CN112057622B

CN112057622B - Atp结合盒跨膜转运亚家族c成员3在制备防治肠道病毒71型感染药物中的应用

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Publication number: CN112057622B
Application number: CN201910500985.7A
Authority: CN
Inventors: 刘延刚; 任浩; 郑丽雪; 朱勇喆; 戚中田; 赵平; 陈生林
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2039-06-11
Also published as: CN112057622A

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体是一种抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。本发明以人结肠癌细胞(Caco‑2)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞转运相关膜蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人结肠癌细胞的宿主因子，达到从源头(肠道)阻断EV71感染的目的。本发明发现ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3(ABCC3)在EV71感染Caco‑2细胞中发挥着重要的作用，下调ABCC3的表达，能明显抑制EV71的感染。本发明提供了ABCC3在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用，为临床预防和治疗因EV71感染所导致的手足口病、脑膜炎、脑干脑炎或脊髓灰质炎等疾患提供了新的靶点和治疗方案。

Description

ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3在制备防治肠道病毒71型感染药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，是一种抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。

背景技术

肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属人肠道A类病毒，是导致手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病原体之一。目前，手足口病在世界多个地区暴发并流行，尤其是亚太地区。在我国，自2008年几大省市暴发手足口病疫情以来，该病的感染人数和死亡率一直居高不下，每年报告发病数超过100万例，死亡数近1000例。手足口病主要发病人群为5岁以下婴幼儿，临床表现为发热，手、足、臀部以及口腔粘膜等部位出现疱疹等症状；少数患儿可发展为重症患者，出现中枢神经系统(central nervous system，CNS)病变，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脑脊髓炎以及神经源性肺水肿等，严重威胁着婴幼儿的生命健康[Solomon T,et al.Virology,epidemiology,pathogenesis,and control of enterovirus 71.Lancet Infect Dis.2010,10(11):778-90]。手足口病特别是重症病例多由肠道病毒71型(EV71)感染所致。然而，目前关于EV71引起手足口病的治疗尚无特异高效的抗病毒药物，临床上仍以对症治疗为主，在预防方面也无有效疫苗问世。

EV71的传播以粪-口途径最广，在此传播途径中，肠道是人体抵御病原体的第一道屏障。动物实验研究证实，EV71经口腔接种小鼠后，最先在小肠组织表现出病原体阳性[Chen YC,et al.A murine oral enterovirus 71infection model with centralnervous system involvement.Journal of General Virology,2004,85(1):69-77]。因此，EV71首先通过对肠道系统进行感染，在小肠道细胞内大量快速复制，随后入血导致病毒血症并引发其它器官的感染。然而，在EV71到达人体肠道系统后，病毒如何侵入肠道细胞的机制尚不清楚。小肠作为人体消化系统重要器官，主要负责营养物质的消化与吸收，其腔面最外层为小肠粘膜上皮细胞，对于抵御病原体的起着至关重要的作用。作为人结肠癌细胞系，Caco-2在形态学和生理学功能方面与人小肠粘膜上皮细胞相似，培养成熟的Caco-2为致密的单层细胞，具有与正常的小肠粘膜上皮细胞相同的极性和紧密连接、微绒毛结构；且作为肿瘤细胞，比小肠粘膜上皮细胞更易培养。因此，探明EV71感染Caco-2的机制并以此寻找新的抗病毒靶点，对于防治EV71感染至关重要。而目前关于EV71感染Caco-2的具体分子机制仍不清楚。

病毒在感染宿主时，必须利用宿主细胞的各种分子及相关信号通路才能完成自身的生命周期。其中，细胞膜上转运相关分子对病毒的入侵，复制，以及释放出有感染性的子代病毒颗粒具有重要意义。比如，A解联蛋白和金属蛋白酶结构域蛋白10(ADisintegrinand metalloproteinase domain-containing protein，ADAM10)在HIV的核转运和复制中具有重要作用[Endsley MA,et al.Nuclear trafficking of the HIV-1pre-integrationcomplex depends on the ADAM10intracellular domain,Virology.2014,454-455:60-6；Friedrich BM,et al.A functional role for ADAM10in human immunodeficiencyvirus type-1replication.Retrovirology.2011,8:32]。近年来研究也发现ADP核糖基化因子6(ADP ribosylation factor 6，ARF6)分子在柯萨奇病毒A9型的感染过程中发挥着重要的作用[

O,et al.Internalization of coxsackievirus A9is mediated bybeta 2-microglobulin,dynamin,and ARF6but not by caveolin-1or clathrin.JVirol.2010,84(7):3666-81]。还有研究表明EV71主要利用细胞膜上小窝蛋白1(CAV1)依赖的内吞途径(caveolar-dependent endocytosis)感染Jurkat T淋巴细胞[Lin HY,etal.Caveolar endocytosis is required for human PSGL-1-mediated enterovirus71infection.J Virol.2013,87(16):9064-76]。此外，还有研究发现绒毛蛋白2(VIL2或Ezrin)参与细小病毒的复制与扩散[Nüesch JP,et al.Ezrin-radixin-moesin familyproteins are involved in parvovirus replication and spreading.J Virol.2009,83(11):5854-63]。因此，细胞膜上转运相关分子已成为抗病毒药物筛选的重要靶标。

ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3(ATP binding cassette transmembranetransporter subfamily C member 3，ABCC3)属于ABC转运家族成员，可以转运葡糖苷酸、谷胱甘肽和硫酸盐等的结合物以及单阴离子胆汁酸。人类ABCC3在肝脏、肠道、胰腺、胆囊和肾中表达，也存在于人类的几种癌症中，如肝细胞癌、肺腺癌、卵巢癌、胰腺癌和白血病细胞。据报道，人类ABCC3可以通过转运依托泊苷、替尼泊苷和长春新碱等药物参与多种抗肿瘤药的耐药[Kobayashi K,et al.Functional analysis of nonsynonymous singlenucleotide polymorphism type ATP-binding cassette transmembrane transportersubfamily C member 3.Pharmacogenet Genomics.2008,18(9):823-33]。过表达ABCC3可以促进细胞增殖，耐药性和有氧糖酵解并与肿瘤进展和预后相关[Liu X,etal.Overexpression of ABCC3promotes cell proliferation,drug resistance,andaerobic glycolysis and is associated with poor prognosis in urinary bladdercancer patients.Tumour Biol.2016,37(6):8367-74；Carrasco-Torres G,et al.Thetransmembrane transporter ABCC3participates in liver cancer progression andis a potential biomarker.Tumour Biol.2016,37(2):2007-14]。敲除ABCC3会严重损害由胆汁酸诱导的肝脏生长并延迟小鼠肝部分切除术后的肝再生[Fernández-Barrena MG,et al.Lack of Abcc3expression impairs bile-acid induced liver growth anddelays hepatic regeneration after partial hepatectomy in mice.J Hepatol.2012,56(2):367-73]。

溶质载体家族7成员7(solute carrier family 7member 7，SLC7A7)编码Y+L氨基酸转运蛋白1，是一种不依赖于钠的氨基酸转运蛋白。该转运蛋白存在于上皮细胞膜上，主要通过调节阳离子和大的中性氨基酸跨膜转运而调节多种生理功能[Ji X,etal.Function of SLC7A7in T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia.Cell PhysiolBiochem.2018,48(2):731-740]。广泛的研究证明该基因的缺陷是导致溶血素蛋白不耐受(lysinuric protein intolerance，LPI)的重要原因[Sperandeo MP,et al.Lysinuricprotein intolerance:update and extended mutation analysis of theSLC7A7gene.Hum Mutat.2008,29(1):14-21]。此外，SLC7A7突变导致的阳离子转运蛋白功能障碍与多种临床症状相关，如高血氨、肾功能障碍、胃肠道症状、异常造血、生长迟缓和骨质疏松症[Ji X,et al.Function of SLC7A7in T-Cell Acute LymphoblasticLeukemia.Cell Physiol Biochem.2018,48(2):731-740]。SLC7A7的高表达与恶性胶质瘤和多发性骨髓瘤的预后，卵巢癌的耐药性以及肺癌的放射治疗敏感性高度相关[Fan S，etal.Genetic variants in SLC7A7are associated with risk of glioma in a Chinesepopulation.Exp Biol Med(Maywood),2013,238:1075-1081；Agnelli L,et al.Thereconstruction of transcriptional networks reveals critical genes withimplications for clinical outcome of multiple myeloma.Clin Cancer Res.2011,17:7402-7412；Cheng L,et al.Analysis of chemotherapy response programs inovarian cancers by the next-generation sequencing technologies.GynecolOncol.2010,117:159-169]。最近的研究还发现，同为溶质载体家族成员的SLC3A2对于丙型肝炎病毒的复制具有重要作用。

然而，目前还没有任何关于ABCC3和SLC7A7分子在病毒感染宿主细胞中作用的报道，对于这两个分子进行深入研究不仅能够提升对EV71感染与致病机制的认识，也可以为预防与治疗EV71感染提供新的思路与靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗肠道病毒71型感染的新靶点，即ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3(ATP binding cassette transmembrane transporter subfamily Cmember 3，ABCC3)。

本发明的另一目的在于提供ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3(ABCC3)分子的新用途，特别是在抗肠道病毒71型感染中的应用。

本发明的第三目的在于提供干扰ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3(ABCC3)分子表达的siRNA及其应用。

为了实现上述目的，本发明的主要技术方案是：

本发明，以人结肠癌细胞(Caco-2)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞转运相关膜蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人结肠癌细胞(Caco-2)的宿主因子，达到从源头(肠道)阻断EV71感染的目的。本发明选择了一组宿主细胞转运相关膜蛋白来进行筛选，这些分子在宿主细胞的跨膜物质运输，囊泡的内吞与分泌中发挥着重要作用，它们往往也是在病毒感染过程中易被病毒“劫持”并利用的分子。这些分子包括：ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3(ABCC3)、ADAM金属蛋白酶10(ADAM10)、ADP核糖基化因子6(ARF6)、小窝蛋白1(CAV1)、发育和分化增强因子2(DDEF2)、酪氨酸蛋白激酶FYN、高尔基体重组蛋白1(GORASP1)、Huntingtin相互作用蛋白1相关蛋白(HIP1R)、Intersectin-1(ITSN1)、溶质载体家族7成员7(SLC7A7)、囊泡相关膜蛋白1(VAMP1)、囊泡相关膜蛋白2(VAMP2)、VAMP相关蛋白A(VAPA)和绒毛蛋白2(VIL2)。通过检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件对这些基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列，然后设计siRNA，通过下调这些分子，来观察对EV71感染的影响。

本发明通过实验发现ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3(ABCC3)在EV71感染Caco-2细胞中发挥着重要的作用，下调ABCC3的表达，能显著抑制EV71的感染。

基于此，本发明的第一方面，提供一种抗肠道病毒71型感染的新靶点，即ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3(ABCC3)。

本发明的第二方面，提供ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3(ABCC3)在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。

进一步的，所述的应用是指将ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3(ABCC3)作为预防或治疗肠道病毒71型感染的干预靶点。

进一步的，所述的肠道病毒71型感染导致的疾病包括但不限于手足口病、脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎等。即，本发明还提供ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3(ABCC3)在制备预防或治疗由肠道病毒71型感染导致的包括但不限于手足口病、脑膜炎、脑干脑炎或脊髓灰质炎等疾病的药物中的应用。

进一步的，所述的药物是通过抑制或下调ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3(ABCC3)的表达量抑制肠道病毒71型感染的药物。

本发明的第三方面，提供抑制或下调ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3(ABCC3)的表达量的试剂在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。

进一步的，所述的抑制或下调ABCC3的表达量的试剂指特异性干扰ABCC3基因表达、加工的siRNA、shRNA、miRNA或反义核苷酸，或包含siRNA、shRNA、miRNA或反义核苷酸的重组载体(如质粒)等。

在本发明的一个实施方式中，所述的抑制或下调ABCC3的表达量的试剂是ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3的干扰RNA(siRNA)，所述的干扰RNA的序列选自以下任一：

CGCUGAUCUUACAACACUA(SEQ ID NO:1)、

GCUGAUCUUACAACACUAU(SEQ ID NO:2)、

UAGUGUUGUAAGAUCAGCG(SEQ ID NO:3)。

其中，以如SEQ ID NO:1所示的siRNA下调ABCC3的表达量效果最佳，且降低EV71对Caco-2细胞的感染最为明显。

本发明的第四方面，提供一种预防或治疗肠道病毒71型感染的药物，所述的药物中包含抑制或下调ABCC3的表达量的试剂。

本发明优点在于：

本发明筛选到能够抑制EV71感染Caco-2细胞的一个新的宿主细胞分子ABCC3。ABCC3基因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了EV71对Caco-2细胞的感染。因此本发明为临床预防和治疗因EV71感染所导致的手足口病、脑膜炎、脑干脑炎或脊髓灰质炎等疾患提供了新的靶点和治疗方案。

附图说明

图1为转染有效siRNA后靶基因的相对表达量及细胞毒性，图中主坐标轴(左y轴)表示采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测的靶基因的相对表达量(以RQ值表示)，次坐标轴(右y轴)表示采用CCK-8试剂盒检测的转染各siRNA对细胞的毒性(以标准化到空转对照组的细胞存活率表示)；

CTRL：不转染任何siRNA的Caco-2细胞组(空转对照组)；

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的Caco-2细胞组(实验组)；

*：p<0.05。

图2为免疫荧光法检测各转运相关膜蛋白下调后对EV71感染的影响，其中A为下调各蛋白后对病毒感染性的荧光观测图，B为下调各分子后相对于空转对照组病毒感染率的统计图；

CTRL：不转染任何siRNA的Caco-2细胞组(空转对照组)；

NT：转染non-targeting siRNA的Caco-2细胞组(阴性对照组)；

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的Caco-2细胞组(实验组)

水平虚线：相对于空转对照组病毒感染率为50％的参考线。

图3为转染靶向ABCC3和SLC7A7的不同序列siRNA后，采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测靶基因的mRNA水平(以ABCC3和SLC7A7基因相对表达量RQ值表示)；

CTRL：不转染任何siRNA的Caco-2细胞组(空转对照组)；

NT：转染non-targeting siRNA的Caco-2细胞组(阴性对照组)；

ABCC3-1：转染针对ABCC3基因的siRNA(SEQ ID NO:1)的Caco-2细胞组；

ABCC3-2：转染针对ABCC3基因的siRNA(SEQ ID NO:2)的Caco-2细胞组；

ABCC3-3：转染针对ABCC3基因的siRNA(SEQ ID NO:3)的Caco-2细胞组；

SLC7A7-28：转染针对SLC7A7基因的siRNA(SEQ ID NO:28)的Caco-2细胞组；

SLC7A7-29：转染针对SLC7A7基因的siRNA(SEQ ID NO:29)的Caco-2细胞组；

SLC7A7-30：转染针对SLC7A7基因的siRNA(SEQ ID NO:30)的Caco-2细胞组；

*：p<0.05。

图4为下调ABCC3和SLC7A7后对EV71感染的影响，A和B为通过RT-PCR法检测病毒RNA载量(以EV71RNA的相对表达量RQ值表示)，C和D为通过Western Blot法检测病毒蛋白表达量；

CTRL：不转染任何siRNA的Caco-2细胞组(空细胞组)；

NT-CTRL：转染non-targeting siRNA的Caco-2细胞组(阴性对照组)；

ABCC3-1：转染针对ABCC3基因的siRNA(SEQ ID NO:1)的Caco-2细胞组；

ABCC3-2：转染针对ABCC3基因的siRNA(SEQ ID NO:2)的Caco-2细胞组；

ABCC3-3：转染针对ABCC3基因的siRNA(SEQ ID NO:3)的Caco-2细胞组；

SLC7A7-28：转染针对SLC7A7基因的siRNA(SEQ ID NO:28)的Caco-2细胞组；

SLC7A7-29：转染针对SLC7A7基因的siRNA(SEQ ID NO:29)的Caco-2细胞组；

SLC7A7-30：转染针对SLC7A7基因的siRNA(SEQ ID NO:30)的Caco-2细胞组；

GAPDH:内参蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)(36kDa)；

*：p<0.05。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：

1设计、合成各转运相关膜蛋白的特异性siRNA序列。

1.1针对各个目的基因，检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件对AXIIR进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列。参照siRNA设计原则，并通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行对比，确保无同源性；排除aitisense链的5’端连续8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA；排除任何一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在siRNA。并利用设计软件进行预评估测定，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰序列，见表1。

1.2单链siRNA的合成与纯化由Invitrogen公司完成。

表1.siRNA靶点的设计

2 siRNA序列筛选与干扰效果鉴定

2.1 RNA转染

转染步骤参照DharmaFECT-1(购于Horizon公司，货号T-2001-02)说明书

1)Caco-2细胞(购自ATCC公司，货号HTB-37)以3×10⁴/孔种于24孔细胞培养板，37℃培养，待细胞密度为70％左右进行siRNA转染。

2)取4μL DharmaFECT-1加入46μL opti-MEM中并轻柔混匀，室温孵育5分钟；另取5μL浓度为5μM的siRNA和46μL opti-MEM混合。孵育结束后，将稀释的DharmaFECT-1转染试剂加入稀释的siRNA中，并轻柔吹吸混匀。室温孵育15min后，加入Caco-2细胞中，补加400μLopti-MEM，使得RNA终浓度为50nM。

3)6-8小时更换含10％胎牛血清(购买自Thermo Fisher scientific公司，货号10437028)的DMEM培养基(购买自Thermo Fisher scientific公司，货号12430062)。

2.2实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各靶蛋白的mRNA水平

1)提取各组细胞的总RNA，具体步骤如下：

转染48小时后，去培养上清，在细胞中加入1ml RNAiso Plus(购买自TAKARA公司，货号9109)，充分混合冰上裂解细胞5-10分钟。将混合物转移到EP管，加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡15秒。于4℃12,000转/分钟离心15分钟。将上层水相转移到新的EP管中，加入等体积异丙醇，充分混合，室温静置10分钟。于4℃12,000转/分钟离心10分钟。弃上清，加入1ml冰冷75％乙醇。于4℃12,000转/分钟离心10分钟。充分弃上清，室温晾干RNA沉淀，加入去RNA酶水(Rnase Free dH₂O)溶解沉淀，得到总RNA。

2)利用逆转录试剂盒(购买自TAKARA公司，货号RR036A)制备总cDNA，具体步骤如下：

在PCR管中加入如下反应体系，

5×PrimeScript RT Master Mix 2μL

Total RNA 500ng

Rnase Free dH₂O up to 10μL

轻柔混合混匀，置于37℃反应15分钟(逆转录反应)，转移至85℃灭活5秒(逆转录酶的失活反应)。

3)RT-PCR检测目的基因表达量

利用TB Green Premix Ex Taq试剂盒(购买自TAKARA公司，货号RR420A)进行反应，反应体系如下，

利用Applied Biosystems 7300plus仪器进行两步法扩增:

第一步：95℃预变性30秒,

4)采用ΔΔt法计算各靶基因相对表达量。

RQ＝2^-ΔΔt＝2^{-[(Ct处理样本目的基因-Ct对照样本目的基因)-(Ct处理样本内参基因-Ct对照样本内参基因)]}

干扰效率＝1-RQ

3细胞毒性实验

采用CCK-8方法检测转染siRNA后对细胞增值的影响，具体步骤如下：

收集对数生长期细胞，以每孔3000个的密度接种于96孔板。培养细胞至约70％融合度，转染各siRNA，培养48小时，弃去原有培养基，每孔加入含10μL CCK-8试剂(购自日本同仁化学研究所，货号：CK04)的新鲜培养基100μL，培养3-4小时后用多功能酶标仪检测各孔在450nm波长吸光度值。实验独立重复3次，计算平均值，并将结果标准化到空转对照组。

4 EV71病毒感染Caco-2细胞

4.1Caco-2细胞的EV71病毒感染实验

Caco-2细胞转染siRNA后48小时，进行EV71病毒感染实验。将培养上清吸出，用预温PBS润洗2次，以MOI＝0.1的病毒量接种EV71，37℃孵育2h后弃去病毒液，并用预温PBS润洗3次，加入新鲜培养基继续培养。

4.2免疫荧光染色检测EV71抗原表达

Caco-2细胞感染病毒后继续培养48h，采用免疫荧光法检测病毒抗原的表达，具体步骤如下：

1)细胞固定与透膜：将96孔板中的培养液移去，加入PBS清洗细胞2次，每孔加入100μl预冷甲醇(兼具固定与透膜功能)，于-20℃条件下固定透膜20min，用预冷的PBS清洗细胞3次。

2)封闭：每孔加入100μl 3％BSA，于室温下孵育1h。

3)一抗孵育：每孔加入EV71特异性鼠源单抗10F0(1:1000稀释)100μl，4℃摇床孵育过夜，用预冷的PBS洗涤3次。

4)二抗孵育：每孔加入AF 488荧光标记抗鼠IgG(1:1000稀释)100μl，室温避光孵育1h，用预冷的PBS避光洗涤3次。

5)标记细胞核：每孔加入细胞核荧光染料DAPI(1:10000，PBS稀释)，室温避光孵育15min，用预冷的PBS避光洗涤3次。

6)荧光显微镜下检测并计算绿色AF 488阳性细胞比率。

4.3蛋白免疫印迹。

(1)用蛋白裂解液分别提取各组Caco-2细胞的总蛋白。

(2)蛋白质定量后分别将20ug蛋白加到10％浓度的SDA-PAGE凝胶中电泳，并截取相应条带用电转仪转到PVDF膜上。

(3)蛋白的非特异性位点用5％的脱脂牛奶封闭，然后用稀释的EV71特异性鼠源单抗10F0(1:1000稀释)孵育4℃过夜，用TBST缓冲液漂洗三遍。

(4)然后用HRP标记的羊抗兔IgG(1:1000稀释)室温孵育2小时，继而用TBST缓冲液洗三遍。

(5)最后，利用显色液显色并拍照分析。

4.4 RT-PCR检测细胞中EV71病毒量

Caco-2细胞感染病毒后继续培养48h，采用TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA，并逆转录获得cDNA，通过RT-PCR检测EV71病毒量。具体步骤同2.2所示。

实验结果：

1设计、合成并筛选有效的siRNA

针对各个目的基因序列，我们设计了多个RNA干扰靶点序列，并利用设计软件进行预评估测定，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰序列，如表1所示。

采用体外转染的方法，将各个基因的干扰RNA转染到Caco-2细胞中去，48h后通过RT-PCR法检测各靶基因的相对表达量(如表2所示)，最终筛选到干扰效果最佳的siRNA序列(表2中加粗序列)进行后续实验。

表2 RT-PCR法检测转染siRNA后靶基因的相对表达量

注：CTRL：不转染任何siRNA的Caco-2细胞组(空转对照组)；

NT：转染non-targeting siRNA的Caco-2细胞组(阴性对照组)；

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的Caco-2细胞组(实验组)。

2 siRNA干扰后的干扰效率以及细胞毒性检测

挑选出的针对各宿主分子的有效siRNA转染Caco-2细胞，转染后48h通过RT-PCR法检测各靶基因的相对表达量，同时采用CCK8检测转染后对Caco-2细胞毒性的影响。

结果如图1所示，转染有效siRNA组与CTRL组相比，转染各siRNA后能够明显抑制相应基因的表达水平(P＜0.05)。转染ABCC3siRNA(SEQ ID NO:1)和SLC7A7siRNA(SEQ ID NO:29)的干扰效率分别高达87.82和88.44％。

细胞毒性实验表明，各siRNA转染后并没有产生明显的细胞毒性(P＞0.05)，对细胞正常的生理功能未产生影响，可用于后续实验。

3 siRNA干扰后对EV71病毒感染的影响

转染各宿主分子的有效siRNA来下调宿主细胞相关分子的表达后，感染相同剂量的EV71病毒，感染48h后，采用免疫荧光法检测各宿主分子下调后对EV71感染的影响，发现与对照组相比，转染ABCC3siRNA(SEQ ID NO:1)和SLC7A7siRNA(SEQ ID NO:29)分别使ABCC3基因和SLC7A7基因下调后，明显降低了EV71对Caco-2细胞的感染(图2A)。通过计算病毒量发现，ABCC3和SLC7A7基因下调后对病毒的抑制率分别达到87.05％和81.66％，而其余分子的下调并没有明显抑制EV71对Caco-2细胞的感染(P＞0.05)(图2B)。

为进一步明确ABCC3和SLC7A7在EV71感染中的重要作用，分别转染三条针对ABCC3和SLC7A7分子的siRNA后观察对病毒感染性的影响。通过RT-PCR法检测siRNA干扰效率。分别通过RT-PCR法和免疫印迹法检测EV71病毒载量。结果表明不同的siRNA对ABCC3和SLC7A7分子的干扰效率不同(图3A、3B)，其中ABCC3siRNA(SEQ ID NO:1)和SLC7A7siRNA(SEQ IDNO:29)的干扰效率最高，与前面的结果相一致。检测干扰后对EV71感染性的影响发现，三条ABCC3和三条SLC7A7分子的siRNA对病毒感染的抑制率均可达到50％以上，并且随着对ABCC3和SLC7A7分子的干扰效率的增高，Caco-2细胞中的病毒量也显著下降(图4A-4D)，与免疫荧光法检测结果相一致。这些结果表明，ABCC3和SLC7A7分子在EV71感染Caco-2细胞中发挥着重要作用。

因此，ABCC3和SLC7A7可作为抑制EV71对Caco-2细胞感染的新的宿主靶点。

通过以上实验结果证明：本发明筛选到能够抑制EV71感染Caco-2细胞的两个新的宿主细胞分子ABCC3和SLC7A7。ABCC3和SLC7A7基因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了EV71对Caco-2细胞的感染。因此本发明为临床预防和治疗EV71感染提供了新的靶点和治疗方案。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军第二军医大学

<120> ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3在制备防治肠道病毒71型感染药物中的应用

<130> /

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

cgcugaucuu acaacacua 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gcugaucuua caacacuau 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

uaguguugua agaucagcg 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gcuaauggcu ggauuuauu 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

cccaaagucu cucacauua 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

gcaagggaag gaauaugua 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

ccucuaacua caaaucuua 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

ggaaggugcu auccaaaau 19

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

ggauacaacu aaaguacga 19

<210> 10

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

cuaaacaccu caacgauga 19

<210> 11

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

gcaguuguac caugcauua 19

<210> 12

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 12

gcaaauacgu agacucgga 19

<210> 13

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 13

gaaauccgca uugcagguu 19

<210> 14

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 14

cgagauagca aacgaguca 19

<210> 15

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 15

gguccucugu ccaaugcua 19

<210> 16

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 16

gcucugaaau uaccaaauc 19

<210> 17

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 17

cgcaugaauu auauccaua 19

<210> 18

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 18

cugugaagca uucgagaca 19

<210> 19

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 19

cuggaggugu ucaauauga 19

<210> 20

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 20

gaggacuucu uuacgcuca 19

<210> 21

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 21

gaucucuacc acagaauaa 19

<210> 22

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 22

cagcucaacu cgugaacua 19

<210> 23

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 23

cuguggagau guuugauua 19

<210> 24

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 24

ccucuucgau cagacguuu 19

<210> 25

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 25

ggacauaguu guacugaaa 19

<210> 26

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 26

gauaucagau gucgauuga 19

<210> 27

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 27

ggccauaacu guagaggaa 19

<210> 28

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 28

cucuuaaccu ucauuaacu 19

<210> 29

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 29

ggcaccacca uuaagaaau 19

<210> 30

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 30

aguuaaugaa gguuaagag 19

<210> 31

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 31

cuccuaacau gaccaguaa 19

<210> 32

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 32

caucacaauu ugagagcag 19

<210> 33

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 33

ccaucaucgu gguaguuau 19

<210> 34

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 34

uaguuuacuu cagcucuua 19

<210> 35

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 35

gcgcaaauac ugguggaaa 19

<210> 36

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 36

ccuccaaacc ucaccagua 19

<210> 37

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 37

ccacagaccu caaauucaa 19

<210> 38

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 38

ggcaaaaccu gaugaauua 19

<210> 39

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 39

ccugagagau gaagguuua 19

<210> 40

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 40

gcucaaagau aaugcuaug 19

<210> 41

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 41

ggcaacagcu ggaaacaga 19

<210> 42

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 42

caagaaggca ccugacuuu 19

Claims

1.抑制或下调ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3的表达量的试剂在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用；所述的抑制或下调ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3的表达量的试剂指特异性干扰ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3基因表达、加工的siRNA、shRNA、miRNA或反义核苷酸，或包含siRNA、shRNA 、miRNA或反义核苷酸的重组载体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抑制或下调ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3的表达量的试剂在制备预防或治疗由肠道病毒 71 型感染导致的手足口病、脑膜炎、脑干脑炎或脊髓灰质炎的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抑制或下调ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3的表达量的试剂是ATP结合盒跨膜转运亚家族C成员3的干扰RNA，所述的干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3中任一所示。