CN114438043B - 一种区分感染和免疫的致弱流感病毒疫苗株及疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种区分感染和免疫的致弱流感病毒疫苗株及疫苗，属于生物制品技术领域。流感病毒致弱毒株在含A/B嵌合型NA基因的流感病毒株的基础上对M基因进行突变获得；所述突变包括在CCTCTC序列的3'端后缺失一段长度8bp以上的DNA片段。流感病毒致弱毒株在MDCK‑M2细胞中可以生长，但不能在缺乏M2的MDCK细胞中生长，具有良好减毒效果，克服生产高致病性禽流感灭活疫苗需要培养非复制缺陷病毒带来生物安全风险；制备的灭活疫苗免疫SPF鸡后，免疫鸡血清检测到了较高水平的HAI效价，显示致弱流感病毒株所产生的毒株在制备禽类动物禽流感灭活疫苗中安全和有效，免疫产生的抗血清具有区分自然感染和免疫的能力。

Description

一种区分感染和免疫的致弱流感病毒疫苗株及疫苗
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种区分感染和免疫的致弱流感病毒疫苗株及疫苗。
背景技术
流感病毒属于正黏病毒科单股负链分节段RNA病毒，根据抗原性不同可以分为A，B，C，D型四种类型。其中，A型流感病毒(IAV)普遍感染禽类动物，B型流感病毒(IBV)主要感染人和海豹。这两种类型病毒表面都含有血凝素酶(HA)和神经氨酸酶(NA)，HA负责识别和结合细胞表面唾液酸受体，帮助病毒入侵细胞，NA蛋白可以破坏HA和宿主细胞受体结合，帮助子代病毒释放。
如果引入B型NA与A型HA结合的重配疫苗株，则能够在血清学层面区分免疫和感染动物，目前，已经有研究使用A型流感病毒HA基因与嵌合B型流感病毒NA基因，利用反向遗传学技术生产区分感染和免疫的流感病毒疫苗株，然而，目前对于高致病性禽流感病毒，如H5、H7等亚型禽流感病毒，由于生产过程存在安全性隐患，禽流感灭活疫苗的培养与生产均需要BLS-III级生产车间，大大增加了疫苗生产成本，阻碍了产业的发展。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用，不需要在BLS-III级生产车间制备，不仅大大降低生产成本而且杜绝生产过程中带来的生物安全风险；此外由本方法制备的禽流感灭活疫苗还具有区分感染和免疫动物的作用，有助于高致病性禽流感的防控和净化。
本发明提供了一种流感病毒致弱毒株，在含A/B嵌合型NA基因的流感病毒株的基础上对M基因进行突变获得；所述突变包括在CCTCTC序列的3'端后缺失一段长度8bp以上的DNA片段。
优选的，所述DNA片段的长度包括28～111bp。
优选的，所述DNA片段包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第一DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的第二DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的第三DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的第四DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的第五DNA片段和核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示的第六DNA片段。
优选的，所述突变还包括将CCTCTC序列突变为双终止密码子TGATGA。
优选的，所述A/B嵌合型NA基因是将A型流感病毒NA蛋白的胞外区序列替换为B型流感病毒NA蛋白的胞外区序列得到。
优选的，所述流感病毒株还包括突变的H5-HA基因片段。
优选的，所述突变的H5-HA基因片段为将HA的保守氨基酸序列SEQ ID NO:7突变为SEQ ID NO:8形成；
所述突变的H5-HA基因片段中HA基因来自于流行株高致病毒株A/Duck/Hubei/49/2005。
优选的，所述流感病毒株背景包括PR8病毒株。
本发明提供了所述流感病毒的制备方法，对流感病毒M基因的CCTCTC序列3’端后缺失一段8bp以上的DNA片段，构建得到Mdel缺陷型质粒；
利用经典的流感病毒6+2反向遗传系统，将所述Mdel缺陷型质粒、表达A/B嵌合型NA基因质粒与流感病毒其他基因双向表达质粒共转染细胞，收获病毒。
本发明提供了所述流感病毒致弱毒株在制备流感减毒疫苗中的应用。
本发明提供了所述流感病毒致弱毒株免疫产生的抗血清在制备区分免疫和自然感染的试剂中的应用。
本发明提供了一种流感病毒致弱毒株，在流感病毒株的基础上对M基因进行突变获得；所述突变包括在CCTCTC序列3'端后缺失一段长度8bp以上的DNA片段。对M基因的CCTCTC序列3'端后缺失一段不同长度的DNA片段，形成的流感病毒株仅在MDCK-M2中可以正常生长，不能在MDCK细胞中生长，表明本发明获得的毒株具有明显致弱作用。同时，鸡胚生长实验表明，与野生型毒株相比，不同长度DNA片段的缺失使毒株的血凝价下降明显，甚至不能在鸡胚中正常生产，说明本发明获得的毒株具有明显的减毒效果。
进一步的，本发明限定了缺失不同长度DNA片段。结果表明，缺失的DNA片段的长度能够影响毒株的生长性能。缺失片段的长度会影响毒株在细胞以及鸡胚中的生长，缺失51bp、73bp、91bp和111bp长度的DNA片段时，与野生型毒株比较具有理想的生长特性和致弱作用。
进一步的，本发明还限定了将M基因的CCTCTC序列突变为双终止密码子TGATGA。突变为双终止密码子同时缺失其后的DNA片段，有利于毒株表现较强的致弱作用，并且有更明显的减毒效果。
本发明提供了所述流感病毒致弱毒株在制备流感减毒疫苗中的应用。将致弱病毒进行家禽免疫后，所述毒株能够在家禽体内产生较高水平的HAI抗体效价，这表明所述毒株能够用于制备灭活疫苗。同时由于流感病毒致弱毒株带有A/B嵌合型NA基因，A/B嵌合型NA基因作为标签序列，使制备的灭活疫苗免疫动物产生的阳性血清具有区分免疫和自然感染的能力。
本发明提供了所述流感病毒致弱毒株免疫产生的抗血清在制备区分免疫和自然感染的试剂中的应用。
附图说明
图1为本发明对M基因质粒的改造示意图；
图2为本发明构建的减毒流感重配株病毒在MDCK-M2生长曲线；
图3为免疫荧光检测免疫鸡血清与A型以及B型NA蛋白的反应性。
具体实施方式
本发明提供了一种流感病毒致弱毒株，在含有A/B嵌合型NA基因的流感病毒株的基础上对M基因进行突变获得；所述突变包括在CCTCTC序列的3'端后缺失一段长度8bp以上的DNA片段。
在本发明中，所述M基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。对M基因进行突变见图1。所述DNA片段的长度优选包括28～111bp，更优选包括73～91bp。所述DNA片段优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2(ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCT)所示的第一DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:3(ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTT)所示的第二DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:4(ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCA)所示的第三DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:5(ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAAT)所示的第四DNA片段和核苷酸序列如SEQ ID NO:6(ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAATACGGACTGAAAGGAGGGCCT)所示的第五DNA片段和核苷酸序列如SEQ ID NO:17(ACTATTGC)所示的第六DNA片段。缺失8～111bp的DNA片段后，使得M2基因在蛋白表达水平产生移码突变或截短，所得毒株在生长和减毒方面与野生型毒株相比均具有显著降低。然而DNA片段的缺失长度并非越长效果越显著，在缺失111bp时，虽然在24～48h培养时间内毒株的滴度呈较低的趋势，然而在72～96h时毒株滴度有大幅度升高，明显高于其他长度的DNA片段的毒株。
在本发明中，所述突变优选还包括将CCTCTC序列突变优选为双终止密码子TGATGA(M2stop序列)。将CCTCTC突变为双终止密码子有利于进一步影响毒株的生长和减毒效果。
在本发明中，所述流感病毒株优选还包括突变的H5-HA基因片段。所述突变的H5-HA基因片段中突变为将HA的保守氨基酸序列SEQ ID NO:7(RERRRKRGLF)突变为SEQ ID NO:8(RETRGLF)形成。所述突变的H5-HA基因片段中HA基因优选来自于流行株高致病毒株A/Duck/Hubei/49/2005，具体氨基酸序列如SEQ ID NO:10(MEKIVLLLAVVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSEVEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRRKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI*)所示。突变的H5-HA基因片段有利于进一步减弱病毒的毒力，形成致弱毒株。
在本发明中，所述A/B嵌合型NA基因是在A型流感病毒NA的基础上，将NA基因的胞外区域更换为B型流感NA基因的胞外域得到，对应的表达A/B嵌合型NA基因质粒在CN201711167959.4的专利中已公开，A/B嵌合型NA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：18(AGCAAAAGCAGGGGTTTAAAATGAATCCAAATCAGAAAATAATAACCATTGGATCAATCTGTCTGGTAGTCGGACTAATTAGCCTAATATTGCAAATAGGGAATATAATCTCAATATGGATTAGCCATTCAATTCAAACTGGAAGTCAAAACCATACTGGAATATGCAACCAAAACATCATTACCTATAAAAATAGCACCTGGGTTCAGGCTGTAAATCATTCTGCAGCAAAAGGGGTGACACTTCTTCTCCCAGAACCGGAATGGACATACCCTCGTTTATCTTGCCCGGGCTCAACCTTTCAGAAAGCACTCCTAATTAGCCCCCATAGATTCGGAGAAATCAAAGGAAACTCAGCTCCCTTGATAATAAGGGAACCTTTTATTGCTTGTGGACCAACGGAATGCAAACACTTTGCTCTAACCCATTATGCAGCTCAACCAGGGGGATACTACAATGGAACAAGAGAAGACAGAAACAAGCTGAGGCATCTAATTTCAGTCAAATTGGGCAAAATCCCAACAGTAGAAAACTCCATTTTCCACATGGCAGCTTGGAGCGGGTCCGCATGCCATGATGGTAAAGAATGGACATATATCGGAGTTGATGGCCCCGACAGTAATGCATTGCTCAAAATAAAATATGGAGAAGCATATACTGACACATACCATTCCTATGCAAAAAACATCCTAAGGACACAAGAAAGTGCCTGCAATTGCATCGGGGGAGATTGTTATCTTATGATAACTGATGGCCCAGCTTCAGGGGTTAGTGAATGCAGATTCCTTAAGATTCGAGAGGGCAGAATAATAAAAGAAATATTTCCAACAGGAAGAGTAAAACATACTGAGGAATGCACATGCGGATTTGCCAGCAACAAAACCATAGAATGTGCTTGTAGAGATAACCGTTACACAGCAAAAAGACCCTTTGTCAAATTAAATGTGGAGACTGATACAGCGGAAATAAGATTGATGTGCACAGAGACTTATTTGGACACCCCCAGACCAAATGATGGAAGCATAACAGGGCCTTGCGAATCTGATGGGGACAAAGGGAGTGGAGGCATCAAGGGAGGATTTGTTCATCAAAGAATGGCATCCAAGATTGGAAGGTGGTACTCTCGAACGATGTCTAAAACCAAAAGAATGGGGATGGGACTGTATGTAAAATATGATGGAGACCCATGGACTGACAGTGAAGCCCTTGCTCTTAGTGGAGTAATGGTTTCAATGGAAGAACCTGGTTGGTATTCCTTTGGCTTCGAAATAAAAGATAAGAAATGTGATGTCCCCTGTATTGGGATAGAAATGGTACATGATGGTGGGAAAACGACTTGGCACTCAGCAGCAACAGCCATTTATTGTTTAATGGGCTCAGGACAATTGCTGTGGGACACTGTCACAGGTGTTGATATGGCTCTGTAAGAGGCCGTGCTTCTGGGTTGAATTAATCAGGGGACGACCTAAAGAAAAAACAATCTGGACTAGTGCGAGCAGCATTTCTTTTTGTGGCGTGAATAGTGATACTGTAGATTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAGTTGCCATTCAGCATTGACAAGTAGTCTGTTCAAAAAACTCCTTGTTTCTACT)所示。
在本发明中，所述流感病毒株的背景毒株优选包括PR8病毒株。在本发明实施例中，分别构建了缺失8bp、28bp、51bp、73bp、91bp和111bp的DNA片段的毒株，依次命名为Re-MuH5-DIVA-Mdel8，Re-MuH5-DIVA-Mdel28，Re-MuH5-DIVA-Mdel51，Re-MuH5-DIVA-Mdel73，Re-MuH5-DIVA-Mdel91，Re-MuH5-DIVA-Mdel111。当在缺失73bp、91bp的DNA片段的同时还包括CCTCTC序列突变为双终止密码子时，得到的毒株依次为Re-MuH5-DIVA-M2stop Mdel73，Re-MuH5-DIVA-M2stopMdel91。
在本发明中，所述流感病毒致弱毒株的构建方法，优选包括以下步骤：
对流感病毒M基因的CCTCTC序列3’端后缺失一段长度8bp以上的DNA片段，构建得到Mdel缺陷型质粒；
利用经典的流感病毒6+2反向遗传系统，将所述Mdel缺陷型质粒、表达A/B嵌合型NA基因质粒与流感病毒其他基因双向表达质粒共转染细胞，收获病毒。
在本发明中，所述表达Mdel缺陷型质粒的构建方法，优选对流感病毒M基因CCTCTC序列3'端后缺失一段长度8bp以上的DNA片段，形成表达Mdel缺陷型质粒。在本发明实施例中，缺失DNA片段后的M基因的序列如SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:16。优选pFlu-PR8-M质粒为基础进行缺失处理。所述缺失处理的方法优选为同源重组克隆。
在本发明中，所述表达其他基因的质粒包括PB2质粒、PB1质粒、PA质粒、NP质粒、NS质粒、HA质粒、NA质粒和表达M2蛋白的质粒。在本发明实施例中，PB2质粒为pFlu-PR8-PB2。PB1质粒为pFlu-PR8-PB1。PA质粒为pFlu-PR8-PA。NP质粒为pFlu-PR8-NP。NS质粒为pFlu-PR8-NS。HA质粒为pFlu-MuH5-HA。NA质粒为pFlu-PR8-BNA，其中BNA为上述A/B嵌合型NA基因。表达M2蛋白的质粒为表达A/Puerto Rico/8/1934全长M2蛋白的质粒。
本发明提供了一种流感病毒的致弱方法，在流感病毒株的M基因CCTCTC序列3'端后缺失一段长度8bp以上的DNA片段。
本发明对流感病毒株的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的流感病毒株即可，例如A/Puerto Rico/8/1934H1N1(PR8)。所述DNA片段的具体序列与上述方案中DNA片段的序列一致，在此不做赘述。
本发明提供了所述流感病毒致弱毒株在制备区分感染和免疫的禽流感减毒灭活疫苗中的应用。
本发明提供了所述流感病毒致弱毒株免疫产生的抗血清在制备区分免疫和自然感染的试剂中的应用。
在本发明中，鉴于流感病毒致弱毒株构建时采用A/B嵌合型NA基因，将A型流感病毒株来源的NA基因的胞外区域更换为B型流感NA基因的胞外域，使制备的流感病毒致弱毒株胞外表达B型NA蛋白，在免疫动物时，产生针对胞外表达B型NA蛋白表位的抗血清，从而实现对流感病毒致弱毒株制备的灭活疫苗发生抗原抗体免疫反应，而对自然免疫的A型流感病毒不能实现检测，从而达到区分免疫和自然感染的目的。
下面结合实施例对本发明提供的一种区分感染和免疫的致弱流感病毒疫苗株及疫苗进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
不同种类的表达M缺陷型质粒的构建方法
1.定义M基因上两个终止密码子，缺失不同长度序列del8，del28，del51，del73，del91，del111缺陷型质粒统称为Mdel缺陷型质粒。
针对所要构建的缺陷型质粒，设计如表1所示的引物：
表1 Mdel缺陷型质粒构建用引物序列
del8-F tcaagtgatcctctccgcaaatatcattgggatcttg(SEQ ID NO：19)
del28-F tcaagtgatcctctctgcacttgacattgtggattcttg(SEQ ID NO：20)
del51-F tcaagtgatcctctcgatcgtctttttttcaaatg(SEQ ID NO：21)
del73-F tcaagtgatcctctctttaccgtcgctttaaatacg(SEQ ID NO：22)
del91-F tcaagtgatcctctcacggactgaaaggagggccttct(SEQ ID NO：23)
Del111-F tcaagtgatcctctctctacggaaggagtgccaaag(SEQ ID NO：24)
M2stopdel73 tcaagtgattgatgatttaccgtcgctttaaatacg(SEQ ID NO：25)
M2stopdel91 tcaagtgattgatgaacggactgaaaggagggccttct(SEQ ID NO：26)
PR8delR tcatcaatcacttgaaccgttg(SEQ ID NO：27)
以包含A型流感病毒(A/Puerto Rico/8/1934)M基因的载体质粒pFlu-PR8-M为模板，以表1中所示的每个上游引物和共同的下游引物PR8delR配对，用高保真酶PrimerSTAR进行PCR扩增，按PrimerSTAR说明常规操作说明进行实验，分别扩增得到del片段。实验中，退火温度58℃，延伸温度72℃，延伸时间1.5min。反应体系如表2：
表2反应体系
名称 体积/微升
模板质粒 1(100ng)
反向引物 0.5
正向引物 0.5
PrimerSTAR 0.5
2×buffer 25
ddH2O 22.5
总体积 50
将扩增得到的片段按照HiFi DNAAssembly试剂盒说明书要求，进行同源重组克隆。克隆体系如表3：
表3克隆体系
将克隆产物转化大肠杆菌细胞，涂布LB氨苄平板后，在37℃培养24h，挑单克隆菌落，用常规生物学方法提取质粒，将获得的载体用引物gctggtctgaaaaatgatcttcttg(SEQID NO：9)进行测序。通过测序比对突变体M2序列，最终得到缺陷型Mdel质粒(pFlu-PR8-Mdel8、pFlu-PR8-Mdel28、pFlu-PR8-Mdel51、pFlu-PR8-Mdel73、pFlu-PR8-Mdel91、pFlu-PR8-Mdel111、pFlu-PR8-M2stop del73、pFlu-PR8-M2stop del91)。
实施例2
pFlu-MuH5-HA质粒的构建方法
pFlu-MuH5-HA质粒中的HA来自于流行株高致病毒株A/Duck/Hubei/49/2005，MuH5是将HA氨基酸序列中高保守序列(RERRRKRGLF)突变为低致病性氨基酸序列(RETRGLF)，形成的MuH5基因由金唯智生物进行基因合成而来。
实施例3
采用经典“6+2”流感反向遗传操作系统拯救重组病毒疫苗株。将6个PR8内部基因pFlu-PR8-PB2、pFlu-PR8-PB1，pFlu-PR8-PA、pFlu-PR8-NP、实施例1构建的pFlu-PR8-Mdel缺陷型质粒和pFlu-PR8-NS和2个外部基因实施例2构建的pFlu-MuH5-HA和pFlu-PR8-BNA(参见CN201711167959.4专利记载)各0.5μg，以及表达M2蛋白的质粒pCAG-M2各0.25μg分别共转染到293T细胞(Lipofectamine 3000)。转染后24h更换含有终浓度为0.5μg/ml TPCK-Trypsin的培养液，并在转染后48h收集细胞上清，将细胞上清按照0.2ml/枚通过尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚。接种后的鸡胚在37℃温箱内培养48h。收集鸡胚尿囊液(F0代)，获得Re-MuH5-DIVA-Mdel8，Re-MuH5-DIVA-Mdel28，Re-MuH5-DIVA-Mdel51，Re-MuH5-DIVA-Mdel73，Re-MuH5-DIVA-Mdel91，Re-MuH5-DIVA-Mdel111疫苗株和Re-MuH5-DIVA-M2stop del73，Re-MuH5-DIVA-M2stop del91疫苗株，并测定其是否有血凝价。如果没有血凝价，将收获病毒盲传一代，再测其是否有血凝价。
实施例4
减毒流感病毒生长曲线
将MDCK-M2细胞铺于24孔板，待细胞长满单层后，将实施例3获得的不同种类的疫苗株以感染复数(MOI)为0.001的剂量接种细胞，做3个重复，感作2h后，弃掉24孔板中的液体，用PBS洗涤后加入含2％FBS的DMEM培养基维持细胞生长，置37℃、5％CO2，培养箱中培养。分别在感染后12、24、36、48、60和72h收获病毒，将收获的不同时间点的病毒液作连续10倍倍比稀释后，每个稀释度做4个重复，分别接种于96孔板中长至单层的MDCK-M2细胞中，感染2h后换成2％FBS的DMEM培养液维持细胞的生长，48h后观察细胞病变，测定减毒流感病毒株的毒价，应用Reed-Muench方法计算其TCID50，数据分析完成后，绘制减毒流感重组病毒的生长曲线。对照使用野生型PR8毒株。其中，MDCK-M2细胞是通过慢病毒系统构建而来的流感病毒M2基因稳转细胞系。
不同种类的疫苗株在MDCK-M2生长曲线见图2。由以上结果可知，M缺陷型致弱重配株病毒在MDCK-M2中可以正常生长，48h，72h，96h时病毒滴度基本达到106TCID50/ml左右，其中，Re-MuH5-DIVA-Mdel111毒株在72h时的生长滴度与野生型PR8毒株相近。同时，以上所有Mdel缺陷型致弱重配株病毒(MOI＝0.001)不能在MDCK细胞中生长，说明本发明所产生的毒株具有明显致弱作用。
实施例5
鸡胚生长实验
将实施例3获取的M基因部分删除片段大于50bp以上的流感疫苗株以及PR8-WT(PR8野生型病毒)以病毒原液接种10日龄SPF鸡胚，100μl/胚×3枚，培养72h后收集鸡胚尿囊液测量血凝价。
结果见表4。致弱疫苗株在鸡胚生长血凝价在0到2.5之间，Re-H5-DIVA-Mdel91，Re-H5-DIVA-Mdel111，Re-H5-DIVA-M2stop del73，Re-H5-DIVA-M2stop del91血凝价下降明显，基本不能在鸡胚正常生长，而PR8野生型毒株血凝价可以达到9.5以上。可见本发明的重组流感病毒减毒效果明显。同时，由结果可知，删除不同的基因序列长度对病毒的毒性影响不同。另外，终止密码子的引入进一步使得重组流感病毒毒力减弱，表现出较强的致弱作用。
表4减毒株在鸡胚生长情况
备注：半个0是指第一个未稀释的孔有半个血凝价。
实施例6
Re-H5-DIVA-Mdel灭活疫苗的制备方法
选取Re-MuH5-DIVA-Mdel28疫苗株F0、F1、F2或F3代尿囊液50ml，用终浓度0.25％的福尔马林溶液37℃灭活24h。将灭活后的尿囊液加入2％的Tween-80，待充分溶解后与含有3％Span 80的白油乳化，乳化比例为1：3，剪切乳化速度12000rpm，3min。经剂型检验、粒度检验、粘度检验、稳定性检验，确定灭活油苗为乳白色的油包水型乳剂，粘度低，颗粒大小均匀，稳定性好，适宜注射。
实施例7
区分感染和免疫致弱流感灭活疫苗免疫家禽
使用上述实施例得到的灭活疫苗分别免疫8只3周龄SPF鸡，0.3ml/只，颈部皮下注射，免疫后21天采血，分离血清，测定HAI抗体效价，HAI试验参考GBT 18936-2003(高致病性禽流感诊断技术)。结果见表5，免疫后鸡血清HAI抗体效价总体较高，平均可以达到6.6±0.98log2，可见减毒流感病毒灭活疫苗能够在鸡体内产生较高水平HAI。
表5免疫血清HAI抗体效价
实施例8
血清学试验
首先制备A型和B型流感病毒NA基因的表达质粒。将A型流感病毒N1(A/PuertoRico/8/1934(H1N1))，N2(A/Korea/426/1968(H2N2))，N3(A/duck/Singapore/3/97(H5N3))，N4(A/mallard/New York/AH0179244/2021(H5N4))，N5(A/duck/Liaoning/LN/2011(H5N5))，N6(A/duck/Yunnan/87/2007(H7N6))，N7(A/chicken/Wenzhou/334b/2013(H7N7))，N8(A/equine/Xuzhou/01/2013(H3N8))和N9(A/Shanghai/02/2013(H7N9))基因编码区域，以及B型NA(B/Massachusetts/2/2012)基因编码区域通过同源重组克隆到pCAGGS真核表达质粒，分别命名为pCAGGS-N1～pCAGGS-N9，以及pCAGGS-B-NA。将以上质粒按照Lipofectamine 3000转染试剂说明书转染提前铺布在24孔板上的293T细胞，转染后30h使用免疫荧光检测上述免疫鸡血清与细胞上表达的A型NA以及B型NA的反应性。
免疫荧光方法为：1)固定：4％多聚甲醛4℃固定过夜，1×PBS洗3×1min，最后一遍吸尽液体；
2)透膜：0.2％Triton x 100(1×PBS配制)，室温放置10min，洗涤同上；
3)封闭：5％BSA(1×PBS配制，现配现用)，200μL/孔，37℃1h，洗涤同上；
4)一抗：用1％BSA按1:50稀释免疫后禽流感NA阳性血清，200μL/孔，37℃孵育1h，洗涤同上；
5)二抗：用1％BSA按1:500稀释驴抗鸡IgY，0.5mg/mL(红光，Jackson Alexa Fluor594)，200μL/孔，37℃避光孵育0.5h，洗涤同上；
6)染核：DAPI(5mg/mL)1：100稀释后染核，室温静置5min，洗涤同上。最后加适量1×PBS，荧光显微镜观察细胞荧光情况。
由图3可知，上述免疫鸡血清仅能够检测到B型流感B/Massachusetts/2/2012病毒株NA蛋白(B-NA)，而不能够检测到293T细胞中表达的所有A型流感病毒NA蛋白(N1到N9)。表明由本发明的减毒流感病毒生产的灭活疫苗免疫血清具有区分免疫和感染动物的能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江迪福润丝生物科技有限公司
<120> 一种区分感染和免疫的致弱流感病毒疫苗株及疫苗
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 982
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720
cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat cctctcacta ttgccgcaaa 780
tatcattggg atcttgcact tgacattgtg gattcttgat cgtctttttt tcaaatgcat 840
ttaccgtcgc tttaaatacg gactgaaagg agggccttct acggaaggag tgccaaagtc 900
tatgagggaa gaatatcgaa aggaacagca gagtgctgtg gatgctgacg atggtcattt 960
tgtcagcata gagctggagt aa 982
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actattgccg caaatatcat tgggatct 28
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actattgccg caaatatcat tgggatcttg cacttgacat tgtggattct t 51
<210> 4
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actattgccg caaatatcat tgggatcttg cacttgacat tgtggattct tgatcgtctt 60
tttttcaaat gca 73
<210> 5
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
actattgccg caaatatcat tgggatcttg cacttgacat tgtggattct tgatcgtctt 60
tttttcaaat gcatttaccg tcgctttaaa t 91
<210> 6
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actattgccg caaatatcat tgggatcttg cacttgacat tgtggattct tgatcgtctt 60
tttttcaaat gcatttaccg tcgctttaaa tacggactga aaggagggcc t 111
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe
1 5 10
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe
1 5
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctggtctga aaaatgatct tcttg 25
<210> 10
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
50 55 60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
115 120 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
130 135 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Thr Pro Ser Phe Phe
145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp
180 185 190
Gly Ile His His Ser Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
210 215 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225 230 235 240
Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
260 265 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly
275 280 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
325 330 335
Pro Leu Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala
340 345 350
Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu
370 375 380
Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile
385 390 395 400
Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn
405 410 415
Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly
420 425 430
Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu
435 440 445
Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr
450 455 460
Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn
465 470 475 480
Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser
485 490 495
Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg
500 505 510
Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr
515 520 525
Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu
530 535 540
Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser
545 550 555 560
Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 11
<211> 974
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
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cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat cctctccgca aatatcattg 780
ggatcttgca cttgacattg tggattcttg atcgtctttt tttcaaatgc atttaccgtc 840
gctttaaata cggactgaaa ggagggcctt ctacggaagg agtgccaaag tctatgaggg 900
aagaatatcg aaaggaacag cagagtgctg tggatgctga cgatggtcat tttgtcagca 960
tagagctgga gtaa 974
<210> 12
<211> 954
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
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gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
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cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat cctctctgca cttgacattg 780
tggattcttg atcgtctttt tttcaaatgc atttaccgtc gctttaaata cggactgaaa 840
ggagggcctt ctacggaagg agtgccaaag tctatgaggg aagaatatcg aaaggaacag 900
cagagtgctg tggatgctga cgatggtcat tttgtcagca tagagctgga gtaa 954
<210> 13
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
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aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
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tggtcatttt gtcagcatag agctggagta a 931
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<211> 909
<212> DNA
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ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
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gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
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ctggagtaa 909
<210> 15
<211> 891
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
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aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720
cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat cctctcacgg actgaaagga 780
gggccttcta cggaaggagt gccaaagtct atgagggaag aatatcgaaa ggaacagcag 840
agtgctgtgg atgctgacga tggtcatttt gtcagcatag agctggagta a 891
<210> 16
<211> 871
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720
cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat cctctctcta cggaaggagt 780
gccaaagtct atgagggaag aatatcgaaa ggaacagcag agtgctgtgg atgctgacga 840
tggtcatttt gtcagcatag agctggagta a 871
<210> 17
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
actattgc 8
<210> 18
<211> 1612
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agcaaaagca ggggtttaaa atgaatccaa atcagaaaat aataaccatt ggatcaatct 60
gtctggtagt cggactaatt agcctaatat tgcaaatagg gaatataatc tcaatatgga 120
ttagccattc aattcaaact ggaagtcaaa accatactgg aatatgcaac caaaacatca 180
ttacctataa aaatagcacc tgggttcagg ctgtaaatca ttctgcagca aaaggggtga 240
cacttcttct cccagaaccg gaatggacat accctcgttt atcttgcccg ggctcaacct 300
ttcagaaagc actcctaatt agcccccata gattcggaga aatcaaagga aactcagctc 360
ccttgataat aagggaacct tttattgctt gtggaccaac ggaatgcaaa cactttgctc 420
taacccatta tgcagctcaa ccagggggat actacaatgg aacaagagaa gacagaaaca 480
agctgaggca tctaatttca gtcaaattgg gcaaaatccc aacagtagaa aactccattt 540
tccacatggc agcttggagc gggtccgcat gccatgatgg taaagaatgg acatatatcg 600
gagttgatgg ccccgacagt aatgcattgc tcaaaataaa atatggagaa gcatatactg 660
acacatacca ttcctatgca aaaaacatcc taaggacaca agaaagtgcc tgcaattgca 720
tcgggggaga ttgttatctt atgataactg atggcccagc ttcaggggtt agtgaatgca 780
gattccttaa gattcgagag ggcagaataa taaaagaaat atttccaaca ggaagagtaa 840
aacatactga ggaatgcaca tgcggatttg ccagcaacaa aaccatagaa tgtgcttgta 900
gagataaccg ttacacagca aaaagaccct ttgtcaaatt aaatgtggag actgatacag 960
cggaaataag attgatgtgc acagagactt atttggacac ccccagacca aatgatggaa 1020
gcataacagg gccttgcgaa tctgatgggg acaaagggag tggaggcatc aagggaggat 1080
ttgttcatca aagaatggca tccaagattg gaaggtggta ctctcgaacg atgtctaaaa 1140
ccaaaagaat ggggatggga ctgtatgtaa aatatgatgg agacccatgg actgacagtg 1200
aagcccttgc tcttagtgga gtaatggttt caatggaaga acctggttgg tattcctttg 1260
gcttcgaaat aaaagataag aaatgtgatg tcccctgtat tgggatagaa atggtacatg 1320
atggtgggaa aacgacttgg cactcagcag caacagccat ttattgttta atgggctcag 1380
gacaattgct gtgggacact gtcacaggtg ttgatatggc tctgtaagag gccgtgcttc 1440
tgggttgaat taatcagggg acgacctaaa gaaaaaacaa tctggactag tgcgagcagc 1500
atttcttttt gtggcgtgaa tagtgatact gtagattggt cttggccaga cggtgctgag 1560
ttgccattca gcattgacaa gtagtctgtt caaaaaactc cttgtttcta ct 1612
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcaagtgatc ctctccgcaa atatcattgg gatcttg 37
<210> 20
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcaagtgatc ctctctgcac ttgacattgt ggattcttg 39
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcaagtgatc ctctcgatcg tctttttttc aaatg 35
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcaagtgatc ctctctttac cgtcgcttta aatacg 36
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcaagtgatc ctctcacgga ctgaaaggag ggccttct 38
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tcaagtgatc ctctctctac ggaaggagtg ccaaag 36
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcaagtgatt gatgatttac cgtcgcttta aatacg 36
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcaagtgatt gatgaacgga ctgaaaggag ggccttct 38
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcatcaatca cttgaaccgt tg 22

Claims (5)

1.一种流感病毒致弱毒株，其特征在于，在含A/B嵌合型NA基因的流感病毒株的基础上对M基因进行突变获得；所述突变包括在CCTCTC序列3'端后缺失一段长度8bp以上的DNA片段；
所述A/B嵌合型NA基因是在A型流感病毒NA的基础上，将NA基因的胞外区域更换为B型流感NA基因的胞外域得到；
所述DNA片段的长度为28bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
流感病毒株背景来自PR8病毒株。
2.根据权利要求1所述流感病毒致弱毒株，其特征在于，所述流感病毒株存在突变的H5-HA基因片段；
所述突变的H5-HA基因片段为将HA的保守氨基酸序列SEQ ID NO:7突变为SEQ ID NO:8形成；
所述突变的H5-HA基因片段中HA基因来自于流行株高致病毒株A/Duck/Hubei/49/2005。
3.一种权利要求1~2任意一项所述流感病毒致弱毒株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
对流感病毒M基因的CCTCTC序列3'端后缺失一段长度8bp以上的DNA片段，构建得到Mdel缺陷型质粒；所述DNA片段的长度为28bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
利用经典的流感病毒6+2反向遗传系统，将所述Mdel缺陷型质粒、表达A/B嵌合型NA基因质粒与流感病毒其他基因双向表达质粒共转染细胞，收获病毒。
4.权利要求1~2任意一项所述流感病毒致弱毒株或权利要求3所述制备方法得到的流感病毒致弱毒株在制备流感减毒灭活疫苗中的应用。
5.权利要求1~2任意一项所述流感病毒致弱毒株或权利要求3所述制备方法得到的流感病毒致弱毒株免疫产生的抗血清在制备区分免疫和自然感染的试剂中的应用。
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Denomination of invention: A attenuated influenza virus vaccine strain and vaccine that distinguishes infection and immunity

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Pledgor: Zhejiang Difu runsi Biotechnology Co.,Ltd.

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