JP6253576B2 - インフルエンザウイルス変異体およびその使用 - Google Patents

インフルエンザウイルス変異体およびその使用 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１１年６月２４日出願の米国仮特許出願第６１／５０１，０３４号の利益を主張するものであり、その内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる。
インフルエンザは、アメリカの成人の主な死因である。毎年、インフルエンザで約３６，０００人が死亡し、２００，０００人を超える人々が入院している。インフルエンザは、極めて伝染性の高い疾患であり、咳、くしゃみ、並びにドアノブおよび電話などのウイルスを保有する物体への直接の物理的接触により伝播する。インフルエンザの症状としては、発熱、極度の倦怠感、頭痛、悪寒および全身の痛みが挙げられ、感染者の約５０％が無症状であるが感染性を持つ。免疫処置は、流行しているウイルス株の抗原性がワクチンの抗原性と一致する場合に、６５歳未満の健常者でインフルエンザを予防するのに７０〜９５％効果的である。
ワクチン接種は、インフルエンザ予防の主要な方法であり、弱毒生ワクチンおよび不活化（死滅）ウイルスワクチンの両者が利用可能である。典型的には鼻腔投与される生ウイルスワクチンは、免疫系の全ての段階を活性化し、複数のウイルス抗原への免疫応答を刺激し得る。つまり、生ウイルスの使用により、不活化ウイルスワクチンの調製の間に発生しかねないウイルス抗原の破壊の問題が解消される。加えて、生ウイルスワクチンにより生成された免疫は、一般に不活化ワクチンにより誘導された免疫よりも持続性があり効果的で交差反応性がある他、生ウイルスワクチンは、不活化ウイルスワクチンよりも安価に製造される。しかし、弱毒ウイルスの変異は、多くの場合、不明確であり、復帰変異が懸念される。
一態様において、本開示は、配列番号１を含む核酸配列を提供する。
一態様において、本開示は、配列番号２を含む核酸配列を提供する。
一態様において、本開示は、配列番号３を含む核酸配列を提供する。
一態様において、本開示は、（ｉ）プロモーターと、（ii）転写終結配列とに動作可能に連結された配列番号１、配列番号２または配列番号３を含む組成物を提供する。
一態様において、本開示は、Ｍ遺伝子内に変異を含む組換えインフルエンザウイルスを提供する。一部の実施形態において、組換えインフルエンザウイルスは、配列番号１、配列番号２または配列番号３を含む。一部の実施形態において、Ｍ遺伝子内の変異により、ウイルスにＭ２蛋白質を発現できなくさせるか、またはウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる。一部の実施形態において、Ｍ遺伝子内の変異は、インビトロ宿主細胞系での少なくとも１０継代の間に、機能性Ｍ２蛋白質をコードする野生型または非野生型配列に復帰しない。一部の実施形態において、ウイルスは、インフルエンザＡ型ウイルスである。一部の実施形態において、ウイルスは、ウイルスに感染した哺乳動物において非病原性である。一部の実施形態において、インビトロ細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞を含む。一部の実施形態において、インビトロ細胞系は、ベロ細胞を含む。
一態様において、本開示は、特許請求の範囲５〜１０のいずれか一項に記載の組換えインフルエンザウイルスを含む細胞を提供する。一部の実施形態において、細胞は、インビトロのものである。一部の実施形態において、細胞は、インビボのものである。
一態様において、本開示は、Ｍ遺伝子内に変異を含む組換えインフルエンザウイルスを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、該組成物は、配列番号１、配列番号２または配列番号３を含む。一部の実施形態において、Ｍ遺伝子内の変異により、ウイルスにＭ２蛋白質を発現できなくさせるか、またはウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる。一部の実施形態において、ウイルスは、インフルエンザＡ型ウイルスである。一部の実施形態において、該組成物は、組成物を投与される哺乳動物に対して非病原性である。一部の実施形態において、該組成物は、哺乳動物への組成物投与後約３週間以内に哺乳動物において検出可能な免疫応答を誘発する。
一態様において、本開示は、Ｍ遺伝子内に変異を含む組換えインフルエンザウイルスを含むワクチンを提供する。一部の実施形態において、ワクチンは、配列番号１、配列番号２または配列番号３を含む。一部の実施形態において、Ｍ遺伝子内の変異により、ウイルスにＭ２蛋白質を発現できなくさせるか、またはウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる。一部の実施形態において、ウイルスは、インフルエンザＡ型ウイルスである。一部の実施形態において、ワクチンは、ワクチンを投与される哺乳動物に対して非病原性である。一部の実施形態において、ワクチンは、哺乳動物へのワクチン投与後約３週間以内に哺乳動物において検出可能な免疫応答を誘発する。一部の実施形態において、ワクチンは、組換えウイルスに加えて、少なくとも２種の異なるインフルエンザウイルス株を含む。一部の実施形態において、ワクチンは、少なくとも１種のインフルエンザＢ型ウイルスまたはインフルエンザＢ型ウイルス抗原を含む。一部の実施形態において、ワクチンは、少なくとも１種のインフルエンザＣ型ウイルスまたはインフルエンザＣ型ウイルス抗原を含む。一部の実施形態において、ワクチンは、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスおよび非ヒト種からのパンデミックインフルエンザウイルスを含む１種以上のウイルスまたはウイルス抗原を含む。一部の実施形態において、ワクチンは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、およびＨ３Ｎ２を含む群から選択されるヒトインフルエンザＡ型ウイルスを含む。
一態様において、本開示は、宿主細胞を組換えインフルエンザウイルスの配列番号１、配列番号２または配列番号３と接触させることと、宿主細胞をウイルス複製に適した条件下で十分な時間インキュベートすることと、子孫ウイルス粒子を単離することと、を含む、組換えインフルエンザウイルスを増殖させる方法を提供する。
一態様において、本開示は、宿主細胞をバイオリアクターに入れることと、宿主細胞を組換えウイルスの配列番号１、配列番号２または配列番号３と接触させることと、宿主細胞をウイルス増殖に適した条件下で十分な時間インキュベートすることと、子孫ウイルス粒子を単離することと、子孫ウイルス粒子をワクチンとしての投与のために製剤化することと、を含む、ワクチンを調製する方法を提供する。
一態様において、本開示は、Ｍ遺伝子内に変異を含む組換えインフルエンザウイルスを含む組成物を投与することと、を含み、Ｍ遺伝子内の変異により、ウイルスにＭ２蛋白質を発現できなくさせるか、またはウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる、対象を免疫処置する方法を提供する。
一態様において、本開示は、Ｍ遺伝子内に変異を含む組換えインフルエンザウイルスを含む組成物を投与することと、を含み、Ｍ遺伝子内の変異により、ウイルスにＭ２蛋白質を発現できなくさせるか、またはウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる、対象におけるインフルエンザＡ型ウイルスによる感染の可能性または重症度を低減する方法を提供する。一部の実施形態において、組換えインフルエンザウイルスは、配列番号１、配列番号２または配列番号３を含む。一部の実施形態において、該方法は、組成物の少なくとも１種のブースター用量を提供することを含み、少なくとも１種のブースター用量は、最初の投与後３週間目に提供される。一部の実施形態において、該方法は、組成物を鼻腔、筋肉内または皮膚内に投与することを含む。一部の実施形態において、該方法は、投与が皮膚内に実施されることを含む。一部の実施形態において、該方法は、投与がマイクロニードル送達デバイスを用いて実施されることを含む。
一態様において、本開示は、（ａ）（ｉ）穿刺機構と、（ii）皮膚を穿刺することが可能な複数のマイクロニードルを含む免疫原性組成物層と、を含み、免疫原性組成物を皮膚内投与させることが可能である、マイクロニードル送達デバイスを提供することと、（ｂ）穿刺機構を押し下げることと、を含み、免疫原性組成物が、Ｍ遺伝子内に変異を含む組換えインフルエンザウイルスを含み、Ｍ遺伝子内の変異により、ウイルスにＭ２蛋白質を発現できなくさせるか、またはウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる、免疫原性組成物の皮膚内投与方法を提供する。一部の実施形態において、組換えインフルエンザウイルスは、配列番号１、配列番号２または配列番号３を含む。一部の実施形態において、マイクロニードルアレイは、最初、デバイスハウジングの内部に配置されており、レバーの動作によりマイクロニードルをデバイスの底を貫通させて皮膚内に挿入させ、それによりワクチン液を皮膚に注入させる。
一態様において、本開示は、Ｍ遺伝子内に変異を含む組換えインフルエンザウイルスを提供し、ウイルスは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベロ細胞、またはメイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞からなる群より選択される非変性宿主細胞中で複製しない。一部の実施形態において、Ｍ遺伝子内の変異により、ウイルスにＭ２蛋白質を発現できなくさせるか、またはウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる。
一態様において、本開示は、インフルエンザウイルスＭ２イオンチャネル遺伝子をコードする核酸を含む組換え細胞を提供し、核酸は、細胞内で発現される。
一態様において、本開示は、２，６−シアル酸受容体遺伝子を含む組換え細胞を提供する。
一態様において、本開示は、（ｉ）ウイルスＭ２イオンチャネル遺伝子、および（ii）２，６−シアル酸受容体遺伝子、を発現する細胞内ゲノムまたは発現ベクターを含む組換え細胞を提供する。一部の実施形態において、細胞は、真核細胞である。一部の実施形態において、真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはベロ細胞である。一部の実施形態において、組換え細胞は、機能性Ｍ２蛋白質を発現しないヒトインフルエンザウイルスを更に含む。
一態様において、本開示は、（Ａ）（ｉ）機能性Ｍ２イオンチャネル蛋白質を構成的に発現するか、または（ii）機能性Ｍ２イオンチャネル蛋白質を発現するようにウイルス感染後に導入され、細胞により発現された機能性Ｍ２イオンチャネル蛋白質の存在下のみで複製に成功する、請求項４７〜５２の１項に記載の細胞を、ヒトインフルエンザウイルス粒子に感染させることと、（Ｂ）子孫ウイルス粒子を単離することと、を含む、組換えインフルエンザウイルス粒子を生成する方法を提供する。一部の実施形態において、該方法は、単離されたウイルス粒子をワクチンに配合させることを更に含む。一部の実施形態において、ウイルスは、ヒトインフルエンザウイルスを含み、ウイルスは、機能性Ｍ２蛋白質を発現しない。
インフルエンザウイルスのライフサイクルにおけるＭ２イオンチャネルの役割を示す図であり、（１）インフルエンザウイルスが、細胞表面のシアル酸受容体に付着し、（２）ウイルスが細胞に内部移行し、（３）Ｍ２イオンチャネルが、ウイルス表面で発現され、（４）Ｍ２イオンチャネルが開いて、プロトンを侵入させ、ウイルスＲＮＡを放出し、ウイルスＲＮＡが核に入って複製され、ウイルス蛋白質を合成させ、（５）ウイルス成分がバイロンにパッケージングされて放出される。 野生型および変異型Ｍ２遺伝子の模式図である。Ｍ１蛋白質のオープンリーディングフレームの下流に２つの終止コドンを挿入し、続いて膜貫通ドメイン内の５１のヌクレオチドを欠失させることにより、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（ＰＲ８）ＭセグメントのＭ２遺伝子を欠失させて、全長Ｍ２蛋白質の発現を阻害した。 未処理のＭ１およびＭ２のヌクレオチド配列を示す。 正常なＭＤＣＫ細胞およびＭ２蛋白質を安定発現するＭＤＣＫ細胞（Ｍ２ＣＫ）中でのＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）（上のパネル）および野生型ＰＲ８（下のパネル）ウイルスの発育動態を示すグラフである。細胞を１０-5の感染多重度でウイルスに感染させた。細胞上清中のウイルス価を測定した。野生型ＰＲ８は、両細胞型の中で高力価に発育したが、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）は、Ｍ２ＣＫ細胞内のみで良好に発育し、ＭＤＣＫ細胞内では一切発育しなかった。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスが、正常細胞内でウイルス抗原を生成するがＭ２を生成しないことを示すウエスタンブロットである。細胞溶解物は、ＰＲ８感染マウス血清（パネルＡ）または抗Ｍ２モノクローナル抗体（パネルＢ）でプローブした。レーン１：分子量マーカ、レーン２：ＰＲ８に感染したＭＤＣＫ細胞、レーン３：Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）に感染したＭＤＣＫ細胞、レーン４：未感染のＭＤＣＫ細胞。 Ｍ２ＫＯ変異体を接種された後のマウスの体重変動を示すグラフである。 Ｍ２ＫＯ変異体を接種されたマウスにおける抗体応答を示すグラフである。 感染から６週間後の、ブーストされたマウスの血清中の抗ＰＲ８ ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。 Ｍ２ＫＯ変異体の接種後の、インフルエンザチャレンジの後のマウスの体重変動を示すグラフである。 Ｍ２ＫＯ変異体での接種後の、インフルエンザチャレンジの後のマウスの生存を示すグラフである。 ＰＲ８での鼻腔（ＩＮ）、皮内（ＩＤ）または筋肉内（ＩＭ）接種後のマウスの体重変動を示すグラフである。 ＰＲ８を１．８×１０1ｐｆｕ（Ｌｏ）または１．８×１０4ｐｆｕ（Ｈｉ）のウイルス濃度で接種した後２週間目に採取されたマウスの血清中の抗体価を示すグラフである。 ＰＲ８を１．８×１０1ｐｆｕ（Ｌｏ）または１．８×１０4ｐｆｕ（Ｈｉ）のワクチン濃度で接種した後７週間目に採取されたマウスの血清中の抗体価を示すグラフである。 ＰＲ８の接種後の、インフルエンザチャレンジ後のマウスの生存を示すグラフである。 ＰＲ８接種後の、インフルエンザチャレンジ後のマウスの体重変動を示すグラフである。 接種後７週目に１．８×１０4ｐｆｕのＰＲ８を皮内に接種されたマウスから採取された血清中の抗体価を示すグラフである。 １．８×１０4ｐｆｕのＰＲ８を皮内に接種されたマウスの体重変動を示すグラフである。 ヘテロサブタイプウイルスに感染したマウスのチャレンジ後の生存％を示すグラフである。 異なるワクチン接種群のマウスのＥＬＩＳＡ力価を示すグラフである。 ホモサブタイプウイルス感染後のマウスの生存％を示すグラフである。 ヘテロサブタイプウイルスチャレンジ後のマウスの生存％を示すグラフである。 接種されたフェレットの体重変動を示すグラフである。フェレットは、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルス１０7ＴＣＩＤ50（パネルＡ）またはＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザＡ型ウイルス１０7ＴＣＩＤ50（パネルＢ）を接種された。体重を、接種後３日間モニタリングした。 接種されたフェレットの体温変動を示すグラフである。フェレットは、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルス １０7ＴＣＩＤ50（パネルＡ）またはＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザＡ型ウイルス１０7ＴＣＩＤ50（パネルＢ）を接種された。体温を、接種後３日間モニタリングした。 ワクチン接種後のフェレットの体重変動を示すグラフである。フェレットは、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルス［Ｇ１およびＧ３］１０7ＴＣＩＤ50、ＦＭ＃６ウイルス［Ｇ２およびＧ４］１０7ＴＣＩＤ50またはＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）［Ｇ５］を接種された。体重変動を、プライムワクチン接種の後（パネルＡ）およびブーストワクチンを受けた後（パネルＢ）１４日間モニタリングした。 チャレンジ後のフェレットの体重変動を示すグラフである。フェレットは、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザＡ型ウイルス１０7ＴＣＩＤ50でチャレンジされた。体重を、接種後１４日間モニタリングした。 ワクチン接種後のフェレットの体温変動を示すグラフである。フェレットは、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルス［Ｇ１およびＧ３］１０7ＴＣＩＤ50、ＦＭ＃６ウイルス［Ｇ２およびＧ４］１０7ＴＣＩＤ50またはＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）［Ｇ５］を接種された。体温変動を、プライムワクチン接種の後（パネルＡ）およびブーストワクチンを受けた後（パネルＢ）１４日間モニタリングした。 チャレンジ後のフェレットの体温変動を示すグラフである。フェレットは、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザＡ型ウイルス１０7ＴＣＩＤ50でチャレンジされた。体温を、接種後１４日間モニタリングした。 ウイルス接種後のフェレットの体重変動を示すグラフである。ドナーフェレットは、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルス１０7ＴＣＩＤ50（パネルＡ）またはＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）ウイルス１０7ＴＣＩＤ50（パネルＢ）を０日目に接種された。接種から２４時間後（１日目）に、ドナーをエアロゾル接触器（ａｅｒｏｚｏｌ ｃｏｎｔａｃｔ）（ＡＣ）を収容するケージに隣接した直接接触器（ＤＣ）を有するケージに入れた。体重変動を、ドナー接種後１４日間モニタリングした。 ウイルス接種後のフェレットの体温変動を示すグラフである。ドナーフェレットは、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルス１０7ＴＣＩＤ50（パネルＡ）またはＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）ウイルス１０7ＴＣＩＤ50（パネルＢ）を０日目に接種された。接種から２４時間後（１日目）に、ドナーを、エアロゾル接触器（ＡＣ）を収容するケージに隣接した直接接触器（ＤＣ）を有するケージに入れた。体温変動を、ドナー接種後１４日間モニタリングした。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンが、液性および粘膜応答を誘発することを示すグラフである。パネルＡは、ＰＲ８、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）、不活化ＰＲ８（ＩＮ、ＩＭ）、またはＰＢＳの投与後の血清ＩｇＧおよびＩｇＡ価を示す。パネルＢは、ＰＲ８、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）、不活化ＰＲ８（ＩＮ、ＩＭ）、またはＰＢＳの投与後の肺洗浄液ＩｇＧおよびＩｇＡ価を示す。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンが、マウスを致死的ホモサブタイプおよびヘテロサブタイプウイルスチャレンジから防御することを示すグラフである。パネルＡは、相同性ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）チャレンジ後のマウスの体重変動を示す。パネルＢは、非相同性Ａｉｃｈｉ（Ｈ３Ｎ２）チャレンジ後のマウスの生存を示す。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）が、気道におけるチャレンジウイルス複製を制御することを示すグラフである。パネルＡは、ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）チャレンジ後のウイルス価を示す。パネルＢは、Ａｉｃｈｉ（Ｈ３Ｎ２）チャレンジ後のウイルス価を示す。 血清中のＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンへの抗体応答の反応速度を示すグラフである。 血清および気道中のＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンへの粘膜抗体応答を示すグラフである。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンへの応答におけるマウスの抗ＨＡ ＩｇＧの反応速度を示すグラフである。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンが、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）およびＩＶＲ−１４７に類似した免疫応答を誘導することを示すグラフである。パネルＡは、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）Ｈ３、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）Ｈ３、ＩＶＲ−１４７、およびＰＢＳを投与された動物における血清ウイルス価を示す。パネルＢは、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）Ｈ３、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）Ｈ３、ＩＶＲ−１４７、およびＰＢＳを投与された動物における肺洗浄液ウイルス価を示す。パネルＣは、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）Ｈ３、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）Ｈ３、ＩＶＲ−１４７、およびＰＢＳを投与された動物における鼻甲介ウイルス価を示す。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンが、Ａｉｃｈｉチャレンジを防御することを示すグラフである。パネルＡは、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）Ｈ３、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）Ｈ３、ＩＶＲ−１４７、およびＰＢＳを投与された動物におけるＡｉｃｈｉチャレンジ後の体重減少を示す。パネルＢは、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）Ｈ３、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）Ｈ３、ＩＶＲ−１４７、およびＰＢＳを投与された動物のＡｉｃｈｉチャレンジ後の生存％を示す。 Ｈ５Ｎ１ Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンが、ＨＡに対するＩｇＧ抗体価を誘発することを示すグラフである。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ） ＣＡ０７、ＷＴ ＣＡ０７、およびＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）ＣＡ０７ワクチンの投与後の体重を示すグラフである。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスが、マウスの気道において複製しないことを示すグラフである。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンが、急速な抗体反応速度を呈することを示すグラフである。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンが、Ｈ３Ｎ２ウイルス、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８での非相同性チャレンジを防御することを示すグラフである。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンが、チャレンジの際にリコールされた細胞応答を刺激することを示すグラフである。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスが、Ｍ２の野生型ウイルスと類似のｍＲＮＡレベルを生成することを示すグラフである。 ｐＣＭＶ−ＰＲ８−Ｍ２発現プラスミドの制限消化を示すアガロースゲルである。レーン１および５；１Ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン所在）、レーン２〜４；Ｅｃｏ Ｒ１で消化されたｐＣＭＬＶ−ＰＲ８−Ｍ２：０．３７５μｇ（レーン２）、０．７５μｇ（レーン３）、および１．５μｇ（レーン４）。 インフルエンザＭ２遺伝子のオープンリーディングフレームへのｐＣＭＬＶ−ＰＲ８−Ｍ２の配列アラインメントを示すグラフである。 フェレットの気道内でのＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）およびＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）ウイルス複製を示すグラフである。 Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）ウイルスでの鼻腔チャレンジ後の鼻腔洗浄液中のＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）およびＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）ウイルス価を示すグラフである。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）およびＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）プライムのみ群の接種後のフェレットのＩｇＧ価を示すグラフである。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）およびＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）プライム−ブースト群の接種後のフェレットのＩｇＧ価を示すグラフである。 Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）またはＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）のワクチン接種からチャレンジ後までのフェレット血清中のＥＬＩＳＡ ＩｇＧ価の概要を示すグラフである。 伝播試験におけるフェレットから得た鼻腔洗浄液中のウイルス価を示すグラフである。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスは伝播しなかったが（ウイルスが検出されなかった）、対照Ｂｒｉｓｂ／１０ウイルスは伝播した。 Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ａ／Ｐｅｒｔｈ、およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅウイルスを鼻腔（ＩＮ）、筋肉内（ＩＭ）および皮内（ＩＤ ＦＧＮ）にワクチン接種された対象におけるＩｇＧ価を示すグラフである。 Ａ／Ｐｅｒｔｈ（Ｈ３Ｎ２）ワクチンのプライミング用量またはプライミング＋ブースター用量を筋肉内（ＩＭ）または皮内（ＩＤ ＦＧＮ）に投与された対象のＩｇＧ価を示すグラフである。 接種後０、３０および６０日目にＦｌｕＬａｖａｌ：Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９、ＮＹＭＣ Ｘ−１８１、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９ＮＹＭＣ Ｘ−１８７（Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９様ウイルス）、およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８を筋肉内（ＩＭ）および皮内（ＩＤ）送達により接種されたモルモットのウイルス価を示すグラフである。 免疫処置から５ヶ月後にＶｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４ウイルスでチャレンジされたＨ５Ｎ１ Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチン接種対象の生存％を示すグラフである。 免疫処置から４週間後にＶｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４ウイルスでチャレンジされたＨ５Ｎ１ Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチン接種対象の生存％を示すグラフである。
Ｉ．定義
以下の用語は、本明細書において用いられており、その定義が指標のために示される。
本明細書で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、単数のみを指すことを明確に示していない限り、単数および複数の両方を示す。
一般に、用語「約」および範囲でのその使用は、用語「約」が適格であるか否かを問わず、含まれる数が本明細書に示された厳密な数に限定されず、本発明の範囲から逸脱せずに実質的に言及された範囲内の範囲を指すことを意味する。本明細書で用いられる「約」は、当業者に理解されており、用いられる文脈により多少変動する。用いられた文脈に当業者に明白でない用語が使用されている場合、「約」は、特定の用語の±１０％を意味する。
本明細書で用いられる「対象」および「患者」は、互換的に用いられ、動物、例えば任意の脊椎動物種の一種を指す。本明細書に開示の主題の方法および組成物は、哺乳動物およびトリなどの温血脊椎動物に特に有用である。例示的対象としては、ヒトなどの哺乳動物、並びに絶滅の危機に瀕しているために重要である、ヒトにとって経済的に重要である（ヒトからの消費のために農家で飼育される動物）、および／または社会的に重要である（ペットとして、または動物園で飼育される動物）哺乳動物およびトリを挙げることができる。一部の実施形態において、対象は、ヒトである。一部の実施形態において、対象は、ヒトでない。
本明細書で用いられる用語「有効量」または「治療的有効量」または「薬学的有効量」は、所望の治療的および／または予防的効果を実現するのに十分な量、例えば疾患、状態および／または症状の予防を引き起こす量を指す。治療的または予防的適用に関連して、対象に投与される組成物の量は、疾患のタイプおよび重症度、並びに個体の特徴、例えば一般的健康、年齢、性別、体重および組成薬への耐容性に依存する。それは、疾患または状態の程度、重症度およびタイプにも依存する。当業者は、これらおよび他の因子に応じて適切な投与量を決定することができよう。一部の実施形態において、複数の用量が、投与される。上記に加えてあるいは上記に代えて、一部の実施形態において、複数の治療組成物または化合物（例えば、ワクチンなどの免疫原性組成物）が、投与される。
本明細書で用いられる用語「単離された」および／または「精製された」は、不適切なインビボ物質を伴わないように、または正常に生じる不適切なインビボ物質から実質的に精製されるように、核酸（例えば、ベクターまたはプラスミド）、ポリペプチド、ウイルスまたは細胞のインビトロ調製、単離および／または精製を指す。例えば一部の実施形態において、単離されたウイルス調製物は、インビトロ培養および増殖により得られ、他の感染性物質を実質的に含まない。本明細書で用いられる「実質的に含まない」は、その化合物または物質についての標準的検出法を用いて、特定の化合物、例えば不適切な核酸、蛋白質、細胞、ウイルス、感染性物質などが検出レベル未満であることを意味する。
本明細書で用いられる用語「組換えウイルス」は、ウイルスゲノムを導入する、および／またはウイルス蛋白質への変化を導入するために、インビトロで、例えば組換え核酸技術を用いて操作されたウイルスを指す。例えば一部の実施形態において、組換えウイルスは、野生型、内在型の核酸配列と、変異体および／または外来性の核酸配列の両方を含んでいてもよい。上記に加えてあるいは上記に代えて、一部の実施形態において、組換えウイルスは、修飾蛋白質成分、例えば変異体または変異体マトリックス、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、核蛋白質、非構造蛋白質および／またはポリメラーゼ蛋白質を含んでいてもよい。
本明細書で用いられる用語「組換え細胞」または「変性細胞」は、核酸を細胞に導入するため、および／または細胞内核酸を修飾するために、例えば組換え核酸技術を用いて、インビトロで操作された細胞を指す。組換え細胞の例としては、外来性プラスミド、発現ベクターなどを含む原核もしくは真核細胞、および／または細胞内核酸への修飾（例えば、細胞内ゲノムへの置換、変異、挿入、欠失など）を含む細胞が挙げられる。例示的組換え細胞は、ウイルスＭ２蛋白質などの外来性蛋白質を発現するためにインビトロで操作されたものである。
本明細書で用いられる用語「変異体」、「変異」および「変異体」は、互換的に用いられ、野生型配列と異なる核酸またはポリペプチド配列を指す。一部の実施形態において、変異体または変異体の配列は、天然由来のものである。他の実施形態において、変異体または変異体の配列は、組換えにより、および／または化学的に導入される。一部の実施形態において、核酸変異は、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ配列への修飾（例えば、付加、欠失、置換）を含む。一部の実施形態において、修飾は、化学修飾（例えば、メチル化）を含み、天然および／または非天然ヌクレオチドの置換または付加を含むこともできる。核酸変異は、非表現変異（例えば、野生型配列と同じアミノ酸をコードする１つ以上の核酸変化）であってもよく、あるいはコードされたアミノ酸の変化を引き起こすことも、終止コドンを与えることも、またはスプライシング欠損もしくはスプライシング変化を導入することもできる。コード配列への核酸変異は、保存的または非保存的アミノ酸変化を引き起こすこともできる。
本明細書で用いられる用語「ｖＲＮＡ」は、分割または非分画ウイルスゲノムを含むウイルスゲノム、プラスおよびマイナス鎖ウイルスゲノムなどのウイルスゲノムを含むＲＮＡを指す。ｖＲＮＡは、全体的に内因性および「野生型」であっても、並びに／あるいは、組換え体および／もしくは変異体配列を含むこともできる。
本明細書で用いられる用語「宿主細胞」は、ウイルスなどの病原が複製し得る細胞を指す。一部の実施形態において、宿主細胞は、インビトロの培養細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ベロ細胞、ＭＤＣＫ細胞など）である。上記に加えてあるいは上記に代えて、一部の実施形態において、宿主細胞は、インビボ（例えば、感染された脊椎動物の細胞、例えば鳥類または哺乳動物）である。一部の実施形態において、宿主細胞は、例えば宿主細胞のウイルス感染を促進すること、および／またはウイルス発育速度を促進することなどにより、ウイルス生成を促進するように、変性することもできる。限定ではなく例示として、例示的宿主細胞変性としては、宿主細胞の細胞表面にある２〜６位結合シアル酸受容体の組換え発現、および／または病原もしくはウイルス中で存在しなかった、もしくは無効であった宿主細胞中蛋白質の組換え発現が挙げられる。
本明細書で用いられる用語「感染した」は、疾患または病原、例えばウイルスを保有することを指す。感染は、例えばウイルスもしくは病原の投与による（例えば、ワクチン接種による）、意図的なものであってもよく、または例えば１つの生物体から他の生物体へ、もしくは汚染された表面から生物体への病原の自然な移動による、非意図的なものであってもよい。
本明細書でウイルスと共に用いられる用語「弱毒」は、非弱毒同等物と比較して低い病毒性または病原性を有するウイルスを指すが、生存可能であるか、または生存している。典型的には弱毒は、ウイルスなどの感染性物質を、非弱毒ウイルスと比較して、感染された対象に対して低い有毒性または病毒性にする。このことが、死滅または完全不活化ウイルスと対照的である。
本明細書でウイルスと共に用いられる用語「型」または「株」は、互換的に用いられ、一般に異なる特徴を有するウイルスを指すために用いられる。例えばインフルエンザＡ型ウイルスは、インフルエンザＢ型ウイルスと異なるウイルスの型である。同様にインフルエンザＡ型 Ｈ１Ｎ１は、インフルエンザＡ型 Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２と異なるウイルスの型である。上記に加えてあるいは上記に代えて、一部の実施形態において、インフルエンザＡ型 Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２など、異なるウイルスの型は、「サブタイプ」と呼ばれる場合がある。
本明細書で用いられる「Ｍ２ＫＯ」または「Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）」は、用いられる文脈に応じて、配列番号１、配列番号１を含むウイルス、または配列番号１を含むウイルスを含むワクチンを指す。例えば本明細書に示されるＭ２遺伝子の変異の記載において、「Ｍ２ＫＯ」または「Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）」は、配列番号１を指す。ワクチンのウイルス成分を記載する場合、「Ｍ２ＫＯ」または「Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）」は、ＰＲ８（核蛋白質（ＮＰ）、ポリメラーゼ遺伝子（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、非構造蛋白質（ＮＳ）、マトリックス（Ｍ））の内部６遺伝子を有するが、機能性Ｍ２蛋白質を発現しない、組換えインフルエンザウイルスを指す。ワクチンを記載する際に、「Ｍ２ＫＯ」または「Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）」は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）組換えウイルスを含むワクチンを指す。
本明細書で用いられる、「Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルス」は、単独で、または他のウイルス成分および／もしくは他のウイルス成分をコードする遺伝子と組み合わせてＰＲ８（核蛋白質（ＮＰ）、ポリメラーゼ遺伝子（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、非構造蛋白質（ＮＳ）、マトリックス（Ｍ））の内部６遺伝子を有するが、機能性Ｍ２蛋白質を発現しない、組換えインフルエンザウイルスを包含する。一部の実施形態において、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスは、他のインフルエンザウイルスの遺伝子を含む。一部の実施形態において、ウイルスは、インフルエンザＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７様Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）のＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む。一部の実施形態において、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスは、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）ウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む。一部の実施形態において、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（ＣＡ０７）（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）ウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む。
II．インフルエンザＡ型ウイルス
Ａ．概論
インフルエンザは、アメリカの成人の主な死因である。インフルエンザの原因物質は、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、およびインフルエンザＣ型ウイルスなどのオルトミクソウイルス科のウイルスであり、インフルエンザＡ型が、ヒトにおいて最も一般的かつ最も悪性である。
インフルエンザＡ型ウイルスは、エンベロープを持ったマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。インフルエンザＡ型ウイルスのゲノムは、８の一本鎖（対を形成していない）ＲＮＡ上に、１１種の蛋白質（ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＥＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２、ＰＢ２）をコードする相補体を含む。総ゲノムサイズは、約１４，０００塩基である。ゲノムのセグメントという特徴により、細胞内同居の間に異なるウイルス鎖間で遺伝子全体の交換が可能である。以下の８つのＲＮＡセグメントを有する。１）ＨＡが、ヘマグルチニンをコードする（ヘマグルチニンの約５００の分子が、１つのバイロンを生成するのに必要となる）。２）ＮＡが、ノイラミニダーゼをコードする（ノイラミニダーゼの約１００の分子が、１つのバイロンを生成するのに必要となる）。３）ＮＰが、核蛋白質をコードする。４）Ｍが、同じＲＮＡセグメントの異なるリーディングフレームを用いることにより２つの蛋白質（Ｍ１およびＭ２）をコードする（約３０００のＭ１分子が、１つのバイロンを生成するのに必要となる）。５）ＮＳが、同じＲＮＡセグメントの異なるリーディングフレームを用いることにより、２つの蛋白質（ＮＳ１およびＮＥＰ）をコードする。６）ＰＡが、ＲＮＡポリメラーゼをコードする。７）ＰＢ１が、同じＲＮＡセグメントの異なるリーディングフレームを用いることにより、ＲＮＡポリメラーゼおよびＰＢ１−Ｆ２蛋白質をコードする（アポトーシスを導入する）。８）ＰＢ２が、ＲＮＡポリメラーゼをコードする。
インフルエンザＡ型には複数のサブタイプが存在し、（ヘマグルチニンの型に対する）Ｈ番号および（ノイラミニダーゼの型に対する）Ｎ番号に応じて命名される。現在、認識された１６種の異なるＨ抗原（Ｈ１〜Ｈ１６）および認識された９種の異なるＮ抗原（Ｎ１〜Ｎ９）が存在する。各ウイルスサブタイプは、異なる病原プロファイルを有する様々なウイルス株に変異し、１つの種に対して病原性があるが他の種に対しては病原性がないものもあれば、複数の種に対して病原性があるものもある。ヒトにおいて確認された例示的インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプとしては、限定するものではないが、「スペイン風邪」および２００９年ブタインフルエンザの世界的流行を引き起こしたＨ１Ｎ１、１９５０年代後期の「アジア風邪」を引き起こしたＨ２Ｎ２、１９６０年代後半の香港風邪を引き起こしたＨ３Ｎ２、２０００年代中盤に蔓延した世界的なインフルエンザパンデミックの兆しが懸念されたＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、現在ヒトおよびブタに特有であるＨ１Ｎ２、並びにＨ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ５Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７が挙げられる。
幾つかのインフルエンザＡ型変異体が同定されており、最も類似した、すなわち、系統が共通すると仮定される公知の単離物に従って（例えば、福建株）、典型的な宿主に従って（例えば、ヒトインフルエンザウイルス）、それらのサブタイプに従って（例えば、Ｈ３Ｎ２）、および病原性に従って（例えばＬＰ、つまり低病原性）命名される。つまりＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）単離物と類似したウイルスから生じたインフルエンザは、福建型インフルエンザ、ヒト型インフルエンザ、およびＨ３Ｎ２型インフルエンザと呼ぶことができる。
加えてインフルエンザ変異体は、ウイルス株が特有である、または馴化された種（宿主）に従って命名される場合がある。この慣習を用いて命名された主な変異体には、トリインフルエンザ、ヒトインフルエンザ、ブタインフルエンザ、ウマインフルエンザおよびイヌインフルエンザがある。変異体は、家禽、特に鶏における病原性にも従って命名された（例えば、低病原性トリインフルエンザ（ＬＰＡＩ）および高病原性トリインフルエンザ（ＨＰＡＩ））。
Ｂ．ライフサイクルおよび構造
インフルエンザウイルスのライフサイクルは、一般に、細胞表面の受容体への付着、細胞への侵入、およびウイルス核酸の脱殻と、それに続く細胞内部のウイルス遺伝子の複製を含む。ウイルス蛋白質および遺伝子の新しいコピーを合成した後、これらの成分は、子孫ウイルス粒子を組み立て、その後、細胞を出る。異なるウイルス蛋白質が、これらのステップのそれぞれにおいて役割を果たす。
インフルエンザＡ型粒子は、ウイルス核をカプセル化する脂質エンベロープで構成される。エンベロープの内側は、マトリックス蛋白質（Ｍ１）により裏打ちされており、外面は、スパイク糖蛋白質の２つのタイプである、ヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）とにより特徴づけられる。膜貫通型イオンチャネル蛋白質であるＭ２も、脂質エンベロープの一部である。例えば、図１を参照されたい。
トリマーＩ型膜蛋白質であるＨＡ蛋白質は、宿主細胞表面の糖蛋白質または糖脂質上のシアリルオリゴ糖（ガラクトースに結合された末端シアル酸を含むオリゴ糖）への結合を担う。この蛋白質は、エンドサイトーシスによるバイロンのインターナリゼーションに続く、ウイルスと宿主細胞膜との融合も担う。
テトラマーII型膜蛋白質であるノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、宿主細胞の複合糖質並びにＨＡおよびＮＡの末端シアル酸残基を切断するシアリダーゼであり、つまり受容体破壊酵素として認識されている。このシアリダーゼ活性は、宿主細胞表面から子孫バイロンを効率的に放出するため、およびウイルスＨＡと他の糖蛋白質との結合活性による子孫凝集を阻止するために必要である。つまりＨＡの受容体結合活性およびＮＡの受容体破壊活性が、おそらく平衡力として作用して、インフルエンザの効率的複製を可能にする。
ゲノムセグメントは、ウイルス粒子の核にパッケージングされている。ＲＮＰ（ＲＮＡ＋核蛋白質ＮＰ）は、各セグメントに結合する３つのウイルスポリメラーゼポリペプチドと共にらせん形態をとる。
インフルエンザウイルスのライフサイクルは、宿主細胞の表面にあるシアル酸含有受容体へのＨＡの結合により開始し、その後、受容体を介したエンドサイトーシスに入る。図１。後期エンドソームにおける低いｐＨは、ＨＡ内でのコンホメーションシフトを惹起し、それによりＨＡ２サブユニット（いわゆる融合ペプチド）のＮ末端を露出させる。融合ペプチドは、ウイルスとエンドソーム膜との融合を開始し、マトリックス蛋白質（Ｍ１）とＲＮＰとの複合体が、細胞質中に遊離される。ＲＮＰは、ｖＲＮＡをキャプシド形成する核蛋白質（ＮＰ）と、ＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２蛋白質により形成されるウイルスポリメラーゼ複合体と、からなる。ＲＮＰは核に輸送され、そこで転写および複製が起こる。ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、３つの異なる反応、つまり（１）５’キャップおよび３’ポリＡ構造を有するｍＲＮＡ、（２）全長相補性ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）、並びに（３）ｃＤＮＡを鋳型として用いたゲノムｖＲＮＡの合成を触媒する。新たに合成されたｖＲＮＡ、ＮＰおよびポリメラーゼ蛋白質は、その後、ＲＮＰに組み立てられ、核から輸出されて細胞膜に輸送され、そこで子孫ウイルス粒子の出芽が起こる。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）蛋白質は、シアリルオリゴ糖からシアル酸を除去する、つまり新たに組み立てられたバイロンを細胞表面から放出して、ウイルス粒子の自己凝集を阻止することにより、感染後期において重要な役割を果たす。ウイルスの組み立ては、蛋白質−蛋白質および蛋白質−ｖＲＮＡ相互作用を含むが、これらの相互作用の性質、大部分が依然として未知である。
Ｃ．Ｍ２蛋白質の役割
前述のように、ウイルス膜をつなぐのは、３種の蛋白質、つまりヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、およびＭ２である。ＨＡおよびＮＡの細胞外ドメイン（エクトドメイン）は、非常に可変的であるが、Ｍ２のエクトドメインは、インフルエンザＡ型ウイルスのうちでは本質的に不変的である。理論に束縛されるのを望むものではないが、インフルエンザＡ型ウイルスにおいてイオンチャネル活性を有するＭ２蛋白質は、宿主細胞の透過とウイルスＲＮＡの脱殻の間のウイルスライフサイクルの早期状況で機能すると考えられる。バイロンが、エンドサイトーシスを受けたら、ヘモ四量体ヘリックスバンドルであるバイロン結合Ｍ２イオンチャネルが、プロトンをエンドソームからバイロン内部に流して酸不安定性のＭ１蛋白質−リボ核蛋白質複合体（ＲＮＰ）相互作用を破壊し、それにより細胞質へのＲＮＰ遊離を促進させると考えられる。加えて、ＨＡが細胞内で切断される一部のインフルエンザ株（例えば、Ａ／ｆｏｗｌ ｐｌａｇｕｅｓ／Ｒｏｓｔｏｃｋ／３４）では、Ｍ２イオンチャネルは、トランスゴルジ網のｐＨを上昇させて、このコンパートメントにおける低ｐＨ条件によりＨＡ内のコンホメーション変化を阻止すると考えられる。Ｍ２膜貫通ドメイン自体が、イオンチャネルとして機能し得ることも示された。Ｍ２イオンチャネル活性を遮断するアマンタジン塩酸は、ウイルス複製を阻害することが示されているため、Ｍ２蛋白質イオンチャネル活性は、インフルエンザウイルスのライフサイクルにおいて不可欠であると考えられる。しかしインフルエンザＡ型ウイルスの複製におけるこの活性の必要性は、直接示されていない。Ｍ２蛋白質の構造を、図２に示す。Ｍ１配列と共にＭ２蛋白質の核酸配列を、図３に示す。
インフルエンザＢ型およびＣ型ウイルスは、インフルエンザＡ型ウイルスと構造的および機能的に類似しているが、幾つかの差異がある。例えばインフルエンザＢ型ウイルスは、イオンチャネル活性のあるＭ２蛋白質を有さない。代わりに、ＮＡ遺伝子の産物であるＮＢ蛋白質は、おそらくイオンチャネル活性を有し、つまりインフルエンザＡ型ウイルスのＭ２蛋白質と類似の機能を有する。同様にインフルエンザＣ型ウイルスは、イオンチャネル活性のあるＭ２蛋白質を有さない。しかしインフルエンザＣ型ウイルスのＣＭ１蛋白質は、この活性を有する可能性がある。
III．Ｍ２ウイルス変異体
一態様において、変異体Ｍ２ ｖＲＮＡ配列を持つインフルエンザＡ型ウイルスが、開示される。典型的にはそのような変異体は、Ｍ２イオンチャネル活性を有さず、インビボで弱毒された発育特性を呈し、感染性子孫を生成することができず、感染した対象において非病原性であるか、または低い病原性を示す。変異体ウイルスは、免疫原性があり、ワクチンとして用いられる場合、同等物の野生型および／または他の病原性ウイルスの感染への防御を与える。加えて、本明細書に開示のＭ２変異体は、安定しており、用いられる宿主細胞を問わず、機能性Ｍ２ポリペプチドを発現する変異はしない。上記に加えてあるいは上記に代えて、一部の実施形態において、これらの変異体のＭ１蛋白質は、機能への検出可能な変化を示さずに生成される。一部の実施形態において、変異体Ｍ２核酸配列を持つウイルスは、対応する野生型ウイルスが増殖し得る宿主細胞において、複製することができない。限定するものではないが、例えば、一部の実施形態において、野生型ウイルスは、培養するＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞および／またはベロ細胞において発育、増殖および複製することができるが、変異体Ｍ２配列を持つ対応するウイルスは、同じ型の細胞において発育、複製または増殖することができない。
前述のように、一部の実施形態において、Ｍ２変異体ウイルスは、安定しており、宿主細胞中の機能性Ｍ２蛋白質をコードする野生型または非野生型配列に変異も復帰もしない。例えば一部の実施形態において、Ｍ２変異ウイルスは、宿主細胞における２継代、３継代、５継代、１０継代、１２継代、１５継代、２０継代、２５継代の間、または２５継代を超えて安定している。一部の実施形態において、宿主細胞は、非変性宿主細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、変性された宿主細胞、例えばＭ２蛋白質を発現するＭＤＣＫ細胞である。
一部の実施形態において、Ｍ２変異体は、１種以上の核酸置換および／または欠失を含む。一部の実施形態において、変異は、Ｍ２蛋白質の細胞外ドメイン、Ｍ２蛋白質の膜貫通ドメインおよび／またはＭ２蛋白質の細胞質側末端の１つ以上をコードする核酸中に局在化される。上記に加えてあるいは上記に代えて、一部の実施形態において、１つ以上の核酸変異は、Ｍ２ペプチドのスプライス変異体、１つ以上の終止コドンおよび／または１つ以上のアミノ酸欠失を与える。一部の実施形態において、変異体Ｍ２核酸を保有するウイルスは、非機能性Ｍ２ポリペプチドを生成する。一部の実施形態において、変異体Ｍ２核酸を保有するウイルスは、Ｍ２ポリペプチドを生成しない。一部の実施形態において、変異体Ｍ２核酸を保有するウイルスは、トランケート型Ｍ２ポリペプチドを生成する。一部の実施形態において、トランケート型Ｍ２ポリペプチドは、アミノ酸配列ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＧＳＳＤを有する。
３つの例示的で非限定的なＭ２ウイルス変異体（Ｍ２−１、Ｍ２−２およびＭ２−３）を、以下の表１〜３に示す。表において、小文字はＭ２配列に対応し、大文字はＭ１配列に対応し、変異体配列（例えば、終止コドン、スプライス欠損）は、下線を付した太字で記す。Ｍ２−２変異体内の下線を付した（下の囲い）塩基は、Ｍ２−１およびＭ２−３変異体内の欠失領域を示す。
この変異体から生成されたＭ２ポリペプチド配列は、以下の通りである。
ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＧＳＳＤ（配列番号４）。
Ｍ２ポリペプチド配列はこの変異体から生成されない。
Ｍ２ポリペプチド配列はこの変異体から生成されない。
上記に加えてあるいは上記に代えて、一部の実施形態において、Ｍ２変異は、細胞質側末端に導入される。図２参照。Ｍ２蛋白質の細胞質側末端は、感染性ウイルス生成の仲介物質である。一部の実施形態において、Ｍ２細胞質側末端のトランケーションは、感染性ウイルス価を低下させ、パッケージングされたウイルスＲＮＡの量を減少させ、出芽事象を減少させて、出芽の効率を低下させる。５’配列が、ゲノムパッケージングにとって３’配列よりも重要であること、および長い５’配列ほど、ゲノムパッケージングにとってより重要であることが、示された。加えて複数の研究から、ヌクレオチド長は重要であるが、実際の配列はそれほど重要でない（ランダム配列は、ウイルスを生成するのに十分である）ことも示された。安定したＭ２細胞質側末端変異体の開発が、挑戦されており、文献には、変異体の復帰を示す数多くの例が挙げられている。
例えばＰｅｋｏｓｚ ｅｔ ａｌ ＪＶＩ，２００５；７９（６）：３５９５−３６０５は、アミノ酸位置７０で２つのコドンを終止コドンに交換したが、ウイルスは直ちに復帰した。別の例示的なＭ２細胞質側末端の変異は、Ｍ２ｄｅｌ１１と呼ばれる。Ｍ２ｄｅｌ１１変異体において、１１のアミノ酸残基が、細胞質側末端のカルボキシル末端から欠失されている。このトランケーションは、２つの終止コドンの導入によるものであり、全長Ｍ２ポリペプチドは作製されない。この変異体は、Ｍ２発現ＭＤＣＫ細胞（Ｍ２ＣＫ）中で継代された場合には安定しているが、正常なＭＤＣＫ細胞中での継体の間に全長Ｍ２に復帰する（Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２００８ ８２（５）：２４８６−９２）。理論に束縛されるのを望むものではないが、復帰が、ＭＤＣＫ細胞中の選択的圧力で起こる可能性がある。
別のＭ２細胞質側末端変異体であるＭ２Ｓｔｏｐ９０ａｌａ７８−８１は、ウイルス価を減少させなかったが、ａｌａ７０−７７は減少させた（ＪＶＩ ２００６；８０（１６）ｐ８１７８−８１８９）。アラニンのスキャニング実験から、Ｍ２末端の７４位〜７９位のアミノ酸が、バイロンの形態学において役割を果たし、ウイルス感染性に影響を及ぼすことが更に示された（Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２００６ ８０（１１）：５２３３−４０）。
したがって、上述の特徴とは異なる特徴を有する新規な細胞質変異体が本明細書に提示される。例えば一部の実施形態において、細胞質変異体は、ＭＤＣＫ細胞において安定している（全長Ｍ２ポリペプチドを発現するように復帰しない）。一部の実施形態において、細胞質変異体は、宿主細胞における２継代、３継代、５継代、１０継代、１５継代、２０継代、２５継代の間、または２５継代を超えて安定している。
野生型Ｍ２ポリペプチドを、以下の表４に示す。各配列について、太字は、膜貫通ドメインを示す。細胞外ドメインを最初（左）に、続いて膜貫通ドメイン（中央）、細胞質側末端配列（右側）を記載する。
Ｍ２−４（Ｍ２ｄｅｌ ＦＧ＃１）は作製されたものの、正常なＭＤＣＫ細胞においては継代可能でなかったが、変性された宿主細胞（例えば、野生型Ｍ２ポリペプチドを発現する細胞）において継代可能となる場合がある。Ｍ２−５（Ｍ２ｄｅｌ ＦＧ＃２）およびＭ２−６（ＦＧ＃３）が作製され、正常なＭＤＣＫ細胞中で継代された。これらのウイルスのＭ遺伝子のヌクレオチド配列は、ＭＤＣＫ細胞中での少なくとも１０継代までは安定している。これらの変異体は、他の細胞（例えば、インフルエンザ複製を支持する細胞）中でも増殖および継代することができた。これらの変異体は、弱毒化されておらず病原性があることも、見出されている。
以下の実施形態に記載の通り、本明細書に記載されたＭ２変異体ウイルスは、フェレットモデルでは気道において複製しないか、または他の臓器に伝播せず、フェレットモデルにおいて伝染されない。Ｍ２変異体を含むワクチンは、哺乳動物においてロバストな免疫応答を誘発し、哺乳動物をインフルエンザウイルスチャレンジから防御する。Ｍ２ＫＯウイルスは、マウスにおける液性と粘膜の両方の免疫応答を誘発し、マウスを致死的ホモサブタイプおよびヘテロサブタイプチャレンジから防御する。本明細書に記載されたＭ２変異体ウイルスを含むワクチンは、インフルエンザチャレンジからの効果的防御をもたらし、哺乳動物宿主において弱毒化されているという利点を有する。これらの知見から、本明細書に記載されたＭ２変異体ウイルスは、インフルエンザに対するワクチンに有用であることが示される。
IV．細胞を基にしたウイルス生成系
Ａ．「第一世代」変異体ウイルスの生成
変異体Ｍ２核酸を保有するウイルスなどの変異体ウイルスは、全体として参照により本明細書に組み入れられる、Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｅｎｔｉｒｅｌｙ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：９３４５−９３５０（１９９９）に記載されたプラスミドを基にした逆遺伝学により作製することができる。簡潔に記載すると、真核宿主細胞を、８つのウイルスＲＮＡをコードする１種以上のプラスミドでトランスフェクトさせる。各ウイルスＲＮＡ配列を、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターによりフランクする。注目すべきこととして、Ｍ２蛋白質をコードするウイルスＲＮＡは、変異体Ｍ２核酸配列を含む。宿主細胞を追加的に、野生型Ｍ２蛋白質などのウイルス蛋白質（例えば、ポリメラーゼ、核蛋白質および構造蛋白質）をコードする１つ以上の発現プラスミドでトランスフェクトさせる。ウイルスＲＮＡプラスミドによる宿主細胞のトランスフェクトは、８つ全てのインフルエンザウイルスＲＮＡの合成をもたらし、それらのうちの１つが、変異体Ｍ２配列を有する。コトランスフェクトされたウイルスポリメラーゼおよび核蛋白質は、ウイルスＲＮＡで機能性ｖＲＮＰを組み立て、それが複製および転写されて、最終的に変異体Ｍ２核酸配列を有し、ウイルス脂質エンベロープに組み入れられた機能性Ｍ２ポリペプチドも有する、感染性インフルエンザウイルスを形成する。
「第一世代」変異体ウイルスを生成する別の方法は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｅｎａｍｉ ａｎｄ Ｐａｌｅｓｅ， Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５（５）：２７１１−２７１３に記載された、インフルエンザウイルス遺伝子とインビトロ生成された組換えＲＮＡ分子との交換を可能にするリボ核蛋白質（ＲＮＰ）トランスフェクションシステムを含む。
参照により本明細書に組み入れられるＬｕｙｔｊｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｏｆ ａ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅ ｂｙ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ， Ｃｅｌｌ ５９：１１０７−１１１３に示された通り、ウイルスＲＮＡを、インビトロで合成し、ＲＮＡ転写産物を、トランスフェクト細胞内で生物活性のあるＲＮＰとして作用するウイルス核蛋白質（ＮＰ）およびポリメラーゼ蛋白質でコーティングさせる。
ＲＮＰトランスフェクション法は、以下の４つのステップに分けることができる。１）ＲＮＡの調製：インフルエンザウイルスセグメントをコードするプラスミドＤＮＡをインビトロ転写反応において（−）鎖ＲＮＡに転写する。２）ＲＮＡのカプシド形成：転写されたＲＮＡをその後、勾配精製されたＮＰおよび破壊されたインフルエンザウイルスから単離されたポリメラーゼ蛋白質と混合して、生物活性ＲＮＰ複合体を形成させる。３）カプシド形成されたＲＮＡのトランスフェクションおよびレスキュー：人工リボヌクレオカプシドを、レスキューされた遺伝子とは異なる遺伝子を含むヘルパーインフルエンザウイルスで予め感染された細胞にトランスフェクトし、ヘルパーウイルスがトランスフェクトされたＲＮＡを増幅する。４）トランスフェクトされた遺伝子の選択：ヘルパーウイルスとレスキューされた遺伝子を含むトランスフェクタントの両方が、培養上清中に存在するため、抗体を用いた適切な選択システムが、トランスフェクトされた遺伝子を保有するウイルスの単離に必要である。
その選択システムにより、特異的な生物学的および分子的特徴を有する新規なトランスフェクタントインフルエンザウイルスの作製が可能になる。その後、標的表面蛋白質に対する抗体の選択を、正または負の選択に利用することができる。
例えば、Ｍ２蛋白質を発現しないＭ２遺伝子を含むトランスフェクトまたは変異体ウイルスは、野生型機能性Ｍ２蛋白質を安定発現するように変性された適切な哺乳動物細胞株において発育させることができる。野生型Ｍ２遺伝子、つまり膜表面のＭ２ｅ蛋白質を発現するヘルパーウイルスの複製を防御または阻害するために、Ｍ２ｅへの抗体を用いることができる。そのような抗体は市販されており、ヘルパーウイルスの複製を阻害し、変異体Ｍ２を含むトランスフェクタント／変異体ウイルスを上清中で発育して高濃度にすることができる。Ｍ２ｅ抗体によるインフルエンザウイルス複製の阻害は、過去に、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ Ｍ２ ｐｒｏｔｅｉｎｋｏｒｏｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍ２ ｉｎ ｖｉｒｉｏｎｓ， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２：２７６２−２７７２（１９８８） およびＴｒｅａｎｏｒ ｅｔ ａｌ，Ｐａｓｓｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｍ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６４：１３７５−１３７７（１９９０）に記載された。
上記に加えてあるいは上記に代えて、同じ抗体を用いて、ヘルパーウイルスを「捕捉」し、トランスフェクタントを高濃度にすることができる。例えば抗体を用いて、組織培養皿の底をコーティングすることができ、またはカラムマトリックス中で用いて、上清もしくは溶離液中のトランスフェクタントを高濃度にすることができる。
トランスフェクタントウイルスは、限定希釈によりマルチウェルプレート中のＭ２発現細胞中で発育させ、その後、例えばレプリカプレートを作製することにより、同定およびクローニングすることができる。例えば発育したウイルスを含むマルチウェルプレートの所定のウェルのアリコットの半量は、ＭＤＣＫ細胞を感染させるのに用い、残りの半量はＭ２蛋白質を発現するＭＤＣＫ細胞を感染させることができる。トランスフェクトウイルスおよびヘルパーウイルスの両方が、Ｍ２蛋白質を発現するＭＤＣＫ細胞中で発育するであろう。しかしヘルパーウイルスだけが、標準のＭＤＣＫ細胞中で発育して、トランスフェクタントを含有するマルチウェルプレート中のウェルを同定することができよう。トランスフェクタントウイルスは、Ｍ２蛋白質を発現する細胞中でプラーク精製することができる。
Ｂ．ウイルス変異体の増殖
一部の実施形態において、本明細書に記載されたウイルス変異体が、宿主細胞内で維持および継代される。限定するものではないが、例えば、インフルエンザＡ型ウイルス変異体などのインフルエンザウイルス変異体の発育に適した例示的宿主細胞としては、限定するものではないが、メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ細胞）、アフリカミドリザルなどのサル細胞（例えば、ベロ細胞）、ＣＶ−１細胞およびアカゲザル腎臓細胞（例えば、ＬＬｃｏｍｋ．２細胞）、ウシ細胞（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ブタ細胞、フェレット細胞（例えば、ミンク肺細胞）ＢＫ−１細胞、げっ歯類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ヒト細胞、例えば胚性ヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲ−Ｃ６（登録商標））、２９３Ｔヒト胚性腎臓細胞および胚性線維芽細胞を含むトリ細胞などの任意の数の真核細胞が挙げられる。
上記に加えてあるいは上記に代えて、一部の実施形態において、真核宿主細胞を変性させて、例えば宿主細胞のウイルス感染を促進することおよび／またはウイルス発育速度を促進することにより、ウイルス生成を促進する。例えば一部の実施形態において、宿主細胞を変性させて、細胞表面での２，６−結合シアル酸を発現するかまたはその発現を増加させて、変異体または野生型インフルエンザＡ型ウイルスによりこれらの細胞のより効率的および効果的感染を可能にする。例えば全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１０−００２１４９９号および米国特許第７，１７６，０２１号を参照されたい。つまり幾つかの例示的実施形態において、２，６−シアリルトランスフェラーゼ遺伝子（ＳＴ６ＧＡＬ １）の少なくとも１つのコピーを発現するように変性されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）および／またはベロ細胞が、用いられる。限定するものではないが、例えば、アクセッション番号ＢＣ０４０００９．１に表されるホモサピエンスＳＴ６β−ガラクトサミドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ遺伝子配列は、ＣＨＯ細胞に統合および発現され得るＳＴ６Ｇａｌ遺伝子の一例である。機能性ＳＴ６Ｇａｌ Ｉ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドの１つ以上のコピーを、細胞に遺伝子操作で組み込むことができる。すなわちＳＴ６Ｇａｌ Ｉ遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２コピーを、または１２を超えるコピーを発現するように安定して形質転換された細胞を、用いることができる。１つの発現カセットは、発現されるＳＴ６Ｇａｌ Ｉ遺伝子の１コピー以上を含み、それをプロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなどの調節要素、並びにポリアデニル化シグナル配列に動作可能に連結して、ＳＴ６Ｇａｌ Ｉ遺伝子またはそのコピーの発現を容易にすることができる。あるいは１つの発現カセットを遺伝子操作して、ＳＴ６Ｇａｌ Ｉ遺伝子の１コピーを発現させることもでき、複数の発現カセットを宿主細胞ゲノム内に統合させることもできる。したがって一部の実施形態において、少なくとも１つのＳＴ６Ｇａｌ Ｉ遺伝子を、宿主細胞のゲノムに組み入れて、その細胞がＳＴ６Ｇａｌ Ｉ遺伝子およびその酵素蛋白質産物を発現するようにする。コピー数に応じて、１つの宿主細胞が、多くの機能性ＳＴ６Ｇａｌ Ｉ遺伝子蛋白質を発現することもできる。
安定した変性細胞株をクローニングしトランスフェクトして生成させるための適切なベクターは、当該技術分野で周知である。１つの非限定的な例としては、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。
上記に加えてあるいは上記に代えて、一部の実施形態において、真核性宿主細胞が、変異体ウイルス遺伝子の野生型を生成し、それにより遺伝子をウイルスにトランスに提供するように変性される。例えば変異体Ｍ２蛋白質を有するウイルス株は、野生型Ｍ２蛋白質を生成する宿主細胞で継代された場合、高い発育速度（例えば、より大きなウイルス生成量）を示すことができる。一部の実施形態において、変異体Ｍ２蛋白質を有するウイルス株は、発育することができず、または野生型Ｍ２遺伝子を発現しない細胞で複製することができる。加えてそのような宿主細胞は、例えばそのような宿主において復帰への選択的圧力が存在しないため、機能性Ｍ２配列へのウイルス復帰を緩やかにするか、またはウイルス復帰を阻止することができる。
発現ベクターおよび変性された宿主細胞の両方を生成する方法は、当該技術分野で周知である。例えばＭ２発現ベクターは、Ｍ２核酸配列（Ｍ２ ＯＲＦ配列、「野生型」Ｍ２の開始コドンから終止コドンまで（表５））を以下の通り真核性発現ベクターにおいて配置させることにより生成することができる。
宿主細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞）を、その後、例えばＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、ウィスコンシン州マディソン所在）などの市販の試薬およびキットを用いて、当該技術分野で公知の方法によりトランスフェクトすることができる。限定するものではないが、例えば、細胞を、検出可能なマーカまたは選択マーカを用いたコトランスフェクションにより、および／またはスクリーニング、例えばＭ２抗体を用いた間接的免疫染色により、Ｍ２発現に関して選択および検査することができる。Ｍ２発現を、間接的免疫染色、フローサイトメトリーまたはＥＬＩＳＡにより測定することができる。
限定するものではないが、例えば、２９３Ｔヒト胚性腎臓細胞およびメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＳＫ）細胞を、それぞれ１０％胎仔ウシ血清を補足されたダルベッコ改変イーグル培地、および５％新生仔ウシ血清を含有する最小必須培地（ＭＥＭ）に保持した。細胞の全てを、５％ＣＯ2中に３７℃で保持した。Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）から得たＰ２蛋白質を安定発現するハイグロマイシン耐性ＭＤＣＫ細胞を、１：１の比の、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドｐＲＨｙｇ、および全長Ｍ２蛋白質を発現するプラスミドｐＣＡＧＧＳ／Ｍ２でのコトランスフェクションにより樹立した。Ｍ２を発現する安定したＭＤＣＫ細胞クローン（Ｍ２ＣＫ）を、抗Ｍ２（１４Ｃ２）モノクローナル抗体（Ｉｗａｔｓｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＪＶＩ，２００６，ｖｏｌ．８０，Ｎｏ．１，ｐ．５２３３−５２４０）を用いた間接的免疫染色でのスクリーニングにより、０．１５ｍｇ／ｍＬハイグロマイシン（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ所在）を含有する培地中で選択した。Ｍ２ＣＫ細胞を、１０％胎仔ウシ血清および０．１５ｍｇ／ｍＬハイグロマイシンを補足されたＭＥＭ中で培養した。Ｍ２ＣＫ細胞において、Ｍ２の発現レベルおよび局在化は、ウイルス感染細胞のものと類似していた（データは示さない）。Ｍ２発現ベロ細胞は、類似の様式で作製することができる。
一部の実施形態において、細胞およびウイルス変異体を、当該技術分野で周知の方法により培養および増殖する。限定するものではないが、例えば、一部の実施形態において、宿主細胞を、１０％胎仔ウシ血清を補足されたＭＥＭの存在下で発育させる。ＰＢＳでの洗浄と、続く３７℃でのウイルスの吸着により、Ｍ２を発現する細胞をＭＯＩ ０．００１で感染させる。一部の実施形態において、トリプシン／ＴＰＣＫを含有するウイルス発育培地を添加して、細胞変性作用が観察されるまで、細胞を２〜３日間インキュベートする。
このようにして、ディスポーザブルバイオリアクターシステムが、ウイルスの使用、不使用を問わず、哺乳動物細胞用に開発され、その利点として、施設設置がより迅速であり、交差汚染のリスクが低いことが挙げられる。例えば本明細書に記載された細胞は、ディスポーザブルバッグ、例えばＳｔｅｄｉｍのもの、ＳＡＦＣ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＢｉｏｅａｚｅバッグ、Ｃｅｌｌｅｘｕｓ ＢｉｏｓｙｔｅｍｓのＨｙｂｒｉｄＢａｇ（商標）、またはＨｙＣｌｏｎｅの単回用バイオリアクター、またはＬｏｎｚａのＣｅｌｌｔａｉｎｅｒで培養することができる。バイオリアクターは、１Ｌ，１０Ｌ、５０Ｌ、２５０Ｌ、１０００Ｌサイズ形式であってもよい。一部の実施形態において、細胞を、動物製品を含まない最適化された無血清培地中で懸濁させて保持する。システムは、例えば培養物を１Ｌ〜１０Ｌの単一バッグ中で増殖し得るフェドバッチシステムであっても、または栄養物の一定供給を可能にしながら同時に培地中への潜在的に有毒な副生物の蓄積を回避する灌流システムであってもよい。
長期貯蔵のために、変異体ウイルスは、凍結保存物として貯蔵することができる。
Ｖ．ワクチンおよび投与方法
Ａ．免疫原生組成物／ワクチン
本明細書に開示された、細胞を基にしたウイルス生成システムから作製され得るワクチンには様々な異なるタイプがある。本開示は、限定するものではないが、弱毒生ウイルスワクチン、不活化ウイルスワクチン、全粒子ウイルスワクチン、スプリットウイルスワクチン、ビロソームウイルスワクチン、ウイルス表面抗原ワクチンおよびそれらの組み合わせを包含する。つまり、これらのワクチンタイプのいずれかの適切な配合により免疫応答、例えば全身免疫応答を生成し得る、異なるインフルエンザウイルスに特異的な防御的免疫応答を生成し得る数多くのワクチンが存在する。弱毒生ウイルスワクチンは、気道内の局所的粘膜免疫を刺激し得るという利点も有する。
一部の実施形態において、本明細書に記載された組成物中で用いられるワクチン抗原は、「直接」抗原であり、即ちそれらは、ＤＮＡとして投与されず、それ自体が抗原である。そのようなワクチンは、単独であるか、またはキャリア要素、例えばキャリア蛋白質、弱毒生全微生物体、不活化微生物体、組換えペプチドおよび蛋白質、糖蛋白質、糖脂質、リポペプチド、合成ペプチド、または「スプリット」ワクチンと呼ばれるワクチンの場合には破壊された微生物体にコンジュゲートされているかにかからわらず、全粒子ウイルスまたは限定するものではないがウイルス多糖類などのウイルスのほんの一部を含んでいてもよい。
一部の実施形態において、完全バイロンワクチンが、提供される。完全バイロンワクチンを、限外ろ過により濃縮し、その後、ゾーン遠心分離またはクロマトグラフィーにより精製することができる。典型的にはバイロンを、例えばホルマリンまたはβプロピオラクトンを用いて、精製前または後に不活化させる。
一部の実施形態において、精製糖蛋白質を含むサブユニットワクチンが、提供される。そのようなワクチンは、以下の通り調製されてもよい：洗浄剤での処理により断片化されたウイルス懸濁液を用いて、例えば超遠心分離により、表面抗原を精製する。このように、サブユニットワクチンは、主にＨＡ蛋白質のほか、ＮＡも含有する。用いられた洗浄剤は、例えばカチオン系洗浄剤、例えばヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、アニオン系洗浄剤、例えばデオキシコール酸アンモニウム、または非イオン系洗浄剤、例えばＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００の名称で販売されるものであってもよい。バイロンをプロテアーゼ、例えばブロメリンで処理され、その後標準法により精製した後で、ヘマグルチニンを単離してもよい。
一部の実施形態において、脂質を溶解する薬剤での処理を受けたバイロンを含むスプリットワクチンが、提供される。スプリットワクチンは、以下の通り調製することができる。前述のように得られた不活化または非不活化精製ウイルスの水性懸濁液を、脂質溶媒、例えばエチルエーテルまたはクロロホルムにより撹拌下で処理し、洗浄剤と会合させる。ウイルスエンベロープ脂質の溶解は、ウイルス粒子を断片化させる。主に本来の脂質環境が除去されたヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ、並びにコアまたはその分解産物で構成されたスプリットワクチンを含む水相が、回収される。その後、残留する感染粒子は、既に不活化されていなければ不活化される。
一部の実施形態において、不活化インフルエンザウイルスワクチンが、提供される。一部の実施形態において、不活化ワクチンは、公知方法、例えば限定するものではないがホルマリンまたはβ−プロピオラクトン処理を用いて、ウイルスを不活化することにより作製する。本発明において用いられ得る不活化ワクチンのタイプとしては、全粒子ウイルス（ＷＶ）ワクチンまたはサブバイロン（ＳＶ）（スプリット）ワクチンを挙げることができる。ＷＶワクチンは、無傷の不活化ウイルスを含み、ＳＶワクチンは、脂質含有ウイルスエンベロープを可溶化する洗浄剤で破壊され、続いて残留ウイルスが化学的に不活化された、精製ウイルスを含む。
上記に加えてあるいは上記に代えて、一部の実施形態において、弱毒生インフルエンザウイルスワクチンが提供される。そのようなワクチンは、公知方法ステップにより、インフルエンザウイルス感染を予防または処置するために用いることができる。
一部の実施形態において、弱毒は、公知方法により、弱毒ドナーウイルスからの弱毒遺伝子を単離物またはリアソートウイルスに導入することにより、一段階で実現される（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｃｌｉｎ． Ｐｒａｃｔ． ２，１７４（１９９３）参照）。一部の実施形態において、ウイルスは、１つ以上のウイルス核酸配列の変異により弱毒化されて、変異体ウイルスが得られる。例えば一部の実施形態において、変異体ウイルス核酸配列は、欠陥のある蛋白質生成物をコードする。一部の実施形態において、蛋白質生成物は、低減された機能を有するか、または機能を有さない。他の実施形態において、いずれの蛋白質生成物も、変異体ウイルス核酸から生成されない。
つまりウイルスは、動物、例えばトリおよび／または哺乳動物において免疫応答を誘発する免疫原性組成物として（例えば、ワクチンとして）、公知方法により弱毒または不活化し、配合し、投与することができる。そのような弱毒または不活化ワクチンが、臨床単離物またはそれから得られた高度発育株と類似の抗原性を保持しているかを決定する方法は、当該技術分野で周知である。そのような公知方法としては、抗血清または抗体を用いてドナーウイルスの抗原決定因子を発現するウイルスを排除することと、化学的選別（例えば、アマンタジンまたはリマンチジン）；ＨＡおよびＮＡ活性および阻害；並びに抗原決定因子（例えば、ＨＡまたはＮＡ遺伝子）または他の変異体配列（例えば、Ｍ２）をコードするドナー遺伝子が弱毒ウイルス中に存在しないことを確認するためのＤＮＡスクリーニング（プローブハイブリダイゼーションまたはＰＣＲなど）が挙げられる。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｉｏｒｎａｌｅ ｄｉ Ｉｇｉｅｎｅ ｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖａ，２９，４（１９８８）；Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｂｕｌｌ． Ｍ２ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇ．，４１，６４３ （１９６９）；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，２０，２１３（１９９２）を参照されたい。
一部の実施形態において、ワクチンは、機能性Ｍ２蛋白質の発現を示さない弱毒インフルエンザウイルスを含む。一部の実施形態において、変異体ウイルスは、Ｍ２蛋白質を発現する細胞において良好に複製するが、対応する野生型細胞においては、感染性子孫バイロンを生成しないウイルス蛋白質を発現する。
皮内投与、接種または非経口もしくは経口投与に適した本発明の医薬組成物は、弱毒または不活化インフルエンザウイルスを含み、場合により滅菌水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンを更に含んでいてもよい。該組成物は、当該技術分野で公知の通り補助剤または賦形剤を更に含むことができる。例えば、Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，１５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（１９８７）；Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｅｉｇｈｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ａｖｅｒｙ’ｓ Ｄｒｕｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｋｏｒｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＤＩＳ Ｐｒｅｓｓ，ＬＴＤ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ． （１９８７）；およびＫａｔｚｕｎｇ，ｅｄ．，Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．（１９９２）を参照されたい。
一部の実施形態において、非経口投与用の調製物は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液および／またはエマルジョンを含み、当該技術分野で公知の補助剤または賦形剤を更に含んでいてもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。担体または密封包帯を用いて、皮膚透過性を上昇させ、抗原吸収を促進することができる。経口投与用の液体投与形態は、一般に、液体投与形態を含むリポソーム溶液を含んでいてもよい。リポソームを懸濁するための適切な形態としては、当該技術分野で一般に用いられる不活性希釈剤、例えば水を含む、エマルジョン、懸濁液、溶液、シロップ、およびエリキシルが挙げられる。不活性希釈剤の他に、そのような組成物は、アジュバント、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味剤、着香剤または芳香剤を含むこともできる。
本発明の組成物が個体への投与に用いられる場合、当該組成物は、塩、緩衝剤、アジュバント、または組成物の効能を改善するのに望ましい他の物質を更に含んでもよい。ワクチンの場合、アジュバント、つまり特異的免疫応答を増進する物質を、用いることができる。通常、アジュバントおよび組成物は、免疫系への提示の前に混合されるか、または別個ではあるが免疫処置される同じ臓器部位に提示される。
一部の実施形態において、本明細書に開示の免疫原性組成物（例えば、ワクチン）は、ウイルスまたはウイルス抗原の複数の異なるタイプを含み、その少なくとも１つは、変異体Ｍ２遺伝子（例えば、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）（配列番号１）変異を含むウイルス）、および／またはそのウイルスのＭ２機能性同等物内の対応する変異（例えば、インフルエンザＢ型のＮＢ蛋白質、またはインフルエンザＣ型のＣＭ１蛋白質）を含む。別の実施形態において、免疫原性組成物は、変異体Ｍ２遺伝子（例えば、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）（配列番号１）変異を含むウイルス）、および／またはそのウイルスのＭ２機能性同等物内の対応する変異（例えば、インフルエンザＢ型のＮＢ蛋白質、またはインフルエンザＣ型のＣＭ１蛋白質）を含むウイルスまたはウイルス抗原の単一タイプを含む。例えば一部の実施形態において、ワクチン組成物などの免疫原性組成物の主な構成要素は、Ａ型、Ｂ型もしくはＣ型、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上のインフルエンザウイルス、またはこれらのウイルスからの抗原の任意の組み合わせを含み、その少なくとも１つのウイルスは、変異体Ｍ２遺伝子（例えば、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）（配列番号１）変異を含むウイルス）、および／またはそのウイルスのＭ２機能性同等物内の対応する変異（例えば、インフルエンザＢ型のＮＢ蛋白質、またはインフルエンザＣ型のＣＭ１蛋白質）を含む。例えば一部の実施形態において、３つのタイプの少なくとも２つ、異なるサブタイプの少なくとも２つ、同じタイプの少なくとも２つ、同じサブタイプの少なくとも２つ、または異なる単離物（複数可）もしくはリアソータント（複数可）が、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）中で提供される。限定するものではないが、例えば、ヒトインフルエンザウイルスＡ型は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、およびＨ３Ｎ２サブタイプを含む。一部の実施形態において、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）は、変異体Ｍ２遺伝子（例えば、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）（配列番号１）変異を含むウイルス）、および／またはそのウイルスのＭ２機能性同等物内の対応する変異（例えば、インフルエンザＢ型のＮＢ蛋白質、またはインフルエンザＣ型のＣＭ１蛋白質）を含むウイルスと、組成物に侵入するウイルス株それぞれからのヘマグルチニン 約０．１〜２００μｇ、例えば１０〜１５μｇとを含む。ワクチンにおける非相同性は、少なくとも２株、例えば２〜５０株、またはその中の任意の範囲もしくは数値のインフルエンザウイルス株について、複製されたインフルエンザウイルスを混合することにより、提供される。一部の実施形態において、近年の抗原性組成物を有するインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルス株が、用いられる。加えて、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）は、当該技術分野で公知の技術を用いてインフルエンザウイルスの単一株内で変異を引き起こすことができる。
一部の実施形態において、ワクチンは、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）（配列番号１）変異を含むウイルスを、他のウイルス成分および／または他のウイルス成分を発現する遺伝子と共に含む。一部の実施形態において、ワクチン（例えば、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）（配列番号１）変異を含むウイルス）は、限定するものではないが例えば他のウイルス株からのＨＡおよびＮＡ遺伝子などの、他のウイルス株からの遺伝子を含む。一部の実施形態において、ワクチンは、ヒトインフルエンザウイルスＡ型サブタイプＨ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２またはＨ３Ｎ２からのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む。一部の実施形態において、ワクチンは、例えばＰＲ８ｘＢｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４、またはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（ＣＡ０７）ウイルスからのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む。
本発明による医薬組成物は、例えば遺伝子治療用の、少なくとも１種の化学療法化合物、免疫抑制剤、抗炎症剤もしくは免疫刺激剤、または抗ウイルス薬、例えば限定するものではないが、ガンマグロブリン、アマンタジン、グアニジン、ヒドロキシベンゾイミダゾール、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、チオセミカルバゾン（thiosemicarbarzones）、メチサゾン、リファムピン、リバビリン、ピリミジン類似体、プリン類似体、ファスカルネット、ホスホノ酢酸、アシクロビル、ジデオキシヌクレオシド、プロテアーゼ阻害剤、またはガンシクロビルを更に、または追加として含んでいてもよい。
組成物は、可変量であるが少量のエンドトキシン不含有ホルムアルデヒドと、安全であり本発明の組成物が投与される生物体中での望ましくない作用に寄与しないことが見出されている防腐剤とを含有してもよい。
Ｂ．投与
本明細書に開示の免疫原性組成物（例えば、ワクチン）は、従来からワクチンに利用または推奨される経路である非経口経路、粘膜経路のいずれかを介して投与されても、注射可能な、またはスプレー可能な液体、凍結乾燥、または噴霧乾燥、または風乾製剤などの様々な形態であってもよい。ワクチンは、筋肉内、皮下または皮内注射用のシリンジを用いて、または無針注射器を用いて投与されてもよい。ワクチンは、鼻、肺、膣または直腸のいずれに対しても、乾燥粉末または液体スプレーを粘膜に送達することが可能なネブライザーにより投与されてもよい。
本明細書に開示のワクチンは、受動免疫法または能動免疫法のいずれかにより、１つ以上のインフルエンザ株に耐性を付与し得る。能動免疫法では、不活化または弱毒生ワクチン組成物を、宿主（例えば、哺乳動物）に予防的に投与して、投与に対する宿主の免疫応答が、感染および／または疾患を防御する。受動免疫法に関しては、誘発された抗血清を回収して、少なくとも１つのインフルエンザウイルス株による感染の誘起が疑われるレシピエントに投与することができる。
つまり本発明は、疾患または障害、例えば少なくとも１つのインフルエンザウイルス株による感染を予防または弱毒化する方法を包含する。本明細書で用いられるワクチンは、その投与が疾患の症状もしくは状態の全体的もしくは部分的弱毒（即ち、抑制）を、または疾患に対する個体の全体的もしくは部分的免疫を生じる場合、疾患を予防または弱毒化すると言われる。
本発明の少なくとも１つの不活化もしくは弱毒インフルエンザウイルス、またはその組成物は、上述の医薬組成物を用いて、意図する目的を実現する任意の手段により投与され得る。例えば、そのような組成物の投与は、様々な非経口経路、例えば皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔、経口または経皮経路によるものであってもよい。非経口投与は、ボーラス注射によるものであっても、または時間をかけた緩徐な灌流によるものであってもよい。一部の実施形態において、本明細書に開示の免疫原性組成物は、筋肉内または皮下適用による。
一部の実施形態において、インフルエンザウイルス関連の病原を予防、抑制、または処置するためのレジメンは、単回処置として投与されるか、あるいは１週間〜約２４ヶ月、またはその中の任意の範囲もしくは数値までの期間にわたり、強化もしくはブースター投与量として反復される、本明細書に記載された有効量のワクチン組成物の投与を含む。一部の実施形態において、本明細書に開示のインフルエンザワクチンは、１年に１回投与される。
本発明によれば、ワクチン組成物の「有効量」は、所望の生物学的作用を実現するのに十分となる量である。一部の実施形態において、有効投与量が、レシピエントの年齢、性別、健康および体重、該当する場合には併用処置の種類、処置の頻度、並びに望まれる作用の性質に依存することが理解されよう。以下に示される有効用量の範囲は、本発明を限定するものではなく、例示的用量範囲を表す。つまり一部の実施形態において、投与量は、当業者に理解され、決定可能である通り、個々の対象に調合させる。哺乳動物（例えば、ヒト）の成体のための弱毒ウイルスワクチンの投与量は、約１０3〜１０7プラーク形成単位（ＰＦＵ）、またはその中の任意の範囲もしくは数値であってもよい。不活化ワクチンの用量は、ヘマグルチニン蛋白質約０．１〜２００ μｇの範囲内、例えば５０μｇであってもよい。しかし投与量は、出発点として既存のワクチンを用いて従来法により決定された、安全で有効な量でなければならない。
Ｃ．皮膚内送達
生インフルエンザワクチンは、従来は天然の感染経路を模倣して天然のウイルス感染と類似の免疫応答を促進するために、鼻腔に送達される。代わりに本明細書に開示されるのは、皮内送達の免疫学的利点を利用する新規なマイクロニードルデバイスの使用を含む皮内送達法である。一部の実施形態において、弱毒ウイルス（例えば、Ｍ２ウイルス変異体）が、皮内投与用のワクチン組成物中で用いられる。一部の実施形態において、感染性子孫ウイルスを生成しないＭ２ウイルス変異体が、ワクチン中で提供される。つまり野生型循環インフルエンザウイルスでのリアソートメントのいずれの可能性も、事実上、排除される。
本明細書に開示の実施形態において、皮内送達（皮膚内）により、皮膚にワクチンを投与する。一部の実施形態において、皮内送達は、マイクロニードル送達デバイスを用いて実施される。本明細書に開示の通り、皮膚内送達は数多くの利点を有する。例えばワクチンの免疫原性が、皮膚免疫系の免疫学的能力を惹起することにより促進される。ワクチンは、皮膚の強力な抗原提示樹状細胞、即ち表皮ランゲルハンス細胞および皮膚樹状細胞への直接的アクセスを有する。皮膚細胞は、皮膚を通して導入される抗原への免疫応答を促進する炎症誘発シグナルを生成する。更に皮膚免疫系は、抗原特異性抗体および細胞内免疫応答を生成する。皮内送達により、ワクチン用量を節約することができ、即ち皮膚内送達された場合に、先の因子を考慮して、より低用量の抗原が有効になり得る。
また、ワクチンが、デバイスのマイクロニードルアレイを通して皮膚に送達されるため、意図しない針刺しのリスクが低減され、マイクロニードルアレイを介した皮膚内ワクチン送達が、従来の針およびシリンジでの筋肉注射と比較して相対的に無痛である。
マイクロニードルデバイスは、例えば米国特許出願公開第２０１２／０１０９０６６号、同第２０１１／０１７２６４５号、同第２０１１／０１７２６３９号、同第２０１１／０１７２６３８号、同第２０１１／０１７２６３７号、および同第２０１１／０１７２６０９号に記載されたものなど、当該技術分野で公知である。マイクロニードルデバイスは、例えばウェットエッチングによるステンレス鋼シート（例えば、Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｂｒａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｇｅｏｇｉａ；ＳＳ ３０４；５０μｍ厚）の成型加工から作製することができる。一部の実施形態において、個々のマイクロニードルは、約５００μｍ〜１０００μｍ、例えば約７５０μｍの長さ、および約１００μｍ〜５００μｍ、例えば約２００μｍの幅を有する。その後、ワクチンを、マイクロニードルにコーティングとして塗布することができる。限定するものではないが、例えば、コーティング溶液は、１％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロールナトリウム塩（低粘度、ＵＳＰ等級；Ｃａｒｂｏ−Ｍｅｒ、カリフォルニア州サンディエゴ所在）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｌｕｔｒｏｌ Ｆ−６８ ＮＦ （ＢＡＳＦ、ニュージャージー州マウントオリーブ）および抗原（例えば、５ｎｇ／ｍｌの可溶性ＨＡ蛋白質；本明細書に記載されたＭ２変異体ウイルスなどの弱毒生ウイルスなど）を含んでいてもよい。より高いワクチン濃度に達するように、コーティング溶液を室温（〜２３℃）で５〜１０分間蒸発させてもよい。コーティングは、ディップコーテォング法により実施されてもよい。マイクロニードルの１列あたりのワクチン量は、マイクロニードルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２００μｌに５分間浸漬し、当該技術分野で公知の方法により抗原についてアッセイすることにより、決定することができる。
一部の実施形態において、簡単なスナップフィットおよびヒートシールにより嵌め合わせられたポリプロピレンおよびステンレス鋼のファーストカット部品で主に作製されたマイクロニードルデバイスが用いられる。一部の実施形態において、デバイスは、完全内蔵式であり、ワクチン、ポンプ機構、活性化機構、およびマイクロニードルユニットを含む。これらの構成部品は、プラスチックカバー内に隠れている。動作ボタンを押すことにより、デバイスを用いたワクチンの注入が開始される。ボタンを押すと同時にマイクロニードルが皮膚内に挿入され、主な薬物コンテナに圧力を加えるポンプ機構が始動する。ばね機構がワクチンリザーバーに十分な圧力を加えると、ワクチンがマイクロニードルアレイを通り皮膚内に流れ始める。一部の実施形態において、ワクチン用量の送達は、デバイスの動作後約２分以内に完了される。注入が完了した後、デバイスが皮膚から穏やかに除去される。
一部の実施形態において、マイクロニードルデバイスを用いて免疫原性組成物（例えば、ワクチン）の皮膚内投与の方法が提供される。一部の実施形態において、マイクロニードルデバイスは、穿刺機構および免疫原性組成物層を含んでおり、皮膚を穿刺することが可能な複数のマイクロニードルを含み、免疫原性組成物を皮膚内に投与させることができる。一部の実施形態において、該方法は、穿刺機構を押し下げることを含む。一部の実施形態において、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）は、発現される変異体Ｍ２蛋白質または発現されない変異体Ｍ２蛋白質をコードする核酸配列を含むウイルスを含み、発現される変異体Ｍ２蛋白質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。一部の実施形態において、マイクロニードルアレイは、最初、デバイスハウジングの内部に配置され、レバーの動作により、デバイスボタンを通してマイクロニードルを伸長させて皮膚内に挿入し、それによりワクチン液を皮膚に注入することができる。
本明細書に記載された送達デバイスを利用して、所望の任意の物質を送達してもよい。一実施形態において、送達される物質は薬物であり、送達デバイスは、薬物を対象に送達するように構成された薬物送達デバイスである。本明細書で用いられる用語「薬物」は、任意の治療的、予防的または薬効的目的で対象に送達される任意の物質（例えば、ワクチン、医薬、栄養素、機能性食品など）を含むものとする。そのような一実施形態において、薬物送達デバイスは、対象に１用量のワクチンを送達するように構成されたワクチン送達デバイスである。一実施形態において、送達デバイスは、インフルエンザワクチンを送達するように構成されている。本明細書に議論された実施形態は、主として、物質を経皮的に送達するように構成されたデバイスに関する。一部の実施形態において、デバイスは、物質を皮膚以外の臓器に直接送達するように構成されていてもよい。
以下の実施例は、インフルエンザＡ型で示されるが、本明細書に記載された変異および方法が、Ｍ２、Ｍ２様蛋白質、またはインフルエンザＡ型Ｍ２蛋白質と同じ機能もしくは類似した機能を有する蛋白質を発現する他のウイルスに等しく適用可能であることを理解されたい。
実施例１：Ｍ２ウイルス変異体の生成
Ｍ２変異体を、以下の通り構築した。
ａ）Ｍ２−１：Ｍ２エクトドメイン＋２つの終止コドン＋ＴＭ欠失（ＰＲ８ Ｍセグメント＋７９２〜８４２（ＴＭ）を含ない２つの終止コドン（７８６〜７９１））
ＰＲ８からの部分的野生型Ｍ遺伝子を、以下に示すオリゴセット１およびオリゴセット２を用いたＰＣＲにより増幅させた。
ＰＣＲ産物を、その後、ＢｓｍＢＩで消化した。発現ベクター（ｐＨＨ２１）もＢｓｍＢＩで消化して、消化されたＰＣＲ産物を、その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてベクターにライゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をベクターで形質転換し、適切なインキュベーションの後、当該技術分野で公知の方法により、ベクターを単離および精製した。ベクターの変異体Ｍ２部分を、核酸配列決定によりキャラクタライゼーションした。
ｂ）Ｍ２−２：Ｍ２エクトドメイン＋２つの終止コドン＋スプライス欠損（ＰＲ８ Ｍセグメント＋２つの終止コドン（７８６〜７９１）＋スプライス欠損 ｎｔ５１）
ＰＲ８からの部分的野生型Ｍ遺伝子を、以下に示すプライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅させた。
ＰＣＲ産物を、その後、ＢｓｍＢＩで消化した。発現ベクター（ｐＨＨ２１）も、ＢｓｍＢＩで消化した。二本鎖ＤＮＡフラグメントを、その後、以下に示す２つのヌクレオチドをアニーリングすることにより作製した。
その後、消化されたベクター、ＰＣＲ産物および二本鎖フラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をベクターで形質転換し、適切なインキュベーションの後、当該技術分野で公知の方法により、ベクターを単離および精製した。ベクターの変異体Ｍ２部分を、核酸配列決定によりキャラクタライゼーションした。
ｃ）Ｍ２−３：Ｍ２エクトドメイン＋２つの終止コドン＋ＴＭ欠失（ＰＲ８ Ｍセグメント＋７９２〜８４２（ＴＭ）を含まない２つの終止コドン（７８６〜７９１）＋スプライス欠損 ｎｔ５１）
部分的Ｍ２−１変異体（Ｍ２エクトドメイン＋２つの終止コドン＋ＴＭ欠失（ＰＲ８ Ｍセグメント＋７９２〜８４２（ＴＭ）を含ない２つの終止コドン（７８６〜７９１）））を、以下のプライマーを用いたＰＣＲによりＰＲ８から増幅させた。
その後、ＰＣＲ産物を、ＢｓｍＢＩで消化した。発現ベクター（ｐＨＨ２１）も、ＢｓｍＢＩで消化した。二本鎖ＤＮＡフラグメントを、その後、以下に示す２つのヌクレオチドをアニーリングすることにより作製した。
その後、消化されたベクター、ＰＣＲ産物および二本鎖フラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をベクターで形質転換し、適切なインキュベーションの後、当該技術分野で公知の方法により、ベクターを単離および精製した。ベクターの変異体Ｍ２部分を、核酸配列決定によりキャラクタライゼーションした。
３つのＭ２変異体構築物それぞれの配列を、表１〜３に示す。
実施例２：Ｍ２変異体ウイルスの作製および培養
この実施例は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）（配列番号１）変異を含むＰＲ８ウイルスの培養を示す。変異体ウイルスを、Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｅｎｔｉｒｅｌｙ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：９３４５−９３５０（１９９９）に報告されたものに若干の改良を加えて作製した。簡潔に記載すると、２９３Ｔ細胞を、１７個のプラスミドでトランスフェクトした：８個のＲＮＡセグメントに関する８個のＰｏｌI構築物（その１つが変異体Ｍ２配列を有する）、および以下のような５個の構造蛋白質に関する９個の蛋白質発現構築物：Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＮＰ（ｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−ＮＰ０／１４）；Ｍ２（ｐＥＰ２４ｃ）：ＰＢ１（ｐｃＤＮＡ７７４）；ＰＢ２（ｐｃＤＮＡ７６２）；およびＰＡ（ｐｃＤＮＡ７８７）。
プラスミドを、トランスフェクション試薬（ＤＮＡ１μｇあたりＴｒａｎｓ ＩＴ（登録商標） ＬＴ−１（Ｍｉｒｕｓ、ウィスコンシン州マディソン所在）２μＬ）と混合し、室温で１５〜３０分間インキュベートして、１×１０6個の２９３Ｔ細胞に添加した。４８時間後に、上清中のウイルスを系列希釈し、Ｍ２ＣＫ細胞に接種した。接種から２〜４日後に、細胞が明らかな細胞変性作用（ＣＰＥ）を示した最終希釈ウェルの上清中のウイルスを、ウイルス原液の生成のためにＭ２ＣＫ細胞に接種した。生成されたウイルスのＭ２遺伝子を配列決定して、その遺伝子および意図する変異の存在を確認し、不適切な変異が存在しないことを確認した。
変異体Ｍ２ウイルスを、以下の通り発育および継代させた。Ｍ２ＣＫ宿主細胞を、１０％胎仔ウシ血清を補足されたＭＥＭの存在下で発育させた。ＰＢＳで洗浄し、次に３７℃でウイルスを吸着させることにより、細胞をＭＯＩ ０．００１で感染させた。トリプシン／ＴＰＣＫを含有するウイルス発育培地を添加して、細胞変性作用が観察されるまで、細胞を２〜３日間インキュベートした。
実施例３：Ｍ２ＫＯ複製が正常細胞において制限される
Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）（配列番号１）変異を含むＰＲ８ウイルスおよび野生型ＰＲ８の発育速度を、正常なＭＤＣＫ細胞およびＭ２蛋白質を安定発現するＭＤＣＫ細胞（Ｍ２ＣＫ）の両方で分析した。細胞を１０-5の感染多重度でウイルスに感染させた。細胞上清中のウイルス価を、ＭＤＣＫまたはＭ２ＣＫ細胞で決定した。野生型ＰＲ８は、両細胞型内で高力価に発育したが、Ｍ２ＫＯは、Ｍ２ＣＫ細胞内のみで良好に発育し、ＭＤＣＫ細胞内では一切発育しなかった（図４）。
実施例４：Ｍ２ＫＯウイルスは正常細胞においてウイルス抗原を生成するがＭ２を生成しない
この実施例は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）（配列番号１）変異を含むＰＲ８ウイルスが正常細胞においてウイルス抗原を生成するがＭ２蛋白質を生成しないことを示す。トリプシンを含まない培地中で野生型ＭＤＣＫ細胞を野生型ＰＲ８またはＭ２ＫＯに０．５の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させて、ウイルスが１回のみのライフサイクルを確実に完了させることにより、ウイルス蛋白質発現を評価した。細胞溶解物中のウイルス蛋白質を、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離して、ＰＲ８に感染したマウス血清（パネルＡ）または抗Ｍ２モノクローナル抗体（１４Ｃ２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（パネルＢ）を用いたウエスタンブロットにより検出した。図３Ａは、ＰＲ８への抗血清が、ＰＲ８およびＭ２ＫＯの両方について類似レベルの蛋白質発現を検出することを示す。溶解物を抗Ｍ２モノクローナル抗体でプローブした場合（パネルＢ）、Ｍ２発現が、ＰＲ８感染細胞のみで検出され、Ｍ２ＫＯでは検出されない。これらの結果から、Ｍ２ＫＯウイルスが、Ｍ２蛋白質を除く全てのウイルス蛋白質を、ＰＲ８ウイルスと類似のレベルまで発現することが示される（図５）。
実施例５：Ｍ２変異体がインビボで弱毒化される
Ｍ２変異体ウイルスがインビボで弱毒化されることを示す実験を実施した。６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群２３匹）に、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ（２００９）８３：５９４７−５９５０に記載されたＭ２ＫＯ（ｙｋ）；Ｍ２−１(ＴＭ ｄｅｌ Ｍ２ＫＯ ａｋａ Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ））およびＭ２−２(Ｓｐｌｉｃｅ ｄｅｆ Ｍ２ＫＯ）（集合的に「Ｍ２ＫＯ変異体」と称する)の変異体の１つを鼻腔接種した。変異体を、１．２×１０4ｐｆｕ／匹の用量で投与した。対照群のマウスには、ＰＢＳを与えた。任意の体重変動および感染の症状について、マウスを接種後１４日間観察した。加えて接種から３日後に、ウイルス価を、各群マウス３匹の肺および鼻甲介（ＮＴ）から得た。
図６に示す通り、Ｍ２ＫＯ変異体およびＰＢＳを接種されたマウスは、１４日間にわたり、感染の臨床症状も、体重減少も示さなかった。群間での体重変動は、１４日間にわたり同等であった。加えて、肺およびＮＴから集められた力価において、ウイルスは一切検出されなかった。まとめると、臨床症状がなく、体重減少がなく、ウイルスが存在しないことから、Ｍ２ウイルスがマウスにおいて弱毒化され、病原性がないことが示される。
実施例６：Ｍ２変異体はインフルエンザウイルスへの抗体を誘導し、マウスを致死的ウイルスチャレンジから防御する
上記の実施例５に記載されたマウスからの抗体価および致死的ウイルス用量でチャレンジされた後の生存を測定する検査も実施した。血清試料を、接種から３週間後に採取し、血清試料からの抗ウイルスＩｇＧ抗体価を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により決定した。液性反応を図７に示すが、それは３種のＭ２変異体全てが対照ＰＢＳ群よりも高く抗インフルエンザウイルス抗体を上昇させたことを示す。
加えて、群それぞれのマウスの半数を、同量のＭ２変異体ウイルス接種から２８日後にブーストした。その後、最初の接種から６週後に血清を採取し、ウイルスへのＩｇＧ抗体価を決定した。図７Ｂに示す通り、Ｍ２変異体ウイルスによりブーストされたマウスは、ブーストされていないマウスより高レベルの抗インフルエンザウイルス抗体を有した。
最初の接種から４９日後（ブーストから３週間後）に、マウスを致死用量（マウス４０匹の５０％の致死用量（ＭＬＤ50））のＰＲ８ウイルスでチャレンジした。図８および図９に示す通り、Ｍ２ＫＯ変異体をワクチン接種されたマウスは全て、チャレンジ後に生存し、体重減少がなかった。しかしＰＢＳのみを与えられた対照マウスは、体重が減少し、チャレンジ日から８日後に生存していなかった。チャレンジ後３日目に、肺およびＮＴを得て、ウイルス価をプラークアッセイによりＭＤＣＫ細胞において決定した。表１１に表す通り、Ｍ２ＫＯ変異体の肺ウイルス価は、ナイーブ対照ＰＢＳにおける力価よりも少なくとも１ｌｏｇ低かった。また、ウイルスのほとんど全てが、Ｍ２ＫＯ変異体群では鼻甲介において検出されなかったが、ナイーブ対照ＰＢＳ群では１００，０００ＰＦＵ／ｇより多く検出されており、Ｍ２変異体ワクチンが防御を付与し、チャレンジウイルスの複製を制限することが示される。
別の実験において、免疫処置から６週後に、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）群をホモサブタイプまたはヘテロサブタイプインフルエンザウイルスでチャレンジした。マウスをＡｉｃｈｉ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスでチャレンジし、１４日間の生存について評定した。ヘテロタイプチャレンジの結果を、図１６に示す。
実施例７：皮内ワクチン送達
皮内ワクチン送達／免疫処置が対象をインフルエンザから防御することを示す実験を実施した。６〜７週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群５匹）（Ｈａｒｌａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、１．８×１０1、１．８×１０2、１．８×１０3または１．８×１０4ｐｆｕ（５０μｌ）／匹の濃度のＰＲ８ウイルス（３．５×１０1ｐｆｕ）を鼻腔（ＩＮ）、筋肉内（ＩＭ）または皮内（ＩＤ）のいずれかで接種した。対照マウスにも、３つの異なる投与経路でＰＢＳを与えた。体重および生存を、接種後１４日間モニタリングした。マウスの実験では、皮内ベベル針の付いたアレルギー用シリンジを用いた。
ワクチンの大半は、従来の針およびシリンジを用いて筋肉または皮下注射により投与される。しかし、近年の研究により、皮内ワクチン送達が筋肉または皮下投与よりも良好な免疫原性に達することが示されている。皮内ワクチン接種は、抗原を豊富な皮膚免疫系に直接送達するもので、狂犬病、Ｂ型肝炎およびインフルエンザなどの一定範囲のワクチンに効果的であることが示されている。皮内送達は、用量の節約ももたらし、筋肉注射で必要とされるワクチンよりも少ないワクチンを用いて同じ免疫応答を実現することができる。皮内送達（従来の針およびシリンジを用いる）で現在最先端の技術がマントー法であるが、この方法はかなりの訓練を必要とし、実施が困難であり、多くの場合、誤った（皮下）または不完全な投与を引き起こす。この投与経路での優れた免疫応答が示されたとしても、適切な送達デバイスが無いことで、皮内ワクチン接種の研究および製品開発が妨げられてきた。
表１２に示すように、ＩＮ接種されたマウスは、１．８×１０3および１．８×１０4ｐｆｕ／匹の高用量でインフルエンザ感染により死亡し、完全に生存したのは最低用量１．８×１０1のみであった。しかしＩＭおよびＩＤ接種されたマウスは、全用量で生存した。表１３は、ＩＮ接種群でのマウスのメジアン致死用量（ＭＬＤ50）を示す。図１０は、ウイルスを１．８×１０4ｐｆｕ接種されたＩＭおよびＩＤ接種マウスが、体重変動を一切呈しなかったことを示し、ウイルスを１．８×１０4ｐｆｕ接種されたＩＮ接種マウスが生存しなかったことを示す。

接種後２週目（図１１Ａ）および７週目（図１１Ｂ）に血清を採取し、ＥＬＩＳＡにより決定された抗ＰＲ８ ＩｇＧ抗体を評価した。「Ｈｉ」は、１．８×１０4ｐｆｕ接種を表し、「Ｌｏ」は、１．８×１０1ｐｆｕを表す。両期間でのＩＭおよびＩＤ接種マウスの応答は類似している。各期間で、ＩＮ接種マウスは、最大数の抗体を提示した。この時期までに、より高用量を接種されたＩＮ接種マウスが死亡していたため、１．８×１０1ｐｆｕを接種されたＩＮ接種マウスのみが、同定された（即ち、「Ｌｏ」）。ＩＭおよびＩＤ接種マウスは、ＩＮ接種マウスよりも低レベルで抗体を提示したが、より高用量を接種されたマウスは、ＰＢＳのみを与えられた対照マウスと比較して、より多くの抗体量を示した。加えて、図１１Ｂに示されたより高力価レベルにより示されるように、時間を経ると、皮内投与経路が筋肉内経路よりも多くの抗体を生成した。
別の実験において、ＩＮ、ＩＭおよびＩＤ接種マウスの群（１．８×１０3群の４匹以外は５匹／群）を、ワクチン接種から８週後にチャレンジした。具体的には、１．８×１０1 ＩＮ接種マウス、１．８×１０3 ＩＭ接種マウス、１．８×１０4 ＩＭ接種マウス、１．８×１０3 ＩＤ接種マウス、および１．８×１０4 ＩＤ接種マウスを、チャレンジした。体重が２５％を超えて減少したマウスは安楽死させた。
図１２に示すように、用量１．８×１０3のＩＭ接種マウスの１００％が、チャレンジから８日後に生存しなかった。ＩＤ接種マウス全ての生存率は、４０％〜６０％であった。しかし１．８×１０4のＩＭ接種マウスの生存率は、１００％であった。図１３は、ＩＤ接種群およびＩＭ接種群（１．８×１０4）群のマウスは、初期平均体重の減少を有したが、チャレンジ日からは比較的低い体重減少量で終了した。
ＩＤ接種マウス（１．８×１０4）の評価から、マウス２匹（図１４および図１５内の１および５）は、他のマウスよりも良好な免疫応答を誘発し、更にインフルエンザ感染の症状（例えば、体重減少、被毛粗剛、沈静など）を発症しなかった。しかしＩＭ接種群（１．８×１０4）のマウスは全て、若干の症状と、少なくとも１０％の体重減少とを示した。
実施例８：Ｍ２ＫＯ変異体の安定性
野生型細胞におけるＭ２ＫＯ変異体のＭ２遺伝子の安定性を検査するために、Ｍ２ＫＯ変異体を、Ｍ２蛋白質を発現するＭＤＣＫ細胞であるＭ２ＣＫ細胞と共に、Ｍ２蛋白質発現を示さない野生型ＭＤＣＫ細胞中で継代させた。Ｍ２ＫＯ変異体は全て、少なくとも１０継代までいずれの変異も有さずにＭ２ＣＫ細胞中で継代可能であった。Ｍ２−１（ＴＭ ｄｅｌ Ｍ２ＫＯ）、Ｍ２−２（Ｓｐｌｉｃｅ ｄｅｆ Ｍ２ＫＯ）、およびＭ２−３（ＴＭ ｄｅｌ＋Ｓｐｌｉｃｅ ｄｅｆ Ｍ２ＫＯ）は、野生型ＭＤＣＫ細胞中で継代することができなかったが（細胞変性作用（ＣＰＥ）は、野生型ＭＤＣＫ細胞内では見られない）、Ｍ２ＫＯ（ｙｋ）は、ＭＤＣＫ細胞中での４継代目以降でもＣＰＥを示した。ＭセグメントＲＮＡを、野生型ＭＤＣＫ中でのＭ２ＫＯ（ｙｋ）の４継代目から抽出し、ｃＤＮＡを配列決定した。表１４に示す通り、Ｍ２ＫＯ（ｙｋ）の挿入された２つの終止コドンは、編集され、野生型ＭＤＣＫ中のＭ２ＫＯ（ｙｋ）の４継代目は、全長Ｍ２蛋白質遺伝子を有した。
実施例９：Ｍ２ＫＯワクチン接種
Ｍ２ＫＯワクチンが天然インフルエンザ感染に類似した免疫応答を刺激し得ることを示すために、ワクチン実験を実施した。天然のインフルエンザ感染がＰＲ８ウイルスの低用量接種により提示され、標準の不活化インフルエンザワクチンが、標準的筋肉内経路および鼻腔に送達された不活化ＰＲ８ウイルス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）により提示された。
６〜７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを、生ウイルス（１０ｐｆｕ ＰＲ８）、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）を含むＰＲ８ウイルス（１０4ｐｆｕ）で鼻腔に免疫処置するか、または不活化ＰＲ８ウイルス１μｇを鼻腔および筋肉内の両方で送達させた。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）の感染性粒子１０4を鼻腔に与えられたマウスは、体重を一切減少させず、感染の兆候も一切示さなかった。更にＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）で処置されたマウスの肺は、接種から３日後に検出可能な感染性粒子を含まなかった。２１日目に免疫処置マウスから血清を得て、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにより、ヘマグルチニンに対する抗体価を決定した。図１７は、抗ＨＡ ＩｇＧ価が、不活化ワクチン群に対して、生ウイルスおよびＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）群で最高であったことを示す。インフルエンザに対する粘膜ＩｇＡ抗体は、生ＰＲ８またはＭ２ＫＯワクチン接種マウスでは血清のみに検出された。
免疫処置の６週後に、全ての群を、ホモサブタイプ（ＰＲ８ Ｈ１Ｎ１）またはヘテロサブタイプ（Ａｉｃｈｉ、Ｈ３Ｎ２）インフルエンザウイルスでチャレンジした。Ｍ２ＫＯおよび不活化ワクチン接種の両方が、マウスをホモサブタイプウイルス感染から防御した（図１８）。しかし、Ｍ２ＫＯワクチン接種マウスのみが、ヘテロサブタイプウイルスチャレンジから防御された（図１９）。不活化ワクチンで免疫処置されたマウスは、ナイーブマウスと同様に感染により死亡した。
実施例１０ Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスは気道または他の臓器内で複製しない
概要−この実施例は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスがフェレットモデルにおいて、気道内で複製しないこと、または他の臓器に伝播しないことを示す。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを１×１０7ＴＣＩＤ50の用量レベルで、雄フェレット３匹に鼻腔投与した。対照として、雄フェレット３匹の第二の群に、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザＡ型ウイルスを１×１０7ＴＣＩＤ50の用量で鼻腔投与した。ウイルス接種後に、死亡率について接種後３日目までフェレットを観察し、体重、体温および臨床兆候は、１日１回観察した。剖検は、接種から３日後に全ての動物で実施した。臓器を、組織病理学的検査およびウイルス価のために採取した。
Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）を受けた対照群は、一過性の体重減少と、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）群では観察されなかった接種から２日後の体温上昇を示した。活動レベルも、感染後２〜３日目にくしゃみが観察されたＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７群において低下された。ウイルス暴露に関連する活動レベルまたは臨床兆候の変動は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）群において一切観察されなかった。組織病理学的分析で、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスに暴露されたフェレットで見られなかった、インフルエンザＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）に暴露された動物における鼻甲介の変動が、明らかとなった。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７への暴露は、呼吸器上皮の萎縮、好中球浸潤および鼻甲介の浮腫を生じた。他の臓器は、ウイルス接種による影響を一切受けなかった。その実験の条件下で、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスは、感染の臨床兆候を誘導せず、または分析された臓器における組織学的変動をもたらさなかった。
材料および方法
Ａ．ワクチン材料および対照ウイルス：Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスは、ＰＲ８（核蛋白質（ＮＰ）、ポリメラーゼ遺伝子（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、非構造蛋白質（ＮＳ）、マトリックス（Ｍ））の内部遺伝子６つを有するが、機能性Ｍ２蛋白質、並びにインフルエンザＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７様Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）のＨＡおよびＮＡ遺伝子を発現しない組換えウイルスである。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）野生型ウイルスは、対照ウイルスとして働き、ＩＩＴＲＩにより供給された。ウイルスは、使用するまで−６５℃で凍結保存した。
Ｂ．被験物質および陽性対照投与製剤：１×１０１０ＴＣＩＤ50／ｍＬの８μＬをＰＢＳ ２．５２８ｍＬに希釈することにより、３１６μＬあたり１×１０7ＴＣＩＤ50／ｍＬのＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）投与溶液を調製した。３１６μＬあたり１×１０7ＴＣＩＤ50／ｍＬの力価のＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）は、希釈せずに用いた。
Ｃ．動物および動物の飼育：雄フェレット８匹を、Ｔｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍから購入し、フェレット６匹を試験に登録した。動物は、試験開始時は約４月齢であった。動物は、健康で感染性疾患への抗体を有さないことが供給業者により保証されていた。到着時の動物は、紙張りの排泄皿を備え、底に隙間の開いている吊り下げ式ワイヤーケージに、個別に収容した。動物室およびケージを、一般に認められている動物飼育手順および関連の標準操作手順書に従って動物の受け入れ前に掃除し、衛生化した。保証書のあるＴｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｆｅｒｒｅｔ Ｄｉｅｔ ＃２０７２（Ｔｅｋｌａｄ Ｄｉｅｔｓ、ウィスコンシン州マディソン所在）およびシカゴ市水道水が、随意に摂取され、少なくとも１日１回新しいものに交換した。動物室の蛍光照明を、１２時間の明暗周期で維持した。動物室の温度および相対湿度は、それぞれプロトコールの限界内であり、試験の間はそれぞれ２２．０〜２５．０℃および３３〜５６％の範囲内であった。
Ｄ．動物の検疫および無作為化：フェレットを５日間検疫した後無作為化して、１日１回観察した。動物の全般的な健康を示す１日１回の観察に基づいて、フェレットを無作為化および検査のために検疫から解放した。検疫後に、フェレットの体重を計量し、類似の群平均値を生じる体重に基づくコンピューター無作為化手順を利用して、処置群に割りつけた[ＴｏｘＤａｔａ（登録商標） ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１．Ｅ．１１（ＰＤＳ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、スイス、バーゼル所在）]。群内では、全動物の体重が、平均の２０％以内であった。試験に選択された動物は、耳標およびトランスポンダーにより永久的識別番号を受け取り、個々のケージカードでも、個体番号および群により試験動物を識別した。割りつけられた識別番号は、その試験のみのものであった。
Ｅ．実験計画：動物手順は全て、ＩＩＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物実験委員会により承認されたプロトコールに従って、動物の生物学的安全性レベル２施設で実施した。試験開始時に４月齢の雄フェレット（Ｔｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍｓ、ペンシルバニア州セイヤー所在）６匹を、試験に用いた。感染の前に、フェレットを体重測定およびベース体温の確定のために３日間モニタリングした。温度の測定値を、各フェレットにおいて皮下に植え付けられたトランスポンダー（ＢｉｏＭｅｄｉｃ ｄａｔａ ｓｙｓｔｅｍｓ、デラウエア州シーフォード所在）で１日１回記録した。試験開始前に、血液を頸静脈から採取して、血清をインフルエンザ抗体について検査した。インフルエンザ抗体を含まない試験動物を無作為化して、表１５に示す通り２群（３匹／群）に分けた。３匹からなる１群を麻酔にかけて、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスの１×１０7ＴＣＩＤ50 ３１６μＬの単一用量を鼻腔接種した。対照群（３匹）には、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）の１×１０7ＴＣＩＤ50 ３１６μＬを接種した。フェレットは、体重、体温および臨床症状をモニタリングするために、１日１回観察した。接種後３日目に、フェレット（３匹／群）を安楽死させて、剖検に供した。鼻甲介、気管、肺、腎臓、膵臓、嗅球、脳、肝臓、脾臓、小腸および大腸の組織試料を採取した。採取した試料の一部を、組織学的評価のために緩衝された中性ホルマリンで固定し、試料の他の部分は、ウイルス価測定のために−６５℃で貯蔵した。
Ｆ．ウイルス接種：フェレットに、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスまたは野生型Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザＡ型ウイルスのいずれかを接種した。凍結貯蔵物のバイアルを解凍して、リン酸緩衝生理食塩溶液で適切な濃度に希釈した。フェレットにケタミン／キシラジンで麻酔をし、ウイルス用量を、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスでは３１６μＬ、およびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）ウイルスでは３１６μＬの容積で鼻腔投与した。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）ウイルスの接種力価を確認するために、ＴＣＩＤ50アッセイを、調製されたウイルスチャレンジ溶液の一部によりＩＩＴＲＩで実施した。ウイルス価アッセイを、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＩＩＴＲＩ）の標準操作手順に従って実施した。
Ｇ．瀕死／致死の観察：チャレンジ後に、致死または瀕死のエビデンスの有無を全ての動物について１日２回観察した。動物は、チャレンジ後３日間観察した。静脈内投与されたペントバルビタールナトリウム１５０ｍｇ／ｋｇの過剰用量により、動物を安楽死させた。
Ｈ．体重および体重変動：動物の体重を、受け入れ時（無作為に１０％の試料）、無作為化時（試験前３日目〜０日目）、およびウイルス接種後は１日１回、それぞれ記録した。
Ｉ．臨床観察：体温（摂氏）の変動を、各フェレットについて１日１回測定した。食欲不振の臨床兆候、呼吸困難、くしゃみ、咳および鼻漏などの呼吸器の兆候、並びに活動レベルを、１日１回評価した。Ｒｅｕｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，”Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｓｉｇｎｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｌｌｎｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｒｅｔ ｍｏｄｅｌ，” Ｊ． Ｖｉｒｏｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２７−３４（１９８９）の記載に基づく評定システムを利用して、０、機敏でよく遊ぶ；１、機敏であるが刺激した時だけよく遊ぶ；２、機敏であるが刺激した時にあまり遊ばない；３、機敏でなく刺激してもあまり遊ばない、の通り活動レベルを評価した。相対不活発指数（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｉｎａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）（ＲＩＩ）を、試験期間中の観察（１日）１回あたりのフェレット群ごとの平均スコアとして計算した。
Ｊ．安楽死：試験動物を、ペントバルビタールナトリウム１５０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量により安楽死させた。観察可能な鼓動および呼吸がないことにより、死亡を確認した。全ての試験動物で、剖検を実施した。
Ｋ．剖検：鼻甲介、気管、肺、腎臓、膵臓、嗅球、脳、肝臓、脾臓、小腸および大腸を、採取した。各組織の一部をホルマリンに固定し、他の部分は凍結および貯蔵のためにＩＩＴＲＩの職員に渡した。力価用に採取された組織は、右鼻甲介、気管の上部１／３、右肺後葉、右腎、膵臓の右側（十二指腸付近）、右嗅球、右脳、肝臓の外側右葉、脾臓の右半分（腹腔を開くと見える脾臓の端部）、小腸および大腸である。
Ｌ．組織病理学的分析：組織をパラフィンブロックに加工し、約５ミクロン厚に切り出し、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
Ｍ．血清採取：ワクチン接種前（投与前３日目）の血清を、全てのフェレットから採取した。フェレットに、ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）との混合物で麻酔した。血液試料（約０．５〜１．０ｍＬ）を、各フェレットの大静脈から採取して、血清に処理した。血液をＳｅｒｕｍ Ｇｅｌ Ｚ／１．１管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州ニュートン所在）に採取し、血清を採取する前に室温で１時間以下の間貯蔵した。Ｓｅｒｕｍ Ｇｅｌ Ｚ／１．１管を１０，０００×ｇで３分間遠心分離して、血清を採取した。個々の接種前血清試料を採取して、２つのアリコットを各試料から作製した。一方のアリコットは、フェレットがインフルエンザＡ型ウイルスへの抗体を有さないことを確認するために試験開始前に検査して、もう一方の血清のアリコットは、−６５℃に貯蔵した。
Ｎ．赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイ：血清試料を受容体破壊酵素（ＲＤＥ）（デンカ生研、日本、東京都所在）で処理して、非特異的赤血球凝集の抑制物質を排除した。ＲＤＥは、製造業者の使用説明書に従って再生した。血清をＲＤＥで１：３に希釈し、３７℃±２℃の水浴中で１８〜２０時間インキュベートした。等容積の２．５％（ｖ／ｖ）クエン酸ナトリウムを添加した後、試料を５６±２℃の水浴中で３０±５分間インキュベートした。０．８５％ＮａＣｌを、ＲＤＥ処理の後、各試料に１：１０の最終血清希釈になるまで添加した。その後、希釈された試料を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）での２倍希釈を２本ずつ４回行い（１：１０〜１：８０）、その後、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザＡ型ウイルスの４赤血球凝集単位と共にインキュベートした。インキュベーション後、０．５％トリ赤血球細胞を各試料に添加して、インキュベートした。その後、赤血球凝集の有無を評定した。
Ｏ．ウイルス価：チャレンジウイルス接種前および接種後の試料中の感染性ウイルス濃度を、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞中のＴＣＩＤ50により決定した。簡潔に記載すると、−６５℃で保存された試料を解凍し、遠心分離して細胞断片を除去した。得られた上清を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で三重測定として、ペニシリン／ストレプトマイシン、０．１％ゲンタマイシン、３％ＮａＣＯ3、０．３％ＢＳＡ第Ｖ画分（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス所在）、１％ＭＥＭビタミン溶液（Ｓｉｇｍａ）および１％Ｌ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、米国バージニア州マナサス所在）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ、米国カリフォルニア州カールスバッド所在）に１０倍希釈した。１０倍系列希釈物を作製した後、１００Ｌを、単層のＭＤＣＫ細胞を含む９６ウェルプレートの各ウェルに移し替えた。プレートを５±２％ＣＯ2、湿度７０％中、３７℃±２℃でインキュベートした。４８時間後に、ウェルを、細胞変性作用（ＣＰＥ）について観察した。各ウェルからの上清（５０μｌ）を９６ウェルプレートに移し替えて、赤血球凝集（ＨＡ）活性を測定および記録した。上清のＨＡ活性を、０．５％七面鳥濃厚赤血球細胞（ｃＲＢＣ）を用いたＨＡアッセイにより評価した。ＴＣＩＤ50力価を、Ｒｅｅｄ ＬＪ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ Ｈ，”Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ５０％ ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ，” Ａｍ． Ｊ． Ｈｙｇｉｅｎｅ ２７： ４９３−４９７（１９３８）の方法を用いて計算した。
Ｐ．データ解析：体重および体重増加（減少）および体温変動を、各個体動物について測定し、各検査群の平均および平均の標準偏差として表した。
結果
Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスまたはＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザＡ型ウイルスのいずれかを接種した後、フェレットを生存および感染の臨床兆候についてモニタリングした。結果を表１６Ａおよび１６Ｂに表す。フェレットは全て、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスおよびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）への感染後に生存した。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７を接種されたフェレットは、２日目および３日目に、呼吸器の兆候（くしゃみ）を示した。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７を接種されたフェレットの相対不活発指数は、０．６７であったが、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）を接種されたフェレットは、活動レベルの低下を一切示さず、相対不活発指数は０．０であった。
ウイルス接種後の体重および体温の変動を、図２０および２１に示す。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）の接種後に、２〜３％の体重減少が、全ての動物において接種後２日目に観察された。最小〜０の体重減少が、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを接種されたフェレットにおいて観察された。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）を接種されたフェレット１匹は、接種後２日目に１％の体重減少を示した。４０．３〜４０．７℃の高い体温が、接種後２日目にＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７を接種されたフェレットにおいて観察された。体温は、３日目までに正常範囲に戻った。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）を接種されたフェレットの体温は、試験期間全体を通して正常範囲内のままであった。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスが気道または他の臓器において複製して、病原性を誘導するかを決定するために、フェレットの組織を接種後３日目に組織学的に検査して、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７を接種されたフェレットの組織と比較した。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７を接種されたフェレットにおいて、鼻甲介のみに病原性が観察された。呼吸器上皮の萎縮、好中球浸潤および浮腫が、鼻甲介において観察された。ウイルス感染に関連する組織病理学的変動は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを接種されたフェレットにおいて一切観察されなかった。チャレンジ前およびチャレンジ後のウイルス投与溶液の濃度は、それぞれ１０7.5ＴＣＩＤ50／ｍＬおよび１０7.75ＴＣＩＤ50／ｍＬであり、投与全体を通したチャレンジ材料の良好な安定性が示された。

結論
この実施例から、接種後３日目にＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスが、野生型ウイルスの感染に関連する疾患の臨床兆候または組織病理学的変動を誘導しないことが示される。これは、本発明の技術のＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスが、鼻腔インフルエンザワクチンに有用であることを示している。
実施例１１：他のワクチンに対するＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスの免疫応答および防御的影響
概要−この実施例は、フェレットモデルにおいて、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンにより誘発された免疫応答およびそのワクチンの防御的効果を示す。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを、雄フェレット１２匹に１×１０7ＴＣＩＤ50の用量レベルで鼻腔投与した。対照として、雄フェレット１２匹からなる第二の群に、ＦＭ＃６ウイルスを１×１０7ＴＣＩＤ50の用量で鼻腔投与した。第三のフェレット群には、プラセボ対照としてＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）を投与した。プライムのみまたはプライム−ブーストワクチン接種レジメンを、各処置群に用いた。プライム−ブーストワクチン接種レジメンを受けたフェレットに、プライムワクチンを投与し（０日目）、２８日後に（２８日目）ブーストワクチン接種を実施した。プライムワクチンのみを受けたフェレットには、ブーストワクチンをプライム−ブーストフェレットに与えたのと同じ日に、単回のワクチン接種を受けた。各ワクチン接種後に、接種後１４日間はフェレットを致死について観察し、体重、体温および臨床兆候を１日１回測定した。鼻腔洗浄液を、プライムワクチン接種から１日、３日、５日、７日および９日後にフェレットから採取して、ウイルス排出をプローブした。鼻腔洗浄液および血清を、ワクチン接種後全てのフェレットから週に１回採取して、時間を経ての抗体レベルを評価した。
全ての動物に、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）の１×１０7ＴＣＩＤ50を５６日目に鼻腔チャレンジした。チャレンジ後に、フェレットを接種後１４日間、致死について観察し、体重、体温および臨床兆候を１日１回測定した。鼻腔洗浄液を、ウイルス価のためにチャレンジから１日、３日、５日、７日、９日および１４日後に各群から採取した。加えて血清を、分析のためにチャレンジ後（７０日目）に生存するフェレットから採取した。剖検を、チャレンジから３日後に群あたり３匹で実施した。臓器を、組織病理学的検査およびウイルス価のために採取した。
ワクチンに関連する有害事象は、５群において一切観察されなかった。チャレンジ後にプラセボ対照群では、チャレンジ後２日目の体温の上昇、および体重の減少が示された。体重の減少は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）およびＦＭ＃６ワクチン接種群でも観察されたが、その減少は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）群で観察されたものよりも小さかった。活動レベルは、いずれの群でも低下しなかったが、チャレンジ後の全ての群でくしゃみが観察された。組織病理学的分析から、ワクチン接種フェレットの肺の混合細胞浸潤の重症度が、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）群における肺浸潤と比較して高いことが明らかとなった。鼻甲介において、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）またはＦＭ＃６のいずれかのプライムまたはプライム＋ブーストレジメンを受けた動物は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）対照群と比較して、呼吸器上皮の萎縮の重症度が低かった。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスのワクチン接種は、ＦＭ＃６ウイルスと同様の、ウイルスチャレンジへの防御を与えるようであった。
材料および方法
Ａ．ワクチン材料：Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスは、ＰＲ８の内部遺伝子６つ（核蛋白質（ＮＰ）、ポリメラーゼ遺伝子（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、非構造蛋白質（ＮＳ）、マトリックス（Ｍ））を有するが、機能性Ｍ２蛋白質、並びにインフルエンザＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７様Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）のＨＡおよびＮＡ遺伝子を発現しない組換えウイルスである。ＦＭ＃６ウイルスは、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）（２００９−２０１０製剤）のＡ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザＡ型ウイルスのクローン＃６である。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスおよびＦＭ＃６ウイルスを、１×１０7ＴＣＩＤ50（５０％組織培養感染用量）の３１６μＬ用量で動物に鼻腔投与した。
Ｂ．被験物質および陽性対照投与製剤：１×１０9ＴＣＩＤ50／ｍＬの１２０μＬをＰＢＳ ３．６８０ｍＬに希釈することにより、３１６μＬあたり１×１０7ＴＣＩＤ50／ｍＬのＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルス投与溶液を調製した。１×１０9ＴＣＩＤ50／ｍＬ１２０μＬをＰＢＳ ３．６８０ｍＬに希釈することにより、３１６μＬあたり１×１０7ＴＣＩＤ50／ｍＬの力価のＦＭ＃６を調製した。
Ｃ．動物および動物の飼育：雄フェレット３６匹を、Ｔｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍから購入し、フェレット３０匹を試験に登録した。動物は、試験開始時は約４月齢であった。動物は、健康で感染性疾患への抗体を有さないことが、供給業者により保証されていた。到着時の動物は、紙張りの排泄皿を備え、底に隙間の開いている吊り下げ式ワイヤーケージに、個別に収容した。動物室およびケージを、一般に認められている動物飼育手順および関連の標準操作手順書に従って動物の受け入れ前に掃除し、衛生化した。保証書のあるＴｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｆｅｒｒｅｔ Ｄｉｅｔ ＃２０７２（Ｔｅｋｌａｄ Ｄｉｅｔｓ、ウィスコンシン州マディソン所在）およびシカゴ市水道水が、随意に摂取され、少なくとも１日１回新しいものに交換した。動物室の蛍光照明を、１２時間の明暗周期で維持した。動物室の温度および相対湿度は、それぞれプロトコールの限界内であり、試験の間はそれぞれ２２．０〜２５．０℃および３０〜６３％の範囲内であった。
Ｄ．動物の検疫および無作為化：フェレットを７日間検疫した後無作為化して、１日１回観察した。動物の全般的な健康を示す１日１回の観察に基づいて、フェレットを無作為化および検査のために検疫から解放した。検疫後に、フェレットの体重を計量し、類似の群平均値を生じる体重に基づくコンピューター無作為化手順を利用して、処置群に割りつけた[ＴｏｘＤａｔａ（登録商標） ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１．Ｅ．１１（ＰＤＳ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、スイス、バーゼル所在）]。群内では、全動物の体重が、平均の２０％以内であった。試験に選択された動物は、耳標およびトランスポンダーにより永久的識別番号を受け取り、個々のケージカードでも、個体番号および群により試験動物を識別した。割りつけられた識別番号は、その試験のみのものであった。
Ｅ．実験計画：Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンの効能を評価するために、フェレットをＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルス、低温馴化弱毒生ウイルス（ＦＭ＃６）により免疫処置するか、または培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標））により偽免疫処置した。動物の体重、体温および臨床症状をモニタリングし、免疫学的反応を評価した。試験開始時に４月齢の雄フェレット（Ｔｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍｓ、ペンシルバニア州セイヤー所在）３０匹を、試験に用いた。動物手順は全て、ＩＩＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物実験委員会により承認されたプロトコールに従って、動物の生物学的安全性レベル２または生物学的安全性レベル３施設で実施した。接種の前に、フェレットを、体重測定およびベース体温の確定のために３日間モニタリングした。温度の測定値を、各フェレットにおいて皮下に植え付けられたトランスポンダー（ＢｉｏＭｅｄｉｃ ｄａｔａ ｓｙｓｔｅｍｓ、デラウエア州シーフォード所在）で１日１回記録した。試験開始前に、血液を採取して、血清をインフルエンザ抗体について検査した。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）に対してＨＡＩ（赤血球凝集抑制）力価４０を有するフェレットのみを、血清陰性と判断し、本試験に用いた。試験動物を無作為化して、表１７に示す通り２群（６匹／群）に分けた。２つの群（１および３）が、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを受け、２つの群（２および４）が、ＦＭ＃６ウイルスを受けた。１つの群（５）を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）で偽免疫処置した。各ワクチン群内でフェレットを２つのレジメンに分け、６匹にプライムワクチン接種のみ（プライムのみ）を行い、６匹にプライムワクチン接種を行った後、プライムワクチン接種の２８日後にブーストワクチン（プライム／ブースト）を行った。プライム／ブースト群：フェレットに、０および２８日目にＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを１×１０7ＴＣＩＤ50 ３１６μＬの単一用量で鼻腔接種した。対照群には、０および２８日目に、ＦＭ＃６を１×１０7ＴＣＩＤ50 ３１６μＬ（Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）と同じ用量）で鼻腔接種するか、または０および２８日目にＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）３１６μＬで偽免疫処置した。フェレットは、体温、体重、および臨床症状を、接種後１４日間１日１回モニタリングした。細胞中のウイルス価測定用にはプライムワクチン接種後１日、３日、５日、７日、９日および１４日目に採取し、抗体価用として、２１日および４９日目に、鼻腔洗浄液をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）対照群を含む全てのフェレットから採取した。鼻腔洗浄液試料は、−６５℃に保持した。接種前（前３〜５日目）および７日、２１日、３５日、４２日、および４９日目に血液を採取して、ＥＬＩＳＡおよびＨＩアッセイによる抗体価の測定まで、−６５℃に保持した。
プライムのみ群：フェレットに、２８日目にＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを１×１０7ＴＣＩＤ50 ３１６μＬの単一用量で鼻腔接種した。対照群には、２８日目にＦＭ＃６を１×１０7ＴＣＩＤ50 ３１６μＬの単一用量（Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）と同じ用量）で鼻腔接種するか、またはＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）３１６μＬで偽接種した。フェレットの体温、体重、および臨床症状を、接種後１４日間１日１回モニタリングした。細胞中のウイルス価測定用には２９日、３１日、３３日、３５日、３７日、および４２日目に採取し、抗体価用として４９日目に、鼻腔洗浄液を全てのフェレットから採取した。鼻腔洗浄液試料は、−６５℃に保持した。血液を接種前（２３〜２５日目）および３５日、４２日および４９日目に採取して、血清をＥＬＩＳＡおよびＨＩアッセイによる抗体価の測定まで、−６５℃に保持した。フェレットは全て、５６日目、つまりプライム／ブーストワクチン投与後４週間目に、野生型Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザウイルスを１×１０7ＴＣＩＤ50／ｍＬ ３１６μＬの用量でチャレンジした。フェレットの体重、体温および臨床症状を、チャレンジ後１４日間モニタリングし、鼻腔洗浄液および臓器を採取した。チャレンジ後１日、３日、５日、７日、９日および１４日目（５７、５９、６１、６３、６５および７０日目）に、鼻腔洗浄液をチャレンジされたフェレットから採取して、ウイルス価測定のために試料を細胞中の−６５℃に保持した。チャレンジ後３日目（５９日目）に、動物（３匹／群、合計１５匹）を安楽死させて、以下の組織試料を採取した：鼻甲介、気管、および肺。採取された試料の一部は、組織学的評価のために緩衝された中性ホルマリンで固定し、試料の他の部分は、ウイルス価測定のために−６５℃に貯蔵した。血液をチャレンジから１４日後（７０日目）に採取して、全ての生存動物を安楽死させた。
Ｆ．ウイルス接種：フェレットに、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスまたはＦＭ＃６インフルエンザＡ型ウイルスのいずれかを接種した。凍結貯蔵物のバイアルを解凍して、リン酸緩衝生理食塩溶液で適切な濃度に希釈した。フェレットにケタミン／キシラジンで麻酔をし、ウイルス用量を、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスでは３１６μＬ、およびＦＭ＃６では３１６μＬの容積で鼻腔投与した。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）およびＦＭ＃６ウイルスの接種力価を確認するために、投与溶液のアリコットを、投与の前（投与前）および投与の後（投与後）に採取した。アリコットは、ウイルス価測定のために−６５℃に貯蔵した。
Ｇ．チャレンジウイルス：インフルエンザＡ型ウイルスのＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７株セロタイプＨ３Ｎ２を、フェレットをチャレンジするために用いた。使用前に、ウイルスを約−６５℃に貯蔵した。用いられたチャレンジウイルスのレベルは、３１６μＬの容積に１×１０7ＴＣＩＤ50で調製した。定量的ウイルス感染アッセイであるＴＣＩＤ50アッセイを、調製されたウイルスチャレンジ溶液の一部によりＩＩＴＲＩで実施した。ウイルス価アッセイを、ＩＩＴＲＩの標準操作手順に従って実施した。
Ｈ．瀕死／致死の観察：チャレンジ後に、致死または瀕死のエビデンスの有無を全ての動物について１日２回観察した。動物は、ワクチン接種後１４日間およびチャレンジ後１４日間観察した。
Ｉ．体重および体重変動：動物の体重を、受け入れの２日以内および無作為化時に記録した。試験動物は全て、接種前と各ワクチン接種後１４日間に１日１回体重を計量し、チャレンジ後１４日間に１日１回評価した。接種前は、ベース体温を確認するために、フェレットを３〜５日間モニタリングした。温度の測定値を、各フェレットにおいて皮下に植え付けられたトランスポンダー（ＢｉｏＭｅｄｉｃ ｄａｔａ ｓｙｓｔｅｍｓ、デラウエア州シーフォード所在）により、各ワクチン接種後１４日間１日１回、およびチャレンジ後１４日間１日１回記録した。体温（摂氏）の変動を、各フェレットについて各時点で計算した。
Ｊ．臨床観察：体温（摂氏）の変動を、各フェレットについて１日１回測定した。食欲不振の臨床兆候、呼吸困難、くしゃみ、咳および鼻漏などの呼吸器の兆候、並びに活動レベルを、１日１回評価した。Ｒｅｕｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，”Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｓｉｇｎｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｌｌｎｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｒｅｔ ｍｏｄｅｌ，” Ｊ． Ｖｉｒｏｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２７−３４（１９８９）の記載に基づく評定システムを利用して、０、機敏でよく遊ぶ；１、機敏であるが刺激した時だけよく遊ぶ；２、機敏であるが刺激した時にあまり遊ばない；３、機敏でなく刺激してもあまり遊ばない、の通り活動レベルを評価した。相対不活発指数（ＲＩＩ）を、試験期間中の観察（１日）１回あたりのフェレット群ごとの平均スコアとして計算した。
Ｋ．生存確認：２回の生存確認を、試験を通して試験動物全てに毎日実施した。２回の生存確認は臨床観察と同時に実施した。２回目の確認は、同じ日の遅い時間に実施した。
Ｌ．鼻腔洗浄液：フェレットに、ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）との混合物で麻酔にかけ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、およびゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む滅菌ＰＢＳ０．５ｍｌを各鼻孔に注射し、フェレットが排出したら標本カップに採取した。鼻腔洗浄液を、クライオバイアルに採取して、回収された容積を記録した。
Ｍ．安楽死：試験動物を、ペントバルビタールナトリウム１５０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量により安楽死させた。観察可能な鼓動および呼吸がないことにより、死亡を確認した。
Ｎ．剖検：剖検は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＰＡＩ）により実施された。ＰＡＩチームには、病理学管理責任者および２名の検死解剖者が属していた。鼻甲介、気管および肺を採取した。各組織の一部をホルマリンに固定し、他の部分は凍結および貯蔵のためにＩＩＴＲＩの職員に渡した。力価用に採取された組織は、右鼻甲介、気管の上部１／３および右肺後葉である。
Ｏ．組織病理学的分析：各剖検の後、組織をＰＡＩシカゴ施設に運搬した。受け取り時に、１５匹全てのフェレットの部分的組織をパラフィンブロックに加工し、約５ミクロン厚に切り出し、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。全てのパラフィンＨ＆Ｅスライドを、顕微鏡で評価した。
Ｐ．血清採取：ワクチン接種前（３、４および５群では投与前３〜５日目、１および２群では投与後２３〜２５日目）の血清を、フェレットから採取した。接種後に、３、４、および５群から７日、１４日、２１日、３５日、４２日、４９日および７０日目に血清を採取した。１および２群では３５日、４２日、４９日、および７０日目に血清を採取した。フェレットに、ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）との混合物で麻酔した。血液試料（約０．５〜１．０ｍＬ）を、各フェレットの大静脈から採取して、血清に処理した。血液をＳｅｒｕｍ Ｇｅｌ Ｚ／１．１管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州ニュートン所在）に採取し、血清を採取する前に室温で１時間以下の間貯蔵した。Ｓｅｒｕｍ Ｇｅｌ Ｚ／１．１管を１０，０００×ｇで３分間遠心分離して、血清を採取した。
Ｑ．赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイ：血清試料を受容体破壊酵素（ＲＤＥ）（デンカ生研、日本、東京都所在）で処理して、非特異的赤血球凝集の抑制物質を排除した。ＲＤＥは、製造業者の使用説明書に従って再生した。血清をＲＤＥで１：３に希釈し、３７℃±２℃の水浴中で１８〜２０時間インキュベートした。等容積の２．５％（ｖ／ｖ）クエン酸ナトリウムを添加した後、試料を５６±２℃の水浴中で３０±５分間インキュベートした。０．８５％ＮａＣｌを、ＲＤＥ処理の後、各試料に１：１０の最終血清希釈になるまで添加した。その後、希釈された試料を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）での２倍希釈を２本ずつ４回行い（１：１０〜１：８０）、その後、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザＡ型ウイルスの４赤血球凝集単位と共にインキュベートした。インキュベーション後、０．５％トリ赤血球細胞を各試料に添加して、３０±５分間インキュベートした。その後、赤血球凝集の有無を評定した。
Ｒ．ウイルス価：チャレンジウイルス接種前および接種後の試料中の感染性ウイルス濃度を、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞でのＴＣＩＤ50アッセイにより決定した。簡潔に記載すると、−６５℃で保存された試料を解凍し、遠心分離して細胞断片を除去した。得られた上清を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で三重測定として、ペニシリン／ストレプトマイシン、０．１％ゲンタマイシン、３％ＮａＣＯ3、０．３％ＢＳＡ第Ｖ画分（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス所在）、１％ＭＥＭビタミン溶液（Ｓｉｇｍａ）および１％Ｌ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、米国バージニア州マナサス所在）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ、米国カリフォルニア州カールスバッド所在）に１０倍希釈した。１０倍系列希釈物を作製した後、１００μＬを、単層のＭＤＣＫ細胞を含む９６ウェルプレートの各ウェルに移し替えた。プレートを、５±２％ＣＯ2、湿度７０％中、３７℃±２℃でインキュベートした。４８時間後に、ウェルを、細胞変性作用（ＣＰＥ）について観察した。各ウェルからの上清（５０μｌ）を９６ウェルプレートに移し替えて、赤血球凝集（ＨＡ）活性を測定および記録した。上清のＨＡ活性を、０．５％七面鳥濃厚赤血球細胞（ｔＲＢＣ）を用いたＨＡアッセイにより評価した。ＴＣＩＤ50力価を、Ｒｅｅｄ ＬＪ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ Ｈ，”Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ５０％ ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ，” Ａｍ． Ｊ． Ｈｙｇｉｅｎｅ ２７：４９３−４９７（１９３８）の方法を用いて計算した。
Ｓ．データ解析：体重および体重増加（減少）および体温変動を、各個体動物について測定し、各検査群の平均および平均の標準偏差として表した。
結果
Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスまたはＦＭ＃６ウイルスのいずれかを鼻腔接種した後、フェレットを感染の臨床兆候について１日１回モニタリングした。鼻腔洗浄液を、プライムワクチン接種の後に採取して、ウイルス排出をモニタリングし、血清を採取して血清抗体価を測定した。結果を表１８Ａ、表１８Ｂ、および表１８Ｃに表す。


全てのフェレットが、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスおよびＦＭ＃６ウイルスのワクチン接種後に生存した。プライムワクチン接種後に、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを接種されたフェレット２匹が、８日目に呼吸器の兆候（くしゃみ）を示した。ブーストワクチン接種後に、ＦＭ＃６ウイルスを接種されたフェレットが、ワクチン接種から７日後に呼吸器の兆候（くしゃみ）を示した。くしゃみは、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）のフェレットでも、ブースト後４日目に観察された。プライムワクチン接種後、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスおよびＦＭ＃６ウイルスを接種されたフェレットの相対不活発指数は、それぞれ０．０７および０．２７であった。この活動低下は、プライムワクチン接種後にウイルスごとに１群のみで観察された。ブーストワクチン接種後は、活動レベルの低下は一切観察されなかった。ウイルス接種後の体重および体温の変動を、図２２および２３に示す。体重減少は、ワクチン接種後に一切観察されなかったが、ワクチン接種は体重増加への影響を有するようであった。ワクチン接種後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）対照フェレットの体重は、１４日の観察の間に２０％増加したが、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）またはＦＭ＃６ワクチン接種されたフェレットの体重増加は、プライム後では６〜１５％およびブースト後では４〜６％の範囲内であった。体温上昇は、ワクチン接種後いずれの群にも一切観察されなかった。チャレンジ後の体重および体温の変動を、図２４および２５に示し、臨床兆候を、表１９にまとめる。
Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）でのチャレンジ後に、２〜４％の体重減少が、全ての動物においてチャレンジ後２日目に観察された。１４日の観察期間を通して、動物の体重は初期体重未満のままであった。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）フェレットは、体重減少が最も大きかった（８％）。ワクチン接種されたフェレットの体重減少は、ワクチンのレジメンに依存した。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）またはＦＭ＃６のプライムのみのレジメンを受けたフェレットは、それぞれ最大５％および４％減量した。ブースターを受けたフェレットは、ＦＭ＃６群で最大３％、およびＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）群で最大２％減量した。チャレンジ後の体温上昇が、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）フェレットでは２日目、およびＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）またはＦＭ＃６のプライムのみのレジメンを受けたフェレットでは１日目に観察された（図２５）。ブースターを受けたフェレットの体温は、正常範囲内のままであった。
ワクチン接種が気道のチャレンジウイルスの複製を防御し、臓器の病理組織を減少させるかを決定するために、チャレンジされたフェレットの病理組織を、接種後３日目に組織学的に検査した。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）プライムのみまたはプライム／ブーストレジメンを受けた動物の肺の変動は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）群と比較して、肺内の混合細胞浸潤の重症度上昇に関連した。肺浸潤発生数のわずかな差が、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）プライム群とＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）プライム／ブースト群との間に観察された。肺内の混合細胞浸潤の重症度上昇も、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）群と比較したＦＭ＃６プライムのみ群とＦＭ＃６プライム／ブースト群との間に観察された。ＦＭ＃６プライムのみ群よりもＦＭ＃６プライム／ブースト群で肺混合細胞浸潤におけるわずかな重症度上昇が観察された。鼻甲介では、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスのプライムまたはプライム／ブーストを受けた動物が、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）群と比較して、呼吸器上皮の萎縮の重症度が低かった。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）のプライム群とプライム／ブースト群とを比較すると、鼻甲介の萎縮に差は存在しなかった。ＦＭ＃６のプライム／ブーストレジメンを受けた動物において呼吸器上皮萎縮のわずかな重症度上昇が、ＦＭ＃６のプライムのみのレジメンを受けた動物と比較して観察され、ＦＭ＃６動物における呼吸器上皮萎縮の重症度は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）群で観察されたものよりも低かった。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）プライムおよびプライム／ブースト群における鼻腔（管腔）への好中球浸潤の発生数が、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）群と比較して少なかった。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）プライムのみ群における好中球の管腔浸潤は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）群と異なると解釈された。ＦＭ＃６プライムのみ群およびＦＭ＃６プライム／ブースト群における管腔の好中球浸潤の重症度が、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）群と比較してわずかに上昇していた。チャレンジ前およびチャレンジ後のウイルス投与溶液の濃度は、それぞれ１０7．８３ＴＣＩＤ50／ｍＬおよび１０7．２５ＴＣＩＤ50／ｍＬであり、投与全体を通したチャレンジ材料の良好な安定性が示された。
図４５は、フェレットの気道におけるＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）およびＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）ウイルス複製を示す。
図４６は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）ウイルスでの鼻腔チャレンジ後の鼻腔洗浄液中のＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）およびＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）ウイルスを示す。
図４７は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）およびＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）のプライムのみ群でのワクチン接種後のフェレットのＩｇＧ価を示す。
図４８は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）およびＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）のプライム−ブースト群でのワクチン接種後のフェレットのＩｇＧ価を示す。
図４９は、チャレンジ後にＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）またはＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）でワクチン接種されたフェレット血清中のＥＬＩＳＡ ＩｇＧ価の概要を示す。
結論
この実施例は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスの鼻腔投与が、任意のワクチン関連有害事象（体温上昇、体重減少または臨床兆候）に関連しなかったことを示す。これらの結果から、本発明の技術のＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスが、鼻腔インフルエンザワクチンにおける使用に有用であることが示される。
実施例１２：Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスはフェレットモデルにおいて伝播されない
概要−この実施例は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスがフェレットモデルにおいて伝播されないことを示す。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを１×１０7ＴＣＩＤ50の用量レベルで、雌フェレット３匹に鼻腔投与した。対照として、雌フェレット３匹の第二の群に、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）ウイルスを１×１０7ＴＣＩＤ50の用量で鼻腔投与した。接種から２４時間後に、各ドナーフェレットを２匹のナイーブフェレット（直接接触およびエアロゾル接触）と共に伝播チャンバーに誘導した。接種後に、フェレットを死亡率について接種後１４日間観察し、体重、体温および臨床兆候は、１日１回測定した。鼻腔洗浄液を、接種されたドナーフェレット全てから１日、３日、５日、７日、９日目に採取し、接触（直接およびエアロゾル）フェレット全てから２日、４日、６日、８日、１０日目に採取して、ウイルス排出をプローブした。鼻腔洗浄液および血清を、全てのフェレットから試験の接種時（１４日目）に採取して、抗体レベルを評価した。感染の臨床兆候は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）群においては一切観察されなかったが、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）群は、体重減少、体温上昇を有し、くしゃみがあった。Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０の接種後、ドナーフェレットは、チャレンジから２日後の体温上昇、および体重減少を示した。活動レベルは、いずれの群でも低下しなかった。ドナーフェレットと直接接触したフェレットは、接種後４日目まで、体重の漸増を示した。類似の傾向がエアロゾル接触フェレットにおいて観察され、それは接種後６日目に開始した。接触フェレットにおける体重減少は、体温上昇と相関した。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスの接種は、接種動物において感染の臨床兆候を誘発しなかった。接触フェレットへの伝播は、可能性が低い。
材料および方法
Ａ．ワクチン材料：Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスは、ＰＲ８の内部遺伝子６つ（核蛋白質（ＮＰ）、ポリメラーゼ遺伝子（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、非構造蛋白質（ＮＳ）、マトリックス（Ｍ））を有するが、機能性Ｍ２蛋白質、並びにインフルエンザＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７様Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）のＨＡおよびＮＡ遺伝子を発現しない組換えウイルスである。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを、１×１０７ＴＣＩＤ50（５０％組織培養感染用量）の３１６μＬ用量で動物に鼻腔投与した。
Ｂ．被験物質投与製剤：１×１０9ＴＣＩＤ50／ｍＬの４５μＬをＰＢＳ １．３７７ｍＬに希釈することにより、３１６μＬあたり１×１０7ＴＣＩＤ50／ｍＬのＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルス投与溶液を調製した。
Ｃ．動物および動物の飼育：雌フェレット２２匹を、Ｔｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍから購入し、フェレット１８匹を試験に登録した。動物は、試験開始時は約４月齢であった。動物は、健康で感染性疾患への抗体を有さないことが、供給業者により保証されていた。到着時の動物は、紙張りの排泄皿を備え、底に隙間の開いている吊り下げ式ワイヤーケージに、個別に収容した。動物室およびケージを、一般に認められている動物飼育手順および関連の標準操作手順書に従って動物の受け入れ前に掃除し、衛生化した。保証書のあるＴｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｆｅｒｒｅｔ Ｄｉｅｔ ＃２０７２（Ｔｅｋｌａｄ Ｄｉｅｔｓ、ウィスコンシン州マディソン所在）およびシカゴ市水道水が、随意に摂取され、少なくとも１日１回新しいものに交換した。動物室の蛍光照明を、１２時間の明暗周期で維持した。動物室の温度および相対湿度は、それぞれプロトコールの限界内であり、試験の間はそれぞれ２３．０〜２５．０℃および３６〜５０％の範囲内であった。
Ｄ．動物の検疫および無作為化：フェレットを７日間検疫した後無作為化して、１日１回観察した。動物の全般的な健康を示す１日１回の観察に基づいて、フェレットを無作為化および検査のために検疫から解放した。検疫後に、フェレットの体重を計量し、類似の群平均値を生じる体重に基づくコンピューター無作為化手順を利用して、処置群に割りつけた[ＴｏｘＤａｔａ（登録商標） ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１．Ｅ．１１（ＰＤＳ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、スイス、バーゼル所在）]。群内では、全動物の体重が、平均の２０％以内であった。試験に選択された動物は、耳標およびトランスポンダーにより永久的識別番号を受け取り、個々のケージカードでも、個体番号および群により試験動物を識別した。割りつけられた識別番号は、その試験のみのものであった。
Ｅ．実験計画：Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスの伝播性を評価するために、フェレットにＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスまたはＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）ウイルスを接種した。動物の体重、体温、臨床症状およびウイルス排出をモニタリングし、免疫応答を評価した。試験開始時に４月齢の雌フェレット（Ｔｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍｓ、ペンシルバニア州セイヤー所在）１８匹を、試験に用いた。動物手順は全て、動物の生物学的安全性レベル２または生レベル３施設で実施した。接種の前に、フェレットを、体重測定およびベース体温の確定のために３日間モニタリングした。温度の測定値を、各フェレットにおいて皮下に植え付けられたトランスポンダー（ＢｉｏＭｅｄｉｃ ｄａｔａ ｓｙｓｔｅｍｓ、デラウエア州シーフォード所在）で１日１回記録した。試験開始前に、血液を採取して、血清をインフルエンザ抗体について検査した。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）ウイルスに対してＨＩ力価４０を有するフェレットのみを、血清陰性と判断し、本試験に用いた。試験動物を無作為化して、表２０に示す通り２群（９匹／群、３／伝播チャンバー）に分けた。群１（チャンバーＡ〜Ｃ）のフェレットは、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを受けるように割りつけた。群２（チャンバーＡ〜Ｃ）のフェレットは、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）ウイルスを受けるように割りつけた。各群内で、フェレットを接種ドナーまたはナイーブドナーに分けた。
各群は、別々の部屋に収容され、動物との個別作業後に厳密な作業に流れるパターンで、２群間の交差汚染を予防した。各群において、ドナーフェレット１匹は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）の１×１０7ＴＣＩＤ50（群１）またはＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）の１×１０7ＴＣＩＤ50（群２）を３１６μｌの単一用量で鼻腔接種した。接種から２４時間後に、各ドナーをナイーブフェレット１匹と同じケージに入れ（直接接触）、１つのワイヤーケージに２匹ずつ飼育した。更なるフェレット（エアロゾル接触）を、ドナーケージと１０〜１２ｃｍの距離で離れた伝播チャンバー内の別の隣接するワイヤーケージ内に入れた（個別飼育）。フェレットの体温、体重、および臨床症状を、接種後１４日間に１日１回モニタリングした。細胞中のウイルス価測定のために、鼻腔洗浄液を、接種されたドナーフェレット全てから１日、３日、５日、７日、９日目に採取し、接触（直接およびエアロゾル）フェレット全てから２日、４日、６日、８日、１０日目に採取した。鼻腔洗浄液試料を、抗体価測定のために１４日目に全てのフェレットから採取した。鼻腔洗浄液試料を、−６５℃に保持した。
Ｆ．伝播チャンバー：各伝播チャンバーは、２立方メートルであった。ＨＥＰＡフィルター処理のため、並びにｍ伝播チャンバー内の環境条件をモニタリングおよび制御するために、コンピューター制御の空調装置を用いた。方向性のある気流を提供するために、ＨＥＰＡフィルターを通した空気を、チャンバーの一方の端部に配置された入口から供給し、チャンバーの反対の端部にある出口から排出し、ＨＥＰＡフィルターを通して、室内に排気させた。空気交換速度は、各チャンバーで１時間あたり２０完全空気交換であり、気流は、＜０．１ｍ／秒に維持した。チャンバーは、−０．１５水柱インチの陰圧に保持した。フェレットは、紙張りの排泄皿を備え、底に隙間の開いているワイヤーケージに収容した。フェレットを、３２×２４×１４のケージに２匹ずつ収容するか、または各ＨＥＰＡフィルターを通す伝播チャンバーの内部に入れられた２４×２４×１４のワイヤーケージに個別に収容した。
Ｇ．ウイルス接種：フェレットに、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを接種した。凍結保存物のバイアルを解凍して、リン酸緩衝生理食塩溶液で適切な濃度に希釈した。フェレットにケタミン／キシラジンで麻酔をし、ウイルス用量を、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ） ３１６μＬの容積で鼻腔投与した。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスの接種力価を確認するために、投与溶液のアリコットを、投与の前（投与前）および投与の後（投与後）に採取した。アリコットは、ウイルス価測定のために−６５℃に貯蔵した。
Ｈ．チャレンジウイルス：インフルエンザＡ型ウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７株セロタイプＨ３Ｎ２を、対照フェレットに接種するために用いた。使用前に、ウイルスを約−６５℃に貯蔵した。用いられたチャレンジウイルスの用量レベルは、３１６μＬの容積に１×１０７ＴＣＩＤ50で調製した。定量的ウイルス感染アッセイであるＴＣＩＤ50アッセイを、調製されたウイルスチャレンジ溶液の一部によりＩＩＴＲＩで実施した。ウイルス価アッセイを、ＩＩＴＲＩの標準操作手順に従って実施した。
Ｉ．瀕死／致死の観察：チャレンジ後に、致死または瀕死のエビデンスの有無を全ての動物について１日２回観察した。動物は、ワクチン接種後１４日間およびチャレンジ後１４日間観察した。
Ｊ．体重および体重変動：動物の体重を、受け入れの２日以内および無作為化時に記録した。試験動物は全て、接種前と各ワクチン接種後１４日間に１日１回体重を計量し、チャレンジ後１４日間に１日１回評価した。接種前は、ベース体温を確認するために、フェレットを３〜５日間モニタリングした。各フェレットにおいて皮下に植え付けられたトランスポンダー（ＢｉｏＭｅｄｉｃ ｄａｔａ ｓｙｓｔｅｍｓ、デラウエア州シーフォード所在）により、温度の測定値を、各ワクチン接種後１４日間１日１回、およびチャレンジ後１４日間１日１回記録した。体温（摂氏）の変動を、各動物について各時点で計算した。
Ｋ．臨床観察：体温（摂氏）の変動を、各フェレットについて１日１回測定した。食欲不振の臨床兆候、呼吸困難、くしゃみ、咳および鼻漏などの呼吸器の兆候、並びに活動レベルを、１日１回評価した。Ｒｅｕｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，”Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｓｉｇｎｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｌｌｎｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｒｅｔ ｍｏｄｅｌ，” Ｊ． Ｖｉｒｏｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２７−３４（１９８９）の記載に基づく評定システムを利用して、０、機敏でよく遊ぶ；１、機敏であるが刺激した時だけよく遊ぶ；２、機敏であるが刺激した時にあまり遊ばない；３、機敏でなく刺激してもあまり遊ばない、の通り活動レベルを評価した。相対不活発指数（ＲＩＩ）を、試験期間中の観察（１日）１回あたりのフェレット群ごとの平均スコアとして計算した。
Ｌ．生存確認：２回の生存確認を、試験を通して試験動物全てに１日１回実施した。２回の生存確認は臨床観察と同時に実施した。２回目の確認は、同じ日の遅い時間に実施した。
Ｍ．鼻腔洗浄液：フェレットに、ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）との混合物で麻酔にかけ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、およびゲンタマイシン（５０を含む滅菌ＰＢＳ０．５ｍｌを各鼻孔に注射し、フェレットが排出したら標本カップに採取した。
Ｎ．安楽死：試験動物を、ペントバルビタールナトリウム１５０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量により安楽死させた。観察可能な鼓動および呼吸がないことにより、死亡を確認した。剖検は、全ての試験動物で実施した。
Ｏ．血清採取：ワクチン接種前の血清（３〜５日目）および接種後の血清（１４日目）を、フェレット全てから採取した。フェレットに、ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）との混合物で麻酔した。血液試料（約０．５〜１．０ｍＬ）を、各フェレットの大静脈から採取して、血清に処理した。血液をＳｅｒｕｍ Ｇｅｌ Ｚ／１．１管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州ニュートン所在）に採取し、血清を採取する前に室温で１時間以下の間貯蔵した。Ｓｅｒｕｍ Ｇｅｌ Ｚ／１．１管を１０，０００×ｇで３分間遠心分離して、血清を採取した。個々の接種後血清試料を採取して、２つのアリコットを各試料から作製した。一方のアリコットは、フェレットがインフルエンザＡウイルスの抗体を有さないことを確認するために試験開始前に検査し、血清のもう一方のアリコットは、−６５℃に貯蔵した。
Ｐ．赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイ：血清試料を受容体破壊酵素（ＲＤＥ）（デンカ生研、日本、東京都所在）で処理して、非特異的赤血球凝集の抑制物質を排除した。ＲＤＥは、製造業者の使用説明書に従って再生した。血清をＲＤＥで１：３に希釈し、３７℃±２℃の水浴中で１８〜２０時間インキュベートした。等容積の２．５％（ｖ／ｖ）クエン酸ナトリウムを添加した後、試料を５６±２℃の水浴中で３０±５分間インキュベートした。０．８５％ＮａＣｌを、ＲＤＥ処理の後、各試料に１：１０の最終血清希釈になるまで添加した。その後、希釈された試料を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）での２倍希釈を２本ずつ４回行い（１：１０〜１：８０）、その後、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザＡ型ウイルスの４赤血球凝集単位と共にインキュベートした。インキュベーション後、０．５％トリ赤血球細胞を各試料に添加して、３０±５分間インキュベートした。その後、赤血球凝集の有無を評定した。
Ｑ．ウイルス価：チャレンジウイルス接種前および接種後の試料中の感染性ウイルス濃度を、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞でのＴＣＩＤ50アッセイにより決定した。簡潔に記載すると、−６５℃で保存された試料を解凍し、遠心分離して細胞断片を除去した。得られた上清を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で三重測定として、ペニシリン／ストレプトマイシン、０．１％ゲンタマイシン、３％ＮａＣＯ3、０．３％ＢＳＡ第Ｖ画分（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス所在）、１％ＭＥＭビタミン溶液（Ｓｉｇｍａ）および１％Ｌ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、米国バージニア州マナサス所在）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ、米国カリフォルニア州カールスバッド所在）に１０倍希釈した。１０倍系列希釈を作製した後、１００ｆｌＬを、単層のＭＤＣＫ細胞を含む９６ウェルプレートの各ウェルに移し替えた。プレートを５±２％ＣＯ2、湿度７０％中、３７℃±２℃でインキュベートした。４８時間後に、ウェルを、細胞変性作用（ＣＰＥ）について観察した。各ウェルからの上清（５０μｌ）を９６ウェルプレートに移し替えて、赤血球凝集（ＨＡ）活性を測定および記録した。上清のＨＡ活性を、０．５％七面鳥濃厚赤血球細胞（ｔＲＢＣ）を用いたＨＡアッセイにより評価した。ＴＣＩＤ50力価を、Ｒｅｅｄ ＬＪ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ Ｈ，”Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ５０％ ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ，” Ａｍ． Ｊ． Ｈｙｇｉｅｎｅ ２７：４９３−４９７（１９３８）の方法を用いて計算した。
Ｒ．データ解析：体重および体重増加（減少）および体温変動を、各個体動物について測定し、各検査群の平均および平均の標準偏差として表した。
結果
Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスまたはＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザＡ型のいずれかでドナーフェレットを接種した後、ドナーフェレットを、ナイーブ接触フェレットを含む伝播チャンバーに誘導した。フェレットを、感染の臨床兆候について１日１回モニタリングし、鼻腔洗浄液を採取してウイルス排出をモニタリングし、血清を採取して血清抗体価を測定した。フェレットの全てが、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスおよびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７の接種後に生存した（表２１）。疾患の臨床兆候は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）群のフェレットにおいて一切観察されなかった。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）ウイルスを接種されたドナーフェレット３匹のうち２匹が、６日および８日目に呼吸器の兆候（くしゃみ）を示した。エアロゾル接触フェレットでは、くしゃみは一切観察されなかった。活動レベルの低下は、観察されなかった。
ウイルス接種後の体重および体温の変動を、図２６および図２７に示す。有意な体重減少は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを接種した後に一切観察されなかった。エアロゾル接触では、１日の体重減少が平均で１％であったが、これはウイルスへの暴露による可能性は低い。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルス中でのフェレットの体重の増加は、１４日間の観察期間にドナーフェレットでは９％、接触フェレットでは１０〜１１％であった（図２６Ａ）。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７での体重増加は、ドナーフェレットではわずか３％、接触フェレットでは６〜８％であり、ウイルス感染が示された（図２６Ｂ）。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）群において、体温は、感染後３日目以外は正常レベルのままであった（図２７Ａ）。体温は、エアロゾル接触フェレットでは正常値よりも低かった。これは、温度トランスポンダーの故障または欠陥によるものであり、温度は試験の残り期間を通して正常範囲内で記録された。高い体温が、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７ドナーフェレットでは２日目に、エアロゾル接触では７日目に観察された（図２７Ｂ）。チャレンジ前およびチャレンジ後のウイルス投与溶液の濃度は、それぞれ１０7.50ＴＣＩＤ50／ｍＬおよび１０7.25ＴＣＩＤ50／ｍＬであり、投与全体を通したチャレンジ材料の良好な安定性が示された。
図５０は、ウイルス伝播試験においてフェレットから得た鼻腔洗浄液中のウイルス価を示す。このデータから、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスが伝播しないが（ウイルスが検出されない）、対照Ｂｒｉｓｂ／１０ウイルスが伝播することが示される。
結論
この実施例から、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７ウイルスを接種されたフェレットが、感染の臨床兆候（くしゃみ、体重減少および一過性の体温上昇）を呈したが、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを接種されたフェレットが、疾患の臨床兆候を一切呈しなかったことが示される。それゆえ、ドナーフェレットへのＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）の接種は、接触またはエアロゾルを介した感染またはウイルス伝播を誘発するとは思われなかった。これらの知見から、本発明の技術のＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスが、鼻腔インフルエンザワクチンに有用であることが示される。
実施例１３．Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスはマウスにおいて液性および粘膜の両方の免疫応答を誘発する
この実施例は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスがマウスにおいて液性および粘膜の両方の免疫応答を誘発することを示す。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）の免疫原性をマウスにおいて評価し、ワクチン接種の他の様式により生じた免疫応答と比較した。免疫原性試験を、表２２に概要された通り、１．Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルス、２．ＰＲ８ウイルス（１０ｐｆｕ）生ワクチン見本（ｌｉｖｅ ｗａｃｃｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ）、３．不活化ＰＲ８ウイルス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 マサチューセッツ州ウィルミントン所在）、１μｇ、鼻腔（ＩＮ）、４．不活化ＰＲ８ウイルス、１μｇ、筋肉内（ＩＭ）またはＰＢＳのみ、の群で実施した。
Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスの免疫原性を検査するために、マウスにＭ２ＫＯ（ΔＴＭ） １．２×１０4ｐｆｕ、野生型ＰＲ８ １０ｐｆｕ、不活化全粒子ＰＲ８（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン所在）、または対照としてのＰＲ８を鼻腔接種し、１群には不活化ＰＲ８全粒子ＰＲ８ １μｇを筋肉内投与した。免疫処置から３週間後に、血清および気管−肺洗浄液をマウスから採取し、抗ＰＲ８免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）およびＩｇＡレベルを酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。ＥＬＩＳＡプレートを不活化ＰＲ８全粒子でコーティングし、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により遮断して、試料を適用した。マウスＩｇＧおよびＩｇＡ抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧおよびＩｇＡヤギ抗体（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ゲイザースバーグ所在）およびＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．）基質により検出した。
予測通り、免疫処置群のマウスは、ＰＢＳのみ群と比較して、血清および気管−肺洗浄液中の抗ＰＲ８抗体の有意な増加を示した（図２８）。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスの場合の血清中の抗ＰＲ８ ＩｇＧレベルは、不活化ＰＲ８群よりも高く、生ＰＲ８ウイルスと類似している。より重要なこととして、抗ＰＲ８ ＩｇＡ抗体は、血清および気管−肺洗浄液の両方において、ＰＲ８およびＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）免疫処置マウスのみに存在した。これらのデータから、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスがマウスにおいて有意な液性および粘膜免疫応答を誘発することが示唆される。
実施例１４：Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスはマウスを致死的ホモサブタイプおよびヘテロサブタイプチャレンジから防御する
これらの実施例は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスがマウスを致死的ホモサブタイプおよびヘテロサブタイプチャレンジから防御することを示す。免疫処置から６週後に、免疫処置マウスを野生型ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１；ホモサブタイプチャレンジ）またはマウス馴化インフルエンザＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ａｉｃｈｉ；Ｈ３Ｎ２；ヘテロサブタイプチャレンジ）の致死用量でチャレンジすることにより、防御的効能のあるＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスを評価した。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）またはＰＲ８ １０ｐｆｕで免疫処置し、続いて野生型ＰＲ８によりチャレンジされたマウスはいずれも、体重減少などの任意の臨床症状を示さなかった（図２９Ａ）。これに対し、ナイーブＰＢＳマウスは、死亡するか、または５日目までに２０％を超える体重減少により安楽死された。チャレンジマウスの気道におけるウイルス複製を、ＭＤＣＫ細胞におけるＴＣＩＤ50アッセイによりチャレンジ後３日目に測定した。図３０Ａに示される通り、ウイルスは、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）またはＰＲ８免疫処置マウスの肺において一切検出されず（検出限界１０2.75ＴＣＩＤ50／臓器）、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）がＰＲ８感染と類似の無菌免疫を提供することが示される。これに対し、チャレンジウイルスは、不活化ＰＲ８およびＰＢＳ群からは回収されなかった。
ヘテロサブタイプチャレンジでは、マウスを、Ａｉｃｈｉ（Ｈ３Ｎ２）によりチャレンジした。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）および野生型ＰＲ８免疫処置マウスは、チャレンジ後に生存したが、不活化ＰＲ８またはＰＢＳを受けたマウスは、感染により死亡した（図２９）。チャレンジ後３日目のマウス気道におけるウイルス価は、他の群のマウスと比較して、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチン接種マウスにおいて有意な低下を示さなかった（図３０）。これらの結果から、Ａｉｃｈｉチャレンジに対して観察された交差防御が、一部、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンにより誘導されたＴ細胞を介した免疫応答による可能性が示唆される。Ａｉｃｈｉへの赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体は、チャレンジマウスから得られたチャレンジ後血清中は検出できず（１未満：４０）、防御が中和抗体に介されていないことが示唆される。
Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスは、表２３にまとめたように、致死的ホモおよびヘテロサブタイプチャレンジに対して、液性および細胞の両方の免疫応答を刺激し、動物に防御免疫を付与する。
実施例１５ Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）およびＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）と比較したＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチン
この実施例は、弱毒生ウイルス（ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標））、Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）不活化インフルエンザワクチンと比較した、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスの効能を示す。マウスを、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルス、低温馴化弱毒生ウイルス（ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標））、Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）不活化インフルエンザワクチンで免疫処置するか、またはＰＢＳにより偽免疫処置した。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）−Ｈ３ウイルスを、インフルエンザＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７様Ａ／Ｕｒｕｇｕａｒｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）のＨＡおよびＮＡコード配列をＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）バックボーン（配列番号１）に挿入することにより構築した。インフルエンザＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７様Ａ／Ｕｒｕｇｕａｒｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）のＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む低温馴化Ａ／ＡＡ／６／６０バックボーンから得たＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）−Ｈ３内部遺伝子を、２００９／２０１０三価ワクチン製剤からプラーク精製した。Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）２００９／２０１０製剤を、三価製剤として直接用いた。
血清を免疫処置後７日、１４日、２１日目に得て、ＥＬＩＳＡにより抗体応答の反応速度を比較した（図３１）。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）−Ｈ３ウイルス、つまり複製欠損ウイルスは、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）−Ｈ３、つまり弱毒の手法で多重サイクル複製（ｍｕｌｔｉ−ｃｙｃｌｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を受ける生インフルエンザウイルスよりも早期に抗体を発生した。不活化ワクチンＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）は、高度の抗原提示であるため、最高の血清中抗体価を有した。
血清、肺洗浄液および鼻甲介における抗ＨＡ粘膜抗体の存在を、ＥＬＩＳＡにより評価した。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）−Ｈ３およびＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）（２種とも生インフルエンザワクチン）は、不活化ワクチンＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）よりも気道において高いＩｇＡを有した。（図３２）
実施例１６：生ウイルスにより誘発された防御および免疫原性の比較
イソフルランで麻酔した６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０日および２８日目に、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）−Ｈ３（先に記載）、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）（２００９−２０１０）（Ｈ３Ｎ２）ＩＶＲ−１４７（ＰＲ８×Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７）１０6ＴＣＩＤ50／５０μｌで鼻腔感染させた。ＩＶＲ−１４７は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスの野生型であり、即ち、機能性Ｍ２蛋白質を含む。偽感染された対照マウスは、ウイルスの代わりにＰＢＳ ５０μｌを受けた。血清を全てのマウスから週に１回採取し、ＥＬＩＳＡにより抗ＨＡ抗体の存在について分析した。図３３に示す通り、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスおよびＩＶＲ−１４７は、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）と比較して、より高い抗体レベルを急速な速度で生じた。
動物の体重を、感染後１４日間モニタリングした。ワクチン接種されたマウスは、いずれの体重減少も有さなかった。ブースト後２１日目に、群あたり３匹のマウスを安楽死させて、気管−肺洗浄液、鼻腔洗浄液、および血清を、抗体価測定のために採取した（図３４）。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）は、血清および気道において、液性および粘膜の両方の抗体をＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）およびＩＶＲ−１４７と類似レベルまで誘導した。
マウスを、ブーストから６週後にＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ウイルス ４０ＭＬＤ50でチャレンジした。マウスを、１４日間の体重減少および生存について観察した（図３５）。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）は、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）とは対照的に少ない体重減少（パネルＡ）および１００％の生存（パネルＢ）により示される通り、マウスを致死的Ａｉｃｈｉチャレンジから防御した。チャレンジ後３日目には、１群３匹を安楽死させて、肺および鼻甲介をウイルス価測定のために採取した（表２４）。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）は、表２４に示される通り、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）よりも良好にチャレンジウイルスを制御した。
実施例１７：高病原性トリＨ５ｎ１インフルエンザウイルスへのＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンの生成
概要−Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）は、機能性Ｍ２蛋白質の発現を示さないインフルエンザウイルスである。Ｍ２蛋白質は、インフルエンザウイルス感染の開始および子孫ウイルスへの効率的ウイルスＲＮＡ取り込みのために不可欠である。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）は、細胞に侵入してウイルス蛋白質を発現することができるが、Ｍ２遺伝子の欠失により感染性子孫ウイルスを作製することができない。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）は、許容Ｍ２蛋白質発現細胞において生成されるが、非許容野生型細胞においては生成されない。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）は、マウスにおいて粘膜および液性の両方の免疫を誘発し、ホモおよびヘテロの両方のサブタイプ致死的チャレンジから防御する。
Ｈ５Ｎ１ Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスは、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）バックボーンにＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４のＨＡ（無毒性）およびＮＡ遺伝子を含む。「Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）バックボーン」は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）（配列番号１）変異を含むＰＲ８の配列を意味する。用いられたＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（無毒性）およびＮＡ配列を、以下に示す。
Ｈ５Ｎ１ Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）の生成：Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）の無毒性ＨＡおよびＮＡを、各遺伝子のＣＤＣ配列に基づきＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓにより化学的に合成した（ＣＤＣ ＩＤ：２００４７０６２８０、アクセッション番号：ＥＦ５４１４６７およびＥＦ５４１４０３）。構築物の配列を確認し、適切なベクターにサブクローニングして、標準的プロトコールを用いたシードウイルスを生成させた。
Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ＶＮ１２０３ａｖＨＡ，ＮＡ（Ｈ５Ｎ１ Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ））ウイルスを、Ｍ２ＣＫ細胞（Ｍ２蛋白質を安定発現するＭＤＣＫ細胞）中で増幅させて、上清から細胞断片を取り除き、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−７０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により１００倍に濃縮した。このウイルスを、マウス試験における免疫原として用いた。
マウス試験計画：マウス（７〜８週齢、雌ＢＡＬＢ／ｃ）を、Ｈ５Ｎ１ Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）（１０6ＴＣＩＤ50／匹）、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ＣＡ０７ＨＡ，ＮＡ（１０6ＴＣＩＤ50／匹）を鼻腔接種するか、またはＶＮ１２０３蛋白質（１．５μｇ）を筋肉内投与した。体重および臨床症状を、接種後１４日間観察した。血清を接種後７日、１４日、２１日目に採取した。２８日目にマウスを同時に開始した新しいプライムのみ群でブーストした。
ブースト免疫処置および「プライムのみ」群：２８日目に、Ｈ５Ｎ１ Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）を予め接種されたマウスを、１０6ｐｆｕ／マウスの二次免疫処置でブーストした。同時に、「プライムのみ」群に最初の用量を与えた。体重を、２８日目の接種後に全ての群で実施した。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンのブースト用量を受けたマウスは、体重を多くても５％減少させた。「プライムのみ」群は、体重を最大１０％減少させた。
Ｈ５Ｎ１ Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）はＨＡに対するＩｇＧ抗体価を誘発する：血清を、接種後７日、１４日、２１日目にマウスから得て、ヘマグルチニンに対する抗体についてＥＬＩＳＡにより分析した。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）は、Ｈ５ＨＡ蛋白質よりも少なくとも１００倍高い力価を生じた（図３６）。マウスを２８日目にブーストして、１週間後（３５日目）に血清を得た。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）の力価は、１３０倍ブーストされたが、ＨＡ蛋白質は、１３倍しかブーストされなかった。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）プライムのみ群での３５日目の第一週採血は、プライム−ブースト群の第一週と同様に高いＩｇＧ価を示した。
マウスを、Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４ウイルスの致死用量（２０ＭＬＤ50）でチャレンジした。Ｈ５Ｎ１ Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）をワクチン接種された（プライムのみおよびプライム−ブースト）マウスは全て生存した（図５４および５５）。免疫処置から５ヶ月後にチャレンジされたマウスの高い生存率から、Ｈ５Ｎ１ Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンがメモリー応答を刺激することが示唆される。免疫処置から４週間後にチャレンジされたマウスは、ワクチンの一用量のみを受けており、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチンが強い免疫応答を刺激することが示される。Ｈ１Ｎ１ｐｄｍＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）を免疫処置されたマウスも、５ヶ月後のＨ５Ｎ１チャレンジ後に生存し、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）が交差反応性免疫応答を刺激して、非相同性チャレンジに対する防御を提供することが示される。
実施例１８：Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ：ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）ＣＡ０７とＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ＣＡ０７との対比
Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（ＣＡ０７）（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）のＨＡおよびＮＡ ｃＤＮＡクローンを、標準の分子生物学的プロトコールにより生成させた。構築物の配列を確認し、適切なベクターにサブクローニングして、標準的プロトコールを用いたシードＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスおよびＭ２ＷＴＣＡ０７／ＰＲ８ウイルスを生成させた。ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）ＣＡ０７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）を、ＭＤＣＫ細胞において、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）２０１１−２０１２ワクチンＬｏｔ＃Ｂ１１Ｋ１８０２からプラーク精製した。用いられたＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（ＣＡ０７）ＨＡおよびＮＡ配列を、以下に示す。
マウス（７〜８週齢、雌ＢＡＬＢ／ｃ）に、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ） ＣＡ０７（１０6ＴＣＩＤ50／匹）、Ｍ２ＷＴ ＣＡ０７（１０6ＴＣＩＤ50／匹）、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標） ＣＡ０７（１０6ＴＣＩＤ50／匹）またはナイーブ対照としてのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）を鼻腔接種した。体重および臨床症状を、接種後１４日間観察した。図３７は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）およびＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）をワクチン接種されたマウスが、体重を減少させなかったが、ＷＴ Ｍ２を含むウイルスが、体重を減少させて感染により死亡したことを示す。これらの結果から、Ｍ２遺伝子の欠失がウイルスを弱毒化し、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）が弱毒化されていることが示された。
図３８ 肺および鼻末端におけるＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）およびＭ２野生型ウイルスの力価。肺および鼻甲介を、細胞のウイルス価測定のために、ワクチン接種後３日目に採取した。ウイルスは、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）免疫処置マウスにおいて肺または鼻甲介のいずれにおいても一切検出されなかった。これに対し、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）は、肺および鼻甲介の両方においてウイルス複製を行ったが、野生型ウイルスよりも低レベルであった。
図３９ 接種から７日、１４日、および２１日後に採取された血清中のＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）およびＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）の力価、並びに抗ＨＡ ＩｇＧ価を、ＥＬＩＳＡにより決定した。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）は、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）の応答よりも高い応答を誘発し、それはより早期に検出された。２１日目までに、両方のウイルスでピーク抗体レベルに達した。
図４０は、非相同性ウイルスのマウス馴化インフルエンザＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ２Ｎ２）の４０ＭＬＤ50での免疫処置から１２週後にチャレンジされたマウスの生存％を示す。体重変動および臨床症状を、チャレンジ後１４日間観察した。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍＨＡ，ＮＡ）で免疫処置されたマウスの全てが、Ａｉｃｈｉ（Ｈ３Ｎ２）チャレンジを防御されたが、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍＨＡ，ＮＡ）では８０％のみが防御された。生存したＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）マウスは、体重を２０％近く減少させたが、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）マウスは、〜１０％の体重減少であった。
表２６は、チャレンジ後３日目に採取された肺および鼻甲介におけるウイルス価を示す。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）およびＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）は、肺および鼻甲介におけるチャレンジウイルス複製を類似のレベルまで制御したが、ナイーブマウスは、肺および鼻甲介の両方において１ｌｏｇ高いウイルス価を示した。
気管支肺胞（ＢＡＬ）中の細胞の細胞内染色。ＢＡＬをチャレンジから３日後に採取し、フローサイトメトリーにより免疫染色用表面マーカで染色して、ＣＤ８＋ＣＤ４＋、ＣＤ８＋ＣＤ４−、ＣＤ８−ＣＤ４＋、ＣＤ８−ＣＤ４−細胞集団を検出した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞集団は両者とも、ナイーブマウスよりもワクチン接種マウスにおいて大きくなり、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）がＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）と類似の細胞応答を刺激したことが示される。Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチン接種マウスは、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）よりも大きなＣＤ８＋ＣＤ４−細胞集団を有した（４９％対４０％）（図４１）。
実施例１９ ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）および野生型ウイルスに関するＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ｍＲＮＡ発現
一部の実施形態において、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスが、Ｍ２蛋白質をトランスに安定して提供する細胞において生成され、ウイルス膜内に機能性Ｍ２蛋白質を有するがゲノムにおいてＭ２コードしないウイルスを生成する。それゆえ本発明者は、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスが、正常細胞の初期感染および最初の複製周期においては野生型ウイルスと同様に挙動すると仮定した。本発明者は、ウイルス抗原のｍＲＮＡレベルが、感染初期の野生型レベルと類似しており、弱毒化複製ウイルスワクチンよりも迅速に強力な免疫応答を刺激すると示唆する。
ヒト肺癌（Ａ５４９）細胞を、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）および野生型ウイルスで０．５の感染多重度で感染させた。非吸着ウイルスを、ＰＢＳで５回洗浄することにより除去した。ウイルス発育培地を添加した後、感染させた細胞を３５℃ ＣＯ2インキュベータに入れた。トリプシンを発育培地に一切添加せずに、全ウイルスの１周期の複製を確認した。細胞の単層を回収して、ＲＮＡを感染から４、９および２２時間後に抽出した。
対照および感染Ａ５４９細胞から得た総ＲＮＡ（１００ｍｇ）を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析に用いた。ｃＤＮＡをｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で合成して、初期インフルエンザ遺伝子Ｍ１および後期インフルエンザ遺伝子ＨＡおよびサイトカインＩＰ−１０遺伝子用の遺伝子特異性プライマーを用いて、リアルタイム定量ＰＣＲ解析により定量した。製造業者の使用説明書に従い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｉｇｅｎ、カールスバッド所在）を使用して、反応を行った。反応効率を、ハウスキーピング遺伝子γ−アクチンおよび試料遺伝子の系列１０倍希釈を利用することにより計算した。ＡＢＩ ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティ所在）で反応を実施し、用いられた熱プロファイルは、ステージ１：５０℃で３０分間、ステージ２：９５℃で１５分間、ステージ３：９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間であり、これを３０周期繰り返す。全ての定量（閾値サイクル［ＣＴ］値）を、ハウスキーピング遺伝子に標準化して、ΔＣＴを作成し、試料のΔＣＴ値と参照（野生型試料）のΔＣＴとの差を、−ΔΔＣＴとして計算した。ｍＲＮＡ発現の相対レベルは、２−ΔΔＣＴとして表した。
Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスＨＡ ｍＲＮＡ発現は、感染後４時間目のＨ３（表２７）、ＰＲ８（表２８）およびＨ１Ｎ１ｐｄｍ（図４２）の野生型Ｍ２ウイルスと類似していた。低温馴化ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）は、複製速度が緩やかであるため、初期時点では野生型およびＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）よりも低かった。Ｍ１、初期時点の遺伝子、ｍＲＮＡ発現を検査すると、類似の結果が観察された（表２７、図４２）。これらの結果から、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）が初期感染周期において類似レベルのｍＲＮＡを生じ、野生型ウイルスと類似の「危険シグナル」を生成して強力な免疫応答を誘発する、デノボウイルス抗原を生成することが示唆される。

実施例２０：Ｍ２ ベロ生成細胞の作製
ＰＲ８ウイルスのＭ２遺伝子を、標準の分子技術によりベクターｐＣＭＶ−ＳＣ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラジョア所在）にクローニングして、ｐＣＭＶ−ＰＲ８−Ｍ２を作製した。そのプラスミドをＥｃｏＲ１で消化して、３００ｂｐ Ｍ２遺伝子および４．５Ｋｂベクターの存在を図４３に示す通り確認した。Ｍ２遺伝子挿入部を含むプラスミドの配列を、図４４に示す通り確認した。
Ｍ２ベロ細胞の作製：上述の、ネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＣＭＶ−ＰＲ８−Ｍ２プラスミドを、製造業者の使用説明書に従ってＴｒａｎｓ ＩＴ−ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）を用いることにより、ベロ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）にトランスフェクトした。簡潔に記載すると、トランスフェクションの前日に、ベロ細胞を５×１０5個／１００ｍｍ皿で播種した。１日目に、プラスミドＤＮＡ １０μｇをＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．３ｍＬ中でＴｒａｎｓ ＩＴ−ＬＴ１ ２０μｇと混合して、５％ＣＯ2中、３７℃でこれらの細胞と共に一晩インキュベートした。２日目に、トランスフェクション混合物を、５％新生仔ウシ血清を補足した改変イーグル培地（ＭＥＭ）である完全培地と交換した。培地は、ネオマイシン蛋白質を発現する哺乳動物細胞を選択するために用いられる広域抗生物質であるゲネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も１ｍｇ／ｍｌ含有した。耐性細胞（Ｍ２遺伝子を安定発現するベロ細胞）は、選択培地中で発育を開始し、培地を新しい選択培地と交換して、ゲネティシン耐性クローンを、ＴＣ−９６プレートにおいて限界希釈法により単離した。Ｍ２蛋白質の表面発現を、Ｍ２特異性モノクローナル抗体１４Ｃ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた免疫染色により実証した。
親ベロ細胞および変性Ｍ２ベロ細胞のＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスでの感染：Ｍ２ベロ細胞がＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ウイルスの生成細胞として作用する能力を、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）−ＰＲ８ウイルスでの感染により検査した。簡潔に記載すると、Ｍ２ベロ細胞および親ベロ細胞の単層を、標準のインフルエンザ感染手順を利用して、Ｍ２ＫＯ（ΔＴＭ）−ＰＲ８ウイルスの１０倍希釈系列（１０-1〜１０-6）で感染させた。感染細胞を３５℃でインキュベートして、細胞変性作用（ＣＰＥ）について１日１回観察した。Ｍ２ベロ細胞はＣＰＥを示し、ウイルス発育が示された。上清を４日目に１０-3のウェルから採取して、Ｍ２遺伝子を安定発現するＭＤＣＫ細胞（Ｍ２ＣＫ）でのＴＣＩＤ50アッセイによりウイルス価を決定した。Ｍ２ベロ細胞内で発育されたＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）−ＰＲ８ウイルス価は、１０6.75ＴＣＩＤ50／ｍｌであり、Ｍ２ベロ細胞がＭ２ＫＯ（ΔＴＭ）ワクチン製造のための生成細胞として働き得ることが示される。
実施例２１：インフルエンザワクチンの皮内送達
この実施例は、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）に、発行された米国特許出願公開第２０１１／０１７２６０９号に記載されたような皮下マイクロニードルデバイスを用いて投与した場合の、季節性インフルエンザワクチンＦｌｕＬａｖａｌ（２０１１−２０１２製剤）の免疫原性を示す。無毛モルモットに０日目に接種して、選択群を３０日目にブースとした。血清を０日、３０日および６０日目に採取して、ヘマグルチニン特異性ＩｇＧ応答について酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）により分析した。
結果を図５１〜５３に示す。データは、季節性インフルエンザワクチンＦｌｕＬａｖａｌにおいて配合された、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９ ＮＹＭＣ Ｘ−１８１、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９ ＮＹＭＣ Ｘ−１８７（Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９様ウイルス）、およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８の３つのウイルス株に対する抗体レベルの定性的吸収を示す。３０日目に、ＩＭおよびＩＤ送達は、全てのウイルスＨＡに対して同等のＩｇＧ応答を生じた。ＩＤプライムのみ群は、６０日目により高い力価を示しており、ＩＤ送達が全てのウイルスＨＡへの長期持続性免疫を誘発することが示唆される。

本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕配列番号１を含む核酸配列。
〔２〕配列番号２を含む核酸配列。
〔３〕配列番号３を含む核酸配列。
〔４〕（ｉ）プロモーターと、（ii）転写終止配列とに動作可能に連結された配列番号１、配列番号２または配列番号３を含む組成物。
〔５〕Ｍ遺伝子内に変異を含む組換えインフルエンザウイルス。
〔６〕配列番号１、配列番号２、または配列番号３を含む、前記〔５〕に記載の組換えインフルエンザウイルス。
〔７〕前記Ｍ遺伝子内の変異により、前記ウイルスにＭ２蛋白質を発現できなくさせるか、または前記ウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる、前記〔５〕または〔６〕に記載の組換えインフルエンザウイルス。
〔８〕前記Ｍ遺伝子内の変異が、インビトロ宿主細胞系での少なくとも１０継代の間に、機能性Ｍ２蛋白質をコードする野生型または非野生型配列に復帰しない、前記〔５〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の組換えインフルエンザウイルス。
〔９〕前記ウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルスである、前記〔５〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
〔１０〕感染された哺乳動物において非病原性である、前記〔５〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
〔１１〕前記インビトロ細胞系が、チャイニーズハムスター卵巣細胞を含む、前記〔８〕に記載の組換えウイルス。
〔１２〕前記インビトロ細胞系が、ベロ細胞を含む、前記〔８〕に記載の組換えウイルス。
〔１３〕前記〔５〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載の組換えインフルエンザウイルスを含む細胞。
〔１４〕前記細胞が、インビトロのものである、前記〔１３〕に記載の細胞。
〔１５〕前記細胞が、インビボのものである、前記〔１３〕に記載の細胞。
〔１６〕Ｍ遺伝子内に変異を含む組換えインフルエンザウイルスを含む組成物。
〔１７〕配列番号１、配列番号２または配列番号３を含む、前記〔１６〕に記載の組成物。
〔１８〕前記Ｍ遺伝子内の変異により、前記ウイルスにＭ２蛋白質を発現できなくさせるか、または前記ウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる、前記〔１６〕または〔１７〕に記載の組成物。
〔１９〕前記ウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルスである、前記〔１６〕〜〔１８〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔２０〕投与された哺乳動物に対して非病原性である、前記〔１６〕〜〔１９〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔２１〕哺乳動物への投与後約３週間以内に前記哺乳動物において検出可能な免疫応答を誘発する、前記〔１６〕〜〔２０〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔２２〕Ｍ遺伝子内に変異を含む組換えインフルエンザウイルスを含むワクチン。
〔２３〕配列番号１、配列番号２または配列番号３を含む、前記〔２２〕に記載のワクチン。
〔２４〕前記Ｍ遺伝子内の変異により、前記ウイルスにＭ２蛋白質を発現できなくさせるか、または前記ウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる、前記〔２２〕または〔２３〕に記載のワクチン。
〔２５〕前記ウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルスである、前記〔２２〕〜〔２４〕のいずれか一項に記載のワクチン。
〔２６〕投与された哺乳動物に対して非病原性である、前記〔２２〕〜〔２５〕のいずれか一項に記載のワクチン。
〔２７〕哺乳動物への投与後約３週間以内に前記哺乳動物において検出可能な免疫応答を誘発する、前記〔２２〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載のワクチン。
〔２８〕前記組換えウイルスに加えて、少なくとも２種の異なるインフルエンザウイルス株を含む、前記〔２２〕〜〔２７〕のいずれか一項に記載のワクチン。
〔２９〕少なくとも１種のインフルエンザＢ型ウイルスまたはインフルエンザＢ型ウイルス抗原を含む、前記〔２２〕〜〔２８〕のいずれか一項に記載のワクチン。
〔３０〕少なくとも１種のインフルエンザＣ型ウイルスまたはインフルエンザＣ型ウイルス抗原を含む、前記〔２２〕〜〔２９〕のいずれか一項に記載のワクチン。
〔３１〕ヒトインフルエンザＡ型ウイルスおよび非ヒト種からのパンデミックインフルエンザウイルスを含む１種以上のウイルスまたはウイルス抗原を含む、前記〔２２〕〜〔３０〕のいずれか一項に記載のワクチン。
〔３２〕前記ヒトインフルエンザＡ型ウイルスが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２を含む群から選択される、前記〔２２〕〜〔３１〕のいずれか一項に記載のワクチン。
〔３３〕宿主細胞を組換えインフルエンザウイルスの配列番号１、配列番号２または配列番号３と接触させることと、前記宿主細胞をウイルス複製に適した条件下で十分な時間インキュベートすることと、子孫ウイルス粒子を単離することと、を含む、組換えインフルエンザウイルスを増殖させる方法。
〔３４〕宿主細胞をバイオリアクターに入れることと、前記宿主細胞を組換えウイルスの配列番号１、配列番号２または配列番号３と接触させることと、前記宿主細胞をウイルス増殖に適した条件下で十分な時間インキュベートすることと、子孫ウイルス粒子を単離することと、前記子孫ウイルス粒子をワクチンとしての投与のために製剤化することと、を含む、ワクチンを調製する方法。
〔３５〕Ｍ遺伝子内に変異を含む組換えインフルエンザウイルスを含む組成物を投与することと、を含み、前記Ｍ遺伝子内の変異により、前記ウイルスにＭ２蛋白質を発現できなくさせるか、または前記ウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる、対象を免疫処置する方法。
〔３６〕Ｍ遺伝子内に変異を含む組換えインフルエンザウイルスを含む組成物を投与することと、を含み、前記Ｍ遺伝子内の変異により、前記ウイルスにＭ２蛋白質を発現できなくさせるか、または前記ウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる、対象におけるインフルエンザＡ型ウイルスによる感染の可能性または重症度を低減する方法。
〔３７〕前記組換えインフルエンザウイルスが、配列番号１、配列番号２または配列番号３を含む、前記〔３５〕または〔３６〕に記載の方法。
〔３８〕前記組成物の少なくとも１種のブースター用量を提供することを含み、前記少なくとも１種のブースター用量が、最初の投与後３週間目に提供される、前記〔３５〕〜〔３７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３９〕前記組成物を鼻腔、筋肉内または皮膚内に投与することを含む、前記〔３５〕〜〔３８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４０〕前記投与が、皮膚内に実施される、前記〔３９〕に記載の方法。
〔４１〕前記投与が、マイクロニードル送達デバイスを用いて実施される、前記〔４０〕に記載の方法。
〔４２〕（ａ）（ｉ）穿刺機構と、（ii）皮膚を穿刺することが可能な複数のマイクロニードルを含む免疫原性組成物層と、を含み、免疫原性組成物を皮膚内投与させることが可能である、マイクロニードル送達デバイスを提供することと、（ｂ）前記穿刺機構を押し下げることと、を含み、前記免疫原性組成物が、Ｍ遺伝子内に変異を含む組換えインフルエンザウイルスを含み、前記Ｍ遺伝子内の変異により、前記ウイルスにＭ２蛋白質を発現できなくさせるか、または前記ウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる、免疫原性組成物の皮膚内投与方法。
〔４３〕前記組換えインフルエンザウイルスが、配列番号１、配列番号２または配列番号３を含む、前記〔４２〕に記載の方法。
〔４４〕前記マイクロニードルアレイが、最初、デバイスハウジングの内部に配置されており、レバーの動作により前記マイクロニードルを前記デバイスの底を貫通させて皮膚内に挿入させ、それにより前記ワクチン液を皮膚に注入させる、前記〔４２〕に記載の方法。
〔４５〕前記ウイルスが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベロ細胞、またはメイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞からなる群より選択される非変性宿主細胞中で複製しない、Ｍ遺伝子内の変異を含む組換えインフルエンザウイルス。
〔４６〕前記Ｍ遺伝子内の変異により、前記ウイルスにＭ２蛋白質を発現できなくさせるか、または前記ウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる、前記〔４５〕に記載の組換えウイルス。
〔４７〕インフルエンザウイルスＭ２イオンチャネル遺伝子をコードする核酸を含み、前記核酸が前記細胞内で発現される、組換え細胞。
〔４８〕２，６−シアル酸受容体遺伝子を含む組換え細胞。
〔４９〕（ｉ）ウイルスＭ２イオンチャネル遺伝子、および（ii）２，６−シアル酸受容体遺伝子、を発現する細胞内ゲノムまたは発現ベクターを含む組換え細胞。
〔５０〕前記細胞は、真核細胞である、前記〔４７〕〜〔４９〕のいずれか一項に記載の組換え細胞。
〔５１〕前記真核細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはベロ細胞である、前記〔４７〕〜〔５０〕のいずれか一項に記載の組換え細胞。
〔５２〕機能性Ｍ２蛋白質を発現しないヒトインフルエンザウイルスを更に含む、前記〔４７〕〜〔５１〕のいずれか一項に記載の組換え細胞。
〔５３〕（Ａ）（ｉ）機能性Ｍ２イオンチャネル蛋白質を構成的に発現するか、または（ii）前記機能性Ｍ２イオンチャネル蛋白質を発現するようにウイルス感染後に導入され、前記細胞により発現された前記機能性Ｍ２イオンチャネル蛋白質の存在下のみで複製に成功する、前記〔４７〕〜〔５２〕の１項に記載の細胞を、ヒトインフルエンザウイルス粒子に感染させることと、（Ｂ）子孫ウイルス粒子を単離することと、を含む、組換えインフルエンザウイルス粒子を生成する方法。
〔５４〕前記単離されたウイルス粒子をワクチンに配合させることを更に含む、前記〔５３〕に記載の方法。
〔５５〕前記ウイルスが、ヒトインフルエンザウイルスを含み、前記ウイルスが、機能性Ｍ２蛋白質を発現しない、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の方法。

Claims (10)

  1. 配列番号１を含む、変異体Ｍ遺伝子を有する組換えインフルエンザウイルス。
  2. 前記Ｍ遺伝子の変異により、前記ウイルスに配列番号４のアミノ酸配列を有するトランケート型Ｍ２蛋白質を発現させる、請求項１に記載の組換えインフルエンザウイルス。
  3. 前記変異体Ｍ遺伝子が、インビトロ宿主細胞系での少なくとも１０継代の間に、機能性Ｍ２蛋白質をコードする野生型または非野生型配列に復帰せず、
    前記宿主細胞が、前記変異体遺伝子の野生型バージョンを生成するように修飾されており、それにより前記遺伝子産物を前記ウイルスにトランスに提供する、
    請求項１に記載の組換えインフルエンザウイルス。
  4. 前記ウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルスである、請求項１に記載の組換えウイルス。
  5. 前記ウイルスに感染された哺乳動物において非病原性である、請求項１に記載の組換えウイルス。
  6. 前記インビトロ細胞系が、チャイニーズハムスター卵巣細胞又はベロ細胞を含む、請求項３に記載の組換えウイルス。
  7. 宿主細胞を、配列番号１を含む組換えインフルエンザウイルスと接触させることと、前記宿主細胞をウイルス複製に適した条件下で十分な時間インキュベートすることとを含む、組換えインフルエンザウイルスを増殖させる方法であって、
    前記宿主細胞が、インフルエンザＭ遺伝子の野生型バージョンを生成するように修飾されており、それにより前記遺伝子産物を前記ウイルスにトランスに提供する、方法。
  8. 更に、子孫ウイルス粒子を単離すること、及び／又は、前記ウイルス粒子をワクチンに製剤化することを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記変異体Ｍ遺伝子が、前記宿主細胞の少なくとも１０継代の間に、機能性Ｍ２蛋白質をコードする野生型または非野生型配列に復帰しない、請求項７に記載の方法。
  10. 前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞又はベロ細胞である、請求項７に記載の方法。
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