CN115554391A - 跨膜蛋白106a在制备抗手足口病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种跨膜蛋白106A在制备抗手足口病药物中的应用。所述跨膜蛋白106A(TMEM106A)具有通过干扰肠病毒吸附至宿主细胞表面而发挥抗EV71和CVA16病毒的活性,具有开发为治疗手足口病的药物的潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明属于医药新用途领域。更具体地,涉及跨膜蛋白106A(TMEM106A)在制备抗手足口病药物中的新用途。
背景技术
手足口病(HFMD)是由肠道病毒引起的急性传染病,主要在5岁以下儿童中发病。HFMD主要临床症状为手、足、口腔等部位斑丘疹、疱疹,重症患者可出现严重的神经系统疾病,甚至死亡。引发HFMD的肠道病毒有20多种(型),其中以柯萨奇病毒A16型(CVA16)和肠道病毒71型(EV71)最为常见,其它不同型的肠道病毒和柯萨奇病毒也可致病。EV71和CAV16具有高度传染性,感染呈全球性分布,特别是在亚太地区,所引起的手足口病已成为一种严重危害社会公众健康的疾病。由于缺乏特异、高效的抗病毒药物,根据手足口病诊疗指南(2018年版),目前主要采取隔离和对症治疗。因此,急需抗EV71和CVA16等肠病毒药物的研制与开发。
肠道病毒是非包膜的RNA正链病毒,是一种二十面体病毒颗粒,由四种结构蛋白VP1、VP2、VP2、VP3、VP4组成病毒衣壳结构。EV71和CVA16病毒主要使用宿主编码的受体清清夫受体B类成员2(SCARB2)或p-选择素糖蛋白配体-1作为受体与宿主细胞结合。与受体结合后,病毒粒子通过内吞作用进入细胞;内吞小体的酸性环境促进了病毒颗粒的脱壳和病毒RNA的释放;正链RNA通过位于其5‘-非翻译区(5’-UTR)的内部核糖体进入位点(IRES)来指导病毒蛋白的翻译;合成的病毒多聚蛋白经病毒编码的蛋白酶2A和3C作用后切割成功能蛋白;病毒外壳与病毒基因组RNA组装成熟的病毒颗粒,经宿主细胞裂解后释放。
宿主细胞通过膜表面模式识别受体特异性结合病毒的模式分子来感知病毒感染,并激活干扰素(IFN)转录表达;IFN蛋白合成分泌后激活细胞的IFN信号通路促使细胞产生抗病毒应答,其中干扰素刺激基因(ISG)的表达上调发挥了关键的抗病毒作用。跨膜蛋白106A(TMEM106A)是一种II型跨膜蛋白,全长262个氨基酸,经鉴定为一种肿瘤抑癌基因;同时在巨噬细胞质膜上组成性表达,具有调节巨噬细胞M1极化和促炎的功能。研究还发现TMEM106A的表达受IFN的调控,细胞经IFN-α2b刺激后,TMEM106A的表达显著上调,是一种ISG。进一步研究发现,TMEM106A具有抗人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)和其他包膜病毒的活性,通过捕获病毒颗粒的释放来发挥抗病毒活性,该活性依赖于质膜和病毒包膜的相互作用。TMEM106A是否具有抑制非包膜病毒如EV-A71或其他肠道病毒的活性,尚未见任何相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种跨膜蛋白106A(TMEM106A)的新用途,即抗肠病毒EV71和柯萨奇病毒CAV16等病毒,从而用于制备治疗手足口病的药物,同时为手足口病药物研发提供可能的作用靶位和新思路。
为达到上述目的,本发明采取的技术方案为:
本发明提供了一种跨膜蛋白106A在制备抗肠病毒感染所致手足口病药物中的应用。
进一步的,所述肠病毒为柯萨奇病毒A16型或肠道病毒71型。
本发明鉴定出跨膜蛋白106A具有抗肠道病毒EV71和CVA16的活性,提示IFN介导的抗EV-A71和CV-A16感染存在新机制;重要的是,TMEM106A具有开发为手足口病治疗药物的潜在应用价值,为手足口病治疗提供了一种新策略和新思路。
附图说明
图1TMEM106A稳定表达细胞株293A-SCARB2-TMEM106A的抗肠病毒活性分析;将EV71-MZ(A)、CVA16-GZ(B)分别感染293A-SCARB2-TMEM106A细胞和表达空白载体的对照细胞(293A-SCARB2-Ctrl),MOI为0.01;感染后24h、36h、48h和60h分别取上清,用TCID50检测不同时间点的病毒产量。数据为三次独立实验的平均值±标准差。
图2通过RNAi技术合并病毒感染考察TMEM106A表达抑制后对IFN-α2b抗EV71复制活性的影响;将106A-shRNA转染293A-SCARB2和Vero细胞,以空白载体pSUPER-GFP(Ctrl)为对照,转染24小时后流式分选GFP阳性细胞,然后用IFN-α2b处理12小时,采用RT-qPCR检测TMEM106AmRNA水平,以GAPDH mRNA水平为内对照,与转染对照质粒的细胞相比,评估其敲除效率(A);上述流式分离的GFP阳性细胞,用IFN-α2b刺激12h后,感染EV-A71(MOI=0.1)感染12小时,采用RT-qPCR方法检测病毒蛋白酶2C mRNA水平,以GAPDH mRNA水平作为内对照。对照细胞和106A-shRNA转染细胞之间的统计学差异采用t检验。
图3TMEM106A对EV71附着和内吞的影响;将对照细胞(293A-SCRB2-Ctrl)和TMEM106A表达细胞(293A-SCRB2-TMEM106A)与EV71(MOI=100)在4℃孵育1小时,使用抗EV-A71VP2的一抗和Alexa-Fluor555偶联的二抗检测EV71病毒颗粒,用DAPI染色显示细胞核,考察TMEM106A对EV71吸附宿主细胞的影响(左);将上述细胞和病毒在4℃孵育1小时后置于37℃孵育1小时,进行同样的荧光免疫分析,考察TMEM106A对细胞内吞EV71的影响(右)。
图4通过EV71-GFP RNA转染分析TMEM106A对病毒蛋白翻译的影响。将体外转录的病毒EV71-GFP RNA转染293A-SCRB2-TMEM106A细胞,以293A-SCRB2细胞为对照,转染后9h、12h、18h、24h用荧光显微镜观察GFP的表达情况(A),每种细胞计数100个视野,计算平均每个视野中的GFP阳性(GFP+)细胞数(B)。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明,下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解,下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的,不应以此限制本发明的保护范围。
细胞及病毒株
293A-SCARB2细胞稳定组成型表达EV71的天然受体SCARB2;非洲绿猴肾Vero细胞对EV71高度敏感,广泛用来分离、扩增EV71和CVA16。EV71-GFP为携带报告基因EGFP的、从北京地区分离的毒株;EV71-MZ是从广东地区重症手足口病患儿分离得到的高致病性肠病毒EV71毒株;CVA16-GZ是从广东地区重症手足口病患儿分离得到的高致病性柯萨奇病毒A16毒株。
EV71和CVA16病毒的制备和感染:
将pcDNA3.1-T7-RNAP和pWSK-T7-T7-EV71-GFP质粒以10:1的比例共转染293T细胞,收集上清感染RD细胞,制备携带EGFP报告基因的EV71-GFP病毒。将临床分离的EV71-MZ和CVA16-GZ病毒分别感染RD细胞,扩增繁殖。病毒感染按如下进行:细胞与CVA16-GZ、EV71-MZ或EV71-GFP在37℃的CO2培养箱孵育1小时后去除未结合的病毒,更换新鲜培养基。采用空斑法测定病毒滴度。
实施例1、TMEM106A抗手足口病肠病毒的活性分析
将EV71-MZ和CVA16-GZ分别感染TEME106A稳定表达细胞株和对照细胞,感染后不同时间分别收集细胞上清,通过空斑分析测定子代病毒的产生情况,评价TMEM106A对病毒EV71和CAV16的复制是否具有抑制作用、对宿主细胞是否具有保护作用。
1.1TMEM106A表达载体的构建:质粒pLPCX-TMEM106A是一种表达TMEM106A的慢病毒载体。
以5'-CACGGATCCGCCACCATGGGTAAGACGTT-3’(上游引物)和5’-CACTCTAGTGGTGGGTGAGGGGTCAG-3’(下游引物),通过PCR从pLPCX-TMEM106A中扩增出TMEM106基因,经BamHI和XbaI双酶切后克隆到pcDNA4/To/Myc-His B载体生成pcDNA4-TMEM106A。
1.2TMEM106A稳定细胞株的构建:为获得组成性表达TMEM106A的细胞株,将pcDNA4-TMEM106A转染293A-SCARB2细胞,并用Zeocin(200μg/ml)进行选择,所获得的抗性菌落分别扩增并通过蛋白印迹法验证;选择一个阳性克隆,命名为293A-SCARB2-TMEM106A。此过程应用于空载体,得到对照细胞293A-SCARB2-Ctrl。将293A-SCARB2细胞以10个细胞的密度接种到6厘米的培养皿中6cells/well.16-18h后,当细胞单层融合率约为70%时,使用脂质体2000用pcDNA4-TMEM106A-His转染细胞。转染48h后,将细胞转移到10厘米培养皿中,加入zeocin(终浓度200μg/ml),选择稳定表达细胞株。
1.3TMEM106A过表达细胞株对EV-71和CVA16病毒复制的抑制作用:为了进一步研究TMEM106A对病毒感染的抑制机制,将293A-SCARBA-TMEM106A细胞分别感染肠道病毒EV71和CVA16,以293A-SCARB2-Ctrl作为对照。在感染后的不同时间点收集含病毒的培养上清液,并测定其滴度。结果表明,在TMEM106A表达细胞株中,EV71滴度显著降低(图1A),CV-A16的复制也显著减少(图1B)。因此,TMEM106A具有同时抑制EV71和CVA16感染的活性。
1.4靶向TMEM106A基因的shRNA的设计和RNAi敲低效率的检测:pSUPER RNAi系统用于TMEM106A shRNA的表达;采用Sigma网站(https://www.sigmaaldrich.com/catalog/genes)推荐的TMEM106A转录本进行shRNA序列设计,命名为106A-shRNA;为构建表达106A-shRNA的质粒;分别合成互补寡核苷酸:
5′-GATCCCCAAGTCAATCCTGTCCTCCATTCAAGAGATGGAGGACAGGATTGACTTTTTTA-3′(正义链)和
5′-AGCTTAAAAAAAGTCAATCCTGTCCTCCATCTCTTGAATGGAGGACAGGATTGACTTGGG-3′(反义链);
5’端为BglII和HindIII酶切位点,退火后克隆至pSUPER-GFP,命名为pSUPER-GFP-106A-shRNA。将pSUPER-GFP-106A-shRNA和对照质粒pSUPER-GFP分别转染293A-SCARB2、Vero细胞,培养24h后用流式细胞仪对表达GFP的细胞进行分选,然后用IFN-α2b(1000IU/毫升)处理12h后收集细胞提取RNA,通过RT-qPCR检测TMEM106A mRNA水平,以GAPDH mRNA水平为内对照,表达106A-shRNA的细胞中TMEM106A mRNA水平对对照细胞进行归一化处理,检测TMEM106A的RNAi敲低效率。无论293A细胞还是Vero细胞,TMEM106A mRNA水平降低约50%(图2A),说明所设计的106A-shRNA可有效敲低内源性TMEM106A的表达。
1.5内源性TMEM106A表达沉默对IFN抑制EV71复制的影响:IFN-ɑ2b存在的情况下以剂量依赖的方式限制了EV71对Vero和293A-SCARB2的感染。为检测TMEM106A在其中是否发挥了作用,将106A-shRNA转染至293A-SCARB2和Vero细胞并进行流式分选,收集的细胞用IFN-ɑ2b处理12h后感染EV71病毒,24h后收集细胞、提取RNA,通过RT-qPCR检测EV71 2CmRNA水平,以细胞GAPDH mRNA水平为内对照,结果显示,无论293A-SCARB2还是Vero细胞,TMEM106A表达敲低后,病毒EV71 2C RNA的水平增加了一倍(图2B),说明TMEM106A是干扰素发挥最佳抗病毒活性所必需的。
针对TMEM106A的荧光定量PCR引物对为5'-GAGAAGCAGTGGGCT-3’和5’-ATCAAGCCACTGGG-3’;针对EV71的引物对为5’-TGTATGTCTCATTATCAGGGG-3’和5’-CCACCTGTTGCTTGTAACCGT-3’,扩增子为EV71 2C片段;以细胞的GAPDH为内参进行校正,引物对为5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’,5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。
综上所述,跨膜蛋白TMEM106A具有显著的抗病毒EV71和CVA16活性;在干扰素介导的抗肠病毒活性中,TMEM106A作为一种干扰素刺激基因产物发挥了重要的抗EV71活性,内源性TMEM106A经RNAi沉默后,IFN-α2b的抗病毒活性明显减弱。
实施例2、TMEM106A抗肠病毒EV71的作用机制分析
EV71的复制周期包括:EV71识别细胞表面的病毒特异受体,结合并吸附在细胞表面;随后内吞进入胞内,病毒RNA完成脱衣壳进入宿主细胞内;EV71直接以基因组RNA为模板翻译出多聚蛋白,同时作为模板扩增、完成自身基因组的复制;子代病毒RNA被组装到病毒衣壳蛋白形成具有感染能力的病毒颗粒;最后宿主细胞裂解释放大量子代病毒,开始新一轮的感染。为进一步探讨TMEM106A抗肠病毒的活性机制,我们通过将EV71颗粒与细胞体外孵育观察TMEM106A蛋白对病毒吸附和内吞的影响;体外转录获取大量EV71-GFP RNA,通过EV71-GFP RNA转染、观察绿色荧光细胞的百分比,考察TMEM106A蛋白对EV71胞内基因组复制和病毒蛋白合成的影响。
2.1检测TMEM106A对EV71病毒颗粒吸附和内吞的影响:V-A71与细胞表面受体结合,然后通过内吞作用进入细胞。体外实验中,病毒EV71的内吞作用可通过降低培养温度来阻断,而病毒受体结合仍然有效。为检测TMEM106A是否阻断了受体介导的病毒结合和进入,将293A-SCARB2-TMEM106A细胞和对照细胞293A-SCARB2-Ctrl分别与EV71在4℃孵育允许病毒吸附,然后在37℃孵育允许病毒进入;分别用DAPI和抗EV71衣壳蛋白VP2的荧光抗体进行荧光染色分析。结果显示,在TMEM106A的存在下,EV71与宿主细胞的结合显著减少,进入量也大大减少(图3)。说明TMEM106A在病毒复制的早期阶段(包括吸附、进入及脱衣壳)发挥了抗病毒活性。TMEM106A可阻断病毒与靶细胞的结合。
2.2检测TMEM106A对病毒RNA合成和病毒蛋白翻译的影响:为了进一步研究TMEM106A是否影响病毒生命周期的其他步骤,以pWSK-EV71-GFP为模板,体外转录EV-A71-GFP RNA并转染细胞,观察GFP阳性细胞的比率,考察TMEM106A对EV71胞内复制的影响。TMEM106A的表达在EV71-GFPRNA转染后9或12h不影响病毒的GFP信号,在转染后18h GFP的表达略有降低、24h GFP的表达显著降低(图4A)。18h时的轻微抑制是由于TMEM106A阻断了EV-A71RNA转染后发生的EV-A71病毒粒子感染的新周期。观察上述四个时间点的荧光表达情况,随机计数100个视野并计算每个视野的平均GFP+细胞数,可以看出TMEM106A在转染24h时明显抑制了GFP的表达(图4B),说明TMEM106A能阻断EV71病毒的多聚蛋白合成或加工。此结果表明TMEM106A阻断EV71的复制很可能发生在RNA复制或蛋白翻译阶段。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定,对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无法对所有的实施方式予以穷举,凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (2)
1.跨膜蛋白106A在制备抗肠病毒感染所致手足口病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述肠病毒为柯萨奇病毒A16型或肠道病毒71型。
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