CN103781901B - 流感病毒突变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文中公开了与突变体病毒有关的组合物和方法，具体地是突变体流感病毒。本文中公开的突变体病毒包括突变体M2序列，且可用于免疫原性组合物中，例如，作为疫苗。本文中也公开了用于繁殖病毒突变体的方法、组合物和细胞，以及与疫苗接种有关的方法、装置和组合物。

Description

流感病毒突变体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年6月24日提交的美国临时申请号61/501,034的权益， 其内容通过引用整体并入本文。
序列表
本申请包含已通过EFS-Web提交的ASCII格式的序列表且该序列表的全部 内容以引用方式并入本文。于2013年2月21日创建的所述ASCII副本名称为 090248-0125_SL.txt且大小为28,140字节。
背景技术
流感是美国成年人死亡的主要原因。每年，约36,000人死于流感，超过 200,000人住院。流感是一种高度接触传染的疾病，其通过咳嗽、喷嚏和通过与 携带病毒的物体（诸如门把手和电话）的直接物理接触而传播。流感的征状包 括发热、极度疲劳、头痛、寒冷和身体疼痛；约50%的受感染者没有征状，但 是仍然是接触传染的。免疫接种在65岁以下的健康人中具有70-90%的预防流感 的有效性，只要循环病毒株的抗原性与疫苗的抗原性匹配。
疫苗接种是预防流感的主要方法，并且活的减毒的和灭活的(杀死的)病毒疫 苗都是目前可得到的。通常鼻内施用的活病毒疫苗会活化免疫系统的所有阶段， 且可以刺激针对多种病毒抗原的免疫应答。因而，活病毒的应用克服了在灭活 病毒疫苗的制备过程中可能发生的病毒抗原破坏的问题。另外，与由灭活疫苗 诱导的免疫相比，由活病毒疫苗产生的免疫通常更持久、更有效和更有交叉反 应性，并且活病毒疫苗的生产成本比灭活的病毒疫苗更低。但是，减毒病毒的 突变经常是不太确定的，且恢复是一个问题。
发明内容
在一个方面，本公开内容提供了一种核酸序列，其包含SEQ ID NO:1。
在一个方面，本公开内容提供了一种核酸序列，其包含SEQ ID NO:2。
在一个方面，本公开内容提供了一种核酸序列，其包含SEQ ID NO:3。
在一个方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含与(i)启动子和(ii)转 录终止序列可操作地连接的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
在一个方面，本公开内容提供了一种重组流感病毒，其包含M基因中的突 变。在某些实施方案中，所述重组流感病毒包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 或SEQ ID NO:3。在某些实施方案中，所述M基因中的突变导致病毒表达M2 蛋白的失败，或者造成病毒表达具有SEQID NO:4的氨基酸序列的截短的M2 蛋白。在某些实施方案中，在体外宿主细胞系统中至少10代，所述M基因中的 突变不会恢复成野生型或编码功能性M2蛋白的非野生型序列。在某些实施方案 中，所述病毒是甲型流感病毒。在某些实施方案中，所述病毒在被所述病毒感染的哺乳动物中是非致病性的。在某些实施方案中，所述体外细胞系统包含中 国仓鼠卵巢细胞。在某些实施方案中，所述体外细胞系统包含Vero细胞。
在一个方面，本公开内容提供了一种细胞，其包含权利要求5-10中的任一 项所述的重组流感病毒。在某些实施方案中，所述细胞是在体外。在某些实施 方案中，所述细胞是在体内。
在一个方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含：含有M基因中的突 变的重组流感病毒。在某些实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。在某些实施方案中，所述M基因中的突变导致病毒表 达M2蛋白的失败，或者造成病毒表达具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短 的M2蛋白。在某些实施方案中，所述病毒是甲型流感病毒。在某些实施方案中， 所述组合物对施用所述组合物的哺乳动物是非致病性的。在某些实施方案中， 在给哺乳动物施用所述组合物以后约3周内，所述组合物在哺乳动物中引起可 检测的免疫应答。
在一个方面，本公开内容提供了一种疫苗，其包含：含有M基因中的突变 的重组流感病毒。在某些实施方案中，所述疫苗包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 或SEQ ID NO:3。在某些实施方案中，所述M基因中的突变导致病毒表达M2 蛋白的失败，或者造成病毒表达具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2 蛋白。在某些实施方案中，所述病毒是甲型流感病毒。在某些实施方案中，所 述疫苗对施用所述疫苗的哺乳动物是非致病性的。在某些实施方案中，在给哺 乳动物施用所述疫苗以后约3周内，所述疫苗在哺乳动物中引起可检测的免疫 应答。在某些实施方案中，除了所述重组病毒以外，所述疫苗包含至少2种不 同的流感病毒株。在某些实施方案中，所述疫苗包含至少一种乙型流感病毒或 乙型流感病毒抗原。在某些实施方案中，所述疫苗包含至少一种丙型流感病毒 或丙型流感病毒抗原。在某些实施方案中，所述疫苗包含一种或多种病毒或病 毒抗原，所述病毒或病毒抗原包含人甲型流感和得自非人物种的大范围流行流 感病毒。在某些实施方案中，所述疫苗包含选自H1N1、H2N2和H3N2的人甲 型流感病毒。
在一个方面，本公开内容提供了一种用于繁殖重组流感病毒的方法，所述 方法包括：使宿主细胞与重组流感病毒SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3接触；在适合病毒复制的条件下，温育宿主细胞足够的时间，和分离后代 病毒颗粒。
在一个方面，本公开内容提供了一种用于制备疫苗的方法，所述方法包括： 将宿主细胞放入生物反应器中；使所述宿主细胞与重组病毒SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3接触；在适合病毒繁殖的条件下，温育所述宿主细胞 足够的时间；分离后代病毒颗粒；和配制所述后代病毒颗粒用于作为疫苗来施 用。
在一个方面，本公开内容提供了一种用于免疫受试者的方法，所述方法包 括：施用包含重组流感病毒的组合物，所述重组流感病毒包含M基因中的突变， 其中所述M基因中的突变导致病毒表达M2蛋白的失败，或者造成病毒表达具 有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
在一个方面，本公开内容提供了一种用于降低受试者中的甲型流感病毒感 染的可能性或严重程度的方法，所述方法包括：施用包含重组流感病毒的组合 物，所述重组流感病毒包含M基因中的突变，其中所述M基因中的突变导致病 毒表达M2蛋白的失败，或者造成病毒表达具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的 截短的M2蛋白。在某些实施方案中，所述重组流感病毒包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。在某些实施方案中，所述方法包括：提供至少1个加 强剂量的组合物，其中在第一次施用以后3周提供所述至少1个加强剂量。在 某些实施方案中，所述方法包括：鼻内地、肌肉内地或皮内地施用所述组合物。 在某些实施方案中，所述方法包括：皮内地进行施用。在某些实施方案中，所 述方法包括：使用微型针递送装置进行施用。
在一个方面，本公开内容提供了一种用于皮内施用免疫原性组合物的方法， 所述方法包括：(a)提供微型针递送装置，其包括(i)穿刺机构；(ii)免疫原性组 合物层，其包括多个能够刺穿皮肤和允许免疫原性组合物皮内施用的微型针； 和(b)压迫所述穿刺机构；其中所述免疫原性组合物包含含有M基因中的突变 的重组流感病毒，且其中所述M基因中的突变导致病毒表达M2蛋白的失败， 或者造成病毒表达具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。在某些 实施方案中，所述重组流感病毒包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。在某些实施方案中，所述微型针阵列最初位于装置壳体的内部，并在杆 致动后，允许微型针延伸穿过装置底部并插入皮肤中，由此允许疫苗流体输注 进皮肤中。
在一个方面，本公开内容提供了一种重组流感病毒，其包含M基因中的突 变，其中所述病毒不在未修饰的选自以下的宿主细胞中复制：a中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞、Vero细胞、或Madin-Darby犬肾细胞。在某些实施方案中，所述 M基因中的突变导致病毒表达M2蛋白的失败，或者造成病毒表达具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
在一个方面，本公开内容提供了一种重组细胞，其包含编码流感病毒M2 离子通道基因的核酸，其中所述核酸在所述细胞中表达。
在一个方面，本公开内容提供了一种重组细胞，其包含2,6-唾液酸受体基因。
在一个方面，本公开内容提供了一种重组细胞，其包含表达(i)病毒的M2 离子通道基因和(ii)2,6-唾液酸受体基因的细胞基因组或表达载体。在某些实施 方案中，所述细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述真核细胞是中国仓鼠 卵巢细胞或Vero细胞。在某些实施方案中，所述重组细胞进一步包含人流感病 毒，其中所述病毒不表达功能性M2蛋白。
在一个方面，本公开内容提供了一种用于生产重组流感病毒颗粒的方法， 所述方法包括：(A)用人流感病毒感染权利要求47-52中的一项所述的细胞，其 中所述细胞要么(i)组成型地表达功能性的M2离子通道蛋白，要么(ii)在病毒 感染以后被诱导表达功能性的M2离子通道蛋白，且其中所述病毒仅在有细胞表 达的功能性M2离子通道蛋白存在下成功地复制；和(B)分离后代病毒颗粒。在 某些实施方案中，所述方法进一步包括：将分离的病毒颗粒配制成疫苗。在某 些实施方案中，所述病毒包含人流感病毒，且其中所述病毒不表达功能性M2 蛋白。
附图说明
图1的图描绘了M2离子通道在流感病毒生命周期中的作用，其中(1)流感 病毒附着于细胞表面上的唾液酸受体；(2)病毒被内化进细胞中；(3)M2离子通 道在病毒表面上表达；(4)M2离子通道打开以允许质子进入，从而导致进入细 胞核的病毒RNA的释放，发生复制，并导致病毒蛋白合成；和(5)病毒组分被 包装进病毒粒子中和释放。
图2是野生型和突变体M2基因的示意图。如下删除A/Puerto Rico/8/1934 (PR8)M区段的M2基因：在M1蛋白的开放读码框下游插入2个终止密码子， 随后删除跨膜结构域中的51个核苷酸以抑制全长M2蛋白的表达。
图3显示了未加工的M1和M2的核苷酸序列(SEQ ID NO:28)。
图4的图显示了正常MDCK细胞和稳定表达M2蛋白的MDCK细胞(M2CK) 中的M2KO(ΔTM)(上图)和野生型PR8(下图)病毒的生长动力学。以10-5的感染 复数，用病毒感染细胞。确定细胞上清液中的病毒滴度。野生型PR8在两个细 胞类型中生长至高滴度，而M2KO(ΔTM)仅在M2CK细胞中生长得较好，在 MDCK细胞中根本不生长。
图5的蛋白质印迹表明，M2KO(ΔTM)病毒在正常细胞中生产病毒抗原，但 是不生产M2。用PR8感染的小鼠血清(组A)或抗-M2单克隆抗体(组B)探测细 胞裂解物。泳道1，分子量标志物；泳道2，被PR8感染的MDCK细胞；泳道 3，被M2KO(ΔTM)感染的MDCK细胞；泳道4，未感染的MDCK细胞。
图6的图显示了接种M2KO变体以后小鼠体重的变化。
图7A的图显示了接种M2KO变体的小鼠中的抗体应答。
图7B的图显示了感染后6周加强的小鼠的血清中的抗-PR8IgG抗体滴度。
图8的图显示了接种M2KO变体以后，流感攻击以后小鼠体重的变化。
图9的图显示了接种M2KO变体以后，流感攻击以后的小鼠存活。
图10的图显示了鼻内地(IN)、真皮内地(ID)或肌肉内地(IM)接种PR8以后 小鼠体重的变化。
图11A的图显示了在接种PR8以后2周从具有1.8x101pfu(Lo)或1.8x104pfu (Hi)的病毒浓度的小鼠收集的血清中的抗体滴度。图11B的图显示了在接种 PR8以后7周从具有1.8x101pfu(Lo)或1.8x104pfu(Hi)的疫苗浓度的小鼠收集的 血清中的抗体滴度。
图12的图显示了在接种PR8以后，流感攻击以后的小鼠存活。
图13的图显示了在接种PR8以后，流感攻击以后的小鼠体重的变化。
图14的图显示了接种后7周从小鼠收集的血清中的抗体滴度，所述小鼠真 皮内地接种1.8x104pfu PR8。
图15的图显示了真皮内地接种1.8x104pfu PR8的小鼠的体重的变化。
图16的图显示了被杂亚型病毒感染的小鼠在攻击后的存活百分比。
图17的图显示了得自不同疫苗接种组的小鼠的ELISA滴度。
图18的图显示了同亚型病毒感染以后小鼠的存活百分比。
图19的图显示了杂亚型病毒攻击以后小鼠的存活百分比。
图20的图显示了接种的雪貂(ferret)的体重的变化。给雪貂接种107TCID50的M2KO(ΔTM)病毒(组A)或107TCID50的A/布里斯班/10/2007(H3N2)甲型流 感病毒(组B)。接种后监测体重3天。
图21的图显示了接种的雪貂的体温的变化。给雪貂接种107TCID50的 M2KO(ΔTM)病毒(组A)或107TCID50的A/布里斯班/10/2007(H3N2)甲型流感 病毒(组B)。接种后监测体温3天。
图22的图显示了疫苗接种以后雪貂的体重的变化。给雪貂接种107TCID50的M2KO(ΔTM)病毒[G1和G3]、107TCID50的FM#6病毒[G2和G4]或 OPTI-MEMTM[G5]。在激发疫苗接种以后(组A)和接受加强疫苗以后(组B)，监 测体重的变化14天。
图23的图显示了攻击以后雪貂的体重的变化。用107TCID50的A/布里斯班 /10/2007(H3N2)甲型流感病毒攻击雪貂。接种后监测体重14天。
图24的图显示了疫苗接种以后雪貂的体温的变化。给雪貂接种107TCID50的M2KO(ΔTM)病毒[G1和G3]、107TCID50的FM#6病毒[G2和G4]或 OPTI-MEMTM[G5]。在激发疫苗接种以后(组A)和接受加强疫苗以后(组B)，监 测体温的变化14天。
图25的图显示了攻击以后雪貂的体温的变化。用107TCID50的A/布里斯班 /10/2007(H3N2)甲型流感病毒攻击雪貂。接种后监测体温14天。
图26的图显示了病毒接种以后雪貂的重量的变化。在第0天给供体雪貂接 种107TCID50的M2KO(ΔTM)病毒(组A)或107TCID50的A/布里斯班/10/2007 (H3N2)病毒(组B)。接种后24小时(第1天)，将供体放入具有直接接触(DC)的笼 子中，所述笼子邻近容纳气溶胶接触(AC)的笼子。在供体接种以后，监测体重 的变化14天。
图27的图显示了病毒接种以后雪貂的体温的变化。在第0天给供体雪貂接 种107TCID50的M2KO(ΔTM)病毒(组A)或107TCID50的A/布里斯班/10/2007 (H3N2)病毒(组B)。接种后24小时(第1天)，将供体放入具有直接接触(DC)的笼 子中，所述笼子邻近容纳气溶胶接触(AC)的笼子。在供体接种以后，监测体温 的变化14天。
图28的图表明，M2KO(ΔTM)疫苗会引起体液和粘膜应答。组A显示了施 用PR8、M2KO(ΔTM)、灭活的PR8(IN、IM)或PBS以后的血清IgG和IgA滴 度。组B显示了施用PR8、M2KO(ΔTM)、灭活的PR8(IN、IM)或PBS以后肺 洗液IgG和IgA滴度。
图29的图表明，M2KO(ΔTM)疫苗会保护小鼠免于致命的同亚型和杂亚型 病毒攻击。组A显示了同源PR8(H1N1)攻击以后的小鼠体重变化。组B显示 了异源Aichi(H3N2)攻击以后的小鼠存活。
图30的图表明，M2KO(ΔTM)疫苗会控制呼吸道中的攻击病毒复制。组A 显示了PR8(H1N1)攻击以后的病毒滴度。组B显示了Aichi(H3N2)攻击以后 的病毒滴度。
图31的图显示了血清中针对M2KO(ΔTM)疫苗的抗体应答的动力学。
图32的图显示了血清和呼吸道中针对M2KO(ΔTM)疫苗的粘膜抗体应答。
图33的图显示了小鼠中响应于M2KO(ΔTM)疫苗的抗-HA IgG的动力学。
图34的图表明，M2KO(ΔTM)疫苗会诱导与和IVR-147类似的免 疫应答。组A显示了施用M2KO(ΔTM)H3、IVR-147和PBS的动 物中的血清病毒滴度。组B显示了施用M2KO(ΔTM)H3、IVR-147 和PBS的动物中的肺洗液病毒滴度。组C显示了施用M2KO(ΔTM) H3、IVR-147和PBS的动物中的鼻甲病毒滴度。
图35的图表明，M2KO(ΔTM)疫苗会保护免于Aichi攻击。组A显示了施 用H3、M2KO(ΔTM)H3、IVR-147和PBS的动物在Aichi攻击以后的 体重减轻。组B显示了施用M2KO(ΔTM)H3、IVR-147和PBS的 动物在Aichi攻击以后的存活百分比。
图36的图表明，H5N1M2KO(ΔTM)疫苗会引起针对HA的IgG抗体滴度。
图37的图显示了施用M2KO(ΔTM)CA07、WT CA07和疫 苗以后的体重。
图38的图表明，M2KO(ΔTM)病毒不会在小鼠的呼吸道中复制。
图39的图表明，M2KO(ΔTM)疫苗表现出快速的抗体动力学。
图40的图表明，M2KO(ΔTM)疫苗会保护免于H3N2病毒、A/Aichi/2/1968 的异源攻击。
图41的图表明，M2KO(ΔTM)疫苗会激发在攻击后恢复的细胞应答。
图42的图表明，M2KO(ΔTM)病毒会产生与M2的野生型病毒类似的mRNA 水平。
图43的琼脂糖凝胶显示了pCMV-PR8-M2表达质粒的限制酶切消化。泳道 1和5；1KbDNA梯型剂(Promega，Madison，WI，USA)，泳道2-4；Eco R1 消化的pCMLV-PR8-M2:0.375μg(泳道2)、0.75μg(泳道3)和1.5μg(泳道4)。
图44的图显示了pCMV-PR8-M2与流感M2基因的开放读码框的序列比 对。图44按出现顺序分别示出了SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.33。
图45的图显示了雪貂呼吸道中的M2KO(ΔTM)和病毒复制。
图46的图显示了用A/布里斯班/10/2007(H3N2)病毒鼻内攻击以后鼻洗液中 的M2KO(ΔTM)和病毒滴度。
图47的图显示了仅用M2KO(ΔTM)和激发组疫苗接种以后雪貂中 的IgG滴度。
图48的图显示了用M2KO(ΔTM)和激发-加强组疫苗接种以后雪貂 中的IgG滴度。
图49的图显示了从用M2KO(ΔTM)或疫苗接种至攻击后，雪貂血 清中的ELISA IgG滴度的总结。
图50的图显示了传播研究中得自雪貂的鼻洗液中的病毒滴度。M2KO(ΔTM) 病毒没有传播(没有检测到病毒)，而对照布里斯班(Brisb)/10病毒确实传播。
图51的图显示了用A/加利福尼亚、A/珀斯(Perth)和B/布里斯班(brisbane) 病毒鼻内地(IN)、肌肉内地(IM)和真皮内地(ID FGN)接种疫苗的受试者中的IgG 滴度。
图52的图显示了肌肉内地(IM)或真皮内地(ID FGN)施用激发剂量或激发和 加强剂量的A/珀斯(H3N2)疫苗的受试者中的IgG滴度。
图53的图显示了在接种后0、30和60天在通过肌肉内(IM)和真皮内(ID) 递送接种FluLaval:A/加利福尼亚/7/2009NYMC X-181、A/维多利亚/210/2009 NYMC X-187(A/珀斯/16/2009-样病毒)和B/布里斯班/60/2008的豚鼠中的病毒滴 度。
图54的图显示了免疫接种越南/1203/2004病毒以后5个月攻击的、H5N1 M2KO(ΔTM)接种疫苗的受试者的存活百分比。
图55的图显示了免疫接种越南/1203/2004病毒以后4周攻击的、H5N1 M2KO(ΔTM)接种疫苗的受试者的存活百分比。
具体实施方式
I.定义
在本文中使用以下术语，提供所述术语的定义用于引导。
除非明确地阐明仅表示单数，否则本文中使用的单数形式“一个”、“一种” 和“所述”表示单数和复数。
术语“约”和一般范围的应用（不论是否用术语约限定）是指，包括的数字不 限于在本文中阐述确切数字，且意图表示在不脱离本发明的范围的情况下基本 上在举例的范围内的范围。本文中使用的“约”会被本领域的普通技术人员理解， 且在一定程度上随它所应用的上下文而变化。如果本领域的普通技术人员在它 所应用的上下文下不清楚该术语的应用，“约”是指特定术语的至多加或减10%。
本文中使用的“受试者”和“患者”互换使用，且表示动物，例如，任意脊椎动 物物种的成员。本文公开的主题的方法和组合物对于温血脊椎动物（包括哺乳 动物和禽类）而言是特别有用的。示例性的受试者可以包括：哺乳动物诸如人 类，以及由于将要绝种而重要的、经济上重要的(在农场中饲养的动物，用于人 类消费)和/或对于人类在社会上重要的(作为宠物或在动物园中饲养的动物)哺乳 动物和禽类。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述 受试者不是人。
本文中使用的术语“有效量”或“治疗有效量”或“药学有效量”表示，足以实现 期望的治疗和/或预防效果的量，例如，导致疾病、病症和/或其征状的预防的量。 在治疗或预防应用的背景下，施用给受试者的组合物的量将取决于疾病的类型 和严重程度以及个体的特征，诸如一般健康、年龄、性别、体重和对组合物药 物的耐受性。还将取决于疾病或病症的程度、严重程度和类型。技术人员将能 够根据这些和其它因素确定适当的剂量。在某些实施方案中，施用多次剂量。 额外地或可替换地，在某些实施方案中，施用多个治疗组合物或化合物(例如， 免疫原性组合物，诸如疫苗)。
本文中使用的术语“分离的”和/或“纯化的”表示核酸(例如，载体或质粒)、多 肽、病毒或细胞的体外制备、分离和/或纯化，使得它不伴有不希望的体内物质， 或者从通常与其一起存在的不希望的体内物质中基本上纯化。例如，在某些实 施方案中，通过体外培养和繁殖得到分离的病毒制品，且其基本上不含有其它 感染性病原体。本文中使用的“基本上不含有”是指，使用该化合物或试剂的标准 检测方法，低于特定化合物（诸如不希望的核酸、蛋白、细胞、病毒、感染性 病原体等）的检测水平。
本文中使用的术语“重组病毒”表示这样的病毒：其已经经过体外操作(例如， 使用重组核酸技术），以将变化引入病毒基因组和/或以将变化引入病毒蛋白。 例如，在某些实施方案中，重组病毒可以包括野生型、内源、核酸序列和突变 体和/或外源核酸序列。额外地或可替换地，在某些实施方案中，重组病毒可以 包括修饰的蛋白组分，诸如突变体或变体基质、血凝素、神经氨酸酶、核蛋白、 非结构蛋白和/或聚合酶蛋白。
本文中使用的术语“重组细胞”或“修饰的细胞”表示这样的细胞：其已经经过 体外操作(例如，使用重组核酸技术），以将核酸引入细胞中和/或以修饰细胞的 核酸。重组细胞的例子包括：携带外源性质粒、表达载体等的原核或真核细胞， 和/或包括对它们的细胞核酸的修饰(例如，在细胞基因组中的置换、突变、插入、 缺失等)的细胞。一种示例性的重组细胞是，已经经过体外操作以表达外源性蛋 白（诸如病毒M2蛋白）的细胞。
本文中使用的术语“突变体”、“突变”、和“变体”互换使用，且表示与野生型 序列不同的核酸或多肽序列。在某些实施方案中，突变体或变体序列是天然存 在的。在其它实施方案中，重组地和/或化学地引入突变体或变体序列。在某些 实施方案中，核酸突变包括：对RNA和/或DNA序列的修饰(例如，添加、缺失、 置换)。在某些实施方案中，稀释包括化学修饰(例如，甲基化)，且也可以包括 天然的和/或非天然的核苷酸的置换或添加。核酸突变可以是沉默突变(例如，一 个或多个核酸变化，其编码与野生型序列相同的氨基酸)，或者可以导致编码的 氨基酸的变化，产生终止密码子，或者可以引入剪接缺陷或剪接改变。对编码 序列的核酸突变也可以导致保守的或非保守的氨基酸变化。
本文中使用的术语“vRNA”表示这样的RNA：其包含病毒基因组，包括分段 的或未分段的病毒基因组，以及正链和负链病毒基因组。vRNA可以是完全内源 的和“野生型”，和/或可以包括重组体和/或突变体序列。
本文中使用的术语“宿主细胞”表示，诸如病毒等病原体可以在其中复制的细 胞。在某些实施方案中，宿主细胞是体外培养的细胞(例如，CHO细胞、Vero 细胞、MDCK细胞等)。额外地或可替换地，在某些实施方案中，宿主细胞是体 内的(例如，被感染的脊椎动物诸如禽或哺乳动物的细胞)。在某些实施方案中， 可以修饰宿主细胞，例如，以增强病毒生产，诸如通过增强宿主细胞的病毒感 染，和/或通过增强病毒的生长速率。作为例子，但是不作为限制，示例性的宿 主细胞修饰包括：在宿主细胞的细胞表面上重组表达2-6-连接的唾液酸受体，和 /或在已经被造成病原体或病毒缺失或无效的宿主细胞中重组表达蛋白。
本文中使用的术语“感染”表示，携带疾病或病原体，诸如病毒。感染可以是 故意的，诸如通过施用病毒或病原体(例如，通过疫苗接种)，或非故意的，诸如 通过病原体从一个生物体向另一个生物体的自然转移，或从被污染的表面向生 物体的自然转移。
如本文中使用的，与病毒结合使用的术语“减毒的”表示这样的病毒：其与未 减毒的相应物相比具有降低的毒力或致病性，但是仍然是可存活的或活的。通 常，与未减毒病毒相比，减毒会使得感染性病原体（诸如病毒）对受感染的受 试者的有害性或毒力更低。这不同于杀死的或完全灭活的病毒。
如本文中使用的，与病毒结合使用的术语“型”和“株”互换使用，且用于泛指 具有不同特征的病毒。例如，甲型流感病毒是与乙型流感病毒不同类型的病毒。 同样地，甲型流感H1N1是与甲型流感H2N1、H2N2和H3N2不同类型的病毒。 额外地或可替换地，在某些实施方案中，可以将不同类型的病毒（诸如甲型流 感H2N1、H2N2和H3N2）称作“亚型”。
本文中使用的“M2KO”或“M2KO(ΔTM)”表示SEQ ID NO:1、含有SEQ ID NO:1的病毒、或包含含有SEQ ID NO:1的病毒的疫苗，取决于它所应用的上下 文。例如，在描述本文中证实的M2基因的突变时，“M2KO”或“M2KO(ΔTM)” 表示SEQ ID NO:1。在描述疫苗的病毒组分时，“M2KO”或“M2KO(ΔTM)”表示 这样的重组流感病毒：其具有PR8的内部6个基因(核蛋白(NP)、聚合酶基因(PA、 PB1、PB2)、非结构(NS)、基质(M))，但是其不表达功能性M2蛋白。在描述疫 苗时，“M2KO”或“M2KO(ΔTM)”表示包含M2KO(ΔTM)重组病毒的疫苗。
本文中使用的“M2KO(ΔTM)病毒”包括这样的重组流感病毒：其具有PR8的 内部6个基因(核蛋白(NP)、聚合酶基因(PA、PB1、PB2)、非结构(NS)、基质(M))， 但是其不表达功能性M2蛋白，无论是单独的还是与其它病毒组分和/或编码其 它病毒组分的基因相组合。在某些实施方案中，所述M2KO(ΔTM)病毒包含其它 流感病毒的基因。在某些实施方案中，所述病毒包含甲型流感/布里斯班/10/2007- 样A/乌拉圭/716/2007(H3N2)的HA和NA基因。在某些实施方案中，所述 M2KO(ΔTM)病毒包含A/越南/1203/2004(H5N1)病毒的HA和NA基因。在某些 实施方案中，所述M2KO(ΔTM)病毒包含A/加利福尼亚/07/2009(CA07)(H1N1pdm)病毒的HA和NA基因。
II.甲型流感病毒
A.概述
流感是美国成年人死亡的主要原因。流感的致病菌是正粘病毒科的病毒， 包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒，其中甲型流感是在人类中 最常见的和最有毒的。
甲型流感病毒是有包膜的负链RNA病毒。甲型流感病毒的基因组被包含在 8个单独的(未成对的)RNA链上，其补体编码11种蛋白(HA、NA、NP、M1、 M2、NS1、NEP、PA、PB1、PB1-F2、PB2)。总基因组大小为约14，000个碱 基。该基因组的分段性质允许在细胞同居过程中在不同病毒株之间交换整个基 因。8个RNA区段如下。1)HA编码血凝素(需要约500个血凝素分子才能构成 1个病毒粒子)；2)NA编码神经氨酸酶(需要约100个神经氨酸酶分子才能构成 1个病毒粒子)；3)NP编码核蛋白；4)M使用得自相同RNA区段的不同读码框 编码2种蛋白(M1和M2)(需要约3000个M1分子才能构成1个病毒粒子)； 5)NS使用得自相同RNA区段的不同读码框编码2种蛋白(NS1和NEP)；6)PA 编码RNA聚合酶；7)PB1使用得自相同RNA区段的不同读码框编码RNA聚合 酶和PB1-F2蛋白(诱导细胞凋亡)；8)PB2编码RNA聚合酶。
存在几种甲型流感亚型，它们根据H数目(对于血凝素型)和N数目(对于神 经氨酸酶型)命名。目前，存在16种不同的已知H抗原(H1至H16)和9种不同 的已知N抗原(N1至N9)。每个病毒亚型已经突变成具有不同致病特性的多种株； 一些对一个物种是致病性的，但是其它不是致病性的，一些对多个物种是致病 性的。已经在人类中证实的示例性的甲型流感病毒亚型包括、但不限于：H1N1， 其造成“西班牙流感”和2009年的猪流感爆发；H2N2，其造成二十世纪50年代 后期的“亚洲流感”；H3N2，其造成二十世纪60年代后期的香港流感；H5N1， 通过它在2000年中期的传播，造成全球流感大范围流行威胁；H7N7；H1N2， 其目前在人类和猪中流行；和H9N2，H7N2，H7N3，H5N2，H10N7。
鉴定了一些甲型流感变体，并如下命名：根据它们的最类似的已知分离物， 且因而假定共享谱系(例如，福建流感病毒-样)；根据它们的典型宿主(例如人流 感病毒)；根据它们的亚型(例如H3N2)；和根据它们的致病性(例如LP，低致病 性的)。因而，与分离物A/福建/411/2002(H3N2)类似的病毒引起的流感可以被称 作福建流感、人流感和H3N2流感。
另外，有时根据所述株在其中流行或适应的物种(宿主)来命名流感变体。使 用该惯例命名的主要变体是：禽流感、人流感、猪流感、马流感和犬流感。还 已经根据它们在家禽（特别是鸡）中的致病性来命名变体，例如，低致病性的 禽流感(LPAI)和高致病性的禽流感(HPAI)。
B.生命周期和结构
流感病毒的生命周期通常包括：与细胞表面受体结合，进入细胞和病毒核 酸脱壳，随后病毒基因在细胞内复制。合成病毒蛋白和基因的新拷贝以后，这 些组分装配成后代病毒颗粒，所述颗粒随后离开细胞。不同的病毒蛋白在这些 步骤的各步中起作用。
甲型流感颗粒由包囊病毒核心的脂质包膜构成。包膜的内侧衬有基质蛋白 (M1)，而外表面的特征在于2类糖蛋白刺突：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。 M2（一种跨膜离子通道蛋白）也是脂质包膜的一部分。参见例如，图1。
HA蛋白（一种三聚体I型膜蛋白）负责结合宿主细胞表面糖蛋白或糖脂上 的唾液酸寡糖(含有与半乳糖连接的末端唾液酸的寡糖)。该蛋白也负责在通过胞 吞而内化病毒粒子以后病毒和宿主细胞膜之间的融合。
神经氨酸酶(NA)（一种四聚体II型膜蛋白）是从宿主细胞与HA和NA的 糖缀合物切割末端唾液酸残基的唾液酸酶，且因而被公认为受体破坏酶。该唾 液酸酶活性是后代病毒粒子从宿主细胞表面的有效释放以及后代聚集的阻止 （由于病毒的HA与其它糖蛋白的结合活性）所必需的。因而，HA的受体结合 活性和NA的受体破坏活性可能作为抗衡起作用，从而允许流感的有效复制。
基因组区段被包装进病毒颗粒的核心。RNP(RNA+核蛋白，NP)是呈螺旋 形式，3个病毒聚合酶多肽与每个区段结合。
流感病毒生命周期起始于HA与宿主细胞表面上的含唾液酸受体的结合， 其后是受体介导的胞吞。图1。晚期核内体的低pH会触发HA的构象转换，由 此暴露出HA2亚基的N端(所谓的融合肽)。融合肽启动病毒和胞内体膜的融合， 并且基质蛋白(M1)和RNP复合物释放到细胞质内。RNP由将vRNA壳体化的核 蛋白(NP)以及由PA、PB1和PB2蛋白形成的病毒聚合酶复合物组成。RNP被转 运到细胞核中，在此发生转录和复制。RNA聚合酶复合物催化3个不同的反应： (1)合成具有5′帽和3′聚腺苷酸结构的mRNA、(2)合成全长互补RNA(cRNA)，和(3)使用cDNA作为模板合成基因组vRNA。随后，将新合成的vRNA、NP 和聚合酶蛋白装配成RNP，从细胞核输出，转运到质膜，在此发生后代病毒颗 粒的出芽。神经氨酸酶(NA)蛋白如下在感染后期起作用：从唾液酸寡糖除去唾 液酸，由此从细胞表面释放出新装配的病毒粒子，并阻止病毒颗粒的自我聚集。 尽管病毒装配涉及蛋白-蛋白相互作用和蛋白-vRNA相互作用，但是这些相互作 用的性质很大程度上还是未知的。
C.M2蛋白的作用
如上所述，3种蛋白跨病毒膜：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和M2。HA 和NA的细胞外结构域(胞外结构域)是高度可变的，而M2的胞外结构域在甲型 流感病毒中是基本上不变的。不希望受理论的约束，在甲型流感病毒中，认为 M2蛋白（其具有离子通道活性）在病毒生命周期的早期阶段在宿主细胞穿透和 病毒RNA脱壳之间起作用。一旦病毒粒子经过胞吞作用，认为病毒粒子-相关 的M2离子通道(一种同源四聚体螺旋束)会允许质子从核内体流到病毒粒子内 部，以破坏酸不稳定的M1蛋白-核糖核蛋白复合物(RNP)相互作用，从而促进 RNP释放到细胞质中。另外，在其HA被细胞内切割的某些流感株(例如A/禽瘟 疫/Rostock/34)中，认为M2离子通道会升高跨高尔基体网络的pH，从而避免在 此隔室中由低pH条件引起的HA的构象变化。还证实了M2跨膜结构域自身可 以充当离子通道。认为M2蛋白离子通道活性在流感病毒的生命周期中是必不可 少的，因为已经证实，阻断M2离子通道活性的盐酸金刚烷胺会抑制病毒复制。 但是，尚未直接证实该活性在甲型流感病毒复制中的必要条件。M2蛋白的结构 显示在图2中。M2蛋白的核酸序列以及M1序列显示在图3中。
尽管乙型和丙型流感病毒在结构上和在功能上类似于甲型流感病毒，但是 存在一些差异。例如，乙型流感病毒没有具离子通道活性的M2蛋白。相反， NB蛋白（NA基因的产物）可能具有离子通道活性，且因而具有甲型流感病毒 M2蛋白的类似功能。类似地，丙型流感病毒也没有具离子通道活性的M2蛋白。 但是，丙型流感病毒的CM1蛋白可能具有该活性。
III.M2病毒突变体
在一个方面，公开了携带突变体M2vRNA序列的甲型流感病毒。通常，这 样的突变体不具有M2离子通道活性，表现出减弱的体内生长性能，不可产生感 染性后代，且在受感染的受试者中是非致病性的或表现出减少的发病机制。突 变体病毒是免疫原性的，并且当用作疫苗时，会提供对抗相应野生型和/或其它 致病性病毒的感染的保护。另外，不论使用何种宿主细胞，本文中公开的M2 突变体是稳定的，且不会突变以表达功能性的M2多肽。额外地或可替换地，在 某些实施方案中，在没有可检测地改变它的功能的情况下，产生这些突变体的 M1蛋白。在某些实施方案中，携带突变体M2核酸序列的病毒不可在宿主细胞 中复制，而对应的野生型病毒可以在所述宿主细胞中繁殖。作为例子，但是不 作为限制，在某些实施方案中，所述野生型病毒可以在培养的MDCK细胞、CHO 细胞和/或Vero细胞中生长、繁殖和复制，而携带突变体M2序列的对应病毒不 可在相同类型的细胞中生长、繁殖或复制。
如上面所指出的，在某些实施方案中，所述M2突变体病毒是稳定的，且不 会在宿主细胞中突变或恢复成野生型或编码功能性M2蛋白的非野生型序列。例 如，在某些实施方案中，所述M2突变体病毒可在宿主细胞中稳定2代、3代、 5代、10代、12代、15代、20代、25代或超过25代。在某些实施方案中，所 述宿主细胞是未修饰的宿主细胞。在其它实施方案中，所述宿主细胞是经修饰 的宿主细胞，诸如表达M2蛋白的MDCK细胞。
在某些实施方案中，所述M2突变体包括一个或多个核酸置换和/或缺失。 在某些实施方案中，所述突变局部化在编码以下的一个或多个的核酸中：M2蛋 白的细胞外结构域，M2蛋白的跨膜结构域，和/或M2蛋白的细胞质尾巴。额外 地或可替换地，在某些实施方案中，一个或多个核酸突变会产生M2肽的剪接变 体、一个或多个终止密码子和/或一个或多个氨基酸缺失。在某些实施方案中， 携带突变体M2核酸的病毒产生无功能的M2多肽。在某些实施方案中，携带突 变体M2核酸的病毒不产生M2多肽。在某些实施方案中，携带突变体M2核酸 的病毒产生截短的M2多肽。在某些实施方案中，截短的M2多肽具有氨基酸序 列MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID NO:4)。
在下面的表1-3中提供了3个示例性的、非限制性的M2病毒突变体(M2-1、 M2-2和M2-3)。在所述表中，小写字母对应于M2序列；大写字母对应于M1 序列；用粗体下划线显示突变体序列(例如，终止密码子、剪接缺陷)。M2-2突 变体中标有下划线的(小写字体)字母指示在M2-1和M2-3突变体中缺失的区域。
从该突变体产生的M2多肽序列如下：
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD.(SEQ ID NO:4)。
从该突变体没有产生M2多肽序列。
从该突变体没有产生M2多肽序列。
额外地或可替换地，在某些实施方案中，将M2突变引入细胞质尾巴中。图 2。M2蛋白细胞质尾巴是感染性病毒生产的介质。在某些实施方案中，M2细胞 质尾巴的截短会导致感染性病毒滴度的下降、包装的病毒RNA的量的减少、芽 殖事件的下降和芽殖效率的下降。已经证实，对于基因组包装而言，5’序列比3’ 序列更重要，并且较长的5’序列对于基因组包装而言是较佳的。另外，研究已 经证实，核苷酸长度是重要的，但是实际序列不太重要(随机序列足以产生病毒)。 稳定的M2细胞质尾巴突变体的开发已经成为挑战性的，并且文献包括突变体恢 复的众多例子。
例如，Pekosz等人JVI,2005;79(6):3595-3605在氨基酸位置70处用终止密 码子替代2个密码子，但是病毒不久恢复。另一个示例性的M2细胞质尾巴突变 被称作M2del11。在M2del11突变体中，从细胞质尾巴的羧基末端删除11个氨 基酸残基。该截短是由于2个终止密码子的引入，且没有产生全长M2多肽。尽 管该突变体当在表达M2的MDCK细胞(M2CK)中传代时是稳定的，它在正常 MDCK细胞中的传代过程中恢复成全长M2(J Virol.200882(5):2486-92)。不希 望受理论的约束，恢复可能在MDCK细胞的选择压力下发生。
另一种M2细胞质尾巴突变体M2Stop90ala78-81没有降低病毒滴度，但是 ala70-77却降低(JVI2006;80(16)p8178-8189)。丙氨酸扫描实验进一步指示，在 M2尾巴的位置74-79处的氨基酸在病毒粒子形态发生中起作用，且影响病毒的 侵染性(J Virol.200680(11):5233-40)。
因此，本文中提供了新颖的细胞质突变体，其具有与上述的那些不同的特 征。例如，在某些实施方案中，所述细胞质突变体在MDCK细胞中是稳定的(不 会恢复成表达全长M2多肽)。在某些实施方案中，所述细胞质突变体在宿主细 胞中稳定2代、3代、5代、10代、15代、20代、25代或超过25代。
在下面表4中显示了野生型M2多肽。对于每个序列，粗体文字指示跨膜结 构域。细胞外结构域是在前面(左)，继之以跨膜结构域(中心)和细胞质尾巴序列 (右)。
制备了M2-4(M2del FG#1)，但是不可在正常MDCK细胞中传代，但是可 在修饰的宿主细胞(例如，表达野生型M2多肽的细胞)中传代。制备了M2-5 (M2del FG#2)和M2-6(FG#3)，并在正常MDCK细胞中传代。这些病毒的M基 因的核苷酸序列在MDCK细胞中至少稳定至第10代。可以繁殖这些突变体， 并也在其它细胞中传代(例如，支持流感复制的细胞)。还发现，这些突变体不是 减毒的，且是致病性的。
如在下面的实施例中所述，本文描述的M2突变体病毒在雪貂模型中不会在 呼吸道中复制或者传播至其它器官，且不会在雪貂模型中传播。包含M2突变体 的疫苗在哺乳动物中引起稳健的免疫应答，且保护哺乳动物免于流感病毒攻击。 M2KO病毒在小鼠中引起体液和粘膜免疫应答，并且保护小鼠免于致命的同亚 型和杂亚型攻击。如本文中所述的包含M2突变体病毒的疫苗会提供针对流感攻 击的有效保护，且具有在哺乳动物宿主中减毒的优点。这些发现证实，本文描 述的M2突变体病毒可用于抗流感疫苗。
IV.基于细胞的病毒生产系统
A.生产“第一代”突变体病毒
通过如Neumann等人,Generation of influenza A viruses entirely fromclone cDNAs,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:9345-9350(1999)（其通过引用整体并入本 文）所述的基于质粒的反求遗传学，可以制备突变体病毒，诸如携带突变体M2 核酸的那些。简而言之，用一个或多个编码8个病毒RNA的质粒转染真核宿主 细胞。每个病毒RNA序列侧接RNA聚合酶I启动子和RNA聚合酶I终止子。 值得注意的是，编码M2蛋白的病毒RNA包括突变体M2核酸序列。另外用一 个或多个编码病毒蛋白(例如，聚合酶、核蛋白和结构蛋白，包括野生型M2蛋 白)的表达质粒转染宿主细胞。用病毒RNA质粒对宿主细胞的转染会导致所有8个流感病毒RNA的合成，其中之一携带突变体M2序列。共转染的病毒聚合酶 和核蛋白将病毒RNA装配成功能性的vRNP，后者进行复制和转录，最终形成 具有突变体M2核酸序列的感染性流感病毒，其仍然具有掺入病毒脂质包膜中的 功能性的M2多肽。
生产“第一代”突变体病毒的替代方法包括核糖核蛋白(RNP)转染系统，其允 许用体外制备的重组RNA分子替代流感病毒基因，如Enami和Palese, High-efficiencyformation of influenza virus transfectants,J.Virol.65(5):2711-2713 （其通过引用并入本文）所述。
在体外合成病毒RNA，并用病毒核蛋白(NP)和聚合酶蛋白包被RNA转录 物，所述聚合酶蛋白在转染的细胞中充当生物活性的RNP，如Luytjes等人, Amplification,expression,and packaging of a foreign gene by influenza virus,Cell 59:1107-1113（其通过引用并入本文）所证实的。
可以将RNP转染方法分成4个步骤：1)RNA的制备：在体外转录反应中将 编码流感病毒区段的质粒DNA转录成负义RNA；2)RNA的衣壳化：然后将转 录的RNA与分离自破碎的流感病毒的梯度纯化的NP和聚合酶蛋白混合，以形 成生物活性的RNP复合物；3)衣壳化的RNA的转染和援救：将人工核糖核衣 壳转染至预先用辅助流感病毒感染的细胞，所述辅助流感病毒含有得自要援救 的RNA的不同基因；所述辅助病毒将扩增转染的RNA；4)转染的基因的选择： 因为辅助病毒和含有援救的基因的转染子是在培养物上清液中，使用抗体的适 当选择系统是分离携带转染的基因的病毒所必需的。
所述选择系统允许制备具有特定生物和分子特征的新颖转染子流感病毒。 针对靶表面蛋白的抗体选择然后可以用于阳性或阴性选择。
例如，可以在合适的哺乳动物细胞系中培养含有不表达M2蛋白的M2基因 的转染子或突变体病毒，所述细胞系已经被修饰以稳定地表达野生型功能性M2 蛋白。为了防止或抑制表达野生型M2基因、并因此在膜表面处表达M2e蛋白 的辅助病毒的复制，可以使用抗M2e的抗体。这样的抗体是商购可得的，且会 抑制辅助病毒的复制，并允许含有突变体M2的转染子/突变体病毒生长和富集 在上清液中。M2e抗体对流感病毒复制的抑制以前已经描述在：Influenza A virus M2protein:monoclonal antibody restriction of virusgrowth and detection of M2in virions,J Virol62:2762-2772(1988)和Treanor等人,Passively transferred monoclonal antibody to the M2protein inhibits influenzaA virus replication in mice, J.Virol.64:1375-1377(1990)。
额外地或可替换地，相同的抗体可以用于‘捕获’辅助病毒，并允许富集转染 子。例如，可以用抗体包被组织培养皿的底部，或者可以用在柱矩阵中，以允 许富集上清液或洗脱液中的转染子。
通过有限稀释可以在多孔平板内的表达M2的细胞中培养转染子病毒，然后 鉴别和克隆，例如，通过制备复制平板。例如，含有培养的病毒的多孔板的给 定孔的一半等分试样可以用于感染MDCK细胞，并可以用另一半感染表达M2 蛋白的MDCK细胞。转染子病毒和辅助病毒都会在表达M2蛋白的MDCK细胞 中生长。但是，仅辅助病毒会在标准的MDCK细胞中生长，从而允许鉴别多孔 板中含有转染子的孔。可以在表达M2蛋白的细胞中进一步噬斑纯化转染子病 毒。
B.繁殖病毒突变体
在某些实施方案中，在宿主细胞中维持和传代本文描述的病毒突变体。作 为例子，但是不作为限制，适合用于培养流感病毒突变体（诸如甲型流感病毒 突变体）的示例性宿主细胞包括任意数目的真核细胞，包括、但不限于 Madin-Darby犬肾细胞(MDCK细胞)、猿猴细胞诸如非洲绿猴细胞(例如，Vero 细胞)、CV-1细胞和恒河猴肾细胞(例如，LLcomk.2细胞)、牛细胞(例如，MDBK 细胞)、猪细胞、雪貂细胞(例如，貂肺细胞)BK-1细胞、啮齿动物细胞(例如， 中国仓鼠卵巢细胞)、人细胞例如胚胎人视网膜细胞(例如，)、293T人胚胎肾细胞和禽细胞（包括胚胎成纤维细胞）。
额外地或可替换地，在某些实施方案中，修饰真核宿主细胞以增加病毒生 产，例如，通过增加宿主细胞的病毒感染和/或通过增加病毒生长速率。例如， 在某些实施方案中，修饰宿主细胞以在细胞表面上表达2,6-连接的唾液酸或增加 其表达，从而允许突变型或野生型甲型流感病毒对这些细胞的更高效和有效的 感染。参见例如，美国专利公开号2010-0021499和美国专利号7,176,021，通过 引用整体并入本文。因而，在某些示例性实施方案中，使用被修饰成表达2,6- 唾液酸转移酶基因(ST6GAL1)的至少1个拷贝的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞) 和/或Vero细胞。作为例子，但是不作为限制，由登录号BC040009.1表示的智 人ST6β-galatosamideα-2,6-唾液酸转移酶基因序列是可以掺入CHO细胞中并由CHO细胞表达的ST6Gal基因的一个例子。可以将编码功能性的ST6Gal I基因 产物的多核苷酸的一个或多个拷贝工程构建进细胞中。也就是说，可以使用已 经被稳定地转化以表达ST6Gal I基因的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7 个、8个、9个、10个、11个、12个或超过12个拷贝的细胞。单个表达盒可以 包括要表达的ST6Gal I基因的一个或多个拷贝，其可操作地连接至调节元件， 诸如启动子、增强子和终止子和聚腺苷酰化信号序列，以促进ST6Gal I基因或 它的拷贝的表达。可替换地，可以将单个表达盒工程改造成表达ST6Gal I基因 的1个拷贝，并将多个表达盒整合进宿主细胞基因组中。因此，在某些实施方 案中，将至少一个ST6Gal I基因整合进宿主细胞的基因组中，使得所述细胞表 达ST6Gal I基因和它的酶蛋白产物。取决于拷贝数，单个宿主细胞可以表达许 多功能性的ST6Gal I基因蛋白。
对于克隆、转染和生产稳定的经修饰的细胞系而言合适的载体是本领域众 所周知的。一个非限制性例子包括pcDNA3.1载体(Invitrogen)。
额外地或可替换地，在某些实施方案中，修饰真核宿主细胞以生产野生型 形式的突变体病毒基因，由此将所述基因反向提供给病毒。例如，当在生产野 生型M2蛋白的宿主细胞中传代时，携带突变体M2蛋白的病毒株可以表现出增 加的生长速率(例如，更大的病毒生产)。在某些实施方案中，携带突变体M2蛋 白的病毒株可能不会在不表达野生型M2基因的细胞中生长或复制。另外，这样 的宿主细胞可能减慢或阻止病毒恢复成功能性的M2序列，因为，例如，在这样 的宿主中不存在恢复的选择压力。
用于生产表达载体和经修饰的宿主细胞的方法是本领域众所周知的。例如， 通过将下面的M2核酸序列(M2ORF序列；这是“野生型”M2的起始密码子至终 止密码子(表5))放置在真核表达载体中，可以制备M2表达载体。
然后可以通过本领域已知的方法，例如，使用商购可得的试剂和试剂盒， 诸如(Mirus Bio,Madison,WI)，转染宿主细胞(例如，MDCK细胞)。 作为例子，但是不作为限制，可以如下选择细胞并针对M2表达进行试验：通过 用可检测的标志物或选择标记(例如，潮霉素抗性)共转染，和/或通过例如使用 M2抗体用间接免疫染色法进行筛选。通过间接免疫染色法、流式细胞计量术或 ELISA，可以确定M2表达。
作为例子，但是不作为限制，分别在补充了10%胎牛血清的Dulbecco氏改 良的伊格尔培养基中和在含有5%新生小牛血清的最低必需培养基(MEM)中， 维持293T人胚胎肾细胞和Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞。在37℃在5%CO2中维持所有细胞。通过用含有潮霉素抗性基因的质粒pRHyg和表达全长M2蛋 白的质粒pCAGGS/M2以1:1的比例共转染，建立稳定地表达得自A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的M2蛋白的潮霉素抗性的MDCK细胞。通过使用抗-M2(14C2) 单克隆抗体用间接免疫染色法进行筛选(Iwatsuki等人,JVI,2006,第80卷,第1期,第5233-5240页)，在含有0.15mg/mL潮霉素(Roche,Mannheim,德国)的培 养基中选择表达M2的稳定MDCK细胞克隆(M2CK)。在补充了10%胎牛血清 和0.15mg/mL潮霉素的MEM中培养M2CK细胞。在M2CK细胞中，M2的表 达水平和局部化类似于在病毒感染的细胞中的那些(数据未显示)。以类似的方式 可以制备表达M2的Vero细胞。
在某些实施方案中，通过本领域众所周知的方法，培养和繁殖细胞和病毒 突变体。作为例子，但是不作为限制，在某些实施方案中，在有补充了10%胎 牛血清的MEM存在下，培养宿主细胞。通过用PBS洗涤，然后在37℃吸附病 毒，以0.001的MOI感染表达M2的细胞。在某些实施方案中，加入含有胰蛋 白酶/TPCK的病毒生长培养基，并将细胞温育2-3天，直到观察到细胞病变效应。
与这些系一起，已经为哺乳动物细胞（有或没有病毒）开发了一次用弃的 生物反应器系统，其益处包括更快的设备安装和减少的交叉污染的风险。例如， 可以在一次用弃的袋中培养本文描述的细胞，所述袋例如得自Stedim,Bioeaze 的袋、得自SAFCBiosciences的袋、得自Cellexus Biosytems的HybridBagTM、 或得自HyClone的一次性使用的生物反应器或得自Lonza的Celltainer。生物反 应器可以是1L、10L、50L、250L、1000L尺寸形式。在某些实施方案中，在 经过优化的不含动物产品的无血清培养基中悬浮维持细胞。所述系统可以是： 补料分批系统，其中可以在例如1L至10L的单个袋中扩增培养物；或灌注系 统，其允许恒定地供给营养物，并同时避免潜在有毒副产物在培养基中的积累。
为了长期贮存，可以将突变体病毒作为冷冻储备物进行储存。
V.疫苗和施用方法
A.免疫原性组合物/疫苗
从本文中公开的基于细胞的病毒生产系统，可以制备多种不同类型的疫苗。 本公开内容包括、但不限于：活减毒病毒疫苗、灭活的病毒疫苗、全病毒疫苗、 裂解的病毒疫苗、病毒体病毒疫苗、病毒表面抗原疫苗和它们的组合的制备和 生产。因而，存在众多能够产生对不同流感病毒特异性的保护性免疫应答的疫 苗，其中这些疫苗类型中的任一种的适当制剂能够产生免疫应答，例如，全身 性免疫应答。活减毒病毒疫苗具有也能够刺激呼吸道中的局部粘膜免疫的优点。
在某些实施方案中，在本文描述的组合物中使用的疫苗抗原是“直接”抗原， 即它们不是作为DNA施用，而是抗原本身。这样的疫苗可以包括全病毒或病毒 的仅一部分，例如，但不限于病毒多糖，无论它们是单独的还是与载体元件缀 合，所述载体元件例如载体蛋白、活的减毒的完整微生物、灭活的微生物、重 组肽和蛋白、糖蛋白、糖脂、脂肽、合成肽或裂解的微生物，在疫苗的情况下， 被称作“裂解”疫苗。
在某些实施方案中，提供了全病毒粒子疫苗。可以通过超滤浓缩全病毒粒 子疫苗，然后通过区带离心或通过色谱法进行纯化。通常，在纯化之前或之后， 使用例如福尔马林或β-丙内酯灭活病毒粒子。
在某些实施方案中，提供了包含纯化的糖蛋白的亚单位疫苗。可如下制备 这样的疫苗：使用经去污剂处理而片段化的病毒混悬液，通过例如超速离心而 纯化表面抗原。因此，亚单位疫苗主要含有HA蛋白，也含有NA。所用的去污 剂可以是：阳离子去污剂，例如十六烷基三甲基溴化铵；阴离子去污剂，例如 脱氧胆酸铵；或非离子去污剂，例如商品名为TRITON X100的去污剂。也可以 在用蛋白酶（诸如菠萝蛋白酶）处理病毒粒子后分离血凝素，然后通过标准方 法进行纯化。
在某些实施方案中，提供了裂解疫苗，其包含已经用溶解脂质的试剂处理 过的病毒粒子。可如下制备裂解疫苗：在搅拌下，用脂质溶剂（例如乙醚或氯 仿）以及去污剂处理如上获得的、灭活的或未灭活的纯化病毒的水性悬浮液。 病毒包膜脂质的溶解会导致病毒颗粒的片段化。回收含裂解疫苗的水相，所述 裂解疫苗主要由血凝素和神经氨酸酶(其原有的脂质环境被去除)以及核心或它 的降解产物组成。然后，如果之前尚未经过灭活，则将残留的感染性颗粒灭活。
在某些实施方案中，提供了灭活的流感病毒疫苗。在某些实施方案中，通 过用已知方法灭活病毒来制备灭活的疫苗，所述方法例如但不限于福尔马林或 β-丙内酯处理。可用于本发明中的灭活疫苗类型可以包括全病毒(WV)疫苗或亚 病毒粒子(SV)(裂解)疫苗。WV疫苗含有完整的灭活病毒，而SV疫苗含有用去 污剂（其溶解含脂质的病毒包膜）破坏、接着化学灭活残余病毒的纯化病毒。
额外地或可替换地，在某些实施方案中，提供了活的减毒的流感病毒疫苗。 根据已知方法步骤，这样的疫苗可以用于预防或治疗流感病毒感染。
在某些实施方案中，根据已知方法(参见，例如，Murphy,Infect.Dis.Clin.Pract.2,174(1993))，通过将得自减毒供体病毒的减毒基因转移到分离物或重配 的病毒，在单个步骤中实现减毒。在某些实施方案中，通过一个或多个病毒核 酸序列的突变而使病毒减毒，从而产生突变体病毒。例如，在某些实施方案中， 所述突变体病毒核酸序列编码有缺陷的蛋白产物。在某些实施方案中，所述蛋 白产物具有减少的功能或没有功能。在其它实施方案中，不从突变体病毒核酸 生产蛋白产物。
因此，可根据已知方法将所述病毒减毒或灭活、配制并作为免疫原性组合 物(例如，作为疫苗)施用，以在动物(例如，禽和/或哺乳动物）中诱导免疫应答。 用于确定这样的减毒或灭活疫苗是否维持与临床分离物或由其衍生的高生长株 相似的抗原性的方法是本领域众所周知的。这样的已知方法包括：利用抗血清 或抗体消除表达供体病毒的抗原决定簇的病毒；化学选择(例如金刚烷胺或金刚 乙胺)；HA和NA活性和抑制；以及DNA筛选(诸如探针杂交或PCR)，以证实 在减毒病毒中不存在编码所述抗原决定簇的供体基因(例如，HA或NA基因)或 其它突变体序列(例如，M2)。参见，例如，Robertson等人,Giornale diIgiene e Medicina Preventiva,29,4(1988);Kilbourne,Bull.M2World Health Org.,41,643 (1969)；和Robertson等人,Biologicals,20,213(1992)。
在某些实施方案中，所述疫苗包括不表达功能性M2蛋白的减毒流感病毒。 在某些实施方案中，所述突变体病毒在表达M2蛋白的细胞中较好地复制，但是 在对应的野生型细胞中，表达病毒蛋白，而不产生感染性的后代病毒粒子。
适合用于真皮内施用、接种或胃肠外或口服施用的本发明的药物组合物包 含减毒的或灭活的流感病毒，且可以任选地进一步包含无菌的水性或非水性溶 液、混悬液和乳剂。所述组合物可以进一步包含本领域已知的助剂或赋形剂。 参见，例如，Berkow等人,TheMerck Manual,第15版,Merck and Co.,Rahway, N.J.(1987);Goodman等人,编,Goodmanand Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,第8版,Pergamon Press,Inc.,Elmsford,N.Y.(1990);Avery's Drug Treatment:Principles and Practice ofClinical Pharmacology and Therapeutics,第3 版,ADIS Press,LTD.,Williams andWilkins,Baltimore,Md.(1987)；和Katzung,编, Basic and Clinical Pharmacology,第5版,Appleton and Lange,Norwalk,Conn. (1992)。
在某些实施方案中，用于胃肠外施用的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、 混悬液和/或乳剂，其可含有本领域已知的助剂或赋形剂。非水性溶剂的例子为 丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)以及可注射的有机酯（例如油酸乙酯）。 载体或封闭敷料可用于增加皮肤透过性并增强抗原吸收。用于口服施用的液体 剂型通常可以包括含有脂质体溶液的液体剂型。适合用于悬浮脂质体的形式包 括乳剂、混悬液、溶液、糖浆剂和酏剂，其含有本领域常用的惰性稀释剂，例 如净化水。除了惰性稀释剂外，这样的组合物还可以包含佐剂、润湿剂、乳化 剂和助悬剂、或者甜味剂、矫味剂或芳香剂。
当本发明的组合物用于施用给个体时，其可以进一步包含盐、缓冲剂、佐 剂或对于提高所述组合物的效力而言需要的其它物质。对于疫苗来说，可以使 用佐剂，即增强特异性免疫应答的物质。通常，在呈现给免疫系统之前将佐剂 和组合物混合在一起，或者分开呈现，但是呈现在待免疫的生物体的相同部位。
在某些实施方案中，本文中公开的免疫原性组合物(例如，疫苗)包括多种不 同类型的病毒或病毒抗原，其中的至少一种包括突变体M2基因(例如，包含 M2KO(ΔTM)(SEQ IDNO:1)突变的病毒)和/或在该病毒的M2功能等效物(例 如，乙型流感的NB蛋白，或丙型流感的CM1蛋白)中的对应突变。在其它实 施方案中，所述免疫原性组合物包括单一类型的病毒或病毒抗原，其包括突变 体M2基因(例如，包含M2KO(ΔTM)(SEQ ID NO:1)突变的病毒)和/或在该病毒 的M2功能等效物(例如，乙型流感的NB蛋白，或丙型流感的CM1蛋白)中的 对应突变。例如，在某些实施方案中，免疫原性组合物（诸如疫苗组合物）中 的主要组分包括：一种或多种甲型、乙型或丙型流感病毒，或它们的任意组合， 或得自这些病毒的抗原的任意组合，其中至少一种病毒包括突变体M2基因(例 如，包含M2KO(ΔTM)(SEQ ID NO:1)突变的病毒)和/或在该病毒的M2功能等 效物(例如，乙型流感的NB蛋白，或丙型流感的CM1蛋白)中的对应突变。例 如，在某些实施方案中，在免疫原性组合物(例如，疫苗)中提供3种类型中的至 少2种、不同亚型中的至少2种、相同类型中的至少2种、相同亚型中的至少2 种、或不同的分离物或重配株。作为例子，但是不作为限制，人甲型流感病毒 包括H1N1、H2N2和H3N2亚型。在某些实施方案中，所述免疫原性组合物(例 如，疫苗)包括：包含突变体M2基因(例如，包含M2KO(ΔTM)(SEQ ID NO:1)突 变的病毒)和/或在该病毒的M2功能等效物(例如，乙型流感的NB蛋白，或丙型 流感的CM1蛋白)中的对应突变的病毒，和约0.1-200μg（例如，10-15μg）得 自进入所述组合物中的每个病毒株的血凝素。通过混合至少2个流感病毒株（诸 如2-50个病毒株或其间的任意范围或值）的重复流感病毒，可以在疫苗中提供 异质性。在某些实施方案中，使用具有现代抗原组成的甲型或乙型流感病毒株。 另外，使用本领域已知的技术，可以为单个流感病毒株中的变异提供免疫原性 组合物(例如，疫苗)。
在某些实施方案中，所述疫苗包含这样的病毒：其包含M2KO(ΔTM)(SEQ ID NO:1)突变以及其它病毒组分和/或表达其它病毒组分的基因。在某些实施方 案中，所述疫苗(例如，包含M2KO(ΔTM)(SEQ ID NO:1)突变的病毒)包含得 自其它病毒株的基因，包括、但不限于，例如，得自其它病毒株的HA和NA基 因。在某些实施方案中，所述疫苗包含得自人甲型流感病毒亚型H5N1、H1N1、 H2N2或H3N2的HA和NA基因。在某些实施方案中，所述疫苗包含得自例如 PR8x布里斯班/10/2007、A/越南/1203/2004或A/加利福尼亚/07/2009(CA07)病 毒的HA和NA基因。
根据本发明的药物组合物可以进一步或另外包含至少一种化疗化合物，例 如用于基因治疗的免疫抑制剂、抗炎剂或免疫刺激剂，或抗病毒剂，包括、但 不限于，γ球蛋白、金刚烷胺、胍、羟基苯并咪唑、干扰素-α、干扰素-β、干扰 素-γ、肿瘤坏死因子-α、缩氨基硫脲类、美替沙腙、利福平、利巴韦林、嘧啶类 似物、嘌呤类似物、膦甲酸、膦酰基乙酸、阿昔洛韦、二脱氧核苷、蛋白酶抑 制剂或更昔洛韦。
所述组合物还可含有可变的、但小量的无内毒素的甲醛和防腐剂，其已被 发现是安全的，并且在给其施用所述组合物的生物体中不会促成不希望的作用。
B.施用
通过疫苗常规使用的或推荐的途径（非肠道途径、粘膜途径）中的任一种， 可以施用本文中公开的免疫原性组合物(例如，疫苗)，且可以呈不同的形式：可 注射的或可喷射的液体，已经冷冻干燥的或通过雾化干燥的或风干的制剂，等。 借助于注射器或借助于用于肌肉内、皮下或真皮内注射的无针注射器，可以施 用疫苗。还可以借助于能够将干粉或液体喷雾递送至粘膜（不论它们是鼻粘膜、 肺粘膜、阴道粘膜还是直肠粘膜）的喷雾器来施用疫苗。
本文中公开的疫苗可以通过被动免疫接种或者主动免疫接种而赋予针对一 种或更多种流感株的抗性。在主动免疫接种中，给宿主(例如哺乳动物)预防性 地施用灭活的或减毒的活疫苗组合物，宿主的针对所述施用的免疫应答会保护 免于感染和/或疾病。对于被动免疫接种，可以回收激发的抗血清，并将其施用 给疑似具有至少一种流感病毒株引起的感染的受体。
因此，本发明包括用于预防或缓解疾病或障碍(例如，由至少一种流感病毒 株引起的感染)的方法。如本文中使用的，如果疫苗的施用会引起疾病的征状或 病况的全部或部分缓解(即抑制)，或使个体产生针对该疾病的全部或部分免疫， 则认为该疫苗会预防或缓解疾病。
通过达到预期目的的任何方式，使用如前所述的药物组合物，可以施用本 发明的至少一种灭活的或减毒的流感病毒或其组合物。例如，这样的组合物的 施用可以是通过各种胃肠外途径，诸如皮下的、静脉内的、真皮内的、肌肉内 的、腹膜内的、鼻内的、口服的或透皮的途径。可采用快速推注或随着时间梯 度灌注进行胃肠外施用。在某些实施方案中，本文中公开的免疫原性组合物是 通过肌肉内或皮下施用。
在某些实施方案中，用于预防、抑制或治疗流感病毒相关病理的方案包括： 施用有效量的如本文中所述的疫苗组合物，其作为单次治疗施用，或者在1周 至约24个月(包括端值)之间的周期内或者其间的任何范围或值内作为加强或增 强剂量重复施用。在某些实施方案中，每年施用本文中公开的流行性感冒疫苗。
根据本发明，疫苗组合物的“有效量”是足以达到期望的生物学效应的量。应 当理解，在某些实施方案中，有效剂量将取决于受体的年龄、性别、健康和重 量、并行治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和所期望的作用的性质。下面提供 的有效剂量的范围无意成为限制性的，且代表示例性的剂量范围。因而，在某 些实施方案中，将为个别受试者定制剂量，这是本领域技术人员理解的且可确 定的。用于成年哺乳动物(例如，人)的减毒病毒疫苗的剂量可为约约103-107噬 斑形成单位(PFU)或其间的任何范围或值。灭活疫苗的剂量范围可为约0.1-200 （例如，50μg）血凝素蛋白。但是，使用现有疫苗作为起始点，通过常规方法 确定，所述剂量应当是安全且有效的量。
C.皮内递送
传统上鼻内递送活流感疫苗，以模仿天然的感染途径和促进对天然病毒感 染的类似免疫应答。作为一个替代方案，本文中公开了真皮内递送方法，其包 括使用新颖的微型针装置来利用真皮内递送的免疫学益处。在某些实施方案中， 在用于真皮内施用的疫苗组合物中使用减毒病毒(例如，M2病毒突变体)。在某 些实施方案中，在疫苗中提供M2病毒突变体，其不产生感染性后代病毒。因而， 基本上消除了野生型循环流感病毒重配的任何潜力。
在本文中公开的实施方案中，真皮内递送(皮内)将疫苗施用至皮肤。在某些 实施方案中，使用微型针递送装置执行真皮内递送。如在本文中公开的，皮内 递送具有众多优点。例如，通过触发皮肤免疫系统的免疫学潜力，增强疫苗的 免疫原性。所述疫苗可直接接近有效的呈递抗原的皮肤树突细胞，即，表皮的 朗格汉斯细胞和真皮的树突细胞。皮肤细胞会产生促炎信号，所述信号增强对 穿过皮肤引入的抗原的免疫应答。此外，皮肤免疫系统会产生抗原特异性的抗 体和细胞免疫应答。考虑到上述因素，当皮内递送时，真皮内递送允许疫苗剂 量减小，即，更低剂量的抗原可能是有效的。
并且，因为通过所述装置的微型针阵列将疫苗递送至皮肤，会减少非故意 的针刺风险，与使用常规针和注射器的肌肉内注射相比，经由微型针阵列的皮 内疫苗递送是相对无痛的。
微型针装置是本领域已知的，包括、例如，在公开的美国专利申请 2012/0109066、2011/0172645、2011/0172639、2011/0172638、2011/0172637和 2011/0172609中描述的那些。微型针装置可以例如如下制成：通过湿法蚀刻从 不锈钢片(例如，Trinity BrandIndustries,Georgia;SS304;50μm厚)制造。在某些 实施方案中，单个微型针具有约500μm至1000μm（例如，约750μm）的长度 和约100μm至500μm（例如，约200μm）的宽度。然后可以将疫苗作为涂层施 加于微型针。作为例子，但是不作为限制，涂层溶液可以包括1%(w/v)羧甲基 纤维素钠盐(低粘度，美国药典级;Carbo-Mer,San Diego CA)、0.5%(w/v)Lutrol F-68NF(BASF,Mt.Olive,NJ)和抗原(例如，5ng/ml的可溶性的HA蛋白；活的 减毒病毒诸如本文描述的M2突变体病毒等)。为了达到更高的疫苗浓度，可以 将涂层溶液在室温(～23℃)蒸发5-10分钟。可以通过浸渍涂布法执行涂布。可以 如下确定每行微型针的疫苗的量：将微型针浸没在200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS) 中5分钟，并通过本领域已知的方法测定抗原。
在某些实施方案中，使用主要由聚丙烯和不锈钢粗切割(first-cut)块制成的微型针装置，所述块用简单的搭扣配合和热封配合在一起。在某些实施方案中， 所述装置是完全自含式的，且包括疫苗、泵机构、活化机构和微型针单元。这 些组分被隐藏在塑料罩内。利用所述装置，通过按压致动按钮来启动疫苗输注。 按压所述按钮会同时将微型针插入皮肤中，并启动泵送机构，后者在主要药物 容器上施加压力。当弹簧机构在疫苗蓄池上施加足够的压力时，疫苗开始流过 微型针阵列并进入皮肤中。在某些实施方案中，在装置致动以后约2分钟内完 成疫苗剂量的递送。输注结束以后，从皮肤轻轻除去装置。
在某些实施方案中，提供了一种使用微型针装置皮内施用免疫原性组合物 (例如，疫苗)的方法。在某些实施方案中，所述微型针装置包括穿刺机构和免疫 原性组合物层，其包括多个能够刺穿皮肤和允许免疫原性组合物皮内施用的微 型针。在某些实施方案中，所述方法包括压迫所述穿刺机构。在某些实施方案 中，所述免疫原性组合物(例如疫苗)包含病毒，所述病毒包含编码被表达的突 变体M2蛋白或不被表达的突变体M2蛋白的核酸序列；其中所述表达的突变体 M2蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，所 述微型针阵列最初位于装置壳体的内部，并在杆致动后，允许微型针延伸穿过 装置底部并插入皮肤中，由此允许疫苗流体输注进皮肤中。
本文描述的递送装置可以用于递送可能期望的任意物质。在一个实施方案 中，要递送的物质是药物，且递送装置是被构造成给受试者递送药物的药物递 送装置。本文中使用的术语“药物”意图包括为了任何治疗、预防或医学目的而递 送给受试者的任意物质(例如，疫苗、药物、营养物、营养制品等)。在一个这样 的实施方案中，所述药物递送装置是被构造成给受试者递送一定剂量的疫苗的 疫苗递送装置。在一个实施方案中，所述递送装置被构造成递送流感疫苗。在 本文中讨论的实施方案主要涉及被构造成经皮地递送物质的装置。在某些实施 方案中，所述装置可以被构造成将物质直接地递送至除了皮肤以外的器官。
实施例
尽管用甲型流感证实了下述实施例，应当理解，本文描述的突变和方法同 样适用于表达M2、M2-样蛋白或具有与甲型流感M2蛋白相同或类似的功能的 蛋白的其它病毒。
实施例1：M2病毒突变体的制备
如下构建M2突变体。
a)M2-1：M2胞外结构域+2个终止密码子+TM缺失(PR8M区段+2个停 止(786-791)没有792-842(TM))
使用如下所示的寡物集合1和寡物集合2，通过PCR从PR8扩增部分野生 型M基因。
表6
寡物集合1
acacacCGTCTCTAGgatcgtctttttttcaaatgcatttacc (SEQ ID NO: 10)
CACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT (SEQ ID NO: 11)
寡物集合2
acacacCGTCTCatcCTATTAatcacttgaaccgttgc(SEQ ID NO: 12)
CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGTAG (SEQ ID NO: 13)
然后用BsmBI消化PCR产物。还用BsmBI消化表达载体(pHH21)，并使用 T4DNA连接酶将消化的PCR产物连接进载体。用该载体转化大肠杆菌细胞， 并在适当的温育以后，通过本领域已知的方法分离和纯化载体。通过核酸测序， 表征载体的突变体M2部分。
b)M2-2：M2胞外结构域+2个停止+剪接缺陷(PR8M区段+2个停止 (786-791)+剪接缺陷核苷酸51)
使用下面显示的引物集合，通过PCR从PR8扩增部分野生型M基因。
表7
PCR引物
5’acacacCGTCTCcCTACGTACTCTCTATCATCCCG(SEQ ID NO: 14)
5’CACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT(SEQ ID NO: 15)
然后用BsmBI消化PCR产物。还用BsmBI消化表达载体(pHH21)。然后通 过退火下面显示的2种核苷酸，制备双链DNA片段。
表8
退火核苷酸
5’GGGAGCAAAAGCAGGTAGATATTGAAAGatgagtcttctaaccgaggtcgaaac (SEQ ID NO: 16)
5’GTAGgtttcgacctcggttagaagactcatCTTTCAATATCTACCTGCTTTTGC (SEQ ID NO: 17)
然后使用T4 DNA连接酶连接经消化的载体、PCR产物和双链片段。用该 载体转化大肠杆菌细胞，并在适当的温育以后，通过本领域已知的方法分离和 纯化载体。通过核酸测序，表征载体的突变体M2部分。
c)M2-3:M2胞外结构域+2个停止+剪接缺陷+TM缺失(PR8M区段+2 个停止(786-791)没有792-842(TM)+剪接缺陷核苷酸51)
使用下述引物，通过PCR从PR8扩增部分M2-1突变体(M2胞外结构域+2 个终止密码子+TM缺失(PR8M区段+2个停止(786-791)没有792-842(TM))：
表9
PCR引物
5’acacacCGTCTCcCTACGTACTCTCTATCATCCCG(SEQ ID NO:18)
5’CACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT(SEQ ID NO:19)
然后用BsmBI消化PCR产物。还用BsmBI消化表达载体(pHH21)。然后通 过退火下面显示的2种核苷酸，制备双链DNA片段。
表10
退火核苷酸
5’GGGAGCAAAAGCAGGTAGATATTGAAAGatgagtcttctaaccgaggtcgaaac(SEQ ID NO:20)
5’GTAGgtttcgacctcggttagaagactcatCTTTCAATATCTACCTGCTTTTGC(SEQ ID NO:21)
然后使用T4DNA连接酶连接经消化的载体、PCR产物和双链片段。用该 载体转化大肠杆菌细胞，并在适当的温育以后，通过本领域已知的方法分离和 纯化载体。通过核酸测序，表征载体的突变体M2部分。
在表1-3中提供了3种M2突变体构建体中的每一种的序列。
实施例2：M2突变体病毒的制备和培养
本实施例证实了包含M2KO(ΔTM)(SEQ ID NO:1)突变的PR8病毒的培养。 如在Neumann等人,Generation of influenza A viruses entirely from clone cDNAs,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:9345-9350(1999)中所报道的，经过一些修改，制备 突变体病毒。简而言之，用17种质粒转染293T细胞：针对8种RNA区段的8 种PolI构建体，其中之一携带突变体M2序列；和针对如下5种结构蛋白的9 种蛋白表达构建体：NP(pCAGGS-WSN-NP0/14)；M2(pEP24c)；PB1 (pcDNA774)；PB2(pcDNA762)；和A/Puerto Rico/8/34(H1N1)病毒的PA (pcDNA787)。
将质粒与转染试剂(2μL(Mirus,Madison,Wis.)/μg DNA)混 合，在室温温育15-30分钟，并加入1x106个293T细胞中。48小时后，将上清 液中的病毒系列稀释，并接种进M2CK细胞中。接种后2-4天，将最后稀释孔 （其中细胞表现出明显的细胞病变效应(CPE)）内的上清液中的病毒接种进 M2CK细胞，用于生产储备病毒。将制备的病毒的M基因测序，以证实预期的 突变的基因和存在，并确保不存在不希望的突变。
如下培养和传代突变体M2病毒。在有补充了10%胎牛血清的MEM存在下， 培养M2CK宿主细胞。通过用PBS洗涤，然后在37℃吸附病毒，以0.001的 MOI感染细胞。加入含有胰蛋白酶/TPCK的病毒生长培养基，并将细胞温育2-3 天，直到观察到细胞病变效应。
实施例3：正常细胞中的M2KO复制受限
在正常MDCK细胞和稳定地表达M2蛋白的MDCK细胞(M2CK)中，分析 了具有M2KO(ΔTM)(SEQ ID NO:1)突变的PR8病毒和野生型PR8的生长动力 学。以10-5的感染复数，用病毒感染细胞。在MDCK或M2CK细胞中确定细胞 上清液的病毒滴度。野生型PR8在两种细胞类型中生长至高滴度，而M2KO仅 在M2CK细胞中较好地生长，且在MDCK细胞中根本不生长(图4)。
实施例4：M2KO病毒在正常细胞中产生病毒抗原，但是不产生M2
本实施例证实，具有M2KO(ΔTM)(SEQ ID NO:1)突变的PR8 病毒在正常细胞中产生病毒抗原，但是不产生M2蛋白。通过在不含 胰蛋白酶(以确保病毒仅完成1个生命周期)的培养基中用野生型 PR8或M2KO以0.5的感染复数(MOI)感染野生型MDCK细胞，评 价了病毒蛋白表达。在4-12％SDS-PAGE凝胶上分离细胞裂解物中 的病毒蛋白，并使用PR8感染的小鼠血清(组A)或抗-M2单克隆抗体 (14C2,Santa Cruz Biotechnology)(组B)通过蛋白质印迹进行检测。图 5表明，针对PR8的抗血清检测到PR8和M2KO的类似蛋白表达水 平(组A)。当用抗-M2单克隆抗体探测裂解物时(组B)，仅在PR8感 染的细胞中检测到M2表达，在M2KO中未检测到。这些结果指示， M2KO病毒以与PR8病毒类似的水平表达除了M2蛋白以外的所有 病毒蛋白(图5)。
实施例5：M2突变体是体内减毒的
进行一项实验来证实，M2突变体病毒是体内减毒的。给6周龄BALB/c雌 性小鼠(23只/组)鼻内地接种下述突变体之一：如在J.Virol(2009)83:5947-5950 中描述的M2KO(yk)；M2-1(TM del M2KO aka M2KO(ΔTM))和M2-2(Splice def M2KO)(共同地称作“M2KO变体”)。以1.2x104pfu/小鼠的剂量施用突变体。给 对照组的小鼠施用PBS。接种后针对体重的任何变化和感染征状观察小鼠14天。 另外，接种后3天以后，从每组3只小鼠的肺和鼻甲(NT)获取病毒滴度。
如图6所示，接种M2KO变体和PBS的小鼠在14天时段内没有表现出感 染的任何临床症状，也没有减轻任何体重。在14天时段内，组之间的体重的变 化是相当的。另外，在从肺和NT收集的滴度中，没有检测到病毒。临床症状的 缺乏、体重减轻的缺乏和病毒的缺乏一起指示，M2突变体病毒在小鼠中是减毒 的且非致病性的。
实施例6：M2突变体诱导针对流感病毒的抗体和保护小鼠免于致命性病毒攻击
还进行试验以确定得自上面实施例5中描述的小鼠的抗体滴度和在用致命 性病毒剂量攻击以后它们的存活。在接种以后3周采集血清样品，并通过酶联 免疫吸附测定(ELISA)来确定得自血清样品的抗-病毒IgG抗体滴度。体液应答显 示在图7中，该图表明，所有3种M2突变体升高了抗-流感病毒抗体，高于PBS 对照组。
另外，在接种后28天用相同量的M2突变体病毒强化每组内的一半小鼠。 然后在第一次接种以后6周收集血清，并确定针对病毒的IgG滴度。如图7B所 示，用M2突变体病毒强化的小鼠具有比未强化的小鼠更高水平的抗-流感病毒 抗体。
在第一次接种以后49天(强化以后3周)，用致死剂量的PR8病毒攻击小鼠 (40只小鼠50%致死剂量(MLD50))。如图8和图9所示，用M2KO变体接种疫苗 的所有小鼠度过了攻击且没有减轻重量。但是，仅施用PBS的对照小鼠减轻体 重，且没有活过攻击日以后8天。在攻击以后第3天，得到肺和NT，并通过菌 斑测定在MDCK细胞中确定病毒滴度。如表11中所示，M2KO变体中的肺病 毒滴度比原初对照PBS中的滴度低至少1个对数，且在M2KO变体组的鼻甲中 几乎没有检测到病毒，但是在原初对照PBS组中检测到超过100,000PFU/g，这 指示，M2突变体疫苗会赋予保护和限制攻击病毒的复制。
表11：攻击以后小鼠组织中的病毒滴度(log10PFU/g)
肺 鼻甲
M2KO(yk) 6.1,5.9,ND 1.7,ND,ND
M2KO(ΔTM) 5.8±0.25 2.5,ND,ND
M2KO(splice def) ND,ND,ND ND,ND,ND
PBS 7.9±0.27 5.3±0.55
在另一个实验中，在免疫接种后6周，用同亚型或杂亚型流感病毒攻击 M2KO(ΔTM)组。用Aichi(H3N2)病毒攻击小鼠，并针对存活评分14天。杂亚 型攻击的结果显示在图16中。
实施例7：真皮内疫苗递送
进行实验来证实，真皮内疫苗递送/免疫会保护受试者免于流感。以每只小 鼠1.8x101、1.8x102、1.8x103或1.8x104pfu(50μl)的浓度，给6-7周龄的BALB/c 雌性小鼠(5只/组)(Harland Laboratories)鼻内地(IN)、肌肉内地(IM)或真皮内地 (ID)接种PR8病毒(3.5x107pfu)。还通过3种不同的施用途径，给对照小鼠施用 PBS。接种后监测体重和存活14天。对于小鼠实验，使用具有真皮内斜角针头 的变态反应注射器。
使用常规针头和注射器，通过肌肉内或皮下注射施用大多数疫苗。但是， 最近的研究证实，真皮内疫苗递送会实现比肌肉内或皮下施用更好的免疫原性。 真皮内疫苗接种会将抗原直接地递送至富集的皮肤免疫系统，且已经被证实对 多种疫苗（包括狂犬病、乙型肝炎和流感）而言是有效的。真皮内递送也可以 提供剂量减小，从而使用比肌肉内注射所需更少的疫苗实现相同的免疫应答。 用于真皮内递送(使用常规针头和注射器)的当前现有技术是芒图技术，其需要 大量训练，难以执行，且经常导致错误方向的(皮下的)或不完全的施用。合适的 递送装置的缺乏已经阻碍了真皮内疫苗接种研究和产物开发，尽管已经记载了 利用该施用途径的优良免疫应答。
如表12所示，IN-接种的小鼠会在1.8x103和1.8x104pfu/小鼠的较高剂量发 生流感感染，仅在1.8x101的最低剂量具有完全存活。但是，IM-和ID-接种的小 鼠在所有剂量都存活。表13显示了IN-接种组的小鼠的半数致死剂量(MLD50)。 图10表明用1.8x104pfu的病毒IM-和ID-接种的小鼠没有表现出体重变化，且 表明用1.8x104pfu的病毒IN-接种的小鼠缺乏存活。
在接种后2周(图11A)和7周(图11B)收集血清，并评价抗-PR8IgG抗体（如 通过ELISA确定）。“Hi”代表1.8x104pfu接种，“Lo”代表1.8x101pfu。IN-、IM- 和ID-接种的小鼠在两个时间段的应答是类似的。在每个时间段，IN-接种的小 鼠呈现最高抗体数目。仅鉴别出用1.8x101pfu IN-接种的小鼠(即，“Lo”)，因为 至该时间，用更高剂量IN-接种的小鼠已经死亡。IM-和ID-接种的小鼠呈现比IN- 接种的小鼠更低水平的抗体，尽管与仅施用PBS的对照小鼠相比，在更高剂量 接种的小鼠表现出更大量的抗体。另外，真皮内施用途径随时间产生比肌肉内 途径更多的抗体，如通过图11B所示的更高滴度水平所证实的。
在另一个实验中，在疫苗接种以后8周，攻击IN-、IM-和ID-接种的小鼠组 (除了1.8x103组的4只小鼠以外，5只小鼠/组)。具体地，攻击1.8x101IN-接种 的小鼠、1.8x103IM-接种的小鼠、1.8x104IM-接种的小鼠、1.8x103ID-接种的小 鼠和1.8x104ID-接种的小鼠。将减轻它们的体重超过25%的小鼠安乐死。
如图12所示，100%的以1.8x103的剂量IM-接种的小鼠没有活过攻击后8 天。所有ID-接种的小鼠的存活率是在40%至60%之间。但是，以1.8x104IM- 接种的小鼠的存活率为100%。图13表明，ID-接种的和IM-接种的(1.8x104)小 鼠组具有最初的平均重量减轻，但是以相对于攻击日期的低重量减轻结束。
ID-接种的小鼠(1.8x104)的评价表明，2只小鼠(在图14和图15中的1和5) 引起了比其它小鼠更好的免疫应答，且另外没有发展流感感染的征状(例如，体 重减轻、不光滑的皮毛、安静等)。但是，在IM-接种组(1.8x104)中的所有小鼠表 现出一些征状，且减轻至少10%的体重。
实施例8：M2KO变体的稳定性
为了试验M2KO变体的M2基因在野生型细胞中的稳定性，在缺少M2蛋 白表达的野生型MDCK细胞以及M2CK细胞（其为表达M2蛋白的MDCK细 胞）中传代M2KO变体。所有M2KO变体都是可在M2CK细胞中传代的，在 至少第10代之前没有任何突变。尽管M2-1(TM delM2KO)、M2-2(Splice def M2KO)和M2-3(TM del+Splice def M2KO)不能在野生型MDCK细胞中传代 (在野生型MDCK细胞中没有观察到细胞病变效应(CPE))，M2KO(yk)甚至在 MDCK细胞中第4代以后表现出CPE。从野生型MDCK中的M2KO(yk)第4 代提取M区段RNA，并对cDNA测序。如表14所示，编辑了M2KO(yk)的2 个插入的终止密码子，并且野生型MDCK中的M2KO(yk)第4代具有全长M2 蛋白基因。
实施例9：M2KO疫苗接种
为了证实M2KO疫苗可以刺激与天然流感感染类似的免疫应答，进行了疫 苗实验。用PR8病毒的低接种物代表天然流感感染，并用通过标准的肌肉内途 径和鼻内途径递送的灭活PR8病毒(Charles River)代表标准的灭活流感疫苗。
用鼻内地和肌肉内地递送的活病毒(10pfu PR8)、包含M2KO(ΔTM)的PR8 病毒(104pfu)或1μg灭活的PR8病毒免疫6-7周龄BALB/c小鼠。鼻内地施用104个M2KO(ΔTM)的感染性颗粒的小鼠没有减轻重量，且没有表现出感染征象。此 外，在接种后3天，用M2KO(ΔTM)处理的小鼠的肺不含有可检测的感染性颗粒。 在第21天，从免疫小鼠得到血清，并通过标准ELISA测定确定针对血凝素的抗 体滴度。图17表明，与灭活的疫苗组相比，抗-HA IgG滴度在活病毒和 M2KO(ΔTM)组中是最高的。仅在活PR8或M2KO接种疫苗的小鼠的血清中检测到针对流感的粘膜IgA抗体。
免疫接种后6周，用同亚型(PR8,H1N1)或杂亚型(Aichi,H3N2)流感病毒攻 击所有组。M2KO和灭活的疫苗接种都会保护小鼠免于同亚型病毒感染(图18)。 但是，仅M2KO接种疫苗的小鼠被保护免于杂亚型病毒攻击(图19)。用灭活疫 苗免疫的小鼠发生与原初小鼠类似的感染。
实施例10：M2KO(ΔTM)病毒不会在呼吸道或其它器官中复制
概要-本实施例证实，M2KO(ΔTM)病毒不会在呼吸道中复制或者在雪貂模 型中扩散至其它器官。以1x107TCID50的剂量水平，将M2KO(ΔTM)病毒鼻内地 施用给3只雄性雪貂。作为对照，以1x107TCID50的剂量给第二组3只雄性雪 貂鼻内地施用A/布里斯班/10/2007(H3N2)甲型流感病毒。在病毒接种以后，针 对死亡率观察雪貂至接种后第3天，每天测量体重、体温和临床征象。在接种 后3天，对所有动物进行尸检。收集器官用于组织病理学和病毒滴度。
接受A/布里斯班/10/2007(H3N2)的对照组在接种后2天表现出重量的短暂 下降和体温的升高，这在M2KO(ΔTM)组中没有观察到。A/布里斯班/10/2007组 中的活性水平也下降，在感染后第2-3天观察到喷嚏。在M2KO(ΔTM)组中没有 观察到与病毒暴露有关的活性水平或临床征象的变化。组织病理学分析揭示了 暴露于甲型流感/布里斯班/10/2007(H3N2)的动物中的鼻甲的变化，所述变化没 有在暴露于M2KO(ΔTM)病毒的雪貂中观察到。向A/布里斯班/10/2007的暴露 会导致呼吸上皮的萎缩、嗜中性粒细胞的浸润和鼻甲的水肿。病毒接种没有影 响其它器官。在实验条件下，M2KO(ΔTM)病毒没有诱导感染的临床征象或导致 分析的器官的组织学变化。
材料和方法
A.疫苗材料和对照病毒：M2KO(ΔTM)病毒是这样的重组病毒：其具有PR8 的内部6个基因(核蛋白(NP)、聚合酶基因(PA、PB1、PB2)、非结构(NS)、基质 (M))，但是其不表达功能性M2蛋白，以及甲型流感/布里斯班/10/2007-样A/乌 拉圭/716/2007(H3N2)的HA和NA基因。A/布里斯班/10/2007(H3N2)野生型病 毒充当对照病毒，并由IITRI提供。在使用之前在-65℃冷冻保存该病毒。
B.试验物和阳性对照剂量制剂：通过将8μL1x1010TCID50/mL稀释进2.528 mL PBS中，制备每316μL的1x107TCID50/mL的M2KO(ΔTM)病毒施用溶液。 不经稀释地使用每316μL的1x107TCID50/mL滴度的A/布里斯班/10/2007 (H3N2)。
C.动物和动物护理：从Triple F Farms购买8只雄性雪貂，将6只雪貂用于 研究。在研究起始时，动物为大约4月龄。所述动物经过供应商检验为健康的， 且没有对感染性疾病的抗体。到达后，将动物单个地圈养在具有条板底的悬丝 笼子中，悬挂在衬纸的废物盘上面。在接收动物之前，根据接受的动物护理实 践和有关的标准操作规程，已经清洁和消毒动物房和笼子。随意供给Certified Teklad Global Ferret Diet#2072(Teklad Diets,Madison WI)和芝加哥城市自来水， 并至少每天1次地更新。将动物房中的荧光照明维持在12-小时光照/黑暗周期。 在研究过程中，动物室温度和相对湿度是在各自的方案限度内，且分别是在 22.0-25.0℃和33-56%的范围内。
D.动物隔离和随机化：将雪貂保持隔离5天，然后随机化，并每天观察。 基于指示动物的总体良好健康的每天观察，从隔离释放雪貂用于随机化和试验。 隔离以后，将雪貂称重，并使用计算机化的随机化操作，基于产生类似的组平 均值的体重，将其分配至治疗组[2.1.E.11版(PDS Pathology Data Systems,Inc.,Basel,瑞士)]。在一组内，所有体重是在它们的平均值的20%内。 为研究选择的动物通过耳标接受永久标识号，并且发射机应答器和各个笼子卡 片也通过各个编号和组鉴别研究动物。分配的鉴别编号在研究中是独有的。
E.实验设计：根据位于IIT Research Institute的动物护理和使用委员会批准的方案，在动物生物安全性水平-2设备中进行所有动物操作。将6只雄性雪貂 (Triple FFarms,Sayre PA)（在研究起始时4月龄）用于研究。在感染之前，监测 雪貂3天以测量体重和建立基线体温。每天通过皮下地植入每只雪貂中的发射 机应答器(BioMedic数据系统,Seaford,DE)记录温度读数。在研究起始之前通过 颈静脉收集血液，并针对流感抗体试验血清。将不含流感抗体的研究动物随机 化，并分成2组(3只雪貂/组)，如表15所示。将一组3只雪貂麻醉，并鼻内地 接种单次剂量的316μL的1x107TCID50的M2KO(ΔTM)病毒。给对照组(3只雪 貂)接种316μL的1x107TCID50的A/布里斯班/10/2007(H3N2)。每天观察雪貂， 以监测体重、体温和临床症状。在接种后第3天，将雪貂(3只雪貂/组)安乐死， 并尸检。收集下述组织样品：鼻甲、气管、肺、肾、胰腺、嗅球、脑、肝、脾、 小肠和大肠。用缓冲的中性福尔马林固定收集的样品的一部分用于组织学评价， 并将样品的另一部分在-65℃保存用于病毒滴定。
表15:免疫接种和样品收集计划
F.病毒接种：给雪貂接种M2KO(ΔTM)病毒或野生型A/布里斯班/10/2007 (H3N2)甲型流感病毒。将一瓶冷冻的储备物融化，并在磷酸盐缓冲盐水溶液中 稀释至适当的浓度。用氯胺酮/赛拉嗪麻醉雪貂，并以316μL（对于M2KO(ΔTM) 病毒）和316μL（对于A/布里斯班/10/2007(H3N2)病毒）的体积鼻内地施用病 毒剂量。为了证实A/布里斯班/10/2007(H3N2)病毒的接种滴度，在IITRI对制 备的病毒攻击溶液的一部分进行TCID50测定。根据Illinois Institute of Technology Research Institute(IITRI)标准操作规程，执行病毒滴度测定。
G.垂死率（Moribundity）/死亡率观察：攻击后，针对死亡率或垂死率的证 据每天2次地观察所有动物。在攻击后3天，观察动物。通过静脉内地施用的 剂量过量的150mg/kg戊巴比妥钠，将动物安乐死。
H.体重和体重变化：在接收时(随机的10%样品)、在随机化时(第-3至0天) 和病毒接种后每天，记录动物的体重。
I.临床观察：每天确定每只雪貂的温度变化(以摄氏度为单位)。每天评估临 床征象、食欲不振、呼吸征象（诸如呼吸困难、喷嚏、咳嗽和鼻漏）和活性水 平。使用基于Reuman,等人,“Assessment of signs of influenza illness in the ferret model,”J.Virol,Methods24:27-34(1989)描述的评分，如下评估活性水平：0，警 觉的和多趣的；1，警觉的，但是仅在受刺激时是多趣的；2，警觉的，但是在 受刺激时不是多趣的；和3，既不是警觉的，也不是在受刺激时多趣的。将相对 无活性指数(RII)计算为在研究期间每组雪貂每次观察(天)的平均评分。
J.安乐死：通过静脉内施用的150mg/kg戊巴比妥钠，将研究动物安乐死。 通过可观察的心搏和呼吸的缺失来确认死亡。对所有研究动物进行尸检。
K.尸检：收获鼻甲、气管、肺、肾、胰腺、嗅球、脑、肝、脾、小肠和大 肠。将每个组织的一部分在福尔马林中固定，并给其它部分施用IITRI杆用于冷 冻和贮存。收获的用于滴度的组织是：右鼻甲、气管的上部1/3、右颅侧肺叶、 右肾、胰腺的右分支(靠近十二指肠)、右嗅球、右脑、右侧肝叶、脾的右半(在 打开腹腔时看到的脾的末端)、小肠和大肠。
L.组织病理学分析：将组织包埋进石蜡块，以大约5-微米厚度切片，并用 苏木精和伊红(H&E)染色。
M.血清收集：疫苗接种前(第-3天)，从所有雪貂收集血清。用氯胺酮(25 mg/kg)和赛拉嗪(2mg/kg)混合物麻醉雪貂。经由腔静脉从每只雪貂收集血液样品 (大约0.5-1.0mL)，并处理成血清。将血液收集进Serum Gel Z/1.1试管(Sarstedt Inc. Newton,NC)，并在室温储存不超过1小时，然后收集血清。将Serum Gel Z/1.1 试管在10,000xg离心3分钟，并收集血清。收集各个接种前血清样品，并从每 个样品制备2个等分试样。在研究起始之前试验一个等分试样，以证实雪貂不 含有针对甲型流感病毒的抗体，并将一个血清等分试样在-65℃储存。
N.血凝集抑制(HI)测定：用受体破坏酶(RDE)(Denka Seiken,Tokyo,日本) 处理血清样品，以消除非特异性的血凝集的抑制剂。按照生产商的说明书，重 构RDE。将血清在RDE中1:3稀释，并在37℃±2℃水浴中温育18-20小时。加 入等体积的2.5%(v/v)柠檬酸钠以后，将样品在56±2℃水浴中温育30±5分钟。 在RDE处理后，将0.85%NaCl加入每个样品，至1:10的最终血清稀释度。然 后将经稀释的样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中一式两份稀释成4个2倍稀释度 (1:10至1:80)，然后与4个血凝单位的A/布里斯班/10/2007(H3N2)甲型流感病 毒一起温育。温育后，将0.5%鸡红血细胞加入每个样品，并温育。然后将血凝 集的存在或不存在评分。
O.病毒滴度：通过Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞中的TCID50，确定攻击 前和攻击后病毒接种物样品中的感染性病毒的浓度。简而言之，将在-65℃保存 的样品融化，并离心以除去细胞碎片。将得到的上清液在96-孔微孔滴定板内的 Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM)(Gibco,Carlsbad,CA,USA)中一式三 份地10倍稀释，所述DMEM含有青霉素/链霉素、0.1%庆大霉素、3%NaCO3、 0.3%BSA级分V(Sigma St.Louis,MO)、1%MEM维生素溶液(Sigma)和1%L- 谷氨酰胺(Mediatech,马纳萨斯,VA,USA)。在制备10倍系列稀释物以后，将100 L转移进96-孔板的各个孔中，所述孔含有单层MDCK细胞。在37℃±2℃、5±2% CO2、70%湿度温育平板。48小时以后，观察孔的细胞致病效应(CPE)。将得自 每个孔的上清液(50μl)转移至96孔板，并确定和记录血凝集(HA)活性。通过使 用0.5%填充的火鸡红血细胞(cRBC)的HA测定，评估上清液的HA活性。使用 Reed LJ和Muench H,“A simple method forestimating50%endpoints,”Am.J. Hygiene27:493-497(1938)的方法，计算TCID50滴度。
P.数据分析：确定每只单独动物的体重和体重增加(减轻)和体温的变化， 表达为每个试验组的平均值和平均值标准差。
结果
用M2KO(ΔTM)病毒或A/布里斯班/10/2007(H3N2)甲型流感病毒接种后， 监测雪貂的存活和感染临床征象。将结果呈现在表16A和16B中。所有雪貂度 过了M2KO(ΔTM)病毒和A/布里斯班/10/2007(H3N2)的感染。接种了A/布里斯 班/10/2007的雪貂在第2和3天呈现呼吸征象(喷嚏)。接种了A/布里斯班/10/2007 的雪貂的相对无活性指数为0.67；而接种了M2KO(ΔTM)的雪貂没有表现出活性 水平的下降，具有0.0的相对无活性指数。
病毒接种以后的体重和温度的变化显示在图20和图21中。用A/布里斯班 /10/2007(H3N2)接种后，在接种后第2天在所有动物中观察到2-3%体重减轻。 在接种了M2KO(ΔTM)病毒的雪貂中观察到轻微至零重量减轻。一只 M2KO(ΔTM)接种的雪貂在接种后第2天表现出1%的重量减轻。在接种后第2 天在接种了A/布里斯班10/2007的雪貂中观察到40.3-40.7℃的高体温。体温在 第3天恢复至正常范围。M2KO(ΔTM)接种的雪貂的体温在研究期间保持在正 常范围内。为了确定M2KO(ΔTM)病毒是否在呼吸道或其它器官中复制和诱导病 理学，在接种后第3天在组织学上检查雪貂的组织，并与得自接种了A/布里斯 班/10/2007的雪貂的那些组织进行对比。在接种了A/布里斯班/10/2007的雪貂 中，仅在鼻甲中观察到病理学。在鼻甲中观察到呼吸上皮的萎缩、嗜中性粒细 胞的浸润和水肿。在接种了M2KO(ΔTM)病毒的雪貂中，没有观察到与病毒感染 有关的组织病理学变化。攻击前和攻击后病毒施用溶液的浓度分别为107.5 TCID50/mL和107.75TCID50/mL，从而指示攻击材料在施用中的良好稳定性。
表16A：病毒接种对雪貂的存活和感染临床征象的影响.
a在病毒接种之前在雪貂血清中针对同源病毒的血凝集抑制(HI)抗体滴度。
b在病毒接种以后观察临床征象3天。除了嗜睡以外，将临床征象的发现给出为具有征象的雪貂的数目/总数。 呼吸征象包括喷嚏。
c基于评分系统每天2次地确定，持续观察3天，并计算为在3-天时段内每次观察(天)每组雪貂的平均评分。 接种之前的相对无活性指数为0。
表16B：M2KO(ΔTM)不会在第3天收获的雪貂呼吸器官中复制
结论
本实施例表明，在接种后第3天，M2KO(ΔTM)病毒没有诱导疾病的临床征 象或与野生型病毒感染有关的组织病理学变化。这表明，本技术的M2KO(ΔTM) 病毒可用于鼻内流行性感冒疫苗。
实施例11：M2KO(ΔTM)病毒相对于其它疫苗的免疫应答和保护作用
概要-本实施例证实了由M2KO(ΔTM)疫苗引起的免疫应答和该疫苗在雪 貂模型中的保护作用。以1x107TCID50的剂量水平，将M2KO(ΔTM)病毒鼻内地 施用给12只雄性雪貂。作为对照，以1x107TCID50的剂量，给第二组12只雄 性雪貂鼻内地施用FM#6病毒。给第三组雪貂施用OPTI-MEMTM作为安慰剂对 照。对于每个治疗组，使用仅激发或激发-强化疫苗接种方案。给接受激发-强化 疫苗接种方案的雪貂施用激发疫苗(第0天)，并在28天后(第28天)施用强化疫 苗接种。在给激发-强化雪貂施用加强疫苗的同一天(第28天)，给仅接受激发疫 苗的雪貂施用单次疫苗接种。每次疫苗接种以后，针对死亡率观察雪貂至接种 后14天，每天测量体重、体温和临床征象。在激发疫苗接种后第1、3、5、7 和9天，从雪貂收集鼻洗液，以观察病毒的脱落。每周从疫苗接种后的所有雪 貂收集鼻洗液和血清，以随时间评价抗体水平。
在第56天，用1x107TCID50的A/布里斯班/10/2007(H3N2)鼻内地攻击所 有动物。攻击后，针对死亡率监测雪貂至接种后14天，每天测量体重、体温和 临床征象。在攻击后第1、3、5、7、9和14天，从每组中的雪貂收集鼻洗液用 于病毒滴度。另外，在攻击后(第70天)从存活雪貂收集血清用于分析。在攻击 后3天，对每组3只雪貂进行尸检。收集器官用于组织病理学和病毒滴度。
在5组中没有观察到疫苗相关的不利事件。攻击以后，安慰剂对照组表现 出攻击后2天的体温增加和重量减轻。也在M2KO(ΔTM)和FM#6接种疫苗组中 观察到重量减轻；但是，所述减轻小于在OPTI-MEMTM组中观察到的减轻。活 性水平在任何组中没有降低；但是，在攻击后在所有组中观察到喷嚏。组织病 理学分析揭示，与OPTI-MEMTM对照组中的肺浸润相比，接种疫苗的雪貂的肺 中的混合细胞浸润的严重程度的增加。在鼻甲中，与OPTI-MEMTM对照组相比， 接受M2KO(ΔTM)或FM#6的激发或激发+强化方案的动物具有更低严重程度的呼吸上皮萎缩。使用M2KO(ΔTM)病毒的疫苗接种似乎会提供与FM#6病毒类似 的对抗病毒攻击的保护。
材料和方法
A.疫苗材料：M2KO(ΔTM)病毒是这样的重组病毒：其具有PR8的内部6 个基因(核蛋白(NP)、聚合酶基因(PA、PB1、PB2)、非结构(NS)、基质(M))，但 是其不表达功能性M2蛋白，以及甲型流感/布里斯班/10/2007-样A/乌拉圭 /716/2007(H3N2)的HA和NA基因。FM#6病毒是得自(2009-2010制剂) 的A/乌拉圭/716/2007(H3N2)甲型流感病毒的克隆#6。以316μL剂量的1x107 TCID50(50%组织培养物感染剂量)，将M2KO(ΔTM)病毒和FM#6病毒鼻内地 施用给动物。
B.试验物和阳性对照剂量制剂：通过将120μL1x109TCID50/mL稀释进 3.680mL PBS中，制备每316μL的1x107TCID50/mL的M2KO(ΔTM)病毒施用 溶液。通过通过将120μL1x109TCID50/mL稀释进3.680mL PBS中，制备每316μL 的1x107TCID50/mL滴度的FM#6病毒。
C.动物和动物护理：从Triple F Farms购买36只雄性雪貂，并将30只雪貂 用于研究。在研究起始时，动物为大约4月龄。所述动物经过供应商检验为健 康的，且没有对感染性疾病的抗体。到达后，将动物单个地圈养在具有条板底 的悬丝笼子中，悬挂在衬纸的废物盘上面。在接收动物之前，根据接受的动物 护理实践和有关的标准操作规程，已经清洁和消毒动物房和笼子。随意供给 Certified Teklad Global Ferret Diet#2072(TekladDiets,Madison WI)和芝加哥城市 自来水，并每周至少3次地更新。将动物房中的荧光照明维持在12-小时光照/ 黑暗周期。在研究过程中，动物室温度和相对湿度是在各自的方案限度内，且 分别是在20.0-25.0℃和30-63%的范围内。
D.动物隔离和随机化：将雪貂保持隔离7天，然后随机化，并每天观察。 基于指示动物的总体良好健康的每天观察，从隔离释放雪貂用于随机化和试验。 隔离以后，将雪貂称重，并使用计算机化的随机化操作，基于产生类似的组平 均值的体重，将其分配至治疗组[2.1.E.11版(PDS Pathology Data Systems,Inc.,Basel,瑞士)]。在一组内，所有体重是在它们的平均值的20%内。 为研究选择的动物通过耳标接受永久标识号，并且发射机应答器和各个笼子卡 片也通过各个编号和组鉴别研究动物。分配的鉴别编号在研究中是独有的。
E.实验设计：为了评估M2KO(ΔTM)疫苗效力，用M2KO(ΔTM)病毒、冷适 应的活减毒病毒(FM#6)免疫雪貂，或者用介质(OPTI-MEMTM)假免疫。监测动 物体重、体温和临床症状，并评价免疫学应答。将30只在研究起始时4月龄的 雄性雪貂(Triple F Farms,SayrePA)用于研究。根据位于IIT Research Institute的 动物护理和使用委员会批准的方案，在动物生物安全性水平-2或生物安全性水 平-3设备中进行所有动物操作。在接种之前，监测雪貂3天以测量体重和建立 基线体温。每天通过皮下地植入每只雪貂中的发射机应答器(BioMedic数据系统, Seaford,DE)记录温度读数。在研究起始之前收集血液，并针对流感抗体试验血 清。仅具有针对A/布里斯班/10/2007(H3N2)的HAI(血凝集抑制)滴度40的雪貂被认为是血清阴性的，并用在该研究中。将研究动物随机化，并分成5组(6 只雪貂/组)，如表17所示。2组(1&3)接受M2KO(ΔTM)病毒，2组(2&4)接受 FM#6病毒。用OPTI-MEMTM假免疫一组(5)。在每个疫苗组内，将雪貂分成2 个疫苗方案，6只仅接受激发疫苗接种(仅激发)，6只接受激发疫苗接种和激发 疫苗接种以后28天的加强疫苗(激发/强化)。激发/强化组：在第0和28天给雪 貂鼻内地接种单次剂量的316μL1x107TCID50的M2KO(ΔTM)病毒。在第0和28天给对照组鼻内地接种316μL1x107TCID50(与M2KO(ΔTM)相同剂量)的 FM#6或假接种316μL OPTI-MEMTM。每天监测雪貂体温、重量和临床症状至接 种后14天。在激发疫苗接种后第1、3、5、7、9和14天（用于细胞中的病毒 滴定）和在第21和49天（用于抗体滴定），从所有雪貂（包括OPTI-MEMTM对照组）收集鼻洗液。在-65℃保存鼻洗液样品。在接种前(第-3至-5天)和第7、 14、2135、42和49天，收集血液，并在-65℃保存血清，直到通过ELISA和 HI测定测量抗体滴度。
仅激发组：在第28天，给雪貂鼻内地接种单次剂量的316μL1x107TCID50的M2KO(ΔTM)病毒。在第28天，给对照组鼻内地接种316μL1x107TCID50(与 M2KO(ΔTM)相同剂量)的FM#6或假接种316μL OPTI-MEMTM。每天监测雪貂 体温、重量和临床症状至14天接种后。在第29、31、33、35、37和42天（用 于细胞中的病毒滴定）和第49天（用于抗体滴定），从所有雪貂收集鼻洗液。 在-65℃保存鼻洗液样品。在接种前(第23-25天)和第35、42和49天收集血液，并在-65℃保存血清，直到通过ELISA和HAI测定测量抗体滴度。在施用激发/ 强化疫苗以后4周，在第56天用316μL剂量的1x107TCID50的野生型A/布里斯 班/10/2007(H3N2)流感病毒攻击所有雪貂。监测雪貂体重、体温和临床症状至 攻击后14天，并收集鼻洗液和器官。在攻击后第1、3、5、7、9和14天(第57、 59、61、63、65和70天)，从攻击的雪貂收集鼻洗液，并在-65℃保存样品，用 于细胞中的病毒滴定。在攻击后第3天(第59天)，将动物(3只动物/组，共15只动物)安乐死，并收集下述组织样品：鼻甲、气管和肺。用缓冲的中性福尔马 林固定收集的样品的一部分用于组织学评价，并将样品的另一部分在-65℃储存 用于病毒滴定。在攻击后14天(第70天)收集血液，并将所有存活的动物安乐死。
表17：疫苗接种和样品收集计划
1以1x107TCID50的剂量鼻内接种
2仅从激发疫苗接种后的动物收集的鼻洗液
3从每组3只雪貂收集的器官(鼻甲、气管和肺)用于组织学和病毒滴度
F.病毒接种：给雪貂接种M2KO(ΔTM)病毒或FM#6甲型流感病毒。将一 瓶冷冻的储备物融化，并在磷酸盐缓冲盐水溶液中稀释至适当的浓度。用氯胺 酮/赛拉嗪麻醉雪貂，并以316μL（对于M2KO(ΔTM)病毒）和316μL（对于FM#6 病毒）的体积鼻内地施用病毒剂量。为了证实M2KO(ΔTM)和FM#6病毒的接种 滴度，在施用之前(施用前)和在施用之后(施用后)收集施用溶液的等分试样。在 -65℃储存等分试样用于病毒滴定。
G.攻击病毒：使用甲型流感病毒、A/布里斯班/10/2007株、血清型H3N2 攻击雪貂。在使用之前在大约-65℃储存病毒。以316μL的体积，在1x107TCID50制备使用的攻击病毒的剂量水平。在IITRI对制备的病毒攻击溶液的一部分执行 定量病毒侵染性测定，即TCID50测定。根据IITRI标准操作规程，执行病毒滴 度测定。
H.垂死率/死亡率观察：攻击后，针对死亡率或垂死率的证据每天2次地观 察所有动物。观察动物至疫苗接种后14天和攻击后14天。
I.体重和体重变化：在接收的2天内和在随机化时，记录体重。在接种之 前将所有研究动物称重，每天称重至每次疫苗接种后14天，并每天评估至攻击 后14天。在接种之前，监测雪貂3-5天，以测量建立基线体温。每天通过皮下 地植入每只雪貂中的发射机应答器(BioMedic数据系统,Seaford,DE)记录温度读 数至每次疫苗接种后14天，并记录至攻击后14天。在每个时间点记录每只动 物的温度的变化(以摄氏度为单位)。
J.临床观察：每天确定每只雪貂的温度的变化(以摄氏度为单位)。每天评估 临床征象、食欲不振、呼吸征象（诸如呼吸困难、喷嚏、咳嗽和鼻漏）和活性 水平。使用基于Reuman,等人,“Assessment of signs of influenza illness in the ferret model,”J.Virol,Methods24:27-34(1989)描述的评分，如下评估活性水平：0， 警觉的和多趣的；1，警觉的，但是仅在受刺激时是多趣的；2，警觉的，但是 在受刺激时不是多趣的；和3，既不是警觉的，也不是在受刺激时多趣的。将相 对无活性指数(RII)计算为在研究期间每组雪貂每次观察(天)的平均评分。
K.存活检查：在研究过程中，每天对所有研究动物进行2次存活检查。两 次存活检查与临床观察同时进行。在同一天内稍后进行第二次检查。
L.鼻洗液：用氯胺酮(25mg/kg)和赛拉嗪(2mg/kg)混合物麻醉雪貂，并将0.5 ml含有青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)和庆大霉素(50μg/ml)的无菌PBS注 射进每个鼻孔，当从雪貂排出时，收集进样本杯中。将鼻洗液收集进冷冻小瓶 中，并记录回收的体积。
M.安乐死：通过静脉内施用150mg/kg戊巴比妥钠，将研究动物安乐死。 通过可观察的心搏和呼吸的缺失，证实死亡。
N.尸检：由Charles River Laboratories,Pathology Associates(PAI)执行尸检。 PAI团队由1个监督病理学家和2个解剖员组成。收获鼻甲、气管和肺。将每个 组织的一部分在福尔马林中固定，并给其它部分施用IITRI杆用于冷冻和贮存。 收获的用于滴度的组织是：右鼻甲、气管的上部1/3和右颅侧肺叶。
O.组织病理学分析：在每次尸检以后，将组织运输至PAI Chicago设备。 接收后，将得自所有15只雪貂的部分组织包埋进石蜡块，以大约5-微米厚度切 片，并用苏木精和伊红(H&E)染色。在显微镜下评价所有石蜡H&E切片。
P.血清收集：从雪貂收集疫苗接种前血清(对于第3、4和5组，第-3至-5 天；对于第1和2组，第23-25天)。接种后，在第7、14、21、35、42、49和 70天从第3、4和5组收集血清。在第35、42、49和70天从第1和2组收集血 清。用氯胺酮(25mg/kg)和赛拉嗪(2mg/kg)混合物麻醉雪貂。经由腔静脉从每只 雪貂收集血液样品(大约0.5-1.0mL)，并加工成血清。将血液收集进Serum Gel Z/1.1试管(Sarstedt Inc.Newton,NC)，并在室温储存不超过1小时，然后收集血 清。将Serum Gel Z/1.1试管在10,000xg离心3分钟，并收集血清。
Q.血凝集抑制(HI)测定：用受体破坏酶(RDE)(Denka Seiken,Tokyo,日本) 处理血清样品，以消除非特异性的血凝集的抑制剂。按照生产商的说明书，重 构RDE。将血清在RDE中1:3稀释，并在37℃±2℃水浴中温育18-20小时。加 入等体积的2.5%(v/v)柠檬酸钠以后，将样品在56±2℃水浴中温育30±5分钟。 在RDE处理后，将0.85%NaCl加入每个样品，至1:10的最终血清稀释度。然 后将经稀释的样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中一式两份稀释成4个2倍稀释度 (1:10至1:80)，然后与4个血凝单位的A/布里斯班/10/2007(H3N2)甲型流感病 毒一起温育。温育后，将0.5%禽红血细胞加入每个样品，并温育30±5分钟。然 后将血凝集的存在或不存在评分。
R.病毒滴度：通过Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞中的TCID50，确定攻击 前和攻击后病毒接种物样品中的感染性病毒的浓度。简而言之，将在-65℃保存 的样品融化，并离心以除去细胞碎片。将得到的上清液在96-孔微孔滴定板内的 Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM)(Gibco,Carlsbad,CA,USA)中一式三 份地10倍稀释，所述DMEM含有青霉素/链霉素、0.1%庆大霉素、3%NaCO3、 0.3%BSA级分V(Sigma St.Louis,MO)、1%MEM维生素溶液(Sigma)和1%L- 谷氨酰胺(Mediatech,马纳萨斯,VA,USA)。在制备10倍系列稀释物以后，将100 μL转移进96-孔板的各个孔中，所述孔含有单层MDCK细胞。在37℃±2℃、5±2% CO2、70%湿度温育平板。48小时以后，观察孔的细胞致病效应(CPE)。将得自 每个孔的上清液(50μl)转移至96孔板，并确定和记录血凝集(HA)活性。通过使 用0.5%填充的火鸡红血细胞(tRBC)的HA测定，评估上清液的HA活性。使用 Reed LJ和Muench H,“A simple method forestimating50%endpoints,”Am.J. Hygiene27:493-497(1938)的方法，计算TCID50滴度。
S.数据分析：确定每只单独动物的体重和体重增加(减轻)和体温的变化， 表达为每个试验组的平均值和平均值标准差。
结果
在鼻内疫苗接种M2KO(ΔTM)病毒或FM#6病毒以后，每天监测雪貂的感染 临床征象。在激发疫苗接种以后收集鼻洗液以监测病毒的脱落，并收集血清以 测量血清抗体滴度。结果呈现在表18A、18B和18C中。
表18A：疫苗接种对雪貂的存活和感染临床征象的影响.
a在病毒接种之前雪貂血清中的针对同源病毒的血凝集抑制(HI)抗体滴度。
b观察临床征象至病毒接种以后3天。除了嗜睡以外，将临床征象的发现给出为具有征象的雪貂的数目/总数。 呼吸征象包括喷嚏。
c基于评分系统每天2次地确定，持续观察3天，并计算为在3-天时段内每次观察(天)每组雪貂的平均评分。 接种之前的相对无活性指数为0。
表18B：攻击以后雪貂呼吸器官中的病毒滴度
表18C：雪貂中的粘膜IgA应答
所有雪貂度过了使用M2KO(ΔTM)病毒和FM#6病毒的疫苗接种。激发疫苗 接种以后，2只接种了M2KO(ΔTM)病毒的雪貂在第8天呈现出呼吸征象(喷嚏)。 强化疫苗接种以后，接种了FM#6病毒的雪貂在疫苗接种后7天呈现呼吸征象(喷 嚏)。还在强化后第4天在OPTI-MEMTM雪貂中观察到喷嚏。激发疫苗接种以后， 接种了M2KO(ΔTM)病毒和FM#6病毒的雪貂的相对无活性指数分别为0.07和 0.27。在激发疫苗接种以后，该活性下降仅在每种病毒的一个组中观察到。强化 疫苗接种以后，没有观察到活性水平的下降。病毒接种以后体重和温度的变化 显示在图22和图23中。在疫苗接种以后没有观察到重量减轻；但是，疫苗接 种似乎对重量增加具有影响。疫苗接种以后，OPTI-MEMTM对照雪貂的体重在 14天观察期中增加了20%，而M2KO(ΔTM)或FM#6接种疫苗的雪貂的体重增 加范围为激发以后的6-15%和强化以后的4-6%。在疫苗接种以后在任何组中没 有观察到体温的增加。攻击以后的体重和温度的变化显示在图24和图25中，
临床征象总结在表19中。
表19：病毒攻击对雪貂的存活和感染临床征象的影响.
a观察临床征象至病毒接种以后3天。除了嗜睡以外，将临床征象的发现给出为具有征象的雪貂的数目/总 数。呼吸征象包括喷嚏。
b基于评分系统每天2次地确定，持续观察3天，并计算为在3-天时段内每次观察(天)每组雪貂的平均评 分。接种之前的相对无活性指数为0。
用A/布里斯班/10/2007(H3N2)攻击以后，在攻击后第2天在所有动物中观 察到2-4%体重减轻。在14天观察期中，动物体重保持低于它们的初始重量。 OPTI-MEMTM雪貂减轻最大的重量(8%)。接种疫苗的雪貂的重量减轻取决于疫 苗方案。接受M2KO(ΔTM)或FM#6的仅激发方案的雪貂分别减轻5%和4%的 最大值。接受强化剂的雪貂减轻以下最大值：FM#6组为3%，M2KO(ΔTM)组为 2%。在第2天在OPTI-MEMTM雪貂中和在第1天在接受M2KO(ΔTM)或FM#6的仅激发方案的雪貂中观察到攻击后的高体温(图25)。接受强化剂的雪貂的体温 保持在正常范围内。
为了确定疫苗接种是否会阻止攻击病毒在呼吸道中的复制和减轻器官病理 学，在接种后第3天在组织学上检查了攻击的雪貂的组织。将接受M2KO(ΔTM) 仅激发或激发/强化方案的动物的肺中的变化与相对于OPTI-MEMTM组的肺中的 混合细胞浸润的严重程度的增加相关联。在M2KO(ΔTM)激发组和M2KO(ΔTM) 激发/强化组之间观察到肺浸润发生率的微小差异。与OPTI-MEMTM组相比，也 在FM#6激发组和FM#6激发/强化组中观察到肺中的混合细胞浸润的严重程度 的增加。在FM#6激发/强化组中观察到相对于FM#6仅激发组的肺混合细胞浸 润的严重程度的轻微增加。在鼻甲中，与OPTI-MEMTM组相比，接受M2KO(ΔTM) 病毒的激发或激发/强化的动物具有更低严重程度的呼吸上皮萎缩。当将激发组 相对于激发/强化M2KO(ΔTM)组进行对比时，不存在鼻甲萎缩差异。相对于接 受FM#6仅激发方案的动物，在接受FM#6激发/强化方案的动物中观察到呼吸 上皮萎缩的严重程度的轻微增加；所有FM#6动物中的呼吸上皮萎缩的严重程 度都低于在OPTI-MEMTM组中观察到的结果。与OPTI-MEMTM组相比，在 M2KO(ΔTM)激发和激发/强化组中存在向鼻腔(内腔)中的嗜中性粒细胞性浸润 的发生率的下降。M2KO(ΔTM)仅激发组中的嗜中性粒细胞性内腔浸润被解释为与OPTI-MEMTM组没有不同。与OPTI-MEMTM组相比，在FM#6仅激发和激 发/强化组中存在内腔嗜中性粒细胞性浸润的严重程度的轻微增加。攻击前和攻 击后病毒施用溶液的浓度分别为107.83TCID50/mL和107.25TCID50/mL，从而指 示攻击材料在施用中的良好稳定性。
图45显示了雪貂呼吸道中的M2KO(ΔTM)和病毒复制。
图46显示了用A/布里斯班/10/2007(H3N2)病毒鼻内攻击以后鼻洗液中的 M2KO(ΔTM)和病毒滴度。
图47显示了仅用M2KO(ΔTM)和激发组疫苗接种以后雪貂中的 IgG滴度。
图48显示了用M2KO(ΔTM)和激发-加强组疫苗接种以后雪貂中的 IgG滴度。
图49显示了从用M2KO(ΔTM)或疫苗接种至攻击后，雪貂血清中 的ELISA IgG滴度的总结。
结论
本实施例表明，M2KO(ΔTM)病毒的鼻内施用没有与任何疫苗相关的不利事 件(体温升高、重量减轻或临床征象)关联。这些结果表明，本技术的M2KO(ΔTM) 病毒可用于鼻内流感疫苗。
实施例12：M2KO(ΔTM)病毒未在雪貂模型中传播
概要-本实施例证实，M2KO(ΔTM)病毒未在雪貂模型中传播。以1x107 TCID50的剂量水平，将M2KO(ΔTM)病毒鼻内地施用给3只雌性雪貂。作为对 照，以1x107TCID50的剂量给第二组3只雌性雪貂鼻内地施用A/布里斯班 /10/2007(H3N2)病毒。接种后24小时，将每只供体雪貂引入具有2只原初雪貂(直 接接触和气溶胶接触)的传播室。接种后，针对死亡率观察雪貂至接种后14天， 每天测量体重、体温和临床征象。从所有接种的供体雪貂（在第1、3、5、7、9 天）和从所有接触(直接和气溶胶)雪貂（在第2、4、6、8、10天）收集鼻洗液， 以查看病毒的脱落。在研究接种时(第14天)，从所有雪貂收集鼻洗液和血清， 以评价抗体水平。在M2KO(ΔTM)组中没有观察到感染临床征象；但是，在A/ 布里斯班/10/2007(H3N2)组中的雪貂具有重量减轻、增加的体温，且打喷嚏。用 布里斯班/10接种后，供体雪貂在攻击和重量减轻以后2天表现出体温的增加。 任何组中的活性水平没有降低。与供体雪貂直接接触的雪貂在接种后第4天之 前表现出进行性重量增加。从接种后第6天开始，在气溶胶接触雪貂中观察到 类似的趋势。接触雪貂的体重减少与体温的增加有关。用M2KO(ΔTM)病毒接种没有在接种的动物中引起感染临床征象。向接触雪貂的传播是不太可能的。
材料和方法
A.疫苗材料：M2KO(ΔTM)病毒是这样的重组病毒：其具有PR8的内部6 个基因(核蛋白(NP)、聚合酶基因(PA、PB1、PB2)、非结构(NS)、基质(M))，但 是其不表达功能性M2蛋白，以及甲型流感/布里斯班/10/2007-样A/乌拉圭 /716/2007(H3N2)的HA和NA基因。以316μL剂量的1x107TCID50(50%组织培 养物感染剂量)，将M2KO(ΔTM)病毒鼻内地施用给动物。
B.试验物剂量制剂：通过将45的1x109TCID50/mL稀释进1.377mL PBS 中，制备每316μL1x107TCID50/mL的M2KO(ΔTM)病毒施用溶液。
C.动物和动物护理：从Triple F Farms购买22只雌性雪貂，将18只雪貂用 于研究。在研究起始时，动物为大约4月龄。所述动物经过供应商检验为健康 的，且没有对感染性疾病的抗体。到达后，将动物单个地圈养在具有条板底的 悬丝笼子中，悬挂在衬纸的废物盘上面。在接收动物之前，根据接受的动物护 理实践和有关的标准操作规程，已经清洁和消毒动物房和笼子。随意供给 Certified Teklad Global Ferret Diet#2072(TekladDiets,Madison WI)和芝加哥城市 自来水，并至少每天1次地更新。将动物房中的荧光照明维持在12-小时光照/ 黑暗周期。在研究过程中，动物室温度和相对湿度是在各自的方案限度内，且 分别是在23.0-25.0℃和36-50%的范围内。
D.动物隔离和随机化：将雪貂保持隔离7天，然后随机化，并每天观察。 基于指示动物的总体良好健康的每天观察，从隔离释放雪貂用于随机化和试验。 隔离以后，将雪貂称重，并使用计算机化的随机化操作，基于产生类似的组平 均值的体重，将其分配至治疗组[2.1.E.11版(PDS Pathology Data Systems,Inc.,Basel,瑞士)]。在一组内，所有体重是在它们的平均值的20%内。 为研究选择的动物通过耳标接受永久标识号，并且发射机应答器和各个笼子卡 片也通过各个编号和组鉴别研究动物。分配的鉴别编号在研究中是独有的。
E.实验设计：为了评估M2KO(ΔTM)病毒的传播性，给雪貂接种M2KO(ΔTM) 病毒或A/布里斯班/10/2007(H3N2)病毒。监测动物体重、体温、临床症状和病 毒脱落，并评价免疫学应答。将18只在研究起始时为4月龄的雌性雪貂(Triple F Farms,Sayre PA)用于研究。在动物生物安全性水平-2或水平3设备中执行所有 动物操作。在接种之前，监测雪貂3天以测量体重和建立基线体温。每天通过 皮下地植入每只雪貂中的发射机应答器(BioMedic数据系统,Seaford,DE)记录温 度读数。在研究起始之前收集血液，并针对流感抗体来试验血清。仅具有针对 A/布里斯班/10/2007(H3N2)病毒的HI滴度40的雪貂被认为是血清阴性的，并 用在该研究中。将研究动物随机化，并分成2组(9只雪貂/组，3只/传播室)，如 表20所示。指定组1中的雪貂(室A-C)接收M2KO(ΔTM)病毒。指定组2中的 雪貂(室A-C)接收A/布里斯班/10/2007(H3N2)病毒。在每个组内，将雪貂分成 接种的供体或原初接触。
表20:研究设计
1每个室由3只雌性雪貂组成：1只受感染的供体雪貂和2只原初接触雪貂(1只直接接触和1只气溶胶接触)。
2鼻内地接种单次剂量的316μl的1x107TCID50的M2KO或1x107TCID50的A/布里斯班/10/2007(H3N2) 病毒。
将每组圈养在单独的房间中，并操作所述动物的个人遵循严格的工作流模 式，以防止两组之间的交叉污染。在每个组中，给1只供体雪貂鼻内地接种单 次剂量的316μL的1x107TCID50的M2KO(ΔTM)(组1)或1x107TCID50的A/布里 斯班/10/2007(H3N2)病毒(组2)。接种后24小时，将每只供体放入含有1只原初 雪貂的相同笼子中(直接接触)，在丝笼内双圈养。将另一只雪貂(气溶胶接触)放 入传播室内的单独邻近丝笼(单圈养)，其与供体的笼子隔开10-12cm的距离。 每天监测雪貂体温、重量和临床症状至接种后14天。从所有接种的供体雪貂（在 第1、3、5、7、9天）和从所有接触(直接和气溶胶)雪貂（在第2、4、6、8、 10天）收集鼻洗液，用于细胞中的病毒滴定。在第14天从所有雪貂收集鼻洗液 用于抗体滴定。在-65℃保存鼻洗液样品。
F.传播室：每个传播室是2立方米。使用计算机化的空气处理单元进行 HEPA过滤，并监测和控制传播室内的环境条件。为了提供定向气流，穿过位于 室一端处的入口供给HEPA-过滤的空气，并穿过在室的相对端处的出口离开， 用HEPA过滤，并排入室中。空气交换速率是每个室每小时20次完全换气，将 气流维持为<0.1m/秒。将室维持在-0.15英寸水的负压。将雪貂圈养在具有条板 底的丝笼中，悬挂在衬纸的废物盘上面。将雪貂在32x24x14笼子中双圈养或者 在24x24x14丝笼中单圈养，所述笼子放在每个HEPA-过滤的传播室内。
G.病毒接种：给雪貂接种M2KO(ΔTM)病毒。融化1瓶冷冻的储备物，并 在磷酸盐缓冲盐水溶液中稀释至适当的浓度。用氯胺酮/赛拉嗪麻醉雪貂，并以 316μL的体积鼻内地施用M2KO(ΔTM)病毒剂量。为了证实M2KO(ΔTM)病毒的 接种滴度，在给药之前(给药前)和给药之后(给药后)收集施用溶液的等分试样。 在65℃储存等分试样用于病毒滴定。
H.攻击病毒：使用甲型流感病毒菌株A/布里斯班/10/2007血清型H3N2接 种对照雪貂。在使用之前在大约-65℃储存病毒。以316μL的体积，在1x107 TCID50制备使用的攻击病毒的剂量水平。在IITRI对制备的病毒攻击溶液的一部 分进行定量病毒侵染性测定，即TCID50测定。根据IITRI标准操作规程，执行 病毒滴度测定。
I.垂死率/死亡率观察：攻击后，针对死亡率或垂死率的证据每天2次地观 察所有动物。观察动物至疫苗接种后14天和攻击后14天。
J.体重和体重变化：在接收的2天内和在随机化时记录体重。在接种之前 将所有研究动物称重，每天称重至每次疫苗接种后14天，并每天评估至攻击后 14天。在接种之前，监测雪貂3-5天，以测量建立基线体温。每天通过皮下地 植入每只雪貂中的发射机应答器(BioMedic数据系统,Seaford,DE)记录温度读数 至每次疫苗接种后14天，并记录至攻击后14天。在每个时间点计算每只动物 的温度的变化(以摄氏度为单位)。
K.临床观察：每天确定每只雪貂的温度变化(以摄氏度为单位)。每天评估 临床征象、食欲不振、呼吸征象（诸如呼吸困难、喷嚏、咳嗽和鼻漏）和活性 水平。使用基于Reuman,等人,“Assessment of signs of influenza illness in the ferret model,”J.Virol,Methods24:27-34(1989)描述的评分，如下评估活性水平：0， 警觉的和多趣的；1，警觉的，但是仅在受刺激时是多趣的；2，警觉的，但是 在受刺激时不是多趣的；和3，既不是警觉的，也不是在受刺激时多趣的。将相 对无活性指数(RII)计算为在研究期间每组雪貂每次观察(天)的平均评分。
L.存活检查：在研究过程中，每天对所有研究动物进行2次存活检查。两 次存活检查与临床观察同时进行。在同一天内稍后进行第二次检查。
M.鼻洗液：用氯胺酮(25mg/kg)和赛拉嗪(2mg/kg)混合物麻醉雪貂，并将 0.5ml含有青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)和庆大霉素(50μg/ml)的无菌PBS 注射进每个鼻孔，当从雪貂排出时，收集进样本杯中。
N.安乐死：通过静脉内施用150mg/kg戊巴比妥钠，将研究动物安乐死。 通过可观察的心搏和呼吸的缺失，证实死亡。对所有研究动物进行尸检。
O.血清收集：从所有雪貂收集疫苗接种前血清(第-3至-5天)和接种后血清 (第14天)。用氯胺酮(25mg/kg)和赛拉嗪(2mg/kg)混合物麻醉雪貂。经由腔静脉 从每只雪貂收集血液样品(大约0.5-1.0mL)，并加工成血清。将血液收集进Serum Gel Z/1.1试管(SarstedtInc.Newton,NC)，并在室温储存不超过1小时，然后收 集血清。将Serum Gel Z/1.1试管在10,000xg离心3分钟，并收集血清。收集单 个接种前血清样品，并从每个样品制备2个等分试样。在研究起始之前试验1 个等分试样，以证实雪貂不含针对甲型流感病毒的抗体，并在-65℃储存血清的 1个等分试样。
P.血凝集抑制(HI)测定：用受体破坏酶(RDE)(Denka Seiken,Tokyo,日本) 处理血清样品，以消除非特异性的血凝集的抑制剂。按照生产商的说明书，重 构RDE。将血清在RDE中1:3稀释，并在37℃±2℃水浴中温育18-20小时。加 入等体积的2.5%(v/v)柠檬酸钠以后，将样品在56±2℃水浴中温育30±5分钟。 在RDE处理后，将0.85%NaCl加入每个样品，至1:10的最终血清稀释度。然 后将经稀释的样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中一式两份稀释成4个2倍稀释度 (1:10至1:80)，然后与4个血凝单位的A/布里斯班/10/2007(H3N2)甲型流感病 毒一起温育。温育后，将0.5%禽红血细胞加入每个样品，并温育30±5分钟。然 后将血凝集的存在或不存在评分。
Q.病毒滴度：通过Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞中的TCID50测定，确 定攻击前和攻击后病毒接种物样品中的感染性病毒的浓度。简而言之，将在-65℃ 保存的样品融化，并离心以除去细胞碎片。将得到的上清液在96-孔微孔滴定板 内的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM)(Gibco,Carlsbad,CA,USA)中一 式三份地10倍稀释，所述DMEM含有青霉素/链霉素、0.1%庆大霉素、3% NaCO3、0.3%BSA级分V(Sigma St.Louis,MO)、1%MEM维生素溶液(Sigma) 和1%L-谷氨酰胺(Mediatech,马纳萨斯,VA,USA)。在制备10倍系列稀释物以 后，将1OOflL转移进96-孔板的各个孔中，所述孔含有单层MDCK细胞。在 37℃±2℃、5±2%CO2、70%湿度温育平板。48小时以后，观察孔的细胞致病效 应(CPE)。将得自每个孔的上清液(50μl)转移至96孔板，并确定和记录血凝集(HA) 活性。通过使用0.5%填充的火鸡红血细胞(tRBC)的HA测定，评估上清液的 HA活性。使用Reed LJ和Muench H,“A simple method forestimating50% endpoints,”Am.J.Hygiene27:493-497(1938)的方法，计算TCID50滴度。
R.数据分析：确定每只单独动物的体重和体重增加(减轻)和体温的变化， 表达为每个试验组的平均值和平均值标准差。
结果
给供体雪貂接种M2KO(ΔTM)病毒或A/布里斯班/10/2007(H3N2)甲型流感 病毒以后，将供体雪貂引入含有原初接触雪貂的传播室。每天监测雪貂的感染 临床征象，收集鼻洗液以监测病毒的脱落，并收集血清以测量血清抗体滴度。 所有雪貂度过了使用M2KO(ΔTM)病毒和A/布里斯班/10/2007的接种(表21)。在 M2KO(ΔTM)组雪貂中没有观察到疾病的临床征象。用A/布里斯班/10/2007病毒 接种的3只供体雪貂中的2只在第6和8天呈现呼吸征象(喷嚏)。所有室中的直 接接触雪貂在第8天呈现喷嚏。在气溶胶接触雪貂中没有观察到喷嚏。没有观 察到活性水平的下降。
表21：接种的供体雪貂和接触雪貂中的临床征象.
a在病毒接种之前在雪貂血清中针对同源病毒的血凝集抑制(HI)抗体滴度。
b观察临床征象至病毒接种以后14天。除了嗜睡以外，将临床征象的发现给出为具有征象的雪貂的数目/总数。 呼吸征象是喷嚏，每只雪貂的发作天数在括弧中。
c基于评分系统每天2次地确定，持续观察14天，并计算为在14-天时段内每次观察(天)每组雪貂的平均评分。 接种之前的相对无活性指数为0。
病毒接种以后的体重和温度的变化显示在图26和图27中。在用 M2KO(ΔTM)病毒接种后，没有观察到显著的重量减轻。气溶胶接触的重量减轻 的平均值为1%；但是，这不可能是由于暴露于病毒。在14天观察期中， M2KO(ΔTM)病毒雪貂的体重增加为9%（对于供体雪貂）和10-11%（对于接 触雪貂）(图26A)。A/布里斯班/10/2007的体重增加仅为3%（对于供体雪貂） 和6-8%（对于接触雪貂），从而指示病毒感染(图26B)。在M2KO(ΔTM)组中， 除了感染后第3天以外，体温保持在正常水平内(图27A)。体温低于气溶胶接触 雪貂的正常值。这归因于有缺陷的或失败的温度发射机应答器，在研究的其它 部分中记录在正常范围内的温度。在A/布里斯班/10/2007供体雪貂中在第2天 和对于气溶胶接触而言在第7天，观察到高体温(图27B)。攻击前和攻击后病毒 施用溶液的浓度分别为107.50TCID50/mL和107.25TCID50/mL，从而指示攻击材料 在施用过程中的良好稳定性。
图50显示了在病毒传播研究中得自雪貂的鼻洗液中的病毒滴度。数据表明， M2KO(ΔTM)病毒没有传播(未检测到病毒)，而对照Brisb/10病毒传播。
结论
本实施例表明，用A/布里斯班/10/2007病毒接种的雪貂表现出感染临床征 象(喷嚏、体重减轻和短暂体温升高)，而用M2KO(ΔTM)病毒接种的雪貂没有表 现出疾病的临床征象。因此，用M2KO(ΔTM)接种供体雪貂似乎不会经由接触或 经由气溶胶造成感染或传播病毒。这些发现表明，本技术的M2KO(ΔTM)病毒可 用于鼻内流行性感冒疫苗。
实施例13.M2KO(ΔTM)病毒会在小鼠中引起体液和粘膜免疫应答.
本实施例证实，M2KO(ΔTM)病毒会在小鼠中引起体液和粘膜免疫应答。在 小鼠中评价了M2KO(ΔTM)的免疫原性，并与由其它疫苗接种模式产生的免疫应 答进行对比。如表22所示，进行含有以下组的免疫原性研究：1.M2KO(ΔTM) 病毒，2.PR8病毒(10pfu)，代表性的活疫苗，3.灭活的PR8病毒(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)，1μg，鼻内(IN)，4.灭活的PR8病毒，1μg，肌 肉内(IM)，或仅PBS。
表22：在免疫原性研究中的疫苗组
免疫原 递送途径 剂量 原理
M2KO(ΔTM)病毒 鼻内 1x10<sup>4</sup>pfu 包含M2KO(ΔTM)(SEQ ID NO:1)突变
PR8病毒 鼻内 10pfu 代表与天然感染和/或活流感疫苗有关的免疫应答
灭活的PR8，全病毒 鼻内 1μg 证实由鼻内递送的杀死的流感病毒产生的基线应答
灭活的PR8，全病毒 肌肉内 1μg 传统的灭活流感疫苗的标准递送途径
为了试验M2KO(ΔTM)病毒的免疫原性，与肌肉内地施用1μg灭活的全PR8 的组一起，给小鼠鼻内地接种1.2x104pfu的M2KO(ΔTM)、10pfu的野生型PR8、 1μg灭活的全PR8(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)或作为对照的 PBS。免疫接种后3周，从小鼠收集血清和气管-肺洗液，并通过酶联免疫吸附 测定(ELISA)测量抗-PR8免疫球蛋白G(IgG)和IgA水平。简而言之，用灭活的 全PR8包被ELISA平板，用牛血清白蛋白(BSA)封闭，并施加样品。用辣根过 氧化物酶标记的抗-小鼠IgG-和IgA-山羊抗体(KPL,Inc.,Gaithersburg,MD)和 SureBlue TMB(KPL,Inc.)底物检测小鼠IgG和IgA抗体。
如预期的，与仅PBS组相比，免疫组中的小鼠表现出血清和气管-肺洗液中 的抗-PR8抗体的显著升高(图28)。M2KO(ΔTM)病毒组的血清中的抗-PR8IgG 水平高于灭活的PR8组，且类似于活PR8病毒。更重要的是，抗-PR8IgA抗体 仅存在于PR8和M2KO(ΔTM)免疫的小鼠的血清和气管-肺洗液中。这些数据 提示，M2KO(ΔTM)病毒会在小鼠中引起显著的体液和粘膜免疫应答。
实施例14M2KO(ΔTM)病毒会保护小鼠免于致命的同亚型和杂亚型攻击.
本实施例证实，M2KO(ΔTM)病毒会保护小鼠免于致命的同亚型和杂亚型攻 击。通过在免疫接种后6周用致死剂量的野生型PR8(H1N1；同亚型攻击)或小 鼠适应的甲型流感/Aichi/2/68(Aichi；H3N2；杂亚型攻击)攻击免疫的小鼠，评 价了M2KO(ΔTM)病毒的保护效力。用M2KO(ΔTM)或10pfu的PR8免疫并随 后用野生型PR8攻击的小鼠没有表现出任何临床症状，包括重量减轻(图29A)。 相比而言，原初PBS小鼠死亡，或者由于在第5天之前大于20%重量减轻而被 安乐死。在攻击后第3天，通过在MDCK细胞中的TCID50测定，确定攻击的小 鼠的呼吸道中的病毒复制。如图30A所示，在M2KO(ΔTM)或PR8免疫的小鼠 的肺中没有检测出病毒(检测限度102.75TCID50/器官)，从而指示M2KO(ΔTM)会 提供与PR8感染类似的无菌免疫。相比而言，从灭活的PR8和PBS组回收到攻 击病毒。
对于杂亚型攻击，用Aichi(H3N2)攻击小鼠。M2KO(ΔTM)和野生型PR8 免疫的小鼠度过攻击，而接受灭活的PR8或PBS的小鼠发生感染(图29)。在 M2KO(ΔTM)-接种疫苗的小鼠中在攻击后第3天在小鼠呼吸道中的病毒滴度与 其它组中的小鼠相比没有显示出显著下降(图30)。这些结果提示，针对Aichi攻 击观察到的交叉保护可以部分地归因于由M2KO(ΔTM)疫苗诱导的T-细胞介导 的免疫应答。在得自攻击的小鼠的攻击后血清中，针对Aichi的血凝集抑制(HI) 抗体不是可检测的(小于1:40)，从而提示保护不是由中和抗体介导。
M2KO(ΔTM)病毒会刺激体液和细胞免疫应答，并赋予动物对抗致命的同亚 型和杂亚型攻击的保护性免疫，如表23所示。
表23同亚型(H1N1)和杂亚型(H3N2)流感攻击以后的保护
实施例15相对于 和 的M2KO(ΔTM)疫苗
本实施例证实了M2KO(ΔTM)病毒相对于活减毒病毒灭活流感疫苗的效力。用M2KO(ΔTM)病毒、冷适应的活减毒病毒 灭活流感疫苗免疫小鼠，或用PBS假免疫。通过将甲型流感/布里斯班 /10/2007-样A/乌拉圭/716/2007(H3N2)的HA和NA编码序列插入M2KO(ΔTM) 主链(SEQ ID NO:1)中，构建M2KO(ΔTM)-H3病毒。从2009/2010三价疫苗制剂 噬斑纯化即得自冷适应的A/AA/6/60主链的内部基因，其含有甲 型流感/布里斯班/10/2007-样A/乌拉圭/716/2007(H3N2)的HA和NA基因。将 2009/2010制剂直接地用作三价制剂。
在免疫接种后第7、14、21天得到血清，以通过ELISA对比抗体应答的动 力学(图31)。M2KO(ΔTM)-H3病毒（一种复制缺陷型病毒）比（以 衰减的方式经历多循环复制的活流感病毒疫苗）更早地形成抗体。灭活的疫苗 具有最高血清抗体滴度，因为它是抗原的浓缩呈现。
通过ELISA评价了抗-HA粘膜抗体在血清、肺洗液和鼻甲中的存在。与灭 活的疫苗相比，M2KO(ΔTM)-H3和（两种活流感疫苗）在呼 吸道中具有更高的IgA(图32)
实施例16：由活病毒引起的保护和免疫原性的对比.
在第0和28天用106TCID50/50μl M2KO(ΔTM)-H3(上述)、 (2009-2010)(H3N2)IVR-147(PR8x布里斯班/10/2007)鼻内地感染6周龄 雌性BALB/c小鼠（用异氟烷麻醉）。IVR-147是M2KO(ΔTM)病毒的野生型形 式；即含有功能性M2蛋白。假感染的对照小鼠接受50μl PBS替代病毒。每周 从所有小鼠收集血清，并通过ELISA分析抗-HA抗体的存在。如图33所示，与 相比，M2KO(ΔTM)病毒和IVR-147产生更高的抗体水平，具有快速动 力学。
监测动物的体重至感染后14天。接种疫苗的小鼠没有减轻任何重量。在强 化后第21天，将每组3只小鼠安乐死，并收集它们的气管-肺洗液、鼻洗液和血 清用于抗体滴度确定(图34)。M2KO(ΔTM)诱导体液和粘膜抗体至与血清和呼吸 道中的和IVR-147类似的水平。
在强化后6周，用40MLD50的A/Aichi/2/68病毒鼻内地攻击小鼠。观察小 鼠的体重减轻和存活持续14天(图35)。M2KO(ΔTM)会保护小鼠免于致命的 Aichi攻击，如相对于而言更少的体重减轻(组A)和100%存活(组B)所 指示的。在攻击后第3天，将每组3只小鼠安乐死，并收集它们的肺和鼻甲用 于病毒滴度确定(表24)。M2KO(ΔTM)比更好地控制攻击病毒，如表 24所示。
表24.呼吸道中的攻击病毒滴度.
实施例17：针对高度致病性的禽H5n1流感病毒的M2KO(ΔTM)疫苗的制备
概要：M2KO(ΔTM)是缺乏功能性M2蛋白表达的流感病毒。M2蛋白对于 流感病毒感染起始而言和对于病毒RNA向后代病毒粒子中的有效整合而言是关 键性的。M2KO(ΔTM)可以进入细胞和表达病毒蛋白，但是由于M2基因的缺 失而不可制备感染性后代病毒。M2KO(ΔTM)在许可的M2蛋白表达细胞中生产， 但是不在非许可的野生型细胞中生产。M2KO(ΔTM)会在小鼠中引起粘膜和体 液免疫，并保护免于同亚型和杂亚型致命攻击。
H5N1M2KO(ΔTM)病毒在M2KO(ΔTM)主链上含有A/越南/1203/2004的 HA(无毒性)和NA基因。“M2KO(ΔTM)主链”是指包含M2KO(ΔTM)(SEQ ID NO:1)突变的PR8序列。使用的A/越南/1203/2004HA(无毒性)(SEQ ID NO:24) 和NA(SEQ ID NO:25)序列显示在下面。
＞无毒性的VN1203HAORF+PR8非编码
AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCAAAATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGT GATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTAC ACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGAAACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTGAGAG ATTGTAGCGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTG GAGAAGGCCAATCCAGTCAATGACCTCTGTTACCCAGGGGATTTCAATGACTATGAAGAATTGAAACACCTATTGAGCAG AATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCAGTCATGAAGCCTCATTAGGGGTGAGCTCAG CATGTCCATACCAGGGAAAGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAACAATA AAGAGGAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTACTGTGGGGGATTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCA GACAAAGCTCTATCAAAACCCAACCACCTATATTTCCGTTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCAAGAATAG CTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATGCAATCAAC TTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAG TGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGCATGCCATTCCACAATA TACACCCTCTCACCATTGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGC CCTCAAAGAGAGACTAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAG TCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAA AGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCT CATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGG ATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAAT GGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAAT AGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCT TATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAAGATTAGAATTTCAGAGATATGAGGAAAAACACC CTTGTTTCTACT
＞VN1203NAORF+PR8非编码
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H5N1M2KO(ΔTM)的制备：基于每个基因的CDC序列(CDC ID: 2004706280，登录号：EF541467和EF541403)，通过Synthesis 来化学合成A/越南/1203/2004(H5N1)的无毒性HA和NA。确认构建体的序列， 并亚克隆进适当的载体中，以允许使用标准方案制备种子病毒。
在M2CK细胞(稳定表达M2蛋白的MDCK细胞)中扩增M2KO(ΔTM) VN1203avHA,NA(H5N1M2KO(ΔTM))病毒，将上清液除去细胞碎片，并通过 Centricon Plus-70(Millipore)浓缩100倍。使用该病毒作为小鼠研究中的免疫原。
小鼠研究设计：给小鼠(7-8周龄,雌性BALB/c)鼻内地接种H5N1 M2KO(ΔTM)(106TCID50/小鼠)、M2KO(ΔTM)CA07HA、NA(106TCID50/小鼠)， 或肌内地施用VN1203蛋白(1.5μg)。观察体重和临床症状至接种后14天。在接 种后第7、14、21天，收集血清。在第28天强化小鼠，同时开始的新的仅激发 组。
强化免疫接种组和‘仅激发’组：在第28天，用106pfu/小鼠的第二次免疫接 种，强化以前用H5N1M2KO(ΔTM)接种的小鼠。同时，给‘仅激发’组施用它们 的第一剂量。在第28天接种以后，跟踪所有组的重量减轻。接受强化剂量的 M2KO(ΔTM)疫苗的小鼠减轻了它们的体重的至多5%。‘仅激发’组减轻了它们 的体重的至多10%。
表25.小鼠研究中的疫苗组
H5N1M2KO(ΔTM)会引起针对HA的IgG抗体滴度：在接种后第7、14、 21天从小鼠得到血清，并通过ELISA分析针对血凝素的抗体。M2KO(ΔTM)产 生了比H5HA蛋白高至少100倍的滴度(图36)。在第28天强化小鼠，并在1 周后(第35天)得到血清。M2KO(ΔTM)滴度增强了130倍，而HA蛋白仅增强 了13倍。M2KO(ΔTM)仅激发组在第35天的第一周抽血表现出与激发-加强组 的第一周一样高的IgG滴度。
用致死剂量的越南/1203/2004病毒(20MLD50)攻击小鼠。所有H5N1 M2KO(ΔTM)接种疫苗的(仅激发和激发-强化)小鼠存活(图54和55)。免疫接种 后5个月攻击的小鼠的高存活率提示，H5N1M2KO(ΔTM)疫苗会激发记忆应 答。免疫接种后4周攻击的小鼠仅接受一剂疫苗，从而指示M2KO(ΔTM)疫苗 会刺激强免疫应答。H1N1pdm M2KO(ΔTM)免疫的小鼠也度过5个月后的 H5N1攻击，从而指示M2KO(ΔTM)会激发提供对抗异源攻击的保护的交叉反应性免疫应答。
实施例18:H1N1pdm： 相对于M2KO(ΔTM)CA07
通过标准分子生物学方案，制备了A/加利福尼亚/07/2009(CA07)(H1N1pdm) 的HA和NA cDNA克隆。使用标准方案，证实构建体的序列，并亚克隆进适当 的载体中，以允许制备种子M2KO(ΔTM)病毒和M2WTCA07/PR8病毒。在 MDCK细胞中从2011-2012疫苗批号B11K1802噬斑纯化 (H1N1pdm)。使用的A/加利福尼亚/07/2009(CA07)HA(SEQ ID NO:26)和 NA(SEQ ID NO:27)序列显示在下面。
在 M2KOTMdel中的A/加利福尼亚/07/2009(H1N1)HA
AGCAAAAGCAGGGGAAAACAAAAGCAACAAAAATGAAGGCAATACTAGTAGTTCTGCTATATACATTTGCAACCGCAAAT GCAGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGT AACACACTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGG GTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCCTACATT GTGGAAACACCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAG CTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAA CGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCA AAGCTCAGCAAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCATCCATCTACTAGTGC TGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGTCATCAAGATACAGCAAGAMGTTCAAGCCGG AAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCRAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAA ATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTAT CATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAAACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTC AGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGG AATATCCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTTGGGGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTG ACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCAC CTGGAAAAAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTT GGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGATTCAAATGTGAAGAACTTATATGAAAAGGTAAGAAGCCAGC TAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTC AAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAATAGATGGGGTAAAGCTGGA ATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAA TCAGTTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAACATTAGGATTTCAGAAGCATGAGAAAA AAACACCCTTGTTTCTACT
>在M2KOTMdel中的A/加利福尼亚/07/2009(H1N1)NA
AGCAAAAGCAGGAGTTTAAAATGAATCCAAACCAAAAGATAATAACCATTGGTTCGGTCTGTATGACAATTGGAATGGCT AACTTAATATTACAAATTGGAAACATAATCTCAATATGGATTAGCCACTCAATTCAACTTGGGAATCAAAATCAGATTGA AACATGCAATCAAAGCGTCATTACTTATGAAAACAACACTTGGGTAAATCAGACATATGTTAACATCAGCAACACCAACT TTGCTGCTGGACAGTCAGTGGTTTCCGTGAAATTAGCGGGCAATTCCTCTCTCTGCCCTGTTAGTGGATGGGCTATATAC AGTAAAGACAACAGTGTAAGAATCGGTTCCAAGGGGGATGTGTTTGTCATAAGGGAACCATTCATATCATGCTCCCCCTT GGAATGCAGAACCTTCTTCTTGACTCAAGGGGCCTTGCTAAATGACAAACATTCCAATGGAACCATTAAAGACAGGAGCC CATATCGAACCCTAATGAGCTGTCCTATTGGTGAAGTTCCCTCTCCATACAACTCAAGATTTGAGTCAGTCGCTTGGTCA GCAAGTGCTTGTCATGATGGCATCAATTGGCTAACAATTGGAATTTCTGGCCCAGACAATGGGGCAGTGGCTGTGTTAAA GTACAACGGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTTGGAGAAACAATATATTGAGAACACAAGAGTCTGAATGTGCATGTG TAAATGGTTCTTGCTTTACTGTAATGACCGATGGACCAAGTAATGGACAGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATAGAAAAG GGAAAGATAGTCAAATCAGTCGAAATGAATGCCCCTAATTATCACTATGAGGAATGCTCCTGTTATCCTGATTCTAGTGA AATCACATGTGTGTGCAGGGATAACTGGCATGGCTCGAATCGACCGTGGGTGTCTTTCAACCAGAATCTGGAATATCAGA TAGGATACATATGCAGTGGGATTTTCGGAGACAATCCACGCCCTAATGATAAGACAGGCAGTTGTGGTCCAGTATCGTCT AATGGAGCAAATGGAGTAAAAGGGTTTTCATTCAAATACGGCAATGGTGTTTGGATAGGGAGAACTAAAAGCATTAGTTCAAGAAACGGTTTTGAGATGATTTGGGATCCGAACGGATGGACTGGGACAGACAATAACTTCTCAATAAAGCAAGATATCG TAGGAATAAATGAGTGGTCAGGATATAGCGGGAGTTTTGTTCAGCATCCAGAACTAACAGGGCTGGATTGTATAAGACCT TGCTTCTGGGTTGAACTAATCAGAGGGCGACCCAAAGAGAACACAATCTGGACTAGCGGGAGCAGCATATCCTTTTGTGG TGTAAACAGTGACACTGTGGGTTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAGTTGCCATTTACCATTGACAAGTAATTTGTTCAAA AAACTCCTTGTTTCTACT
给小鼠(7-8周龄,雌性BALB/c)鼻内地接种M2KO(ΔTM)CA07(106TCID50/ 小鼠)、M2WT CA07(106TCID50/小鼠)、(106TCID50/小鼠)或作 为原初对照的OPTI-MEMTM。观察体重和临床症状至接种后14天。图37表明， M2KO(ΔTM)和接种疫苗的小鼠没有减轻重量，而含有WT M2的病毒 减轻重量且发生和感染。这些结果证实，M2基因的缺失会使该病毒减毒，且 M2KO(ΔTM)是减毒的。
图38M2KO(ΔTM)、FluMist、和M2野生型病毒滴度肺和鼻终止。在疫苗 接种后第3天收获肺和鼻甲，用于细胞上的病毒滴定。在M2KO(ΔTM)免疫的 小鼠中，在肺或鼻甲中没有检测到病毒。相比而言，确实具有在肺和鼻 甲中的病毒复制，尽管在比野生型病毒更低的水平。
图39通过ELISA确定了在接种后第7、14和21天收集的血清中的 M2KO(ΔTM)和滴度和抗-HA IgG滴度。M2KO(ΔTM)诱导更高的应答， 其比应答更早地检测到。在第21天之前，2种病毒达到峰抗体水平。
图40显示了用40MLD50的异源病毒、小鼠适应的甲型流感/Aichi/2/1968 (H3N2)免疫接种后12周攻击的小鼠的存活百分比。观察体重变化和临床症状 至攻击后14天。所有M2KO(ΔTM)(H1N1pdm HA,NA)免疫的小鼠被保护免于 Aichi(H3N2)攻击，而仅80%的(H1N1pdm HA,NA)受到保护。存活的 小鼠减轻了它们的体重的接近20%，而M2KO(ΔTM)小鼠减轻了它们的 体重的约10%。
表26显示了在攻击后第3天收集的肺和鼻甲的病毒滴度。M2KO(ΔTM)和控制肺和鼻甲中的攻击病毒复制至类似水平，而原初小鼠表现出肺和鼻 甲中高1个对数的病毒滴度。
支气管肺泡灌洗(BAL)的细胞的细胞内染色.攻击后3天收集BAL，并通过 流式细胞计量术用免疫染色的表面标志物染色，以检测CD8+CD4+、CD8+CD4-、 CD8-CD4+、CD8-CD4-细胞群体。在接种疫苗的小鼠中的CD4+和CD8+细胞 群体与原初小鼠相比更大，指示M2KO(ΔTM)激发与类似的细胞应答。 M2KO(ΔTM)接种疫苗的小鼠具有比更大的CD8+CD4-细胞群体(49% 相对于40%)(图41)。
表26.小鼠的呼吸道的病毒滴度.
实施例19相对于 和野生型病毒的M2KO(ΔTM)mRNA表达
在某些实施方案中，在稳定地反式提供M2蛋白的细胞中生产M2KO(ΔTM) 病毒，从而产生在病毒膜中具有功能性M2蛋白、但是在它的基因组中不编码 M2的病毒。因此，我们假定，M2KO(ΔTM)病毒与正常细胞中的野生型病毒的 初始感染和第一轮复制类似地表现。我们提议，病毒抗原的mRNA水平与感染 早期的野生型水平类似，并且比减毒的复制病毒疫苗更快地刺激有效免疫应答。
以0.5的感染复数用M2KO(ΔTM)、和野生型病毒感染人肺癌(A549) 细胞。通过用PBS洗涤5次，除去未吸附的病毒。加入病毒生长培养基以后， 将受感染的细胞置于35℃CO2培养箱中。没有向生长培养基加入胰蛋白酶，以 确保所有病毒的单个循环复制。收获细胞单层，并在感染后4、9和22小时提 取RNA。
将得自对照和受感染的A549细胞的总RNA(100ng)用于定量RT-PCR分 析。用寡-dT引物和Superscript II逆转录酶(Invitrogen)合成cDNA，并通过实时 定量PCR分析使用早期流感基因M1和晚期流感基因HA和细胞因子IP-10基 因的基因特异性引物进行定量。根据生产商的说明书，使用SYBR Green试剂 (Invitrogen,Carlsbad)进行反应。
使用持家基因γ-肌动蛋白和样品基因的系列10倍稀释，计算反应效率。在ABI7300实时PCR系统(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)上进行反应， 使用的热方案是：阶段1:50℃保持30min；阶段2:95℃保持15min；阶段3:94℃ 保持15秒，55℃保持30秒；和72℃保持30秒，重复30个循环。将所有定量(阈 值循环[CT]值)标准化为持家基因的值以产生ΔCT，并且将样品的ΔCT值和参照 (野生型样品)的ΔCT值之间的差异计算为-ΔΔCT。将mRNA表达的相对水平表 达为2-ΔΔCT。
在感染后4小时，就H3(表27)、PR8(表28)和H1N1pdm(图42)而言， M2KO(ΔTM)病毒HA mRNA表达类似于野生型M2病毒。由于更缓慢的复制动 力学，冷适应的在早期时间点小于野生型和M2KO(ΔTM)。在M1（早 期时间点基因）时，试验了mRNA表达，观察到类似的结果(表27,图42)。这 些结果提示，M2KO(ΔTM)在早期感染循环中产生类似水平的mRNA，以从头产 生病毒抗原，所述抗原产生与野生型病毒类似的‘危险信号’并诱导有效免疫应 答。
表27.H3HA基因的相对mRNA表达.
表28.PR8HA和M1基因的相对mRNA表达.
实施例20：M2Vero生产细胞的制备
通过标准分子技术，将PR8病毒的M2基因克隆进表达载体pCMV-SC (Stratagene,La Jolla,CA)中，以制备pCMV-PR8-M2。用EcoR1消化质粒以证实 300bp M2基因和4.5Kb载体的存在，如图43所示。确认含有M2基因插入片 段的质粒的序列，如图44所示。
M2Vero细胞的制备：根据生产商的说明书，使用Trans IT-LT1转染试剂 (Mirus)，将以前描述的且含有新霉素抗性基因的pCMV-PR8-M2质粒转染进 Vero细胞(ATCC CCL-81)。简而言之，在转染前一天，以5x105个细胞/100-mm 盘将Vero细胞铺板。在第1天，将10μg质粒DNA与20μg Trans IT-LT1在0.3 ml OptiMEM(Invitrogen)中混合，并与这些细胞一起在37℃在5%CO2温育过夜。 在第2天，用完全培养基替换转染混合物，所述完全培养基是补充了5%新生 小牛血清的改良伊格尔培养基(MEM)。所述培养基还含有1mg/ml遗传霉素(Invitrogen)，即用于选择表达新霉素蛋白的哺乳动物细胞的广谱抗生素。抗性细 胞(稳定地表达M2基因的Vero细胞)开始在选择培养基中生长，用新鲜选择培 养基替代该培养基，并通过在TC-96平板中的有限稀释来分离遗传霉素抗性的 克隆。使用M2特异性的单克隆抗体14C2(Santa Cruz Biotechnology)，通过免疫 染色证实M2蛋白的表面表达。
用M2KO(ΔTM)病毒感染亲本和修饰的M2Vero细胞：通过用 M2KO(ΔTM)-PR8病毒感染，试验了M2Vero细胞的充当M2KO(ΔTM)病毒的 生产细胞的能力。简而言之，使用标准流感感染操作，用M2KO(ΔTM)-PR8病 毒的10倍系列稀释物(10-1-10-6)感染单层M2Vero和亲本Vero细胞。将受感染 的细胞在35℃温育，并每天观察细胞病变效应(CPE)。仅M2Vero细胞表现出指 示病毒生长的CPE。在第4天从10-3孔收获上清液，并通过TCID50测定在稳定 表达M2基因的MDCK细胞(M2CK)上确定病毒滴度。在M2Vero细胞上生长 的M2KO(ΔTM)-PR8病毒滴度为106.75TCID50/ml，从而指示M2Vero细胞可以 充当用于制备M2KO(ΔTM)疫苗的生产细胞。
实施例21：流行性感冒疫苗的真皮内递送
本实施例证实了当肌内地(IM)、真皮内地(ID)和使用皮下微型针装置（诸如 在公开的美国专利申请2011/0172609中描述的装置）施用时，季节性流行性感 冒疫苗FluLaval(2011-2012制剂)的免疫原性。在第0天给无毛豚鼠接种，并在 第30天强化选定的组。在第0、30和60天收集血清，并通过酶联免疫吸附测 定(ELISA)分析血凝素特异性的IgG应答。
结果显示在图51-53中。数据显示了针对在季节性流行性感冒疫苗FluLaval 中配制的3个株的抗体水平的定性吸光度：A/加利福尼亚/7/2009NYMC X-181、 A/维多利亚/210/2009NYMC X-187(A/珀斯/16/2009-样病毒)和B/布里斯班 /60/2008。在第30天，IM和ID递送产生了针对所有病毒HA的相同IgG应答。 ID仅激发组在第60天表现出更高的滴度，这提示，ID递送诱导针对所有病毒 HA的持久免疫。

Claims (10)

1.一种重组流感病毒，其具有突变体M基因，所述突变体M基因由SEQ ID NO:1构成。
2.根据权利要求1所述的重组流感病毒，其中所述M基因的突变导致所述病毒表达M2蛋白的失败，或者造成所述病毒表达由SEQ ID NO:4的氨基酸序列构成的截短的M2蛋白。
3.根据权利要求1所述的重组流感病毒，其中所述突变体M基因不会恢复成野生型或编码功能性M2蛋白的非野生型序列在体外宿主细胞系统中至少10代，其中所述宿主细胞被修饰以生产野生型形式的所述突变体基因，由此将基因产物反向提供给所述病毒。
4.根据权利要求1所述的重组流感病毒，其中所述病毒是甲型流感病毒。
5.根据权利要求1所述的重组流感病毒，其中所述病毒在被所述病毒感染的哺乳动物中是非致病性的。
6.根据权利要求3所述的重组流感病毒，其中所述体外宿主细胞系统包含中国仓鼠卵巢细胞或Vero细胞。
7.一种用于繁殖重组流感病毒的方法，所述方法包括：使宿主细胞与由SEQ ID NO:1构成的重组流感病毒接触；和在适合病毒复制的条件下，温育所述宿主细胞足够的时间，其中所述宿主细胞被修饰以生产野生型形式的流感M基因，由此将基因产物反向提供给所述病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括：分离后代病毒颗粒，和/或将所述病毒颗粒配制成疫苗。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述重组流感病毒不会恢复成野生型或编码功能性M2蛋白的非野生型序列持续所述宿主细胞的至少10代。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述宿主细胞是CHO细胞或Vero细胞。
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