37℃放置6h后，加入10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃5％CO2培养箱中培养，3d后换液，1周后再次换液，此后每隔3d换液，观察贴壁组织周围的细胞生长情况，当细胞达到80％-90％融合度时，用胰酶消化传代，并将组织转移到新的培养瓶中，继续培养，获得间充质干细胞。
1.3.肺间充质干细胞的采集
无菌取流产胎儿肺脏组织，机械离散，0.25％胰蛋白酶消化后，用孔径为100um的纱布过滤，1 000r/min离心5min，弃上清液，添加DMEM培养液(0.1umolβ-巯基乙醇，100UI/mL 青链霉素，10％胎牛血清)。在37℃、5％CO2条件下培养。45min后换液，以去除尚未贴壁的细胞，后每48h换液。待细胞汇合度达80％后，0.25％胰蛋白酶消化传代。
2.间充质干细胞的新冠病毒易感基因(ACE2)装配
2.1.慢病毒表达载体pHBLV-ACE2-OE或pGC-FU-ACE2的构建和鉴定
PCR扩增质粒pc-DNA3.1-hygro(+)-mACE2中的ACE2(或从肺组织细胞中提取RNA，逆转录为cDNA，再PCR扩增ACE2)。根据GenBank的人ACE2 mRNA序列，设计合成PCR引物序列，人ACE2扩增的外端引物：F1(F out)5’-GAT GGA GTA CCG ACT GGA GTC-3’，R1(Rout)5’-CTA ATA TCG ATG GAG GCA TAA-3’，产物547bp；内端引物：F2(F in)5’-GAG GAG GAT GTGCGA GTG GCT A-3’，R2(R in)5’-CCA ACC ACT ATC ACT CCC ATC A-3’，产物269bp。人β -actin的扩增引物序列：F 5’-GCT CGT CGT CGA CAA CGG CTC-3’，R 5’-CAA ACA TGA TCTGGGTCATCTTCT-3’，产物353bp。PCR条件：94℃5min，然后94℃变性30s、55℃退火30s、 68℃延伸5min，循环30次，最后于68℃延伸10min。
用BamH I和EcoRI分别酶切载体pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro和上述PCR产物，或用AgeI和EcoRI分别酶切pGC-F和上述PCR产物，用琼脂糖电泳纯化，将线性化的载体DNA、酶切回收的PCR产物、T4噬菌体DNA连接酶及其缓冲液、ddH20置16℃连接过夜，将连接液转化感受态细胞，阳性克隆用PCR和测序鉴定。用LB培养液扩增转化菌，用质粒提取试剂盒提取pHBLV-ACE2-OE或pGC-FU-ACE2，采用Lipofectamine 2000转染293FT细胞，转染72h后用Western-Blot检测ACE2基因的表达。
2.2.携带ACE2慢病毒的包装及其滴度测定
将慢病毒表达载体(pHBLV-OE-ACE2)、包装质粒(psPAX2载体和pMD2G)或将pGC-FU-ACE2、包装质粒(pHelper 1.0和pHelper 2.0)分别按Invitmgen公司upofectamine2000说明进行共转染293FT细胞，获得携带ACE2基因的重组慢病毒(OE-ACE2)或Lentiviral-ACE。
同时将pHBLV空载(含GFP基因)、包装质粒(psPAX2载体和pMD2G)共转染另一组293FT 细胞，所获得的仅携带GFP基因的空载体(NC-GFP)作为对照。
转染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒的细胞上清液，4℃，4000 g离心10min，再以0.45μm滤器过滤上清液，除去细胞碎片，离心，得到高滴度的慢病毒。
以待鉴定的病毒原液感染293T细胞，4d后抽提RNA，应用Real-Time PCR法测定待测慢病毒的病毒滴度。
2.3.间充质干细胞的易感基因装配
取永生化干细胞，以每孔1×106个细胞密度接种于6孔板，分为目的基因过表达(OE-ACE2)组、空载体(NC-GFP)对照组、空白组，每组2孔，待细胞汇合至30％时，慢病毒组加入5倍稀释的慢病毒原液，空载体组加入5倍稀释的空载体原液，培养24h后更换10％FBS 的DMEM液，并加入最佳筛选浓度的嘌呤霉素(2.50μg·mL-1)，维持嘌呤霉素浓度，隔天换液，直至空白对照组细胞完全死亡，筛选结束(用氨苄青霉素筛选Lentiviral-ACE转染的细胞)。未被嘌呤霉素杀死的细胞即为已被重组慢病毒转染并已在DNA上整合了ACE2基因的干细胞系，下称重组ACE2干细胞。
2.4.ACE2干细胞的ACE2基因检测
2.4.1.RT-PCR检测ACE2基因的mRNA转录水平
取ACE2干细胞，以1×106个细胞密度接种于6孔板，培养4d后荧光显微镜观察荧光的表达，并应用RT-PCR检测ACE2干细胞中ACE2基因的转录水平。RT-PCR扩增ACE2的引物序列为：ACE2上游：CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3；下游： EF1-Rn：5’-GCCAGTACACGACATCACTT-3’；β-actin上游和下游分别为： 5’-TGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’、5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’。RT-PCR检测到 OE-ACE2组中ACE2基因呈高水平转录，与对照组相比，显示1条额外的由ACE2转录的409bp 的mRNA条带。并且经ACE2/B-actin积分光密度值(IOD)比较和统计学分析，发现ACE2干细胞的mRNA表达量明显增多(p＜0.01)(正常细胞组为0.234±0.10l，空载体对照组为0.247 ±0.098，ACE2干细胞组为0.682±0.118)，提示明显增加ACE2转录。
2.4.2.Western-Blot检测ACE2基因的蛋白表达水平
抽提各组细胞裂解液的蛋白，BAC法蛋白定量，每组设置3个随机复孔。用10％SDS-PAGE 分离样品蛋白质，电转至硝酸纤维素膜上，以1∶400稀释的抗VDR抗体为一抗，用ECL化学发光试剂盒显像，用凝胶图像分析系统确定各蛋白条带的相对灰度值。Western-Blot检测到ACE2干细胞组ACE2基因的蛋白表达明显增加，显示1条由ACE2表达的很明显的蛋白表达条带(ACE2-90kDa)，而正常细胞组和空载体组只有1条相同的β-actin(42kDa)条带。
3.ACE2干细胞的RNA干扰基因装配
3.1.设计新冠病毒的siRNA基因
以Ambion公司(http：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNAtools.html)的shRNA在线设计软件，从SARS-CoV-2(NC_045512.2株ORFlab、3’UTR、S、E、M、N)的保守序列中筛选出多个siRNA备选序列。
根据人类基因组数据库、RNA结合的Tm值及特异性的比对结果，分别优选3条与人类基因组没有同源性的保守siRNA序列(表1A)，同时设计1条无关的siRNA序列作为阴性对照(NC：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTAA-3’)。
表1A NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列
Figure BSA0000226490440000061
3.2.合成shRNA模板
靶序列确定以后，根据慢病毒干扰载体pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO的多克隆酶切位点，设计shRNA模板，使每个模板由两条大部分互补的长度为52-60nt的单链DNA构成，寡核苷酸单链DNA的3’端有2-5个U字形突出，包括靶序列的正义序列、loop序列、靶序列的反义序列、转录终止信号以及酶切后的粘性末端序列，经退火互补后能形成带有BamH I和ECORI酶切位点粘性末端的DNA双链(如用pSilencer4.1.CMV.neo，则用BamH I和Hind III)。如表1B，“斜体”表示酶切位点，“加粗”表示茎环结构，“下划线”表示正义链。
表1B 以表1A中的siRNA合成S、E、M、N基因相对应的shRNA模板
Figure BSA0000226490440000071
3.3.慢病毒干扰载体的构建
以新冠病毒N基因的靶向干扰序列(nCoV-N-siRNA-1/2/3)作为实施例，以T4连接酶将合成的shRNA模板与线性化的慢病毒载体pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO连接，构建慢病毒干扰载体pHBLV-nCoV-N-shRNA1/2/3，转化感受态E.coli DH5α。
3.4.慢病毒干扰载体的鉴定
取慢病毒干扰载体转化的感受态E.coli DH5α10μL，涂布于含50μg.mL-1嘌呤霉素的 LB平板抗性培养，筛选出阳性克隆，提取质粒，以PCR、BamH I和ECORI酶切或测序鉴定，培养测序正确的阳性克隆，按质粒抽提试剂盒抽提质粒。观察重组慢病毒干扰载体中3个靶向nCoV-N-siRNA1/2/3干扰基因与设计的干扰序列是否完全一致。
3.5.携带shRNA慢病毒的包装
取对数生长期的293FT细胞，以5×106cell·mL-1的密度接种于培养瓶，加入重组质粒和慢病毒包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体三质粒组成)各4μg，并与Lipofectamine200脂质体共转染，8h后更换为完全培养基，继续培养48h，然后收集富含慢病毒的上清液，离心，过滤，分装，置于-80℃保存。
3.6.慢病毒滴度的检测
①孔稀释法计数荧光细胞：取慢病毒原液10μL，用10％FBS的DMEM培养液10倍稀释为3-5个梯度，将293 FT细胞按每孔3×104个细胞的密度接种于96孔板，37℃5％CO2培养24h后，每孔更换为10％FBS的DMEM培养液150μL继续培养48h，用荧光显微镜计数荧光细胞，计算病毒滴度。结果在重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA(LV3-nCoV-N-shRNA)转染293 FT 细胞后，被包装成慢病毒颗粒，在荧光显微镜下293 FT细胞内呈现绿色荧光。②Real time 定量PCR法测定：以10％FBS的DMEM培养液培养293 FT细胞，以待测定的慢病毒原液感染，根据Invitrogen公司的TRIZOL操作说明抽提RNA，RT-qPCR测定所抽提RNA的浓度。
3.7.ACE2干细胞的慢病毒转染
以每孔1×106个细胞密度将生长状态良好的ACE2干细胞接种于6孔板，待细胞融合至 30％时，试验组细胞分别加入5倍稀释的慢病毒原液，分别命名为pHBLV-nCoV-N-shRNA1组、 pHBLV-nCoV-N-shRNA2组、pHBLV-nCoV-N-shRNA3组。同时设立阴性对照组(仅转染慢病毒干扰载体的干细胞组)和空白对照组(未转染慢病毒干扰载体的正常干细胞组)。
本发明包括选用慢病毒载体pSilencer4.1.CMV.neo、以EcoR I和Hind III酶切、构建重组载体LV3-nCoV-N-shRNA、将重组载体与包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、 pLV/helper-SL5)共转染293FT细胞、包装慢病毒、以氨苄青霉素筛选阳性克降。
3.8.筛选转染阳性的ACE2干细胞
上述细胞培养24h后更换10％FBS的DMEM液，并加入最佳筛选浓度的嘌呤霉素(2.00μ g·mL-1)，维持嘌呤霉素浓度，隔天换液，直至空白对照组细胞完全死亡，筛选结束。
未被嘌呤霉素杀死的干细胞即为已被重组慢病毒干扰载体转染并已在DNA上整合了新冠病毒靶向干扰序列(nCoV-shRNA)的ACE2干细胞。理论上这种干细胞能表达dsRNA，dsRNA 能干扰nCoV基因，从而产生干细胞内的抗病毒作用。
3.9.验证转染阳性ACE2干细胞的shRNA表达
3.9.1.RT-PCR检测shRNA的mRNA表达
用Trizol试剂分别提取ACE2干细胞的nCoV-N-shRNA1、nCoV-N-shRNA2和nCoV-N-shRNA3 组的总RNA，以GAPDH为内参照，设计表2所示的引物，定量分析nCoV-N-shRNA1/2/3的mRNA， PCR条件为：95℃3min变性，95℃12s，62℃40s，72℃30s，共40个循环。每组均设 3个随机复孔。反应结束后，仪器自动记录每个样品管中Ct值，以GAPDH为内参照，计算目的基因的相对含量，用2-ΔCt表示。观察空白对照组、阴性对照组pHBLV-nCoV-N的mRNA表达量以及pHBLV-nCoV-N-shRNA1、pHBLV-nCoV-N-shRNA2和pHBLV-nCoV-N-shRNA3组这3个干扰组中pHBLV-nCoV-N的mRNA表达量是否下降，推断3个特异性靶点对nCoV-N基因是否有沉默效果，与阴性和空白对照组有无统计学差异，筛选出干扰效果最佳(pHBLV-nCoV-N-shRNA2)。
表2 新冠病毒S、E、M、N基因靶向干扰序列siRNA1～siRNA3扩增引物的设计
Figure BSA0000226490440000091
3.9.2.Western Blotting检测shRNA的蛋白表达
①抽提各组细胞裂解液的蛋白，BAC法蛋白定量，每组设置3个随机复孔。用10％SDS-PAGE 分离样品蛋白质，电转至硝酸纤维素膜上，以1∶400稀释的抗VDR抗体为一抗，用ECL化学发光试剂盒显像，用凝胶图像分析系统确定各蛋白条带的相对灰度值。②观察空白对照组、阴性对照组的pHBLV-nCoV-N蛋白表达量以及pHBLV-nCoV-N-shRNA1、pHBLV-nCoV-N-shRNA2 和pHBLV-nCoV-N-shRNA3组这3个干扰组中重组慢病毒pHBLV-nCoV-N蛋白的表达量，与阳性对照组和空白对照组间有无统计学差异。③结果发现pHBLV-nCoV-N-shRNA2组能有效干扰nCoV-N基因的蛋白表达，下称RNA干扰干细胞。
本发明涉及的载体还包括过表达载体如pHBLV-CMV-IRES-ZsGreen、pHBLV-CMV-EF1-RFP、、 pHBLV-CMV-IRES-Puro、pHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro、pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-Puro、 pHBLV-CMVIE-RFP-T2A-Puro、pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-Puro、pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-Luc、 pGC-FU，干扰载体如pHBLV-U6-ZSGreen、pHBLV-U6-ZSGreen-puro、pHBLV-U6-Puro、 pHBLV-U6-ZsGreen-T2A-Puro、pHBLV-U6-RFP-T2A-Puro、pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro、 pHBLV-U6-RFP、pHBLV-U6-ZsGreen-T2A-Luc、pHBLV-U6-RFP-T2A-luc，干扰过表达双框架载体如pHBAd-U6-CMV(用于构建同时表达两种基因的重组载体，例如表达shRNA和ACE2的 pHBAd-U6/shRNA-CMV/ACE2)。
4.RNA干扰干细胞的功能检测
4.1.RNA干扰干细胞的体外抗病毒功能检测
4.1.1.样本采集
取COVID-19确诊患者的咽拭，按100∶1的比例加入双抗(10000IU的青霉素和10000μg 的链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100IU和100μg，置4℃过夜，备用。
4.1.2.病毒培养和分离
将Vero-E6接种至含(10％胎牛血清)DMEM培养液的12.5cm2培养瓶中，置36℃、5％CO2培养箱中培养成30％汇合度的单层细胞，吸去培养液，用DMEM清洗细胞2遍，然后在培养瓶中加入0.5mL经过双抗处理的COVID-19患者样本，置36℃、5％CO2培养箱中吸附90min后，吸去样本，加入3.5mL DMEM培养液(10％胎牛血清)，每天观察细胞病变效应(CPE)，经培养5～7d后，取病变细胞上清液蔗糖梯度超速离心，分离新冠病毒，用培养液配成103～105TCID50/ml病毒液(同时用于后述的动物试验)。
4.1.3.RNA干扰干细胞与病毒共培养
设立间充质干细胞组、ACE2干细胞组、RNA干扰干细胞组(重组ACE2和shRNA)，每组接种12孔板，使每孔含有2×105个细胞、2mL DMEM培养液(10％胎牛血清)，置36℃、5％CO2培养箱中培养至30％汇合度时，每孔加病毒液0.5mL，继续培养。然后分别于培养1小时、6 小时、24小时和72小时后每组各取3孔的上清液，混合后以1∶4、1∶12、1∶36、1∶108、1∶324、 1∶972、1∶2916、1∶8748倍稀释，进行RT-PCR检测。
4.1.4.实时荧光RT-PCR检测病毒RNA
核酸提取试剂盒(批号：2019004)、2019新型冠状病毒(ORF1ab/N)核酸检测试剂盒(批号：20200123)和DA3200核酸提取仪，购自中山大学达安基因股份有限公司，ABI 7500型PCR 仪购自美国Thermo Fisher Scientific。按试剂盒说明书操作，扩增反应条件为：50℃15min； 95℃15min；94℃15s；55℃45s；共45个循环，在55℃采集荧光信号。
根据试剂盒说明，结果判断标准如下：①如果检测样本在ORF1ab和N基因通道无扩增曲线或Ct值＞38，判为SARS-CoV-2阴性；②如果检测样品在ORF1ab和N基因通道Ct值≤38，且有明显的扩增曲线，判为SARS-CoV-2阳性；③如果检测样品在ORF1ab或者N基因通道Ct值≤38，另一通道无扩增曲线，复检结果与原来结果一致，判为SARS-CoV-2阳性。
4.1.5.病毒RNA检测结果
在表3中，3组干细胞培养1小时培养液RNA检测结果的阳性滴度均为1∶12，被认为是属于外源加入病毒检测结果。在表4～8中，3组干细胞培养6～72小时后，以ACE2干细胞组RNA检测结果的阳性滴度为最高，其最高滴度为1∶2916；以RNA干扰干细胞组的阳性滴度为最低，其最高滴度为1∶36。说明ACE2有利于将病毒吸入干细胞内并在胞内复制，而shRNA 能干扰病毒在干细胞内复制。
表3 干细胞与分离的新冠病毒共培养1小时培养液中病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226490440000111
表4 干细胞与分离的新冠病毒共培养6小时的培养液病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226490440000112
表5 干细胞与分离的新冠病毒共培养6小时的细胞内病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226490440000113
Figure BSA0000226490440000121
表6 干细胞与分离的新冠病毒共培养24小时培养液的病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226490440000122
表7 干细胞与分离的新冠病毒共培养72小时培养液的病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226490440000123
表8 干细胞与分离的新冠病毒共培养72小时的细胞内病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226490440000124
4.1.6.RNA干扰干细胞与病毒共培养特点
重组ACE2的干细胞组在培养72小时后细胞变圆、漂浮、死亡(图3)，图3说明细胞内ACE2基因的表达有利于将病毒吸入胞内并在胞内繁殖、致细胞较快死亡，而重组ACE2和shRNA 的干细胞组在培养72小时后仍呈贴壁生长(图4)，图4说明shRNA的表达能干扰病毒在胞内复制，使重组ACE2和shRNA的干细胞能将病毒吸入胞内并在胞内杀灭。
4.2.RNA干扰干细胞的动物体内抗病毒功能检测
4.2.1.RNA干扰干细胞的准备
取RNA干扰干细胞接种于10％FBS的DMEM完全培养液中进行细胞培养，每隔两三天更换培养液1次；5d左右细胞铺满瓶底约90％，0.25％胰酶消化2～3min，800r/min，离心半径12cm，离心5min，按1∶2接种于75cm2培养瓶中，于37℃、5％CO2恒温培养箱中扩增培养，4～5d传代1次。
4.2.2.实验动物的分组
选择6-8周龄、40克左右的SPF级雌性BALB/c小鼠，随机分为RNA干扰干细胞组(用于感染NC_045512.2株、接种携带ACE2和shRNA的干细胞)、ACE2干细胞组(用于感染NC_045512.2株、接种携带ACE2的干细胞)，另设间充质干细胞组(用于感染NC_045512.2 株、接种未重组ACE2和shRNA的干细胞)、阳性对照组(用于感染NC_045512.2株、接种生理盐水)和阴性对照组(仅接种生理盐水)。
4.2.3.实验动物的感染和接种
RNA干扰干细胞组、ACE2干细胞组、干细胞组和阳性对照组分别经鼻腔喷雾接种40μl 的NC_045512.2株病毒液，滴度为105/mlTCID50，阴性对照组经鼻腔喷雾接种40μl生理盐水。在各组小鼠腹腔注射5％水合氯醛溶液(0.006mL/g或0.6mg/g)，肌肉松弛后固定于板上；颈部皮肤备皮，碘伏擦拭消毒，颈部皮肤剪开约1cm小口，组织镊子分离肌肉及结缔组织，暴露气管；将1×106个干细胞缓慢注入小鼠气管(阴性和阳性对照组注入生理盐水)，复位组织、缝合皮肤；每天观察小鼠的症状，感染后第7天处死小鼠，进行肺组织的病毒检测。
4.2.4.试验结果的检测
①RT-PCR检测
按Trizol法取200μl DMEM制成的处死小鼠肺组织匀浆标本，加入800μl Trizol，室温放置5min使蛋白彻底的裂解，加入氯仿200μl，用手剧烈震荡15sec，室温放置3min，4℃， 12,000g离心15min，取上清至新的Eppendorf管，加入0.5ml异丙醇，室温放置10min， 4℃，12,000g离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，7,500g离心5min，弃上清，再重复漂洗1次，以30μl DEPC处理过的水溶解沉淀。按试剂盒进行引物设计、PCR扩增和产物电泳，为了比较不同实验组病毒复制量的不同，可同时扩增宿主基因β-actin作为内参，将目的基因与内参基因表达水平灰度值的比值作为各样品病毒的半定量分析。
②细胞病变效应(CPE)观察
将-70℃冰冻的肺组织解冻后用DMEM制成10％匀浆，3,000rpm离心20min，取100pl上清接种于长成单层VeroE6细胞的24孔培养板上，每份标本接种2个孔，37℃吸附1h，然后吸出标本液，用PBS(加2％双抗)洗3遍后加DMEM补充至1.5ml，置37℃、5％CO2培养箱培养，观察培养液的pH，如发现变黄或变蓝，及时调整pH或更换培养液，每天观察细胞病变效应(CPE)，记录是否出现CPE，连续观察7天，若不出现CPE进行盲传，传3～4代，观察结果。接种细胞产生病变的特点是细胞变圆、融合，透光性减弱，最终细胞死亡脱落。
③间接免疫荧光检测
将出现病变效应(CPE)的VeroE6细胞用胰酶消化和PBS清洗，按每孔10μl(107/ml)滴加于抗原载玻片上，待干燥后置冷丙酮中固定10min，用PBS冲洗(干燥后放-20℃保存)，在制备的抗原片上滴加抗S蛋白单抗(1∶200，PBS配置)，37℃湿盒中孵育30-40min，PBS冲洗三次后，滴加FITC标记的二抗(1∶500，0.02％伊文思蓝-PBS配制)，37℃湿盒中孵育20-30min， PBS冲洗3次后，用50％甘油-PBS封片，荧光显微镜下观察荧光。结果判定：在阴性对照和阳性对照成立的条件下，标本接种的VeroE6细胞均出现红色荧光判断小鼠未感染病毒；标本接种的VeroE6细胞细胞膜或细胞浆中出现绿色荧光判断为小鼠感染了病毒。
④细胞培养半数感染量(TCID50)的百分率
取每只处死小鼠(每组10只)肺组织匀浆上清100μl，以10倍递次稀释法稀释成不同的稀释度，分别接种经Hank氏液洗3次的组织培养单层VeroE6细胞96孔培养板，每孔细胞接种30μl，每个稀释度接种4个细胞孔，轻微振荡，使匀浆与细胞充分接触，放37℃吸附1min，以Hank氏液洗3次，加入细胞维持液，放37℃CO2培养箱培养，在普通倒置显微镜下观察记录细胞病变情况，连续观察10-14天，分别计算各组VeroE6细胞半数感染量(TCID50)的百分率，然后比较各组TCID50百分率的差异，百分率越大病毒含量越多。从表9-14的结果可知，RNA干扰干细胞具有较低的VeroE6细胞半数感染量，说明具有较好的抗病毒作用。而ACE2干细胞组具有较高的VeroE6细胞半数感染量，说明ACE2能促进病毒感染和繁殖。
表9 RNA干扰干细胞组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量百分率
Figure BSA0000226490440000141
表10 ACE2干细胞组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量百分率
Figure BSA0000226490440000142
表11 干细胞组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
Figure BSA0000226490440000151
表12 阳性对照组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
Figure BSA0000226490440000152
表13 阴性对照组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
Figure BSA0000226490440000153
表14 各组间10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率比较
Figure BSA0000226490440000154
4.3.RNA干扰干细胞产生的ACE2-Ab的抗病毒作用
4.3.1.RNA干扰干细胞产生的ACE2-Ab的检测原理
应用双抗原夹心法测定人血管紧张素转化酶2抗体(ACE2-Ab)。以hACE2包被微孔板，然后加入ACE2-Ab，再加HRP标记的hACE2，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过洗涤、底物TMB显色，转化成蓝色，颜色的深浅和样品中的ACE2-Ab呈正相关，用酶标仪测定450nm吸光度(OD)，通过标准曲线计算ACE2-Ab的浓度。
4.3.2.RNA干扰干细胞产生的ACE2-Ab的检测方法
按说明书制备100U/L、50U/L、25U/L、12.5U/L、6.25U/L的标准品。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔(设3复孔)和对照孔(设3复孔)，在标准孔中准确加各标准品 50μl，在待测样品孔中加样品稀释液40μl、再加待测样品(接种重组干细胞小鼠的肺组织匀浆上清液)10μl，在对照孔中加对照样品(接种干细胞小鼠的肺组织匀浆上清液)轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30分钟。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂 50μl，空白孔除外。再用封板膜封板后重复上述操作，然后每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻混匀，37℃避光显色15分钟。终止反应，以空白调零， 450nm波长测量各孔的OD值。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度。
4.3.3.RNA干扰干细胞产生的ACE2-Ab的检测结果
由表15可知，接种RNA干扰干细胞组和ACE2干细胞组小鼠的肺组织匀浆ACE2-Ab显著高于接种干细胞(不携带ACE2基因)组小鼠的肺组织匀浆ACE2-Ab。说明ACE2基因能表达蛋白，进而刺激小鼠产生ACE2-Ab。
表15 接种重组干细胞组小鼠和接种干细胞组小鼠的ACE2-Ab检测结果比较
Figure BSA0000226490440000161
4.3.4.ACE2-Ab的抗病毒检测
①将ACE2-Ab(兔抗ACE2抗体)和ACE1-Ab(兔抗ACE1抗体)分别配成0.05、0.5、5、50和100ug/ml，然后分别与1×104个Vero E6细胞混合，置37℃水浴1h，洗涤细胞3次。
②分别用2mL DMEM培养液(10％FBS)混悬细胞，移入12孔板，每孔加入20uL 103/mLTCID50病毒液，置37℃、5％CO2培养箱3～5天，每天观察细胞病变效应(CPE)。
③用台盼蓝染色法计数1000个细胞中的活细胞和死细胞数目，计算细胞成活率(成活率＝未染色的细胞数/观察的细胞总数，也可用RT-PCR检测培养液或细胞的病毒RNA含量)。
④结果发现，当试验组的ACE2-Ab浓度分别为0.05、0.5、5、50和100ug/ml时，相应的细胞成活率分别为55％、60％、75％、85％和85％；而当对照组的ACE1-Ab浓度分别为0.05、 0.5、5、50和100ug/ml时，相应的细胞成活率均为10～15％。
说明RNA干扰干细胞携带的ACE2能表达ACE2蛋白，进而刺激机体产生ACE2-Ab，而ACE2-Ab具有抗病毒作用。
4.4.RNA干扰干细胞产生的细胞因子的抗炎症作用
当机体受病毒或细菌感染时，会产生各种细胞因子，有些细胞因子具有抗炎作用，而有些细胞因子具有致炎作用。本实验以细菌内毒素(LPS)分别处理各试验组细胞8小时(表16)，然后按酶联免疫吸附测定(ELISA))试剂盒说明，采用双抗体夹心法测定培养细胞上清液的人白细胞介素，结果发现，干细胞组经LPS处理后，其IL-1β和IL-8均明显增加，而IL-10未见明显增加；重组ACE2干细胞组经LPS处理后，其IL-1β和IL-8均未见明显增减，而IL-10可见明显增加。
文献报道，IL-1β和IL-8均为致炎细胞因子。其中IL-1β广泛参与人体组织破坏、水肿形成等病理损伤过程，虽可促进β防御素-4的生成，但总体上破坏大于防御。而IL-8通过趋化中性粒细胞、激活中性粒细胞溶酶体酶活性和吞噬作用，达到杀菌和损伤细胞的目的，IL-8主要促进细胞毒、局部炎症和肿瘤细胞增殖。
IL-10的作用不同于IL-1β和IL-8。IL-10是一种重要的抗炎因子，主要通过抑制单核、巨噬细胞等产生致炎因子和趋化因子而发挥抗炎作用。表16的结果表明，RNA干扰干细胞能在LPS的作用下，通过增加IL-10的分泌而抑制炎症反应。
表16 RNA干扰干细胞的抗炎症细胞因子检测结果
Figure BSA0000226490440000171
5.RNA干扰干细胞的应用
RNA干扰干细胞可按姓名、ABO血型或HLA分型冻存于-196℃干细胞库备用。当新冠病毒流行时，可取各型RNA干扰干细胞进行培养扩增，然后按自身或同型使用原则选用，进行个体化治疗，以提高干细胞治疗的效果，减少、消除其免疫排斥等副作用。

Claims (7)

1.一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，将新冠病毒的易感基因ACE2插入干细胞DNA中，制备易被新冠病毒感染的易感干细胞，进而将新冠病毒M、N、E和/或S基因的RNA干扰序列shRNA插入所制易感干细胞DNA中，构建既能通过ACE2将新冠病毒吸入干细胞内又能通过shRNA靶向干扰新冠病毒在干细胞内复制的RNA干扰干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，所述干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、肺干细胞或诱导肺干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，所述插入基因包括重组慢病毒载体的构建、重组慢病毒载体和包装质粒共转染293FT细胞进行慢病毒的包装、干细胞的慢病毒转染、RNA干扰干细胞的筛选和鉴定。
4.根据权利要求1、3所述的一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，所述重组慢病毒载体的构建包括将新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰序列shRNA和/或将新冠病毒易感基因ACE2克隆到慢病毒载体的多克隆位点。
5.根据权利要求1所述的一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，所述新冠病毒M、N、E和/或S基因的siRNA序列见“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列”。
6.根据权利要求1所述的一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，扩增所述hACE2基因的上游引物为：CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3；下游引物为：EF1-Rn：5’-GCCAGTACACGACATCACTT-3’；β-actin的上游和下游引物分别为：5’-TGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’、5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’。
7.根据权利要求1所述的一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，按以下步骤制备：
(1)获得间充质干细胞：从干细胞样本库或日常实验后剩余的样本中获得间充质干细胞和/或羊水成纤维细胞，筛选或诱导成肺干细胞。
(2)给干细胞装配新冠病毒易感基因：将血管紧张素转换酶II基因连接慢病毒表达载体pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro或pGC-FU，分别构建重组质粒pHBLV-OE-ACE2或pGC-FU-ACE2，将重组质粒pHBLV-OE-ACE2和包装质粒(psPAX2和pMD2G)或者将重组质粒pGC-FU-ACE2和包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)分别共转染293FT细胞，包装携带ACE2的重组慢病毒OE-ACE2或FU-ACE2，将重组慢病毒转染干细胞，使ACE2基因整合到干细胞DNA。
(3)给干细胞装配新冠病毒RNA干扰基因：优选新冠病毒(nCoV)的靶向干扰序列siRNA，合成shRNA模板，连接到慢病毒载体pHBLV或LV3，构建重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA或LV3-nCoV-N-shRNA，将重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA和包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体)或者将重组质粒LV3-nCoV-N-shRNA和包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5)共转染293FT细胞，包装携带shRNA的慢病毒，将慢病毒转染干细胞，使shRNA基因整合到干细胞DNA上，使干细胞获得能干扰nCoV在胞内复制的新功能。
(4)制成一种人工装配新冠病毒易感基因和新冠病毒RNA干扰基因从而兼具干细胞天然治疗功能、新冠病毒易感特性和RNA干扰功能的干细胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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