JP2022527235A - インフルエンザウイルスにおける付加的遺伝子に遺伝的安定性を付与する突然変異 - Google Patents

インフルエンザウイルスにおける付加的遺伝子に遺伝的安定性を付与する突然変異 Download PDF

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Abstract

本開示は、アスパラギンではない５４０位における残基若しくはグルタミン酸ではない７１２位における残基を有するＰＢ２をコードするＰＢ２ウイルスセグメント、グルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメント、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメント、又はそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つを有する分離された組換えインフルエンザウイルスと、ウイルスを作製し、使用する方法とを提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月２３日に出願された米国出願第６２／７９５，８２１号の出願日の利益を主張するものであって、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
政府の権利に関する宣言
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＨＨＳＮ２７２２０１４００００８Ｃの下における政府の支援によって為されたものである。前記政府は、本発明において特定の権利を有する。
インフルエンザＡ型ウイルスは、毎年の流行病及び散発的な汎発流行病を引き起こす呼吸器病原体である（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１３）。その上、高病原性鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス及び最近出現したＨ７Ｎ９インフルエンザウイルスは、非常に多くの高死亡率のヒト感染症を引き起こしてきた（Ｗａｔａｎａｂｅら、２０１３；Ｚｈａｎｇら、２０１３）。インフルエンザウイルスは、哺乳類宿主における呼吸器上皮細胞及び肺胞マクロファージに感染する（Ｙｕら、２０１０）。宿主免疫系は、サイトゾルセンサを介してインフルエンザウイルスのＲＮＡゲノムを認識し（Ｄｉｅｂｏｌｄら、２００４；Ｐｉｃｈｌｍａｉｒら、２００６）、それによってＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）、炎症誘発性サイトカイン及び炎症誘発性ケモカインの産生をもたらす先天性免疫応答が引き起こされる（Ｈｏｎｄａ及びＴａｎｉｇｕｃｈｉ、２００６）。Ｉ型ＩＦＮは、ミクソウイルス抵抗性（Ｍｘ）、オリゴアデニル酸シンセターゼ（ＯＡＳ）及びインターフェロン刺激遺伝子１５（ＩＳＧ１５）を含む抗ウイルスタンパク質の産生を上方制御する（Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｓｔｒｅら、２０１１）。インフルエンザウイルス感染に対する先天性免疫応答の調節不全は、マクロファージ及び好中球を含む浸潤免疫細胞によって媒介される肺病理を引き起こす（Ｈｅｒｏｎら、２００８；Ｐｅｒｒｏｎｅら、２００８）。いくつかの研究がインフルエンザウイルス感染に対する宿主応答に言及しているが（Ｆａｋｕｙａｍａ及びＫａｗａｏｋａ、２０１１）、インフルエンザウイルス誘導病理の機序は、依然として完全に理解されていない。
インビボにおけるインフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を分析するために、蛍光レポータタンパク質を発現するウイルスが作製された（Ｋｉｔｔｅｌら、２００４；Ｓｈｉｎｙａら、２００４）。しかし、これらのウイルスは、著しく弱毒化し（Ｋｉｔｔｅｌら、２００４；Ｓｈｉｎｙａら、２００４）、自然感染を正確に反映することができなかった。例えば、Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙら（２０１０）は、インフルエンザウイルス感染の際における抗原提示の経路を評価するために用いたＧＦＰ発現インフルエンザウイルスを作製した（Ｈｅｌｆｔら、２０１２）。しかし、前記ＧＦＰ遺伝子は、マウスの肺細胞又は培養細胞における複製の間に安定して維持されなかった（Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙら、２０１０）。
Ｈ５Ｎ１サブタイプの高病原性鳥インフルエンザウイルス（ＨＰＡＩ）は、自然界で進化し続けており、それによって動物の健康及び公衆衛生が脅かされている。これらのウイルスは、１９９６年に中国の広東省において最初に同定され（Ｌｉら、２００６）、以後、複数の鳥類種において、６３を超える国において発見され、ブタ及びヒトなどの哺乳動物に繰り返し感染している（Ｌｉら、２０１０；Ｎｅｕｍａｎｎら、２０１０）。２０１３年１２月までにＨ５Ｎ１ウイルス感染の６４８のヒト症例が世界保健機関（ＷＨＯ）によって確認されたが、それらの内の３８４人が致死的であり、死亡率は約６０％であった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ）。加えて、Ｈ７Ｎ９ウイルス及びＨ１０Ｎ８ウイルスなどの新規のサブタイプのインフルエンザウイルスが自然発生的に出現し、ヒトに散発的に感染して、致死的転帰をもたらした（Ｃｈｅｎら、２０１４；Ｌｉら、２０１３）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ）。したがって、インフルエンザウイルスによる現在の脅威によって、我々は、インフルエンザウイルス感染の動的プロセスを含む制御のためのより有効な戦略を開発するためにそれらの病原性機序の完全な理解を得ることの緊急の必要性に気づかされるが、インビボにおけるウイルス標的細胞は不明なままである。
本開示は、例として、例えば、無処置の若しくは修飾された（例えば、トランケートされた、若しくは内部欠失させた）ウイルスタンパク質コード領域に融合させたウイルスセグメントの内の１つに挿入されるか、又は付加的なウイルスセグメント上に存在する、「異種」遺伝子配列などの付加的な非インフルエンザウイルス遺伝子の遺伝的安定性を増大させるインフルエンザウイルスの（１又は複数の）ウイルスセグメントの突然変異に関する。一実施形態において、異種遺伝子配列によって増大しないインフルエンザウイルスの安定性を増強させるために前記突然変異の内の１つ以上を用いてもよい。一実施形態において、前記異種遺伝子配列は、マーカー遺伝子、例えば、ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＲＦＰ若しくはＹＦＰに対するものなどの蛍光タンパク質遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－グルクロニダーゼ遺伝子又はβ－ラクタマーゼ遺伝子である。一実施形態において、前記異種配列は、予防的遺伝子産物に対するものである。一実施形態において、前記異種配列は、治療遺伝子産物をコードする。
本明細書において開示されるように、異なる色の蛍光タンパク質を発現するインフルエンザウイルス（色－インフルエンザウイルス（Ｃｏｌｏｒ－ｆｌｕ ｖｉｒｕｓｅｓ））が作製された。異物遺伝子を含むウイルスの継代を行った。マウスに対する適応の際、感染動物における蛍光タンパク質の安定発現によって、異なる型の顕微鏡検査及びフローサイトメトリによるそれらの検出が可能になった。各々が４つの異なる蛍光タンパク質の内の１つを安定して発現する蛍光インフルエンザウイルスの使用によって、同時モニタリング及びライブイメージングが可能になる。これらのウイルスを用いて、これらのウイルスの多用性を示すためにいくつかの研究が行われた。例えば、このシステムは、ウイルス感染細胞のライブイメージングのために、並びに色－インフルエンザ感染マウスの肺におけるウイルス抗原陽性生細胞及びウイルス抗原陰性生細胞における識別的遺伝子発現研究のために、マウス肺におけるウイルスの拡散の進行を分析するために用いられた。したがって、色－インフルエンザウイルスは、インフルエンザ病原性をより良好理解するためにインビボにおける細胞レベルにおけるウイルス感染を分析するための強力なツールである。その上、結果として生じるウイルスにおける異なる安定化突然変異が同定された。これらの突然変異は、ＨＡタンパク質におけるＴ３８０Ａ（番号付けは、Ｈ１についてのものである）及びＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＰＢ２タンパク質におけるＥ７１２Ｄ、並びに、それぞれ、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）ウイルスのＰＢ２、ＰＡ、ＰＢ１及びＮＳ１タンパク質におけるＶ２５Ａ、Ｒ４４３Ｋ、Ｋ７３７Ｒ及びＰ１６７Ｓアミノ酸置換を含む。Ｈ５ウイルス単独における個別の突然変異によって、インビトロにおいてより安定な外来遺伝子を含むウイルスが生じ、それらの全ての組み合わせは、インビボにおいてさらにより大きな安定性を提供した。これらの突然変異は、いかなるＨＡ／ＮＡの組み合わせについても有用である。
一実施形態において、組換えウイルスは、１以上の安定化突然変異、例えば、１以上の置換を有さない対応するウイルス（親ウイルス）と比較して１以上の置換を有する組換えウイルスの安定性若しくは複製を増強する（例えば、力価を増強する）１以上のインフルエンザウイルスタンパク質における１以上の置換、及び／又はそれぞれのウイルスセグメントにおける異種遺伝子配列を有する１以上の置換を有さない対応するウイルスと比較して組換えウイルスにおけるウイルスセグメントの内の１つに存在する異種遺伝子配列の安定性若しくは複製を増強する１以上のインフルエンザウイルスタンパク質の１以上の置換、及び／又は１以上の置換を有さない対応するウイルスと比較して組換えウイルスにおいて付加的なウイルスセグメントに存在し且つ異種遺伝子配列を有する付加的なウイルスセグメントを有する異種遺伝子配列の安定性若しくは複製を増強する１以上のインフルエンザウイルスタンパク質における１以上の置換を有する。前記１以上の置換としては、インフルエンザＰＡ、ＰＡ－Ｘ、ＰＢ１、ＰＢ１－Ｆ２、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ１、Ｍ２、ＮＡ及び／又はＨＡ（例えば、インフルエンザＡ型ウイルスのＨＡ）の内のいずれかにおける置換、それらに対する対応するウイルスセグメント（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、Ｍ、ＮＡ及び／又はＨＡ）においてコードされる置換、又はそれらのインフルエンザウイルスタンパク質若しくは遺伝子の内のいずれか１つにおける置換の組み合わせ、又はそれらのタンパク質又は遺伝子の内の２つ以上における１以上の置換の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されるものではない。一実施形態において、インフルエンザウイルスの安定性又は複製を増強する前記１以上の置換は、ＰＡタンパク質中におけるもの、例として、例えばＲＮＡ複製、ＰＡタンパク質分解活性及び／又は１以上のウイルスタンパク質若しくは細胞タンパク質との相互作用を増強する（タンパク質表面上に位置する）ＰＡにおける１８０位のグルタミン、２００位のスレオニン又は４４３位のアルギニンについての置換である。一実施形態において、ＰＡにおける４４３位のアルギニンについての置換は、保存的置換である。一実施形態において、ＰＡにおける４４３位のアルギニンについての置換は、非保存的置換である。一実施形態において、ＰＡの１８０位のグルタミンについての置換は、保存的置換である。一実施形態において、ＰＡにおける１８０位のグルタミンについての置換は、非保存的置換である。一実施形態において、ＰＡのける２００位のスレオニンについての置換は、保存的置換である。一実施形態において、ＰＡにおける２００位のスレオニンについての置換は、非保存的置換である。一実施形態において、インフルエンザウイルスの安定性又は複製を増強する１以上の置換は、ＰＢ２タンパク質中におけるもの、例として、例えばポリメラーゼ活性、（２５位についての）ＭＡＶＳとの相互作用及び／又は（７１２位についての）タンパクの折り畳み若しくは安定性を増強するＰＢ２における、２５位のバリンについての置換、５４０位のアスパラギンについての置換、及び／又は７１２位のグルタミン酸についての置換である。一実施形態において、ＰＢ２における２５位のバリンについての置換は、保存的置換である。一実施形態において、ＰＢ２における２５位のバリンについての置換は、非保存的置換である。一実施形態において、ＰＢ２における５４０位のアスパラギンについての置換は、保存的置換である。一実施形態において、ＰＢ２における５４０位のアスパラギンについての置換は、非保存的置換である。一実施形態において、ＰＢ２における７１２位のグルタミン酸についての置換は、保存的置換である。一実施形態において、ＰＢ２における７１２位のグルタミン酸についての置換は、非保存的置換である。一実施形態において、インフルエンザウイルスの安定性又は複製を増強する前記１以上の置換は、ＰＢ１タンパク質中におけるもの、例として、例えばポリメラーゼ活性又はエンドヌクレアーゼ活性を改変する（タンパク質表面上に位置してもよい）ＰＢ１における１４９位のバリンについての置換、７３７位のリジンについての置換、６８４位のグルタミン酸についての置換及び／又は６８５位のアスパラギン酸についての置換である。一実施形態において、ＰＢ１における７３７位のリジンについての置換は、保存的置換である。一実施形態において、ＰＢ１における７３７位のリジンについての置換は、非保存的置換である。一実施形態において、ＰＢ１における１４９位のバリンについての置換は、保存的置換である。一実施形態において、ＰＢ１における１４９位のバリンについての置換は、非保存的置換である。一実施形態において、ＰＢ１における６８４位のグルタミン酸についての置換は、保存的置換である。一実施形態において、ＰＢ１における６８４位のグルタミン酸についての置換は、非保存的置換である。一実施形態において、ＰＢ１における６８５位のアスパラギン酸についての置換は、保存的置換である。一実施形態において、ＰＢ１における６８５位のアスパラギン酸についての置換は、非保存的置換である。
一実施形態において、例えばインフルエンザウイルスのＮＳ１のインターフェロン干渉活性又は転写調節活性を改変することによって安定性又は複製を増強する前記１以上の置換は、ＮＳ１タンパク質中におけるもの、例えば、細胞タンパク質との相互作用を改変し得るＮＳ１における１６７位のプロリンについての置換である。一実施形態において、ＮＳ１における１６７位のプロリンについての置換は、保存的置換である。一実施形態において、ＮＳ１における１６７位のプロリンについての置換は、非保存的置換である。一実施形態において、インフルエンザウイルスの安定性又は複製を増強する前記１以上の置換は、ＨＡタンパク質中におけるもの、例えば、（ＨＡ－２のアルファヘリックス中におけるものである）ＨＡにおける３８０位のスレオニンについての置換である。一実施形態において、ＨＡにおける３８０位のスレオニンについての置換は、保存的置換である。一実施形態において、ＨＡにおける３８０位のスレオニンについての置換は、非保存的置換である。一実施形態において、ＰＡにおける４４３位の残基は、Ｋ又はＨである。一実施形態において、ＰＢ１における７３７位の残基は、Ｈ又はＲである。一実施形態において、ＰＢ２における２５位の残基は、Ａ、Ｌ、Ｔ、Ｉ又はＧである。一実施形態において、ＰＢ２における７１２位の残基は、Ｄである。一実施形態において、ＮＳ１における１６７位の残基は、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ又はＴである。
前記ウイルスは、ワクチンとして、又は、遺伝子送達ベクターとして用いられてもよい。
前記ベクターは、インフルエンザｃＤＮＡ、例えば、インフルエンザＡ型（例えば、１８ＨＡサブタイプ又は１１ＮＡサブタイプのいずれかを含む任意のインフルエンザＡ型遺伝子）、Ｂ型又はＣ型ＤＮＡを含む（具体的に参照により本明細書に組み込まれるＦｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｆｉｅｌｄｓら（編）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＷｉｃｋｅｎｓ（２００６）参照）。
一実施形態において、ウイルスタンパク質における開示された位置及び置換は、任意のインフルエンザウイルス分離株に由来するウイルスセグメントにおいて生じ得るか、又は１以上の開示された位置において特定の残基を有するウイルスセグメントを選択するために用いられ得るが、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ及びＮＳは、配列番号１～６又は１０～１５の内の１つによってコードされるポリペプチドに対する連続アミノ酸配列同一性が８０～９９の任意の整数を含む少なくとも８０％、例えば９０％、９２％、９５％、９７％、９８％又は９９％であるタンパク質をコードする。一実施形態において、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ及びＮＳは、配列番号１～６又は１０～１５の内の１つによってコードされるポリペプチドに対する連続アミノ酸配列同一性が８０～９９の任意の整数を含む少なくとも８０％、例えば９０％、９２％、９５％、９７％、９８％又は９９％であるタンパク質をコードする。一実施形態において、インフルエンザウイルスポリペプチドは、配列番号１～６又は１０～１５の内の１つによってコードされるポリペプチドと比較して、１以上、例えば２、５、１０、１５、２０以上の保存的アミノ酸置換、例えば２、５、１０、１５、２０以上の保存的アミノ酸置換及び非保存的アミノ酸置換の組み合わせの最高１０％又は２０％の保存的置換、例えば残基の最高１０％又は２０％の保存的置換を有し、安定性を提供する本明細書に記載される特徴的な残基を有する。
本開示の組換えインフルエンザウイルスは、１以上のインフルエンザウイルスタンパク質における１以上の安定化突然変異を有する再集合体ウイルス(reassortant virus)などの組換えウイルス内に含まれるためのウイルスセグメントを選択することによって調製されてもよい。例えば、スレオニンではない３８０位における残基を有するＨＡをコードするＨＡウイルスセグメントが選択されてもよく、アルギニンではない４４３位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメントが選択されてもよく、グルタミンではない１８０位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメントが選択されてもよく、スレオニンではない２００位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメントが選択されてもよく、リジンではない７３７位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメントが選択されてもよく、バリンではない１４９位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメントが選択されてもよく、グルタミン酸ではない６８４位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメントが選択されてもよく、アスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメントが選択されてもよく、バリンではない２５位における残基、５４０位におけるアスパラギンでない残基又はグルタミン酸ではない７１２位における残基を有するＰＢ２をコードするＰＢ２ウイルスセグメントが選択されてもよく、プロリンではない１６７位における残基を有するＮＳ１をコードするＮＳウイルスセグメントが選択されてもよく、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。一実施形態において、ＰＡにおける４４３位の残基は、Ｋ又はＨである。一実施形態において、ＰＡにおける１８０位の残基は、Ｒ、Ｋ又はＨである。一実施形態において、ＰＡにおける２００位の残基は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶである。一実施形態において、ＰＢ１における７３７位の残基は、Ｈ又はＲである。一実施形態において、ＰＢ１における１４９位の残基は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｉ又はＬである。一実施形態において、ＰＢ１における６８４位の残基は、Ｄ又はＮである。一実施形態において、ＰＢ１における６８５位の残基は、Ｅ又はＱである。一実施形態において、ＰＢ２における２５位の残基は、Ａ、Ｌ、Ｔ、Ｉ又はＧである。一実施形態において、ＰＢ２における７１２位の残基は、Ｄである。一実施形態において、ＰＢ２における５４０位の残基は、Ｋ、Ｒ又はＨである。一実施形態において、ＮＳ１における１６７位の残基は、Ｓ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ又はＴである。一実施形態において、ＨＡにおける３８０位の残基は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ又はＧである。
一実施形態において、本開示のインフルエンザウイルスは、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＨＡ及び／又はＮＳ１の内の１つ以上における特定の位置において選択されたアミノ酸残基の内の２つ以上を有する組換えインフルエンザウイルスである。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、ＰＡにおける４４３位にリジン若しくはヒスチジン、ＰＢ１における７３７位にヒスチジン若しくはアルギニン、ＰＢ２における２５位にロイシン、イソロイシン、スレオニン、アラニン若しくはグリシン、及び／又はＰＢ２における７１２位にアスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニン、リジン若しくはアスパラギン；ＨＡにおける３８０位にロイシン、アラニン、バリン、イソロイシン若しくはグリシン、又はＮＳ１における１６７位にセリン、システイン、メチオニン、アラニン、バリン、グリシン、イソロイシン若しくはロイシンを有する。
異種遺伝子配列を有する追加のウイルスセグメントを有する本開示の組換えインフルエンザウイルス（「９セグメント」ウイルス）について、前記ウイルスは、安定性及び／又は複製を増強したが、インフルエンザウイルスタンパク質における安定化突然変異の内の１つ以上を有する組換えウイルス内に含まれるためのウイルスセグメントを選択することによって調製されてもよい。例えば、スレオニンではない３８０位における残基を有するＨＡをコードするＨＡウイルスセグメントが選択されてもよく、アルギニンではない４４３位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメントが選択されてもよく、リジンではない７３７位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメントが選択されてもよく、バリンではない２５位における残基又はグルタミン酸ではない７１２位における残基を有するＰＢ２をコードするＰＢ２ウイルスセグメントが選択されてもよく、プロリンではない１６７位における残基を有するＮＳ１を封入するＮＳウイルスセグメントが選択されてもよく、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。前記追加のウイルスセグメントは、天然由来のウイルスセグメントのいずれかから誘導されてもよい。一実施形態において、ＰＡにおける４４３位の残基は、Ｋ又はＨである。一実施形態において、ＰＢ１における７３７位の残基は、Ｈ又はＲである。一実施形態において、ＰＢ２における２５位の残基は、Ａ、Ｌ、Ｔ、Ｉ又はＧである。一実施形態において、ＰＡにおける１８０位の残基は、Ｒ、Ｋ又はＨである。一実施形態において、ＰＡにおける２００位の残基は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶである。一実施形態において、ＰＢ１における１４９位の残基は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｉ又はＬである。一実施形態において、ＰＢ１における６８４位の残基は、Ｄ又はＮである。一実施形態において、ＰＢ１における６８５位の残基は、Ｅ又はＱである。一実施形態において、ＰＢ２における５４０位の残基は、Ｋ、Ｒ又はＨである。一実施形態において、ＰＢ２における７１２位の残基は、Ｄである。一実施形態において、ＮＳ１における１６７位の残基は、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ又はＴである。異種遺伝子配列は、その異種遺伝子配列が、長さが最高で４ｋｂ、４．２ｋｂ、４．５ｋｂ、４．７ｋｂ、５ｋｂ、５．２ｋｂ、５．５ｋｂ、５．７ｋｂ又は６ｋｂのものである長さを有するウイルスセグメントとなる長さのものであってもよい。一実施形態において、追加のウイルスセグメントにおける異種遺伝子は、インフルエンザウイルスタンパク質コード配列を置換する（例えば、ウイルスセグメントの一方の端又は両端における非コード配列におけるキャプシド形成配列に結合するコード配列においてキャプシド形成（組み込み）配列が欠失することなくインフルエンザウイルスコード配列の欠失がある）。一実施形態において、追加のウイルスセグメントにおける異種遺伝子配列には、ゲノム指向性がある。一実施形態において、追加のウイルスセグメントにおける異種遺伝子配列は、Ｎ末端インフルエンザウイルスタンパク質コード配列にインフレームで融合する。一実施形態において、追加のウイルスセグメントにおける異種遺伝子配列は、Ｃ末端インフルエンザウイルスタンパク質コード配列にインフレームで融合する。異種遺伝子は、ＲＮＡ、例えばマイクロＲＮＡ、又はタンパク質、例えば予防的若しくは治療的である遺伝子産物をコードしてもよい。一実施形態において、遺伝子産物は、異なるインフルエンザウイルス分離株に由来する抗原、又は細菌、インフルエンザウイルス以外のウイルス、寄生生物若しくは真菌に由来する抗原である。
安定性及び／又は複製が増強された８つのウイルスセグメントの内の１つにおいて異種遺伝子配列を有する本開示の組換えインフルエンザウイルス（「８セグメント」ウイルス）は、インフルエンザウイルスタンパク質における安定化突然変異の内の１つ以上を有する組換えウイルス内に含まれるためのウイルスセグメントを選択することによって調製されてもよい。例えば、スレオニンではない３８０位における残基を有するＨＡをコードするＨＡウイルスセグメントが選択されてもよく、アルギニンではない４４３位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメントが選択されてもよく、リジンではない７３７位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメントが選択されてもよく、バリンではない２５位における残基又はグルタミン酸ではない７１２位における残基を有するＰＢ２をコードするＰＢ２ウイルスセグメントが選択されてもよく、プロリンではない１６７位における残基を有するＮＳ１を封入するＮＳウイルスセグメントが選択されてもよく、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。一実施形態において、ＰＡにおける４４３位の残基は、Ｋ又はＨである。一実施形態において、ＰＢ１における７３７位の残基は、Ｈ又はＲである。一実施形態において、ＰＢ２における２５位の残基は、Ａ、Ｌ、Ｔ、Ｉ又はＧである。一実施形態において、ＰＢ２における７１２位の残基は、Ｄである。一実施形態において、ＰＡにおける１８０位の残基は、Ｒ、Ｋ又はＨである。一実施形態において、ＰＡにおける２００位の残基は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶである。一実施形態において、ＰＢ１における１４９位の残基は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｉ又はＬである。一実施形態において、ＰＢ１における６８４位の残基は、Ｄ又はＮである。一実施形態において、ＰＢ１における６８５位の残基は、Ｅ又はＱである。一実施形態において、ＰＢ２における５４０位の残基は、Ｋ、Ｒ又はＨである。一実施形態において、ＮＳ１における１６７位の残基は、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ又はＴである。
ウイルスセグメントも欠くインフルエンザウイルスウイルスセグメントの内の１つにおいて異種遺伝子配列を有する本開示の組換えインフルエンザウイルス（「７セグメント」ウイルス）について、前記ウイルスは、安定性及び／又は複製を増強したが、インフルエンザウイルスタンパク質における安定化突然変異の内の１つ以上を有する組換えウイルス内に含まれるためのウイルスセグメントを選択することによって調製されてもよい。例えば、スレオニンではない３８０位における残基を有するＨＡをコードするＨＡウイルスセグメントが選択されてもよく、アルギニンではない４４３位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメントが選択されてもよく、リジンではない７３７位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメントが選択されてもよく、バリンではない２５位における残基又はグルタミン酸ではない７１２位における残基を有するＰＢ２をコードするＰＢ２ウイルスセグメントが選択されてもよく、プロリンではない１６７位における残基を有するＮＳ１を封入するＮＳウイルスセグメントが選択されてもよく、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。除かれるウイルスセグメントは、天然由来のウイルスセグメントのいずれか１つでもあってもよく、場合によりコードされたタンパク質は、途中で提供される。一実施形態において、７セグメントウイルスはＰＡウイルスセグメントを含むか、又はＰＡタンパク質は途中で提供され、ＰＡにおける４４３位の残基は、Ｋ又はＨである。一実施形態において、７セグメントウイルスはＰＢ１ウイルスセグメントを含むか、又はＰＢ１タンパク質は途中で提供され、ＰＢ１における７３７位の残基は、Ｈ又はＲである。一実施形態において、７セグメントウイルスはＰＢ２ウイルスセグメントを含むか、又はＰＢ２タンパク質は途中で提供され、ＰＢ２における２５位の残基は、Ａ、Ｌ、Ｔ、Ｉ又はＧである。一実施形態において、７セグメントウイルスはＰＢ２ウイルスセグメントを含むか、又はＰＢ２タンパク質は途中で提供され、ＰＢ２における７１２位の残基は、Ｄである。一実施形態において、７セグメントウイルスはＰＡウイルスセグメントを含むか、又はＰＡタンパク質は途中で提供され、ＰＡにおける１８０位の残基は、Ｒ、Ｋ又はＨである。一実施形態において、７セグメントウイルスはＰＡウイルスセグメントを含むか、又はＰＡタンパク質は途中で提供され、ＰＡにおける２００位の残基は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶである。一実施形態において、７セグメントウイルスはＰＢ１ウイルスセグメントを含むか、又はＰＢ１タンパク質は途中で提供され、ＰＢ１における１４９位の残基は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｉ又はＬである。一実施形態において、７セグメントウイルスはＰＢ１ウイルスセグメントを含むか、又はＰＢ１タンパク質は途中で提供され、ＰＢ１における６８４位の残基は、Ｄ又はＮである。一実施形態において、７セグメントウイルスはＰＢ１ウイルスセグメントを含むか、又はＰタンパク質は途中で提供され、ＰＢ１における６８５位の残基は、Ｅ又はＱである。一実施形態において、７セグメントウイルスはＰＢ２ウイルスセグメントを含むか、又はＰＢ２タンパク質は途中で提供され、ＰＢ２における５４０位の残基は、Ｋ、Ｒ又はＨである。一実施形態において、７セグメントウイルスはＮＳウイルスセグメントを含むか、又はＮＳ１タンパク質は途中で提供され、ＮＳ１における１６７位の残基は、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ又はＴである。異種遺伝子配列は、その異種遺伝子配列が、長さが最高で４ｋｂ、４．２ｋｂ、４．５ｋｂ、４．７ｋｂ、５ｋｂ、５．２ｋｂ、５．５ｋｂ、５．７ｋｂ又は６ｋｂのものである長さを有するウイルスセグメントとなる長さのものであってもよい。一実施形態において、異種遺伝子は、インフルエンザウイルスタンパク質コード配列を置換する（例えば、ウイルスセグメントの一方の端又は両端における非コード配列におけるキャプシド形成配列に結合するコード配列においてキャプシド形成（組み込み）配列が欠失することなくインフルエンザウイルスコード配列の欠失がある）。一実施形態において、追加のウイルスセグメントにおける異種遺伝子配列には、ゲノム指向性がある。一実施形態において、異種遺伝子配列は、Ｎ末端インフルエンザウイルスタンパク質コード配列にインフレームで融合する。一実施形態において、追加のウイルスセグメントにおける異種遺伝子配列は、Ｃ末端インフルエンザウイルスタンパク質コード配列にインフレームで融合する。異種遺伝子は、ＲＮＡ、例えばマイクロＲＮＡ、又はタンパク質、例えば予防的若しくは治療的である遺伝子産物をコードしてもよい。一実施形態において、遺伝子産物は、異なるインフルエンザウイルス分離株に由来する抗原、又は細菌、インフルエンザウイルス以外のウイルス、寄生生物若しくは真菌に由来する抗原である。
異種遺伝子配列は、任意のウイルスセグメントに挿入されてもよい。異種遺伝子配列は、その異種遺伝子配列が、長さが最高で４ｋｂ、４．２ｋｂ、４．５ｋｂ、４．７ｋｂ、５ｋｂ、５．２ｋｂ、５．５ｋｂ、５．７ｋｂ又は６ｋｂのものである長さを有するウイルスセグメントとなる長さのものであってもよい。一実施形態において、異種遺伝子は、ウイルスセグメントにおける内部インフルエンザウイルス配列を置換する。一実施形態において、異種遺伝子配列の挿入によって、それぞれのインフルエンザウイルス遺伝子産物の「ノックアウト」が生じる可能性があり、そのようなウイルスを調製するために、（１又は複数の）インフルエンザウイルスタンパク質が途中で提供されてその型の突然変異を相補してもよい。一実施形態において、異種遺伝子配列は、ウイルスセグメントにおいてインフルエンザウイルスコード配列に加えたものである。一実施形態において、異種遺伝子配列は、Ｎ末端インフルエンザウイルスタンパク質コード配列にインフレームで融合する。一実施形態において、異種遺伝子は、Ｃ末端インフルエンザウイルスタンパク質コード配列にインフレームで融合する。異種遺伝子は、ＲＮＡ又はタンパク質、例えば予防的又は治療的である遺伝子産物をコードしてもよい。一実施形態において、遺伝子産物は、異なるインフルエンザウイルス分離株に由来する抗原、細菌、インフルエンザウイルス以外のウイルス、寄生生物又は真菌に由来する抗原である。一実施形態において、異種遺伝子配列は、ＮＡウイルスセグメント内にある。一実施形態において、異種遺伝子配列は、ＨＡウイルスセグメント内にある。一実施形態において、異種遺伝子配列は、Ｍウイルスセグメント内にある。一実施形態において、異種遺伝子配列は、ＮＳウイルスセグメント内にある。一実施形態において、異種遺伝子配列は、ＮＰウイルスセグメント内にある、例えば、Ｌｉｕら、２０１２；Ｗａｎｇら、２０１０；Ａｒｉｌｏｒら、２０１０；Ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ Ａｆｏｎｓｏら、２００５参照）。一実施形態において、異種遺伝子配列は、ＰＡウイルスセグメント内にある。一実施形態において、異種遺伝子配列は、ＰＢ１ウイルスセグメント内にある。一実施形態において、異種遺伝子配列は、ＰＢ２ウイルスセグメント内にある。一実施形態において、異種遺伝子配列は、５’又は３’からであるか、ＰＡウイルスセグメントにおけるＰＡコード配列の少なくとも一部を置換するか、又は前記ＰＡコード配列に挿入される。一実施形態において、異種遺伝子配列は、５’又は３’からであるか、ＰＢ１ウイルスセグメントにおけるＰＢ１コード配列の少なくとも一部を置換するか、又は前記ＰＢ１コード配列に挿入される。一実施形態において、異種遺伝子配列は、５’又は３’からであるか、ＰＢ２ウイルスセグメントにおけるＰＢ２コード配列の少なくとも一部を置換するか、又は前記ＰＢ２コード配列に挿入される（例えば、Ａｖｉｌｏｖら、２０１２参照）。一実施形態において、異種遺伝子配列は、５’又は３’からであるか、ＮＳウイルスセグメントにおけるＮＳコード配列の少なくとも一部を置換するか、又は前記ＮＳコード配列に挿入される（Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙら、２０１０）。一実施形態において、異種遺伝子配列は、５’又は３’からであるか、ＮＳウイルスセグメントにおけるＮＳ１コード配列の少なくとも一部を置換するか、又は前記ＮＳ１コード配列に挿入される。一実施形態において、異種遺伝子配列は、５’又は３’からであるか、ＮＳウイルスセグメントにおけるＮＳ２コード配列の少なくとも一部を置換するか、又は前記ＮＳ２コード配列に挿入される。一実施形態において、異種遺伝子配列は、５’又は３’からであるか、ＨＡウイルスセグメントにおけるＨＡコード配列の少なくとも一部を置換するか、又は前記ＨＡコード配列に挿入される。一実施形態において、異種遺伝子配列は、５’又は３’からであるか、ＮＡウイルスセグメントにおけるＮＡコード配列の少なくとも一部を置換するか、又は前記ＮＡコード配列に挿入される（例えば、Ｐｅｒｅｚら、２００４参照）。一実施形態において、異種遺伝子配列は、５’又は３’からであるか、ＭウイルスセグメントにおけるＭ１コード配列の少なくとも一部を置換するか、又は前記Ｍ１コード配列に挿入される。一実施形態において、異種遺伝子配列は、５’又は３’からであるか、ＭウイルスセグメントにおけるＭ２コード配列の少なくとも一部を置換するか、又は前記Ｍ２コード配列に挿入される（例えば、Ｗｅｉら、２０１１参照）。
本開示の組換えウイルスを含むワクチン、例えば生弱毒化ワクチン、又は前記組換えウイルスが低温適応しているワクチン、開示された置換の内の１つ以上を有する１つ以上のウイルスセグメントを含む１つ以上のベクター、並びに前記組換えウイルスを作製し、使用する方法が、さらに提供される。一実施形態において、ｖＲＮＡ産生のためのベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモータ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ、Ｔ３プロモータ又はＴ７プロモータなどのプロモータを含む。
選択されたトリ宿主又は哺乳類宿主における改変された特性、例えば増強された複製又は安定性を有するインフルエンザウイルスを作製するための方法も提供される。前記方法は、個別の宿主生物におけるインフルエンザウイルスの分離株の継代を連続的に行うことと、改変された特性を有する個別のウイルスを同定し、場合により個別のウイルスを分子的に特性決定することとを含む。
一組の組換えインフルエンザウイルスであって、前記一組の各要素が明瞭な光学的に検出可能なマーカーをコードし、例えば、オープンリーディングフレームがインフルエンザウイルスタンパク質のオープンリーディングフレームに融合するか、オープンリーディングフレームがインフルエンザＡ型ウイルス若しくはインフルエンザＢ型ウイルスに対する第９ウイルスセグメント上にあるか、又はオープンリーディングフレームがウイルスタンパク質コード領域の内の１つの少なくとも一部を置換する、一組の組換えインフルエンザウイルスがさらに提供される。例えば、前記要素の内の１つは、発光タンパク質遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質遺伝子、黄色蛍光タンパク質遺伝子若しくは赤色蛍光タンパク質遺伝子、アエクオリン発光タンパク質遺伝子若しくはオベリン発光タンパク質遺伝子などの発光タンパク質遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃａｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ）、アルカリ性ホスファターゼ遺伝子などのホスファターゼ遺伝子、ホースラディッシュペルオキシダーゼ遺伝子などのペルオキシダーゼ遺伝子、ベータ－ガラクトシダーゼ遺伝子、ベータ－ラクタマーゼ遺伝子又はベータ－グルクロニダーゼ遺伝子を含む。
マウスにおけるマウス適応Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の特性。１群当たり４匹のＢ６マウスにＷＴ－ＰＲ８、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８又はＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を鼻腔内接種した。マウスの体重及び生存率を１４日間モニタした。 マウスにおけるマウス適応Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の特性。１群当たり４匹のＢ６マウスにＷＴ－ＰＲ８、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８又はＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を鼻腔内接種した。マウスの体重及び生存率を１４日間モニタした。 マウスにおけるマウス適応Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の特性。１群当たり４匹のＢ６マウスにＷＴ－ＰＲ８、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８又はＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を鼻腔内接種した。マウスの体重及び生存率を１４日間モニタした。 マウスにおけるマウス適応Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の特性。１群当たり４匹のＢ６マウスにＷＴ－ＰＲ８、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８又はＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を鼻腔内接種した。マウスの体重及び生存率を１４日間モニタした。 マウスにおけるマウス適応Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の特性。１群当たり４匹のＢ６マウスにＷＴ－ＰＲ８、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８又はＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を鼻腔内接種した。マウスの体重及び生存率を１４日間モニタした。 マウスにおけるマウス適応Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の特性。１群当たり４匹のＢ６マウスにＷＴ－ＰＲ８、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８又はＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を鼻腔内接種した。マウスの体重及び生存率を１４日間モニタした。 マウスにおけるマウス適応Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の特性。１０4ＰＦＵのＰＲ８又はＭＡ－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８に感染させた動物（１群当たり３匹のマウス）の肺を感染後のＤａｙ３、Ｄａｙ５及びＤａｙ７に採取した。ＭＤＣＫ細胞におけるプラークアッセイを用いることによってウイルス力価を分析した。 肺における色－インフルエンザウイルスの分布。（Ａ）色－インフルエンザウイルス（１０5ＰＦＵのＭＡ－ｅＣＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＰＲ８）による感染後のＤａｙ３及びＤａｙ５にＢ６マウスから肺組織を採取した。終止コドンを有さないＮＳ１遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、タンパク質リンカーＧＳＧＧをコードする配列を介して蛍光レポータ遺伝子（Ｖｅｎｕｓ、ｅＣＦＰ、ｅＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ）のＮ末端と融合させた。蛍光遺伝子の後に、ＧＳＧリンカーをコードする配列、ブタテシオウイルス－１に由来する５７個のヌクレオチドを有する口蹄病ウイルスプロテアーゼ２Ａ自己タンパク質分解部位（autoproteolytic site）、ＮＥＰのＯＲＦが続く。加えて、ＮＳ１ ＯＲＦの内因性スプライス受容部位にサイレント突然変異を導入して、スプライシングを防止した。蛍光立体顕微鏡を用いて透明肺組織の全載標本画像を得た。（Ｂ、Ｃ）ＭＡ－ｅＣＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＰＲ８の混合物（１株当たり２．５×１０4ＰＦＵ）をＢ６マウスに鼻腔内接種した。スケールバーは５ｍｍである。（Ｂ）ＩｎＦｏｒｍソフトウェアを有するＮｕａｎｃｅ ＦＸ多スペクトル感応性イメージングシステムを有する倒立蛍光顕微鏡を使用することによって、感染後のＤａｙ２及びＤａｙ５における肺の切片を分析した。スケールバーは１００μｍである。（Ｃ）（Ｂ）における示された領域の拡大画像を混合せず、自己蛍光（ＡＦ）、ｅＣＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ及びｍＣｈｅｒｒｙ蛍光に分離した。結合画像における矢印は、色－インフルエンザウイルスの異なる色彩変異体に感染させた細胞を示す。 マクロファージ浸潤の分析。ＰＢＳ接種マウス（模擬）又は１０5ＰＦＵのＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８に感染させたマウスから肺組織を感染後のＤａｙ２において採取し、組織を固定し、組織学的分析のために前記組織のプロセッシングを行った。切片をＰＥ－抗－Ｍａｃ３抗体でインキュベートし、マクロファージ（赤色）を検出し、ヘキスト染料（青色）で対比染色剤による着色を行って核を視覚化した。Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光シグナルは、緑色で示される。スケールバーは２００μｍを示す。 マクロファージ浸潤の分析。ＰＢＳ接種マウス（模擬）又は１０5ＰＦＵのＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８に感染させたマウスから肺組織を感染後のＤａｙ２において採取し、組織を固定し、組織学的分析のために前記組織のプロセッシングを行った。切片をＰＥ－抗－Ｍａｃ３抗体でインキュベートし、マクロファージ（赤色）を検出し、ヘキスト染料（青色）で対比染色剤による着色を行って核を視覚化した。Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光シグナルは、緑色で示される。スケールバーは２００μｍを示す。 マクロファージ浸潤の分析。ＰＢＳ接種マウス（模擬）又は１０5ＰＦＵのＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８に感染させたマウスから肺組織を感染後のＤａｙ２において採取し、組織を固定し、組織学的分析のために前記組織のプロセッシングを行った。切片をＰＥ－抗－Ｍａｃ３抗体でインキュベートし、マクロファージ（赤色）を検出し、ヘキスト染料（青色）で対比染色剤による着色を行って核を視覚化した。Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光シグナルは、緑色で示される。スケールバーは２００μｍを示す。 マクロファージ浸潤の分析。ＰＢＳ接種マウス（模擬）又は１０5ＰＦＵのＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８に感染させたマウスから肺組織を感染後のＤａｙ２において採取し、組織を固定し、組織学的分析のために前記組織のプロセッシングを行った。切片をＰＥ－抗－Ｍａｃ３抗体でインキュベートし、マクロファージ（赤色）を検出し、ヘキスト染料（青色）で対比染色剤による着色を行って核を視覚化した。Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光シグナルは、緑色で示される。スケールバーは２００μｍを示す。 マクロファージ浸潤の分析。ウイルス感染細胞及び肺マクロファージの間の相互作用のキネティクス。二光子顕微鏡を用いて、未処置Ｂ６マウス（左上のパネル）及び１０5ＰＦＵのＭＡ－ｅＧＦＰ－ＰＲ８による感染後のＤａｙ３におけるＢ６マウス（右上のパネル）に由来する肺組織におけるｅＧＦＰ陽性細胞（緑色）及びＣＤ１１ｂ＋マクロファージ（赤色）の画像を得た。下側のパネル（１～４）における連続的な画像は、右上のパネルにおける箱の拡大図を示す。矢印の先は、ｅＧＦＰ陽性細胞の小疱形成を示す。スケールバーは４０μｍである。 マクロファージ浸潤の分析。ウイルス感染細胞及び肺マクロファージの間の相互作用のキネティクス。二光子顕微鏡を用いて、未処置Ｂ６マウス（左上のパネル）及び１０5ＰＦＵのＭＡ－ｅＧＦＰ－ＰＲ８による感染後のＤａｙ３におけるＢ６マウス（右上のパネル）に由来する肺組織におけるｅＧＦＰ陽性細胞（緑色）及びＣＤ１１ｂ＋マクロファージ（赤色）の画像を得た。下側のパネル（１～４）における連続的な画像は、右上のパネルにおける箱の拡大図を示す。矢印の先は、ｅＧＦＰ陽性細胞の小疱形成を示す。スケールバーは４０μｍである。 マクロファージ浸潤の分析。ウイルス感染細胞及び肺マクロファージの間の相互作用のキネティクス。二光子顕微鏡を用いて、未処置Ｂ６マウス（左上のパネル）及び１０5ＰＦＵのＭＡ－ｅＧＦＰ－ＰＲ８による感染後のＤａｙ３におけるＢ６マウス（右上のパネル）に由来する肺組織におけるｅＧＦＰ陽性細胞（緑色）及びＣＤ１１ｂ＋マクロファージ（赤色）の画像を得た。下側のパネル（１～４）における連続的な画像は、右上のパネルにおける箱の拡大図を示す。矢印の先は、ｅＧＦＰ陽性細胞の小疱形成を示す。スケールバーは４０μｍである。 マクロファージ浸潤の分析。ウイルス感染細胞及び肺マクロファージの間の相互作用のキネティクス。二光子顕微鏡を用いて、未処置Ｂ６マウス（左上のパネル）及び１０5ＰＦＵのＭＡ－ｅＧＦＰ－ＰＲ８による感染後のＤａｙ３におけるＢ６マウス（右上のパネル）に由来する肺組織におけるｅＧＦＰ陽性細胞（緑色）及びＣＤ１１ｂ＋マクロファージ（赤色）の画像を得た。下側のパネル（１～４）における連続的な画像は、右上のパネルにおける箱の拡大図を示す。矢印の先は、ｅＧＦＰ陽性細胞の小疱形成を示す。スケールバーは４０μｍである。 マクロファージ浸潤の分析。インフルエンザウイルスによるマクロファージの感染。ＰＢＳ接種（模擬）マウス又は１０5ＰＦＵのＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８に感染させたマウスの肺から感染後のＤａｙ３において単細胞懸濁液を得て、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ及びＦ４／８０に対する抗体で染色し、フローサイトメトリによって分析した。前記パネルは、Ｆ４／８０発現レベル及びＣＤ４５発現レベルにおいてゲート付けされる細胞からのＣＤ１１ｂ染色プロファイルに対するＶｅｎｕｓ発現を示す。 マクロファージ浸潤の分析。遺伝子発現分析。ＰＢＳ接種（未処置）マウスのソートされたマクロファージから、並びに１０5ＰＦＵのＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８が接種されたマウスのソートされたＶｅｎｕｓ陽性（Ｖｅｎｕｓ（＋））マクロファージ及びＶｅｎｕｓ陰性（Ｖｅｎｕｓ（－））マクロファージから、感染後のＤａｙ３においてトータルＲＮＡを分離し（１回の処置につき９匹のマウス）、マイクロアレイ分析を行った。未処置マクロファージにおける遺伝子発現レベルを感染マウスに由来するＶｅｎｕｓ（＋）マクロファージにおける遺伝子発現レベルと比較することによって差次的発現（ＤＥ）転写物を同定した。同様に、未処置マクロファージ及び感染マウスから得られたＶｅｎｕｓ（－）マクロファージについて遺伝子発現レベルを比較した。階層的クラスタリングによってＤＥ転写物を組織化し、増強された生物学的機能について各クラスタを分析した。各状態についてのクラスタ形成転写物のヒートマップが示され（色キーはパネルの最上部に示される）、異なるクラスタは、ヒートマップで左の色バーで示される。各クラスタについての強化注釈は、括弧の各注釈についての強化スコアと共に各クラスタの左側に列挙される。ヒートマップにおける青線は、Ｖｅｎｕｓ（＋）マクロファージとＶｅｎｕｓ（－）マクロファージとを比較した場合におけるＤＥ転写物の変化倍数を示す。左への青線のシフトは、Ｖｅｎｕｓ（＋）マクロファージにおいてＤＥ転写物がより高く発現していることを示し、右へのシフトは、Ｖｅｎｕｓ（－）マクロファージにおいてＤＥ転写物がより高く発現していることを示す。 マクロファージ浸潤の分析。このパネルは、Ｖｅｎｕｓ（＋）マクロファージ及びＶｅｎｕｓ（－）マクロファージの間におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現レベルを比較するヒートマップを示す。色キーは、パネルの最下部に示される。ＮＳは、感染動物に由来するＶｅｎｕｓ（－）細胞と感染させていない動物に由来する未処置マクロファージとの間における統計学的に有意でなかった比較を示す。 ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＨＰＡＩウイルスの特性決定。（Ａ）１群当たり４匹のＢ６マウスにＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＨＰＡＩウイルスを鼻腔内接種した。マウスの体重及び生存率を１４日間モニタした。（Ｂ）１０5ＰＦＵのＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＨＰＡＩウイルスによる感染後のＤａｙ３においてＢ６マウスから肺、脾臓、腎臓及び脳を採取した。ＭＤＣＫ細胞におけるプラークアッセイを用いることによって組織ホモジェネートのウイルス力価を決定した。各データポイントは、平均±標準偏差を表す（ｎ＝３）。（Ｃ、Ｄ）１０5ＰＦＵのＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＨＰＡＩウイルス及びＰＲ８による感染後のＤａｙ１及びＤａｙ２においてＢ６マウスから肺組織を採取した。二光子顕微鏡によって透明肺組織の画像（気管支（赤色）；肺胞（緑色））を得た。各データポイントは、平均±標準偏差を表す（ｎ＝３）。統計的有意性は、スチューデントのｔ検定を用いて算出された。（Ｄ）透明肺組織の３Ｄ画像を用いてＶｅｎｕｓ陽性気管支及び肺胞領域の容積分析によってＶｅｎｕｓ陽性細胞の分布を評価した。（Ｅ）１０5ＰＦＵのＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８又はＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＨＰＡＩウイルスによる感染後のＤａｙ１、Ｄａｙ２、Ｄａｙ３及びＤａｙ４において細胞をＢ６マウスの肺から回収し、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ及びＦ４／８０について染色した。ＣＤ４５陰性細胞におけるＶｅｎｕｓ発現、及びＣＤ４５陽性細胞においてゲート付けされるＶｅｎｕｓ対Ｆ４／８０染色プロファイルをフローサイトメトリによって分析した。感染後のＤａｙ２における代表的データプロットフォームをＶｅｎｕｓ陽性細胞の割合と共に示す。 各種ウイルスのウイルス収率。 マウスにおけるＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス及びＲＧ－ＭＡウイルスの毒性。１０1～１０5ＰＦＵの用量でＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス又は１０0～１０5ＰＦＵの用量でＲＧ－ＭＡウイルスを４匹のマウスの群に鼻腔内感染させ、それらの体重変化（Ａ－Ｃ）及び生存率（Ｂ－Ｄ）を２週間モニタした。 ＭＤＣＫ細胞における各種Ｈ５Ｎ１ウイルスのＶｅｎｕｓ発現。ＭＤＣＫ細胞にＶｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１関連ウイルスを感染させ、２４ｈｐｉにおいて蛍光顕微鏡検査法（Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１、Ｚｅｉｓｓ）を用いることによって各ウイルスプラークのＶｅｎｕｓ発現を観察した。各ウイルスの代表的画像が示される。 マウス肺における各種Ｈ５Ｎ１ウイルスのＶｅｎｕｓ発現。３匹のマウスの群に１０5ＰＦＵ（５０μＬ）のウイルスを鼻腔内感染させた。感染後のＤａｙ２に前記マウスを安楽死させ、それらの肺を回収し、４％ＰＦＡ中に固定し、次いでＯ．Ｃ．Ｔ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ内に包埋した。凍結組織を５μｍスライスに切断し、次いでヘキスト３３３４２で染色した。Ｎｉｋｏｎ共焦点顕微鏡システムＡ１+を用いることによってＶｅｎｕｓ信号を検出した。青色は、ヘキスト３３３４２によって染色された核を表し、緑色は、Ｖｅｎｕｓ発現を表す。 マウスにおけるＶｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１関連再集合体の遺伝子型及びそれらの毒性。色は、ウイルスセグメントの起源を示す（青色：ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス；赤色：ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス）。ＭＬＤ50値を、５０μＬの体積中に１０0～１０5ＰＦＵのウイルスを含む１０倍の系列希釈物を４匹のマウスの群に接種することによって決定し、Ｒｅｅｄ及びＭｕｅｎｃｈ（３０）の方法を用いることによって算出した。 ＭＤＣＫ細胞における再集合体の成長キネティクス。ＭＤＣＫ細胞に０．０００１のＭＯＩでウイルスを感染させ、示された時間において培養上清を回収し、次いでＭＤＣＫ細胞において滴定した。報告された値は、２つの独立した実験からの平均±標準偏差（ＳＤ）である。＊＊、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス感染細胞と比較したＰ＜０．０１。 ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス及びＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスから誘導される異なるＲＮＰの組み合わせのポリメラーゼ活性。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス又はＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスのいずれかに由来するＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＰを発現するプラスミドと共にルシフェラーゼレポータプラスミド及び内部対照プラスミドを有する三つ組で２９３個の細胞をトランスフェクトした。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスから誘導されるセグメントは白色で示されるが、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスから誘導されるセグメントは緑色で示される。細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、細胞溶解物を分析してホタルルシフェラーゼ活性及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。示された値は、３つの独立した実験の平均±ＳＤであり、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１の活性（１００％）に標準化される。＊、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスと比較したＰ＜０．０５。＊＊、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスと比較したＰ＜０．０１。 Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１関連再集合体のＶｅｎｕｓ－ＮＳセグメント及び欠失ＮＳセグメント。ＭＤＣＫ細胞においてウイルスの継代を５回行い、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いることによって５回目の継代に由来するｖＲＮＡを抽出した。次いで、ＮＳ特異的プライマーによるＰＣＲを用いることによってそれぞれのＮＳセグメントを増幅し、アガロースゲル上を泳動させた。レーン１、ＷＴ＋ＭＡ－ＮＳ；レーン２、ＷＴ＋ＭＡ－Ｍ；レーン３、ＷＴ＋ＭＡ－ＮＡ；レーン４、ＷＴ＋ＭＡ－ＰＡ；レーン５、ＷＴ＋ＭＡ－ＰＢ１；レーン６、ＷＴ＋ＭＡ－ＰＢ２；レーン７、ＷＴ＋ＭＡ－（ＰＢ２＋ＰＡ）；レーン８、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１；レーン９、ＲＧ－ＭＡ；レーン１０、ＰＲ８；レーン１１、１－ｋｂ ＤＮＡマーカー。 欠失ウイルスの概略図。 マウス肺におけるＶｅｎｕｓ再集合体の高発現。 ＭＤＣＫ細胞における突然変異体ウイルスの成長能力の比較。ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスにおいて認められるアミノ酸置換を有するＰＲ８ウイルス、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルス、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルス及び突然変異体ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスをＭＤＣＫ細胞に０．００１のＭＯＩで感染させた。プラークアッセイによってウイルス力価を１２時間毎に決定した。結果は、平均力価（ｌｏｇ10［ＰＦＵ／ｍＬ］）±標準偏差として表される。 Ｖｅｎｕｓを担持するウイルスに感染させたマウスについての体重変化及び生存率。１群当たり４匹のマウスに１０3ＰＦＵ、１０4ＰＦＵ及び１０5ＰＦＵの各ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスを鼻腔内感染させた。体重を測定し、生存率を感染後１４日間モニタした。 マウス肺におけるウイルス力価。１群当たり９匹のマウスに１０3ＰＦＵのＰＲ８を鼻腔内感染させた。１群当たり３匹のマウスを感染後のＤａｙ３、Ｄａｙ５及びＤａｙ７に安楽死させ、それらの肺を回収してウイルス力価を決定した。ウイルス力価は、プラークアッセイによって決定された。結果は、力価（ｌｏｇ10ＰＦＵ／ｇ）±標準偏差の平均として表される。テューキー・クレーマー法を用いることによって統計的有意性を算出した。アスタリスクは、ＰＲ８ウイルス又はＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＷＴウイルスを感染させたマウスから得られた力価との有意差を示す（Ｐ＜０．０５）。ＮＤ：検出せず（検出限界、５ＰＦＵ／肺）。 マウス肺におけるウイルス力価。１群当たり９匹のマウスにそれぞれのＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスを鼻腔内感染させた。１群当たり３匹のマウスを感染後のＤａｙ３、Ｄａｙ５及びＤａｙ７に安楽死させ、それらの肺を回収してウイルス力価を決定した。ウイルス力価は、プラークアッセイによって決定された。結果は、力価（ｌｏｇ10ＰＦＵ／ｇ）±標準偏差の平均として表される。テューキー・クレーマー法を用いることによって統計的有意性を算出した。アスタリスクは、ＰＲ８ウイルス又はＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＷＴウイルスを感染させたマウスから得られた力価との有意差を示す（Ｐ＜０．０５）。ＮＤ：検出せず（検出限界、５ＰＦＵ／肺）。 インビトロ及びインビボにおけるＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスによるＶｅｎｕｓ発現の安定性。ＭＤＣＫ細胞及びマウス肺においてＶｅｎｕｓ発現の陽性率を検討した。左側のパネル：ＭＤＣＫ細胞にＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスを０．００１のＭＯＩで感染させ、２４時間毎に上清を回収した。Ｖｅｎｕｓを発現したプラークの数をプラークの総数で割ることによってＶｅｎｕｓ発現の陽性率を推定した。中央のパネル：ＭＤＣＫ細胞においてＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスの継代を連続的に５回行い、Ｖｅｎｕｓ発現の陽性率を推定した。右側のパネル：９匹のマウスに１０3ＰＦＵのＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスを感染させた。各時点で３匹のマウスを安楽死させ、肺ホモジェネートを用いてプラークアッセイを行った。Ｖｅｎｕｓ発現の陽性率を上記のように推定した。 各ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスを感染させた細胞におけるＶｅｎｕｓ発現の比較。各ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスを感染させた細胞におけるＶｅｎｕｓタンパク質発現をウエスタンブロット法によって検出した。ＭＤＣＫ細胞に１のＭＯＩで各ウイルスを感染させた。感染の１２時間後にウイルス感染細胞を溶解させ、ウエスタンブロット法を行った。抗ＧＦＰ抗体を用いてＶｅｎｕｓタンパク質を検出し、対照としてＭ１タンパク質を検出した。約２７ｋＤａにおいて認められるバンドをＭ１パネルに示した。２つの独立した実験の代表的結果を示す。 各ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスを感染させた細胞におけるＶｅｎｕｓ発現の比較。各ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスを感染させた細胞におけるＶｅｎｕｓタンパク質発現をウエスタンブロット法によって検出した。ＭＤＣＫ細胞に１のＭＯＩで各ウイルスを感染させた。感染の１２時間後にウイルス感染細胞を溶解させ、ウエスタンブロット法を行った。抗ＧＦＰ抗体を用いてＶｅｎｕｓタンパク質を検出し、対照としてＭ１タンパク質を検出した。約２７ｋＤａにおいて認められるバンドをＭ１パネルに示した。２つの独立した実験の代表的結果を示す。 各ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスを感染させた細胞におけるＶｅｎｕｓ発現の比較。共焦点顕微鏡法を用いることによるＶｅｎｕｓ発現の観測。ＭＤＣＫ細胞に１のＭＯＩで各ウイルスを感染させた。感染の１２時間後、細胞を固定し、Ｖｅｎｕｓ発現を観察した。２つの独立した実験の代表的結果を示す。示されたウイルスを用いてＭＤＣＫ細胞に感染させ（１のＭＯＩ）、１２時間後に共焦点顕微鏡法を行った。 各ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスを感染させた細胞におけるＶｅｎｕｓ発現の比較。共焦点顕微鏡法を用いることによるＶｅｎｕｓ発現の観測。ＭＤＣＫ細胞に１のＭＯＩで各ウイルスを感染させた。感染の１２時間後、細胞を固定し、Ｖｅｎｕｓ発現を観察した。２つの独立した実験の代表的結果を示す。示されたウイルスを用いてＭＤＣＫ細胞に感染させ（１のＭＯＩ）、１２時間後に共焦点顕微鏡法を行った。 各ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスを感染させた細胞におけるＶｅｎｕｓ発現の比較。共焦点顕微鏡法を用いることによるＶｅｎｕｓ発現の観測。ＭＤＣＫ細胞に１のＭＯＩで各ウイルスを感染させた。感染の１２時間後、細胞を固定し、Ｖｅｎｕｓ発現を観察した。２つの独立した実験の代表的結果を示す。示されたウイルスを用いてＭＤＣＫ細胞に感染させ（１のＭＯＩ）、１２時間後に共焦点顕微鏡法を行った。 各ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスを感染させた細胞におけるＶｅｎｕｓ発現の比較。共焦点顕微鏡法を用いることによるＶｅｎｕｓ発現の観測。ＭＤＣＫ細胞に１のＭＯＩで各ウイルスを感染させた。感染の１２時間後、細胞を固定し、Ｖｅｎｕｓ発現を観察した。２つの独立した実験の代表的結果を示す。示されたウイルスを用いてＭＤＣＫ細胞に感染させ（１のＭＯＩ）、１２時間後に共焦点顕微鏡法を行った。 各ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスを感染させた細胞におけるＶｅｎｕｓ発現の比較。ｖＲＮＡコードホタルルシフェラーゼを発現するプラスミドと共に、ＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１及びＰＢ２又はＰＢ－２－Ｅ７１２Ｄについてのウイルスタンパク質発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に感染させた。 低ｐＨ緩衝剤に対する曝露後に野生型ＰＲ８又はＨＡ－Ｔ３８０Ａ突然変異を有するＰＲ８を感染させたＨＥＫ２９３細胞による多核細胞形成。５．５～５．９のｐＨ範囲で膜融合についての閾値を検討した。ＨＥＫ２９３細胞にＰＲ８又はＨＡ－Ｔ３８０Ａ置換を有するＰＲ８を感染させた。感染の１８時間後、細胞表面上のＨＡをＴＰＣＫ－トリプシンで消化し、示されたｐＨ緩衝剤に対する曝露を行った。メタノールによる固定後、ギムザ溶液で前記細胞を染色した。代表的写真を示す。 透明肺におけるＶｅｎｕｓ発現細胞の時間経過観察。全肺葉におけるＶｅｎｕｓ発現細胞を観察した。１群当たりの３匹のマウスにＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡ（Ａ～Ｆ）ウイルス、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴ（Ｇ、Ｈ）ウイルス又はＰＲ８（Ｉ、Ｊ）ウイルスを鼻腔内感染させ、示された日に肺を回収した。模擬処置肺を陰性対照（Ｋ、Ｌ）とした。より深くＶｅｎｕｓ発現細胞を撮像するために、試料を透明にするＳＣＡＬＥＶＩＥＷ Ａ２で肺試料を処置し、各葉に分離し、立体蛍光顕微鏡を用いることによって観察した。全肺葉（無処置）を撮像した後、試料を切開して気管支を曝露した（切断）。ＰＲ８ウイルス又はＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルスに感染させたマウスに由来する試料を感染後Ｄａｙ３に調製して、感染中にＶｅｎｕｓ信号が最も明るかったＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルス感染肺と比較した。代表的画像を示す。 肺におけるＣＣ１０+細胞及びＳＰ－Ｃ+細胞におけるＶｅｎｕｓ発現の分析。ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスに感染させたマウスに由来する肺切片を肺における上皮細胞に対して特異的ないくつかの抗体で染色した。１０4ＰＦＵのＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスをマウスに感染させ、感染の３日後及び５日後に肺を回収した。（Ａ）ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスを感染させたマウスの肺切片を感染の３日後に調製し、抗ＣＣ１０ポリクローナル抗体（赤色）で染色した。スケールバー：１００μｍ。（Ｂ）ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスに感染させたマウスの肺切片を感染の５日後に調製し、抗ＳＰ－Ｃポリクローナル抗体（シアン色）及び抗ポドプラニン（Ｐｄｐｎ）ポリクローナル抗体（赤色）で染色した。肺胞部位におけるＶｅｎｕｓ陽性細胞は、ＳＰ－Ｃ陽性細胞（白色の矢印の先）及びポドプラニン陽性細胞（白色の矢印）を含んだ。スケールバー：５０μｍ。 特異的細胞型の肺におけるＶｅｎｕｓ陽性細胞のフローサイトメトリ分析。示された細胞型におけるＶｅｎｕｓ陽性細胞を、フローサイトメトリを用いることによって分析した。１０5ＰＦＵのＰＲ８ウイルス又はＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスをマウスに感染させ、感染後３日後及び５日後に肺を回収した。単細胞懸濁液を抗体で染色した。（Ａ）ＰＢＳが接種されたマウスの肺に由来するＣＤ４５+生細胞についての代表的ドットプロットを示す。（Ｂ、Ｃ）示された時点における各特異的細胞種の総数を示す。結果は、肺１つ当たりの平均細胞数±標準偏差として表される。単球及び肺胞マクロファージについて、ＣＤ４５+及びバイア－プローブ-細胞を分析した。（Ｄ、Ｅ）示された時点におけるＡ及びＢにおいて規定された細胞におけるＶｅｎｕｓ陽性細胞の数を示す。結果は、平均細胞数±標準偏差として表される。ＡＭ：肺胞マクロファージ。 Ｆ４／８０+集団におけるＶｅｎｕｓ陽性細胞及びＶｅｎｕｓ陰性細胞を回収するための選別戦略。１０5ＰＦＵのＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスをマウスに感染させ、感染の３日後に肺を回収した。単細胞懸濁液を一組の抗体で染色した。ＰＢＳを接種したマウスに由来する肺を同様に染色して肺胞マクロファージの自己蛍光を確認した。（Ａ）ＣＤ４５+、バイア－プローブ－Ｆ４／８０+細胞の集団におけるＶｅｎｕｓ陽性細胞及びＶｅｎｕｓ陰性細胞を回収するためのゲーティング戦略を示す代表的ドットプロット。Ｖｅｎｕｓ陽性ゲートは、肺胞マクロファージを含まないことを示した。（Ｂ）ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスに感染させたマウスの肺から回収されたＶｅｎｕｓ陽性細胞及びＶｅｎｕｓ陰性細胞を、免疫蛍光アッセイを用いることによって観察した。 Ｖｅｎｕｓ陽性Ｆ４／８０+細胞及びＶｅｎｕｓ陰性Ｆ４／８０+細胞の間で差次的に発現した遺伝子。１０5ＰＦＵのＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスをマウスに感染させ、感染の３日後に肺を回収した。図１０に記載されているものと同じ方法で単細胞懸濁液を染色した。Ｖｅｎｕｓ陽性細胞及びＶｅｎｕｓ陰性細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩを用いることによって別々に採取し、マイクロアレイ分析に供した。ＰＢＳを接種したマウスの肺から分離されたＦ４／８０+細胞を対照として用いた。（Ａ）スチューデントのｔ検定（Ｐ＜０．０５）によって、且つ、ＰＢＳ群のレベルから発現が少なくとも２．０倍変化した遺伝子からＶｅｎｕｓ陽性群及びＶｅｎｕｓ陰性群の間で発現が少なくとも４．０倍変化した遺伝子を選別することによって、合計６３３個の遺伝子を選択した。（Ｂ）これらの選択された遺伝子を、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）組分けを用いることによって機能的に注釈をつけた。統計的有意性は、フィッシャーの正確検定（Ｐ＜０．０１）を用いることによって決定された。（Ｃ）Ｖｅｎｕｓ陽性Ｆ４／８０+細胞及びＶｅｎｕｓ陰性Ｆ４／８０+細胞の間で有意に差次的に発現した遺伝子によって強化される「サイトカイン活性」において注釈をつけた遺伝子の階層的分析。（Ｄ）Ｖｅｎｕｓ陽性Ｆ４／８０+細胞及びＶｅｎｕｓ陰性Ｆ４／８０+細胞の間で有意に差次的に発現した遺伝子によって強化される「創傷に対する応答」において注釈をつけた遺伝子の階層的分析。 ＰＲ８ＨＧ、及びＰＲ８のＣａｍｂｒｉｄｇｅ株についての例示的な親配列（配列番号１～１９）。 異種タンパク質を含む融合タンパク質の概略図。 複合体の構造上にマッピングされた異種遺伝子産物を安定化するポリメラーゼ複合体タンパク質における突然変異の概略図（ＰＤＢ ＩＤ：４ＷＳＢ）。 Ａ）ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８に含まれる８つのウイルスＲＮＡセグメントの概略的構造。２Ａ：プロテアーゼ２Ａ自己タンパク質分解部位。（Ｂ）ＭＤＣＫ細胞において各ウイルスの継代を行った。蛍光顕微鏡検査を用いることによって、異なる継代に由来するウイルスストックにおけるＶｅｎｕｓ発現プラークの割合をＭＤＣＫ細胞において決定した。（Ｃ）ＭＤＣＫ細胞におけるプラークアッセイを用いることによって、異なる継代に由来するウイルスストックを滴定した。 突然変異率に対するＰＢ２－Ｅ７１２Ｄの効果。（Ａ）ＭＤＣＫ細胞において各ウイルスの継代を５回行い、継代の間に各セグメントに導入される突然変異を計数した。（Ｂ）各セグメントにおけるヌクレオチド１つ当たりの突然変異の数を算出し、全ての８つのセグメントについての平均値を示す。 感染細胞におけるＲＮＡ及びタンパク質発現。（Ａ～Ｃ）ＭＤＣＫ細胞に１のＭＯＩで各ウイルスを感染させた。ＩＦＮ－βｍＲＮＡ（Ａ）、ＮＳ ｖＲＮＡ（Ｂ）及びＮＰ ｖＲＮＡ（Ｃ）の相対発現レベルを感染の９時間後における定量的リアルタイムＰＣＲによって決定した。（Ｄ）ＮＳ ｖＲＮＡ／ＮＰ ｖＲＮＡ比を算出した。（Ｅ）ＭＤＣＫ細胞に１のＭＯＩでＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８（ＷＴ）又はＶｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ（７１２）を感染させた。示された時点において細胞を溶解し、ウエスタンブロット法によってＮＳ１、ＮＰ及びβ－アクチンの発現を検出した。（Ｆ）ウエスタンブロット法のバンド強度に基づいてＮＳ１／ＮＰ比を決定した。Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ－感染細胞における各値を１とする３回の実験の平均±標準偏差をパネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＦに示す。＊＊、Ｐ＜０．０１；ｎｓ、有意でない（スチューデントｔ検定）；ｈｐｉ、感染後時間。 ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８におけるＮＳセグメントで内部欠失が生じた。（Ａ）ＭＤＣＫ細胞における連続的継代後のＶｅｎｕｓ発現を喪失したＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８ウイルスにおけるＮＳセグメントの概略配列。選択された例を示す。（Ｂ）同時感染実験についての手法を示す。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８のＮＳセグメントの３’領域又は５’領域に同義突然変異を導入した。次いで前記ウイルスを用いてＭＤＣＫ細胞を同時感染させた。Ｖｅｎｕｓを発現していないウイルスは、精製されたプラークであり、それらのＮＳセグメントの配列を分析した。（Ｃ）同時感染実験の後に得られたＶｅｎｕｓ陰性ウイルスのＮＳセグメントの配列の例。赤色の「Ｘ」は、導入された同義突然変異を示す。 ＮＳセグメントに挿入されるＶｅｎｕｓ遺伝子を安定化する付加的な突然変異。（Ａ）同定されたアミノ酸突然変異をインフルエンザポリメラーゼ複合体上にマッピングした（ＰＤＢ ＩＤ ４ＷＳＢ）。（Ｂ）ポリメラーゼ内部トンネル（黄色のチューブとして示される）。ｖＲＮＡプロモータ（ｖＲＮＡ ｐｒｏｍｏｔｅｗｒ）はポリメラーゼに結合し、鋳型ｖＲＮＡはポリメラーゼ複合体に入る。鋳型ｖＲＮＡは、ＲＮＡ合成が生じる活性部位を通過し、次いで鋳型出口を通って出ていく。前記活性部位で合成されたＲＮＡ産物は、産物出口を通って出ていく。（Ｃ）ＭＤＣＫ細胞において各突然変異体Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８ウイルスの継代を４回行い、継代を行った後のＶｅｎｕｓ発現プラークの割合を、蛍光顕微鏡検査を用いることによってＭＤＣＫ細胞において決定した。（Ｄ）Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８におけるＶｅｎｕｓ遺伝子を安定化させる突然変異を含むインフルエンザＡ型ウイルス株の割合（すなわち、示されたアミノ酸を含む株の数／Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅにおいて入手可能な株の総数）。
定義
本明細書において用いられる場合、「分離された」という用語は、本開示の核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｗｍｏｌｅｃｕｌｅ）、例えばベクター若しくはプラスミド、ペプチド若しくはポリペプチド（タンパク質）又はウイルスの、それがインビボにおける物質と関連しないか、又はインビトロにおける物質から実質的に精製されるようなインビトロにおける調製及び／又は分離を指す。分離されたウイルス調製物は、インビトロにおける培養及び増殖によって、及び／又は卵における継代を介して、概して得られ、他の感染因子を実質的に含まない。
本明細書において用いられる場合、「実質的に精製される」は、目的の種が、主要な種であって、例えば、モル基準で、組成物中において他のいずれの個別の種よりも豊富であり、例えば、存在する種の少なくとも約８０％であり、場合により、前記組成物中に存在する種の９０％以上、例えば９５％、９８％、９９％以上であることを意味する。
本明細書において用いられる場合、「実質的に含まない」は、特定の感染因子についての標準的検出方法を用いた前記因子についての検出のレベル未満であることを意味する。
「組換え」ウイルスは、ウイルスゲノムに変更を導入するために、例えば組換えＤＮＡ技術を用いてインビトロで操作されたものである。再集合体ウイルスは、組換え技術又は非組換え技術によって調製され得る。
本明細書において、「組換え核酸」又は「組換えＤＮＡ配列又はセグメント」という用語は、核酸、例えば、源から誘導されたか、又は分離され、続いてインビトロにおいて化学的に改変されてもよく、その結果、その配列が天然由来のではないか、又は天然ゲノムにおいて位置する場合に位置しない天然由来の配列に対応する、ＤＮＡを指す。源から「誘導される」ＤＮＡの例は、有用な断片として同定され、次いで、実質的に純粋な形態で化学的に合成されるＤＮＡ配列である。源から「分離される」そのようなＤＮＡの例は、化学的手段によって、例えば制限エンドヌクレアーゼを用いることによって、前記源から切除されるか、又は除去される有用なＤＮＡ配列であって、その結果、遺伝子工学の方法によって、本発明における使用のために、さらに操作することができる、例えば増幅することができる有用なＤＮＡ配列である。
本明細書において用いられる場合、「異種」インフルエンザウイルス遺伝子又はウイルスセグメントは、組換え（例えば再集合体）インフルエンザウイルスにおける他のインフルエンザウイルス遺伝子又はウイルスセグメントの大部分とは異なるインフルエンザウイルス源に由来する。
「分離されたポリペプチド」、「分離されたペプチド」又は「分離されたタンパク質」という用語には、合成起源又はそれらのいくつかの組み合わせを含むｃＤＮＡ又は組換えＲＮＡによってコードされるポリペプチド、ペプチド又はタンパク質が含まれる。
本明細書において用いられる通りの「組換えタンパク質」又は「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ分子から発現させたタンパク質分子を指す。対照的に、「未変性タンパク質」という用語は、天然由来（すなわち、非組換え）源から分離されたタンパク質を示すために本明細書において用いられる。未変性形態のタンパク質と比較して同じ特性を有する組換え形態のタンパク質を産生するために分子生物学的技術を用いてもよい。
比較のための配列の配置方法は、本技術分野でよく知られている。したがって、任意の２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。
これらの数学的アルゴリズムのコンピュータによる実現を配列の比較のために利用して、配列同一性を決定することができる。これらのプログラムを用いたアラインメントは、デフォルトパラメータを用いて実施され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により一般公開されている。アルゴリズムは、まず、データベース配列における同一の長さの語によってアラインメントされる場合に何らかの正の値の閾値スコアＴに適合するか又は前記閾値スコアＴを満たす問い合わせ配列における長さＷのショートワードを同定することによって高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを含んでもよい。Ｔは、近傍語スコア閾値と称される。これらの初期近傍語ヒットは、検索を開始するための種として作用して、それらを含むより長いＨＳＰが見出される。次いで、累積的なアラインメントスコアが増加し得る限り、語ヒットは各々の配列に沿った両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてパラメータＭ（一対の適合残基についての報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不適合残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列について、累積スコアを算出するためにスコアリングマトリックスが用いられる。各方向における語ヒットの延長は、累積的アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少する場合に停止するか、累積スコアは、１以上の負スコアリング残基アラインメントの蓄積のためにゼロ以下になるか、又はいずれかの配列の端に達する。
パーセント配列同一性を算出することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を行ってもよい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測度は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の適合が偶然に起こる確率の指標を提供する最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であってもよい。例えば、参照核酸配列に対する試験核酸配列の比較における最小合計確率が約０．１未満、約０．０１未満又は約０．００１未満である場合、試験核酸配列は参照配列と同様であると考えられる。
（ヌクレオチド配列のための）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、１１の語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両ストランドの比較を用いてもよい。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３の語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いてもよい。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ１ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。アラインメントは、検査によって手作業で行われてもよい。
配列比較について、典型的には、１つの配列は、試験配列と比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する（１又は複数の）試験配列についてのパーセント配列同一性を算出する。
「保存的」アミノ酸置換は、同様の側鎖を有する残基の可換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。一実施形態において、保存的アミノ酸置換群は、スレオニン－バリン－ロイシン－イソロイシン－アラニン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸及びアスパラギン－グルタミンである。
キャプシド形成配列
組換えインフルエンザウイルスへの異種遺伝子配列の組み込みのためのウイルスセグメントは、各端部においてビリオン内へのキャプシド形成（組み込み又はパッケージング）を提供する非コード配列を含む。ウイルスセグメントは、キャプシド形成に寄与する、例えば、隣接するコード配列を欠くウイルスセグメントと比較してキャプシド形成を増強するが異種遺伝子配列を有する一方又は両方の端部から隣接するコード配列も含む。したがって、異種遺伝子配列を有するウイルスセグメントを有するベクターは、隣接する５’コード配列を含んでもよいｖＲＮＡの３’末端において、３’コード配列を含んでもよいｖＲＮＡの５’末端において、又は隣接する５’コード配列を含んでもよいｖＲＮＡの３’末端において、及び３’コード配列を含んでもよいｖＲＮＡの５’末端において、キャプシド形成配列を含む。例えば、ＨＡキャプシド形成配列は、３３－ｎｔの非コード配列及び少なくとも３、６、９又は１５若しくは最高で約２１６ｎｔのＨＡコード配列を含むＨＡ ｖＲＮＡの３’末端において、並びに／又は、約４５ｎｔの非コード配列及び最高で約７５、８０、２６８若しくは２９１のＨＡコード配列を含むＨＡ ｖＲＮＡの５’末端において、配列を含む（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００３）。ＨＳキャプシド形成配列は、少なくとも３０、６０、９０又は１５０ｎｔのコード配列を含むＮＳ ｖＲＮＡの３’末端において、及び少なくとも３０、６０、９０又は１００ｎｔのコード配列を含むＮＳ ｖＲＮＡの５’末端において、配列を含む（Ｆｕｊｉｉら、２００５）。
一実施形態において、３’ＮＡ組み込み配列は、Ｎ末端ＮＡコード領域のヌクレオチド１～１８３、ヌクレオチド１～９０、ヌクレオチド１～４５、ヌクレオチド１～２１、ヌクレオチド１～１９、又は１９～１８３の任意の整数に対応し、ＮＡ開始コドンにおける突然変異を含んでもよい。別の実施形態において、５’ＮＡ組み込み配列は、ＮＡのＣ末端コード領域における配列、すなわち、Ｃ末端ＮＡコード領域についての３９、７８若しくは１５７、又は１～１５７の任意の整数の３’末端ヌクレオチドに対応する配列に対応する。
一実施形態において、５’ＨＡ組み込み配列は、ＨＡのＣ末端コード領域における配列、すなわち、Ｃ末端ＨＡコード領域の７５、８０、２６８、２９１若しくは５１８、又は１～５１８の任意の整数の３’末端ヌクレオチドに対応する配列に対応する。３’ＨＡ組み込み配列は、Ｎ末端ＨＡコード領域のヌクレオチド１～３、１～６、１～９、１～１５、１～２１６、１～４６８、又は１～４６８の任意の整数に対応する。
一実施形態において、３’ＰＢ１又はＰＢ２組み込み配列は、Ｎ末端ＰＢ１又はＰＢ２コード領域のヌクレオチド１～２５０、ヌクレオチド１～２００、ヌクレオチド１～１５０、ヌクレオチド１～１６０若しくは１～１３０、又は１～２５０の任意の整数に対応する。一実施形態において、５’ＰＢ１又はＰＢ２組み込み配列は、Ｃ末端ＰＢ１又はＰＢ２コード領域の３’末端ヌクレオチド、例えば、３’の１～２５０のヌクレオチド、１～２００のヌクレオチド、ヌクレオチド１～１５０、ヌクレオチド１～１６０、１～１７０若しくは１～１９０、又は１～２５０の任意の整数に対応する。
一実施形態において、３’ＰＡ組み込み配列は、Ｎ末端ＰＡコード領域のヌクレオチド１～２５０、ヌクレオチド１～２００、ヌクレオチド１～１５０、又は１～２５０の任意の整数に対応する。一実施形態において、５’ＰＡ組み込み配列は、Ｃ末端ＰＡコード領域の３’末端ヌクレオチド、例えば、３’の１～２５０のヌクレオチド、１～２００のヌクレオチド、ヌクレオチド１～１５０、ヌクレオチド１～１６０、１～１７０若しくは１～１９０、又は１～２５０の任意の整数に対応する。
一実施形態において、３’Ｍ組み込み配列は、Ｎ末端Ｍコード領域のヌクレオチド１～２５０、ヌクレオチド１～２４２、ヌクレオチド１～２４０、又は１～２５０の任意の整数に対応し、Ｍ開始コドンにおける突然変異を含んでもよい。別の実施形態において、５’Ｍ組み込み配列は、ＭのＣ末端コード領域における配列、すなわち、Ｃ末端Ｍコード領域についての５０、１００若しくは２２０、又は１～２５０の任意の整数の３’末端ヌクレオチドに対応する配列に対応する。
一実施形態において、３’ＮＳ又はＮＰ組み込み配列は、Ｎ末端ＮＳ又はＮＰコード領域のヌクレオチド１～２５０、ヌクレオチド１～２００、ヌクレオチド１～１５０、ヌクレオチド１～３０、又は１～２５０の任意の整数、例えば、１～６０、１～７０、１～８０若しくは１～９０に対応し、ＮＳ又はＮＰ開始コドンにおける突然変異を含んでもよい。別の実施形態において、５’ＮＳ又はＮＰ組み込み配列は、ＮＳ又はＮＰのＣ末端コード領域における配列、すなわち、Ｃ末端ＮＳ又はＮＰコード領域についての１０、３０、１５０、２００若しくは２５０、又は１～２５０の任意の整数の３’末端ヌクレオチド、例えば、Ｃ末端ＮＳ又はＮＰコドン領域のヌクレオチド１～２５０、ヌクレオチド１～２００、ヌクレオチド１～１５０、ヌクレオチド１～３０、又は１～２５０の任意の整数、例えば、１～６０、１～７０、１～８０又は１～９０に対応する配列に対応する。
したがって、本開示は、特定のｖＲＮＡの３’非コード領域及び５’非コード領域に対応する配列と、対応するｖＲＮＡの組み込み配列と、異種核酸セグメントとを含むインフルエンザウイルスベクターを提供する。したがって、一実施形態において、前記ベクターは、ＮＡ ｖＲＮＡの３’非コード領域と、３’ＮＡ ｖＲＮＡ組み込み配列又は５’ＮＡ ｖＲＮＡ組み込み配列と、場合により３’ＮＡ組み込み配列及び５’ＮＡ組み込み配列の両方と、異種核酸セグメントと、ＮＡ ｖＲＮＡの５’非コード領域とを含む。別の実施形態において、前記ベクターは、ＨＡ ｖＲＮＡの３’非コード領域と、５’ＨＡ ｖＲＮＡ組み込み配列若しくは３’ＨＡ ｖＲＮＡ組み込み配列又は５’ＨＡ組み込み配列及び３’ＨＡ組み込み配列の両方と、異種核酸セグメントと、ＨＡ ｖＲＮＡの５’非コード領域とを含む。別の実施形態において、前記ベクターは、ＮＳ ｖＲＮＡの３’非コード領域と、ＮＳ組み込み配列と、異種核酸セグメントと、ＮＳ ｖＲＮＡの５’非コード領域とを含む。別の実施形態において、前記ベクターは、Ｍ ｖＲＮＡの３’非コード領域と、５’Ｍ組み込み配列若しくは３’Ｍ組み込み配列又は５’Ｍ組み込み配列及び３’Ｍ組み込み配列の両方と、異種核酸セグメントと、Ｍ ｖＲＮＡの５’非コード領域とを含む。さらに別の実施形態において、前記ベクターは、ＰＢ２ ｖＲＮＡの３’非コード領域と、異種核酸セグメントと、ＰＢ２組み込み配列と、ＰＢ２ ｖＲＮＡの５’非コード領域とを含む。ベクターにおいて２つの組み込み配列が用いられる場合、それらは前記異種核酸セグメントによって分離されてもよい。細胞への導入のためのｖＲＮＡを調製するように、又はウイルス作製のために必要な他のインフルエンザウイルスｖＲＮＡｓ及びタンパク質が存在する細胞においてｖＲＮＡを発現するように、各ベクターを用いてもよい。
別の実施形態において、異種遺伝子配列は、治療遺伝子についてのオープンリーディングフレームに対応する配列を含む。なおさらなる実施形態において、異種遺伝子配列は、病原体又は腫瘍細胞の免疫原性ペプチド又は免疫原性タンパク質、例えば、防御免疫応答を誘導するために有用なものについてのオープンリーディングフレームに対応する配列を含む。例えば、異種核酸セグメントは、癌治療又はワクチンにおいて有用な免疫原性エピトープをコードしてもよい。ベクターｖＲＮＡの転写によってＮＡなどのインフルエンザタンパク質を有する融合タンパク質をコードするｍＲＮＡが生じるように異種核酸セグメントを含むベクターを調製してもよい。したがって、融合タンパク質、例えばＮＡの２１個のＮ末端残基との融合をコードするように異種核酸セグメントをウイルス組み込み配列と融合してもよいことが想定される。前記融合タンパク質は、２つの異なるＮＡタンパク質又はＨＡタンパク質に由来する配列を含む２つの異なるインフルエンザウイルスタンパク質に由来する配列を含んでもよい。別の実施形態において、前記異種核酸セグメントは、オープンリーディングフレームに５Ｎ結合したＩＲＥＳに対応する配列を含んでもよい。
本開示の一実施形態において、異種遺伝子配列は、検出可能な表現型を付与してもよい異種タンパク質（糖タンパク質、又はサイトゾルタンパク質、核タンパク質若しくは糸粒体特異的タンパク質などの非インフルエンザウイルスタンパク質）をコードしてもよい。一実施形態において、異種遺伝子配列は、ＰＢ２コード配列の切断部分、例えば、場合によりキメラタンパク質を形成する５’又は３’ＰＢ２コード組み込み配列に対応するものに融合されてもよい。一実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ウイルスウイルスセグメント（ｖｉｒａｌ ｖｉｒａｌ ｓｅｇｍｅｎｔ）であって、そのセグメントについてのコード領域に対応するウイルスウイルスセグメントにおける配列を、前記ウイルスセグメントのコード領域における組み込み配列を破砕することがないように置換するか、又は前記配列に導入される。例えば、異種ヌクレオチド配列は、非コード配列に隣接する５’及び／又は３’ＰＢ２コード領域の約３～約４００のヌクレオチドだけフランクされてもよい。一実施形態において、３’ＰＢ２組み込み配列は、Ｎ末端及び／又はＣ末端ＰＢ２コード領域のヌクレオチド３～４００、ヌクレオチド３～３００、ヌクレオチド３～１００、ヌクレオチド３～５０、又は３～４００の任意の整数に対応する。一実施形態において、生物学的に含まれたＰＢ２－ＫＯウイルスを宿主細胞に感染させた後、欠失させたＰＢ２タンパク質の残りの残基のＮ末端及び／又はＣ末端との融合物である異種タンパク質が産生される。
付加的なウイルスセグメント又は異種遺伝子配列を有するウイルスセグメントについてのｖＲＮＡが、少なくとも１％、５％、１０％若しくは３０％、又は少なくとも５０％の効率性、すなわち、対応する野生型ｖＲＮＡの効率性でビリオンに組み込まれてもよい。
インフルエンザウイルスの構造及び増殖
インフルエンザＡ型ウイルスは、少なくとも１０個のタンパク質をコードする８つの一本鎖マイナス鎖ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のゲノムを有する。インフルエンザウイルスライフサイクルは、宿主細胞の表面上におけるシアル酸含有受容体への赤血球凝集素（ＨＡ）の結合から開始した後、受容体依存性エンドサイトーシスが生じる。後期エンドソームにおける低ｐＨによって、ＨＡにおける立体配座シフトが引き起こされることにより、ＨＡ２サブユニット（いわゆる融合ペプチド）のＮ末端が曝露される。融合ペプチドは、ウイルス膜及びエンドソーム膜の融合を開始し、マトリックスタンパク質（Ｍ１）及びＲＮＰ複合体が細胞質に放出される。ＲＮＰは、ｖＲＮＡをキャプシド形成する核タンパク質（ＮＰ）と、ＰＡタンパク質、ＰＢ１タンパク質及びＰＢ２タンパク質によって形成されるウイルスポリメラーゼ複合体とからなる。ＲＮＰは、転写及び複製が起きる核の中に移送される。ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、３つの異なる反応、すなわち、５’キャップ及び３’ポリＡ構造を有するｍＲＮＡの合成、全長相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の合成、及び鋳型としてのｃＲＮＡを用いたゲノムｖＲＮＡの合成、を触媒する。次いで、新しく合成されたｖＲＮＡｓ、ＮＰ及びポリメラーゼタンパク質は、ＲＮＰに構築され、核から搬出され、子孫ウイルス粒子の出芽が生じる原形質膜に移送される。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質は、シアリルオリゴ糖からシアル酸を除去し、したがって、新しく構築されたビリオンを細胞表面から放出し、ウイルス粒子の自己凝集を防止することによって、感染における後期において重要な役割を果たす。ウイルス構築は、タンパク質－タンパク質相互作用及びタンパク質－ｖＲＮＡ相互作用を含むが、これらの相互作用の性質は、大部分が不明である。
インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスは、構造的且つ機能的にインフルエンザＡ型ウイルスと同様であるが、多少の差異がある。例えば、インフルエンザＢ型ウイルスは、イオンチャネル活性を有するＭ２タンパク質を有さないが、ＢＭ２を有し、ＮＡ配列及びＮＢ配列の両方を有するウイルスセグメントを有する。インフルエンザＣ型ウイルスは、７つのウイルスセグメントだけを有する。
用いることができる細胞系
インフルエンザウイルスを分離し且つ／又は増殖させるために、インフルエンザウイルスの効率的な複製を支える突然変異体細胞を含む任意の細胞、例えば、トリの細胞又はヒトなどの哺乳類の細胞、例えば、２９３Ｔ細胞若しくはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、又は、イヌ、例えばＭＤＣＫ、ウシ、ウマ、ネコ、ブタ、ヒツジ、齧歯動物、例えばミンク、例えばＭｖＬｕ１細胞、若しくはハムスター、例えばＣＨＯ細胞、若しくは非ヒト霊長類、例えばＶｅｒｏ細胞を用いることができる。再集合体ウイルスを調製するために、分離されたウイルスを用いることができる。一実施形態において、ワクチン作製のための宿主細胞は、哺乳類又はトリの連続細胞系又は連続細胞株である。最終産物の純度についての適切な試験を含むことができるように、用いられる前記細胞の完全な特性決定を行ってもよい。細胞の特性決定のために用いることができるデータは、（ａ）その由来、誘導及び継代歴に関する情報、（ｂ）その成長及び形態学的特性に関する情報、（ｃ）偶発因子の試験の結果、（ｄ）細胞が他の細胞系の中で明確に認識されることを可能にする生化学的パターン、免疫学的パターン及び細胞遺伝学的パターンなどの目立った特徴、及び（ｅ）腫瘍形成性についての試験の結果、を含む。一実施形態において、用いられる宿主細胞の継代レベル又は集団倍化は、できるだけ低い。
一実施形態において、前記細胞は、ＷＨＯによって保証されるか又は保証可能な連続細胞系である。そのような細胞系を保証するための要件としては、系統の少なくとも１つに関する特性決定、成長特性、免疫学的マーカー、ウイルス感受性腫瘍形成性及び貯蔵条件、並びに動物、卵及び細胞培養物における試験によるものが挙げられる。前記細胞が検出可能な偶発因子を含まないことを確認するために、そのような特性決定が用いられる。いくつかの国において、核学が必要とされてもよい。加えて、腫瘍形成性は、ワクチン作製のために用いられるものと同じ継代レベルの細胞において試験されてもよい。ウイルスは、ワクチン作製の前に、一貫した結果を与えることが示されているプロセスによって精製されてもよい（例えば、世界保健機関、１９８２参照）。
宿主細胞によって産生されるウイルスは、ワクチン又は遺伝子治療製剤の前に高度に精製されてもよい。概して、精製手法は、細胞ＤＮＡ及び他の細胞成分並びに偶発因子の大規模な除去をもたらす。大規模にＤＮＡを分解又は変性する手法を用いてもよい。
インフルエンザワクチン
本開示のワクチンは、本開示の分離された組換えインフルエンザウイルス、及び場合により他の分離されたインフルエンザウイルスを含む１以上の他の分離されたウイルス、１以上の分離されたインフルエンザウイルス若しくは１以上の他の病原体の１以上の免疫原性タンパク質若しくは糖タンパク質、例えば、１以上の細菌、非インフルエンザウイルス、酵母若しくは真菌に由来する免疫原性タンパク質、又は本開示の分離されたインフルエンザウイルスの１以上の免疫原性タンパク質を含む１以上のウイルスタンパク質をコードする分離された核酸（例えば、ＤＮＡワクチン）を含む。一実施形態において、本開示のインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルス又は他の病原体のためのワクチンベクターであってもよい。
完全ビリオンワクチンは、限外濾過によって濃縮され、次いでゾーン遠心分離又はクロマトグラフィによって精製されてもよい。多価ワクチンに含まれるものなどの本発明のウイルス以外のウイルスは、例えばホルマリン又はβ－プロピオラクトンを用いて精製の前又は後に不活化されてもよい。
サブユニットワクチンは、精製された糖タンパク質を含む。そのようなワクチンは、以下のように調製されてもよい。すなわち、洗浄剤による処置によって断片化されたウイルス懸濁液を用いて、例えば超遠心によって表面抗原を精製する。したがって、サブユニットワクチンは、主にＨＡタンパク質を含み、ＮＡも含む。用いられる洗浄剤は、例えば臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムなどのカチオン性洗浄剤（Ｂａｃｈｍｅｙｅｒ、１９７５）、デオキシコール酸アンモニウムなどのアニオン性洗浄剤（Ｌａｖｅｒ ＆ Ｗｅｂｓｔｅｒ、１９７６）、又はＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００の名称の下で商業化されたものなどの非イオン性洗浄剤であってもよい。赤血球凝集素を、ブロメリンなどのプロテアーゼによるビリオンの処置後に分離し、次いで精製してもよい。サブユニットワクチンは、多価ワクチンにおいて本開示の弱毒化ウイルスと組み合わせてもよい。
分解ワクチンは、脂質を溶解させる剤による処置を行ったビリオンを含む。分解ワクチンは、以下のように調製され得る。すなわち、不活化されたか又は不活化されていない、上記のように得られた精製ウイルスの水性懸濁液を、洗浄剤に関連するエチルエーテル又はクロロホルムなどの脂質溶媒によって、撹拌下で処置する。ウイルスエンベロープ脂質の溶解によって、ウイルス粒子の断片化が生じる。主に赤血球凝集素及びノイラミニダーゼから、それらの元の脂質環境を除去した状態で構成される分解ワクチンと、コア又はその分解産物とを含む水相を回復する。次いで、残存する感染性粒子の不活化を、これがまだ為されていない場合に行う。分解ワクチンは、多価ワクチンにおいて本開示の弱毒化ウイルスと組み合わせてもよい。
不活化ワクチン。不活化インフルエンザウイルスワクチンは、限定されるものではないが、ホルマリン又はβ－プロピオラクトンによる処置などの知られた方法を用いて、複製されたウイルスを不活化することによって提供される。本発明において用いられ得る不活化ワクチンの型は、全ウイルス（ＷＶ）ワクチン又はサブビリオン（ＳＶ）（分解）ワクチンを含むことができる。ＷＶワクチンは、無処置の不活化ウイルスを含むが、一方でＳＶワクチンは、脂質含有ウイルスエンベロープを可溶化した後で残存ウイルスの化学的不活化を行う洗浄剤によって破砕される精製ウイルスを含む。
加えて、用いることができるワクチンとしては、表面抗原又はサブユニットワクチンと称される、分離されたＨＡ表面タンパク質及びＮＡ表面タンパク質を含むものが挙げられる。
生弱毒化ウイルスワクチン。本開示の組換えウイルスを含むものなどの生弱毒化インフルエンザウイルスワクチンは、インフルエンザウイルス感染を予防又は処置するために使用され得る。弱毒化は、弱毒化ドナーウイルスから知られた方法にかかる複製分離株又は再集合体ウイルスへの弱毒化遺伝子のトランスファーによる単一ステップにおいて達成されてもよい。インフルエンザＡ型ウイルスに対する耐性が、主にＨＡ糖タンパク質及び／又はＮＡ糖タンパク質に対する免疫応答の発現によって媒介されるので、これらの表面抗原をコードする遺伝子は、再集合体ウイルス又は臨床分離株から生じる。弱毒化遺伝子は、弱毒化された親から誘導される。この手法において、弱毒化を付与する遺伝子は、概して、ＨＡ糖タンパク質及びＮＡ糖タンパク質をコードしない。
インフルエンザウイルスを再現的に弱毒化することができるウイルス（ドナーインフルエンザウイルス）が利用可能であり、例えば、弱毒化ワクチン作製のために低温適応（ｃａ）ドナーウイルスを用いることができる。例えば、Ｉｓａｋｏｖａ－Ｓｉｖａｌｌら、２０１４参照のこと。生弱毒化再集合体ウイルスワクチンは、ｃａドナーウイルスと毒性のある複製ウイルスとを組み合わせることによって生成され得る。次いで、弱毒化ｃａドナーウイルスの表面抗原を有するウイルスの複製を阻害する適切な抗血清の存在下で、再集合体子孫は、（ビルレントウイルスの複製のために制限的な）２５℃で選択される。有用な再集合体は、（ａ）感染性があり、（ｂ）血清陰性の非成体哺乳動物及び免疫学的に初回刺激された成体哺乳動物のために弱毒化され、（ｃ）免疫原性であり、及び（ｄ）遺伝子的に安定している。ｃａ再集合体の免疫原性は、複製のそれらのレベルに匹敵する。したがって、新しい野生株ウイルスによるｃａドナーウイルスの６つのトランスファー可能な遺伝子の獲得によって、成体及び非成体の両方の感受性のある哺乳動物に対するワクチン接種における使用のためにこれらのウイルスが再現的に弱毒化された。
部位特異的突然変異誘発によって他の弱毒化突然変異をインフルエンザウイルス遺伝子に導入して、これらの突然変異遺伝子を有する感染性ウイルスを救出することができる。ゲノムの非コード領域、及びコード領域に弱毒化突然変異を導入することができる。そのような弱毒化突然変異を、ＨＡ又はＮＡ以外の遺伝子、例えばＰＢ２ポリメラーゼ遺伝子に導入することもできる。したがって、部位特異的突然変異誘発によって導入された弱毒化突然変異を有する新しいドナーウイルスを生成することも可能であり、そのような新しいドナーウイルスは、ｃａドナーウイルスについて上記で記載されたものと類似の様式で、生弱毒化再集合体ワクチン候補の作製において使用され得る。同様に、他の知られた、適切な弱毒化ドナー株をインフルエンザウイルスにより再集合体とすることで哺乳動物のワクチン接種における使用のために適切な弱毒化ワクチンを得ることができる。
一実施形態において、そのような弱毒化ウイルスは、元の臨床分離株のものと実質的に同様の抗原決定基をコードするウイルスに由来する遺伝子を維持する。このことは、弱毒化ワクチンの目的が、ウイルスの元の臨床分離株と実質的に同じ抗原性を提供すると共に、同時に前記ワクチンがワクチン接種された哺乳動物における重篤な疾患状態を誘導する可能性を最小限にする程度に病原性を欠くことにあるからである。
したがって、多価ワクチンにおけるウイルスは、動物、例えば哺乳動物における免疫応答を誘導するためのワクチンとして、知られた方法に従って、弱毒化又は不活化され、製剤化され、投与され得る。そのような弱毒化ワクチン又は不活化ワクチンが、臨床分離株又はそれから誘導された高増殖株と同様の抗原性を維持したかどうか決定するための方法は、よく知られている。そのような知られた方法としては、ドナーウイルスの抗原決定基を発現するウイルスを排除するための抗血清又は抗体の使用、化学的選択（例えば、アマンタジン又はリマンタジン（ｒｉｍａｎｔｉｄｉｎｅ））、ＨＡ及びＮＡの活性及び阻害、抗原決定基をコードするそのドナー遺伝子（例えば、ＨＡ遺伝子又はＮＡ遺伝子）が弱毒化ウイルス内に存在しないことを確認するための核酸スクリーニング（プローブハイブリダイゼーション又はＰＣＲなど）が挙げられる。
例示的な実施形態
ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を産生するためにインフルエンザＡ型／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８、Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＮＳセグメントにＶｅｎｕｓ蛍光タンパク質についての遺伝子を挿入することによって、例えばインフルエンザウイルス誘導病理を理解するためにウイルス感染細胞の視覚化を可能にするレポータインフルエンザウイルスを調製した。挿入されたＶｅｎｕｓ遺伝子は、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の連続的継代の間に欠失したが、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８は有意に弱毒化され、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異は、Ｖｅｎｕｓ遺伝子を安定化させることが分かった。本明細書に開示されるように、Ｖｅｎｕｓ遺伝子欠失が起きる機序と、ポリメラーゼ突然変異がＶｅｎｕｓ遺伝子を安定化する方法とを検討した。大規模配列決定分析によって、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄが突然変異率の顕著な変化を引き起こさないことが明らかになったが、このことは、Ｖｅｎｕｓ遺伝子の安定性がポリメラーゼ忠実度による影響を受けないことを示唆している。定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８が、高レベルのインターフェロンβ（ＩＦＮ－β）の発現を誘導することが分かった。ＩＦＮ－β発現の誘導は、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８における修飾ＮＳセグメントの転写／複製効率性の低下に起因すると思われた。対照的に、修飾ＮＳセグメントの転写／複製効率性は、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異によって増強された。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８におけるＶｅｎｕｓ遺伝子の喪失は、ＮＳセグメントにおける内部欠失によって引き起こされると思われた。さらに、Ｖｅｎｕｓ安定化機序のさらなる理解のために、Ｖｅｎｕｓ遺伝子を安定化させるウイルスポリメラーゼ複合体における付加的なアミノ酸突然変異を同定した。これらのアミノ酸の一部がウイルスポリメラーゼの鋳型出口又は産物出口の近くに位置することが分かったが、このことは、これらのアミノ酸が、ポリメラーゼ複合体とＲＮＡ鋳型及び産物との間の結合親和性に影響を及ぼすことによってＶｅｎｕｓ遺伝子の安定性に寄与することを示唆している。
本開示は、ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント、ＰＢ２ウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＡウイルスセグメント及びＨＡウイルスセグメントを有する分離された組換えインフルエンザウイルスであって、前記ウイルスセグメントの内の少なくとも１つが、アスパラギンではない５４０位における残基を有するＰＢ２をコードするＰＢ２ウイルスセグメント、グルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメント、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメント、又はそれらの任意の組み合わせであり、前記組換えインフルエンザウイルスが、アスパラギンであるＰＢ２における５４０位における残基、グルタミンであるＰＡにおける１８０位における残基、スレオニンであるＰＡにおける２００位における残基、バリンであるＰＢ１における１４９位における残基、グルタミン酸であるＰＢ１における６８４位における残基又はアスパラギン酸であるＰＢ１における６８５位における残基を有する対応する組換えインフルエンザウイルスと比較して、遺伝的安定性が増強されているか、又は複製が増強されている、分離された組換えインフルエンザウイルスを提供する。一実施形態において、ＰＢ２の５４０位における残基は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｑ若しくはＨであり、ＰＢ２の７１２位における残基は、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ若しくはＣであり、ＰＡにおける１８０位における残基は、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｎ若しくはＨであり、ＰＡにおける２００位における残基は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｓ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｇ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における残基は、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｓ、Ｍ、Ｆ、Ｐ若しくはＧであり、６８４位における残基は、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における残基は、Ｅ、Ｎ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ若しくはＱである。一実施形態において、ＰＢ２の５４０位における残基は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ若しくはＣであり、ＰＢ２の７１２位における残基は、Ｄ、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｑ若しくはＮであり、ＰＡにおける１８０位における残基は、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ若しくはＨであり、ＰＡにおける２００位における残基は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｓ、Ｍ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における残基は、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ若しくはＧであり、６８４位における残基は、Ｄ、Ｑ、Ｈ、Ｌ、Ｒ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における残基は、Ｅ、Ｎ、Ｒ、Ｈ、Ｋ若しくはＱである。一実施形態において、ＰＢ２の５４０位における残基は、Ｋ、Ｒ若しくはＨであり、ＰＢ２の７１２位における残基は、Ｄ若しくはＮであり、ＰＡにおける１８０位における残基は、Ｒ、Ｋ若しくはＨであり、ＰＡにおける２００位の残基は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における残基は、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ若しくはＧであり、６８４位における残基は、Ｄ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における残基は、Ｅ若しくはＱである。一実施形態において、前記ＰＡは、アルギニンではない４４３位における残基をさらに含み、前記ＰＢ１は、リジンではない７３７位における残基をさらに含み、前記ＰＢ２は、バリンではない２５位における残基若しくはグルタミン酸ではない７１２位における残基をさらに含み、前記ＮＳウイルスセグメントは、プロリンではない１６７位における残基を有するＮＳ１をコードし、前記ＨＡウイルスセグメントは、スレオニンではない３８０位における残基を有するＨＡをコードし、又はそれらの任意の組み合わせである。一実施形態において、ＰＡの４４３位における残基は、Ｋ若しくはＨであり、ＰＢ１の７３７位における残基は、Ｈ若しくはＲであり、ＰＢ２の２５位における残基は、Ａ、Ｌ、Ｔ、Ｉ若しくはＧであり、ＰＢ２の７１２位における残基は、Ｄであり、ＮＳ１の１６７位における残基は、Ｓ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ若しくはＴであり、又はそれらの任意の組み合わせである。一実施形態において、前記ウイルスセグメントの内の少なくとも１つは、遺伝子産物をコードする異種遺伝子配列を含む。一実施形態において、前記異種配列は、ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント又はＰＢ２ウイルスセグメント中におけるものである。一実施形態において、前記異種配列は、ＰＡウイルスセグメントにおける５’又は３’からＰＡコード配列までであり、ＰＢ１ウイルスセグメントにおける５’又は３’からＰＢ１コード配列までである。一実施形態において、前記異種配列は、ＰＢ２ウイルスセグメントにおける５’又は３’からＰＢ２コード配列までである。一実施形態において、前記異種配列は、ＮＳウイルスセグメントにおける５’又は３’からＮＳ１コード配列までである。一実施形態において、前記組換えウイルスは、遺伝子産物をコードする異種遺伝子配列を含むさらなるウイルスセグメントを含む。一実施形態において、前記さらなるウイルスセグメントは、ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント又はＰＢ２ウイルスセグメントである。一実施形態において、前記ウイルスは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９又はＨ１０であるＨＡを有する。一実施形態において、前記ウイルスは、インフルエンザＢ型ウイルスである。
ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント、ＰＢ２ウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＡウイルスセグメント及びＨＡウイルスセグメントを有する分離された組換えインフルエンザウイルスであって、前記ウイルスセグメントの内の少なくとも１つが、アスパラギンではない５４０位における残基又はグルタミン酸ではない７１２位における残基を有するＰＢ２をコードするＰＢ２ウイルスセグメントであり、前記他のウイルスセグメントの内の少なくとも１つが、グルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメント、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメント、又はそれらの任意の組み合わせであり、前記組換えインフルエンザウイルスが、アスパラギンであるＰＢ２における５４０位における残基、グルタミン酸である７１２位におけるＰＢ２における残基、グルタミンであるＰＡにおける１８０位における残基、スレオニンであるＰＡにおける２００位における残基、バリンであるＰＢ１における１４９位における残基、グルタミン酸であるＰＢ１における６８４位における残基又はアスパラギン酸であるＰＢ１における６８５位における残基を有する対応する組換えインフルエンザウイルスと比較して、遺伝的安定性又は複製が増強されている、分離された組換えインフルエンザウイルスも提供される。一実施形態において、ＰＢ２の５４０位における残基は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｑ若しくはＨであり、ＰＢ２の７１２位における残基は、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ若しくはＣであり、ＰＡにおける１８０位における残基は、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｎ若しくはＨであり、ＰＡにおける２００位における残基は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｓ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｇ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における残基は、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｓ、Ｍ、Ｆ、Ｐ若しくはＧであり、６８４位における残基は、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ若しくは、Ｎであり、又はＰＢ１における６８５位における残基は、Ｅ、Ｎ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ又はＱである。一実施形態において、ＰＢ２の５４０位における残基は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ若しくはＣであり、ＰＢ２の７１２位における残基は、Ｄ、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｑ若しくはＮであり、ＰＡにおける１８０位における残基は、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ若しくは、Ｈであり、ＰＡにおける２００位における残基は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｓ、Ｍ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における残基は、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ若しくはＧであり、６８４位における残基は、Ｄ、Ｑ、Ｈ、Ｌ、Ｒ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における残基は、Ｅ、Ｎ、Ｒ、Ｈ、Ｋ若しくはＱである。一実施形態において、ＰＢ２の５４０位における残基は、Ｋ、Ｒ若しくはＨであり、ＰＢ２の７１２位における残基は、Ｄ若しくはＮであり、ＰＡにおける１８０位における残基は、Ｒ、Ｋ若しくはＨであり、ＰＡにおける２００位における残基は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における残基は、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ若しくはＧであり、６８４位における残基は、Ｄ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における残基は、Ｅ若しくはＱである。一実施形態において、前記ＰＡは、アルギニンではない４４３位における残基をさらに含み、前記ＰＢ１は、リジンではない７３７位における残基をさらに含み、前記ＰＢ２は、バリンではない２５位における残基若しくはグルタミン酸ではない７１２位における残基をさらに含み、前記ＮＳウイルスセグメントは、プロリンではない１６７位における残基を有するＮＳ１をコードし、前記ＨＡウイルスセグメントは、スレオニンではない３８０位における残基を有するＨＡをコードし、又はそれらの任意の組み合わせである。一実施形態において、ＰＡの４４３位における残基は、Ｋ若しくはＨであり、ＰＢ１の７３７位における残基は、Ｈ若しくはＲであり、ＰＢ２の２５位における残基は、Ａ、Ｌ、Ｔ、Ｉ若しくはＧであり、ＰＢ２の７１２位における残基は、Ｄであり、ＮＳ１の１６７位における残基は、Ｓ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ若しくはＴであり、又はそれらの任意の組み合わせである。一実施形態において、前記ウイルスセグメントの内の少なくとも１つは、遺伝子産物をコードする異種遺伝子配列を含む。一実施形態において、前記異種配列は、ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント又はＰＢ２ウイルスセグメント中におけるものである。一実施形態において、前記異種配列は、ＰＡウイルスセグメントにおける５’又は３’からＰＡコード配列までであり、ＰＢ１ウイルスセグメントにおける５’又は３’からＰＢ１コード配列までである。一実施形態において、前記異種配列は、ＰＢ２ウイルスセグメントにおける５’又は３’からＰＢ２コード配列までである。一実施形態において、異種配列は、ＮＳウイルスセグメントにおける５’又は３’からＮＳ１コード配列までである。一実施形態において、前記組換えウイルスは、遺伝子産物をコードする異種遺伝子配列を含むさらなるウイルスセグメントを含む。一実施形態において、前記さらなるウイルスセグメントは、ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント又はＰＢ２ウイルスセグメントである。一実施形態において、前記ウイルスは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９又はＨ１０であるＨＡを有する。一実施形態において、前記ウイルスは、インフルエンザＢ型ウイルスである。
ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント、ＰＢ２ウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＡウイルスセグメント及びＨＡウイルスセグメントを有する分離された組換えインフルエンザウイルスであって、前記組換えウイルスが、アスパラギンではない５４０位における残基若しくはグルタミン酸ではない７１２位における残基を有するＰＢ２をコードするＰＢ２ウイルスセグメント、グルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメント、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメント、又はそれらの任意の組み合わせを含む２つ以上のウイルスセグメントを有し、前記組換えインフルエンザウイルスが、アスパラギンであるＰＢ２における５４０位における残基、グルタミン酸である７１２位におけるＰＢ２における残基、グルタミンであるＰＡにおける１８０位における残基、スレオニンであるＰＡにおける２００位における残基、バリンであるＰＢ１における１４９位における残基、グルタミン酸であるＰＢ１における６８４位における残基又はアスパラギン酸であるＰＢ１における６８５位における残基を有する対応する組換えインフルエンザウイルスと比較して、遺伝的安定性又は複製が増強されている、分離された組換えインフルエンザウイルスがさらに提供される。一実施形態において、ＰＢ２の５４０位における前記残基は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｑ若しくはＨであり、ＰＢ２の７１２位における前記残基は、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ若しくはＣであり、ＰＡにおける１８０位における前記残基は、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｎ若しくはＨであり、ＰＡにおける２００位における前記残基は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｓ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｇ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における前記残基は、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｓ、Ｍ、Ｆ、Ｐ若しくはＧであり、６８４位における前記残基は、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における前記残基は、Ｅ、Ｎ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ若しくはＱである。一実施形態において、ＰＢ２の５４０位における前記残基は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ若しくはＣであり、ＰＢ２の７１２位における前記残基は、Ｄ、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｑ若しくは、Ｎであり、ＰＡにおける１８０位における前記残基は、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ若しくはＨであり、ＰＡにおける２００位における前記残基は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｓ、Ｍ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における前記残基は、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ若しくはＧであり、６８４位における前記残基は、Ｄ、Ｑ、Ｈ、Ｌ、Ｒ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における前記残基は、Ｅ、Ｎ、Ｒ、Ｈ、Ｋ若しくはＱである。一実施形態において、ＰＢ２の５４０位における前記残基は、Ｋ、Ｒ若しくはＨであり、ＰＢ２の７１２位における前記残基は、Ｄ若しくはＮであり、ＰＡにおける１８０位における前記残基は、Ｒ、Ｋ若しくはＨであり、ＰＡにおける２００位における前記残基は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における前記残基は、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ若しくはＧであり、６８４位における前記残基は、Ｄ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における前記残基は、Ｅ若しくはＱである。一実施形態において、前記ＰＡは、アルギニンではない４４３位における残基をさらに含み、前記ＰＢ１は、リジンではない７３７位における残基をさらに含み、前記ＰＢ２は、バリンではない２５位における残基若しくはグルタミン酸ではない７１２位における残基をさらに含み、前記ＮＳウイルスセグメントは、プロリンではない１６７位における残基を有するＮＳ１をコードし、前記ＨＡウイルスセグメントは、スレオニンではない３８０位における残基を有するＨＡをコードし、又はそれらの任意の組み合わせである。一実施形態において、ＰＡの４４３位における前記残基は、Ｋ若しくはＨであり、ＰＢ１の７３７位における前記残基は、Ｈ若しくはＲであり、ＰＢ２の２５位における前記残基は、Ａ、Ｌ、Ｔ、Ｉ若しくはＧであり、ＰＢ２の７１２位における前記残基は、Ｄであり、ＮＳ１の１６７位における前記残基は、Ｓ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ若しくはＴであり、又はそれらの任意の組み合わせである。一実施形態において、前記ウイルスセグメントの内の少なくとも１つは、遺伝子産物をコードする異種遺伝子配列を含む。一実施形態において、前記異種配列は、前記ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント又は前記ＰＢ２ウイルスセグメント中におけるものである。一実施形態において、前記異種配列は、前記ＰＡウイルスセグメントにおける５’又は３’から前記ＰＡコード配列までであり、前記ＰＢ１ウイルスセグメントにおける５’又は３’から前記ＰＢ１コード配列までである。一実施形態において、前記異種配列は、前記ＰＢ２ウイルスセグメントにおける５’又は３’から前記ＰＢ２コード配列までである。一実施形態において、前記異種配列は、前記ＮＳウイルスセグメントにおける５’又は３’から前記ＮＳ１コード配列までである。一実施形態において、前記組換えウイルスは、遺伝子産物をコードする異種遺伝子配列を含むさらなるウイルスセグメントを含む。一実施形態において、前記さらなるウイルスセグメントは、ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント又はＰＢ２ウイルスセグメントである。一実施形態において、前記ウイルスは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９又はＨ１０であるＨＡを有する。一実施形態において、前記ウイルスは、インフルエンザＢ型ウイルスである。
本開示は、前記分離された組換えウイルスを有するワクチンも提供する。
本開示は、再集合体(reassortant)を調製するための複数のインフルエンザウイルスベクターであって、以下を含む：
転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＰＡ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＰＢ１ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＰＢ２ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＨＡ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＮＰ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＮＡ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＭ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、及び転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＮＳ ｃＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクターであって、ここで、ｖＲＮＡ産生のための前記ベクターにおける前記ＰＢ１ ＤＮＡ、前記ＰＢ２ ＤＮＡ又は前記ＰＡ ＤＮＡが、アスパラギンではない５４０位における残基を有するＰＢ２をコードするＰＢ２ウイルスセグメント、グルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメント、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメント、又はそれらの組み合わせの内の少なくとも１つをコードする、ｖＲＮＡ産生のための前記ベクター、並びに、場合により、インフルエンザウイルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、及びインフルエンザウイルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、並びに、場合により、インフルエンザウイルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、又はインフルエンザウイルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター
上記再集合体を調製するための複数のインフルエンザウイルスベクターを提供する。一実施形態において、ｖＲＮＡ産生のための前記ベクターにおける前記ＰＢ１ ＤＮＡ、前記ＰＢ２ ＤＮＡ、前記ＰＡ ＤＮＡ、前記ＮＰ ＤＮＡ、前記ＮＳ ＤＮＡ及び前記Ｍ ＤＮＡは、配列番号１～６又は１０～１５によってコードされる対応するポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするものに対応する配列を有する。一実施形態において、ＰＢ２の５４０位における前記残基は、Ｋ、Ｒ若しくはＨであり、ＰＡにおける１８０位における前記残基は、Ｒ、Ｋ若しくはＨであり、ＰＡにおける２００位における前記残基は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における残基は、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ若しくはＧであり、６８４位における前記残基は、Ｄ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における前記残基は、Ｅ若しくはまたＱである。一実施形態において、前記ウイルスセグメントの内の少なくとも１つは、遺伝子産物をコードする異種の遺伝子配列を含む。一実施形態において、前記ベクターは、遺伝子産物をコードする異種遺伝子配列を含むウイルスセグメントを有するさらなるベクターを含む。
細胞に、感染性インフルエンザウイルスを産生するために有効な量の、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＰＡ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＰＢ１ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＰＢ２ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＨＡ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＮＰ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＮＡ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結するインフルエンザウイルスＭ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター及び転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＮＳ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクターであって、ここで、ｖＲＮＡ産生のための前記ベクターにおける前記ＰＢ１ ＤＮＡ、前記ＰＢ２ ＤＮＡ又は前記ＰＡ ＤＮＡが、ｉ）アスパラギンではない５４０位における残基又はグルタミン酸ではない７１２位における残基を有するＰＢ２、及びグルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡ、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１、又はそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つ、又はｉｉ）アスパラギンではない５４０位における残基を有するＰＢ２、グルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡ、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１、又はそれらの任意の組み合わせ、又はｉｉｉ）アスパラギンではない５４０位における残基若しくはグルタミン酸ではない７１２位の残基を有するＰＢ２、グルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡ、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１、又はそれらの任意の組み合わせの２つ以上、をコードする、ｖＲＮＡ産生のための前記ベクター、並びに、場合により、インフルエンザウイルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、及びインフルエンザウイルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、並びに、場合により、インフルエンザウイルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、又はインフルエンザウイルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、を接触させること、を含む、インフルエンザウイルスを調製するための方法が提供される。一実施形態において、前記細胞は、トリの細胞又は哺乳動物の細胞である。一実施形態において、前記細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、ヒト細胞又はＭＤＣＫ細胞である。一実施形態において、ｖＲＮＡ産生のための前記ベクターにおける前記ＰＢ１ ＤＮＡ、前記ＰＢ２ ＤＮＡ、前記ＰＡ ＤＮＡ、前記ＮＰ ＤＮＡ、前記ＮＳ ＤＮＡ及び前記Ｍ ＤＮＡは、配列番号１～６又は１０～１５によってコードされる対応するポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするものに対応する配列を有する。一実施形態において、ＰＢ２の５４０位における前記残基は、Ｋ、Ｒ若しくはＨであり、ＰＢ２の７１２位における前記残基は、Ｄ若しくはＮであり、ＰＡにおける１８０位における前記残基は、Ｒ、Ｋ又はＨであり、ＰＡにおける２００位における前記残基は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における前記残基は、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ若しくはＧであり、６８４位における前記残基は、Ｄ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における前記残基は、Ｅ若しくはＱである。
例えば、９セグメントインフルエンザＡ型又はＢ型ウイルスのセグメントの内の１つにおける、８つのウイルスセグメントの内の１つにおける、又は７セグメントウイルスにおけるセグメントの内の１つにおける、例えば、付加的なインフルエンザセグメント中におけるものであってもよい対象の治療遺伝子又は予防遺伝子についての異種配列は、癌関連抗原又は細菌、非インフルエンザウイルス、真菌などの病原体についての免疫原であってもよい。一実施形態において、本開示のインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスのための、及びウイルス性病原体若しくは細菌性病原体などの少なくとも１つの他の病原体のための、或いはインフルエンザウイルス以外の病原体であって、レンチウイルス、例えばＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、例えばＣＭＶ若しくはＨＳＶ、口蹄疫ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトライノウイルス、パラインフルエンザウイルス、例えば呼吸系発疹ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス１型、コロナウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、日本脳炎ウイルス、ロタウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、肺炎連鎖球菌、ヒト結核菌、百日咳菌又はインフルエンザ菌を含むが、限定されるものではない病原体のためのワクチンベクターであってもよい。例えば、本開示の生物学的に含まれるインフルエンザウイルスは、麻疹ウイルスのＨタンパク質、風疹ウイルスのウイルス外膜タンパクＥ１、ムンプスウイルスのＨＮタンパク質、ヒトライノウイルスのＲＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、呼吸系発疹ウイルスのＧタンパク質、コロナウイルスのＳタンパク質、ニパウイルスのＧタンパク質若しくはＦタンパク質、ハンタウイルスのＧタンパク質、日本脳炎ウイルスのＥタンパク質、ロタウイルスのＶＰ６、デングウイルスのＥタンパク質、西ナイルウイルスのＥタンパク質、肺炎連鎖球菌のＰｓｐＡ、ヒト結核菌由来のＨＳＰ６５、百日咳菌のＩＲＰ１－３、或いはインフルエンザ菌のヘム利用タンパク質、保護表面抗原Ｄ１５、ヘム結合性タンパク質Ａ又は外膜タンパク質Ｐ１、Ｐ２、Ｐ５若しくはＰ６についての配列を含んでもよい。遺伝子治療ベクターは、例えば、癌、エイズ、アデノシンデアミナーゼ、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症及び中枢神経系腫瘍又は病原体を阻害するか又は処置するために有用な異種配列を含んでもよいか、又はその抗体若しくは断片、例えばｓｃＦｖ若しくは単一鎖抗体をコードしてもよい。
医薬組成物
接種、例えば経鼻投与、非経口投与又は経口投与のために適切な本開示の医薬組成物は、１以上のインフルエンザウイルス分離株、例えば、１以上の弱毒化若しくは不活化インフルエンザウイルス、それらのサブユニット、それらの（１又は複数の）分離されたタンパク質、及び／又はそれらの１以上のタンパク質をコードする分離された核酸を含み、滅菌された水溶液又は非水溶液、懸濁剤及び乳剤を場合によりさらに含む。前記組成物は、本技術分野において知られている通りの補助剤又は賦形剤をさらに含むことができる。本開示の前記組成物は、概して個別の用量（単位用量）の形態で示される。
概して、従来のワクチンは、それらの組成物中に入る株の各々に由来するＨＡを、約０．１～２００μｇ、例えば、３０～１００μｇ、０．１～２μｇ、０．５～５μｇ、１～１０μｇ、１０μｇ～２０μｇ、１５μｇ～３０μｇ、又は１０～３０μｇ含有する。本開示のワクチン組成物の主要成分を形成するワクチンは、単一のインフルエンザウイルス又はインフルエンザウイルス、例えば、１以上の（１又は複数の）再集合体を含む少なくとも２種又は３種のインフルエンザウイルスの組み合わせを含んでもよい。
非経口投与のために調製物は、本技術分野で知られている補助剤又は賦形剤を含んでもよい滅菌された水溶液若しくは非水溶液、懸濁剤及び／又は乳剤を含む。非水溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びエチルオレエートなどの注射用有機エステルがある。皮膚透過性を増加させ、抗原吸収を増強するために、担体又は閉鎖包帯を用いることができる。概して、経口投与のための液体投与形態は、前記液体投与形態を含むリポソーム溶液を含んでもよい。リポソームを懸濁するための適切な形態は、本技術分野において一般に用いられる不活性希釈剤、例えば精製水を含有する乳剤、懸濁剤、溶剤、シロップ剤及びエリキシル剤を含む。前記不活性希釈剤の他に、そのような組成物は、アジュバント、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、又は甘味剤、着香剤若しくは付香剤を含むこともできる。
本開示の組成物は、個体に対する投与のために用いられる場合、塩、緩衝剤、アジュバント、又は前記組成物の有効性を向上させるために望ましい他の物質をさらに含むことができる。ワクチンのために、アジュバント、特異的免疫応答を増大させることができる物質を用いることができる。通常、前記アジュバント及び前記組成物は、免疫系に対する提示の前に混合されるか、又は別々にではあるが、免疫対象の生物の同じ部位へ提示される。
少なくとも２種のインフルエンザウイルス株、例えば２～２０の株又はその中の任意の範囲若しくは値について複製されたインフルエンザウイルスを混合することによって、ワクチンの不均一性が提供されてもよい。ワクチンは、本技術分野で知られている技術を用いて、インフルエンザウイルスの単一の株における変異について提供され得る。
本開示にかかる医薬組成物は、少なくとも１つの化学療法化合物、例えば遺伝子治療のために、免疫抑制剤、抗炎症剤又は免疫増強剤、及び、ワクチンのために、ガンマグロブリン、アマンタジン、グアニジン、ヒドロキシベンゾイミダゾール、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－γ、腫瘍壊死因子－アルファ、チオセミカルバゾン（ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｒｚｏｎｅｓ）、メチサゾン、リファンピン、リバビリン、ピリミジン類似体、プリン類似体、フォスカーネット、ホスホノ酢酸、アシクロビル、ジデオキシヌクレオシド、プロテアーゼ阻害剤又はガンシクロビルが挙げられるが、それらに限定されるものではない化学療法剤を、さらに又は付加的に含んでもよい。
前記組成物は、安全であることが分かっており、前記組成物が投与される生物における望ましくない効果に寄与しない、可変量であるが少量のエンドトキシン不含ホルムアルデヒド、及び保存剤を含むこともできる。
医薬目的
前記組成物（又はそれが誘発する抗血清）の投与は、「予防」又は「治療」目的のいずれかのためのものであってもよい。ワクチンである本開示の前記組成物は、予防的に提供される場合、病原体感染の病徴又は臨床徴候が明らかになる前に提供される。前記組成物の予防的投与は、いかなる後続の感染も予防するか又は弱める役割を果たす。本開示の前記遺伝子治療組成物は、予防的に提供される場合、疾患のいずれの病徴又は臨床徴候が明らかになる前に提供される。前記組成物の予防的投与は、前記疾患に関連する１以上の病徴又は臨床徴候を予防するか又は弱める役割を果たす。
ウイルスワクチンは、治療的に提供される場合、実際の感染の病徴又は臨床徴候の検出の際に提供される。前記（１又は複数の）化合物の治療的投与は、いずれの実際の感染も弱める役割を果たす。遺伝子治療組成物は、治療的に提供される場合、前記疾患の病徴又は臨床徴候の検出の際に提供される。前記（１又は複数の）化合物の治療的投与は、その疾患の病徴又は臨床徴候を弱める役割を果たす。
したがって、本開示のワクチン組成物は、感染の発症の前に（予想される感染を予防するか、又は弱めるように）、又は実際の感染の開始の後に提供されてもよい。同様に、遺伝子治療のために、前記組成物は、障害若しくは疾患の任意の病徴若しくは臨床徴候が明らかになる前に、又は１つ以上の病徴が検出された後に提供されてもよい。
組成物は、その投与がレシピエント哺乳動物によって忍容性を示され得る場合、「薬理的に許容し得る」と考えられる。そのような剤は、投与される量が生理学的に重要である場合、「治療上有効量」で投与されると考えられる。本開示の組成物は、その存在がレシピエント患者の生理機能の検出可能な変化をもたらす、例えば、感染性インフルエンザウイルスの少なくとも１つの株に対する少なくとも１つの一次的又は二次的な体液性免疫応答又は細胞免疫応答を増強する場合、生理学的に重要である。
提供される「保護」は、絶対である必要はなく、すなわち、インフルエンザ感染は、哺乳動物の対照の集団又は組と比較して統計学的に有意な改善がある場合、全体として予防されるか又は根絶される必要はない。保護は、インフルエンザウイルス感染の病徴又は臨床徴候の重症度又は発現の迅速性を軽減することに限定されてもよい。
医薬投与
本開示の組成物は、受動免疫又は能動免疫によって１以上の病原体、例えば１以上のインフルエンザウイルス株に対する耐性を付与してもよい。能動免疫において、弱毒化生ワクチン組成物は、予防的に宿主（例えば、哺乳動物）に投与され、投与に対する宿主の免疫応答によって、感染及び／又は疾患に対する保護が行われる。受動免疫のために、誘発された抗血清を回収して、少なくとも１つのインフルエンザウイルス株によって引き起こされる感染があることが疑われるレシピエントに投与することができる。本開示の遺伝子治療組成物は、能動免疫によって予防レベル又は治療レベルの所望の遺伝子産物を産生してもよい。
一実施形態において、前記ワクチンは、（胎盤にわたるか、又は母乳中の抗体の受動的組み込みによって）雌及び胎児又は新生児を保護する役割を果たす免疫応答を生じさせるために充分な時間及び量の条件下で、（妊娠又は出産の時又は前に）雌性哺乳動物に提供される。
したがって、本開示は、障害又は疾患、例えば、病原体の少なくとも１つの株による感染を予防するか、又は弱める方法を含む。本明細書において用いられる場合、ワクチンは、その投与が、疾患の臨床徴候若しくは状態を全体的若しくは部分的に弱めること（すなわち、抑制）が生じるか、又は疾患に対する個体の全免疫若しくは部分免疫が生じる場合、疾患を予防するか、又は弱めると考えられる。本明細書において用いられる場合、遺伝子治療組成物は、その投与が、疾患の臨床徴候若しくは状態を全体的若しくは部分的に弱めること（すなわち、抑制）が生じるか、又は疾患に対する個体の全免疫若しくは部分免疫が生じる場合、疾患を予防するか、又は弱めると考えられる。
弱毒化されたもの、１以上の他の分離ウイルス、その１以上の分離ウイルスタンパク質、その１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の分離核酸分子、又はそれらの組み合わせを含む、本開示の少なくとも１つのインフルエンザウイルスを有する組成物は、意図された目的を達成する任意の手段によって投与されてもよい。
例えば、そのような組成物の投与は、皮下経路、静脈内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、鼻腔内経路、経口経路又は経皮経路などの各種非経口経路によるものであってもよい。非経口投与は、ボーラス注射によって、又は経時的な漸進的潅流によって達成され得る。
インフルエンザウイルス関連病理を予防、抑制又は処置するための典型的なレジメンは、最高で１週間～約２４ヵ月間又はその中の任意の範囲若しくは値を含む期間にわたって、単回処置として投与されるか、又は増強用量若しくは追加免疫用量として反復される、本明細書に記載されている通りの有効量のワクチン組成物の投与を含む。
本開示によれば、「有効量」の組成物は、所望の効果を達成するために充分なものである。有効投与量は、レシピエントの種、年齢、性別、健康及び体重、併用処置の種類、もしあるのならば、処置の頻度、並びに望まれる効果の性質に依存していてもよいことが理解される。以下で提供される有効用量の範囲は、本発明を限定することを意図するものではなく、用量範囲を示すものである。
哺乳動物成体生物などの動物のための生弱毒化又は死滅ウイルスワクチンの用量は、約１０2～１０20、例えば、１０3～１０12、１０2～１０10、１０5～１０11、１０6～１０15、１０2～１０10若しくは１０15～１０20プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｋｇ、又はその中の任意の範囲若しくは値であってもよい。例えば不活化ワクチンにおける１つのウイルス分離株ワクチンの用量は、約０．１～１０００の範囲、例えば、０．１～１０μｇ、１～２０μｇ、３０～１００μｇ、１０～５０μｇ、５０～２００μｇ、又は１５０～３００μｇのＨＡタンパク質であってもよい。しかし、前記用量は、出発点として既存のワクチンを用いて従来の方法によって決定される通りの安全で且つ有効な量であるべきである。
複製ウイルスワクチンの各用量における免疫活性ＨＡの用量は、適切な量、例えば、０．１μｇ～１μｇ、０．５μｇ～５μｇ、１μｇ～１０μｇ、１０μｇ～２０μｇ、１５μｇ～３０μｇ、若しくは３０μｇ～１００μｇ、又はその中の任意の範囲若しくは値、又は政府機関若しくは認識された専門組織によって推奨された量を含むために標準化されてもよい。しかし、ＮＡの量を標準化することも可能であり、この糖タンパク質は、精製及び貯蔵の間に不安定であり得る。
複製ウイルスワクチンの各用量における免疫活性ＨＡの用量は、適切な量、例えば１～５０μｇ又はその中の任意の範囲若しくは値、又は、通常、３歳超の年長の小児については１成分当たり１５μｇ、３歳未満の小児については１成分当たり７．５μｇである、アメリカ合衆国公衆衛生局（ＰＨＳ）によって推奨される量を含むために標準化され得る。しかし、ＮＡの量を標準化することも可能であるが、この糖タンパク質は、処理装置精製及び貯蔵の間に不安定である可能性がある（Ｋｅｎｄａｌら、１９８０；Ｋｅｒｒら、１９７５）。各０．５ｍＬ用量のワクチンは、約１００，０００，０００～５００，０００，０００個のウイルス粒子、５００，０００，０００～２，０００，０００，０００個のウイルス粒子、１，０００，０００，０００～５０，０００，０００，０００個のウイルス粒子、１，０００，０００，０００～１０，０００，０００，０００個のウイルス粒子、２０，０００，０００，０００～４０，０００，０００，０００個のウイルス粒子、１，０００，０００，０００～５，０００，０００，０００個のウイルス粒子、又は４０，０００，０００，０００～８０，０００，０００，０００個のウイルス粒子を含んでもよい。
以下の非限定的な実施例によって、本発明をさらに説明する。
実施例１
方法
色－インフルエンザの作製
ｅＣＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ及びｍＣｈｅｒｒｙを含む異なる蛍光レポータ遺伝子と融合させたＰＲ８のＮＳセグメントを、Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙら（２０１０）に記載されているように重複融合ＰＣＲによって構築した。手短に言えば、アミノ酸リンカーＧＳＧＧをコードしている配列によって、終止コドンを有さないＮＳ１遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を蛍光レポータ遺伝子のＮ末端と融合させた。蛍光レポータＯＲＦには、ＧＳＧリンカーをコードする配列、Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙら（２０１０）におけるブタテシオウイルス－１に由来する５７個のヌクレオチドを有する口蹄病ウイルスプロテアーゼ２Ａ自己タンパク質分解部位、及び核外移行タンパク質（nuclear export protein）（ＮＥＰ）のＯＲＦが続いた（図５）。加えて、サイレント突然変異をＮＳ１遺伝子の内在性スプライス受容部位に導入してスプライシングを抑止した（Ｂａｓｌｅｒら、２００１）。続いて、Ｎｅｗｍａｎｎら（１９９９）に記載されているように、構築されたＮＳセグメント（ｅＣＦＰ－ＮＳ、ｅＧＦＰ－ＮＳ、Ｖｅｎｕｓ－ＮＳ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＮＳと呼ばれる）をリバースジェネティクスのためのｐＰｏｌＩベクターにクローニングした。Ｖｅｎｕｓレポータタンパク質をコードするプラスミドは、Ａ．Ｍｉｙａｗａｋｉ博士（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、理化学研究所 脳科学総合研究センター、和光、日本）からの寄贈であった（Ｎａｇａｉら、 ２００２）。Ｎｅｗｍａｎｎら（１９９９）に記載されているようにリバースジェネティクスシステムを用いてＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を作製した。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８病原性レベル及びＶｅｎｕｓ発現レベルがマウスにおいてかなり弱くなったので、マウスにおいてＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の継代を連続的に行った。６回の継代の後、病原性が増加し、Ｖｅｎｕｓ発現が強くなった変異体（ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８）が得られた。ＭＤＣＫ細胞において、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８のストックが生成された。典型的には動物における連続的継代によって遺伝子的変異体から構成されるウイルス集団が生じるので、リバースジェネティクスを用いることによってＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を再形成した。同様に、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８と同じ遺伝子的骨格を有するＭＡ－ｅＣＦＰ－ＰＲ８、－ｅＧＦＰ－ＰＲ８及び－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＰＲ８を生成した。
リバースジェネティクスによってＶｅｎｕｓ－ＨＰＡＩウイルスを生成するために、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１；ＶＮ１２０３）のＮＳセグメントをＰＲ８のＶｅｎｕｓ－ＮＳと置換し、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８について記載されているように前記ウイルスをマウスに適応させた。ＭＤＣＫ細胞においてＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＨＰＡＩウイルスのストックを作製した。各種蛍光タンパク質を担持するこれらのインフルエンザウイルスの組をまとめて「色－インフルエンザ」と称した。
マウス実験
雌の６週齢のＣ５７ＢＬ／６（’Ｂ６’）マウスを日本エスエルシー株式会社（静岡、日本）から購入した。セボフルラン麻酔下で５０μＬのＰＢＳ中において図のパネルに示された用量で色－インフルエンザウイルスをマウスに鼻腔内接種し、体重及び生存率を１４日間モニタされた。図のパネルに示される時点で、ウイルス滴定、フローサイトメトリ分析及び組織学的実験のためにＰＢＳ接種マウス又は色－インフルエンザ感染マウスから肺を採取した。全ての動物実験は、東京大学動物実験委員会の規定に従って行われ、東京大学医科学研究所の動物実験委員会によって承認された。
組織学的検査及び細胞診断
４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）リン緩衝溶液中に肺を固定した。固定された組織をＯＣＴ化合物（サクラファインテック、東京、日本）の中に包埋し、液体Ｎ2によって凍結し、－８０℃で貯蔵した。クライオスタット６μｍ切片を、１％ＢＳＡ（ＰＢＳ－ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで３０分間処置して非特異的結合を阻止し、次いで、フィコエリトリン（ＰＥ）－Ｍａｃ３（Ｍ３／８４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、カリフォルニア州）でインキュベートした。ＭＤＣＫ細胞の細胞診断を検討するために、細胞を色－インフルエンザウイルスに感染させ、次いで、４％ＰＦＡリン緩衝溶液中に固定した。核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）で染色した。ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアによって制御される共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ａ１、ニコン、東京、日本）を用いて、切片及び細胞を視覚化した。定量的多色撮像分析のために、ＩｎＦｏｒｍソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州）を有するＮｕａｎｃｅ ＦＸ多スペクトル感応性イメージングシステムを有する倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＳ１００）を用いることによってスライドを視覚化した。
肺組織の全載標本化撮像
マウスを安楽死させ、心臓内にＰＢＳを潅流させて肺から血液細胞を除去した。４％ＰＦＡリン緩衝溶液による気管内潅流の後に肺を分離した。製造業者の使用説明書に従ってＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ａ２溶液（オリンパス、東京、日本）で肺組織をきれいにした。デジタルカメラ（ＤＦＣ３６５ＦＸ、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えた立体蛍光顕微鏡（Ｍ２０５ＦＡ、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ウェッツラー、ドイツ）を用いることによって画像を取得した。
二光子レーザ顕微鏡検査
合計で１０5ＰＦＵのＭＡ－ｅＧＦＰ－ＰＲ８をＢ６マウスに鼻腔内接種した。肺マクロファージを標識するために、感染後Ｄａｙ３において、マウスに５０μＬのＰＥ－ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を静脈内注射した。抗体注射の３０分後、マウスの肺を採取した。肺におけるｅＧＦＰ陽性細胞及びＰＥ陽性細胞のキネティクスを多光子顕微鏡（ＬＳＭ ７１０ ＮＬＯ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、オーバーコッヘン、ドイツ）で撮像した。分析の間、湿潤チャンバ（３７℃、５％ＣＯ2）内で完全培地（１０％ウシ胎仔血清を有するＲＰＭＩ１６４０）中において肺を維持した。ＬＳＭソフトウェアＺｅｎ２００９（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）でデータを処理した。ＨＰＡＩウイルス感染肺組織の三次元撮像のために、Ｂ６マウスに１０5ＰＦＵのＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＨＰＡＩウイルスを鼻腔内接種した。肺組織を、感染後Ｄａｙ２においてマウスから回収し、ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ａ２溶液（オリンパス）で処置して、上記のように組織を透明にした。肺組織の三次元画像を多光子顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ ＭＰ）から得た。
フローサイトメトリ分析及び細胞選別
単細胞懸濁液を得るために、肺を、ナイロンフィルタ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって組織を粉砕することによって、３７℃で３０分間、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｄ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、マンハイム、ドイツ；終濃度：２μｇ／ｍＬ）及びＤＮａｓｅ Ｉ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、レークウッド、ニュージャージー州；終濃度：４０Ｕ／ｍＬ）によって解離させた。ＲＢＣ溶解緩衝剤（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）による処置によって赤血球（ＲＢＣ）を溶解した。抗体の非特異的結合を阻止するために、精製抗マウスＣＤ１６／３２（Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）によって細胞をインキュベートした。蛍光抗体の適切な組み合わせによって細胞を染色して各免疫細胞サブセットの集団を分析した。以下の抗体、すなわち、抗ＣＤ４５（３０－Ｆ１１：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗Ｆ４／８０（ＢＭ８：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。死滅細胞の排除のために７－アミノアクチノマイシンＤ（Ｖｉａ－Ｐｒｏｂｅ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって全ての試料をインキュベートした。標識細胞からのデータを、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン９．３．１（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、サンカルロス、カリフォルニア州）によって分析した。Ｖｅｎｕｓ陽性マクロファージ及びＶｅｎｕｓ陰性マクロファージを肺から分離するために、染色された細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて選別した。
マイクロアレイ分析
選別されたマクロファージのトータルＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて抽出し、イソプロパノールによって沈殿させた。製造業者の使用説明書に従って、Ａｒｃｔｕｒｕｓ Ｒｉｂｏａｍｐ Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲＮＡ増幅を行った。ＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（１色）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、カリフォルニア州）を用いることによって標識し、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｍｏｕｓｅ ＧＥ ８Ｘ６０Ｋマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にハイブリダイズした。アレイをＳｕｒｅＳｃａｎ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇ２５６５ＣＡ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒで走査し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアバージョン１０．７．３．１（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてデータを取得した。プローブアノテーションは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＡＭＡＤＩＤ ０２８００５）によって提供された。プローブ強度を、それぞれ標準指数法及び分位点法を用いて、バックグラウンド補正し、正規化した。次いで、強度のｌｏｇ2を、対象の群を比較した線形モデルに当てはめた34。全ての報告されたｐ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて複数の仮説比較のために調整した。調整されたｐ＜０．０１を伴う対比の間に平均プローブ強度の少なくとも２倍の変化があった場合、転写物が差次的に発現したと考えた。階層的クラスタリングをＲにおいて行った。次いで、得られた遺伝子クラスタをＴｏｐｐＣｌｕｓｔｅｒ（Ｋａｉｍａｌら、２０１０）で分析して、各クラスタにおいて強化された遺伝子アノテーションを同定した。報告されたスコアは、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ調整ｐ値の－ｌｏｇ10である。
ウエスタンブロット分析
ＭＤＣＫ細胞の全溶解物をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）によって電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｉｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、マサチューセッツ州）にトランスファーした。膜をＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク、京都、日本）でブロックし、ウサギ抗ＧＦＰポリクローナル抗体（ＭＢＬ、名古屋、日本）、マウス抗ＮＳ１抗体（１８８／５）、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（Ｒ３０９）に対するウサギ抗血清又はマウス抗アクチン抗体（Ａ２２２８；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でインキュベートした後、ＨＲ共役抗マウス又は抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウォーキショー、ウィスコンシン州）でインキュベートした。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで前記膜を洗浄した後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｃｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅを用いて特異的タンパク質を検出した。ＶｅｒｓａＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いることによって特異的タンパク質バンドを視覚化した。
結果
ＮＳ１オープンリーディングフレームに融合されたレポータタンパク質を発現する蛍光インフルエンザウイルスを生成するために、Ｖｅｎｕｓを選択した（ＧＦＰと比較して発色団形成を向上させ、輝度を増加させるＦ４６Ｌを含む８つの突然変異を有するＧＦＰ変異体）（Ｗａｇａｉら、２００２）。レポータタンパク質を発現するインフルエンザウイルスについての弱毒化の以前の知見に基づいて予想されるように（Ｋｉｔｔｅｌら、２００４；Ｓｈｉｎｈｙａら、２００４）、Ｖｅｎｕｓ（ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８）を発現するＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８；Ｈ１Ｎ１）ウイルスのマウス病原性は、野生型ＰＲ８（ＷＴ－ＰＲ８）よりも実質的に低く、感染マウスの５０％が死滅するために必要な用量（ＭＬＤ50）は、ＷＴ－ＰＲ８についての１０2.5ＰＦＵと比較して、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８については１０4.5プラーク形成単位（ＰＦＵ）超であった。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスにおいて、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の継代を連続的に行った。６回の連続的継代の後、変異体（ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８と呼ばれる；赤血球凝集素タンパク質の３８０位におけるＴからＡへの突然変異とポリメラーゼサブユニットＰＢ２の７１２位におけるＥからＤへの突然変異とを有する）は、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８と比較して、かなりより高い病原性（ＭＬＤ50＝１０3.5ＰＦＵ）を有することが同定されたが、元のＰＲ８ウイルスよりも依然として病原性が低かった（図１Ａ）。マウス肺におけるＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の複製能を評価するために、１０4ＰＦＵのＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８ウイルス又はＰＲ８ウイルスをＢ６マウスに鼻腔内感染させた。試験された全ての時点において、肺ウイルス力価は、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８感染マウス及びＰＲ８感染マウスについて同様であった（図１Ｂ）。Ｖｅｎｕｓ発現の安定性を試験するために、感染マウス由来の肺ホモジェネートを用いてプラークアッセイを行い、感染後（ｐ．ｉ．）におけるＤａｙ３、Ｄａｙ５及びＤａｙ７の各々において１５０のプラークの内の１つのみがＶｅｎｕｓ陰性であることが分かったが、このことは、この組換えウイルスにおけるＶｅｎｕｓ発現の高遺伝的安定性を証明している。対照的に、ＮＳ１－ＧＦＰウイルスの７０％のみがレポータタンパク質を発現した（Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙら、２０１０）。ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の堅牢な毒性及び遺伝的安定性は、このウイルスが、インビボにおいてインフルエンザウイルス感染細胞を視覚化するための非常に魅力的なレポータシステムを表すことを示す。
Figure 2022527235000001
撮像ツールとしての蛍光インフルエンザウイルスの多用性を増加させるために、異なるスペクトルＧＦＰ変異体、すなわち、ｅＣＦＰ（ｅｘ．４３４ｎｍ、ｅｍ．４７７ｎｍ）及びｅＧＦＰ（ｅｘ．４８９ｎｍ、ｅｍ．５０８ｎｍ）を発現した付加的なＭＡ－ＰＲ８変異体を生成した（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、２００１）。Ｖｅｎｕｓ（ｅｘ．５１５ｎｍ、ｅｍ．５２８ｎｍ）よりも長い波長の蛍光を発するｍＣｈｅｒｒｙ変異体（ｅｘ．５８７ｎｍ、ｅｍ．６１０ｎｍ）（Ｎａｇａｉら、２００２；Ｓｈａｎｅｒら、２００４）も生成した。多スペクトル感応性蛍光レポータタンパク質をコードするこれらのインフルエンザウイルスは、まとめて「色－インフルエンザ」と呼ばれた。色－インフルエンザウイルスの病原性を決定するために、ＭＡ－ｅＣＦＰ、ｅＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＰＲ８のマウス肺組織におけるウイルス力価及びＭＬＤ50値をＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８及びＭＡ－ＰＲ８と比較した。ウイルス株の全ては、肺における比較的高い複製を示し、ＭＬＤ50値は、色－インフルエンザウイルスの中で同様であった（表１）。色－インフルエンザウイルスの蛍光発現の安定性を、プラークアッセイによってインビボ及びインビトロで試験した。感染後のＤａｙ７においてマウスの肺からウイルスを回収した場合、蛍光陽性プラークの割合は、９８．０％（ＭＡ－ｅＣＦＰ－ＰＲ８）、１００．０％（ＭＡ－ｅＧＦＰ－ＰＲ８）及び９６．４％（ＭＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＰＲ８）であった。感染後の７２時間後におけるＭＤＣＫ細胞の培養培地からの試料中の蛍光陽性プラークの割合は、１００．０％（ＭＡ－ｅＣＦＰ－ＰＲ８）、９９．２％（ＭＡ－ｅＧＦＰ－ＰＲ８）及び９８．２％（ＭＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＰＲ８）であることが分かった。加えて、ＭＤＣＫ細胞にＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８ウイルスを感染させ、抗ＧＦＰ抗体及び抗ＮＳ１抗体を用いることによってＮＳ１－Ｖｅｎｕｓキメラタンパク質を検出することによって、ウイルス感染細胞におけるＮＳ１－蛍光タンパク質キメラの安定性を検討した。色－インフルエンザウイルスに感染させた細胞における分解産物からではなく、ＮＳ１－蛍光タンパク質キメラから蛍光シグナルを主に発することを示す、検討された時点（すなわち、感染後１２時間）までＮＳ１－Ｖｅｎｕｓキメラタンパク質は分解されなかった。これらの知見は、色－インフルエンザウイルスの病原性及び安定性が、異なる蛍光レポータ遺伝子に影響されなかったことを示す。
マウス肺における色－インフルエンザウイルスの発現を評価するために、我々は、色－インフルエンザウイルスの各々に感染させたＢ６マウスから肺を回収し、方法セクションにおいて記載されるように視覚化のためにそれらを処理した。全ての４つの色は、蛍光立体顕微鏡によって分析された場合、全透明肺組織において明確に視認可能だった（図２Ａ）。蛍光シグナルは、感染後のＤａｙ３において気管支上皮層内に主に認められた。感染後のＤａｙ５において、蛍光シグナルは、末梢肺胞領域に広がった。これらのデータは、全ての４つの色－インフルエンザウイルスが、マウス肺におけるインフルエンザウイルス感染細胞の分布を分析するために有用であることを示した。マウス肺における色－インフルエンザウイルスの発現を評価するために、色－インフルエンザウイルスの各々に感染されたＢ６マウスから肺を回収し、方法セクションにおいて記載されるように視覚化のためにそれらを処理した。全ての４つの色は、蛍光立体顕微鏡によって分析された場合、全透明肺組織において明確に視認可能だった（図２Ａ）。蛍光シグナルは、感染後のＤａｙ３において気管支上皮層内に主に認められた。感染後のＤａｙ５において、蛍光シグナルは、末梢肺胞領域に広がった。これらのデータは、全ての４つの色－インフルエンザウイルスが、マウス肺におけるインフルエンザウイルス感染細胞の分布を分析するために有用であることを示す。
次に、全ての４つの色－インフルエンザウイルスの蛍光シグナルを同時に検出することができたかどうかを試験するために、Ｎｕａｎｃｅ（商標）スペクトルイメージングシステムを用いた。４つの株の混合物（各々総体積が５０μＬで２．５×１０4ＰＦＵ）を鼻腔内接種したＢ６マウスから肺組織を回収した。感染後のＤａｙ２及びＤａｙ５において得られた肺切片の分析は、全ての４つの色－インフルエンザウイルスの蛍光シグナルが互いに識別可能だったことを示した（図２Ｂ）。感染後のＤａｙ２において、気管支上皮細胞において同じ蛍光色のクラスタが認められたが、このことは、個別のウイルスの局所の広がりを示唆した。この時点で、限られた数の肺胞細胞が感染した。感染後のＤａｙ５において、我々は、単一の蛍光タンパク質を発現する肺胞細胞のクラスタを検出したが、このことは、単一のウイルスの感染の開始とその局所の広がりとを示した（図２Ｂ）。興味深いことに、同時に２つ又は３つの蛍光タンパク質を発現する上皮細胞が、低頻度ではあるものの検出されたが、このことは、これらの細胞の同時感染を示唆している（図２Ｃ）。インビボで異なるインフルエンザウイルスに同時感染した細胞を視覚化する能力は、技術の主要な進歩であり、インフルエンザ同時感染及び再集合処理に対する洞察を可能にすることになる。
次に、感染に対する宿主応答の分析のために、色－インフルエンザウイルスの有用性を試験した。マクロファージが先天性免疫及びインフルエンザウイルス感染肺における急性炎症に関与しているので、共焦点顕微鏡法を用いることによってマクロファージ（ＰＥ－Ｍａｃ３）に対する抗体で染色された肺切片を検討した。ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を有するマウスの感染後Ｄａｙ２におけるＶｅｎｕｓ陽性気管支上皮細胞を含むマクロファージ浸潤領域（図３Ａ）；対照的に、模擬感染動物由来の肺の肺胞においてほんの少数のＭａｃ３陽性細胞だけが検出された。この知見に基づいて、マウス肺におけるインフルエンザウイルス感染上皮細胞及びマクロファージの間の相互作用をさらに試験するために、ライブイメージングを用いた。未処置Ｂ６マウスの肺組織において、二光子レーザ顕微鏡を用いることによってＣＤ１１ｂ＋肺胞マクロファージを検出した。観察期間（４９分間；データは示されない）の間、これらのマクロファージのほとんどは移動しなかった（すなわち、ほとんど移動を示さなかった）。ＭＡ－ｅＧＦＰ－ＰＲ８ウイルスを感染させたマウスにおいて、多くのＣＤ１１ｂ＋マクロファージは、ｅＧＦＰ陽性上皮細胞に「付着する」と思われたが（データは示されない）、その上、これらのｅＧＦＰ陽性上皮細胞の一部は、アポトーシス細胞と同様の小疱形成を示した。興味深いことに、多くのＣＤ１１ｂ＋マクロファージがｅＧＦＰ陽性上皮細胞の周辺に迅速に移動したが、このことは、ＩＦＮ又はケモカインなどの炎症シグナルに対するマクロファージ応答の可能性を示唆している。したがって、本システムは、ウイルス感染細胞及び免疫細胞の間のインビボにおける相互作用をモニタするために使用され得る。
多くの研究は、インフルエンザウイルス感染マウスのトランスクリプトミクスプロファイル及びプロテオミクスプロファイルを評価してきた（Ｇｏら、２０１２；Ｚｈａｏら、２０１２）。これらの研究は全肺試料を用いたので、結果は、ウイルス感染細胞及びウイルス非感染細胞の合計であり、このことによって、宿主応答の希釈が生じ、非感染バイスタンダー細胞のプロファイルから感染細胞のプロファイルを区別することができなくなる。この欠点を克服するための第１のステップとして、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８に感染させたマウスの肺に由来するマクロファージ（インフルエンザウイルスが感染することが知られている（図３Ｂ））を、それらの蛍光タンパク質発現と実施されたマイクロアレイ分析とに基づいて選別した。ＰＢＳ（未処置マクロファージ）が接種されたマウスの肺から分離されたマクロファージは、対照としての役割を果たした。蛍光陽性マクロファージにおいて、６，１９９個の転写物が未処置マクロファージと比較して異なって発現した。対照的に、感染マウスから得られた蛍光陰性マクロファージにおいて、４，２５２個の転写物だけが、未処置マクロファージと比較して差次的に発現した。この差異は、活性インフルエンザウイルス感染によって誘導される遺伝子転写の差異を反映している可能性がある。しかし、感染動物から得られた蛍光陰性細胞集団は、蛍光シグナルがウイルス感染の早期ステージで期待されたようにまだ検出されていなかった感染細胞を含んでいた可能性があることに留意するべきである。実際、共焦点顕微鏡法によって、ＭＤＣＫ細胞の大部分において蛍光タンパク質発現を検出するのに９時間かかったことが明らかになった。各クラスタの機能的強化分析が続く差次的に発現した転写物の階層的クラスタリングは、感染動物から得られた蛍光陽性マクロファージ及び蛍光陰性マクロファージが、免疫応答、サイトカイン産生及び炎症に関連する経路の活性化を示すことを示した（図３Ｄ、緑色クラスタ）。蛍光陰性細胞におけるこれらの経路の上方制御は、（上記で考察したように）感染細胞及び／又はウイルス感染の早期ステージにあった細胞から放出されたＩＦＮ及びサイトカインによる細胞活性化から生じた可能性があった。さらに、強化アノテーションのサブセット、例えば、Ｉ型ＩＦＮ媒介シグナル伝達（図３Ｄ、淡青色のクラスタ）は、蛍光陽性マクロファージにおいてより高く発現した転写物を含んだ。加えて、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子は、蛍光陽性マクロファージにおいて最も上方制御された転写物の中のものであったことが認められた（図３Ｅ）。まとめると、この増強されたＩ型ＩＦＮ活性は、蛍光陽性細胞は感染したが、蛍光陰性細胞は非感染（しかし潜在的に「刺激された」）細胞及びインフルエンザウイルス感染の早期ステージにおける細胞の両方を含んだという示唆と一致している。実際、色－インフルエンザウイルスによる感染後の蛍光タンパク質発現を検出するのに少なくとも５時間かかったが、蛍光タンパク質（すなわち、ｅＣＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ及びｍＣｈｅｒｒｙ）の全てが、感染後の９時間後までに細胞の大部分において検出可能だった。これらの知見は、レポータタンパク質陽性細胞の遺伝子発現（又は他の型の発現）パターンを（放出されたサイトカインによって潜在的に刺激され、且つ／又は感染の早期ステージである）レポータタンパク質陰性細胞と比較する感染性疾患研究における新しい方法を開く。
最終的に、実施例ＩＩでさらに詳細に考察されるように、マウス適応蛍光インフルエンザウイルスの概念を高病原性トリインフルエンザＡ型（Ｈ５Ｎ１）（ＨＰＡＩ）ウイルスなどの他のインフルエンザウイルス株に適用することが可能であったかどうかについて試験したが、それらは、それらがヒトにもたらす脅威によって優先研究である。ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を作製するために用いられた同じ戦略を用いてＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（ＶＮ１２０３；Ｈ５Ｎ１）に基づいたＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＨＰＡＩウイルスを生成したが、ＶＮ１２０３ ＮＳ遺伝子を有するＶｅｎｕｓウイルスはマウスにおける病原性に寄与しなかったので、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓキメラタンパク質を発現するためにＰＲ８ ＮＳ遺伝子を用いた。Ｂ６マウスについてのＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＨＰＡＩウイルスの病原性はＶＮ１２０３と同等であり、両ウイルスについてのＭＬＤ50値は５ＰＦＵ未満であった（図４Ａ及びＨａｔｔａら、２００７）。ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＨＰＡＩウイルスは、全身に広がる能力も他のＨＰＡＩウイルスと共有し、脾臓、腎臓及び脳を含む各種器官の複製する（図４Ｂ及びＨａｔｔａら、２００７）。その上、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＨＰＡＩウイルス感染細胞が発した強い蛍光シグナルを利用して、肺組織内部の深いＨＰＡＩウイルス感染気管支の三次元画像を構築することに成功した（図４Ｃ及びデータは示されない）。この型の三次元撮像分析によって、インフルエンザウイルス感染気管支の空間的分布の理解が向上することになる。ＨＰＡＩウイルスとＰＲ８感染肺との間でウイルス感染細胞の分布を比較する場合、ＨＰＡＩウイルスは、ＰＲ８よりも迅速に気管支上皮から肺胞部位まで広がることが分かった（図４Ｃ及び図４Ｄ）。フローサイトメトリ分析を用いることによって、ＣＤ４５陰性非造血細胞及びＦ４／８０陽性マクロファージは、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８が接種された動物の肺よりもＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＨＰＡＩウイルスに感染させたマウスの肺においてＶｅｎｕｓを頻回に発現したことが分かったが（図４Ｅ及び図４Ｆ）、このことは、Ｈ５Ｎ１ ＨＰＡＩウイルスが、ＰＲ８よりも肺において重度の炎症応答を誘導するという知見を支持し、このことは、インフルエンザ病原性の比較試験のための色－インフルエンザウイルスの有用性を示す。
考察
この研究において、細胞レベルでインフルエンザウイルス感染を研究するために色－インフルエンザウイルスを生成した。色－インフルエンザウイルスは、堅牢なウイルス複製、毒性、安定な蛍光タンパク質発現、及び同時に視覚化され得る一組の４つの異なる色を含む、既存のシステムを超えるいくつかの向上を組み合わせる。色－インフルエンザウイルスは、全てのインフルエンザウイルス株に適用可能である。これらの向上によって、感染細胞及びバイスタンダー細胞の全般的トランスクリプトミクス分析が可能になり、初めて、マウス肺におけるインフルエンザウイルス感染細胞のライブイメージングが可能になる。
我々の元の構築体（すなわち、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８）を含む蛍光インフルエンザウイルスの以前のバージョン（Ｋｉｔｔｅｌら、２００４；Ｓｈｉｎｙａら、２００４）は、マウスにおいてかなり弱毒化された。これらの弱毒化された蛍光ウイルスは、初期標的細胞を同定するために依然として有用であり得る。しかし、これらの非常に弱毒化された非致死性ウイルスによって誘発された免疫応答は、マウス致死性親ウイルスの免疫応答とは著しく異なる可能性が最も高く、このことによって、病原性研究のためにそれらを用いることには問題がある。この問題は、マウスにおいてウイルスの継代を行うことによって解決された。この戦略は、２つの異なるインフルエンザウイルス株について成功したことが分かったが、このことは、その広い適用性を示唆している。以前に試験された蛍光インフルエンザウイルスの第２の欠点は、付加されたレポータタンパク質の遺伝的不安定性である（Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙら、２０１０）。しかし、感染後のＤａｙ７におけるマウス肺試料から検討されたウイルスプラークの約１００％がレポータタンパク質を発現した。
蛍光レポータタンパク質は、蛍光プローブを用いて生きている動物における組織の撮像のために検出されるために「生物学的光学ウインドウ（６５０～９００ｎｍ）」の中になければならないので（Ｗｅｉｓｓｌａｎｄｅｒ、２００１；Ｊｏｂｓｉｓ、１９７７）、現在、生きている動物において色－インフルエンザウイルスを非侵襲的にモニタすることはできず、ｍＣｈｅｒｒｙを含む蛍光レポータタンパク質のいずれも、色－インフルエンザのレポータタンパク質の中で発光が最も長くなく、この生物学的光学ウインドウの内側にない。Ｈｅａｔｏｎら（２０１３）は、生きている動物においてウイルス複製をモニタするために使用され得るルシフェラーゼレポータ発現インフルエンザウイルスを生成したが、このシステムは、あらゆる観察点において動物への基質の全身接種を必要とする。加えて、それらのイメージングシステム（ＩＶＩＳ（登録商標）システムに基づく）の分解能は、本システムによって我々が達成することが可能なインビボにおける細胞免疫機序の分析のために適切ではない。
撮像分析のための新しい技術（Ｇｈｏｚｎａｒｉら、２０１３）は、Ｎｕａｎｃｅ（商標）を用いることによって互いに区別され得る一組の４つの異なるインフルエンザ色変異体の発育を可能にしたが、ゆえに、それらの同時検出が可能になった。実際、我々の予備的研究は、２つ又は３つの異なる蛍光タンパク質を発現する肺上皮細胞を同定した（図２Ｃ）。これは、１超のインフルエンザウイルス株に感染させたマウス肺細胞の最初の視覚化であり得る。将来の研究において、インフルエンザウイルス再集合を、ゆえに、１９５７年（Ｓｃｈａｌｔｉｓｓｅｋら、１９７８；Ｋａｎａｏｋａら、１９８９）、１９６８年（Ｓｃｈａｌｔｉｓｓｅｋら、１９７８；Ｋａｎａｏｋａら、１９８９）及び２００９年（Ｓｍｉｔｈら、２００９；Ｉｔｏｈら、２００９）の流行性ウイルスなどの新規インフルエンザウイルスの生成をよりよく理解するために重要であり得るインビボにおけるウイルス同時感染の頻度などのインフルエンザウイルス研究における長期の疑問に対処するためにこれらの色変異体を用いることが可能であった。
記載されているツールセットを用いることによって、マウスの全肺組織においてインフルエンザウイルス感染細胞を検出したが、それによって、肺におけるインフルエンザウイルスの位置及び分布の観察が可能になった。その上、免疫細胞とのウイルス感染上皮細胞の相互作用が観察された。そのような研究によって、急性気管支炎から、高病原性インフルエンザウイルス感染のかなりの罹患率及び死亡率を引き起こす重度のウイルス性肺炎へのインフルエンザ疾患進行の直接モニタリングが可能になる（Ｇａｍｂｏｔｔｏら、２００８；Ｓｈｉｅｈら、２００９）。
結論として、高度な撮像技術と組み合わせた色－インフルエンザウイルスによって、動物の細胞レベルにおける検出が可能になる。
実施例ＩＩ
実施例Ｉにおいて開示されたように、リバースジェネティクスを用いて、Ｖｅｎｕｓ（Ｎａｇａｉら、２００２）（ｅＧＦＰの変異体）レポータ遺伝子を有するＨ５Ｎ１型ウイルス（野生型Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１型ウイルスと呼ばれる、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスと略記される）を調製したが、このウイルスは、マウスにおいて中等度の毒性及び低いＶｅｎｕｓ発現を示した。マウスにおける６回の継代の後、インビボにおいて高レベルのＶｅｎｕｓを安定して発現し、マウスにとって致死性であったマウス適応Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１型ウイルス（ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスと略記される）を取得し、感染マウスの５０％を死滅させるために必要な用量（ＭＬＤ50）は、３．２プラーク形成単位（ＰＦＵ）であったが、その親ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスについては１０3ＰＦＵであった。しかし、毒性及びＶｅｎｕｓ安定性のこの差異についての機序は不明だった。
この研究において、マウスにおけるＶｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１型ウイルスの毒性及びＶｅｎｕｓ安定性を決定する分子機序を探究した。リバースジェネティクスを用いることによって、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス及びＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの間の各種再集合体を救出し、マウスにおけるそれらの毒性を検討して病原性についての決定因子を同定した。さらに、インビトロ及びインビボにおけるＶｅｎｕｓ発現及びＶｅｎｕｓ安定性についての決定因子を検討した。前記知見は、哺乳動物におけるインフルエンザウイルスの病原性の理解を進め、インフルエンザウイルス関連ワクチン及びインフルエンザウイルス関連治療の開発に有益であった。
材料及び方法
細胞。１０％ウシ胎仔血清を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中においてヒト胎児腎臓２９３及び２９３Ｔ細胞を維持し、５％新生児ウシ血清が補充された最小必須培地（ＭＥＭ）中においてマジンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を維持した。５％ＣＯ2において３７℃で全ての細胞をインキュベートした。
プラスミドの構築。Ｎｅｕｍａｎｎら（１９９９）に記載されているように、ウイルス救出のためのプラスミドを構築した。ウイルスポリメラーゼ活性を測定するために、インフルエンザウイルスのＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＰのオープンリーディングフレームを遺伝子特異的プライマーでＰＣＲによって増幅し、ｐＣＡＧＧＳ／ＭＣＳタンパク質発現プラスミドにクローニングした（Ｄｉａｓら、２００９）。以下にプライマー配列を示す。
Figure 2022527235000002
前記構築体の全てを完全に配列決定して、望ましくない突然変異が存在しないことを保証した。
プラスミド系リバースジェネティクス。以前に記載されているように（Ｍｕｒａｋａｍｉ、２００８；Ｏｚａｗａら；２００７）、プラスミド系リバースジェネティクスを用いてインフルエンザＡ型ウイルスを生成した。ＭＤＣＫ細胞におけるプラークアッセイを用いることによって、救出ウイルスのウイルス力価を決定した。全ての救出ウイルスを配列決定して、望ましくない突然変異が存在しないことを確認した。
マウス実験。本研究において、６週齢の雌性Ｃ５７／ＢＬ６（Ｂ６）マウス（日本エスエルシー株式会社、静岡、日本）を用いた。マウスにおけるウイルス複製を測定するために、各群において６匹のマウスをイソフルランで麻酔し、次いで、１０5ＰＦＵ（５０μＬ）のウイルスを鼻腔内接種した。感染後（ｐ．ｉ．）のＤａｙ１及びＤａｙ３において、３匹のマウスを安楽死させ、肺、腎臓、脾臓及び脳を含むそれらの器官を回収し、ＭＤＣＫ細胞において滴定した。前記ウイルスの５０％マウス致死用量（ＭＬＤ50）を決定するために、各群からの４匹のマウスにそれぞれ１０0～１０5ＰＦＵ（５０μＬ）のウイルスを含む１０倍の系列希釈を鼻腔内接種した。体重及び生存率を、１４日間、毎日モニタした。Ｒｅｅｄ及びＭｕｅｎｃｈ（１９３８）の方法を用いることによって、前記ＭＬＤ50を算出した。全てのマウス実験は、東京大学の動物実験委員会の規定に従って行われ、医科学研究所（東京大学）の動物実験委員会によって承認された。
マウス及びＭＤＣＫ細胞におけるウイルス継代。実施例Ｉにおいて記載されているようにウイルスのマウス適応を行った。ＭＤＣＫ細胞におけるウイルス継代のために、０．０００１の感染多重度（ＭＯＩ）で、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞にウイルスを感染させた。感染後の４８時間後（ｈｐｉ）において、上清を回収し、ＭＤＣＫ細胞において滴定した。採取された新しいウイルスを用いて、次の継代のためのＭＤＣＫ細胞に感染させた。この手法を５回繰り返した。
増殖キネティクスアッセイ。各ウイルスを０．０００１のＭＯＩでサブコンフルエントのＭＤＣＫ細胞の３つのウェルに接種した。前記細胞に０．３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び１μｇ／ｍＬのトシルスルホニルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）トリプシンを含有するＭＥＭを補充し、５％ＣＯ2において３７℃でインキュベートした。感染後の示された時間で培養上清を採取した。ＭＤＣＫ細胞におけるプラークアッセイを用いることによって、異なる時点における上清のウイルス力価を決定した。
ミニゲノムルシフェラーゼアッセイ。以前にＭｕｒａｋａｍｉ（２００８）及びＯｚａｗａら（２００７）に記載されているように、二重ルシフェラーゼシステムを用いることによってポリメラーゼ活性をミニゲノムアッセイによって試験した。簡潔に言えば、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモータ（ｐＰｏｌＩ／ＮＰ（０）Ｆｌｕｃ（０）、０．２μｇ）の制御下でホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするレポータｖＲＮＡを発現するプラスミド及び内部トランスフェクション対照としてウミシイタケルシフェラーゼをコードするｐＲＬ－ｎｕｌｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ、０．２μｇ）によって、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス又はＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス（各々０．２μｇ）に由来するＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡについてのウイルスタンパク質発現プラスミドで２９３個の細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって細胞溶解物を調製し、ＧｌｏＭａｘ９６マイクロプレートルミノメータ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることによってルシフェラーゼ活性を測定した。ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して前記アッセイを標準化した。全ての実験を３回行った。
実験室施設。Ｈ５Ｎ１型ウイルスによる全ての研究は、農林水産省（日本）によってそのような使用のために承認された、東京大学（東京、日本）の増強されたバイオセーフティレベル３の封じ込め実験室内で行われた。
統計分析。Ｒソフトウェア（ｗｗｗ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）（バージョン３．１）を用いることによってデータを分析した。単一の時点において回収される複数の群からの測定値の比較のために、我々は、１元配置分散分析を用いた後、テューキーの事後検定を用いた。異なる時点において独立して得られる測定値（すなわち、ＭＤＣＫ細胞において得られる、マウス由来のウイルス増殖曲線）との複数の群の比較のために、我々は、２元配置分散分析を用いた後、テューキーの事後検定を用いた。複数の群と従属的測定値との比較のために（すなわち、異なる時点において同じ培養物からアリコートが回収された細胞培養物におけるウイルス増殖７曲線）、ＲパッケージＮＬＭＥを用いて線形混合効果モデルをデータに適合させ、時間、ウイルス株及びこれらの２つの因子間の相互作用を考察した。次に、ＲパッケージＰＨＩＡを用いて、同じ時点で（例えば、感染後の２４時間後における群＿１対群＿２、感染後の２４時間後における群＿１対群＿３、感染後の２４時間後における群＿２対群＿３）、ペアワイズ様式において株を比較するために、対比マトリックスを構築した。前記比較を個別に行ったので、多重比較を説明するためのホルムの方法を用いることによって最終的なｐ値を調整した。全ての場合において、我々がｐ値（又は調整されたｐ値）＜０．０５を得た場合、結果は統計学的に有意であるとみなした。
配列分析。デフォルトパラメータ及び最高１００の反復でＭＵＳＣＬＥプログラム（Ｅｄｇａｒ、２００４）を用いることによってＮＣＢＩ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ ＤａｔａｂａｓｅからのＰＢ２配列及びＰＡ配列をアラインメントした。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ（Ｌａｒｋｉｎら、２００７）を用いることによってアラインメントを視覚化し、受託開発のＰｅｒｌスクリプトを用いることによって特定位置におけるアミノ酸発生の頻度を決定した。
結果
ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス及びＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの間の比較。
実施例Ｉにおけるように、リバースジェネティクスを用いることによってＡ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）（ＶＮ１２０３と略記される）のＮＳセグメントをＶｅｎｕｓ－ＰＲ８ウイルスのＶｅｎｕｓ融合ＮＳセグメントと置換し、Ｖｅｎｕｓ蛍光レポータ遺伝子（ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス）を発現したＨ５Ｎ１型ウイルスを取得した。マウスにおける病原性分析は、このウイルスが、１０3ＰＦＵのＭＬＤ50値を有する親ＶＮ１２０３と比較して（ＶＮ１２０３について０．７ＰＦＵと比較して）マウスにおける弱毒化された毒性を示したことを示した（図６Ａ及び図６Ｂ並びにＨａｔｔａら（２００７））。その上、主に呼吸器官で複製されるＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス（表３）、及びそのＶｅｎｕｓ発現は、ＭＤＣＫ細胞（図７）及びウイルス感染後のマウス（図８）の両方において非常に弱かった。
Figure 2022527235000003
マウスにおけるＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの６回の継代の後、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスを得た。ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスは、３．２ＰＦＵのＭＬＤ50でマウスに対して致死性だった（実施例Ｉ）。このウイルスは、マウスにおいて全身的に複製したが、感染後のＤａｙ１において、肺、脾臓及び腎臓において高ウイルス力価が検出され、感染後のＤａｙ３において、脳においてウイルスを検出することが可能であった（表３）。その上、我々は、ＭＤＣＫ細胞（図７）及びマウス（図８）においてＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの高Ｖｅｎｕｓ発現を検出した。ゆえに、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１と比較して、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスは、マウスにおける非常により高い病原性と、より高い複製能とを示した。その上、このウイルスは、インビトロ及びインビボにおいて、その複製の間に高Ｖｅｎｕｓ発現を示した。
マウス適応の間に生じた遺伝子突然変異を同定するために、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスのゲノムを配列決定し、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスのゲノムと比較した。アミノ酸レベルにおいて、それらのＰＢ１遺伝子、ＰＢ２遺伝子、ＰＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子、Ｍ２遺伝子及びＮＳ１遺伝子において２つのウイルスの間に合計で７つの差異が見つかった（表４）。したがって、これらの７つの異なるアミノ酸の中の単一又は複数のアミノ酸変化は、これらの２つのウイルスの間のマウスの毒性及びＶｅｎｕｓ発現の差異に寄与する可能性がある。
Figure 2022527235000004
ＰＢ２のＶ２５Ａ及びＰＡのＲ４４３Ｋは、マウスにおけるＶｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの病原性及びＶｅｎｕｓ発現を決定する。
マウス適応後のＶｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの毒性及びＶｅｎｕｓ発現の差異についての遺伝子的基準を検討するために、ＲＧ－ＭＡウイルスと呼ばれたＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスのためのリバースジェネティクスシステムを確立した。ＲＧ－ＭＡウイルスは、その元のウイルス（ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス）と同様の器官におけるウイルス力価、ＭＬＤ50値（図６Ｃ、図６Ｄ及び図９）及びマウスにおけるＶｅｎｕｓ発現（図９）を示した。
ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス及びＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの間における毒性及びＶｅｎｕｓ発現の差異の原因となるアミノ酸を同定するために、６つの単一遺伝子性組換えウイルスを生成したが、各々は、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスに由来するＰＢ２遺伝子、ＰＢ１遺伝子、ＰＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子、Ｍ遺伝子又はＮＳ遺伝子とＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスに由来する他の７つの遺伝子とを有した。ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスのＰＢ１遺伝子、ＮＡ遺伝子又はＮＳ遺伝子（ＷＴ＋ＭＡ－ＰＢ１、ＷＴ＋ＭＡ－ＮＡ又はＷＴ＋ＭＡ－ＮＳと呼ばれる）を含んだ組換えウイルスは、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１（ＭＬＤ50、１０3ＰＦＵ）と同様のマウスにおける病原性を示したが（図９）、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１のＰＢ２遺伝子、ＰＡ遺伝子又はＭ遺伝子（ＷＴ＋ＭＡ－ＰＢ２、ＷＴ＋ＭＡ－ＰＡ又はＷＴ＋ＭＡ－Ｍと呼ばれる）を有する再集合体は、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１よりも高いマウスにおける病原性を示した（図９）。ＷＴ＋ＭＡ－ＰＢ２及びＷＴ＋ＭＡ－ＰＡは、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１よりもマウス肺において効率的に複製したが、その上、ＷＴ＋ＭＡ－ＰＢ２に感染させた３匹のマウスの内の２匹の脾臓においてウイルスが検出された。
３つの単一遺伝子性組換えウイルスを生成することによって、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１の毒性に対するＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１から誘導されたＰＢ２遺伝子、ＰＡ遺伝子又はＭ遺伝子の効果を検討したが、各々は、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスに由来するＰＢ２遺伝子、ＰＡ遺伝子又はＭ遺伝子と、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスに由来する残りのセグメントとを含む（ＭＡ＋ＷＴ－ＰＢ２、ＭＡ＋ＷＴ－ＰＡ又はＭＡ＋ＷＴ－Ｍと呼ばれる）。ＭＡ＋ＷＴ－ＰＢ２及びＭＡ＋ＷＴ－ＰＡのＭＬＤ50値は、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１（ＭＬＤ50、３．２ＰＦＵ）よりも有意に高い１０2.3ＰＦＵであったが、マウスにおけるＭＡ＋ＷＴ－Ｍの毒性は、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１と同様であった（図９）。これらのデータは、ＰＢ２遺伝子及びＰＡ遺伝子がマウスにおけるＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの病原性において役割を果たしたことを示唆する。
マウスにおけるウイルス病原性に対するＰＢ２遺伝子及びＰＡ遺伝子の潜在的相乗効果を評価するために、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス骨格上にＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１［ＭＡ－（ＰＢ２＋ＰＡ）］のＰＢ２遺伝子及びＰＡ遺伝子の両方を担持する再集合体とＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス骨格上における逆再集合体と［ＷＴ＋ＭＡ－（ＰＢ２＋ＰＡ）及びＭＡ＋ＷＴ－（ＰＢ２＋ＰＡ）と呼ばれる］を救出し、マウスにおける毒性について評価した。ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスからＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスへのＰＢ２遺伝子及びＰＡ遺伝子の置換は、３．２ＰＦＵのＭＬＤ50値でマウスにおけるその毒性を有意に増強し（図９）、マウスにおけるウイルスの広がり及び複製も増強したが、これはＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスと同様であり、逆もまた同様であった。マウス適応後においてＰＢ２及びＰＡに単一突然変異が存在すると仮定すると、これらのデータは、ＰＢ２のＶ２５Ａ及びＲ４４３ＫのＰＡがマウスにおけるＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの毒性に相乗的に寄与することを示す。
ＭＤＣＫ細胞における上記の再集合体のＶｅｎｕｓ発現を確認した際、ＭＡ－ＰＢ２遺伝子がＶｅｎｕｓ発現を著しく増加させることが分かった（図７）。加えて、肺におけるＷＴ＋ＭＡ－ＰＢ２ウイルスのＶｅｎｕｓ発現もかなり増強された（図８）。ＭＡ－ＰＡを含む他の単一遺伝子性置換は、Ｖｅｎｕｓ発現に影響を及ぼさなかったが、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス骨格上におけるＭＡ－ＰＢ２及びＭＡ－ＰＡの二重置換は、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス及びＷＴ＋ＭＡ－ＰＢ２ウイルスによって達成されるものと比較してＭＤＣＫ細胞及びマウス肺におけるＶｅｎｕｓ発現を増加させた（図７及び図８）。これらのデータは、ＰＢ２タンパク質のＶ２５Ａが、インビトロ及びインビボにおけるＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスのＶｅｎｕｓ発現において不可欠な役割を果たし、ＰＡタンパク質のＲ４４３Ｋが、Ｖｅｎｕｓ発現に対するＰＢ２効果を増強することを示す。
ＰＢ２タンパク質における２５位におけるアミノ酸は、哺乳動物細胞におけるウイルス複製を有意に増強する。
これらのウイルスの複製能をＭＤＣＫ細胞においてさらに検討し、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスが、ＲＧ－ＭＡウイルスと同様の複製能を有し、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスよりも効率的に増殖し、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの力価が、３６ｈｐｉ及び４８ｈｐｉでＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの力価よりも有意に高かったことが分かった（図１０）。次いで、２つのウイルスの複製に対するＰＢ２ウイルスセグメント及びＰＡウイルスセグメントの寄与を検討した。感染後のいくつかの時点におけるＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの力価と比較して、ＷＴ＋ＭＡ－ＰＢ２及びＷＴ＋ＭＡ－（ＰＢ２＋ＰＡ）の有意により高い力価が認められたが、それでも、ＷＴ＋ＭＡ－ＰＡの複製効率は、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの複製効率と同等だった（図１０）。ＷＴ＋ＭＡ－（ＰＢ２＋ＰＡ）の力価は、３６ｈｐｉ及び４８ｈｐｉでＷＴ＋ＭＡ－ＰＢ２の力価よりも高かったが、その差は統計学的に有意ではなかった（図１０）。これらの結果は、ＭＡ－ＰＢ２遺伝子がＭＤＣＫ細胞におけるＶｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの複製を増強し、この増加はＭＡ－ＰＡの存在下でさらに増強され得るが、ＭＡ－ＰＡ単独はＭＤＣＫ細胞におけるウイルス複製を改変しないことを示す。
マウス適応後のポリメラーゼ遺伝子における突然変異は、哺乳動物細胞におけるウイルスポリメラーゼ活性を減少させる。
ウイルスリボ核タンパク（ＲＮＰ）複合体のポリメラーゼ活性は、ウイルスの複製及び毒性と相関してきた（Ｇａｂｒｉｅｌら、２００５；Ｌｅｕｎｇら、２０１０；Ｌｉら、２００８；Ｓａｌｏｍｅｎら、２００６）。ルシフェラーゼ活性を測定することによって、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス又はＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスに由来するＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡの８つのＲＮＰの組み合わせの活性を決定した。マウス適合ウイルスのポリメラーゼ活性は、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスのポリメラーゼ活性よりも４倍近く低かった（図１１）。任意のＭＡ遺伝子の置換は、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスのポリメラーゼ複合体の活性を減少させたが、ＭＡ－ＰＢ２及びＭＡ－ＰＡの二重置換を含む複合体のポリメラーゼ活性は、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスのポリメラーゼ活性と比較して有意に減少し、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスのポリメラーゼ活性と同様であった。これらの結果は、ＲＮＰ複合体のポリメラーゼ活性がマウス適応後にとりわけ減少したことを示すが、このことは、増強された複製及び毒性と一致していない。
インビトロ及びインビボにおけるＶｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスにおけるＶｅｎｕｓ安定性の分子決定因子。
インビトロにおけるＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１及びＲＧ－ＭＡウイルスにおけるＶｅｎｕｓ安定性を評価するために、ＭＤＣＫ細胞において２つのウイルスの継代を５回行った。これらの継代の間、ＲＧ－ＭＡウイルスからではなく、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスからＶｅｎｕｓ陰性プラークを採取したが、これによって、Ｖｅｎｕｓ遺伝子がマウス適応後においてより安定していることが示唆された（表５）。このＶｅｎｕｓ安定性の分子決定因子を同定するために、ＭＤＣＫ細胞において各種再集合体の継代を５回行った。ＭＡ－ＰＢ１遺伝子、ＭＡ－ＮＡ遺伝子又はＭＡ－Ｍ遺伝子を有する再集合体からＶｅｎｕｓ陰性プラークを取得したが、我々は、ＭＡ－ＰＢ２遺伝子、ＭＡ－ＰＡ遺伝子、ＭＡ－（ＰＢ２＋ＰＡ）遺伝子又はＭＡ－ＮＳ遺伝子を有するＶｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの５回目の継代からいずれのＶｅｎｕｓ陰性プラークも得なかった（表５）。これらのデータは、ＭＡ－ＰＢ２遺伝子、ＭＡ－ＰＡ遺伝子及びＭＡ－ＮＳ遺伝子がＶｅｎｕｓ安定性において役割を果たすことを示唆する。
Figure 2022527235000005
Ｖｅｎｕｓ安定性に対するこれらの異なる遺伝子の役割をさらに評価するために、ＰＣＲ及びＮＳ特異的プライマーを用いることによって、異なる再集合体に由来する５回目の継代ストックのＮＳセグメントを増幅した。Ｖｅｎｕｓ－ＮＳセグメント（１．９ｋｂ）を除いて、欠失したＮＳセグメントは、１ｋｂ未満のＰＲ８のＮＳセグメントについてのレベルと同様のレベルで検出可能だった。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１並びにＭＡ－ＮＡ遺伝子及びＭＡ－Ｍ遺伝子を有する再集合体の欠失ＮＳセグメントは、他の再集合体の欠失ＮＳセグメントよりも非常に明るかったが（図１２）、このことは、ＭＡ－ＮＡ遺伝子及びＭＡ－Ｍ遺伝子がインビトロにおけるＶｅｎｕｓ安定性に寄与しないことをさらに含意する。ＲＧ－ＭＡウイルス並びにＭＡ－ＮＳ、ＭＡ－ＰＡ又はＭＡ－ＰＢ２を有する再集合体はより安定していたが、より小さい程度ではあるがＰＣＲを用いることによって欠失Ｖｅｎｕｓ－ＮＳセグメントをなお増幅させた（図１２）。各種再集合体に由来する欠失ＮＳセグメントを抽出し、配列決定し、異なる再集合体から異なる欠失形態を同定した（図１３）。
加えて、インビボにおけるＶｅｎｕｓ安定性を検討するために、Ｂ６マウスに１０5ＰＦＵのＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス、ＲＧ－ＭＡウイルス又はＷＴ＋ＭＡ－（ＰＢ２＋ＰＡ）ウイルスを接種した。マウスが死ぬ前に、感染後のＤａｙ４において肺を回収し、ＰＢＳ中でホモジナイズした。上清をＭＤＣＫ細胞内に接種し、４８ｈｐｉでＶｅｎｕｓ陰性プラークを採取し、ＭＤＣＫ細胞において増幅させた。プラークのＶｅｎｕｓシグナルは培養細胞の状態及び検出時間と相関する場合があるということに留意するべきである。ゆえに、増幅されたＶｅｎｕｓ陰性プラークのＶｅｎｕｓ発現をＭＤＣＫ細胞において再確認して偽陰性を除外した。各肺から９５個超のプラークを検出し、ＲＧ－ＭＡウイルスに感染させた３匹のマウスの内の１匹からＶｅｎｕｓ発現がない１個のプラークだけを取得し、ＷＴ＋ＭＡ－（ＰＢ２＋ＰＡ）に感染させた３匹のマウスから１２個のＶｅｎｕｓ陰性プラークを取得し、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスに感染させた各マウスから１５個超のＶｅｎｕｓ陰性プラークを取得した（表６）。これらの結果は、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスがインビボにおいてこれらのウイルスで最も不安定であり、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスに由来するＰＢ２遺伝子及びＰＡ遺伝子が、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスにおいて生じるものよりも少ない程度であるが、Ｖｅｎｕｓ安定性を増強することを示す。ゆえに、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＳにおける突然変異は、インビボにおけるＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスのＶｅｎｕｓ安定性に相乗的に寄与する可能性がある。
Figure 2022527235000006
考察
前に、マウスに対してより致死性となり、且つマウス適応後により安定することになったＶｅｎｕｓレポータ遺伝子を発現する視覚化可能なＨ５Ｎ１ウイルスを構築した（実施例Ｉ）。この研究において、このウイルス（ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１）の全ゲノムを配列決定し、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルス配列とは異なった７つのアミノ酸を同定した。これらの２つのウイルスの間のマウスにおける毒性及びＶｅｎｕｓ発現の差異についての分子決定因子を探究するために、リバースジェネティクスを用いて両ウイルスの一連の再集合体を生成した。ＰＢ２（Ｖ２５Ａ）及びＰＡ（Ｒ４４３Ｋ）の二重突然変異は、マウスにおけるＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１の病原性を著しく増強することが分かった。ＰＢ２のＶ２５Ａも、ＭＤＣＫ細胞及びマウスにおけるＶｅｎｕｓ発現及びウイルス複製を有意に増加させ、ＰＡのそのＲ４４３Ｋは、これらの効果をさらに増強した。異なる再集合体の安定性をインビトロにおいて検討し、ＭＡ－ＰＢ２、ＭＡ－ＰＡ又はＭＡ－ＮＳを有する再集合体がより安定していることが分かった。これらの結果は、ＰＢ２タンパク質及びＰＡタンパク質が、哺乳動物宿主におけるＶｅｎｕｓ発現Ｈ５Ｎ１ウイルスの病原性及びＶｅｎｕｓ安定性において役割を果たすことを示唆する。
哺乳動物における高病原性Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスの病原性は、複数のウイルス遺伝子によって決定される。例えば、ＨＡタンパク質は、ニワトリ（Ｋａｗａｏｋａ及びＷｅｂｓｔｅｒ、１９８８）及び哺乳動物（Ｈａｔｔａら、２００１；Ｓｕｇｕｉｔａｎら、２０１２）におけるＨ５サブタイプウイルスの全身複製及び致死性感染において重要な役割を果たす。Ｈ５Ｎ１ウイルスのＨＡ遺伝子及びＮＳ遺伝子も、フェレット（Ｉｍａｉら、２０１０）における高毒性に寄与する。ＮＳ１タンパク質は、宿主の抗ウイルス性免疫応答を破壊するのに役立ち、マウスにおけるＨ５Ｎ１ウイルスの病原性のために必須である（Ｊｉａｏら、２００５）。Ｍ１タンパク質における突然変異も、マウスにおけるＨ５Ｎ１ウイルスの毒性に影響を及ぼす（Ｆａｎら、２００９）。ＰＢ２の６２７位及び７０１位におけるアミノ酸は、哺乳動物におけるＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスの高毒性の主要な決定因子である（Ｈａｔｔａら、２００１；Ｌｉら、２００５）。最後に、ＰＡタンパク質は、アヒル（Ｓｏｎｇら、２０１１）及びマウス（Ｈｕら、２０１３）におけるＨ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスの毒性に寄与することが報告されている。ここで、ＰＢ２のＶ２５Ａ及びＰＡのＲ４４３Ｋは、マウスにおけるＨ５Ｎ１ウイルスの病原性に相乗的に寄与することが分かった。
公開データベース（ｗｗｗ．ｆｌｕｄｂ．ｏｒｇ）で入手可能なインフルエンザウイルス配列（２３５１４のＰＢ２タンパク質及び２４２４０のＰＡタンパク質）の全てに基づいて、ＰＢ２における２５Ｖ及びＰＡにおける４４３Ｒは極めて保存されるが、ＰＢ２における２５Ａは、２つのウイルス［Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／ＯＮ／４９９／２００５（Ｈ５Ｎ１）、受入番号ＥＦ３９２８４４；及びＡ／Ｚｈｅｊｉａｎｇ／９２／２００９（Ｈ１Ｎ１）、受入番号ＣＹ０９５９９７］だけに存在し、ＰＡにおける４４３Ｋは、ウズラから分離された１つの株［Ａ／Ｑｕａｉｌ／Ｓｈａｎｔｏｕ／１４２５／２００１（Ｈ９Ｎ２）、受入番号ＥＦ１５４８４６］だけに存在することが分かった。マウスにおけるこれらのウイルスの毒性は不明であるが、本研究は、ＰＢ２における２５Ａ及びＰＡにおける４４３Ｋの組み合わせが、マウスにおけるウイルスの毒性の増加に寄与し、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスの固有の特性であることを最初に示唆するものである。
インフルエンザＡ型ウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、ＰＢ１サブユニット、ＰＢ２サブユニット及びＰＡサブユニットからなり、ウイルスライフサイクルにおける多くの必須プロセスにおいて関連づけられる（Ｎａｆｆａｋｈら、２００５）。ＰＢ１は、ポリメラーゼ活性及びエンドヌクレアーゼ活性を行い、ＰＢ２は、キャップＲＮＡ認識の原因となり、ＰＡは、ＲＮＡ複製及びタンパク質分解活性に関与する（Ｏｂａｙａｓｊｏら、２００５）。これらのポリメラーゼサブユニットの界面は、転写開始のために必須である（Ｈｅら、２００８；Ｓｕｇｉｙａｍａら、２００９）。ＰＢ２タンパク質のＮ末端における残基１～３７は、ＰＢ１タンパク質への結合において不可欠な役割を果たし、ＲＮＡポリメラーゼ活性に影響を及ぼし、これらの残基は、インフルエンザウイルスの全サブタイプの中で極めて保存される（Ｓｕｇｉｙａｍａら、２００９）。ＰＢ２の２５位におけるアミノ酸は、そのＰＢ１－結合ドメインの第３α－ヘリックス（アミノ酸２５～３２）の中に位置する（Ｓｕｇｉｙａｍａら、２００９）。本研究において、ＰＢ２における２５位におけるアミノ酸は不安定であることが分かり、ＰＢ２におけるＶ２５Ａは、哺乳動物細胞及びマウスにおけるウイルス複製を増加させることによってマウスにおけるＨ５Ｎ１ウイルスの病原性がより高くなることが分かった。ＰＡタンパク質のＲ４４３残基も複製活性において役割を果たし（Ｏｂａｙａｓｈｉら、２００８；Ｒｅｇａｎら、２００６）、ＰＡにおける突然変異Ｒ４４３Ａは、感染性ウイルスの産生を阻止する（Ｒｅｇａｎら、２００６）。本研究において、それらのＰＡタンパク質におけるＲ４４３Ｋを有する再集合体が救出され、ＰＡにおけるＲ４４３Ｋがマウス肺におけるウイルス複製を増強することを示したが、このことは、それがマウスにおけるＨ５Ｎ１ウイルスの毒性であったことを強調する。したがって、本データは、インフルエンザウイルスについてのＰＡタンパク質の４４３位におけるアミノ酸の役割をさらに強調する。
より初期の報告は、ウイルスＲＮＰ複合体のポリメラーゼ活性がウイルス複製及び毒性と厳密に相関することを示している（Ｇａｂｒｉｅｌら、２００５；Ｌｅｕｎｇら、２０１０；Ｌｉら、２００８；Ｓａｌｏｍｏｎら、２００６）。哺乳動物細胞におけるより高いポリメラーゼ活性を有するウイルスは、マウス（Ｚｈａｎｇら、２０１４）及びフェレット（Ｓａｌｏｍｅｎら、２００６）において、概して、より高い毒性を示す。しかし、高ポリメラーゼ活性を有するウイルスは、必ずしもマウスに対して致死性ではなく、このことは、その宿主におけるウイルスの高病原性があるレベルのポリメラーゼ活性を必要とする可能性があることを示唆する（Ｇａｂｒｉｅｌら、２００５）。この研究において、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスは、その野生型対応物よりもマウスに対して致死性であるが、それでも、それは、ポリメラーゼ活性が非常により低く、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１に由来するポリメラーゼ遺伝子とのいかなるＲＮＰ組み合わせも、活性がより低かったことが分かった。これらの結果は、ｖＲＮＰ複合体のポリメラーゼ活性がウイルスゲノムと厳密に相関し、ポリメラーゼ活性のより低いレベルがＶｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１の再構築ゲノムに対してより適合性があり、このことがマウスにおけるその高い病原性に利益を与えることを含意している可能性がある。
インビボにおける生きたままの撮像の開発によって、蛍光レポータ遺伝子を担持しているインフルエンザウイルスを視覚化する能力は、インフルエンザウイルス関連研究にとって大きな利益となるであろう（Ｈｅａｔｏｎら、２０１３；Ｈｅｌｆｔら、２０１２；Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙら、２０１０；Ｐａｎら、２０１３；実施例Ｉ）。この目的のための有効なウイルスは、良好な複製能を有するべきであり、その宿主においてかなりの病原性を示す。その上、それは、非常に且つ安定してその蛍光レポータタンパク質を発現するべきである。ＧＦＰレポータ遺伝子を担持するインフルエンザＡ型ウイルスを構築する多くの試みが報告されているが（Ｋｉｔｔｅｌら、２００４；Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙら、２０１０）、しかし、これらのウイルスの一部は、マウスにおける低い複製又は劣った病原性を示したが（Ｋｉｔｔｌｅら、２００４）、一方で、一部は、比較的低い蛍光シグナルを生成したか、又はインビトロ及びインビボにおいてウイルス複製の間にＧＦＰを安定して発現しなかった（Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙら、２０１０）。本データは、マウスに対して高病原性のＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスであるが、それも、インビトロ及びインビボにおいてＶｅｎｕｓ蛍光タンパク質を非常に且つ安定して発現することを示す。Ｖｅｎｕｓ発現及びＶｅｎｕｓ安定性の分子決定因子の本分析において、ＰＢ２におけるＶ２５Ａが、ＰＡにおけるＲ４４３Ｋの存在によってさらに増強されたＶｅｎｕｓ発現の決定において役割を果たしたことが分かった。Ｖｅｎｕｓ安定性の分析によって、ＭＡ－ＰＢ１、ＭＡ－ＰＢ２、ＭＡ－ＰＡ又はＭＡ－ＮＳの単一遺伝子が、インビトロにおいてＶｅｎｕｓ安定性を決定するが、インビボにおいて、状況はより複雑であり、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＳにおける突然変異は、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスにおけるＶｅｎｕｓ安定性を相乗的に共同で決定することが可能であることが明らかにされた。
要約すると、マウスにおけるウイルスの病原性と、インビトロ及びインビボのおけるそのＶｅｎｕｓ発現及びＶｅｎｕｓ安定性とにおける重要な役割を果たす、マウス適応Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１ウイルスにおける分子決定因子を同定した。これらの分子マーカーは、抗インフルエンザウイルス薬及びワクチンの開発における将来の研究に利益を与えるであろう。
実施例ＩＩＩ
材料及び方法
細胞及びウイルス。５％の新生児ウシ血清（神経皮膚ＮＣＳ）を含有する最少必須培地（ＭＥＭ）中においてマジンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を維持した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が補充されたダルベッコ変法イーグル培地中においてヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）及びＨＥＫ２９３細胞を維持した。リバースジェネティクスを用いることによってＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１；ＰＲ８）（Ｈｏｒｉｍｏｔｏら、２００７）及び各ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスを生成し、Ｌ－（トシルアミド－２－フェニル）エチルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）処置トリプシン（０．８μｇ／ｍＬ）及び０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＭＥＭ中において、４８時間、３７℃で、ＭＤＣＫ細胞において増殖させた。
マウスにおけるＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスの適応。６～８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ）に５０μＬの２．３×１０6プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスを鼻腔内感染させた。肺を感染の３～６日後（ｄｐｉ）に採取し、１ｍＬのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中においてホモジナイズした。高い増殖能及びＶｅｎｕｓ発現を有するクローンを得るために、ＭＤＣＫ細胞を用いた肺ホモジェネートのプラーク精製を行った。大きな高いＶｅｎｕｓ発現プラークを採取し、クローニングされたウイルスを、３７℃で、４８時間、ＭＤＣＫ細胞において増殖させ、次いで、５０μＬの上清を次の継代のための接種物として用いた。これらの手法を６回繰り返した。
配列分析。ウイルスＲＮＡの配列分析を以前に記載されているように行った（Ｓａｋａｂｅら、２０１１）。簡潔に言えば、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いることによってウイルスＲＮＡを抽出し、ウイルスＲＮＡの逆転写のためにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（商標）逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とウイルスＲＮＡの３’末端において１２－ヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド（Ｋａｔｚら、１９９０）とを用いた。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）とＰＲ８ウイルスの各セグメントに対して特異的なプライマーとによるＰＣＲを用いることによって各セグメントを増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＡＢＩ ３１３０ｘｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いることによってそれらの配列を決定した。
プラスミド構築及びリバースジェネティクス。リバースジェネティクスのために、及び、突然変異誘発のための鋳型として、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモータ及びマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネータの間におけるＰＲ８遺伝子のクローニングされたｃＤＮＡを含むプラスミド（ＰｏｌＩプラスミドと称される）を用いた。部位特異的突然変異誘発を用いることによって、継代後にＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスにおいて見出された突然変異をＰＲ８のプラスミド構築体に導入した（それぞれ、ｐＰｏｌＩＲ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ及びｐＰｏｌＩＲ－ＰＲ８－ＨＡ－Ｔ３８０Ａと称される）。以前に記載されているように（Ｎｅｕｍａｎｎら、１９９９）、リバースジェネティクスを行った。ＴｒａｎｓＩＴ－２９３トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）を用いることによって、ＰＲ８から誘導されたＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰについての真核生物タンパク質発現プラスミドと共に、８つのＰｏｌＩプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、上清を採取し、ＴＰＣＫ処置トリプシン（０．８μｇ／ｍＬ）及び０．３％ＢＳＡを含有するＭＥＭ中において、３７℃で、４８時間、ＭＤＣＫ細胞において一度増殖させた。４℃で、２０分間、２，１００×ｇで遠心分離によって細胞破片を除去し、上清を、使用まで、－８０℃で貯蔵した。ＭＤＣＫ細胞を用いて、プラークアッセイによってウイルス力価を決定した。
多核細胞形成アッセイ。修飾によって、以前に記載されているように（Ｉｍａｉら、２０１２）、多核細胞形成アッセイを行った。１０の感染多重度（ＭＯＩ）において１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭにおいてＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスにおいて見出された赤血球凝集素（ＨＡ）突然変異を有する野生型ＰＲ８又はＰＲ８を、２４ウェルプレートにおいて増殖させたＨＥＫ２９３細胞に感染させた。感染の１８時間後に、細胞を、０．３％ＢＳＡを含有するＭＥＭで洗浄し、３７℃で、１５分間、０．３％ＢＳＡを含有するＭＥＭ中におけるＴＰＣＫ処置トリプシン（１μｇ／ｍＬ）で処置して、ＨＡ１及びＨＡ２に細胞表面上のＨＡを切断した。１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭで細胞を洗浄することによってトリプシンを不活化した。多核細胞形成を開始するために、３７℃で、２分間、低ｐＨ緩衝剤（１４５ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０～５．４））に細胞を曝露させた。次いで、低ｐＨ緩衝剤を、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭと交換し、３７℃で、２時間、細胞をインキュベートした。次いで、細胞をメタノールで固定し、ギムザの溶液で染色した。デジタルカメラ（ニコン）が装着された顕微鏡を用いて写真画像を得た。
ウエスタンブロット法。トリプシンなしで１のＭＯＩで各ウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させた。感染の１２時間後にＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ試料緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を溶解させ、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。次いで、タンパク質をトランスファー緩衝剤（１００ｍＭのＴｒｉｓ、１９０ｍＭのグリシン）中におけるＰＶＤＦ膜にトランスファーした。膜ブロック化の後、我々の実験室において入手可能であったＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（Ｒ３０９）に対するウサギ抗ＧＦＰポリクローナル抗体（ＭＢＬ）又はウサギ抗血清によって膜をインキュベートした。この抗血清は、ＨＡ、ＮＰ及びマトリックスタンパク質（Ｍ１）を含むインフルエンザウイルスタンパク質と反応する。一次抗体によるインキュベーションの後、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳ－Ｔ）を含有するＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ（商標）抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ結合完全抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって膜をインキュベートした。最終的に、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることによって特異的タンパク質を検出した。ＶｅｒｓａＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて写真画像を得た。
マウスにおけるウイルスの病原性及び複製。６週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５０μＬの１０3、１０4又は１０5ＰＦＵの各ウイルスを鼻腔内感染させた。１群当たり４匹のマウスを、感染後の１４日間、生存率及び体重の変化についてモニタした。１群当たり３匹のマウスに１０3ＰＦＵの各ウイルスを感染させ、示された日に前記マウスを安楽死させた。それらの肺を回収して、ＭＤＣＫ細胞におけるプラークアッセイによってウイルス力価を決定した。
免疫蛍光アッセイ。６週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５０μＬの１０4ＰＦＵの各ウイルスを鼻腔内に感染させた。示された日に１群当たりの３匹のマウスを安楽死させた。肺を固定するために、８００μＬの４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）リン緩衝溶液を前記肺に気管内注射し、次いで前記肺を除去した。４℃で４時間の１０ｍＬの４％ＰＦＡによるインキュベーションの後、緩衝剤をＰＢＳ中における１０％、２０％及び３０％のスクロースと段階的に交換した。次いで、肺をＯｐｔｉｍｕｍ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ）Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）で包埋し、液体窒素で凍結した。凍結した切片（厚さ６μｍ）をＰＢＳ中における０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理し、４℃で１２時間、一次抗体によってインキュベートした。一次抗体は、ヤギ抗クララ細胞１０ｋＤａのタンパク質（ＣＣ１０）（サンタクルーズ、ｓｃ－９７７２）、ウサギ抗界面活性剤タンパク質Ｃ（ＳＰ－Ｃ）（サンタクルーズ、ｓｃ－１３９７９）、ゴールデンシリアンハムスター抗ポドプラニン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｅＢｉｏ８．１．１）及びウサギ抗カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ８１９８）であった。ＰＢＳで洗浄した後、切片を、室温で３０分間、種特異的蛍光色素共役二次抗体によってインキュベートした。核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。Ｎｉｋｏｎ Ａ１共焦点顕微鏡（ニコン）を用いて切片を観察した。
透明試料の調製。以前の報告（Ｈａｍａら、２０１２）に従って、ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ Ａ２（オリンパス）を用いることによって透明試料を調製した。６週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５０μＬの１０5ＰＦＵの各ウイルスを鼻腔内感染させた。示された日に心臓内潅流を行い、４℃で４時間、ＰＢＳ中における４％ＰＦＡで肺を固定した。肺を、上記のようにＰＢＳ中における１０％、２０％及び３０％のスクロースによってインキュベートし、ＯＣＴ化合物で包埋し、液体窒素で凍結した。試料を解凍し、ＰＢＳで濯いだ後、室温で３０分間、ＰＢＳ中における４％ＰＦＡで再び固定した。次いで、肺をＳＣＡＬＥＶＩＥＷ Ａ２にトランスファーし、４℃で、少なくとも２週間インキュベートした。ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ Ａ２を２～３日毎に交換した。デジタルカメラ（ＤＦＣ３６５ＦＸ）及びフィルタＧＦＰ３（４８０／４０ＬＰ５１０）を装着した立体蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍ２０５ＦＡ）を用いることによって、透明試料を観察した。
フローサイトメトリ。単細胞懸濁液を調製するために、肺を鋏で切り刻み、３７℃で３０分間、２０ｍｇのコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）及び２００単位のＤＮアーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）によって消化させた。次いで、試料を１００μｍ細胞濾過器に通し、赤血球溶解緩衝剤（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）によって赤血球を溶解させた。以下の抗体、すなわち、アロフィコシアニン共役の抗Ｆ４／８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＭ８）、アロフィコシアニン－シアニン７共役抗ＣＤ１１ｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｍ１／７０）、フィコエリトリン－シアニン７共役抗ＣＤ１１ｃ（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、ＨＬ３）及びｅＦｌｕｏｒ４５０共役ＣＤ４５（ｅＢｉｏｓｃｉｎｃｅ、３０－Ｆ１１）の組み合わせで単細胞懸濁液を染色した。死滅した細胞をバイアプローブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で染色した。染色された試料をＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）によって分析した。
ＲＮＡの分離及び完全性。３つのプールされた肺に由来するＶｅｎｕｓ陽性細胞及びＶｅｎｕｓ陰性細胞をＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において回収した。担体としてのグリコーゲンによるイソプロパノール沈殿によってトータルＲＮＡを抽出した。ＵＶ２６０／２８０吸光度比を決定し、製造業者の使用説明書に従ってＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって２８Ｓ／１８ＳリボソームＲＮＡバンドを検討することによって、分離されたトータルＲＮＡの完全性を評価した。
マイクロアレイ分析。Ａｒｃｔｕｒｕｓ（登録商標）Ｒｉｂｏａｍｐ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることによって、４０ナノグラムのトータルＲＮＡを増幅した。製造業者の使用説明書に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ｏｎｅ ｃｏｌｏｒ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることによって、Ｃｙ３標識相補的ＲＮＡプローブ合成を１００ｎｇのトータルＲＮＡによって開始した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｇｅｎｅ Ｍｏｕｓｅ ＧＥ ８×６０Ｋマイクロアレイも用いた。スライドをＡｇｉｌｅｎｔのＨｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒで走査し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアバージョン１０．７．３．１を用いることによってイメージデータを処理した。続いて、全てのデータをデータ分析のためのＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸバージョン１２．５にアップロードした。データ分析のために、各遺伝子発現アレイデータセットを、ＰＢＳを接種したマウスに由来する試料のためのコンピュータ内におけるプールに正規化した。一元配置分散分析法（分散分析）の後、テューキーＨＳＤ事後検定（Ｔｕｒｋｅｙ ＨＳＤ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｅｓｔ）（Ｐ＜０．０５）及びＢｅｎｊａｍｉｎ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ誤発見率補正を用いることによって、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞及びＶｅｎｕｓ陰性細胞の間における遺伝子発現における統計学的に有意な差を決定した。発現がＰＢＳ群におけるレベルと比較して２．０倍変化した遺伝子を含むように、差次的に発現した遺伝子をさらに選別した。統計分析をパスした遺伝子を遺伝子オントロジー（ＧＯ）組分けにさらに割り当てた。
結果
マウス適応ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ウイルスの確立。リバースジェネティクスによってＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルスを救出することに成功したが、このウイルスは、マウスにおいて無毒性であり（ＭＬＤ50：＞１０5ＰＦＵ）、Ｖｅｎｕｓの発現は、ＭＤＣＫ細胞及びこのウイルスを感染させたマウスの肺切片において非常に弱かった。ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルスの毒性及びＶｅｎｕｓ発現を増加させるために、プラーク精製高Ｖｅｎｕｓ発現クローンによる鼻腔内感染によってマウスにおいて前記ウイルスの継代を連続的に行った（実施例Ｉ及び実施例ＩＩ参照）。６回の連続的継代の後、ウイルスの毒性は増加したと思われ、ゆえに、突然変異を探索するために、このマウス適応ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルスを配列決定した。
配列分析によって、継代後に２つのアミノ酸置換が生じたことが示された（表７）。
Figure 2022527235000007
突然変異の一方は、ＰＢ２中におけるものであり（７１２の位置におけるグルタミン酸からアスパラギン酸への置換）、他方は、ＨＡ中におけるものであった（３８０の位置におけるスレオニンからアラニンへの置換）。マウスにおける病原性に対するそれらの寄与を確認するために、これらの突然変異を対応するｐｏｌＩプラスミドに導入し、リバースジェネティクスを用いて、２つの突然変異を有するＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８（ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスと称される）を生成した。ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスの病原性は、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルスの病原性よりも高かった（ＭＬＤ50：２．１×１０4ＰＦＵ）。さらに、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスを感染させたマウスからの肺におけるＶｅｎｕｓシグナルは強かったが、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴを感染させた肺、及びＰＲ８に感染させた肺では、Ｖｅｎｕｓシグナルは検出されなかった（データは示されない）。ゆえに、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡは、有用なレポータウイルスとしての有望さを示した。
ＭＤＣＫ細胞における突然変異体ウイルス複製の比較。細胞系におけるこれらのウイルスの増殖を比較するために、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスのＰＢ２遺伝子又はＨＡ遺伝子、並びにＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルス及びＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスによる実験における使用のためのＮＳ－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルスに由来する残りの遺伝子を有する２つの単一遺伝子再集合体を生成させた。ＭＤＣＫ細胞に、０．００１のＭＯＩで、これらのウイルスを感染させ、プラークアッセイによって上清におけるウイルス力価を１２時間毎に決定した（図１４）。ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルスは、１０6.5ＰＦＵ／ｍＬに増殖したが、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスは、野生型ＰＲ８ウイルスと同等の１０8ＰＦＵ／ｍＬ超に増殖した。ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＰＢ２ウイルス及びＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＨＡウイルスのウイルス力価は、約１０7.5ＰＦＵ／ｍＬに達したが、これらは、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスのウイルス力価よりも低かった。ゆえに、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスの増殖能は、ＭＤＣＫ細胞において著しく向上し、ＰＢ２遺伝子及びＨＡ遺伝子における突然変異は、相加的に作用した。
突然変異体ウイルスのマウスにおける病原性及び複製の比較。次に、それらの病原性を評価するために、１０5ＰＦＵ、１０4ＰＦＵ又は１０3ＰＦＵのこれらのウイルスをＣ５７ＢＬ／６マウスに感染させ、それらの体重及び生存率をモニタした（図１５）。１０5ＰＦＵのこれらのウイルスを感染させたマウスの体重は著しく減少し、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルスを感染させた４匹のマウスの内の１匹、並びにＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＰＢ２ウイルス及びＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスを感染させたマウスの全てを、観察期間中に安楽死させる必要があった。加えて、１０4ＰＦＵのＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＰＢ２ウイルス及びＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスを感染させたマウスは、顕著な体重減少を示し、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＭＡウイルスを感染させた４匹のマウスの内の１匹と、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＰＢ２ウイルスを感染させた４匹のマウスの内の２匹とは、それらの感染に屈した。他方で、１０4ＰＦＵのＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＨＡウイルス及びＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルスを感染させたマウスの体重は、わずかに減少したものの、前記マウスの全てが生存した。１０3ＰＦＵによる感染の場合、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＰＢ２及びＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡを感染させたマウスの体重は、わずかに減少したが、これらのマウスの全ても生存した。１０3ＰＦＵのＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴ及びＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＨＡを感染させたマウスは、ほとんど体重減少を示さず、前記マウスの全てが生存した。これらのウイルスのウイルス力価をマウス肺において決定した（図１６）。マウスに１０3ＰＦＵのウイルスを感染させ、感染後のＤａｙ３、Ｄａｙ５及びＤａｙ７に肺を回収した。ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＰＢ２ウイルスを感染させたマウスの最大ウイルス肺力価は、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスを感染させたマウスの最大ウイルス肺力価と同様であった１０6ＰＦＵ／ｇ超であった。対照的に、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルス及びＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＨＡウイルスを感染させたマウスに由来する肺におけるウイルス力価は、全ての時点で、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＰＢ２ウイルス及びＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスを感染させたマウスに由来する肺におけるウイルス力価よりも有意に低かった。最終的に、感染の７日後において、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴを感染されたマウスに由来する肺においてウイルスは検出されなかった。まとめると、これらの結果は、ＰＢ２突然変異だけが、マウスにおけるＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスの病原性及び複製に影響を及ぼしたことを示す。
インビトロ及びインビボにおける複製中におけるＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスによるＶｅｎｕｓ発現の安定性。Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙの研究（Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙら、２０１０）において、ＧＦＰ陰性ウイルスの割合は、経時的に増加した。このことは、このウイルスをライブイメージング研究のために利用することに対する障害の内の１つである。ＭＤＣＫ細胞の複製中においてＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスによるＶｅｎｕｓ発現の安定性を評価した（図１７Ａ）。感染の７２時間後においても、プラークの９０％超がＶｅｎｕｓ陽性だった。細胞培養物におけるウイルスの反復継代の間にＶｅｎｕｓ発現の陽性率をモニタした（図１７Ｂ）。プラークの約９０％が、５回の継代後においてもＶｅｎｕｓを発現したが、このことは、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスによるＶｅｎｕｓ発現が細胞培養物において安定していたことを示唆する。最終的に、Ｖｅｎｕｓ発現は、インビボにおいてウイルス複製中に安定していたことが確認された（図１７Ｃ）。肺ホモジェネートを用いてプラークアッセイを行い、実質的に上記のようにＶｅｎｕｓ発現の陽性率を推定した。感染の３日後においてＶｅｎｕｓ陽性プラークの割合は８５％超であったが、感染の７日後では、Ｖｅｎｕｓ陽性プラークの割合は約７５％であった。まとめると、これらの結果は、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスによるＶｅｎｕｓ発現がインビトロにおいて複製中に安定しており、マウス肺におけるＶｅｎｕｓ陽性プラークの割合は、以前に報告されたもの（Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙら、２０１０）と同様であったことを示す。
ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ置換は、高Ｖｅｎｕｓ発現の原因となる。ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスのＶｅｎｕｓ発現レベルは、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルスのＶｅｎｕｓ発現レベルよりも実質的に高かった。ＰＢ２は、インフルエンザウイルスポリメラーゼのサブユニットの１つであるので、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ置換がＶｅｎｕｓ発現の増大にとって重要であると仮定された。Ｖｅｎｕｓタンパク質発現を比較するために、感染細胞におけるウイルスタンパク質及びＶｅｎｕｓのウエスタンブロットを行った（図１８Ａ）。感染の１２時間後、Ｍ１タンパク質の量は、ウイルスの全てについて同様であったが、Ｖｅｎｕｓタンパク質の量は、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＰＢ２ウイルス及びＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスを感染させた細胞において、親ＰＢ２遺伝子を有した他の２つのウイルスと比較して、より高かった。感染細胞におけるＶｅｎｕｓ発現は、共焦点レーザ顕微鏡を用いることによっても観察された（図１８Ｂ）。予想通り、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＰＢ２ウイルス及びＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスを感染させた細胞におけるＶｅｎｕｓシグナルは、親ＰＢ２遺伝子を有した２つのウイルスを感染させた細胞におけるものよりも強かった。まとめると、これらの結果は、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ置換が高Ｖｅｎｕｓ発現の原因であったことを示す。
ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異がＶｅｎｕｓ発現レベルを増加させたことを示すために、示されたウイルスを１のＭＯＩでＭＤＣＫ細胞に感染させ、１２時間後に共焦点顕微鏡法を行った（図１８Ｃ）。予想通り、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質のレベルは、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８又はＨＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を感染させた細胞よりも、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８又はＰＢ２－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を感染させた細胞において高かった（図１８Ｃ）。
まとめて、データは、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ置換が、主に、ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８ウイルスのマウスにおける複製能、Ｖｅｎｕｓ発現及び毒性の増加の原因となることを示す。ミニレプリコンアッセイにおいてＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異がウイルスポリメラーゼ活性に直接影響を及ぼすかどうかを評価するために、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするｖＲＮＡを発現するプラスミドと共に、ＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１及びＰＢ２又はＰＢ２－Ｅ７１２Ｄについてのウイルスタンパク質発現プラスミドによってＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトしたが、ｐＲＬ－ヌルルシフェラーゼタンパク質発現プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、トランスフェクション対照としての役割を果たした。トランスフェクションの４８時間後にＤｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることによってルシフェラーゼ活性を測定した（Ｏｚａｗａら、２００７）。予想外に、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄのポリメラーゼ活性は、親ＰＢ２のポリメラーゼ活性よりも低かった（図１８Ｄ）。同様の結果は、イヌＭＤＣＫ細胞によって得られた（データは示されない）。ウイルス複製及び転写を測定するミニレプリコンの文脈において、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異は、しかるに弱毒化しるが、対照的に、この突然変異は、ウイルスを複製する文脈においてウイルス増殖を増強する。これらの知見は、ＰＢ２タンパク質が、ウイルス複製／転写において機能するだけでなく、ウイルスライフサイクルにおいて付加的な役割を果たすことを示す。
ＨＡ－Ｔ３８０Ａ置換は、膜融合のための閾値を上げる。ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８のＨＡ ｖＲＮＡは、マウスにおけるＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の毒性を有意に増加させなかったが、しかし、ＨＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８ウイルスは、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８よりもＭＤＣＫ細胞において効率的に増殖したが（図１４）、このことは、少なくとも、培養された細胞におけるウイルス複製に対するＨＡ－Ｔ３８０Ａ突然変異の寄与を示唆する。ＨＡ－Ｔ３８０Ａ置換は、ＨＡ２サブユニットにおけるａ－ヘリックス上に位置するので（Ｇａｍｂｌｉｎら、２００４）、多核細胞形成アッセイを用いることによって、ＨＡ膜融合活性に対するその効果を評価した（Ｉｍａｉら、２０１２）。簡潔に言えば、ＨＥＫ２９３細胞に、１０のＭＯＩでＨＡ－Ｔ３８０ＡをコードするＷＴ－ＰＲ８又は突然変異体ＰＲ８ウイルスを感染させた。１８時間後、細胞を、３７℃で１５分間、ＴＰＣＫ処置トリプシン（１μｇ／ｍＬ）で処置し、低ｐＨ緩衝剤（１４５ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０～５．４））に２分間曝露させ、３７℃で維持培地中において２時間インキュベートし、メタノールによって固定し、ギムザの溶液で染色した。野生型ＨＡは、ｐＨ５．５の膜融合についての閾値を有したが、ＨＡ－Ｔ３８０Ａについての閾値はｐＨ５．８であり（図１９）、このことによって、インフルエンザウイルスの侵入中におけるエンドソーム成熟のより早期のステージにおいてＨＡのコンホメーション変化が生じた（Ｌｏｚａｃｈら、２０１１）。膜融合についてのｐＨ閾値の変化は、我々が５０℃で観察しなかった効果（データは示されない）であるＨＡ熱安定性に影響を及ぼす可能性がある（Ｒｕｉｇｒｏｋら、１９８６）。
全マウス肺におけるウイルス増殖の時間経過観察。ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスは、このウイルスによるＶｅｎｕｓ発現が顕微鏡による感染細胞の視覚化が可能にするために充分に高いので、免疫染色なしでのウイルス感染細胞の観察を可能にする。どのようにしてインフルエンザウイルスが肺において増殖するのかを観察するために、蛍光強度を低下させることなく試料を光学的に透明にする試薬であるＳＣＡＬＥＶＩＥＷ Ａ２を用いて透明な肺を処置する（図２０）。マウスに１０5ＰＦＵのＰＲ８ウイルス、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルス及びＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスを鼻腔内感染させ、感染後のＤａｙ１、Ｄａｙ３及びＤａｙ５に肺を回収した。ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ Ａ２による処置後、立体蛍光顕微鏡を用いて試料を観察した。直接観察されたＶｅｎｕｓシグナルは、不充分な透明性のために不明瞭だった。ゆえに、透明試料を長軸の方向に切開して気管支を曝露させた（図２０、下側のパネル、「切断」）。いずれの時点においても、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＷＴウイルスを感染させたマウスに由来する透明試料においてＶｅｎｕｓ発現は観察されなかった（図２０Ｇ及び図２０Ｈ）。感染の３日後に回収された試料を示す。ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスに感染させた肺の場合、Ｖｅｎｕｓシグナルは、感染の１日後に観察されなかったが（図２０Ａ及び図２０Ｂ）、Ｖｅｎｕｓ発現は、感染の３日後に気管支の上皮細胞の大きい部分において明瞭に観察された（図２０Ｃ及び図２０Ｄ）。場合により、気管支周辺の肺胞上皮細胞においてもＶｅｎｕｓ発現は観察された。感染の５日後において、気管支上皮で見出されたＶｅｎｕｓ陽性細胞のほとんどが消失し、細気管支及び肺胞におけるＶｅｎｕｓ陽性細胞の数が増加していた（図２０Ｅ及び図２０Ｆ）。これらの観察に基づいて、感染の３日後に気管支において見出されたＶｅｎｕｓ陽性細胞は死滅し、インフルエンザウイルスは、気管支から細気管支及び肺胞に経時的に広がったかもしれない。ＰＲ８又はＰＢＳを接種したマウスに由来する透明肺において、明らかなＶｅｎｕｓシグナルは観察されなかった（図２０Ｉ～図２０Ｌ）。これらの結果は、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルス及び透明試薬ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ Ａ２によって全肺葉におけるインフルエンザウイルス感染の動態の視覚化が可能になることを示す。
マウス肺におけるＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスの標的細胞の同定。ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスを感染させた透明肺は、インフルエンザウイルスが、最初に気管支上皮に感染し、続いて、経時的に肺胞に侵入したことを明らかにした。次に、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスの標的細胞を同定するために、肺細胞に対して特異的ないくつかの抗体を用いて凍結切片の免疫蛍光アッセイを行った（図２１）。気管支及び細気管支の上皮細胞は、クララ細胞、繊毛細胞、杯状細胞、及び少数の神経内分泌細胞を含むが、一方で肺胞は、Ｉ型肺胞上皮細胞及びＩＩ型肺胞上皮細胞を含む。クララ細胞が気管支及び細気管支の内腔のバルクを構成し（Ｒａｗｌｉｎｓら、２００６）、ＩＩ型肺胞上皮細胞がインフルエンザウイルスの標的であることが以前に報告されている（Ｂａｓｋｉｎら、２００９）ので、これらの細胞型の内、Ｉ型はクララ細胞に集中し、ＩＩ型は肺胞上皮細胞に集中した。感染の３日後において、かなりの割合の細気管支細胞はＶｅｎｕｓ陽性であり、これらの細胞のほとんど全てはＣＣ１０陽性だった（図２１Ａ）。加えて、肺胞領域における立方体様Ｖｅｎｕｓシグナルは、ＳＰ－Ｃ陽性細胞と結合した（図２１Ｂ、白色の矢印）。まれではあるが、感染の５日後にＶｅｎｕｓ陽性Ｉ型肺胞上皮細胞が観察された（図２１Ｂ、白色の矢印）。しかし、神経内分泌細胞におけるＶｅｎｕｓ発現は、全く検出されなかった（データは示されない）。
フローサイトメトリを行って肺胞マクロファージ及び単球がＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスに感染したかどうかを決定したが、その理由は、これらの免疫細胞が肺に存在し、吸い込まれた微生物及び粒子状物質に対する防御の最前線として機能するからである。肺胞マクロファージは、Ｆ４／８０+集団におけるＣＤ１１ｂ発現レベルに基づいて顕著な単球であった（図２２Ａ）。マウスに１０5ＰＦＵのＰＲ８ウイルス又はＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスを感染させ、これらの細胞の総数を比較した。インフルエンザウイルス感染の後、肺胞マクロファージの数は、対照群とめったに異ならなかったものの、単球は、血管から感染の部位に浸潤したので、単球の数は、著しく増加した（図２２Ｂ及び図２２Ｃ）。Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の割合に関して、感染の３日後において、肺胞マクロファージの３．１６％±０．５９％はＶｅｎｕｓ陽性細胞であり、単球の１．５５％±０．０７％はＶｅｎｕｓ陽性だった（図２２Ｄ及び図２２Ｅ）。さらに、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の数は、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルス感染の３～５日後にわずかに減少した。ＰＲ８感染について、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の数は、模擬処置マウスにおけるものと同等だった。まとめると、これらの結果は、気管支及び細気管支におけるクララ細胞、ＩＩ型肺胞上皮細胞、単球、及び肺の肺胞領域における肺胞マクロファージがインフルエンザウイルスの標的細胞であることを示す。
Ｆ４／８０+細胞集団におけるＶｅｎｕｓ陽性細胞及びＶｅｎｕｓ陰性細胞の間の差次的遺伝子発現。肺胞マクロファージ及び単球は、吸い込まれた微生物に対する防御の最前線として作用するので、インフルエンザウイルスによるこれらの細胞の感染は、感染の拡大を阻止するそれらの能力に影響するかもしれないという可能性がある。このことを評価するために、肺胞マクロファージ及び単球の集団の中におけるＶｅｎｕｓ陽性細胞及びＶｅｎｕｓ陰性細胞の間の遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイ分析によって比較した。フローサイトメトリを用いることによって１匹のマウスから回収することが可能であったＶｅｎｕｓ陽性肺胞マクロファージ及び単球の数は、マイクロアレイ分析を行うにはあまりに少なかったので、これらの細胞をＦ４／８０+細胞として一緒に分析し、３匹のマウスからプールした。生きた単核細胞をＣＤ４５+及びバイア－プローブ-細胞としてゲート付けした。図２２Ａに示されるように、前記細胞は、Ｆ４／８０+集団におけるＣＤ１１ｂ発現レベルに基づいて肺胞マクロファージ及び単球であることが確認された。Ｖｅｎｕｓ陽性Ｆ４／８０細胞及びＶｅｎｕｓ陰性Ｆ４／８０細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩによって生きた単核細胞の分画から選別した。ＣＤ１１ｃ高肺胞マクロファージが高い自己蛍光を有するので、Ｖｅｎｕｓシグナルとの重複の可能性があった。ゆえに、Ｖｅｎｕｓの中程度の発現を有するＣＤ１１ｃ高肺胞マクロファージは、Ｖｅｎｕｓ陽性分画から除外された（図２３Ａ）。選別された細胞の共焦点顕微鏡観測から、Ｖｅｎｕｓ発現に基づいてこれらの細胞を適切に回収することが可能であった（図２３Ｂ）。加えて、Ｖｅｎｕｓ発現が細胞の全体にわたって観測可能であったと仮定すると、これらの細胞は、ウイルスに感染したが、感染細胞を貪食しなかった。マイクロアレイ分析は、発現がＰＢＳを接種したマウスに由来するＦ４／８０+細胞のレベルと比較して統計学的に少なくとも２．０倍変化した何千もの遺伝子を示した（データは示されない）。これらの遺伝子の中で、発現がＶｅｎｕｓ陽性Ｆ４／８０+細胞及びＶｅｎｕｓ陰性Ｆ４／８０+細胞の間で統計学的に少なくとも４．０倍の差があった６３３個の遺伝子が同定された（図２４Ａ）。遺伝子オントロジー分析は、これらの遺伝子が細胞外活性に関与していたことを明らかにした（図２４Ｂ）。「サイトカイン活性」においてで注釈がつけられた遺伝子について、合計２４個の遺伝子は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）などのいくつかのサイトカイン及びケモカインを含む発現レベルが変わった（図２４Ｃ）。インターロイキン（ＩＬ）－４及びＣｘｃｌ１３［ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１３］についての遺伝子以外のこれらの遺伝子の全てを、Ｖｅｎｕｓ陰性細胞に対してＶｅｎｕｓ陽性細胞において上方制御した。その上、Ｉ型が「創傷に対する応答」において注釈がつけられた遺伝子上に集中した場合、コラーゲン１α１型（Ｃｏｌ１ａ１）、コラーゲン３α１型（Ｃｏｌ３ａ１）、コラーゲン５α１型（Ｃｏｌ５ａ１）、ヒアルロノグルコサミニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｄａｓｅ）１（Ｈｙａｌ１）及びフィブリノーゲンγ鎖（Ｆｇｇ）を含むほとんどの遺伝子をＶｅｎｕｓ陽性Ｆ４／８０+細胞において上方制御した（図２４Ｄ）。まとめると、これらの結果は、Ｆ４／８０+細胞の総数と比較して少数の細胞がインフルエンザウイルスに感染し、いくつかのサイトカイン及びケモカインの遺伝子発現レベルが感染の部位においてウイルス感染細胞において増強されたことを示す。さらに、ＮＳ１－Ｖｅｎｕｓ ＰＲ８ ＭＡウイルスに感染したＦ４／８０+細胞は、感染及び炎症によって引き起こされる創傷に対する応答に関与する遺伝子の発現を増強した。
実施例ＩＶ
ウイルスＮＳ１タンパク質を有する融合構築体から異種遺伝子産物を発現し得るベクターが上記に記載されている（図２６）。特に、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異は、異種遺伝子産物の発現を安定化した。試験ウイルス（ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８）の継代を連続的に行って、安定化に寄与するポリメラーゼ複合体における他の突然変異を同定した（図２７）。
実施例Ｖ
ポリメラーゼサブユニットＰＢ２の７１２位におけるＥからＤへの突然変異（ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ）は、挿入されたＶｅｎｕｓ遺伝子を安定化した（Ｆｕｋｕｙａｍａら、２０１５；Ｋａｔｓｕｒａら、２０１６）。また、ＰＲ８からＮＳセグメントに挿入されたＶｅｎｕｓ遺伝子を担持するＨ５Ｎ１ウイルス（Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１）も調製した（Ｆｕｋｕｙａｍａら、２０１５）。しかし、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８と同様に、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１は中等度の毒性及び低Ｖｅｎｕｓ発現を示したが、我々は、マウスに対してより致死性になり、マウス適応後にＶｅｎｕｓを安定して発現した変異体を取得した。ポリメラーゼサブユニットＰＢ２の２５位におけるＶからＡへの突然変異及びポリメラーゼサブユニットＰＡの４４３位におけるＲからＫへの突然変異は、Ｖｅｎｕｓ遺伝子の安定した維持に寄与した（Ｚｈａｏら、２０１５）。これらの結果は、ウイルスポリメラーゼの組成物が、挿入された外来遺伝子の安定化において役割を果たすことを示した。しかし、Ｖｅｎｕｓ遺伝子を欠失することができる機序と、ポリメラーゼ突然変異がＶｅｎｕｓ遺伝子を安定化する方法とは、不明なままであった。
以下で開示されるように、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８及びＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異を有するＶｅｎｕｓ－ＰＲ８（Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ）による感染の際の事象を比較することによって、Ｖｅｎｕｓ遺伝子安定化の機序を検討した。感染細胞におけるポリメラーゼ忠実度並びにＲＮＡ及びタンパク質発現を検討し、同時感染実験と併用した配列決定分析を行って、どのようにＶｅｎｕｓ遺伝子が欠失するのかを決定した。その上、安定化機序の理解を進めるために、Ｖｅｎｕｓ遺伝子の安定化に寄与する付加的突然変異を同定した。
材料及び方法
細胞及びウイルス。５％ＣＯ2において３７℃で５％新生児ウシ血清を有する最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）中でマジンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を培養した。１０％のウシ胎仔血清が補充されたダルベッコ変法イーグル培地中においてヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞を培養した。リバースジェネティクス（Ｎｅｕｍａｎｎら、１９９９）を用いることによって、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８及びＶｅｎｕｓ蛍光タンパク質をコードするＮＳセグメントを有するＶｅｎｕｓ－ＰＲ８突然変異体（Ｆｕｋｕｙａｍａら、２０１５）を生成し、３７℃でＭＤＣＫ細胞において増殖させた。
Ｖｅｎｕｓ安定性。ＭＤＣＫ細胞に、０．００１のＭＯＩで、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８又は各Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８突然変異体を感染させた。上清を、感染の４８時間後に回収し、ＭＤＣＫ細胞におけるプラークアッセイを用いることによって滴定した。得られたウイルスの継代を同様に４回行った。蛍光顕微鏡検査を用いて各ウイルスストックにおいて６５個超のプラークを観察することによって、異なる継代からのウイルスストックにおけるＶｅｎｕｓ発現プラークの割合をＭＤＣＫ細胞において決定した。偽陽性プラークを除外するために、Ｖｅｎｕｓ陰性プラークを採取し、ＭＤＣＫ細胞において増幅し、Ｖｅｎｕｓ発現について再評価した。
大規模配列決定分析 リバースジェネティクス（Ｎｅｕｍａｎｎら、１９９９）によってＷＴ－ＰＲ８、ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ、ＰＲ８－ＰＢ１－Ｖ４３Ｉ（Ｃｈｅｕｎｇら、２０１４；Ｎａｉｔｏら、２０１５）及びＰＲ８－ＰＢ１－Ｔ１２３Ａ（Ｐａｕｌｙら、２０１７）を生成し、ＭＤＣＫ細胞に０．００１のＭＯＩで感染させた。上清を、感染の４８時間後に回収し、ＭＤＣＫ細胞におけるプラークアッセイを用いることによって滴定した。得られたウイルスの継代を同じ方法で５回行った。ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることによって、継代を行う前のウイルス及び５回継代を行ったウイルスからウイルスＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ高忠実度ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによって逆転写－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を行った。０．４５倍のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭｐｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によってＤＮＡ単位複製配列を精製し、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を有するバーコード化されたライブラリ調製物のために１ｎｇを用いた。ビーズ系正規化（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の後、ＭｉＳｅｑ ｖ２ ３００サイクル試薬キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて対合端操作においてＭｉＳｅｑプラットフォーム上にライブラリを配列した。ＶｉＶａｎパイプライン（Ｉｓａｋｏｖら、２０１５）を用いることによって未処理配列の読み取りを分析した。ここで、最小頻度としての１％のカットオフを用いた。その上、我々は、最小読み取りカバレージのための実験的カットオフを以下のように規定した。すなわち、１％の頻度を有する変異体のために、少なくとも１，０００の読み取りがその領域をカバーするべきである。同様に、０．１％の頻度を有する変異体のために、１０，０００の読み取りがその領域をカバーするべきである。すなわち、カバレージが１，０００／（頻度）未満である場合、変異体を除去した。５回継代を行ったウイルスの配列決定データを、継代を行う前のウイルスの配列決定データと比較した。継代を行う前に観察されなかったが継代を行った後にだけ観察されたヌクレオチド突然変異の数を計数した。ヌクレオチド１個当たりの突然変異の数を各セグメントについて算出し、各ウイルスにおける全ての８つのセグメントについての平均値を比較した。
定量的リアルタイムＰＣＲ。ＭＤＣＫ細胞に１のＭＯＩでＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８若しくはＶｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄを感染させたか、又は模擬に培地を感染させた。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることによって、感染の９時間後にトータルＲＮＡを細胞から抽出した。以前に記載されているように（Ｋａｗａｋａｍｉら、２０１１）、ＲＮＡの定量を行った。ＩＦＮ－β、ＮＳ ｖＲＮＡ、ＮＰ ｖＲＮＡ及びβ－アクチンのためのプライマーは、以前に記載された（Ｋａｗａｋａｍｉら、２０１１；Ｋｕｐｋｅら、２０１８；Ｐａｒｋら、２０１５）。データを２-ΔΔCT法（Ｌｉｖａｋら、２００１）によって分析し、β－アクチンｍＲＮＡの発現に正規化した。
ウエスタンブロット法。ＭＤＣＫ細胞に１のＭＯＩで各ウイルスを感染させたか、又は模擬に培地を感染させた。示された時点において、Ｔｒｉｓ－グリシンＳＤＳ試料緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって細胞を溶解させた。細胞溶解物を音波破砕し、９５℃で１０分間加熱し、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。Ａｎｙ ｋＤ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸプレキャストタンパク質ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上のタンパク質を、ポリフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にトランスファーし、示された一次抗体（ウサギ抗ＮＳ１［ＧｅｎｅＴｅｘ］、マウス抗Ａｉｃｈｉ ＮＰ［２Ｓ ３４７／４］、マウス抗β－アクチン［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ］）を用いた後、二次抗体（ヒツジホースラディッシュペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］共役抗マウスＩｇＧ［ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］又はロバＨＲＰ共役抗ウサギＩｇＧ［ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］）を用いることによって検出した。ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることによって、特異的タンパク質のシグナルを検出した。画像をＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈイメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって取り込み、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いることによって定量した。
同時感染分析。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８のＮＳセグメントのパッケージングシグナル配列（Ｆｕｊｉｉら、２００５）に重ならない３’領域又は５’領域における３つのヌクレオチドの同義的置換を行った。これらの修飾ウイルスを用いて、各々０．００１のＭＯＩ又は各々５のＭＯＩでＭＤＣＫ細胞に同時感染させた。上清をそれぞれ感染の２日後又は８時間後に回収し、ＭＤＣＫ細胞に感染させた。Ｖｅｎｕｓ陰性プラークを採取し、ＭＤＣＫ細胞において増幅し、次いで、得られたウイルスにおけるＮＳセグメントの配列を分析した。
Ｖｅｎｕｓ遺伝子を安定化する付加的突然変異の同定。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を、０．００１のＭＯＩで、ＭＤＣＫ細胞に感染させた。上清を感染の２日後に回収し、ＭＤＣＫ細胞に感染させた。次に、Ｖｅｎｕｓ陽性プラークを採取し、Ｖｅｎｕｓ蛍光を安定して発現する突然変異体を得るまでＭＤＣＫ細胞において反復して増幅した。突然変異体の配列を分析して、ＰＢ２、ＰＢ１及びＰＡにおけるアミノ酸突然変異を同定した。これらの突然変異がＶｅｎｕｓ遺伝子の安定性に寄与したかどうかを決定するために、同定されたアミノ酸突然変異の各々を含む突然変異体をリバースジェネティクス（Ｎｅｕｍａｎｎら、１９９９）によって生成し、各突然変異体のＶｅｎｕｓ安定性を上記のように検討した。確認されたアミノ酸位置を、ＰｙＭＯＬ分子グラフィックスシステムを用いることによってインフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体（ＰＤＢ ＩＤ ４ＷＳＢ）の結晶構造上にプロットした。図３２Ｂにおいて、ＭＯＬＥｏｎｌｉｎｅウェブインターフェース（Ｐｒａｖｄａら、２０１８）を用いることによってポリメラーゼ内部トンネルを視覚化し、情報は、ＣｈａｎｎｅｌｓＤＢに寄託された（Ｐｒａｖｄａら、２０１８）。Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅにおいて「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｖａｒｉａｎｔ Ｔｙｐｅ」ツールを用いることによって、同定されたアミノ酸を含んだ株の割合を決定した（Ｚｈａｎｇら、２０１７；Ｎｏｒｏｎｈａら、２０１２）。
統計分析。両側独立スチューデントｔ検定を用いることによって、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８及びＶｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄの間の統計学的有意差を評価した。Ｐ値が０．０５未満であることは、有意差があると考えられた。
結果
ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８におけるＶｅｎｕｓ発現の喪失は、複製効率を回復させる。以前に記載されているように（Ｎｅｕｍａｎｎら、１９９９）リバースジェネティクスを用いることによって、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８及びＶｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄを調製した。図２８Ａに示されるように、Ｖｅｎｕｓ蛍光タンパク質の遺伝子をＮＳセグメントに挿入した（Ｆｕｋｕｙａｍａら、２０１５）。最初に、Ｖｅｎｕｓ発現がＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８においてどの程度迅速に喪失したのかについて、及びＶｅｎｕｓ欠失及びウイルス力価の間の関係について確認した。０．００１の感染多重度（ＭＯＩ）でＭＤＣＫ細胞においてウイルスの継代を行い、Ｖｅｎｕｓ陽性プラークの割合を測定した（図２８Ｂ）。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８においてＶｅｎｕｓの発現は直ちに喪失したが、Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄの全てのプラークは、４回の継代後にＶｅｎｕｓ発現を示したことが確認された。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８は、以前に記載されているように（Ｋａｔｓｕｒａら、２０１６）、ＭＤＣＫ細胞におけるＶｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄよりも低い力価を示したが、Ｖｅｎｕｓ陽性プラークの割合が減少するにつれてウイルス力価はウイルス継代の間に増加した（図２８Ｃ）。この結果は、突然変異ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８におけるＶｅｎｕｓ遺伝子の喪失がウイルスの複製効率を回復させたことを示唆する。
ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異は、ポリメラーゼ忠実度のかなりの変化を引き起こさない。
ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異は、継代の間、挿入されたＶｅｎｕｓ遺伝子を保持するために、ウイルスポリメラーゼ忠実度を増加させるということを仮定した。この仮説を試験するために、ＷＴ－ＰＲ８と、ＰＢ２の７１２位においてアスパラギン酸を有するので、このアミノ酸のみがＷＴ－ＰＲ８と異なるＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄとをリバースジェネティクスによって生成し、それらの突然変異率を比較した。ここで、突然変異率を測定することをより容易にするために、Ｖｅｎｕｓ遺伝子を含まなかったウイルスを用いた。忠実度が高い突然変異体ウイルスであることが報告されているＰＲ８－ＰＢ１－Ｖ４３Ｉ（Ｃｈｅｕｎｇら、２０１４；Ｎａｉｔｏら、２０１５）及び忠実度が低い突然変異体ウイルスであることが報告されているＰＲ８－ＰＢ１－Ｔ１２３Ａ（Ｐａｕｌｙら、２０１７）もリバースジェネティクスによって生成し、対照として用いた。突然変異率を推定するために、これらのウイルスの継代を、０．００１のＭＯＩで、ＭＤＣＫ細胞において行い、ゲノム全体の大規模配列決定を行い、継代を５回行ったウイルスについての配列決定データを、継代を行う前のウイルスの配列決定データと比較した。継代を行う前に存在しなかった継代を５回行ったウイルスにおけるヌクレオチド変化の数を計数した。５回の継代の間に導入された突然変異の数は、セグメントによって図２９Ａに示される。また、ヌクレオチド１つ当たりの突然変異の数も正規化のために算出し、８つの全セグメントについての平均値を比較した（図２９Ｂ）。忠実度が高い対照であるＰＲ８－ＰＢ１－Ｖ４３Ｉは、ＷＴ－ＰＲ８よりも突然変異が少なく、忠実度が低い対照であるＰＲ８－ＰＢ１－Ｔ１２３Ａは、ＷＴ－ＰＲ８よりも突然変異が多いことが確認された。ＰＲ８－ＰＢ１－Ｖ４３Ｉは、ＷＴ－ＰＲ８よりも突然変異が少なかったが、ＰＲ８－ＰＢ１－Ｖ４３Ｉ及びＷＴ－ＰＲ８の間の差は小さかった。以前の報告は、ＰＢ１－Ｖ４３Ｉが突然変異率を改変しないことを示唆したので（Ｐａｕｌｙら、２０１７）、突然変異率に対するＰＢ１－Ｖ４３Ｉの影響は、ウイルス株又は実験条件に依存した可能性があった。その上、ＷＴ－ＰＲ８及びＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄの間に突然変異数の明瞭な差はなかった。ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異がウイルスポリメラーゼ忠実度に影響を及ぼすという可能性を除外することはできないものの、その効果は、Ｖｅｎｕｓ安定性のかなりの差を引き起こすために充分に大きいとは思われない。ゆえに、この結果は、Ｖｅｎｕｓ遺伝子の安定性がウイルスポリメラーゼの忠実度によって影響されないことを示唆する。
修飾ＲＮＡセグメントの転写／複製は、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８において損なわれる。
いくつかの報告は、それらのＮＳセグメントにおける外来遺伝子挿入を含む組換えウイルスが、ＭＤＣＫ細胞などのＩＦＮコンピテント細胞におけるよりもインターフェロン（ＩＦＮ）欠乏性Ｖｅｒｏ細胞において効率的に増殖する可能性があることを示唆する（Ｋｉｔｔｅｌら、２００４；Ｆｅｒｋｏら、２００１；Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａら、２０１４）。ゆえに、定量的リアルタイムＰＣＲを用いることによって、ウイルス感染細胞におけるＩＦＮ－βの発現レベルを定量した。１のＭＯＩでＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８若しくはＶｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２ＤをＭＤＣＫ細胞に感染させたか、又は培地だけを模擬に感染させ、感染細胞におけるＩＦＮ－βの相対発現レベルを感染の９時間後に定量した。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８は、Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄよりも高いＩＦＮ－β発現レベルを誘導した（図３０Ａ）。この結果は、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８がＩＦＮ－β発現を効率的に阻害しないことを示唆する。ＮＳ１が宿主におけるＩＦＮ発現及びＩＦＮ媒介抗ウイルス応答を抑制することにおいて主要な役割を果たすと仮定すると（Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｓｔｒｅら、１９９８；Ｏｐｉｔｚら、２００７）、インフルエンザウイルスストランド特異的リアルタイムＰＣＲを用いることによって感染細胞におけるＮＳ ｖＲＮＡを定量した（Ｋａｗａｋａｍｉら、２０１１；Ｋｕｐｋｅら、２０１８）。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８感染細胞におけるＮＳ ｖＲＮＡの量は、Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ感染細胞におけるＮＳ ｖＲＮＡの量よりも９０％低かったが（図３０Ｂ）、それらのＮＰ ｖＲＮＡ発現レベルにおける有意な差（ｄｉｅｒｅｎｃｅ）はなかった（図３０Ｃ）。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８感染細胞におけるＮＳ ｖＲＮＡ／ＮＰ ｖＲＮＡ比は、Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ感染細胞におけるＮＳ ｖＲＮＡ／ＮＰ ｖＲＮＡ比よりも８０％低かった（図３０Ｄ）。この結果は、ＮＳセグメントの転写／複製がＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８において特異的に損なわれることを示唆する。リバースジェネティクスによってウイルスを生成するために用いられるプラスミドの内の全ての配列を使用前に確認し、同じＮＳ－ＶｅｎｕｓプラスミドからＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８及びＶｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２ＤのＮＳセグメントを誘導した。ゆえに、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８又はＶｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄが、そのＮＳセグメントにおいて突然変異プロモータ配列を有する可能性は低い。したがって、ＮＳセグメントの転写／複製効率性の差は、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄによって引き起こされた可能性がある。その上、ウエスタンブロット法によってＮＳ１タンパク質の発現レベルが確認された（図３０Ｅ）。ＮＳセグメントの転写／複製効率性の低下のため、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８感染細胞におけるＮＳ１タンパク質の発現レベルは、Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ感染細胞におけるＮＳ１タンパク質の発現レベルよりも非常に低かった。対照的に、ＮＰの発現レベルは、ほとんど同じであった。バンド強度に基づいて定量されたＮＳ１／ＮＰ比は、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８感染細胞において有意に低下した（図３０Ｆ）。ゆえに、ＮＳ１発現の低レベルがＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８感染細胞におけるＩＦＮ－βの高発現をもたらすと思われる。さらに、ＩＦＮ－βの高発現は、他の因子が含まれる可能性があるものの、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の弱毒化を引き起こす。
挿入されたＶｅｎｕｓ遺伝子は、内部欠失によって欠失する。
どのようにしてＶｅｎｕｓ遺伝子の欠失が生じるのかについて探究するために、連続的継代後にＶｅｎｕｓ発現を喪失したＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８におけるＮＳセグメントの配列を決定した。独立して継代を行った３つのＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８ウイルスストックを用いてプラークアッセイを行い、大部分のプラークがＶｅｎｕｓ陰性であることが分かった。各ストックに由来する５超のプラークを配列決定し、各ウイルスストックにおいて１又は２つの欠失パターンがあることが分かった。ＮＳセグメントにおいて大きな欠失が生じ、Ｖｅｎｕｓ配列の大部分が喪失した（図３１Ａ）。しかし、ヌクレオチド欠失の数、（１又は複数の）欠失の部位、又は欠失が生じた特異的配列などの欠失に関する特異的パターンは同定されなかった。前記大きな欠失は、不完全な干渉ウイルスＲＮＡ産生の知られた機序であるポリメラーゼ跳躍（Ｄａｖｉｓら、１９８０；Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、１９８３）又はウイルスゲノムの再配列によるＲＮＡウイルス適応において役割を果たす遺伝子組換え（Ｘｉａｏら、２０１６；Ｓｉｍｏｎら、２０１１；Ｍｉｔａｎｕｌら、２０００；Ｋｈａｔｃｈｉｋｉａｎら、１９８９）によって引き起こされた内部欠失から生じたと仮定された。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８のＮＳセグメントの３’領域又は５’領域に同義突然変異を導入し（図３１Ｂ）、次いで、これらの突然変異体ウイルスの各々を０．００１又は５のＭＯＩでＭＤＣＫ細胞に感染させた後、それぞれ感染の２日後又は８時間後に上清を回収した。次いで、ＭＤＣＫ細胞と共に上清をインキュベートした。Ｖｅｎｕｓ陰性プラークを採取し、ＭＤＣＫ細胞において増幅し、次いで、我々は、Ｖｅｎｕｓ発現を喪失したウイルスにおけるＮＳセグメント配列を決定した。我々は、トランケートされたＮＳセグメントが一方の側だけにおいて同義突然変異を有したことを見出した（図３１Ｃ）。両側において同義突然変異を有するか又は低ＭＯＩ同時感染及び高ＭＯＩ同時感染の両方における同義突然変異を有さないＮＳセグメントを有したウイルスは見出されなかった。この結果は、ＮＳセグメントにおける大きな欠失が、各ＮＳセグメントにおける内部欠失から生じたものであって、ＮＳセグメント間の遺伝子組換えから生じたものではないことを示す。
付加的突然変異は、Ｖｅｎｕｓ遺伝子を安定化する。
Ｖｅｎｕｓの欠失及び安定化の機序をさらに理解するために、Ｖｅｎｕｓ遺伝子を安定化するポリメラーゼ複合体において付加的突然変異を試みた。ＭＤＣＫ細胞に０．００１のＭＯＩでＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８を感染させ、次いで、Ｖｅｎｕｓ陽性プラークを採取し、ＭＤＣＫ細胞において増幅させた。Ｖｅｎｕｓ陽性ウイルスの連続的継代及びプラーク精製の後、増強されたＶｅｎｕｓ蛍光を安定して発現した突然変異体を得た。配列分析によって、突然変異が各突然変異体のポリメラーゼ遺伝子ＰＢ２、ＰＢ１及びＰＡに導入されたことを示した（図３２Ａ）。ＰＡ－１８０及びＰＡ－２００は、ＰＢ２－７１２のようにポリメラーゼ複合体の表面上に位置するが、一方でＰＢ２－５４０、ＰＢ１－１４９及びＰＢ１－６８４は、前記複合体の内部に位置する。ＰＡ－１８０及びＰＡ－２００は、エンドヌクレアーゼドメイン内に位置し、ＰＢ１－１４９及びＰＢ１－６８４は、ＲＮＡ鋳型の出口の近くに位置し、ＰＢ２－５４０は、新しく合成されたＲＮＡ産物の出口の近くに位置するが（図３２Ｂ）、ＰＢ２－７１２周辺の領域の機能は不明なままであった（Ｒｅｉｃｈら、２０１４；Ｐｆｌｕｇら、２０１７；Ｇｅｒｌａｃｈら、２０１５）。これらの突然変異がＶｅｎｕｓ遺伝子の安定化に寄与するかどうかを決定するために、リバースジェネティクスを用いることによって突然変異の各々を含む突然変異体ウイルスを生成し、ＭＤＣＫ細胞における４回の継代の後でＶｅｎｕｓ保持比を測定した（図３２Ｃ）。突然変異体ウイルスは、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８と比較して増強されたＶｅｎｕｓ安定性を示したが、このことは、これらのアミノ酸がＶｅｎｕｓ遺伝子の安定化において役割を果たすことを示す。ＰＢ２－５４０、ＰＢ１－１４９及びＰＢ１－６８４が、鋳型及び産物が転写／複製反応の間に通るポリメラーゼ内部トンネルの近くに位置することを考慮すると（Ｒｅｉｃｈら、２０１４；Ｐｆｌｕｇら、２０１７；Ｇｅｒｌａｃｈら、２０１５）、どのようにしてこれらのアミノ酸がＶｅｎｕｓ遺伝子の安定性に寄与するのかについて明らかにするためにさらなる分析が必要であるものの、これらのアミノ酸は、ＲＮＡ鋳型、産物及びポリメラーゼ複合体の結合安定性に影響を及ぼす可能性がある。これらの突然変異がＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅにおいて以前に分離されたインフルエンザＡ型ウイルスにおいて見出されたかどうかを我々が検討した際（図３２Ｄ）、我々は、これらのアミノ酸が極めてまれであることを見出したが、このことは、それらが進化的に有利ではないことを示唆する。
考察
外来遺伝子を発現する組換えインフルエンザウイルスは、有用なツールであるが、しかし、ウイルスゲノムにおける長い挿入は、多くの場合不安定であり、組換えウイルスの弱毒化を引き起こす。我々は、インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体におけるアミノ酸が外来遺伝子挿入の安定化において重要な役割を果たすことを以前に見出したが、ＮＳセグメントに挿入されるＶｅｎｕｓ遺伝子は、Ｈ１Ｎ１ウイルスにおけるＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ（Ｆｕｋｕｙａｍａら、２０１５；Ｋａｔｓｕｒａら、２０１６）及びＨ５Ｎ１ウイルスにおけるＰＢ２－Ｖ２５Ａ及びＰＡ－Ｒ４４３Ｋ（Ｚｈａｏら、２０１６）によって安定化された。しかし、これらのアミノ酸が前記安定化に寄与する機序は不明なままだった。本研究において、我々は、Ｈ１Ｎ１ウイルスのＮＳセグメントに挿入されたＶｅｎｕｓ遺伝子のＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ誘導安定化の機序を探究した。修飾セグメントの転写／複製効率性は、Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄと比較してＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８において有意に低下することが分かった。この知見は、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異が、修飾ＲＮＡセグメントの転写／複製効率性の増強のために、挿入された外来遺伝子を安定化することを示唆する。対照的に、付加配列を含まないセグメントの転写／複製効率性は、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異の有無にかかわらず変化しない。その上、ポリメラーゼ活性は、ミニレプリコンアッセイにおいて、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異によって低下し、増強されない（Ｋａｔｓｕｒａら、２０１６）。これらの結果は、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄによって引き起こされる転写／複製効率性の変化が修飾ＲＮＡセグメントに対して特異的であることを示す。外来遺伝子の挿入は、修飾セグメントの転写／複製を損なうと思われ、ポリメラーゼは、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異の存在下でこの障害を克服する。
Ｖｅｎｕｓ遺伝子がＮＳセグメントに挿入されるＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８において、このセグメントの転写／複製効率性は、著しく低下する。その結果、ＮＳ１タンパク質の発現も低下する。ＮＳ１は、ＩＦＮ媒介抗ウイルス応答を阻害することにおいて役割を果たすので（Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｓｔｒｅら、２００８；Ｏｐｔｉｚら、２００７）、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８は、効率的にＩＦＮ－β発現を阻害することができず、このことは、ウイルス弱毒化をもたらす可能性がある。ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８のウイルス力価は、ウイルスがＶｅｎｕｓ発現を喪失するにつれて、ＭＤＣＫ細胞における連続的継代の間に増加するが（図２８Ｂ及び図２８Ｃ）、このことは、Ｖｅｎｕｓ遺伝子を含まない突然変異ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８が元のＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８よりも効率的に増殖することを示唆する。ゆえに、ＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８におけるＶｅｎｕｓ発現の速やかな喪失が連続的継代の間においてＶｅｎｕｓ遺伝子を有さない変異体の選択から生じる可能性がある。Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄは、ＮＳセグメントの転写／複製効率性を回復させるが、このことは、効率的なウイルス複製をもたらす。ゆえに、Ｖｅｎｕｓを発現するウイルスは、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異の存在下で選択圧によってパージされないが、このことによって、Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄが、挿入されたＶｅｎｕｓ遺伝子を安定して維持することが可能になる。
どのようにして転写／複製効率性が、修飾ＲＮＡセグメント上で特異的に低下するのであろうか。そして、どのようにして、それは、ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異によって増強されるのであろうか。ＲＮＡ二次構造と、ポリメラーゼ複合体及びＲＮＡ鋳型の間の結合親和性とに、これらの問いに対する答えがある可能性がある。外来遺伝子の挿入は、ＲＮＡ二次構造を変化させるにちがいなく、ウイルスポリメラーゼ複合体による転写／複製は、この通常でないＲＮＡ二次構造によって負の影響を受ける可能性がある。どのようにしてＰＢ２－Ｅ７１２Ｄ突然変異が転写／複製の障害を克服するのかについて我々は決定的には知らないが、１つの可能性がある説明は、ポリメラーゼ複合体及びＲＮＡ鋳型の間の結合親和性が増加するというものである。
同時感染実験と併用した、Ｖｅｎｕｓ発現を喪失したＷＴ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８の配列分析（図２９Ｂ及び図２９Ｃ）は、挿入された配列が内部欠失のために欠失することを示唆した。内部欠失は、多くの場合、外来遺伝子挿入の存在にかかわらずインフルエンザウイルス複製サイクルの間に生じ、ウイルス適応（Ｌｕｉら、１９９３；Ｌｕｉら、１９８５；Ｙａｎｇら、１９８７）及び不完全な干渉ウイルスＲＮＡの生成（Ｄａｖｉｓら、１９８０；Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、１９８３）において役割を果たすことが報告されている。内部欠失は、転写／複製の間のＲＮＡ鋳型からのポリメラーゼ複合体解離によって引き起こされると考えられている（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、１９８３；Ｌａｚａｒｉｎｉら、２００１；Ｄｉｍｍｏｃｋら、２０１４；Ｌｏｐｅｚら、２０１４）。ポリメラーゼ複合体におけるアミノ酸突然変異は、内部欠失の出現頻度に影響を及ぼす（Ｆｏｄｏｒら、２００３；Ｖａｓｉｌｉｊｅｖｉｃら、２０１７；Ｓｌａｉｎｅら、２０１８；Ｔｅ Ｖｅｌｔｈｕｉｓら、２０１８）。ＰＢ２－Ｅ７１２Ｄは、内部欠失の出現に関与する可能性もある。ゆえに、Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８－ＰＢ２－Ｅ７１２ＤにおけるＶｅｎｕｓ遺伝子の安定化は、修飾セグメントにおける転写／複製の増強によってだけでなく、内部欠失の頻度の減少によっても引き起こされる可能性がある。
挿入されたＶｅｎｕｓ遺伝子を安定化するインフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体における付加的突然変異を同定したが、このことは、我々が、ウイルスポリメラーゼ複合体におけるこれらの突然変異の位置に基づいて安定化機序をさらに理解することに役立つ可能性がある。同定されたアミノ酸の一部は、転写／複製反応の間においてＲＮＡ鋳型又は新しく合成されたＲＮＡ産物の近くのポリメラーゼ内部トンネルの近くに位置する（Ｒｅｉｃｈら、２０１４；Ｐｆｌｕｇら、２０１７；Ｇｅｒｌａｃｈら、２０１５）。これらのアミノ酸は、ポリメラーゼ複合体、鋳型及び産物の間における結合親和性に直接影響する可能性がある。鋳型出口チャネルに位置するＰＢ２アミノ酸が、短い異常ＲＮＡの形成に関与することを示した以前の報告（Ｔｅ Ｖｅｌｔｈｕｉｓら、２０１８）は、ポリメラーゼ内部トンネルの近くのアミノ酸が、ポリメラーゼ複合体、鋳型及び産物の間の結合親和性に影響を及ぼすという可能性を支持する。しかし、エンドヌクレアーゼドメインに位置するＰＡ－１８０及びＰＡ－２００は、ポリメラーゼ内部トンネルの近くにないが、このことはＰＢ２－７１２についても当てはまる。ゆえに、これらのアミノ酸は、結合親和性に間接的に影響を及ぼす可能性があるか、又はＶｅｎｕｓ遺伝子の安定化に関与する他の機序がある可能性がある。これらの突然変異を、外来遺伝子を発現する組換えインフルエンザウイルスを確立するために用いることが可能であった。しかし、Ｖｅｎｕｓ－Ｈ５Ｎ１におけるＶｅｎｕｓ遺伝子を安定化させるＰＢ２－Ｖ２５Ａが、Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８におけるウイルス複製に対して負の影響を及ぼし、Ｖｅｎｕｓ安定化を引き起こさなかった（我々の未発表のデータ）ので、これらのアミノ酸は、必ずしも全てのインフルエンザウイルス株における外来遺伝子の安定化を引き起こす可能性があるというわけではない。
同定されたアミノ酸は、ウイルスゲノムの遺伝的安定性を増強すると思われるが、それらは、ウイルス分離株においてめったに見出されなかった（図３２Ｄ）。挿入された配列の維持を支持する突然変異は、ウイルスにとって進化的に有利ではない可能性があると思われる。ウイルスゲノムへの付加配列の挿入は、多くの場合、ウイルス複製のために有害である。これらの突然変異は、恐らく、有害な挿入の蓄積を回避することがウイルス集団においてまれである。ウイルスは、異常な二次構造を形成する挿入を含むＲＮＡセグメントの転写／複製効率性を低下させることによって、有害な挿入をパージすることが可能である。結論として、我々が本研究において同定したアミノ酸突然変異は、組換えウイルスを生成するために有用であるものの、それらは、長い目で見れば、自然界のウイルスにとって有利であるとは思われない。
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全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書において、本発明は、その特定の好ましい実施形態を参照して記載されたが、多くの詳細は、例示目的のために記載されたものであって、本発明がさらなる実施形態の余地があり、本発明の基本的原理を逸脱することなく本明細書における特定の詳細を著しく変更してもよいことは、当業者にとって明らかであろう。

Claims (42)

  1. ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント、ＰＢ２ウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＡウイルスセグメント及びＨＡウイルスセグメントを有する分離された組換えインフルエンザウイルスであって、前記ウイルスセグメントの内の少なくとも１つが、アスパラギンではない５４０位における残基を有するＰＢ２をコードするＰＢ２ウイルスセグメント、グルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメント、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメント、又はそれらの任意の組み合わせであり、前記組換えインフルエンザウイルスが、アスパラギンであるＰＢ２における５４０位における残基、グルタミンであるＰＡにおける１８０位における残基、スレオニンであるＰＡにおける２００位における残基、バリンであるＰＢ１における１４９位における残基、グルタミン酸であるＰＢ１における６８４位における残基又はアスパラギン酸であるＰＢ１における６８５位における残基を有する対応する組換えインフルエンザウイルスと比較して、安定性が増強されており、且つ／又は複製が増強されている、分離された組換えインフルエンザウイルス。
  2. ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント、ＰＢ２ウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＡウイルスセグメント及びＨＡウイルスセグメントを有する分離された組換えインフルエンザウイルスであって、前記ウイルスセグメントの内の少なくとも１つが、アスパラギンではない５４０位における残基又はグルタミン酸ではない７１２位における残基を有するＰＢ２をコードするＰＢ２ウイルスセグメントであり、前記他のウイルスセグメントの内の少なくとも１つが、グルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメント、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメント、又はそれらの任意の組み合わせであり、前記組換えインフルエンザウイルスが、アスパラギンであるＰＢ２における５４０位における残基、グルタミン酸である７１２位におけるＰＢ２における残基、グルタミンであるＰＡにおける１８０位における残基、スレオニンであるＰＡにおける２００位における残基、バリンであるＰＢ１における１４９位における残基、グルタミン酸であるＰＢ１における６８４位における残基又はアスパラギン酸であるＰＢ１における６８５位における残基を有する対応する組換えインフルエンザウイルスと比較して、安定性が増強されており、且つ／又は複製が増強されている、分離された組換えインフルエンザウイルス。
  3. ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント、ＰＢ２ウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＡウイルスセグメント及びＨＡウイルスセグメントを有する分離された組換えインフルエンザウイルスであって、前記組換えウイルスが、アスパラギンではない５４０位における残基若しくはグルタミン酸ではない７１２位における残基を有するＰＢ２をコードするＰＢ２ウイルスセグメント、グルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメント、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメント、又はそれらの任意の組み合わせを含む２つ以上のウイルスセグメントを有し、前記組換えインフルエンザウイルスが、アスパラギンであるＰＢ２における５４０位における残基、グルタミン酸である７１２位におけるＰＢ２における残基、グルタミンであるＰＡにおける１８０位における残基、スレオニンであるＰＡにおける２００位における残基、バリンであるＰＢ１における１４９位における残基、グルタミン酸であるＰＢ１における６８４位における残基又はアスパラギン酸であるＰＢ１における６８５位における残基を有する対応する組換えインフルエンザウイルスと比較して、安定性が増強されており、且つ／又は複製が増強されている、分離された組換えインフルエンザウイルス。
  4. ＰＢ２の５４０位における前記残基が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｑ若しくはＨであり、ＰＢ２の７１２位における前記残基が、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ若しくはＣであり、ＰＡにおける１８０位における前記残基が、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｎ若しくはＨであり、ＰＡにおける２００位における前記残基が、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｓ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｇ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における前記残基が、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｓ、Ｍ、Ｆ、Ｐ若しくはＧであり、６８４位における前記残基が、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における前記残基が、Ｅ、Ｎ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ若しくはＱである、請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルス。
  5. ＰＢ２の５４０位における前記残基が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ若しくはＣであり、ＰＢ２の７１２位における前記残基が、Ｄ、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｑ若しくは、Ｎであり、ＰＡにおける１８０位における前記残基が、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｙ若しくはＨであり、ＰＡにおける２００位における前記残基が、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｓ、Ｍ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における前記残基が、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ若しくはＧであり、６８４位における前記残基が、Ｄ、Ｑ、Ｈ、Ｌ、Ｒ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における前記残基が、Ｅ、Ｎ、Ｒ、Ｈ、Ｋ若しくはＱである、請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルス。
  6. ＰＢ２の５４０位における前記残基が、Ｋ、Ｒ若しくはＨであり、ＰＢ２の７１２位における前記残基が、Ｄ若しくはＮであり、ＰＡにおける１８０位における前記残基が、Ｒ、Ｋ若しくはＨであり、ＰＡにおける２００位における前記残基が、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における前記残基が、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ若しくはＧであり、６８４位における前記残基が、Ｄ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における前記残基が、Ｅ若しくはＱである、請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルス。
  7. 前記ＰＢ２が、アスパラギンではない５４０位における残基を有し、前記ＰＡが、グルタミンではない１８０位における残基及びスレオニンではない２００位における残基を有し、前記ＰＢ１が、バリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基又はアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有する、請求項１又は２に記載のウイルス。
  8. 前記ＰＢ２が、アスパラギンではない５４０位における残基を有し、前記ＰＡが、グルタミンではない１８０位における残基又はスレオニンではない２００位における残基を有し、前記ＰＢ１が、バリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基又はアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有する、請求項１又は２に記載のウイルス。
  9. 前記ＰＢ２が、アスパラギンではない５４０位における残基又はアスパラギン酸ではない７１２位における残基を有し、前記ＰＡが、グルタミンではない１８０位における残基及びスレオニンではない２００位における残基を有し、前記ＰＢ１が、バリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基又はアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有する、請求項２又は３に記載のウイルス。
  10. 前記ＰＢ２が、アスパラギンではない５４０位における残基及びアスパラギン酸ではない７１２位における残基を有し、前記ＰＡが、グルタミンではない１８０位における残基又はスレオニンではない２００位における残基を有し、前記ＰＢ１が、バリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基又はアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有する、請求項２又は３に記載のウイルス。
  11. 前記ＰＡが、アルギニンではない４４３位における残基をさらに含み、前記ＰＢ１が、リジンではない７３７位における残基をさらに含み、前記ＰＢ２が、バリンではない２５位における残基若しくはグルタミン酸ではない７１２位における残基をさらに含み、前記ＮＳウイルスセグメントが、プロリンではない１６７位における残基を有するＮＳ１をコードし、前記ＨＡウイルスセグメントが、スレオニンではない３８０位における残基を有するＨＡをコードし、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１から１０のいずれか一項に記載のウイルス。
  12. ＰＡの４４３位における前記残基が、Ｋ若しくはＨであり、ＰＢ１の７３７位における前記残基が、Ｈ若しくはＲであり、ＰＢ２の２５位における前記残基が、Ａ、Ｌ、Ｔ、Ｉ若しくはＧであり、ＰＢ２の７１２位における前記残基が、Ｄであり、ＮＳ１の１６７位における前記残基が、Ｓ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ若しくはＴであり、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１１に記載のウイルス。
  13. 前記ウイルスセグメントの内の少なくとも１つが、遺伝子産物をコードする異種遺伝子配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
  14. 前記異種配列が、前記ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント又は前記ＰＢ２ウイルスセグメント中におけるものである、請求項１３に記載の組換えウイルス。
  15. 前記異種配列が、前記ＰＡウイルスセグメントにおける５’又は３’から前記ＰＡコード配列までであり、前記ＰＢ１ウイルスセグメントにおける５’又は３’から前記ＰＢ１コード配列までである、請求項１３に記載の組換えウイルス。
  16. 前記異種配列が、前記ＰＢ２ウイルスセグメントにおける５’又は３’から前記ＰＢ２コード配列までである、請求項１３に記載の組換えウイルス。
  17. 前記異種配列が、前記ＮＳウイルスセグメントにおける５’又は３’から前記ＮＳ１コード配列までである、請求項１３に記載の組換えウイルス。
  18. 遺伝子産物をコードする異種遺伝子配列を含むさらなるウイルスセグメントを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
  19. 前記さらなるウイルスセグメントが、ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント又はＰＢ２ウイルスセグメントである、請求項１８に記載の組換えウイルス。
  20. Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９又はＨ１０であるＨＡを有する、請求項１から１９のいずれか一項に記載のウイルス。
  21. インフルエンザＡ型ウイルスである、請求項１から２０のいずれか一項に記載のウイルス。
  22. 請求項１から２１のいずれか一項に記載の分離された組換えウイルスを有するワクチン。
  23. 前記ウイルスが非インフルエンザ微生物タンパク質をコードする、請求項２２に記載のワクチン。
  24. 前記ウイルスが異種インフルエンザタンパク質をコードする、請求項２２に記載のワクチン。
  25. 前記ウイルスが癌関連抗原をコードする、請求項２２に記載のワクチン。
  26. ａ）転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＰＡ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＰＢ１ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＰＢ２ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＨＡ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＮＰ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＮＡ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＭ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、及び転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＮＳ ｃＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクターであって、ここで、ｖＲＮＡ産生のための前記ベクターにおける前記ＰＢ１ ＤＮＡ、前記ＰＢ２ ＤＮＡ又は前記ＰＡ ＤＮＡが、アスパラギンではない５４０位における残基を有するＰＢ２をコードするＰＢ２ウイルスセグメント、グルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡをコードするＰＡウイルスセグメント、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１をコードするＰＢ１ウイルスセグメント、又はそれらの組み合わせの内の少なくとも１つをコードする、ｖＲＮＡ産生のための前記ベクター、並びに、場合により、
    ｂ）インフルエンザウイルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、及びインフルエンザウイルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、並びに、場合により、インフルエンザウイルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、又はインフルエンザウイルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター
    を含む、再集合体を調製するための複数のインフルエンザウイルスベクター。
  27. ｖＲＮＡ産生のための前記ベクターにおける前記ＰＢ１ ＤＮＡ、前記ＰＢ２ ＤＮＡ、前記ＰＡ ＤＮＡ、前記ＮＰ ＤＮＡ、前記ＮＳ ＤＮＡ及び前記Ｍ ＤＮＡが、配列番号１～６又は１０～１５によってコードされる対応するポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするものに対応する配列を有する、請求項２６に記載のベクター。
  28. ＰＢ２の５４０位における前記残基が、Ｋ、Ｒ若しくはＨであり、ＰＡにおける１８０位における前記残基が、Ｒ、Ｋ若しくはＨであり、ＰＡにおける２００位における前記残基が、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における残基が、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ若しくはＧであり、６８４位における前記残基が、Ｄ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における前記残基が、Ｅ若しくはまたＱである、請求項２６又は２７に記載のベクター。
  29. 前記ウイルスセグメントの内の少なくとも１つが、遺伝子産物をコードする異種の遺伝子配列を含む、請求項２６から２８のいずれか一項に記載のベクター。
  30. 遺伝子産物をコードする異種遺伝子配列を含むウイルスセグメントを有するさらなるベクターを含む、請求項２６から２９のいずれか一項に記載のベクター。
  31. 細胞に、
    感染性インフルエンザウイルスを産生するために有効な量の、
    転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＰＡ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＰＢ１ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＰＢ２ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＨＡ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＮＰ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＮＡ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結するインフルエンザウイルスＭ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、及び転写終結配列に結合するインフルエンザウイルスＮＳ ＤＮＡに作動可能に結合するプロモータを含むｖＲＮＡ産生のためのベクターであって、ここで、ｖＲＮＡ産生のための前記ベクターにおける前記ＰＢ１ ＤＮＡ、前記ＰＢ２ ＤＮＡ又は前記ＰＡ ＤＮＡが、
    ｉ）アスパラギンではない５４０位における残基又はグルタミン酸ではない７１２位における残基を有するＰＢ２、及びグルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡ、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１、又はそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つ、又はｉｉ）アスパラギンではない５４０位における残基を有するＰＢ２、グルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡ、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１、又はそれらの任意の組み合わせ、又はｉｉｉ）アスパラギンではない５４０位における残基若しくはグルタミン酸ではない７１２位の残基を有するＰＢ２、グルタミンではない１８０位における残基若しくはスレオニンではない２００位における残基を有するＰＡ、又はバリンではない１４９位における残基、グルタミン酸ではない６８４位における残基若しくはアスパラギン酸ではない６８５位における残基を有するＰＢ１、又はそれらの任意の組み合わせの２つ以上
    をコードする、ｖＲＮＡ産生のための前記ベクター、並びに、場合により、
    インフルエンザウイルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、及びインフルエンザウイルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、並びに、場合により、インフルエンザウイルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、又はインフルエンザウイルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に結合するプロモータを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター
    を接触させることを含む、インフルエンザウイルスを調製するための方法。
  32. 前記細胞が、トリ細胞又は哺乳動物細胞である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記細胞が、Ｖｅｒｏ細胞、ヒト細胞又はＭＤＣＫ細胞である、請求項３２に記載の方法。
  34. ｖＲＮＡ産生のための前記ベクターにおける前記ＰＢ１ ＤＮＡ、前記ＰＢ２ ＤＮＡ、前記ＰＡ ＤＮＡ、前記ＮＰ ＤＮＡ、前記ＮＳ ＤＮＡ及び前記Ｍ ＤＮＡが、配列番号１～６又は１０～１５によってコードされる対応するポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするものに対応する配列を有する、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. ＰＢ２の５４０位における前記残基が、Ｋ、Ｒ若しくはＨであり、ＰＢ２の７１２位における前記残基が、Ｄ若しくはＮであり、ＰＡにおける１８０位における前記残基が、Ｒ、Ｋ又はＨであり、ＰＡにおける２００位における前記残基が、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ若しくはＶであり、ＰＢ１における１４９位における前記残基が、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ若しくはＧであり、６８４位における前記残基が、Ｄ若しくはＮであり、又はＰＢ１における６８５位における前記残基が、Ｅ若しくはＱである、請求項３１から３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記インフルエンザウイルスが、遺伝子産物をコードする異種遺伝子配列を含む、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記異種配列が、ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント又はＰＢ２ウイルスセグメント中におけるものである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記異種配列が、前記ＰＡウイルスセグメントにおける５’又は３’から前記ＰＡコード配列までであり、前記ＰＢ１ウイルスセグメントにおける５’又は３’から前記ＰＢ１コード配列までである、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記異種配列が、前記ＰＢ２ウイルスセグメントにおける５’又は３’から前記ＰＢ２コード配列までである、請求項３６に記載の方法。
  40. 前記異種配列が、前記ＮＳウイルスセグメントにおける５’又は３’から前記ＮＳ１コード配列までである、請求項３７に記載の方法。
  41. 遺伝子産物をコードする異種遺伝子配列を含むさらなるウイルスセグメントを含む、請求項３１から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記さらなるウイルスセグメントが、ＮＳウイルスセグメント、Ｍウイルスセグメント、ＮＰウイルスセグメント、ＰＡウイルスセグメント、ＰＢ１ウイルスセグメント又はＰＢ２ウイルスセグメントである、請求項４１に記載の方法。
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