CN105497918B - 发动蛋白1在防治肠道病毒71型感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。本发明以人神经母细胞瘤(SH‑SY5Y)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人神经母细胞瘤(SH‑SY5Y)细胞的宿主因子，从而保护中枢神经系统的功能。本发明通过实验发现发动蛋白1(dynamin1,DNM1)分子在EV71感染SH‑SY5Y中发挥着重要的作用，下调DNM1的表达，能明显抑制EV71的感染。本发明提供了DNM1在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。

Description

发动蛋白1在防治肠道病毒71型感染中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。

背景技术

肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属人肠道A类病毒，是导致手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病原体之一。目前，手足口病在世界多个地区暴发并流行，尤其是亚太地区。在我国，自2008年几大省市暴发手足口病疫情以来，该病的感染人数和死亡率一直居高不下，每年报告发病数超过100万例，死亡数近1000例。手足口病主要发病人群为5岁以下婴幼儿，临床表现为发热，手、足、臀部以及口腔粘膜等部位出现疱疹等症状；少数患儿可发展为重症患者，出现中枢神经系统(central nervous system，CNS)病变，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脑脊髓炎以及神经源性肺水肿等，严重威胁着婴幼儿的生命健康[Solomon T,Lewthwaite P,Perera D,CardosaMJ,McMinn P,Ooi MH.Virology,epidemiology,pathogenesis,and control ofenterovirus 71.Lancet Infect Dis.2010Nov；10(11):778-90.]。手足口病特别是重症病例多由肠道病毒71型(EV71)感染所致。然而，目前关于EV71引起手足口病的治疗尚无特异高效的抗病毒药物，临床上仍以对症治疗为主，在预防方面也无有效疫苗问世。

EV71感染具有嗜神经性，易造成严重的CNS疾病及其并发症，这也是导致手足口病患者发展为重症甚至死亡的主要原因。其中，脑干是最易被EV71感染的部位[Tee,K.K.,etal.Evolutionary genetics of human enterovirus 71:origin,population dynamics,natural selection,and seasonal periodicity of the VP1gene.J Virol,2010.84(7):p.3339-50.]，研究证实在EV71重症患者的脑干神经元等部位均能够检测到EV71基因及抗原的存在，证明EV71能进入CNS。EV71经血液播散破坏血脑屏障或经周围神经途径逆向轴突输送感染CNS。但EV71引起的中枢神经系统症状的机制尚不明确[Solomon T,LewthwaiteP,Perera D,Cardosa MJ,Mcminn P,Ooi MH.Virology,epidemiology,pathogenesis,andcontrol of enterovirus 71.Lancet Infect Dis.2010；10:778-90.]。神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)为神经组织来源，具有一定的神经细胞特性。因此，探明EV71感染SH-SY5Y的机制并以此寻找新的抗病毒靶点，对于防治EV71所导致的中枢神经系统感染至关重要。

为了有效地感染细胞，病毒必须利用宿主细胞的膜分子及其囊泡运输系统完成对宿主细胞的入侵，才能在细胞内进行复制并释放出有感染性的子代病毒颗粒。因此，作为病毒感染宿主细胞的首要环节，细胞入侵已成为抗病毒药物筛选的重要靶标。研究表明，EV71可利用不同的宿主因子和感染途径来入侵不同种类的靶细胞，比如EV71感染Jurkat T淋巴细胞系主要利用小窝依赖的内吞途径(caveolar-dependent endocytosis)[Lin HY,YangYT,Yu SL,et al.Caveolar endocytosis is required for human PSGL-1-mediatedenterovirus 71infection.J Virol.2013,87(16):9064-76.]。目前，关于EV71感染SH-SY5Y的途径及机制仍不清楚。

病毒侵入靶细胞主要借助了参与宿主细胞自身物质运输的关键分子，这些宿主细胞膜转运分子在细胞的跨膜物质运输，囊泡的形成、内吞以及分泌中发挥着重要的作用。如金属蛋白酶调节了细胞粘附，细胞膜分子的降解；小窝蛋白家族分子caveolin-1(CAV1)、caveolin-2(CAV2)、caveolin-3(CAV3)将物质运输至高尔基体；Flotillin分子能够与脂筏内蛋白分子相互作用并内吞入细胞内；发动蛋白1(DNM1)通过影响囊泡的重新利用在细胞的内吞和突触囊泡循环中发挥重要作用；GTP酶激活蛋白分子GRAF1在网格蛋白非依赖型的囊泡运输中具有重要的调节作用；白细胞介素2受体内吞调节了信号通路并影响了细胞增殖(Jason Mercer,Mario Schelhaas,et al.Virus Entry by Endocytosis.Annu RevBiochem.2010；79:803-833.)。Ezrin蛋白可通过酪氨酸激酶信号调节细胞微管系统，继而调节了细胞黏附与迁徙等生理过程；Ezrin蛋白也被证实参与了丙型肝炎病毒感染肝细胞的过程(Bukong TN,Kodys K,Szabo G.Human ezrin-moesin-radixin proteins modulatehepatitis C virus infection.Hepatology.2013,58(5):1569-79.)。外被蛋白复合体COPA(coatomer protein complex)参与了小泡介导非选择性运输,它参与从内质网到顺面高尔基体的运输。在这些分子中，caveolin-1被证实参与了EV71感染Jurkat T淋巴细胞的过程，而其它分子在EV71感染中的作用还未有报道。

胞吞(Endocytosis)是细胞生理代谢的一个极为重要的过程，也是细胞从环境中获取物质和回收膜组分的过程。发动蛋白(dynamin)家族是一类鸟苷酸三磷酸酶，是细胞在进行内吞过程中特异的一种蛋白，它参与囊泡从细胞膜上出芽和剪切的过程。其中发动蛋白1(DNM1)特异性地分布在神经细胞中。现已证实DNM 1通过水解GTP提供能量，使网格蛋白包被的囊泡凹窝与突触前膜分离，最终回收至突触前膜重新利用从而在细胞内吞和突触囊泡循环中发挥重要作用(Newton AJ,Kirchhausen T,Murthy VN.Inhibition of dynamincompletely blocks compensatory synaptic vesicle endocytosis.PNAS,2006,103(47):17955～17960)。现已证实DNM1在阿尔默茨海默症的发生发展中发挥作用(Brent LK,Robert V,Adriana F,et al.P-amyloid-induced dynamin 1depletion in hippocampalneurons.A potential mechanism for early cognitive decline in Alzheimerdisease[J].J Biol Chem.2005.280(36):31746-31753.)。也有文献报DNM1可能通过磷酸化/去磷酸化方式参与侧颞叶癫癎的发生发展(Clayton EL，Anggono V，Smillie KJ，ChauN，Robinson PJ，Cousin MA.The phospho-dependent dynamin-syndapin interactiontriggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles[J].JNeurosci，2009，29(24):7706-7717.)。

目前还没有任何关于DNM1分子在EV71感染人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)中作用的研究报道，对于DNM1分子进行深入研究不仅能够提升对EV71感染与致病机制的认识，也可以为预防与治疗EV71感染提供新的思路与靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗肠道病毒71型感染的新靶点。

本发明的另一目的在于提供发动蛋白1(DNM1)分子的新用途，特别是在抗肠道病毒71型感染中的应用。

本发明的第三目的在于提供干扰DNM1分子表达的siRNA。

本发明的主要技术方案是：

本发明，以人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)的宿主因子，从而预防神经系统感染与破坏。本实验选择了一组宿主细胞跨膜转运分子来进行筛选，这些分子在宿主细胞的跨膜物质运输，囊泡的内吞与分泌中发挥着重要作用，它们往往也是在病毒感染过程中易被病毒“劫持”并利用的分子。这些分子包括：金属蛋白酶10(ADAM10)、发动蛋白1(DNM1)、caveolin-1(CAV1)、caveolin-2(CAV2)、caveolin-3(CAV3)、Flotillin蛋白1(FLOT1)、GTP酶激活蛋白(GRAF1)、白细胞介素2受体(IL2RB)、Ezrin蛋白、外被蛋白复合体(COPA)。通过检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件对这些基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列，然后设计siRNA，通过下调这些分子，来观察对EV71感染的影响。

我们发现发动蛋白1(DNM1)在EV71感染SH-SY5Y中发挥着重要的作用，下调DNM1的表达，能明显抑制EV71的感染。

本发明的第一方面，提供了发动蛋白1(DNM1)作为一种抗肠道病毒71型感染的新靶点。

所述的发动蛋白1(DNM1)，GENBANK ID：NM_004408。

本发明的第二方面，提供了发动蛋白1(DNM1)在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。

进一步地，本发明还提供发动蛋白1(DNM1)在制备预防或治疗手足口病药物中的应用。

本发明所述的发动蛋白1(DNM1)在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用，该药物具体是指能够抑制或下调DNM1的表达量的试剂。

所述的抑制下调DNM1的表达量的试剂可以是siRNA、shRNA、包含siRNA、shRNA的重组载体(如质粒)等。

本发明的第三方面，本发明提供了发动蛋白1(DNM1)的干扰RNA在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用，或发动蛋白1在制备预防或治疗手足口病药物中的应用，所述的药物为干扰RNA(siRNA)，其序列如下：

CUCGAGAAUUUCGUAGGCAUU(SEQ ID NO:4)、

CUGAACGAAAGUUCUUCCUUU(SEQ ID NO:5)、

GAGAUCAGAUCGACACCUAUU(SEQ ID NO:6)。

其中，以如SEQ ID NO:6所示的siRNA下调DNM1的表达量效果最佳，且降低EV71对SH-SY5Y细胞的感染最为明显。

本发明筛选到能够抑制EV71感染SH-SY5Y细胞的一个新的宿主细胞分子DNM1。DNM1基因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了EV71对SH-SY5Y细胞的感染。

因此本发明为临床预防和治疗因EV71感染所导致的神经系统破坏提供了新的靶点和治疗方案。

附图说明

图1为转染有效siRNA后的干扰效率及细胞毒性检测，图中主坐标轴表示干扰效率，次坐标轴表示对细胞毒性的影响；

CTRL：不转染任何siRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组)；

NT：转染non-targeting siRNA的SH-SY5Y细胞组(阴性对照组)；

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的SH-SY5Y细胞组(实验组)。

图2为免疫荧光法检测各宿主分子下调后对EV71感染的影响，其中A为下调各分子后对病毒感染性的荧光检测图，B为下调各分子后对病毒感染的抑制率图；

CTRL：不转染任何siRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组)；

NT：转染non-targeting siRNA的SH-SY5Y细胞组(阴性对照组)；

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的SH-SY5Y细胞组(实验组)。

图3为DNM1下调后对EV71感染的影响，其中A为Western Blot检测DNM1蛋白的表达图，B为观察EV71的细胞病变效应图，C为检测EV71病毒量图；

CTRL：不转染任何siRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组)；

NT-CTRL：转染non-targeting siRNA的SH-SY5Y细胞组(阴性对照组)；

DNM1：转染针对DNM1基因的siRNA(SEQ ID NO:6)的SH-SY5Y细胞组。

图4为转染DNM1分子的不同干扰序列后的干扰效率及对EV71感染性的影响图，A为DNM1基因的mRNA水平检测图，B为EV71病毒量检测图；

CTRL：不转染任何siRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组)；

NT-CTRL：转染non-targeting siRNA的SH-SY5Y细胞组(阴性对照组)；

DNM1-4：转染针对DNM1基因的siRNA(SEQ ID NO:4)的SH-SY5Y细胞组；

DNM1-5：转染针对DNM1基因的siRNA(SEQ ID NO:5)的SH-SY5Y细胞组；

DNM1-6：转染针对DNM1基因的siRNA(SEQ ID NO:6)的SH-SY5Y细胞组。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：

1 设计、合成各宿主细胞分子的特异性siRNA序列。

1.1 针对各个目的基因，检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件对各目的基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列。参照siRNA设计原则，并通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行对比，确保无同源性；排除aitisense链的5’端连续8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA；排除任何一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在siRNA。并利用设计软件进行预评估测定，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰序列，见表1。

1.2 单链siRNA的合成与纯化由Invitrogen公司完成。

表1.siRNA靶点的设计

2 siRNA序列筛选与干扰效果鉴定

2.1 RNA转染

转染步骤参照Lipofectamine 2000说明书

1)提前12-16小时将SH-SY5Y细胞(购自ATCC，保藏号：ATCC CRL-2266)铺在24孔细胞培养板上培养，使得转染时细胞密度为80％-90％。

2)取2μLLipofectamine 2000加入50μLopti-MEM中并轻柔混匀，室温孵育5分钟；另取5μL浓度为5μM的干扰RNA和50μLopti-MEM混合。孵育结束后，将稀释的Lipofectamine2000转染试剂加入稀释的RNA中，并轻柔吹吸混匀。室温孵育20min后，加入SH-SY5Y细胞中，补加400μLopti-MEM，使得RNA终浓度为50nM。

3)转染后6-8小时更换含有双抗的新鲜培养基。

2.2 实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各宿主分子的mRNA水平

1)TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA，具体步骤如下：

转染48小时后，去培养上清，在细胞中加入1ml TRIzol，充分混合室温裂解细胞3-5分钟。加入1/5体积的氯仿，手动剧烈混合15秒。于4℃、12,000转离心15分钟。取上层水相并转移到新的EP管中，加入等体积异丙醇，充分混合，室温沉淀10分钟。于4℃、12,000转离心10分钟。弃上清，加入1ml预冷的75％乙醇。于4℃、12,000离心5分钟。充分弃上清，室温晾干RNA沉淀，加入DEPC处理水溶解沉淀，得到总RNA。

2)利用takara反转录试剂盒获取对照组与干扰组细胞的cDNA，具体步骤如下：

在PCR管中加入如下反应体系，

5×PrimeScript Buffer 2μL

PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μL

Random 6 mers 0.5μL

Total RNA 500ng

Rnase Free dH₂O up to 10μL

轻柔混合混匀，置于37℃反应15分钟，然后置于85℃加热5秒钟灭活逆转录酶。

3)荧光定量RT-PCR检测

利用takara的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行反应，反应体系如下，

利用Rotor Gene 3000A仪器进行两步法扩增，95℃预变性2min，进行40个PCR循环，95℃5秒，60℃30秒。

3 细胞毒性实验

采用CCK-8方法检测转染siRNA后对细胞增殖的影响，具体步骤如下：

收集对数生长期细胞，以每孔3000个的密度接种于96孔板。待细胞过夜贴壁后，转染各siRNA，培养48小时后检测细胞增殖情况。弃去原有培养基，每孔加入含10μL CCK-8的新鲜培养基110μL，培养3h后用多功能酶标仪在450nm波长检测各孔吸光度值。实验独立重复3次，计算平均值。

4 EV71病毒感染SH-SY5Y细胞

4.1 SH-SY5Y细胞的EV71病毒感染实验

SH-SY5Y细胞转染RNA后72小时，进行EV71病毒感染实验。将培养上清吸出，用预温PBS润洗2次，以MOI＝0.1的病毒量接种EV71，37℃孵育2h后弃去病毒液，并用预温PBS润洗3次，加入新鲜培养基继续培养。

4.2 免疫荧光染色检测EV71抗原表达

SH-SY5Y细胞感染病毒后继续培养48h，采用免疫荧光法检测病毒抗原的表达，具体步骤如下：

1)细胞固定：将96孔板中的培养液移去，加入PBS清洗细胞2次，每孔加入100μl预冷甲醇，于-20℃条件下固定20min，用预冷的PBS清洗细胞3次。

2)透膜：固定后的细胞每孔加入100μl 0.1％TritonX-100，室温孵育15min，用预冷PBS洗涤3次。

3)封闭：每孔加入100μl 3％BSA，于室温下孵育1h。

4)一抗孵育：每孔加入EV71特异性鼠源单抗10F0(1:2000稀释)100μl，室温孵育1h，用预冷的PBS洗涤3次。

5)二抗孵育：每孔加入AF 488荧光标记抗鼠IgG(1:1000稀释)100μl，室温避光孵育1h，用预冷的PBS避光洗涤2次。

6)标记细胞核：每孔加入细胞核荧光染料DAPI(1:5000，PBS稀释)，室温避光孵育15min，用预冷的PBS避光洗涤3次。

7)荧光显微镜下检测并计算绿色AF 488阳性细胞克隆数。

4.3 蛋白免疫印迹。

(1)用蛋白裂解液分别提取对照组与DNM1干扰组SH-SY5Y细胞的总蛋白。

(2)蛋白质定量后分别将30ug蛋白加到12.5％浓度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并截取相应条带用电转仪转到PVDF膜上。

(3)蛋白的非特异性位点用5％的脱脂牛奶封闭，然后用DNM1抗体封闭，4℃过夜，用TBST缓冲液洗三遍，洗去一抗。

(4)然后用HRP标记的二抗室温孵育2小时，继而用TBST缓冲液洗三遍。

(5)最后，利用显色液显色并拍照分析.

4.4 RT-PCR检测细胞中EV71病毒量

SH-SY5Y细胞感染病毒后继续培养48h，采用TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA，并逆转录获得cDNA，通过RT-PCR检测EV71病毒量。具体步骤同2.2所示。

实验结果：

1 设计、合成并筛选有效的siRNA

针对各个目的基因序列，我们设计了多个RNA干扰靶点序列，并利用设计软件进行预评估测定，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰序列，如表1所示。

采用体外转染的方法，将各个基因的干扰RNA转染到SH-SY5Y细胞中去，48h后通过RT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率，最终筛选到干扰效果最佳的siRNA序列(表2中加粗序列)进行后续实验，其干扰效率如表2所示。

表2 RT-PCR法检测siRNA干扰序列对相关宿主基因的下调效率

注：CTRL：不转染任何siRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组)

NT：转染non-targeting siRNA的SH-SY5Y细胞组(阴性对照组)

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的SH-SY5Y细胞组(实验组)。

2 siRNA干扰后的干扰效率以及细胞毒性检测

挑选出的针对各宿主分子的有效siRNA转染SH-SY5Y细胞，转染后48h通过RT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率，同时采用CCK8检测转染后对SH-SY5Y细胞毒性的影响。

结果如图1所示，转染有效siRNA组与CTRL组相比，转染各siRNA后能够明显抑制相应基因的表达水平(P＜0.01)。转染DNM1 siRNA(SEQ ID NO:6)的抑制效率可达到77％。

细胞毒性实验表明，各siRNA转染后并没有产生明显的细胞毒性(P＞0.05)，对细胞正常的生理功能未产生影响，可用于后续实验。

3 siRNA干扰后对EV71病毒感染的影响

转染各宿主分子的有效siRNA来下调宿主细胞相关分子的表达后，感染相同剂量的EV71病毒，感染48h后，采用免疫荧光法检测各宿主分子下调后对EV71感染的影响，发现与对照组相比，转染DNM1 siRNA(SEQ ID NO:6)使DNM1基因下调后，明显降低了EV71对SH-SY5Y细胞的感染(图2A)。通过计算病毒量发现，DNM1基因下调后对病毒的抑制率达到81.43％，而其余分子的下调并没有明显抑制EV71对SH-SY5Y细胞的感染(P＞0.05)(图2B)。

为明确DNM1对EV71感染的抑制作用，在转染DNM1分子siRNA后，通过免疫印迹法检测DNM1蛋白分子的表达，并在感染EV71后观察细胞病变情况，以及通过RT-PCR检测EV71病毒量。结果显示，转染DNM1分子siRNA(SEQ ID NO:6)后，能够明显抑制DNM1蛋白分子的表达(图3A)。与对照组相比，DNM1蛋白表达下调后，能够抑制细胞病变且SH-SY5Y细胞中的病毒量也显著下降(图3B,C)，与免疫荧光法检测结果相一致。这些结果表明，与对照细胞相比，下调DNM1基因后EV71对SH-SY5Y细胞的感染能力明显下降，病毒量减少。

进一步，分别转染三条DNM1分子的siRNA观察对病毒感染性的影响。结果表明不同的siRNA对DNM1分子的下调效率不同(图4A)，其中siRNA(SEQ ID NO:6)的干扰效率最高，与前面的结果相一致。检测干扰后对EV71感染性的影响发现，三条DNM1分子的siRNA对病毒感染的抑制率均可达到72％以上，而且随着对DNM1分子的下调效率的增高，对EV71感染的抑制率也在升高(图4B)，提示DNM1分子在EV71感染SH-SY5Y中发挥着重要作用。因此，DNM1可作为抑制EV71对SH-SY5Y细胞感染的新的宿主靶点。

通过以上实验结果证明：本发明筛选到能够抑制EV71感染SH-SY5Y细胞的一个新的宿主细胞分子DNM1。DNM1基因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了EV71对SH-SY5Y细胞的感染。因此本发明为临床预防和治疗因EV71感染所导致的神经系统损害提供了新的靶点和治疗方案。

以上已对本发明创造的实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (1)

1.抑制或下调发动蛋白DNM1表达量的试剂在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用；所述的抑制或下调DNM1表达量的试剂是DNM1的干扰RNA，所述的干扰RNA的序列选自以下任一：

CUCGAGAAUUUCGUAGGCAUU(SEQ ID NO:4)、

CUGAACGAAAGUUCUUCCUUU(SEQ ID NO:5)、

GAGAUCAGAUCGACACCUAUU(SEQ ID NO:6)。