CN103372200B - 西塔素在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于西药领域，公开了西塔素在制备抗病毒药物中的应用。西塔素及其衍生物可在制备抗病毒药物中的应用，优选应用于制备抗HIV和、或流感病毒的药物。西塔素抗病毒的机制与病毒进入细胞直接相关。从西塔素的时间动力学的表现分析，西塔素最可能的机制是改变细胞膜病毒受体的流动。当西塔素在病毒感染前投入细胞培养碟时，西塔素附在细胞膜上，限制细胞膜上病毒使细胞表面受体不容易与病毒的感染蛋白接触；或与细胞的表面受体反应，使受体不易与其他蛋白接触。
Description
技术领域
本发明属于西药领域，涉及西塔素在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术
流行性感冒病毒，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒（流感）的病原体。其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。例如1918～1919年的大流行中，全世界至少有2000万～4000万人死于流感；乙型流感病毒对人类致病性较低；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。三种流感病毒在传染过程中却体现出相同的传染机制。
流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。包膜是包裹在基质蛋白之外的一层磷脂双分子层膜，这层膜来源于宿主的细胞膜，成熟的流感病毒从宿主细胞出芽，将宿主的细胞膜包裹在自己身上之后脱离细胞，去感染下一个目标。包膜中除了磷脂分子之外，还有两种非常重要的糖蛋白：血凝素和神经氨酸酶。这两类蛋白突出病毒体外，长度约为10至40纳米，被称作刺突。一般一个流感病毒表面会分布有500个血凝素刺突和100个神经氨酸酶刺突。在甲型流感病毒中血凝素和神经氨酸酶的抗原性会发生变化，这是区分病毒毒株亚型的依据。
虽然流感病毒作为病因已经被发现了80年，但始终没有建立有效的治疗方法。目前的抗流感病毒药品主要针对病毒的神经氨酸酶，如奥塞米韦和扎那米韦，但却面临着耐药突变这个主要问题。科研工作者在流感疫苗的研制方面也进行了大量的研究，以期能获得有效抵抗流感病毒的疫苗，但甲型流感病毒的高变异性增大了人们应对流行性感冒的难度，人们无法准确预测即将流行的病毒亚型，便不能有针对性地进行预防性疫苗接种。另一方面，每隔十数年便会发生地抗原转变更会产生根本就没有疫苗的流感新毒株。当接种的疫苗与流行度助雅兴不配时，将会导致免疫失败。
人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV），是一种引起获得性免疫缺陷综合征和相关疾病的RNA病毒。病毒主要侵犯CD4T细胞、CD4单核细胞和B淋巴细胞。1981年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒（Lentivirus），属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统的失去抵抗力，而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病（获得性免疫缺陷综合征）。
人类免疫缺陷病毒直径约120纳米，大致呈球形。病毒外膜是类脂包膜，来自宿主细胞，并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41；gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并与gp41通过非共价作用结合。向内是由蛋白p17形成的球形基质（Matrix），以及蛋白p24形成的半锥形衣壳（Capsid），衣壳在电镜下呈高电子密度。衣壳内含有病毒的RNA基因组、酶（逆转录酶、整合酶、蛋白酶）以及其他来自宿主细胞的成分（如tRNAlys3，作为逆转录的引物）。
现阶段主要治疗手段是抗逆病毒疗法（ART），此疗法同时采用抗逆转录酶和抗蛋白酶的药品抑制病毒逆转录和随后的病毒蛋白切割加工（国内称鸡尾酒疗法）。虽然效果明显，但经多年使用，其缺点也逐渐暴露。一是病人逐渐显现抗药，二是副作用较大，包括恶心，头痛，疲劳，虚弱，不正常脂肪大量积累，心脏病。因此，发展新疗法是势在必行。近年来，科研人员付出了大量的努力以发展HIV疫苗，制备抗HIV的干细胞，用干扰性RNA（RNAi）来降解HIV的RNA,但并未获得突破性的实效。
西塔素是一种存于灵长动物中的天然类肽链抗生素。西塔素虽然已经被报道过，但其功能被定位于抗细菌感染。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供西塔素在制备抗病毒药物中的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
西塔素及其衍生物在制备抗病毒药物中的应用。
其中，所述的的西塔素为θ-Defensin 2[7]，含有18个氨基酸残基，分子结构见图1，制备方法见参考文献[1]。
所述的病毒优选流感病毒。
所述的病毒还可以优选HIV病毒。
有益效果：
带病毒包膜的病毒感染细胞的机制见图8：1.通过病毒包膜蛋白与其在细胞表面的受体结合，病毒附着在细胞表面；2.病毒与细胞膜融合，病毒内核加入细胞；3.病毒基因组脱离内核，进入病毒蛋白合成和病毒基因组的复制。西塔素抗病毒的机制与病毒进入细胞直接相关。从西塔素的时间动力学的表现分析，西塔素最可能的机制是改变细胞膜病毒受体的流动。当西塔素在病毒感染前投入细胞培养碟时，西塔素附在细胞膜上，限制细胞膜上病毒使细胞表面受体不容易与病毒的感染蛋白接触；或与细胞的表面受体反应，使受体不易与其他蛋白接触。西塔素对HIV病毒具有广发的抑制作用，不局限于个别的亚型或特定的区域，能够用于制备抗HIV病毒药物，在艾滋病的预防和治疗中发挥重要作用。西塔素对流感病毒也具有显著的抑制作用，可用于制备抗流感病毒药物，为治疗流感提供新的备选药物。
根据西塔素的作用机制，我们判断西塔素有可能对其他病毒，特别是类似艾滋病毒和流感的，带有来源于细胞膜的病毒包膜（Envelope），的病毒有抑制作用。其中，乙肝病毒，丙肝病毒，疱疹病毒与人类的健康有直接的关系。这些带病毒包膜的病毒，感染细胞的机制都类似于HIV感染（图8）。如果西塔素能对这些病毒有显著的抑制作用，使用西塔素于治疗对于我国人民的健康是有重要意义的。
附图说明
图1.西塔素的分子结构。
图2.增强型绿荧光蛋白（EGFP）被插入HIV的基因组。图中显示的是NL4-3（X4型）[13]艾滋病毒。我们用同样的方法产生了有荧光基因的R5型病毒，94UG-114(14)和JRCSF(16)。NL43和JRCSF是最广泛用于实验室的艾滋病毒株。
图3加入EGFP基因对HIV病毒感染的影响。CEM-CCR5CD4+,CCR5+淋巴细胞被同等滴度的艾滋病毒感染后，产生的病毒用HIV的p24蛋白量来定量。两天时毒株NL4-3与带有EGFP的病毒产生的病毒量相等。4天时，NL4-3产生的病毒比带EGFP的病毒略有优势（图a）。JRCSF感染的情况也类似（图b）。
图4西塔素和T20肽对NL4-3艾滋病毒感染HeLa-CD4细胞抗病毒感染效果。
A.T20肽对NL4-3艾滋病毒感染HeLa-CD4细胞抗病毒感染效果。
B.西塔素对NL4-3艾滋病毒感染HeLa-CD4细胞抗病毒感染效果。
C.不加任何药物的情况下，NL4-3艾滋病毒对HeLa-CD4细胞的感染。
D.在没有病毒的情况下，EGFP阳性细胞的背景（理论上是0，但往往有少量的假阳性细胞）。
图5.西塔素与T20的对抑制HIV感染淋巴细胞的效果比较。
被感染的细胞为CEM-CCR5淋巴细胞。相对感染率以病毒感染不加西塔素和T20的细胞为对照。不加任何肽的病毒感染的细胞培养设为相对感染率为100％。根据方差回归线推算，西塔素对JRCSF艾滋病毒，效果是T20的10倍以上。
图6.西塔素对94UG-114，D地域型R5病毒的作用。
A.T20肽对R5艾滋病毒感染CEM-CCR5淋巴细胞抗病毒感染效果。
B.西塔素对R5艾滋病毒感染CEM-CCR5淋巴细胞抗病毒感染效果。
C.不加任何药物的情况下，NL4-3艾滋病毒对CEM-CCR5淋巴细胞的感染。
D.在没有病毒的情况下，EGFP阳性细胞的背景（理论上是0，但往往有少量的假阳性细胞）。
图7西塔素抑制病毒感染与时间的关系
西塔素在不同时间，从感染前的3小时(-3h)到感染后的24小时(24h)加入NL4-3艾滋病毒感染HeLa-CD4细胞。当西塔素在加入病毒到HeLa-CD4细胞后2小时（2h）后再加入培养的细胞时，西塔素抗病毒效果显著下降。被感染的细胞群落是指在24孔的细胞培养皿(cell culture plates)中平均每孔细胞中的绿色荧光细胞群落数。Cont.是不加西塔素的感染对照。
图8.带病毒包膜的病毒感染细胞的机制。1.通过病毒包膜蛋白与其在细胞表面的受体结合，病毒附着在细胞表面。2.病毒与细胞膜融合，病毒内核加入细胞。3.病毒基因组脱离内核，进入病毒蛋白合成和病毒基因组的复制。
图9.西塔素对流感病毒感染人的HOT细胞的抑制。104的HOT细胞被均匀地撒入24孔碟的培育碟中的每一孔。西塔素或对照的18环肽(GRCICRCGRGRCICRCGR)或磷酸缓冲盐水（PBS）的对照在两小时后加入。随后在10分钟后加入30个病毒感染单位。四天后观测细胞的病态程度并照相。
图10.在不同的病毒感染剂量下，西塔素的抗病毒效果。当细胞被300个病毒感染单位感染时，西塔素失去保护作用。但在50个单位时，西塔素保持保护作用。
具体实施方式
本发明实施例中所涉及的实验方法如下：
1.细胞和细胞培养
HeLa-CD4,CEM.NKR-CCR5淋巴T细胞来源于美国国家健康研究院艾滋病研究材料计划 （NIH AIDS Research and Reference Reagent Program，http://www.aidsreagent.org/）。HOT细胞来源于美国Pang的实验室[2]。细胞培养和维持在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液（购于美国Invitrogen公司）。
2.病毒的制备和定量
HIV克隆的制备用钙沉降293T细胞的方法。试剂购于美国Promega公司的Profection试剂盒（www.promega.com）。具体详情见参考文献[2-4]。病毒量的滴定用测定HIV病毒的p24蛋白确定。H1N1甲型流感病毒也用用钙沉降293T细胞的制备方法见参考文献[5]。病毒的定量采用稀释滴定法。当病毒稀释到一定程度，病毒感染HOT细胞的可能性降低到50%时的病毒单位为1个细胞培养感染剂量50（Tissue Culture Infectivity Dose 50,TCID50）。
3.病毒感染培养的细胞
HIV感染各种细胞的方法见参考文献[2,4,6]。甲型流感病毒感染HOT细胞是把细胞16小时前放入24孔细胞培养碟。每孔细胞104.每孔含培养液0.5毫升。感染时，每孔加入1到1000个TCID50的病毒。感染16小时后洗脱病毒并加入新的培养液。对与含西塔素的细胞，新加入的培养液含同样浓度的西塔素。
4.对HIV感染的细胞的测定
把增强型绿荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)整合入艾滋病毒的RNA基因组中（图2）。细胞备艾滋病毒感染后，在荧光显微镜下，发出绿色荧光（图2）。没有被感染的细胞，则不会发出绿荧光。我们通过用流式细胞仪（Flow Cytometry）检测发出绿荧光的细胞来确定被HIV感染的细胞。细胞被感染的程度，可以通过计算被感染细胞的比例来确定。
实施例1用带绿荧光蛋白的病毒来评估西塔素的抗病毒效果
CEM-CCR5CD4+,CCR5+淋巴细胞被同等滴度的艾滋病毒感染后，产生的病毒用HIV的p24蛋白量来定量。两天时NL4-3与带有EGFP的病毒产生的病毒量相等，说明加入EGFP基因的艾滋病毒在细胞培养的条件下感染和增殖率接近于野生型的母本病毒。4天时，NL4-3产生的病毒比带EGFP的病毒略有优势（图3a）。JRCSF感染的情况也类似（图3b）。因此用EGFP基因改造过的艾滋病毒是适合于做西塔素抗病毒力的评估研究的。
实施例2西塔素对艾滋病毒感染的抑制
我们首先用实验室最常用的组合，NL4-3艾滋病毒感染HeLa-CD4细胞来测定西塔素的抗艾滋病毒的效果。为了明确西塔素作为短肽药品的治疗潜力，我们把已投入市场的治疗艾滋病的短肽T20（商品名Fuzeon，Roche出品）作为对照，考察西塔素对艾滋病毒感染的抑制作用。
不同量的西塔素或T20肽在感染前1小时放入HeLa-CD4细胞培养皿。HeLa-CD4细胞被以平均每个细胞1个病毒的NL4-3艾滋病毒感染3小时。随后残余病毒被洗脱。3天后，细胞被收集并放入流数细胞仪计算被感染的细胞的比例，结果见图4。图4表明T20对于NL4-3艾滋病毒感染HeLa-CD4细胞的抑制效果并不显著。而西塔素则能很有效地抑制感染。
我们用类似的方法测定西塔素对来自欧美的（B地域型）艾滋病毒JRCSF以及来自非洲乌干达（D地域型）R5艾滋病毒94UG-114感染其他细胞的抗病毒效果。
被感染的细胞为CEM-CCR5淋巴细胞。相对感染率以病毒感染不加西塔素和T20的细胞为对照。根据方差回归线推算，西塔素对JRCSF艾滋病毒，效果是T20的10倍以上。对NL4-3艾滋病毒，其效果比T20至少高50倍（图5）。
携带EGFP基因的94UG-114病毒以每毫升1微克的浓度被用于感染CEM-CCR5淋巴细胞，结果见图6，图6显示西塔素对94UG-114病毒有同样明显的抑制作用。当西塔素以每毫升1微克的浓度加入细胞中，99%的感染被抑制。
以上实验结果均显示西塔素对全部测试病毒，都有极显著的效果。
实施例3西塔素作用的时间效应
根据西塔素的结构推测，其抗病毒机理有3种可能：1）与病毒表面的感染蛋白结合，导致病毒表面的感染蛋白结构改变。变构的蛋白不再能有效地与其对应的细胞表面的受体结合。其结果是病毒无法稳定的附着细胞，也就无法谈起完成附着后的病毒与细胞膜的融合和进入细胞。2）西塔素附着在细胞膜上，使细胞膜蛋白的流动性改变，使细胞表面受体不容易与病毒的感染蛋白接触；获与细胞的表面受体反应，使受体不易与其他蛋白接触。3）西塔素可进入细胞，抑制病毒RNA或DNA的复制，或病毒蛋白的合成。我们通过用西塔素干涉感染过程的实验来研究西塔素抗病毒机理。
我们选择在不同的时间，从感染前3小时到感染后24小时的时间点把西塔素加入细胞培养。结果显示西塔素在感染前或感染后1小时内加入培养皿，病毒感染都能得到抑制。在感染后超过2小时才加入则基本没多少抑制（图7）。以上结果提示西塔素抗病毒的机制与病毒进入细胞直接相关。从西塔素的时间动力学的表现分析，西塔素最可能的机制是改变细胞膜病 毒受体的流动。当西塔素在病毒感染前投入细胞培养碟时，西塔素附在细胞膜上，限制细胞膜上病毒受体的相对聚集。以HIV-NL4-3为例，病毒的感染蛋白复合体含3个gp120与3个gp41。复合体需同时结合多个CD4受体和CXCR4辅助受体才有可能实现附着细胞。西塔素抑制CD4和X4受体聚集，病毒是无法附着细胞的。如果西塔素在感染后一小时内加入，病毒可能完成了病毒附着细胞的这步，但大部分仅仅是初步附着，还没有结合够足够量的CD4和X4受体而形成稳固的附着，也无法启动病毒与细胞膜融合这一步。大部分病毒会很快从细胞表面脱落，所以西塔素仍然可以抑制病毒感染。当西塔素在感染2小时后加入细胞培养，有很大部分的病毒已经完成进入细胞的这一步，西塔素的抑制作用因此明显下降。
实施例4西塔素的抗流感病毒的功能
我们对西塔素抗流感病毒做定量的抗病毒研究。与HIV相比，流感病毒基因组含有8个大小不等的片段，载有11个蛋白的编码。因为每个片段编码的蛋白都是不可缺少的，而片段本身的长短也不允许插入象绿荧光蛋白这么大的基因，我们无法用类似研究艾滋病毒的绿荧光蛋白显示法那样灵敏和精确的方法定量西塔素对抗流感病毒的抑制。但我们可以用流感病毒会造成细胞病态这一现象来研究西塔素对流感病毒的抑制作用。
通过对超过20种细胞株的筛选，发现美国Pang的实验室的HOT细胞株能很敏感地被H1N1甲型流感感染。104的HOT细胞被均匀地撒入24孔碟的培育碟中的每一孔，西塔素或对照的18环肽(GRCICRCGRGRCICRCGR，SEQ ID NO.1)或磷酸缓冲盐水（PBS）的对照在两小时后加入。随后在10分钟后加入30个病毒感染单位的H1N1甲型流感（A/WSN/1933病毒克隆，来源于1933年英国）。四天后观测细胞的病态程度并照相，结果见图9。图9显示：加入磷酸缓冲盐水（PBS）为对照的细胞在流感病毒感染后的第4天，会显示极明显的细胞病态。加入18环肽(SEQ ID NO.1)为对照的细胞，病毒感染得到一定程度的抑制，而加入西塔素的细胞，感染会被几乎完全抑制。
在不同的病毒感染剂量下，考察西塔素的抗病毒效果，结果见图10。由图10可见，当细胞被300个病毒感染单位感染时，西塔素失去保护作用。但在50个单位时，西塔素保持保护作用。而所对比的不加西塔素的细胞培养，10个病毒感染单位在同等时间就显示细胞病态。图中展示的是感染后的第4天的细胞状况。因为光在24孔碟的不均匀性，每个小图的光强略有差异。由此估计西塔素可使病毒感染度降低到原先的1/30，考虑到流感病毒是通过空气中游动的微液粒感染的，每个微液粒含有的病毒数并不高，如果能把病毒的感染力降低到原先的 1/30，大多数人是可以避免被感染的。
本发明中使用的个生物材料来源如下：
含HIV基因组的三种HIV亚种，NL4-3，JRCSF和94UG114的质粒（Plasmids)获自美国国家健康研究院艾滋病研究材料计划（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program http://www.aidsreagent.org/）。NL4-3属于艾滋病毒的X4亚型，JRCSF和94UG114属于艾滋病毒的R5亚型。NL4-3是实验室重组的艾滋病毒，其父本病毒来源于欧洲和北美。JRCSF和94UG114是来自病人的艾滋病毒。JRCSF源于一美国病人，而94UG114源于一非洲乌干达病人。
含H1N1甲型流感病毒的8个基因组片段的8个质粒,是来自美国威斯康星大学的Kawaoka教授[5]。但成品病毒也可从美国American Type Culture Collection（ATCC）公司购买，产品目录号VR-825。
[参考文献]
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1.西塔素在制备抗H1N1流感病毒药物中的应用。
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