CN110573614A - 针对流感的免疫原性组合物 - Google Patents
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Abstract
本文公开了涉及突变体病毒、特别是突变体流感病毒的组合物和方法。本文公开的突变体病毒包含突变体M2序列、突变体BM2序列，并且可用于免疫原性组合物、例如作为四价疫苗的免疫原性组合物中。本文还公开了用于繁殖病毒突变体的方法、组合物和细胞，以及涉及接种疫苗的方法、装置和组合物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年2月27日提交的美国申请第62/464,019号的权益和优先权，其内容通过引用整体并入本文。
背景技术
流感是美国成年人死亡的主要原因。每年约有36,000人死于流感，并且超过200,000人住院。流感是高度传染性疾病，其通过咳嗽、打喷嚏以及与携带病毒的物体(诸如门把手和电话)直接物理接触而传播。流感的症状包括发烧、极度疲劳、头痛、发冷和身体疼痛；大约50％的感染者没有症状但仍具有传染性。只要正在流行的病毒株的抗原性与疫苗的抗原性相匹配，免疫接种在65岁以下的健康人群中在预防流感方面50％至60％有效。
接种疫苗是预防流感的主要方法，并且目前可用的是减毒活病毒疫苗和灭活(杀灭)病毒疫苗。通常鼻内施用的活病毒疫苗激活免疫系统的所有阶段，并可以刺激对多种病毒抗原的免疫应答。因此，活病毒的使用克服了在制备灭活的病毒疫苗期间可能发生的病毒抗原破坏的问题。此外，活病毒疫苗产生的免疫力通常比灭活疫苗诱导的免疫力更持久、更有效且交叉反应更强，并且活病毒疫苗的生产成本低于灭活病毒疫苗。然而，减毒病毒的突变通常是不明确的，并且回复(reversion)是一个问题。
发明内容
在一方面，本发明提供了免疫原性组合物，其中，该组合物是包含来自至少两种流感株的重组病毒的多价组合物。
在一些实施方式中，多价组合物包含：a)至少一种经工程化的减毒流感AM2缺陷型重组病毒，其中，经工程化的流感A病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因；和b)至少一种经工程化的减毒流感BM2缺陷型重组病毒，其中，经工程化的流感B病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因。在一些实施方式中，至少一种流感A病毒选自H1N1亚型和H3N2亚型的组，至少一种流感B病毒选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组。
在一些实施方式中，多价组合物包含选自由以下组成的组的重组病毒：a)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的两种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的两种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因；b)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的两种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的一种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因；c)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的一种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的两种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQID NO:11的突变体BM2基因；和d)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的一种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的一种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因。
在一些实施方式中，多价组合物是四价组合物，包含：a)两种经工程化的减毒流感A病毒，由以下组成：i)具有包含SEQ ID NO:1的突变体M2基因的H1N1，和ii)具有包含SEQID NO:1的突变体M2基因的H3N2；和b)两种经工程化的减毒流感B病毒，由以下组成：i)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Victoria，和ii)具有包含SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Yamagata。
在一些实施方式中，多价组合物是四价组合物，包含：a)两种经工程化的减毒流感A病毒，其由以下组成：i)具有包含SEQ ID NO:1的突变体M2基因的H1N1，和ii)具有包含SEQID NO:1的突变体M2基因的H3N2；和b)一种经工程化的减毒流感B病毒，选自由以下组成的组：i)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Victoria，和ii)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Yamagata。
在一些实施方式中，本发明的免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方式中，本发明的免疫原性组合物还包含药学上可接受的佐剂。在一些实施方式中，本技术的免疫原性组合物配制为用于鼻内施用或皮内施用。
在一方面，本发明提供了刺激针对流感A和流感B的免疫应答的方法，其包括向有需要的对象施用多价免疫原性组合物，该组合物包含：a)至少一种经工程化的减毒流感AM2缺陷型重组病毒，其中，所述经工程化的流感A病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因；和b)至少一种经工程化的减毒流感BM2缺陷型重组病毒，其中，所述经工程化的流感B病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因。
在一些实施方式中，至少一种流感A病毒选自H1N1亚型和H3N2亚型的组，至少一种流感B病毒选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组。
在一些实施方式中，多价免疫原性组合物包含选自由以下组成的组的重组病毒：a)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的两种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的两种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因；b)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的两种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的一种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因；c)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的一种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的两种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因；和d)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的一种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的一种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因。
在一些实施方式中，多价免疫原性组合物是四价组合物，包含：a)两种经工程化的减毒流感A病毒，其由以下组成：i)具有包含SEQ ID NO:1的突变体M2基因的H1N1，和ii)具有包含SEQ ID NO:1的突变体M2基因的H3N2；和b)两种经工程化的减毒流感B病毒，其由以下组成：i)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Victoria，和ii)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Yamagata。
在一些实施方式中，多价免疫原性组合物是四价组合物，包含：a)两种经工程化的减毒流感A病毒，其由以下组成：i)具有包含SEQ ID NO:1的突变体M2基因的H1N1，和ii)具有包含SEQ ID NO:1的突变体M2基因的H3N2；和b)一种经工程化的减毒流感B病毒，其选自由以下组成的组：i)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Victoria，和ii)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Yamagata。
在一些实施方式中，本发明的免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方式中，本发明的免疫原性组合物还包含药学上可接受的佐剂。在一些实施方式中，本发明的免疫原性组合物配制为用于鼻内施用或皮内施用。
附图说明
图1是描述M2离子通道在流感病毒生命周期中的作用的图，其中，(1)流感病毒附着于细胞表面上的唾液酸受体；(2)病毒内化到细胞内；(3)M2离子通道在病毒表面上表达；(4)M2离子通道打开以允许质子进入，导致释放病毒RNA，该病毒RNA进入细胞核、被复制并导致病毒蛋白质合成；和(5)病毒组分被包装成病毒体并被释放(6)。
图2是显示由四价疫苗制剂中的BM2SR病毒引发的抗HA IgG抗体应答的图表。
图3A至图3D是显示由多价制剂中的BM2SR和M2SR病毒引发的抗HA IgG抗体应答的图表。Mono/B WI01＝单价B/WI01(包含含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体)；mono B/Bris60＝单价B/Bris60(包含含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体)；mono CA07＝单价CA07(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)；mono Bris10＝单价Bris 10(包含含有SEQ IDNO:1的M2SR-1突变体)；BIV H1H3＝二价H1H3(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)；TIVH3VY＝三价H3VY(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体和含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体)；TIV H1VY＝三价H1VY(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体和含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体)；TIV H1H3V＝三价H1H3V(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体和含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体)；TIV H1H3Y＝三价H1H3Y(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体和含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体)；四价(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体和含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体)。
图4A是显示用单价BM2SR、单价M2SR和四价疫苗接种后的流感B攻击后小鼠体重变化的图表。
图4B是显示用单价BM2SR、单价M2SR和四价疫苗接种后的流感B攻击后小鼠存活率的图表。
图4C是显示在流感B攻击后第4天来自不同接种疫苗组的小鼠的病毒滴度的图表。
图5A是显示用单价BM2SR、单价M2SR和四价疫苗接种后的流感A攻击后小鼠体重变化的图表。
图5B是显示用单价BM2SR、单价M2SR和四价疫苗接种后的流感A攻击后小鼠存活率的图表。
图5C是显示在流感A攻击后第4天来自不同接种疫苗组的小鼠的病毒滴度的图表。
图6A至图6B是显示用单价BM2SR和四价制剂接种后针对流感B病毒引发的抗-HAIgG抗体滴度的图表。代表性BM2SR构建体：B/CA12是B Yamagata BM2SR；B/Bris46是BVictoria BM2SR。四价制剂是两种BM2SR和H1N1和H3N2 M2SR的混合物。
图7A至图7D是显示M2SR和BM2SR突变体在多价制剂中引发针对流感A病毒和流感B病毒的抗体应答的图表。代表性的M2SR和BM2SR构建体：A/MA15是H1N1 M2SR；A/HK4801是H3N2 M2SR；B/CA12是B Yamagata BM2SR-4；B/Bris46是B Victoria BM2SR-4。四价(“quad”)制剂是所有四种的混合物。三价(“tri”)是所示的三种病毒的制剂。
图8A至图8B是分别显示在用单价BM2SR、三价制剂和四价制剂接种后的致死剂量流感B攻击后小鼠体重变化和存活率的图表。
图9A至图9B是分别显示在用三价M2SR制剂(包含H1N1(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)、H3N2(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)、和B/Yamagata(包含含有SEQ ID NO:9的BM2SR-4突变体))或四价M2SR制剂(包含H1N1(包含H1N1(包含含有SEQ IDNO:1的M2SR-1突变体)、H3N2(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)、B/Victoria谱系(包含含有SEQ ID NO:9的BM2SR-4突变体)、和B/Yamagata(包含含有SEQ ID NO:9的BM2SR-4突变体))接种后的致死剂量流感A攻击后小鼠体重变化和存活率的图表。
图10是显示针对四价疫苗的每种组分引发的酶联免疫吸附测定(ELISA)滴度的图表。
图11A是显示针对四价疫苗的每种组分引发的血凝抑制(HAI)滴度的图表。
图11B是显示在接种后第35天在汇集的血清中针对四价疫苗的每种组分引发的HAI滴度的表。
图12是显示流感A攻击后第1天、第3天、第5天和第7天的鼻洗液病毒滴度的图表。
图13A是显示流感A攻击后第3天鼻甲组织中病毒滴度的图表。
图13B是显示流感A攻击后第3天气管组织中病毒滴度的图表。
图13C是显示流感A攻击后第3天肺组织中病毒滴度的图表。
具体实施方式
I.定义
本文使用以下术语，提供其定义用于指导。
如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该”表示单数和复数，除非明确指出仅指定单数。
无论是否由术语约限定，术语“约”和范围的使用一般而言意味着所理解的数字不限于本文所述的确切数字，并且旨在表示基本上在引用范围内的范围，而不脱离本发明的范围。如本文所用，“约”将为本领域普通技术人员所理解，并且在某种程度上根据其使用的上下文而变化。如果该术语的使用在其使用的上下文中对于本领域普通技术人员是不明确的，则“约”将意味着高达特定术语的正负10％。
如本文所用，与病毒一起使用的术语“减毒的”是指与非减毒的对应物相比具有降低的毒力或致病性的、但仍然存活或是活的病毒。通常，与非减毒的病毒相比，减毒使得感染因子(诸如病毒)对受感染的对象的危害较小或毒性较小。这与杀灭的或完全失活的病毒相反。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”或“药学有效量”是指足以实现所期望的治疗效果和/或预防效果的量，例如，导致预防疾病、病症和/或其症状的量。在治疗或预防应用的背景下，向对象施用的组合物的量将取决于疾病的类型和严重程度以及个体的特征，诸如一般健康状况、年龄、性别、体重和对组合物药物的耐受性。它还将取决于疾病或病症的程度、严重程度和类型。技术人员将能够根据这些因素和其他因素确定合适的剂量。在一些实施方式中，施用多个剂量。另外地或替选地，在一些实施方式中，施用多种治疗组合物或化合物(例如免疫原性组合物，诸如疫苗)。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指其中病原体(诸如病毒)可以复制的细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是体外培养的细胞。此种宿主细胞的非限制性实例包括但不限于CHO细胞、Vero细胞和MDCK细胞。另外地或替选地，在一些实施方式中，宿主细胞是体内的(例如，经感染的脊椎动物、诸如禽类或哺乳动物的细胞)。在一些实施方式中，宿主细胞可以诸如通过增强宿主细胞的病毒感染和/或通过增强病毒生长速率被修饰以例如增强病毒产生。以举例的方式但不以限制的方式，示例性宿主细胞修饰包括2-6-连接的唾液酸受体在宿主细胞的细胞表面上的重组表达，和/或宿主细胞中的蛋白的重组表达，其已被认为在病原体或病毒中是缺失或无效的。
术语“免疫原性组合物”在本文中用于指在已经暴露于组合物的哺乳动物中引发免疫应答的组合物。在一些实施方式中，免疫原性组合物包含至少一种M2缺陷型突变体流感A M2SR株(例如，A/California/07/2009(H1N1)(包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的M2SR突变体)、A/Brisbane/10/2007(H3N2)(包含含有SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的M2SR突变体))。在一些实施方式中，免疫原性组合物包含至少一种BM2缺陷型突变体流感B BM2SR株(例如，B/Brisbane/60/2008(Victoria)(包含含有SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的BM2SR突变体)、B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)(包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的BM2SR突变体))。在一些实施方式中，免疫原性组合物包含配制为四价疫苗的A/California/07/2009(H1NI)(包含含有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的M2SR突变体)、A/Brisbane/10/2007(H3N2)(包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的M2SR突变体)、B/Brisbane/60/2008(Victoria)(包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的BM2SR突变体)和B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)(包含含有SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的BM2SR突变体)。
在一些实施方式中，本文所述的免疫原性组合物可以以多种形式配制用于施用(即，经配制用于“暴露”于哺乳动物)。例如，在一些实施方式中，制备免疫原性组合物用于经口、经肺、静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、经鼻或局部施用。还可以配制组合物用于特定剂型。例如，在一些实施方式中，可以将免疫原性组合物配制成液体、凝胶剂、气溶胶、软膏剂、乳膏剂、冻干制剂、粉剂、饼剂、片剂或胶囊剂。在其他实施方式中，免疫原性组合物被配制成控释制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂和混合立即释放制剂。在一些实施方式中，免疫原性组合物以液体形式提供。在其他实施方式中，免疫原性组合物以冻干形式提供。
如本文所用，术语“感染的”是指携带疾病或病原体(诸如病毒)。感染可以是有意的，诸如通过施用病毒或病原体(例如，通过接种疫苗)，或无意的，诸如通过病原体从一生物体到另一生物体，或从污染的表面到生物体的自然转移。
如本文所用，术语“分离的”和/或“纯化的”是指体外制备、分离和/或纯化核酸(例如载体或质粒)、多肽、病毒或细胞，使其与不需要的体内物质不相关联，或使其基本上从不需要的体内物质(其通常与该体内物质一起存在)中纯化。例如，在一些实施方式中，经分离的病毒制剂通过体外培养和繁殖获得，并且基本上不含其他致病因子。如本文所用，“基本上不含”意指使用用于此化合物或试剂的标准检测方法，低于具体化合物(诸如不需要的核酸、蛋白、细胞、病毒、致病因子等)的检测水平。
如本文所用，术语“突变体”、“突变”和“变体”可互换使用，并且是指与野生型序列不同的核酸或多肽序列。在一些实施方式中，突变体序列或变体序列是天然存在的。在其他实施方式中，重组地和/或化学地引入突变体序列或变体序列。在一些实施方式中，核酸突变包括对RNA和/或DNA序列的修饰(例如，添加、缺失、取代)。在一些实施方式中，修饰包括化学修饰(例如，甲基化)，并且还可以包括天然核苷酸和/或非天然核苷酸的取代或添加。核酸突变可以是沉默突变(例如，编码与野生型序列相同的氨基酸的一个或多个核酸变化)或可以导致编码的氨基酸的变化、产生终止密码子，或者可以引入剪接缺陷或剪接变化。编码序列的核酸突变也可以导致保守或非保守的氨基酸变化。
如本文所用，术语“重组病毒”是指例如使用重组核酸技术已经在体外操作以引入病毒基因组的变化和/或引入病毒蛋白的变化的病毒。例如，在一些实施方式中，重组病毒可以包括野生型、内源性、核酸序列和突变体和/或外源核酸序列。另外地或替选地，在一些实施方式中，重组病毒可以包括经修饰的蛋白组分，诸如突变体或变体基质、血球凝集素、神经氨酸酶、核蛋白、非结构和/或聚合酶蛋白。
如本文所用，术语“重组细胞”或“经修饰的细胞”是指已经例如使用重组核酸技术在体外操作以将核酸引入细胞和/或修饰细胞核酸的细胞。重组细胞的实例包括携带外源质粒、表达载体等的原核细胞或真核细胞，和/或包括对其细胞核酸的修饰(例如，取代、突变、插入、缺失等至细胞基因组中)的细胞。示例性重组细胞是已经在体外操作以稳定地表达外源蛋白(诸如病毒M2蛋白)的细胞。
如本文所用，术语“单一复制(SR)病毒”是指在病毒体蛋白中有缺陷的病毒，其在宿主细胞的病毒进入或从宿主细胞释放中起作用。例如，与经典的减毒活流感疫苗相反，如本文所述的M2SR属于新类别的单一复制(SR)病毒疫苗。SR病毒在病毒进入或释放中起作用的病毒体蛋白(诸如流感M2离子通道蛋白，其不影响病毒基因组复制但是对于病毒生长是必不可少的)中是有缺陷的。相比之下，传统的减毒活病毒疫苗在病毒复制机制中含有多个突变，产生高度减毒的表型。因此，与减毒活疫苗相比，SR疫苗病毒机制不影响病毒感染动力学和抗原产生。
如本文所用，“对象”和“患者”可互换使用并且指动物(例如，任何脊椎动物物种的成员)。本发明公开的主题的方法和组合物特别可用于温血脊椎动物，包括哺乳动物和鸟类。示例性对象可以包括哺乳动物(诸如人)，以及由于濒危而具有重要性、具有对人的经济重要性(在农场饲养以供人食用的动物)和/或具有社会重要性(作为宠物或在动物园中饲养的动物)的哺乳动物和鸟类。在一些实施方式中，对象是人。在一些实施方式中，对象不是人。
如本文所用，如与病毒一起使用的术语“类型”和“株”可互换使用，并用于通常指代具有不同特征的病毒。例如，流感A病毒是与流感B病毒不同类型的病毒。同样，流感AH1N1是与流感A H2N1、H2N2和H3N2不同类型的病毒。另外地或替选地，在一些实施方式中，可以将不同类型的病毒(诸如流感A H2N1、H2N2和H3N2)称为“亚型”。
术语“疫苗”在本文中用于指向对象施用以产生或增加对特定疾病的免疫力的组合物。在一些实施方式中，疫苗包含药学上可接受的佐剂和/或药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“vRNA”是指包含病毒基因组的RNA，该病毒基因组包括分段或非分段的病毒基因组、以及正链和负链病毒基因组。vRNA可以是完全内源的和“野生型”和/或可以包括重组和/或突变体序列。
术语“毒力”在本文中用于指病原体引起疾病的相对能力。
术语“减毒的毒力”或“降低的毒力”在本文中用于指病原体引起疾病的相对能力降低。例如，减毒的毒力或降低的毒力可以描述已被减弱的病毒，因此当暴露于对象时它们产生免疫力，但不引起疾病，或引起较轻形式的疾病、持续时间、疾病的发作或较晚发作。
如本文所用，“M2SR”是指单一复制(SR)M2缺陷型重组流感病毒。本文所述的示例性M2SR流感病毒包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3，含有SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和/或SEQ ID NO:3的病毒，或包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ IDNO:3的病毒的疫苗，这取决于其所用的背景。例如，在描述本文所述的M2基因的突变时，“M2SR”是指SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3。特别地，“M2SR-1”是指SEQ IDNO:1；“M2SR-2”是指SEQ ID NO:2；和“M2SR-3”是指SEQ ID NO:3。当描述疫苗的病毒组分时，“M2SR”是指不表达功能性M2蛋白的重组流感病毒。当描述疫苗时，“M2SR”是指包含M2SR重组病毒的疫苗。
如本文所用，“M2SR病毒”涵盖不表达功能性M2蛋白的重组流感病毒。在一些实施方式中，M2SR病毒包含其他流感病毒的基因。在一些实施方式中，该病毒包含流感A/Brisbane/10/2007样A/Uruguay/716/2007(H3N2)的HA和NA基因。在一些实施方式中，M2SR病毒包含A/California/07/2009(CA07)(H1N1pdm)病毒的HA基因和NA基因。
如本文所用，“BM2SR”是指单一复制(SR)BM2缺陷型重组流感病毒。本文所述的示例性BM2SR流感病毒包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10和/或SEQ ID NO:11，含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:11的病毒，或包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:11的病毒的疫苗，这取决于其所用的背景。例如，在描述本文所述的BM2基因的突变时，“BM2SR”是指SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:11。特别地，“BM2SR-1”是指SEQID NO:6；“BM2SR-2”是指SEQ ID NO:7；“BM2SR-3”是指SEQ ID NO:8；“BM2SR-4”是指SEQ IDNO:9；“BM2SR-5”是指SEQ ID NO:10；和“BM2SR-0”是指SEQ ID NO:11。当描述疫苗的病毒组分时，“BM2SR”是指重组流感病毒，以举例的方式但不以限制的方式，其具有B/Lee/40(核蛋白(NP)、聚合酶基因(PA、PB1、PB2)、非结构(NS1和NS2)、NB、基质(BM1))的内部基因，但不表达功能性BM2蛋白。当描述疫苗时，“BM2SR”是指包含BM2SR重组病毒的疫苗。
如本文所用，“BM2SR病毒”涵盖单独或与其他病毒组分和/或编码其他病毒组分的基因组合的重组流感病毒，其具有B/Lee/40(核蛋白(NP)，聚合酶基因(PA、PB1、PB2)，非结构性(NS1和NS2)，基质(BM1))的内部基因但不表达功能性BM2蛋白。在一些实施方式中，BM2SR病毒包含其他流感病毒的基因。在一些实施方式中，病毒包含流感B/Brisbane/60/2008样B/Brisbane/60/2008(B Victoria谱系)的HA基因和NA基因。在一些实施方式中，M2SR病毒包含B/Wisconsin/1/2010样(B Yamagata谱系)病毒的HA基因和NA基因。在一些实施方式中，BM2SR病毒具有近期流感B病毒的内部基因(NP、PA、PB1、PB2、NS1和NS2、BM1)。
II.流感A病毒和流感B病毒
A.概述
流感是美国成年人死亡的主要原因。流感的致病因子是正粘病毒(Orthomyxoviridae)科的病毒，包括流感A病毒、流感B病毒和流感C病毒。
流感A病毒是有包膜的负链RNA病毒。流感A病毒的基因组包含在8条单个(非配对)RNA链上，其互补序列编码11种蛋白(HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NEP、PA、PB1、PB1-F2、PB2)。总基因组大小约为14,000个碱基。基因组的分段性质允许在细胞共栖期间在不同病毒株之间交换整个基因。八个RNA区段如下。1)HA编码血凝素(制备一个病毒体需要约500个分子的血凝素)；2)NA编码神经氨酸酶(制备一个病毒体需要约100个分子的神经氨酸酶)；3)NP编码核蛋白；4)M通过使用来自相同RNA区段的不同阅读框编码两种蛋白质(M1和M2)(制备一个病毒体需要约3000个M1分子)；5)NS通过使用来自相同RNA区段的不同阅读框编码两种蛋白质(NS1和NEP)；6)PA编码RNA聚合酶；7)PB1通过使用来自相同RNA区段的不同阅读框编码RNA聚合酶和PB1-F2蛋白(诱导凋亡)；8)PB2编码RNA聚合酶。
流感B病毒也是有包膜的负链RNA病毒。流感B病毒的基因组包含在8条单个(非配对)RNA链上，其互补序列编码11种蛋白。在这些蛋白中，9种也在流感A病毒中发现：三种RNA依赖性RNA聚合酶亚单位(PB1、PB2和PA)、血球凝集素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1或BM1)和两种非结构蛋白(NS1和NS2，也称为NEP)。两种蛋白(NB和BM2)是流感B病毒独有的。总基因组大小约为14,500个碱基。基因组的分段性质允许在细胞共栖期间在不同病毒株之间交换整个基因，该过程称为重配。以长度递减的顺序编号的八个RNA区段如下。区段1、区段2和区段3分别编码PB1、PB2和PA，它们是RNA聚合酶亚单位。区段4编码HA(血球凝集素)。区段5编码NP(核蛋白)。区段6编码NB(NB蛋白，其功能未知)和NA(神经氨酸酶)。区段7由双顺反子mRNA编码BM1(基质蛋白)和BM2(离子通道)，其翻译策略是独特的。BM2起始密码子与BM1终止密码子(TAATG，终止-起始五核苷酸基序)重叠。BM2蛋白通过这种终止-起始翻译机制翻译，这不同于流感A病毒的M2蛋白，其从剪接的mRNA翻译而来。区段8通过使用来自相同RNA区段的不同阅读框来编码NS1和NEP两者。
流感A和B两者都通过抗原漂移的过程在抗原性方面进化，其中血球凝集素(HA)蛋白的突变允许病毒逃避现有的人免疫性并持续存在于人群中。有几种流感A的亚型，根据H数(对于血球凝集素的类型)和N数(对于神经氨酸酶的类型)命名。目前，存在已知的16种不同的H抗原(H1至H16)和已知的9种不同的N抗原(N1至N9)。每种病毒亚型已经突变成具有不同致病性特征的各种株；一些对一个物种而不是其他物种有致病性，一些对多个物种有致病性。已经在人中证实的示例性流感A病毒亚型包括但不限于导致“西班牙流感”和2009年猪流感爆发的H1N1；引起20世纪50年代后期的“亚洲流感”的H2N2；引起20世纪60年代后期的香港流感的H3N2；H5N1，通过其在2000年代中期的传播被认为是全球流感大流行威胁；H7N7；目前在人和猪中流行的H1N2；以及H9N2、H7N2、H7N3、H5N2、H10N7。
至少从1988年开始，流感B病毒的两种抗原上和遗传上不同的谱系在人中共同传播并引起疾病。Victoria谱系的流感病毒是20世纪80年代在全球流行的主要的B型株，并且Yamagata谱系成为在20世纪90年代早期占优势的B型病毒。自1991年以来，Victoria谱系病毒很少被分离，并且几乎完全限制在东亚。Victoria病毒于2002年重新出现，并且Yamagata和Victoria谱系自此以后共存。
从1940年到2016年分离的流感B病毒的进化关系表明现代分离物的BM1和BM2蛋白相对于彼此的关系比相对于B/Lee/40的关系更密切。
流感病毒具有标准命名法，其包括病毒类型；从其中分离该病毒的物种(如果是非人的)；从其中分离该病毒的位置；分离物编号；分离物年份；以及(仅对于流感A病毒)HA和NA亚型。因此，B/Yamagata/16/88是1988年在山形(日本)采集的人流感B病毒的第16号分离物。
一些流感A变体根据以下鉴定和命名：根据与这些变体最相似的、并因此推测共享谱系的已知分离物(例如Fujian流感病毒样)；根据这些变体的典型宿主(例如人流感病毒)；根据这些变体的亚型(例如H3N2)；以及根据这些变体的致病性(例如LP，低致病性(LowPathogenic))。因此，来自类似于分离物A/Fujian/411/2002(H3N2)的病毒的流感可以称为Fujian流感、人流感和H3N2流感。
此外，流感变体有时根据该株地方性流行的或适应的物种(宿主)来命名。使用该惯例命名的主要变体是：禽流感、人流感、猪流感、马流感和犬流感。变体也已根据其在家禽、尤其是鸡中的致病性命名，例如低致病性禽流感(LPAI)和高致病性禽流感(HPAI)。
B.生命周期和结构
流感病毒的生命周期通常涉及附着于细胞表面受体、进入细胞和病毒核酸的脱壳，然后在细胞内复制病毒基因。在病毒蛋白和基因的新拷贝合成后，这些组分组装成子代病毒颗粒，所述子代病毒颗粒然后离开细胞。不同的病毒蛋白在这些步骤中的每一步骤中起作用。
流感A颗粒由包封病毒核心的脂质包膜组成。包膜的内侧由基质蛋白(M1)填满，而外表面的特征在于两种类型的糖蛋白刺突(spike)：血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)。M2是跨膜离子通道蛋白，也是脂质包膜的一部分。参见例如图1。流感B颗粒包含类似的结构。
HA蛋白是三聚体I型膜蛋白，负责与宿主细胞表面糖蛋白或糖脂上的唾液酸寡糖(含有与半乳糖连接的末端唾液酸的寡糖)结合。该蛋白还负责病毒和宿主细胞膜之间的融合，之后病毒体通过内吞作用内化。
神经氨酸酶(NA)是四聚体II型膜蛋白，是唾液酸酶，其从宿主细胞与HA和NA的糖缀合物(glycoconjugate)切割末端唾液酸残基，并因此被认为是受体破坏酶。该唾液酸酶活性对于从宿主细胞表面有效释放子代病毒体以及防止由于病毒HA与其他糖蛋白的结合活性导致的子代聚集是必需的。因此，HA的受体结合活性和NA的受体破坏活性可能起到平衡作用，从而允许流感的有效复制。
将基因组区段包装到病毒颗粒的核心中。RNP(RNA加核蛋白，NP)呈螺旋形式，三个病毒聚合酶多肽与每个区段相关联。
流感病毒生命周期始于HA与宿主细胞表面上的含唾液酸的受体结合，然后是受体介导的内吞作用(图1)。晚期核内体中的低pH触发HA中的构象转变，从而暴露HA2亚单位(所谓的融合肽)的N-末端。融合肽启动病毒和内体膜的融合，并且基质蛋白(M1)和RNP复合物释放到细胞质中。RNP由包壳vRNA的核蛋白(NP)和由PA、PB1和PB2蛋白形成的病毒聚合酶复合物组成。RNP被转运到细胞核中，在细胞核中发生转录和复制。RNA聚合酶复合物催化三种不同的反应：(1)合成具有5’帽和3’聚A结构的mRNA，(2)全长互补RNA(cRNA)，和(3)基因组vRNA，使用cDNA作为模板。然后将新合成的vRNA、NP和聚合酶蛋白组装成RNP、从细胞核输出并转运到质膜，在质膜发生子代病毒颗粒的出芽。神经氨酸酶(NA)蛋白通过从唾液酸寡聚糖中除去唾液酸而在感染后期起作用，从而从细胞表面释放新组装的病毒体并防止病毒颗粒的自聚集。虽然病毒组装涉及蛋白-蛋白和蛋白-vRNA相互作用，但这些相互作用的性质在很大程度上仍然是未知的。
C.M2和BM2蛋白的作用
如上所述，跨越流感A病毒膜的是三种蛋白质：血球凝集素(HA)、神经氨酸苷酶(NA)和M2。HA和NA的细胞外结构域(胞外域)是相当可变的，而M2的胞外域结构域在流感A病毒中基本上是不变的。M2离子通道蛋白不影响病毒基因组复制但是对于病毒生长是必不可少的。单一复制(SR)病毒在病毒进入或释放中起作用的病毒体蛋白(诸如流感A M2或流感BM2离子通道蛋白)中是有缺陷的。相比之下，传统的减毒活病毒疫苗在病毒复制机制中含有多个突变，产生高度减毒的表型。不希望受理论束缚，在流感A病毒中，具有离子通道活性的M2蛋白被认为在宿主细胞穿透和病毒RNA的脱壳之间的病毒生命周期中的早期状态起作用。一旦病毒体经历内吞作用，病毒体相关的M2离子通道(同源四聚体螺旋束)被认为允许质子从核内体流入病毒体内部以破坏酸不稳定的M1蛋白-核糖核蛋白复合物(RNP)相互作用，从而促进RNP释放到细胞质中。此外，在其HA在细胞内被切割的一些流感株(例如，A/禽疫/Rostock/34)中，M2离子通道被认为提高了反向高尔基体网络的pH值，防止了由于该隔室中的低pH条件导致的HA中的构象变化。还显示M2跨膜结构域本身可以起离子通道的作用。M2蛋白离子通道活性被认为在流感病毒的生命周期中是必不可少的，因为已经显示阻断M2离子通道活性的盐酸金刚烷胺抑制病毒复制。然而，尚未直接证明在流感A病毒的复制中对这种活性的要求。流感B病毒中的流感A病毒M2蛋白的功能性对应物是称为BM2的III型跨膜蛋白。
D.作为疫苗的M2和BM2病毒突变体
M2SR属于新类别的单一复制(SR)病毒疫苗。SR病毒在病毒进入或释放中起作用的病毒体蛋白(诸如流感M2离子通道蛋白，其不影响病毒基因组复制但是对于病毒生长是必不可少的)中是有缺陷的。相比之下，传统的减毒活疫苗含有在病毒复制机制中的多个突变，产生高度减毒的表型。因此，两种不同的疫苗病毒机制影响病毒感染动力学和抗原产生，这影响了免疫应答的保护和诱导。复制缺陷型病毒提供独特形式的病毒疫苗，其通过在细胞内表达病毒基因产物来组合灭活病毒疫苗的安全性和活病毒疫苗的免疫原性，从而可以通过MHC I类和II类途径有效地呈递抗原。单一复制病毒还可以激活Toll样受体和其他先天免疫应答途径，从而用作它们自己的佐剂。此外，这些病毒可以用作探测免疫系统功能的工具。这些突变体病毒在病毒组装后起作用的病毒体蛋白中是缺陷的。病毒在表达缺失的基因产物的互补细胞中繁殖。在正常细胞中，复制周期正常发生并产生子代病毒体。然而，这些病毒体是非感染性的，因此感染不会扩散到第二轮细胞。
III.M2和BM2病毒突变体
在一方面，公开了携带突变体M2 vRNA序列的流感A病毒。通常，此类突变体不具有M2离子通道活性，在体内展现出减毒的生长性质，不能产生受感染的子代，并且在受感染的对象中是非致病性的或显示出减少的发病。在另一方面，公开了携带突变体BM2 vRNA序列的流感B病毒。通常，此类突变体不具有BM2离子通道活性，在体内展现出减毒的生长性质，不能产生受感染的子代，并且在受感染的对象中是非致病性的或显示出减少的发病。突变体病毒是免疫原性的，并且当用作疫苗时，提供对抗对应物野生型对应物和/或其他致病性病毒的感染保护。另外，本文公开的M2和BM2突变体是稳定的，并且不突变以表达功能性M2或BM2多肽，无论使用什么宿主细胞。另外地或替选地，在一些实施方式中，产生这些突变体的M1蛋白而没有对其功能有可检测的改变。在一些实施方式中，携带突变体M2或BM2核酸序列的病毒不能在宿主细胞中复制，其中可以繁殖相应的野生型病毒。以举例的方式但不以限制的方式，在一些实施方式中，野生型病毒可以在培养MDCK细胞、CHO细胞和/或Vero细胞中生长、繁殖和复制，而携带突变体M2或BM2序列的相应病毒不能在相同类型的细胞中生长、复制或繁殖。
如上所述，在一些实施方式中，M2或BM2突变体病毒是稳定的，并且不突变或回复为在宿主细胞中编码功能性M2或BM2蛋白的野生型或非野生型序列。例如，在一些实施方式中，M2或BM2突变体病毒在宿主细胞中稳定2代、3代、5代、10代、12代、15代、20代、25代或超过25代。在一些实施方式中，宿主细胞是未经修饰的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是稳定提供反向M2的任何哺乳动物细胞。在其他实施方式中，宿主细胞是经修饰的宿主细胞，诸如表达M2或BM2蛋白的MDCK或Vero细胞。
在一些实施方式中，M2或BM2突变体包含一种或多种核酸取代和/或缺失。在一些实施方式中，突变位于核酸中，所述核酸编码M2或BM2蛋白的细胞外结构域、M2或BM2蛋白的跨膜结构域、和/或M2或BM2蛋白的细胞质尾中的一种或多种。另外地或替选地，在一些实施方式中，一种或多种核酸突变产生剪接变体，M2或BM2肽的一种或多种终止密码子和/或一种或多种氨基酸缺失。在一些实施方式中，携带突变体M2或BM2核酸的病毒产生非功能性M2或BM2多肽。在一些实施方式中，携带突变体M2或BM2核酸的病毒不产生M2或BM2多肽。在一些实施方式中，携带突变体M2或BM2核酸的病毒产生截短的M2或BM2多肽。
以下在表1至表3中提供了三种示例性的非限制性M2病毒突变体(M2SR-1、M2SR-2和M2SR-3)。在表中，小写字母对应于M2序列；大写字母对应于M1序列和非编码区域；突变体序列(例如，终止密码子、剪接缺陷)呈粗体加下划线。M2SR-2突变体中的加下划线(小写)碱基表示M2SR-1和M2SR-3突变体中缺失的区域。小写斜体碱基包括M和M2重叠区域。
从该突变体产生的M2多肽序列如下：
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD。(SEQ ID NO:4)。
从该突变体未产生M2多肽序列。
从该突变体未产生M2多肽序列。
野生型M1和M2编码序列提供在下表4中。
示例性、非限制性的BM2SR病毒突变体(BM2SR-1、BM2SR-2、BM2SR-3、BM2SR-4、BM2SR-5和BM2SR-0)提供在下表5中。
流感B基因组区段7表达病毒复制所需的两种主要多肽，即BM1基质蛋白和BM2质子通道。BM1和BM2多肽的表达部分地受位于BM1和BM2 ORF之间的接合处的五核苷酸基序翻译滑动位点的调节。五核苷酸基序TAATG含有用于终止M1翻译的TAA终止密码子和用于在交替的-1阅读框中起始M2的ATG起始密码子。已显示该五核苷酸基序和侧接序列对于调节M1蛋白的表达是重要的。
显示BM1和BM2编码序列的野生型流感B区段7和粗体加下划线的五核苷酸基序在下表6中提供。
IV.基于细胞的病毒产生系统
A.产生“第一代”突变体病毒
突变体病毒(诸如携带突变体M2核酸的那些突变体病毒)可以通过其全部内容通过引用并入本文的Neumann等人，Generation of influenza A viruses entirely fromclone cDNAs，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9345-9350(1999)描述的基于质粒的反向遗传学产生。突变体病毒(诸如携带突变体BM2核酸的那些突变体病毒)可以通过类似的方法产生。简言之，用编码八种病毒RNA的一种或多种质粒转染真核宿主细胞。每个病毒RNA序列侧接有RNA聚合酶I启动子和RNA聚合酶I终止子。值得注意的是，编码M2蛋白的病毒RNA包括突变体M2核酸序列。将宿主细胞另外用一种或多种编码包括野生型M2蛋白在内的病毒蛋白(例如聚合酶、核蛋白和结构蛋白)的表达质粒转染。用病毒RNA质粒转染宿主细胞导致所有八种流感病毒RNA的合成，其中一种携带突变体M2序列。共转染的病毒聚合酶和核蛋白将病毒RNA组装成功能性vRNP，其被复制和转录，最终形成具有突变体M2核酸序列的感染性流感病毒，但具有掺入病毒脂质包膜中的功能性M2多肽。
产生“第一代”突变体病毒的替选方法包括核糖核蛋白(RNP)转染系统，其允许用体外产生的重组RNA分子替换流感病毒基因，如通过引用并入本文的Enami和Palese，High-efficiency formation of influenza virus transfectants，J.Virol.65(5):2711-2713所述。
病毒RNA在体外合成，并且RNA转录物包被有病毒核蛋白(NP)和聚合酶蛋白，该聚合酶蛋白在转染的细胞中充当生物活性的RNP，如通过引用并入本文的Luytjes等人，Amplification，expression，and packaging of a foreign gene by influenza virus，Cell 59：1107-1113所证明。
RNP转染方法可以分为四个步骤：1)RNA的制备：编码流感病毒区段的质粒DNA在体外转录反应中转录为负义RNA；2)RNA的壳体化：然后将转录的RNA与梯度纯化的NP和从破坏的流感病毒分离的聚合酶蛋白混合以形成生物活性的RNP复合物；3)经壳体化的RNA的转染和拯救：将人工核糖核衣壳转染至先前用辅助流感病毒感染的细胞，所述辅助流感病毒含有与被拯救的基因不同的基因；辅助病毒会扩增转染的RNA；4)经转染的基因的选择：因为辅助病毒和含有经拯救的基因的转染子都在培养上清液中，所以使用抗体的适当选择系统对于分离携带经转染的基因的病毒是必需的。
选择系统允许产生具有特定生物学和分子特征的新型转染子流感病毒。然后可以将针对靶表面蛋白的抗体选择用于阳性或阴性选择。
例如，含有不表达M2蛋白的M2基因的转染子或突变体病毒可以在合适的哺乳动物细胞系中生长，所述细胞系经过修饰以稳定表达野生型功能性M2蛋白。为了防止或抑制表达野生型M2基因的辅助病毒的复制，并因此防止或抑制膜表面处的M2e蛋白的复制，可以使用针对M2e的抗体。此类抗体是可商购获得的并且将抑制辅助病毒的复制，并允许含有突变体M2的转染子/突变体病毒在上清液中生长和富集。先前已在Influenza A virus M2protein:monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2in virions，J Virol 62:2762-2772(1988)和Treanor等人，Passively transferredmonoclonal antibody to the M2 protein inhibits influenza A virus replicationin mice，J.Virol.64：1375-1377(1990)中描述了M2e抗体抑制流感病毒复制。
另外地或替选地，相同的抗体可以用于‘捕获’辅助病毒并允许转染子富集。例如，抗体可以用于涂覆组织培养皿的底部或可以用于柱基质中以允许转染子在上清液或洗脱液中富集。
转染子病毒可以通过有限稀释在多孔板中的M2表达细胞中生长，然后例如通过产生复制板进行鉴定和克隆。例如，含有生长的病毒的多孔板的给定孔的等分试样的一半可以用于感染MDCK细胞，并且另一半可以用于感染表达M2蛋白的MDCK细胞。转染子病毒和辅助病毒都将在表达M2蛋白的MDCK细胞中生长。然而，只有辅助病毒将在标准MDCK细胞中生长，才允许识别含有转染子的多孔板中的孔。转染子病毒可以在表达M2蛋白的细胞中进一步进行噬菌斑纯化。
B.繁殖病毒突变体
在一些实施方式中，本文所述的病毒突变体在宿主细胞中维持和传代。以举例的方式但不以限制的方式，适合于流感病毒突变体(诸如流感A病毒突变体)生长的示例性宿主细胞包括任何数量的真核细胞，包括但不限于马丁达比犬肾(MDCK)细胞，猿猴细胞(诸如非洲绿猴细胞(例如Vero细胞)、CV-1细胞和恒河猴肾细胞(例如LLcomk.2细胞)，牛细胞(例如MDBK细胞)，猪细胞，雪貂细胞(例如水貂肺细胞)BK-1细胞，啮齿动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞)，人细胞(例如胚胎人视网膜细胞(例如)、293T人胚胎肾细胞)和禽类细胞(包括胚胎成纤维细胞)。
另外地或替选地，在一些实施方式中，修饰真核宿主细胞以增加病毒产生，例如通过增加宿主细胞的病毒感染和/或通过增加病毒生长速率。例如，在一些实施方式中，修饰宿主细胞以在细胞表面上表达或增加表达2,6-连接的唾液酸，从而允许通过突变体或野生型流感A病毒更高效和有效地感染这些细胞。参见例如美国专利公开第2010-0021499号和美国专利第7,176,021号，其通过引用整体并入本文。因此，在一些说明性实施方式中，使用经修饰以表达至少一个拷贝的2,6-唾液酸转移酶基因(ST6GAL1)的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)和/或Vero细胞。以举例的方式但不以限制的方式，由登录号BC040009.1表示的智人(Homo sapiens)ST6β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶基因序列是ST6Gal基因的一个实例，其可以整合到CHO细胞中和由CHO细胞表达。可以将编码功能性ST6Gal I基因产物的一个或多个拷贝的多核苷酸工程化到细胞中。即，可以使用已经稳定转化以表达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或12个以上拷贝的ST6Gal I基因的细胞。单个表达盒可以包括一个或多个拷贝的待表达的ST6Gal I基因，其可操作地连接至调节元件(诸如启动子、增强子和终止子和多腺苷酸化信号序列)，以促进ST6Gal I基因或其拷贝的表达。替选地，可以将单个表达盒工程化以表达一个拷贝的ST6Gal I基因，并将多个表达盒整合到宿主细胞基因组中。因此，在一些实施方式中，将至少一个ST6Gal I基因掺入宿主细胞的基因组中，使得该细胞表达ST6Gal I基因及其酶促蛋白质产物。根据拷贝数，单个宿主细胞可以表达许多功能性ST6Gal I基因蛋白。
用于克隆、转染和产生稳定的经修饰的细胞系的合适载体是本领域熟知的。一个非限制性实例包括pcDNA3.1载体(英杰(Invitrogen))。
另外地或替选地，在一些实施方式中，真核宿主细胞被修饰以产生野生型形式的突变体病毒基因，从而反向地向病毒提供基因。例如，当在产生野生型M2蛋白的宿主细胞中传代时，携带突变体M2蛋白的病毒株可以表现出增强的生长速率(例如，更高的病毒产生)。在一些实施方式中，携带突变体M2蛋白的病毒株在不表达野生型M2基因的细胞中可能不生长或不复制。另外，此类宿主细胞可以减缓或阻止病毒回复到功能性M2序列，因为例如在这种宿主中没有选择性的回复压力。
用于产生表达载体和经修饰的宿主细胞两者的方法是本领域熟知的。例如，可以通过将M2核酸序列(M2 ORF序列；即，“野生型”M2的起始密码子至终止密码子(表7)))定位于真核表达载体中的下面来制备M2表达载体。类似的方法可以用于BM2，其序列在下表7中提供。
然后可以通过本领域已知的方法转染宿主细胞(例如，MDCK细胞)，例如使用可商购获得的试剂和试剂盒，诸如LT1(Mirus Bio，威斯康星州麦迪逊)。以举例的方式但不以限制的方式，可以通过用可检测的标记或可选择的标记(例如，潮霉素-抗性)共转染和/或通过例如使用M2抗体用间接免疫染色进行筛选来选择和测试细胞的BM2表达。M2表达可以通过间接免疫染色、流式细胞术或ELISA测定。
以举例的方式但不以限制的方式，将293T人胚胎肾细胞和马丁达比犬肾(MDCK)细胞分别维持在补充有10％胎牛血清的杜尔贝科氏改良的伊戈尔培养基中和含有5％新生小牛血清的最小必需培养基(MEM)中。将所有细胞维持在37℃下在5％CO2中。通过用含有潮霉素抗性基因的质粒pRHyg和表达全长M2蛋白的质粒pCAGGS/M2以1:1的比例共转染，建立稳定表达来自A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的M2蛋白的潮霉素-抗性MDCK细胞。通过使用抗M2(14C2)单克隆抗体的间接免疫染色筛选，在含有0.15mg/mL潮霉素(罗氏(Roche)，德国曼海姆)的培养基中选择表达M2的稳定MDCK细胞克隆(M2CK)(Iwatsuki等人，JVI，2006，第80卷，第1期，第5233-5240页)。在补充有10％胎牛血清和0.15mg/mL潮霉素的MEM中培养M2CK细胞。在M2CK细胞中，M2的表达水平和定位与经病毒感染的细胞中的那些表达水平和定位相似(数据未显示)。表达BM2的BM2CK细胞可以以类似的方式制备，并且表达M2或BM2的Vero细胞可以以类似的方式制备。
在一些实施方式中，通过本领域熟知的方法培养和繁殖细胞和病毒突变体。以举例的方式但不以限制的方式，在一些实施方式中，宿主细胞在补充有10％胎牛血清的MEM存在下生长。通过用PBS洗涤然后在37℃下吸附病毒，以0.001的MOI感染表达M2或BM2的细胞。在一些实施方式中，加入含有胰蛋白酶/TPCK的病毒生长培养基，并将细胞孵育2天至3天直至观察到细胞病变效应。
沿着这些系(line)，在有或没有病毒的情况下，已经开发了用于哺乳动物细胞的一次性生物反应器系统，其益处包括更快的设施设置和降低的交叉污染的风险。本文所述的细胞例如可以在一次性袋中培养，该一次性袋诸如来自斯泰迪(Stedim)的那些、来自SAFC生物科学(SAFC Biosciences)的Bioeaze袋、来自Cellexus生物系统(CellexusBiosytems)的HybridBagTM、或来自HyClone的一次性生物反应器或来自龙沙(Lonza)的Celltainer。生物反应器可以是1L、10L、50L、250L、1000L尺寸形式。在一些实施方式中，将细胞维持在不含动物产品的优化的无血清培养基内的混悬液。该系统可以是补料分批系统(其中培养物可以在例如1L至10L的单个袋中扩展)，或是灌注系统(其允许持续供应营养物同时避免潜在有毒副产物在培养基中的积累)。
对于长期储存，突变体病毒可以作为冷冻储存物储存。
V.疫苗和施用方法
A.免疫原性组合物和疫苗
存在各种不同类型的疫苗，其可以由本文公开的基于细胞的病毒产生系统制成。本公开包括但不限于制造和产生减毒活病毒疫苗、单复制疫苗、复制缺陷型疫苗、病毒载体疫苗、灭活病毒疫苗、全病毒疫苗、分裂病毒疫苗、病毒体病毒疫苗、病毒表面抗原疫苗及其组合。因此，有许多疫苗能够产生对不同流感病毒有特异性的保护性免疫应答，其中这些疫苗类型中的任一种的适当制剂能够产生免疫应答，例如全身性免疫应答。减毒活病毒疫苗具有能够刺激呼吸道内局部粘膜免疫性的优点。
在一些实施方式中，用于本文所述组合物中的疫苗抗原是“直接”抗原，即它们不以DNA而是以抗原本身的形式施用。此类疫苗可以包括整个病毒或仅是病毒的一部分，诸如但不限于病毒多糖，无论它们是单独的还是与载体元件缀合的，该载体元件诸如载体蛋白、减毒活的整个微生物、灭活的微生物、重组肽和蛋白、糖蛋白、糖脂、脂肽、合成肽或破裂的微生物(在疫苗的情况下称为“分裂”疫苗)。
在一些实施方式中，提供了完整的病毒体疫苗。可以将完整的病毒体疫苗通过超滤浓缩，然后通过区带离心或色谱法纯化。通常，使用例如福尔马林或β-丙内酯在纯化之前或之后使病毒体失活。
在一些实施方式中，提供了亚单位疫苗，其包含纯化的糖蛋白。此类疫苗可以如下制备：使用通过用清洁剂处理片段化的病毒混悬液，通过例如超速离心纯化表面抗原。因此，亚单位疫苗主要含有HA蛋白，也含有NA。所用的清洁剂可以是例如阳离子清洁剂(诸如十六烷基三甲基溴化铵)，阴离子清洁剂(诸如脱氧胆酸铵)；或非离子清洁剂(诸如以名称TRITON X100商业化的清洁剂)。血球凝集素也可以在用蛋白酶(诸如菠萝蛋白酶)处理病毒体后分离，然后用标准方法纯化。
在一些实施方式中，提供了分裂疫苗，其包含已经用溶解脂质的试剂处理的病毒体。可以如下制备分裂疫苗：将灭活或未灭活的如上获得的纯化的病毒的含水混悬液在搅拌下用与清洁剂相关的脂质溶剂(诸如乙醚或氯仿)处理。病毒包膜脂质的溶解导致病毒颗粒的片段化。回收含有分裂疫苗的水相，其主要由原始脂质环境被除去的血球凝集素和神经氨酸酶以及核心或其降解产物组成。然后，如果还没有进行灭活，则灭活残留的感染性颗粒。
在一些实施方式中，提供了灭活的流感病毒疫苗。在一些实施方式中，通过使用已知方法(诸如但不限于福尔马林或β-丙内酯处理)灭活病毒来制备灭活的疫苗。可以用于本发明的灭活的疫苗类型可以包括全病毒(WV)疫苗或亚病毒体(SV)(分裂)疫苗。WV疫苗含有完整的灭活病毒，而SV疫苗含有用溶解含脂质的病毒包膜的清洁剂破坏的纯化病毒，然后化学灭活残留的病毒。
另外地或替选地，在一些实施方式中，提供了减毒活流感病毒疫苗。根据已知的方法步骤，此类疫苗可以用于预防或治疗流感病毒感染。
在一些实施方式中，通过根据已知方法将减毒的基因从减毒的供体病毒转移至分离物或重配的病毒，在一个步骤中实现减毒(参见，例如，Murphy，Infect.Dis.Clin.Pract.2:174(1993))。在一些实施方式中，病毒通过一种或多种病毒核酸序列的突变而减毒，从而产生突变体病毒。例如，在一些实施方式中，突变体病毒核酸序列编码有缺陷的蛋白产物。在一些实施方式中，蛋白产物具有减弱的功能或没有功能。在其他实施方式中，从突变体病毒核酸不产生蛋白产物。
本文所述的单一复制病毒可以作为免疫原性组合物(例如，作为疫苗)来配制和施用以在动物(例如禽类和/或哺乳动物)中诱导免疫应答。用于确定这种减毒疫苗或灭活疫苗是否保持与临床分离物或由其衍生的高生长株的抗原性相似的抗原性的方法是本领域众所周知的。此类已知方法包括使用抗血清或抗体来消除表达供体病毒的抗原决定簇的病毒；化学选择(例如，金刚烷胺或金刚乙胺)；HA和NA活性和抑制；和DNA筛选(诸如探针杂交或PCR)以确认编码抗原决定簇的供体基因(例如HA或NA基因)或其他突变体序列(例如M2)不存在于减毒的病毒中。参见，例如Robertson等人，Giornale di lgiene e MedicinaPreventiva，29A(1988)；Kilbourne，Bull.M2 World Health Org.，41，643(1969)；和Robertson等人，Biologicals，20，213(1992)。
在一些实施方式中，疫苗包含缺乏功能性M2蛋白表达的单一复制流感病毒。在一些实施方式中，突变体病毒在表达M2蛋白的细胞中复制良好，但在相应的野生型细胞中，表达病毒蛋白，不产生感染性子代病毒体。
适用于鼻内施用、真皮内施用、接种或用于肠胃外或经口施用的本发明的药物组合物包含减毒流感病毒或灭活流感病毒，并且还可以任选地包含无菌水溶液或非水溶液、混悬液和乳液。该组合物还可以包含如本领域已知的辅助剂或赋形剂。参见，例如Berkow等人，The Merck Manual，第15版，Merck and Co.，纽约州拉威(1987)；Goodman等人编辑，Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第八版，Pergamon Press，Inc.，纽约州埃尔姆斯福德(1990)；Avery’s Drug Treatment：Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics，第三版，ADISPress，LTD.，Williams and Wilkins，马里兰州巴尔的摩(1987)；和Katzung编辑，Basicand Clinical Pharmacology，第五版，Appleton and Lange，康涅狄格州诺沃克(1992)。
在一些实施方式中，用于鼻内递送的液体制剂可以采取溶液或混悬液的形式，并且可以含有常规赋形剂，诸如张力调节剂，例如氯化钠、右旋糖或甘露醇；防腐剂，例如苯扎氯铵、硫柳汞、苯乙醇；和其他配制剂，诸如助悬剂、缓冲剂、稳定剂和/或分散剂。
在一些实施方式中，用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、混悬液和/或乳液，其可以含有本领域已知的辅助剂或赋形剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。载体或封闭敷料可以用于增加皮肤渗透性和增强抗原吸收。用于经口施用的液体剂型可以一般包含含有液体剂型的脂质体溶液。悬浮脂质体的适合形式包括含有本领域常用的惰性稀释剂(诸如纯净水)的乳液、混悬液、溶液、糖浆和酏剂。除惰性稀释剂外，此类组合物还可以包含佐剂、润湿剂、乳化剂和助悬剂，或甜味剂、调味剂或芳香剂。
当本发明的组合物用于对个体施用时，它还可以包含盐、缓冲剂、佐剂或其他对提高组合物功效所期望的物质。对于疫苗，可以使用佐剂(增强特定免疫应答的物质)。通常，佐剂和组合物在呈递给免疫系统之前混合，或单独呈递，但进入被免疫的生物体的相同位点。
在一些实施方式中，本发明提供了包含来自至少两种流感株的病毒的多价免疫原性组合物。在一些实施方式中，多价免疫原性组合物包含：(a)至少一种经工程化的减毒流感A M2缺陷型重组病毒，其中，经工程化的流感A病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因；和(b)至少一种经工程化的减毒流感BM2缺陷型重组病毒，其中，经工程化的流感B病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因。
在一些实施方式中，流感A病毒选自由H1N1亚型和H3N2亚型组成的组，并且流感B病毒选自由B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系组成的组。
在一些实施方式中，本发明提供了四价免疫原性组合物，其包含：两种M2缺陷型流感A M2SR病毒：A/California/07/2009(H1N1)和A/Brisbane/10/2007(H3N2)，这两者均包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体；和两种BM2缺陷型流感B BM2SR病毒：B/Brisbane/60/2008(Victoria)和B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)，这两者均包含含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体。在一些实施方式中，该免疫原性组合物被配制为四价流感疫苗。
在一些实施方式中，本发明提供了刺激针对流感A和流感B的免疫应答的方法，其包括向有需要的对象施用包含来自至少一种流感A株和至少一种流感B株的多价免疫原性组合物。在一些实施方式中，多价免疫原性组合物包含：(a)至少一种经工程化的减毒流感AM2缺陷型重组病毒，其中，经工程化的流感A病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的突变体M2基因；和(b)至少一种经工程化的减毒流感BM2缺陷型重组病毒，其中，经工程化的流感B病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因。
在一些实施方式中，流感A病毒选自H1N1亚型和H3N2亚型的组，并且流感B病毒选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组。
在一些实施方式中，本发明提供了刺激针对流感A和流感B的免疫应答的方法，其包括向有需要的对象施用包含以下的免疫原性组合物：两种M2缺陷型流感A M2SR病毒：包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体的A/California/07/2009(H1N1)，和包含含有SEQ IDNO:1的M2SR-1突变体的A/Brisbane/10/2007(H3N2)；和两种BM2缺陷型流感B BM2SR病毒：包含含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体的B/Brisbane/60/2008(Victoria)和包含含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体的B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)。在一些实施方式中，将该免疫原性组合物配制成四价流感疫苗。
在一些实施方式中，如本文所述的配制成四价流感疫苗的免疫原性组合物表现出减毒的毒力。例如，在一些实施方式中，与仅感染流感B单价疫苗的小鼠相比，感染四价疫苗的小鼠在流感A攻击后的感染后平均感染寿命增加。在一些实施方式中，与仅用流感A单价疫苗感染的小鼠相比，感染四价疫苗的小鼠在流感B攻击后的平均感染后寿命增加。
根据本发明的药物组合物可以进一步或另外包含至少一种化学治疗化合物(例如用于基因疗法)、免疫抑制剂、抗炎剂或免疫刺激剂，或抗病毒剂，包括但不限于γ球蛋白、金刚烷胺、胍、羟基苯并咪唑、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、缩氨基硫脲、美替沙腙、利福平、利巴韦林、嘧啶类似物、嘌呤类似物、膦甲酸、膦酰乙酸、阿昔洛韦、双脱氧核苷、蛋白酶抑制剂或更昔洛韦。
该组合物还可以含有可变但少量的无内毒素的甲醛和防腐剂，已发现所述甲醛和防腐剂是安全的并且不会对施用本发明的组合物的生物体产生不良作用。
B.施用
如本文公开的免疫原性组合物(例如，疫苗)可以经由常规使用或推荐用于疫苗的任何途径施用：肠胃外途径，粘膜途径，并且可以呈各种形式：可注射或可喷雾的液体，已经冷冻干燥或通过雾化或风干等干燥的制剂等。疫苗可以通过用于肌内、皮下或真皮内注射的注射器或无针注射器施用。疫苗还可以通过雾化器施用，所述雾化器能够将干粉或液体喷雾递送至粘膜，无论它们是经鼻、经肺、经阴道还是经直肠。
如本文所公开的疫苗可以通过被动免疫或主动免疫赋予对一种或多种流感株的抗性。在主动免疫中，将灭活疫苗组合物或减毒活疫苗组合物预防性地施用给宿主(例如哺乳动物)，并且宿主对施用的免疫应答保护其免受感染和/或疾病。对于被动免疫，可以回收引发的抗血清并将其施用给疑似患有由至少一种流感病毒株引起的感染的接受者。
因此，本发明包括用于预防或减轻疾病或病症(例如至少一种流感病毒株的感染)的方法。如本文所用，如果疫苗的施用导致疾病的症状或病症全部或部分减弱(即，抑制)或者个体对疾病的全部或部分免疫，则称疫苗预防或减轻疾病。
本发明的至少一种灭活流感病毒或减毒流感病毒或其组合物可以通过使用如前所述的药物组合物达到预期目的的任何方式施用。例如，此类组合物的施用可以通过各种肠胃外途径，诸如皮下、静脉内、真皮内、肌内、腹膜内、鼻内、经口或透皮途径进行。肠胃外施用可以通过团注注射或通过逐渐输注随时间推移进行。在一些实施方式中，如本文所公开的免疫原性组合物通过肌内或皮下施加进行。
在一些实施方式中，用于预防、抑制或治疗流感病毒相关的病理的方案包括在多达并包括一周至约24个月或其中的任何范围或值的一段时间内施用有效量的如本文所述的疫苗组合物，作为单一治疗施用，或作为增强或加强剂量重复施用。在一些实施方式中，每年施用如本文公开的流感疫苗。
根据本技术，疫苗组合物的“有效量”是足以实现所期望生物效应的量。据了解，在一些实施方式中，有效剂量将取决于接受者的年龄、性别、健康和体重，同时治疗的种类(如果有的话)，治疗频率以及所想要效果的性质。下面提供的有效剂量范围不意在是限制性的，并且代表示例性剂量范围。因此，在一些实施方式中，剂量将为个体对象定制，如本领域技术人员所理解和确定的。用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约101个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约102个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约103个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约104个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约105个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约106个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约107个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约108个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约109个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约109个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是大于1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg。灭活疫苗的剂量的范围可以为约0.1μg至200μg、例如50μg血球凝集素蛋白。然而，使用现有的疫苗作为起点，如通过常规方法测定的所述剂量应该是安全且有效的量。
C.皮内递送
活的流感疫苗传统上是鼻内递送的，以模拟天然的感染途径并促进与天然的病毒感染的免疫应答类似的免疫应答。作为替代方案，本文公开了真皮内递送方法，其涉及使用新型微针装置以利用真皮内递送的免疫学益处。在一些实施方式中，减毒的病毒(例如，M2和/或BM2病毒突变体)用于真皮内施用的疫苗组合物中。在一些实施方式中，在四价疫苗中提供了不产生感染性子代病毒的M2和BM2病毒突变体。因此，几乎消除了与野生型流行流感病毒重配的任何潜力。
在本文公开的实施方式中，真皮内递送(皮内)将疫苗施用至皮肤。在一些实施方式中，使用微针递送装置进行真皮内递送。如本文所公开的，真皮内递送具有许多优点。例如，通过触发皮肤免疫系统的免疫潜力来增强疫苗的免疫原性。疫苗直接进入皮肤的有效抗原呈递树突细胞，即表皮朗格汉斯细胞和真皮树突细胞。皮肤细胞产生促炎信号，其增强对通过皮肤引入的抗原的免疫应答。此外，皮肤免疫系统产生抗原特异性抗体和细胞免疫应答。真皮内递送允许疫苗剂量节省，即，当皮内地递送时，根据上述因素，较低剂量的抗原可以是有效的。
并且，由于疫苗通过装置的微针阵列递送至皮肤，因此减少了意外针刺的风险，并且与使用传统针头和注射器的肌内注射相比，经由微针阵列的皮内疫苗递送相对无痛。
微针装置是本领域已知的，是本领域已知的，包括例如在公开的美国专利申请2012/0109066、2011/0172645、2011/0172639、2011/0172638、2011/0172637和2011/0172609中描述的那些。微针装置可以例如通过湿法蚀刻由不锈钢板(例如，三一品牌产业(Trinity Brand Industries)，乔治亚洲；SS 304；50μm厚)制造来制成。在一些实施方式中，各个微针的长度在约500μm至1000μm之间，例如约750μm，并且宽度在约100μm至500μm之间，例如约200μm。然后可以将疫苗作为涂层施加到微针上。以举例的方式但不以限制的方式，涂层溶液可以包括1％(w/v)羧甲基纤维素钠盐(低粘度，USP级；Carbo-Mer，加州圣地亚哥)、0.5％(w/v)Lutrol F-68NF(BASF，纽约州橄榄山)和抗原(例如，5ng/ml的可溶性HA蛋白；减毒活病毒，诸如本文所述的M2和BM2突变体病毒等)。为了达到更高的疫苗浓度，可以在室温(约23℃)下将涂层溶液蒸发5分钟至10分钟。涂覆可以通过浸涂工艺进行。每排微针的疫苗量可以通过将微针浸入200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中5分钟并通过本领域已知的方法测定抗原来确定。
在一些实施方式中，使用主要由通过简单的卡扣配合和热密封件配合在一起的聚丙烯和不锈钢第一切割件制成的微针装置。在一些实施方式中，所述装置是完全独立的并且包括疫苗、泵机构、激活机构和微针单元。这些组件隐藏在塑料盖内。使用该装置，通过按下致动按钮启动疫苗输注。同时按下按钮将微针插入到皮肤中并启动对主药物容器施加压力的泵送机构。当弹簧机构在疫苗贮存器上施加足够的压力时，疫苗开始流过微针阵列并进入皮肤。在一些实施方式中，在装置制动后约2分钟内完成疫苗剂量的递送。输注完成后，将该装置从皮肤轻轻取出。
在一些实施方式中，提供使用微针装置的用于皮内施用免疫原性组合物(例如四价疫苗)的方法。在一些实施方式中，微针装置包括穿刺机构和包括多个微针的免疫原性组合物层，所述微针能够穿刺皮肤并允许皮内地施用免疫原性组合物。在一些实施方式中，该方法包括按压穿刺机构。在一些实施方式中，免疫原性组合物(例如四价疫苗)包含病毒，所述病毒包含编码经表达的突变体M2和BM2蛋白或者未表达的突变体M2和BM2蛋白的核酸序列；其中，经表达的突变体M2蛋白包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3编码的氨基酸序列，并且BM2蛋白包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11编码的氨基酸序列。在一些实施方式中，微针阵列最初定位在装置壳体内部，并且在致动控制杆后允许微针延伸穿过装置底部并插入皮肤中，从而允许将疫苗流体输注至皮肤中。
本文所述的递送装置可以用于递送任何可能期望的物质。在一个实施方式中，待递送的物质是药物，并且递送装置是配置成将药物递送至对象的药物递送装置。如本文所用，术语“药物”旨在包括为了任何治疗、预防或医学目的而递送给对象的任何物质(例如，疫苗、药物、营养物、营养品等)。在一个此类实施方式中，药物递送装置是配置成向对象递送一剂疫苗的疫苗递送装置。在一个实施方式中，递送装置配置成递送流感疫苗。本文讨论的实施方式主要涉及配置成透皮递送物质的装置。在一些实施方式中，该装置可以配置成将物质直接递送到除皮肤之外的器官。
实施例
如上所述，本申请提供了新型的四价免疫原性组合物，其包含用于在哺乳动物中引发针对流感A和流感B的免疫应答的流感A和流感B突变体株。提供以下实施例以说明用配制成多价疫苗的突变体引发免疫应答的方法，以及测试多价制剂的减弱毒力的方法。
提供以下实施例仅是为了说明而不是为了限制。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本相同或相似结果。所述实施例绝不应该被解释为限制由所附权利要求限定的本技术的范围。
实施例1:BM2SR突变体引发针对配制成四价疫苗的流感B病毒的抗体应答
进行实验以证明当配制成四价疫苗时BM2SR突变体病毒引发抗体应答。将以下四种单价疫苗配制在一起：包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体的A/California/07/2009(H1N1)，包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体的A/Brisbane/10/2007(H3N2)，包含含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体的B/Brisbane/60/2008(Victoria)和包含含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体的B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)。将1×106TCID50的每个单价混合在一起，使得每个四价剂量为每只小鼠4×106TCID50。表1和表5中提供了M2SR-1和BM2SR-0突变体构建体中的每一者的序列。
将6周龄BALB/c雌性小鼠用四价制剂以每只小鼠4x106 TCID50的剂量鼻内接种。对照组小鼠给予PBS。在初免接种后第7天、第14天和第21天和在第28天的第二次免疫后第35天、第42天和第49天采集血清样品。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)针对B/Wisconsin/01/2010和B/Brisbane/60/2008测定来自血清样品的抗HA IgG抗体滴度。体液应答显示在图2中，其显示针对代表两种流感B谱系(B/Bris/60和B/Wisc/01)的两种流感B抗原，四价M2SR和BM2SR疫苗均提高了抗流感病毒抗体高于对照PBS组。由四价疫苗加强的小鼠在第二次免疫后比在初免剂量后具有更高水平的抗流感HA抗体。
这些结果表明每种单价BM2SR疫苗能够在四价制剂中引发抗原特异性应答。
实施例2：M2SR和BM2SR突变体引发针对配制在多价疫苗中的流感A病毒和流感B病
毒的抗体应答
A.BM2SR突变体引发针对配制在多价疫苗中的流感B病毒的抗体应答
进行实验以证明当用流感A H1N1或H3N2 M2SR疫苗配制为单价、二价、三价或四价疫苗时，BM2SR突变体病毒引发抗体应答。表A显示了以下四种单价M2SR和BM2SR疫苗的不同制剂如何配制在一起：A/California/07/2009(H1N1)(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体，A/Brisbane/10/2007(H3N2)(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)，B/Brisbane/60/2008(Victoria)(包含含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体)，B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)(包含含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体)。
表A.M2SR和BM2SR的多价制剂
X＝组分存在于制剂中
以表A中所示的剂量，用单价、二价、三价或四价疫苗对6周龄的BALB/c雌性小鼠鼻内接种。向对照组的小鼠给予PBS。在初免接种后第7天、第14天和第21天以及第28天第二次免疫后第35天、第42天和第49天采集血清样品。通过针对B/Wisconsin/01/2010和B/Brisbane/60/2008的酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定来自血清样品的抗-HA IgG抗体滴度。体液应答显示在图3A至图3B中，其显示针对代表多价制剂中的两种流感B谱系的两种流感B抗原，两种BM2SR疫苗组分(Bris60和WI01)均提高了抗流感病毒抗体高于对照PBS组。
这些结果表明，当配制成多价疫苗时，单价组分之间没有干扰。
B.M2SR突变体引发针对配制在多价疫苗中的流感A病毒的抗体应答
进行实验以证明当用流感B Yamagata谱系或Victoria谱系BM2SR疫苗配制成单价、二价、三价或四价疫苗时，M2SR突变体病毒引发抗体应答。表A显示了以下四种单价M2SR和BM2SR疫苗的不同制剂如何配制在一起：A/California/07/2009(H1N1)(包含含有SEQ IDNO:1的M2SR-1突变体)A/Brisbane/10/2007(H3N2)(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)、B/Brisbane/60/2008(Victoria)(包含含有SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体)、B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)(包含含有SEQ ID NO:11的BM2SR突变体)。
以表A中所示的剂量，用单价、二价、三价或四价疫苗对6周龄的BALB/c雌性小鼠鼻内接种。向对照组小鼠给予PBS。在初免接种后第7天、第14天和第21天以及第28天第二次免疫后第35天、第42天和第49天采集血清样品。通过针对A/California/07/2009(H1N1)和A/Brisbane/10/2007(H3N2)的酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定来自血清样品的抗-HA IgG抗体滴度。体液应答显示在图3C至图3D中，其显示针对代表多价制剂中的H1N1亚型和H3N2亚型的两种流感A抗原，两种流感A M2SR疫苗组分(H1N1和H3N2)均提高了抗流感病毒抗体高于对照PBS组。
这些结果表明，当配制成多价疫苗时，单价组分之间没有干扰。
实施例3：BM2SR突变体保护小鼠免受作为单价或四价制剂的致死流感B病毒攻击
在第一次接种后49天(加强后3周)，用致死剂量的B/Malaysia/2506/2004病毒(20只小鼠50％致死剂量(MLD50))攻击BALB/c雌性小鼠(N＝8只)。如图4A和图4B所示，用BM2SR和四价疫苗接种的所有小鼠在攻击中存活并且体重没有减轻。然而，仅给予PBS的对照小鼠体重减轻并且在攻击日后9天没有存活。在攻击后第4天，获得肺并通过噬菌斑测定在MDCK细胞中测定病毒滴度。如图4C所示，BM2SR和接种四价疫苗的小鼠中的肺病毒滴度低于检测限，而未接种的对照PBS小鼠具有高病毒滴度，表明BM2SR和四价疫苗赋予交叉保护并限制攻击病毒的复制。
实施例4：四价M2SR疫苗保护小鼠免受致死流感A病毒攻击
在第一次接种后49天(加强后3周)用致死剂量的A/Aichi/02/1968(H3N2)病毒(40只小鼠50％致死剂量(MLD50))攻击BALB/c雌性小鼠(N＝8只)。如图5A和图5B所示，用单价H1N1或H3N2 M2SR和四价M2SR疫苗进行接种疫苗的所有小鼠在攻击中存活并且体重短暂减轻但完全恢复。然而，仅给予PBS的对照小鼠体重减轻并且在攻击日期后8天没有存活。在攻击后第4天，获得肺并通过噬菌斑测定在MDCK细胞中测定病毒滴度。如图5C所示，M2SR单价和四价接种疫苗的小鼠中的肺病毒滴度至少低于未接种的对照PBS小鼠一个log，表明M2SR单价和四价M2SR疫苗赋予交叉保护并限制与任何疫苗组分都不匹配的攻击病毒的复制。
实施例5：BM2SR突变体引发针对配制为四价疫苗的流感B病毒的抗体应答
进行实验以证明当配制成四价疫苗时BM2SR突变体病毒引发抗体应答。将以下四种单价疫苗配制在一起：H1N1流感A病毒，其包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体；H3N2流感A病毒，其包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体；Victoria谱系的流感B病毒，其包含含有SEQ ID NO:9的BM2SR-4突变体；和Yamagata谱系的流感B病毒，其包含含有SEQ ID NO:9的BM2SR-4突变体。将0.2x106至1x106 TCID50的每个单价混合在一起使每个四价剂量为每只小鼠约3x106 TCID50。表1和表5中提供了M2SR-1和BM2SR-4突变体构建体中的每一者的序列。
用四价制剂以每只小鼠约3x106 TCID50的剂量对6周龄BALB/c雌性小鼠鼻内接种。向对照组小鼠给予PBS。在初免接种后第14天采集血清样品。通过针对流感抗原(B/Victoria谱系和B/Yamagata谱系)的酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定来自血清样品的抗-HA IgG抗体滴度。如图6A和图6B所示，针对代表两种流感B谱系的两种流感B抗原，四价M2SR和BM2SR疫苗将抗流感病毒抗体提高为高于对照PBS组。
这些结果表明每种单价BM2SR疫苗能够在四价制剂中引发抗原特异性应答。
实施例6：M2SR和BM2SR突变体引发针对配制在多价疫苗中的流感A和流感B病毒的
抗体应答
A.BM2SR突变体引发针对配制在多价疫苗中的流感B病毒的抗体应答
进行实验以证明当用流感A H1N1或H3N2 M2SR疫苗配制成单价、三价或四价疫苗时BM2SR突变体病毒引发抗体应答。将以下四种单价M2SR和BM2SR疫苗配制在一起：H1N1(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)，H3N2(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)，B/Victoria-谱系(包含含有SEQ ID NO:9的BM2SR-4突变体)，B/Yamagata(包含含有SEQ IDNO:9的BM2SR-4突变体)。
用单价、三价或四价疫苗对6周龄BALB/c雌性小鼠鼻内接种。向对照组的小鼠给予PBS。在初免接种后第14天采集血清样品。通过针对两种流感B抗原的酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定来自血清样品的抗-HA IgG抗体滴度。如图7C和图7D所示，针对代表多价制剂中的两种流感B谱系的流感B抗原，两种BM2SR疫苗组分均高于对照PBS组。
这些结果表明，当配制成多价疫苗时，单价组分之间没有干扰。
B.M2SR突变体引发针对配制在多价疫苗中的流感A病毒的抗体应答
进行实验以证明当用流感B Yamagata谱系或Victoria谱系BM2SR疫苗配制成单价、三价或四价疫苗时，M2SR突变体病毒引发抗体应答。将以下四种单价M2SR和BM2SR疫苗配制在一起：H1N1(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)、H3N2(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)、B/Victoria-谱系(包含含有SEQ ID NO:9的BM2SR-4突变体)、B/Yamagata(包含含有SEQ ID NO:9的BM2SR-4突变体)。
用单价、三价或四价疫苗对6周龄BALB/c雌性小鼠鼻内接种。向对照组的小鼠给予PBS。在初免接种后第14天采集血清样品。通过针对H1N1和H3N2流感A病毒的酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定来自血清样品的抗-HA IgG抗体滴度。如图7A和图7B所示，针对代表多价制剂中的H1N1和H3N2亚型的两种流感A抗原，两种流感A M2SR疫苗组分(H1N1和H3N2)均将抗流感抗体提高为高于对照PBS组。
这些结果表明，当配制成多价疫苗时，单价组分之间没有干扰。
实施例7：BM2SR-4突变体保护小鼠免受作为单价、三价或四价制剂的致死流感B病
毒攻击
在接种后22天，用致死剂量的异源亚型流感B病毒(B/Malaysia/2506/2004病毒)(20只小鼠50％致死剂量(MLD50))攻击BALB/c雌性小鼠(N＝4只)。所有小鼠用BM2SR-4单价、三价和四价疫苗接种，在攻击中存活(图8B)并且体重没有减轻(图8A)。然而，仅给予PBS的对照小鼠体重减轻并且未在攻击中存活。这些结果表明，单价BM2SR-4疫苗(每种不同于攻击病毒)、三价和四价疫苗赋予对攻击病毒的交叉保护。这些结果表明多价制剂中的单价组分之间没有干扰。
实施例8：四价M2SR疫苗保护小鼠免受致死流感A病毒攻击
在接种后22天，将BALB/c雌性小鼠(N＝4只)用致死剂量的异源流感A病毒攻击，该病毒诸如A/Aichi/02/1968(H3N2)病毒(40只小鼠50％致死剂量(MLD50))。所有用以下疫苗接种的小鼠在攻击后具有更多的存活者(图9B)和体重短暂减轻但在第7天开始恢复(图9A)：三价(包含H1N1(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)，H3N2(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)和B/Yamagata(包含含有SEQ ID NO:9的BM2SR-4突变体))或四价M2SR疫苗(包含H1N1(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)、H3N2(包含含有SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体)、B/Victoria谱系(包含含有SEQ ID NO:9的BM2SR-4突变体)和B/Yamagata(包含含有SEQ ID NO:9的BM2SR-4突变体))。然而，仅给予PBS的对照小鼠体重减轻并且在攻击日后7天没有存活。这些结果表明，三价和四价M2SR/BM2SR疫苗赋予针对与任何疫苗组分不匹配的攻击病毒的交叉保护。
实施例9：雪貂模型中的由单价M2SR和BM2SR和四价M2SR疫苗引发的免疫应答和保
护性功效
A.概述
该实施例证明在雪貂模型中由四价M2SR疫苗引发的免疫应答类似于单价M2SR和BM2SR疫苗中的每一者。也就是说，四价M2SR不展示干扰并引发针对每种组分的保护性免疫应答。将M2SR和BM2SR候选病毒中的每一者以1x107 TCID50(单价)或4x107 TCID50(四价)的剂量水平鼻内施用至12只雄性雪貂。作为对照，向一组雪貂施用OPTI-MEMTM作为安慰剂对照。每个处理组使用初免-加强接种疫苗方案。向雪貂施用初免疫苗(第0天)和在28天后(第28天)施用加强接种疫苗。在每次接种疫苗后，在接种后14天观察雪貂的死亡率，每天测量体重、体温和临床体征。在第21天、第35天和第56天从接种疫苗后的所有雪貂采集血清以评价随时间推移的抗体水平。
在第70天，用1x106 PFU的A/California/07/2009(H1N1pdm)鼻内地攻击所有动物。攻击后，在接种后监测雪貂14天的死亡率，每天测量体重、体温和临床体征。在攻击后第1天、第3天、第5天和第7天从每组中的雪貂(N＝8只)收集鼻洗液用于病毒滴度。另外，在攻击后(第82天)从存活的雪貂采集血清用于分析。在攻击后3天(第73天)对每组4只雪貂尸检。收集器官以确定攻击后的病毒载量(滴度)。
在5个组中未观察到与疫苗相关的不良事件。攻击后，安慰剂对照组表现出体重减轻(约15％)。在抗原错配的单价H3N2 M2SR和BM2SR接种疫苗组中也观察到体重减轻；然而，所述减轻(约5％至8％)低于安慰剂组中观察到的减轻。四价M2SR和H1N1pdm M2SR在攻击后没有显示任何显著的体重减轻。
B.材料和方法
疫苗病毒接种。用1x107 TCID50剂量的两剂单价M2SR或BM2SR疫苗鼻内接种雪貂，或用4x 107TCID50剂量的两剂四价M2SR疫苗鼻内接种雪貂，如表B所示。将小瓶冷冻储液在室温下解冻至少10分钟，然后冷藏存储(或在湿冰上)直至使用。将雪貂用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，并以500μL的体积鼻内施用病毒剂量(250μL/鼻孔)。在每次接种疫苗后每天观察动物持续7天。监测体重、体温和临床体征7天。
表B:接种疫苗和样品收集时间表
1鼻内接种
2从未分配于尸检的动物收集的鼻洗液。
3从每组4只雪貂中收集的器官(鼻甲、气管、肺(左右侧和尾叶))用于病毒滴度分析。
4接种疫苗后血清收集
M2SR病毒是一种不表达功能性M2蛋白的重组流感A病毒，包含含有编码流感A/Brisbane/10/2007样A/Uruguay/716/2007(H3N2)或A/California/07/2009(H1N1pdm)的HA基因和NA基因的SEQ ID NO:1的M2SR-1突变体。BM2SR病毒是一种不表达功能性BM2蛋白的重组流感B病毒，包含含有编码B/Brisbane/60/2008(Victoria)或B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)的HA和NA的SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体。四价M2SR由编码H1N1、H3N2、B/Victoria、B/Yamagata HA和NA的2种M2SR和2种BM2SR病毒组成。
动物和动物护理。从Triple F Farms购买八十只雄性雪貂，并将这些雪貂中的72只放置在研究中。在研究开始时动物大约4月龄。所述动物经供应商认证是健康的，并且不含针对传染病的抗体。抵达后，将所述动物单独饲养在带有板条底部的悬挂金属丝笼中，悬挂在纸衬里的废物盘上。根据公认的动物护理实践和相关的标准操作程序，动物室和笼子在动物收到之前已经被清洁和消毒。认证的Teklad Global Ferret Diet#2072(特克拉德饮食(Teklad Diets)，威斯康星州麦迪逊)和芝加哥市自来水随意提供，并每周至少补充三次。将动物室中的荧光照明保持12小时光/暗循环。动物室温度和相对湿度在各自的方案限值内，并且在研究期间内范围分别为20.0℃至25.0℃和30％至63％。
动物隔离和随机化。在随机化之前将雪貂隔离保持七天并且每天观察。根据表明动物的一般健康状况的每日观察结果，将雪貂从隔离中释放出来进行随机化和测试。在隔离之后，将雪貂称重并基于产生类似组平均值的体重使用计算机化随机化程序分配给治疗组2.1.E.11版(PDS病理学数据系统有限公司(Pathology Data Systems，Inc.)，瑞士巴塞尔)]。在一组中，所有体重均在其平均值的20％之内。选择用于研究的动物通过耳标和响应器接收永久识别号码，并且各个笼卡还通过各个数字和组识别研究动物。分配的识别号码在研究中是唯一的。
实验设计。为了评估疫苗功效，将雪貂用每种M2SR、BM2SR或四价M2SR病毒免疫或用培养基(OPTI-MEMTM)模拟免疫。监测雪貂体重、体温和临床症状并评价免疫应答。在研究开始时4月龄的72只雄性雪貂(Triple F Farms，宾西法尼亚州塞尔)用于该研究。根据IIT研究所动物护理和使用委员会批准的方案，所有动物程序均在动物生物安全2级设施中进行。在接种之前，监测雪貂3天以测量体重并建立基线体温。每天通过在每只雪貂皮下植入的响应器(BioMedic数据系统，特拉华州西福德)记录温度读数。在研究开始之前收集血液，并测试血清的流感抗体。用受体破坏酶(RDE)处理预接种疫苗的血清样品以除去非特异性抑制剂，然后连续稀释，针对规定量的流感病毒A/California/07/2009样(H1N1pdm)、A/Switzerland/9715293/2013(H3N2)、流感B病毒、B/Brisbane/60/2008(Victoria谱系)和B/Wisconsin/01/2010(Yamagata谱系)测试，并与0.5％火鸡红血细胞或0.75％至1.0％豚鼠红血细胞混合。抗体滴度由引起红细胞凝集抑制的最低血清稀释度定义。只有具有低于40的HAI(血细胞凝集抑制)滴度的雪貂被认为是血清阴性的并且在本研究中使用。将研究动物随机化并分成6组(12只雪貂/组)，如表B所示。
将雪貂在第0天和第28天用单剂量的1x107 TCID50的M2SR或BM2SR病毒鼻内接种或在第0天和第28天用单剂量的4x107 TCID50的四价M2SR鼻内接种。在第0天和第28天用OPTI-MEMTM鼻内模拟接种对照组。在接种后每天监测雪貂体温、体重和临床症状，持续14天。将鼻洗液样品保持在-65℃。在接种前(第-3天至第-5天)和第21天、第35天和第56天收集血液，并将血清保持在-65℃直至通过ELISA和HAI测定法测量抗体滴度。
C.结果
通过针对A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/California/07/2009(H1N1pdm)、B/Wisconsin/01/2010(Yamagata谱系)和B/Brisbane/60/2008(Victoria谱系)的酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定来自血清样品的抗HA IgG抗体滴度。简而言之，将ELISA板用来自各株的重组HA蛋白涂覆，用牛血清白蛋白(BSA)封闭，并施加样品。通过辣根过氧化物酶标记的抗雪貂IgG-山羊抗体(KPL，Inc.，马里兰州盖瑟斯堡)和SureBlue TMB(KPL，Inc.)底物检测雪貂IgG抗体。
如所预期的，每个免疫组中的雪貂显示血清中针对其各自的抗原的抗HA抗体显著升高。更重要的是，四价M2SR组显示血清中针对所有四种抗原的抗HA抗体显著升高(图10)，表明多价制剂的组分之间不存在干扰。这些数据表明M2SR、BM2SR和四价M2SR病毒在雪貂中引发显著的免疫应答。
通过血细胞凝集抑制(HAI)测定分析血清样品，以证明通过ELISA检测的抗体的功能活性。用受体破坏酶(RDE)(日本生研，日本东京)处理血清样品以消除非特异性血细胞凝集抑制剂。根据制造商的说明复溶RDE。将血清在RDE中1:3稀释，并在37±2℃水浴中孵育18小时至20小时。加入等体积的2.5％(v/v)柠檬酸钠后，将样品在56±2℃水浴中孵育30±5分钟。在RDE处理后，向每个样品中加入0.85％NaCl至1:10的最终血清稀释度。然后将稀释的样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中一式两份稀释成四个两倍稀释液(1:10至1:80)，然后与A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/California/07/2009(H1N1pdm)、B/Wisconsin/01/2010(Yamagata谱系)和B/Brisbane/60/2008(Victoria谱系)流感病毒的4个血凝单元一起孵育。孵育后，向每个样品中加入0.5％禽红血细胞并孵育30±5分钟。然后对血细胞凝集的存在或不存在评分。
如图11A和图11B所示，所有M2SR免疫的雪貂都表现出针对其各自的测试病毒的显著HAI抗体滴度。四价M2SR表现出针对所有四种测试病毒的显著HAI滴度。安慰剂(未接种的)组未引发任何流感特异性抗体。CDC指出，血清HAI抗体滴度为40与人群中流感感染或疾病风险降低至少50％相关。因此，这些结果表明M2SR和BM2SR病毒引发当病毒被一起配制成四价疫苗时维持的保护性免疫应答。
在用A/California/09/2009(H1N1pdm)攻击后，在所有动物中攻击后第6天观察到5％至8％的体重减轻。在整个14天的观察期内，动物体重保持低于其初始体重，除了施用OPTI-MEMTM的雪貂(安慰剂组)体重减轻最多(15％)。接种疫苗的雪貂中的体重减轻取决于疫苗的抗原性。接收匹配的H1N1pdm M2SR或四价M2SR(含有H1N1pdm M2SR)的雪貂没有表现出任何显著的体重减轻。接受异源H3N2 M2SR或任一种BM2SR疫苗的雪貂表现出约5％至8％的体重减轻。
在攻击后第1天、第3天、第5天、第7天从所有雪貂收集鼻洗液样品，并通过MDCK细胞中的噬菌斑测定评价其攻击病毒的存在。图12显示四价M2SR以类似于单价同源H1N1pdmM2SR的方式控制攻击病毒复制。安慰剂和BM2SR单价疫苗不控制攻击病毒，其中在感染后多达5天检测到至少5个log的病毒。异源H3N2 M2SR组没有像同源H1N1和Quad M2SR那样消除攻击病毒，但相对于安慰剂组部分控制病毒复制。
从4只雪貂在感染后第3天收获的呼吸器官证明了攻击病毒的控制。如图13A、图13B和图13C所示，H1N1 M2SR和Quad M2SR完全不允许攻击病毒在上呼吸道组织和下呼吸道组织(鼻甲、气管、肺)中复制。相比之下，攻击病毒在其他组的上呼吸道组织(鼻甲和气管)中生长至高滴度。在下呼吸道(肺)中，单价M2SR疫苗相对于安慰剂组控制攻击病毒。这些结果表明，同源和四价M2SR防止了流感感染构建自身，并且无关的M2SR疫苗降低了感染的严重程度。
D结论
该实施例表明，四价M2SR疫苗病毒的鼻内施用与任何疫苗相关的不良事件(例如，体温升高、体重减轻或临床体征)无关。这些结果表明，四价M2SR病毒引发针对多价制剂中所含的每种株的保护性免疫应答，并且可用作鼻内流感疫苗。
Claims (17)
1.一种免疫原性组合物，其中，所述组合物是包含来自至少两种流感株的重组病毒的多价组合物。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述多价组合物包含：
a)至少一种经工程化的减毒流感A M2缺陷型重组病毒，其中，所述经工程化的流感A病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因；和
b)至少一种经工程化的减毒流感BM2缺陷型重组病毒，其中，所述经工程化的流感B病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQID NO:11的突变体BM2基因。
3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中，所述至少一种流感A病毒选自H1N1亚型和H3N2亚型的组，并且所述至少一种流感B病毒选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组。
4.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述多价组合物包含选自由以下组成的组的重组病毒：
a)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的两种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的两种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因；
b)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的两种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的一种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因；
c)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的一种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的两种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因；和
d)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的一种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的一种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因。
5.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述多价组合物是包含以下的四价组合物：
a)两种经工程化的减毒流感A病毒，其由以下组成：
i)具有包含SEQ ID NO:1的突变体M2基因的H1N1，和
ii)具有包含SEQ ID NO:1的突变体M2基因的H3N2；和
b)两种经工程化的减毒流感B病毒，其由以下组成：
i)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Victoria，和
ii)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Yamagata。
6.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述多价组合物是包含以下的四价组合物：
a)两种经工程化的减毒流感A病毒，其由以下组成：
i)具有包含SEQ ID NO:1的突变体M2基因的H1N1，和
ii)具有包含SEQ ID NO:1的突变体M2基因的H3N2；和
b)一种经工程化的减毒流感B病毒，其选自由以下组成的组：
i)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Victoria，和
ii)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Yamagata。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫原性组合物，还包含药学上可接受的载体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫原性组合物，还包含药学上可接受的佐剂。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物经配制用于鼻内施用或皮内施用。
10.一种刺激针对流感A和流感B的免疫应答的方法，包括向有需要的对象施用多价免疫原性组合物，所述多价免疫原性组合物包含：
a)至少一种经工程化的减毒流感A M2缺陷型重组病毒，其中，所述经工程化的流感A病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因；和
b)至少一种经工程化的减毒流感BM2缺陷型重组病毒，其中，所述经工程化的流感B病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQID NO:11的突变体BM2基因。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述至少一种流感A病毒选自H1N1亚型和H3N2亚型的组，并且所述至少一种流感B病毒选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述多价免疫原性组合物包含选自由以下组成的组的重组病毒：
a)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的两种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的两种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因；
b)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的两种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的一种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因；
c)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的一种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的两种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因；和
d)选自H1N1亚型和H3N2亚型的组的一种经工程化的减毒流感A M2缺陷型病毒和选自B/Yamagata谱系和B/Victoria谱系的组的一种经工程化的减毒流感BM2缺陷型病毒，其中，所述A M2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的突变体M2基因，所述BM2缺陷型病毒包含含有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述多价免疫原性组合物是包含以下的四价组合物：
a)两种经工程化的减毒流感A病毒，其由以下组成：
i)具有包含SEQ ID NO:1的突变体M2基因的H1N1，和
ii)具有包含SEQ ID NO:1的突变体M2基因的H3N2；和
b)两种经工程化的减毒流感B病毒，其由以下组成：
i)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Victoria，和
ii)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Yamagata。
14.根据权利要求10所述的方法，其中，所述多价免疫原性组合物是包含以下的四价组合物：
a)两种经工程化的减毒流感A病毒，其由以下组成：
i)具有包含SEQ ID NO:1的突变体M2基因的H1N1，和
ii)具有包含SEQ ID NO:1的突变体M2基因的H3N2；和
b)一种经工程化的减毒流感B病毒，其选自由以下组成的组：
i)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Victoria，和
ii)具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的突变体BM2基因的B/Yamagata。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的佐剂。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的方法，其中，所述免疫原性组合物经配制用于鼻内施用或皮内施用。
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