KR20230163582A - 인플루엔자에 대한 면역원성 조성물 - Google Patents

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마이클 제이. 모저
야수코 해타
패믹 빌셀
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Abstract

본 발명은 변이체 바이러스들, 그리고 특히 변이체 인플루엔자 바이러스들에 관련된 조성물들과 방법들에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 변이체 바이러스들은 변이체 M2 시퀀스들, 변이체 BM2 시퀀스들을 포함하고, 예컨대 4가 백신들로서 면역원성 조성물들에서 유용하다. 본 명세서에서는 바이러스 변이체들을 전파시키기 위한 방법들, 조성물들 및 셀들이 개시되어 있고, 예방 접종과 관련된 방법들, 장치들 및 조성물들이 또한 개시된다.

Description

인플루엔자에 대한 면역원성 조성물{IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AGAINST INFLUENZA}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 전문이 본 명세서에 참조로 통합되어 있고, 2017년 2월 27일 출원된 미국 출원 62/464,019호의 우선권의 이익을 주장한다.
인플루엔자는 미국 성인들의 주요 사망 원인이다. 매년 약 3만 6천 명이 인플루엔자로 사망하고 20만 명 이상이 입원한다. 독감은 기침, 재채기, 그리고 문 손잡이와 전화기 같은 바이러스를 옮기는 물체와 직접 신체 접촉을 통해 퍼지는 전염성이 강한 질병이다. 인플루엔자의 증상은 발열, 극심한 피로, 두통, 오한, 그리고 몸살을 포함한다; 약 50퍼센트의 감염자들은 아무런 증상도 없지만 여전히 전염성이 있다. 면역법은 순환하는 바이러스 균주의 항원이 백신의 그것과 일치하는 한 65세 미만의 건강한 사람들의 인플루엔자 예방에 50-60% 효과적이다.
백신은 인플루엔자를 예방하는 주요 방법이며, 현재 실시간 약독화된 및 비활성(살해) 바이러스 백신을 모두 이용할 수 있다. 일반적으로 내성적으로 투여되는 살아있는 바이러스 백신은 면역 시스템의 모든 단계를 활성화시키고 여러 개의 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 따라서, 살아있는 바이러스의 사용은 활성화되지 않은 바이러스 백신을 준비하는 동안 발생할 수 있는 바이러스 항원의 파괴 문제를 극복한다. 또한, 살아있는 바이러스 백신에 의해 생산된 면역성은 일반적으로 비활성 백신에 의해 유발된 것보다 더 내구성이 좋고, 효과적이며, 상호 반응성이 더 높으며, 살아있는 바이러스 백신은 비활성 바이러스 백신에 비해 생산 비용이 덜 든다. 그러나 약독화 바이러스의 변이체는 종종 잘못 정의되어 있고, 반전이 우려된다.
일 양태에서, 본 개시물은 면역원성 조성물을 제공하고, 이러한 조성물은 적어도 2개의 인플루엔자 균주(influenza strain)들로부터의 재조합 바이러스들을 포함하는 다가 조성물이다.
일부 실시예들에서, 이러한 다가 조성물은 a) 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 재조합 바이러스로서, 상기 설계된 약독화된 인플루엔자 A 바이러스는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3를 포함하는 변이체 M2 유전자를 포함하는, 상기 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 재조합 바이러스; 및 b) 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 재조합 바이러스로서, 상기 설계되는 인플루엔자 B 바이러스는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 M2 유전자를 포함하는, 상기 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 재조합 바이러스를 포함한다. 일부 실시예들에서, 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1 및 H3N2 서브타입(subtype)들의 그룹으로부터 선택되고, 상기 적어도 하나의 인플루엔자 B 바이러스는 B/Yamagata 및 B/Victoria 혈통( lineage)들의 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시예들에서, 다가 조성물은 a) H1N1 및 H3N2 서브타입들의 그룹으로부터 선택되는 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스들로서, 상기 A M2-결핍 바이러스들은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 변이체 M2 유전자를 포함하는, 상기 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스들, 및 B/Yamagata 및 B/Victoria 혈통들의 그룹으로부터 선택되는 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스들로서, 상기 BM2-결핍 바이러스들은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 포함하는, 상기 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스들; b) H1N1 및 H3N2 서브타입들의 그룹으로부터 선택되는 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스들로서, 상기 A M2-결핍 바이러스들은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 변이체 M2 유전자를 포함하는, 상기 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스들, 및 B/Yamagata 및 B/Victoria 혈통들의 그룹으로부터 선택되는 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스로서, 상기 BM2-결핍 바이러스들은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 포함하는, 상기 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스; c) H1N1 및 H3N2 서브타입들의 그룹으로부터 선택되는 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스로서, 상기 A M2-결핍 바이러스는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 변이체 M2 유전자를 포함하는, 상기 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스, 및 B/Yamagata 및 B/Victoria 혈통들의 그룹으로부터 선택되는 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스로서, 상기 BM2-결핍 바이러스들은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 포함하는, 상기 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스들; 및 d) H1N1 및 H3N2 서브타입들의 그룹으로부터 선택되는 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스로서, 상기 A M2-결핍 바이러스는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 변이체 M2 유전자를 포함하는, 상기 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스, 및 B/Yamagata 및 B/Victoria 혈통들의 그룹으로부터 선택되는 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스로서, 상기 BM2-결핍 바이러스는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 포함하는, 상기 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 재조합 바이러스들을 포함한다.
일부 실시예들에서, 다가 조성물은 a) 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A 바이러스들로서: ⅰ) SEQ ID NO: 1을 포함하는 변이체 M2 유전자를 가지는 H1N1, 및 ⅱ) SEQ ID NO: 1을 포함하는 변이체 M2 유전자를 가지는 H3N2로 이루어지는, 상기 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A 바이러스들; 및 b) 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 B 바이러스들로서: ⅰ) SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 가지는 B/Victoria, 및 ⅱ) SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 가지는 B/Yamagata로 이루어지는, 상기 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 B 바이러스들을 포함하는 4가 조성물이다.
일부 실시예들에서, 다가 조성물은: a) 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A 바이러스들로서: ⅰ) SEQ ID NO: 1을 포함하는 변이체 M2 유전자를 가지는 H1N1, 및 ⅱ) SEQ ID NO: 1을 포함하는 변이체 M2 유전자를 가지는 H3N2로 이루어지는, 상기 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A 바이러스들; 및 b) 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 B 바이러스들로서: ⅰ) SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 가지는 B/Victoria, 및 ⅱ) SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 가지는 B/Yamagata로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 상기 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 B 바이러스들을 포함하는 4가 조성물이다.
일부 실시예들에서, 본 개시물의 면역원성 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 본 개시물의 면역원성 조성물은 약학적으로 허용 가능한 보조제를 더 포함한다, 일부 실시예들에서, 본 기술의 면역원성 조성물은 비강내 투여(intranasal administration) 또는 피내 투여(intracutaneous administration)를 위해 제형화된다.
일 양태에서, 본 개시물은 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B에 대한 면역 반응을 자극하는 방법을 제공하고, 이러한 방법은 필요로 하는 대상체(subject)에 다가 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 다가 면역원성 조성물은: a) 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 재조합 바이러스로서, 상기 설계된 인플루엔자 A 바이러스는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 변이체 M2 유전자를 포함하는, 상기 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 재조합 바이러스; 및 b) 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 재조합 바이러스로서, 상기 설계된 인플루엔자 B 바이러스는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 포함하는, 상기 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 재조합 바이러스를 포함한다.
일부 실시예들에서, 상기 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1 및 H3N2 서브타입들의 그룹으로부터 선택되고, 상기 적어도 하나의 인플루엔자 B 바이러스는 B/Yamagata 및 B/Victoria 혈통들의 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시예들에서, 다가 면역원성 조성물은 a) H1N1 및 H3N2 서브타입들의 그룹으로부터 선택되는 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스들로서, 상기 A M2-결핍 바이러스들은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 변이체 M2 유전자를 포함하는, 상기 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스들, 및 B/Yamagata 및 B/Victoria 혈통들의 그룹으로부터 선택되는 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스들로서, 상기 BM2-결핍 바이러스들은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 포함하는, 상기 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스들; b) H1N1 및 H3N2 서브타입들의 그룹으로부터 선택되는 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스들로서, 상기 A M2-결핍 바이러스들은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 변이체 M2 유전자를 포함하는, 상기 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스들, 및 B/Yamagata 및 B/Victoria 혈통들의 그룹으로부터 선택되는 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스로서, 상기 BM2-결핍 바이러스들은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 포함하는, 상기 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스; c) H1N1 및 H3N2 서브타입들의 그룹으로부터 선택되는 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스로서, 상기 A M2-결핍 바이러스는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 변이체 M2 유전자를 포함하는, 상기 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스, 및 B/Yamagata 및 B/Victoria 혈통들의 그룹으로부터 선택되는 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스들로서, 상기 BM2-결핍 바이러스들은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 포함하는, 상기 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스들; d) H1N1 및 H3N2 서브타입들의 그룹으로부터 선택되는 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스로서, 상기 A M2-결핍 바이러스는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 변이체 M2 유전자를 포함하는, 상기 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 바이러스, 및 B/Yamagata 및 B/Victoria 혈통들의 그룹으로부터 선택되는 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스로서, 상기 BM2-결핍 바이러스는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 포함하는, 상기 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 바이러스로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 재조합 바이러스들을 포함한다.
일부 실시예들에서, 다가 면역원성 조성물은 a) 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A 바이러스들로서: ⅰ) SEQ ID NO: 1을 포함하는 변이체 M2 유전자를 가지는 H1N1, 및 ⅱ) SEQ ID NO: 1을 포함하는 변이체 M2 유전자를 가지는 H3N2로 이루어지는, 상기 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A 바이러스들; 및 b) 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 B 바이러스들로서: ⅰ) SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 가지는 B/Victoria, 및 ⅱ) SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 가지는 B/Yamagata로 이루어지는, 상기 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 B 바이러스들을 포함하는 4가 조성물이다.
일부 실시예들에서, 다가 면역원성 조성물은 a) 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A 바이러스들로서: ⅰ) SEQ ID NO: 1을 포함하는 변이체 M2 유전자를 가지는 H1N1, 및 ⅱ) SEQ ID NO: 1을 포함하는 변이체 M2 유전자를 가지는 H3N2로 이루어지는, 상기 2개의 설계된 약독화된 인플루엔자 A 바이러스들; 및 b) 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 B 바이러스들로서: ⅰ) SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 가지는 B/Victoria, 및 ⅱ) SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 가지는 B/Yamagata로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 상기 1개의 설계된 약독화된 인플루엔자 B 바이러스들을 포함하는 4가 조성물이다.
일부 실시예들에서, 본 개시물의 면역원성 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 본 개시물의 면역원성 조성물은 약학적으로 허용 가능한 보조제를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 본 개시물의 면역원성 조성물은 비강내 투여 또는 피내 투여를 위해 제형화된다.
본 발명에 따르면 인플루엔자에 대한 면역원성 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 인플루엔자 바이러스 라이프 사이클에서의 M2 이온 채널의 역할을 묘사하는 그림으로서, (1) 이러한 인플루엔자 바이러스는 셀 표면 상의 시알산 수용기들에 들러 붙고; (2) 그러한 바이러스는 셀 내로 내화되며; (3) M2 이온 채널은 바이러스 표면 상에서 발현되고; (4) M2 이온 채널은 핵으로 들어가는 바이러스 RNA이 방출을 가져오는 양성자가 진입하는 것을 허용하기 위해 열리고, 복제되며, 바이러스 단백질 합성을 초래하며; (5) 바이러스 성분들은 비리온(virion)들로 패키지화되되어 방출된다(6).
도 2는 4가 백신 제형에서 BM2SR 바이러스들에 의해 이끌어 낸 항(anti)-HA IgG 항체 반응을 보여주는 차트이다.
도 3a 내지 도 3d는 다가 제형들에서의 BM2SR 바이러스와 M2SR 바이러스에 의해 이끌어 낸 항-HA IgG 항체 반응들을 보여주는 차트들이다. Mono/B WI01 = 1가B/WI01(SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR-0 변이체를 포함하는); mono B/Bris60 = 1가 B/Bris60(SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR-0 변이체를 포함하는); mono CA07 = 1가 CA07(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는); mono Bris10 = 1가 Bris 10(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는); BIV H1H3 = 2가 H1H3(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는); TIV H3VY = 3가 H3VY (SEQ ID NO: 1를 포함하는 M2SR-1 변이체와 SEQ ID NO: 11를 포함하는 BM2SR-0 변이체들을 포함하는); TIV H1VY = 3가 H1VY(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체들과, SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR-0 변이체를 포함하는); TIV H1H3V = 3가 H1H3V(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체들과, SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR-0 변이체를 포함하는); TIV H1H3Y = 3가 H1H3Y(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체들과, SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR-0 변이체를 포함하는); 4가(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체들과, SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR-0 변이체들을 포함하는).
도 4a는 인플루엔자 B 공격(challenge) 후, 1가 BM2SR, 1가 M2SR, 및 4가 백신들로 접종 후(post-inoculation)의 생쥐의 체중 변화를 보여주는 차트이다.
도 4b는 인플루엔자 B 공격 후, 1가 BM2SR, 1가 M2SR, 및 4가 백신들로 접종후의 생쥐의 생존(survival)을 보여주는 차트이다.
도 4c는 4일째 인플루엔자 B 공격 후의 상이한 예방 접종 그룹들로부터 생쥐들의 바이러스 역가(titer)들을 보여주는 차트이다.
도 5a는 인플루엔자 A 공격 후, 1가 BM2SR, 1가 M2SR, 및 4가 백신들로 접종후의 생쥐의 체중 변화를 보여주는 차트이다.
도 5b는 인플루엔자 A 공격 후, 1가 BM2SR, 1가 M2SR, 및 4가 백신들로 접종후의 생쥐의 생존을 보여주는 차트이다.
도 5c는 4일째 인플루엔자 A 공격 후의 상이한 예방 접종 그룹들로부터 생쥐들의 바이러스 역가들을 보여주는 차트이다.
도 6a 및 도 6b는 1가 BM2SR 및 4가 제형으로 접종한 후 인플루엔자 B 바이러스에 대해 도출된 항-HA IgG 항체 역가들을 보여주는 차트다. 대표적인 BM2SR 구성: B/CA12는 B Yamagata BM2SR; B/Bris46은 B Victoria BM2SR이다. 4가 제형은 2개의 BM2SR과 H1N1 및 H3N2 M2SR이 혼합된 것이다.
도 7a 내지 도 7d는 다가 제형들에서 인플루엔자 A 바이러스와 인플루엔자 B 바이러스에 대해 M2SR 및 BM2SR 변이체들이 항체 반응들을 이끌어 내는 것을 보여주는 차트들이다. 대표적인 M2SR 및 BM2SR 구성: A/MA15은 H1N1 M2SR이고; A/HK4801은 H3N2 M2SR이며; B/CA12는 B Yamagata BM2SR-4이고; B/Bris46은 B Victoria BM2SR-4이다. 4가("quad") 제형은 4가지 모두가 혼합된 것이다. 3가("tri")는 나타내어진 3가지 바이러스들의 제형이다.
도 8a 및 도 8b는 치사량 인플루엔자 B 공격, 1가 BM2SR, 3가, 및 4가 제형들로의 후접종 후의 생쥐의 체중 변화와 생존을 각각 보여주는 차트들이다.
도 9a 및 도 9b는 치사량 인플루엔자 A 공격, 3가 M2SR 제형(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는 H1N1, H3N2(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), 및 B/Yamagata(SEQ ID NO: 9를 포함하는 BM2SR-4 변이체를 포함하는)를 포함하는) 또는 4가 M2SR 제형(H1N1(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), H3N2(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), B/Victoria 혈통(SEQ ID NO: 9를 포함하는 BM2SR-4 변이체를 포함하는), 및 B/Yamagata(SEQ ID NO: 9를 포함하는 BM2SR-4 변이체를 포함하는)를 포함하는)로 후접종 후의 생쥐의 체중 변화와 생존을 각각 보여주는 차트들이다.
도 10은 4가 백신 후의 각각의 성분에 대해 도출된 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 역가들을 보여주는 차트이다.
도 11a는 4가 백신의 각각의 성분에 대해 도출된 HAI(hemagglutination inhibition) 역가들을 보여주는 차트이다.
도 11b는 35일째 후 접종시 풀된 혈청(pooled sera)에서의 4가 백신의 각각의 성분에 대해 도출된 HAI 역가들을 보여주는 표이다.
도 12는 1, 3, 5, 7일째 후 인플루엔자 A 공격시 세비액(nasal wash) 바이러스 역가들을 보여주는 차트이다.
도 13a는 3일째 후 인플루엔자 A 공격시 비갑개 조직에서의 바이러스 역가를 보여주는 차트이다.
도 13b는 3일째 후 인플루엔자 A 공격시 기관(trachea) 조직에서의 바이러스 역가를 보여주는 차트이다.
도 13c는 3일째 후 인플루엔자 A 공격시 폐 조직에서의 바이러스 역가를 보여주는 차트이다.
Ⅰ. 정의들(Definitions)
다음의 용어들이 본 명세서에서 사용되고, 이들의 정의가 지침(guidance)을 위해 제공된다.
본 명세서에서 사용된 것처럼, 단수 형태들인 "a", "an" 및 "the"는 단수형만을 가리키기 위해 일부러 표기되지 않는 한, 단수형태와 복수형태 모두를 가리킨다.
약(about)이라는 용어에 의해 한정되거나 한정되지 않건 간에, "약(about)"이라는 용어와 그 사용 범위들은 일반적으로 파악되는 숫자가 여기에 표현된 정확한 숫자로 제한되지 않고, 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 실질적으로 인용된 범위 내에 있는 범위들을 가리키는 것으로 의도되는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 것처럼, "약"은 당업자들에 의해 이해될 것이고, 그것이 사용되는 상황(context)에서 어느 정도까지는 다양하게 사용될 것이다. 만약 당업자에게 명확하지 않은 용어의 사용이 그것이 사용되는 상황이 주어지는 경우 존재한다면, "약"은 그 특별한 용어의 ±10%까지 의미하게 될 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 바이러스와 함께 사용된 "약독화된(attenuated)"이라는 용어는, 아직 여전히 생명력 있거나 살아 있는 약독화되지 않은 대응물에 비해, 독성 또는 병원성이 감소한 바이러스를 가리킨다. 통상적으로, 약독화는 바이러스와 같은 감염원(infectious agent)을 약독화되지 않은 바이러스에 비해 감염된 대상체에 덜 유해하거나 유독성이 덜하게 한다. 이는 죽거나 완전히 비활성화된 바이러스와는 대비된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "유효한 양" 또는 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약제학적으로 유효한 양"이라는 용어들은 바라는 치료학적 및/또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 양을 가리키는데, 예컨대 질병, 상태 및/또는 그것의 증상(들)의 방지를 가져오는 양을 가리킨다. 치료학적 또는 예방학적 적용의 상황에서는, 대상체에 투여된 조성물의 양은 질병의 유형과 심각도 및 종합적인 건강 상태, 나이, 성별, 체중 및 조성 약물(composition drug)들에 대한 내성과 같은 개개인의 특징들에 의존하게 된다. 그것은 또한 질병이나 질병의 정도, 심각성, 종류에 따라 달라질 것이다. 당업자는 이러한 요인과 다른 요인에 따라 적절한 복용량을 결정할 수 있을 것이다. 일부 실시예들에서는 다량의 선량이 투여된다. 추가적으로 또는 대안적으로 일부 실시예들에서는 복수의 치료 조성물 또는 화합물(예: 백신과 같은 면역원성 조성물)을 투여한다.
본 명세서에서 사용된 것처럼, "호스트 셀(host cell)"라는 용어는 바이러스와 같은, 병원체가 복제할 수 있는 셀을 말한다. 일부 실시예들에서 호스트 셀은 체외, 배양된 셀들이다. 이러한 호스트 셀의 제한되지 않는 예는 CHO 셀, 베로 셀 및 MDCK 셀을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시예들에서는 호스트 셀이 생체 내에 있다(예: 조류나 포유류와 같은 감염된 척추동물의 세포). 일부 실시예들에서는 예컨대, 호스트 셀의 바이러스 감염 및/또는 바이러스 성장률을 향상시킴으로써 바이러스 생성을 향상시키기 위해, 호스트 셀들이 변형될 수 있다. 예를 들어, 제한에 의한 것은 아니지만, 전형적인 호스트 셀 변형은 호스트 셀의 셀 표면에 있는 2-6 링크된(linked) 시알산 수용기들의 재조합식 발현, 및/또는 병원체나 바이러스에 없거나 비효과적인 것으로 밝혀진 호스트 셀들의 단백질의 재조합식 발현을 포함한다.
여기서 "면역원성 조성물"이란 용어는 그러한 조성물에 노출된 포유동물에서 면역 반응을 이끌어낼 조성물을 지칭하기 위해 사용된다. 일부 실시예들에서 면역원성 조성물은 적어도 하나의 M2-결핍 변이체 인플루엔자 A M2SR 균주(예: A/California/07/2009(H1NI)(SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 M2SR 변이체를 포함하는), A/Brisbane/10/2007(H3N2)(SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 M2SR 변이체를 포함하는))을 포함한다. 일부 실시예들에서 면역원성 조성물은 적어도 하나의 BM2-결핍 변이체 인플루엔자 B BM2SR 균주(예: B/Brisbane/60/2008(Victoria)(SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID: 11을 포함하는 BM2SR 변이체를 포함하는), B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)(SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 11를 포함하는 BM2SR 변이체를 포함하는)을 포함한다. 일부 실시예들에서 면역원성 조성물은 4가 백신으로서 제형화된 A/California/07/2009(H1NI)(SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 M2SR 변이체를 포함하는), A/Brisbane/10/2007(H3N2)(SEQ ID NO: 1, 2, SEOQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 M2SR 변이체를 포함하는), B//Brisbane/60/2008(Victoria)(SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR 변이체를 포함하는), 및 B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)(SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR 변이체를 포함하는)를 포함한다.
일부 실시예들에서, 본 명세서에서 설명된 면역원성 조성물은 다수의 형태들로 투여를 위해 제형화될 수 있다(즉, 포유동물로의 "노출(exposure)"을 위해 제형화된). 예를 들면, 일부 실시예들에서 면역원성 조성물은 구강, 폐, 정맥, 근육 내, 피하, 경막, 비강 또는 국부적 투여를 위해 마련된다. 조성물들은 또한 특정 투여량 형태들에 대해서도 제형화될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시예들에서 면역원성 조성물은 액체, 젤, 에어로졸, 연고, 크림, 동결 건조된 제형, 파우더, 케이크, 태블릿 또는 캡슐로 제형화될 수 있다. 다른 실시예들에서는 면역원성 조성물이 제어된 방출 제형, 지연된 방출 제형, 확장된 방출 제형, 맥동성 방출 제형 및 혼합된 즉시 방출 제형으로서 제형화된다. 일부 실시예들에서는 면역원성 조성물이 액체로서 제공된다. 다른 실시예들에서는 면역원성 조성물이 동결 건조된 형태로서 제공된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "감염된(infected)"이라는 용어는 질병 또는 바이러스와 같은 병원균을 숨겨두는 것을 말한다. 감염은 바이러스나 병원체를 투여하는 것(예: 백신 접종에 의한 것)에 의한 것과 같이 의도적일 수 있거나, 한 유기체에서 다른 유기체로 또는 오염된 표면으로부터 유기체로 병원균이 자연적으로 이동하는 것에 의한 것과 같이 의도적이지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "격리된(isolated)" 및/또는 "정화(purified)"라는 용어는 핵산(예: 벡터 또는 플라스미드), 폴리펩타이드, 바이러스 또는 셀의 체외 준비, 격리 및/또는 정화를 의미하며, 이것이 생체 내 원치 않는 물질과 관련이 없거나, 정상적으로 발생하는 생체 내 물질로부터 실질적으로 정화된 것이다. 예를 들어, 일부 구현에서는 체외 배양과 전파에 의해 격리된 바이러스 준비가 얻어지며, 다른 감염물질로부터 실질적으로 자유롭다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 자유로운"은 해당 화합물 또는 작용제에 대한 표준 검출 방법을 사용하는 원하지 않는 핵산들, 단백질들, 셀들, 바이러스들, 전염성 물질들 등과 같은 특정 화합물에 대한 검출 수준 이하를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "변이체(mutant)", "돌연변이(mutation)", "변종(variant)"이라는 용어는 상호 교환적으로 사용되며, 야생형 배열과 다른 핵산 또는 폴리펩타이드 염기서열을 가리킨다. 일부 실시예에서는 변이체 또는 변종 시퀀스가 자연적으로 발생하고 있다. 다른 실시예에서는 변이체 또는 변종 시퀀스가 재결합하여 또는 화학적으로 도입된다. 일부 실시예에서 핵산 돌연변이는 RNA 및/또는 DNA 염기서열에 대한 변형(예: 추가, 삭제, 대체)을 포함한다. 일부 실시예에서 변형은 화학 변형(예: 메틸화)을 포함하며 자연 및/또는 비자연 뉴클레오티드들의 대체 또는 첨가를 포함할 수 있다. 핵산 돌연변이들은 무성 돌연변이(silent mutation)들(예컨대, 야생형 시퀀스와 동일한 아미노산에 대해 코드화하는 하나 이상의 핵산 변경)이거나, 암호화된 아미노산이 변질되어 코돈이 멈추거나, 스플라이싱 결함이나 스플라이싱 변화를 일으킬 수 있다. 코딩 시퀀스들에 대한 핵산 돌연변이는 또한 보수적이거나 비보수적인 아미노산 변화를 초래할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "재조합 바이러스"라는 용어는 재조합 핵산 기술을 사용하여 바이러스 게놈의 변화를 도입하거나 바이러스 단백질에 변화를 도입하기 위해 시험관에서 조작한 바이러스를 말한다. 예를 들어, 일부 실시예에서 재조합 바이러스는 야생형, 내생성, 핵산 염기서열과 변이체 및/또는 외생성 핵산 염기서열을 모두 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 재조합형 바이러스는 변이체 또는 변종 행렬, 헤마글루티닌, 뉴라미니다아제, 핵단백질, 비구조성 및/또는 중합효소 단백질과 같은 변형된 단백질 성분들을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "재조합 셀" 또는 "변형 셀"이라는 용어는 재조합 핵산 기법을 사용하여 셀에 핵산을 도입하거나 세포핵산을 변형하기 위해 시험관에서 조작한 셀을 말한다. 재조합 셀의 예들로는 외생(exogeneous) 플라스미드, 발현 벡터들 등을 운반하는 원핵 셀 또는 진핵 셀 및/또는 그것들의 세포핵산(예: 셀 게놈으로의 대체, 돌연변이, 삽입, 삭제 등)의 변형을 포함하는 셀들이 있다. 전형적인 재조합 셀은 바이러스 M2 단백질과 같은 외생 단백질을 안정적으로 발현하기 위해 체외에서 조작된 셀이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단일 복제(SR) 바이러스"라는 용어는 호스트 셀의 바이러스 입력이나 호스트 셀로부터의 방출에 기능하는 바이러스 단백질에 결함이 있는 바이러스를 지칭한다. 예를 들어, 본 명세어에서 설명된 바와 같은 M2SR은, 고전적인(classical) 살아있는 약독화된(live attenuated) 인플루엔자 백신들과는 대조적으로, SR(단일 복제) 바이러스 백신들의 새로운 클래스에 속한다. SR 바이러스들은 바이러스 게놈 복제에 영향을 주지 않지만 바이러스 성장에 없어서는 안 되는 독감 M2 이온 채널 단백질과 같이 바이러스 진입이나 방출에 기능하는 비리온 단백질에 결함이 있다. 이와는 대조적으로, 기존의 약독화된 살아있는 바이러스 백신은 바이러스 복제 기계에 다수의 돌연변이를 포함하고 있어 크게 약독화된 표현형이다. 그러므로 SR 백신 바이러스 메커니즘들은 약독화된 살아있는 백신들과는 대조적으로 바이러스 감염 운동학 및 항원 생산에 영향을 주지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "대상물(object)"과 "환자(patient)"는 상호 교환적으로 사용되며, 예를 들어 척추동물 종에 속하는 동물을 지칭한다. 본 개시된 주제의 방법과 조성은 포유류와 새를 포함한 온혈 척추동물에게 특히 유용하다. 전형적인 대상물들은 멸종위기로 인해 중요하고, 경제적으로 중요한(인간이 소비하기 위해 농장에서 기르는 동물) 및/또는 인간에 대한 사회적으로 중요한(애완동물로 기르거나 동물원에 있는 동물) 포유류와 조류들 뿐만 아니라 인간들과 같은 포유류를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서는 그 대상물이 인간이다. 일부 실시예들에서는 그 대상물이 인간이 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 바이러스와 함께 사용하는 "유형"과 "균주"라는 용어는 서로 바꾸어 사용되며, 일반적으로 다른 특성을 가진 바이러스를 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스와는 다른 유형의 바이러스이다. 마찬가지로 인플루엔자 A H1N1은 인플루엔자 A H2N1, H2N2와 H3N2와는 다른 유형의 바이러스다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시예들에서는 인플루엔자 A H2N1, H2N2 및 H3N2와 같은 다른 유형의 바이러스를 "서브타입(subtype)들"이라고 부를 수 있다.
본 명세서에서 "백신"이라는 용어는 특정 질병에 대한 면역력을 생산하거나 증가시키기 위해 대상자에게 투여되는 성분을 지칭하기 위해 사용된다. 일부 실시예들에서 백신은 임상적으로 허용되는 보조제 및/또는 치료적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "vRNA"는 양성과 음성의 균주 바이러스 게놈들뿐만 아니라 분할된 또는 비분할된 바이러스 게놈들을 포함한 바이러스 게놈을 포함하는 RNA를 지칭한다. vRNA는 완전히 내생적(endogenous)이며 "야생형"일 수 있고/있거나 재조합 및/또는 변이체 시퀀스들을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "병독성(virulence)"이라는 용어는 질병을 야기하는 병원체의 상대적 능력을 지칭하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용된 "약독화된 병독성" 또는 "감소된 병독성"이라는 용어는 질병을 유발하는 병원체의 감소된 상대적 능력을 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들면, 약독화된 병독성 또는 감소된 병독성은 그것들이 대상물에 노출되었을 때 면역성을 발생시킬 수 있지만, 질병을 일으키지 않거나, 병의 형태, 지속성, 시작성 또는 이후 발병을 유발하지 않도록 약화시킨 바이러스를 설명할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "M2SR"은 단일 복제(SR) M2-결핍 재조합 인플루엔자 바이러스를 지칭한다. 본 명세서에서 설명된 전형적인 M2SR 인플루엔자 바이러스들은 그것이 사용되는 상황에 따라 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 바이러스 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 및 SEQ ID NO: 3을 포함하는 바이러스를 포함하는 백신을 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에서 증명된 M2 유전자의 돌연변이들을 설명할 때, "M2SR"은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 및/또는 SEQ ID NO: 3을 지칭한다. 특히 "M2SR-1"은 SEQ ID NO: 1을, "M2SR-2"는 SEQ ID NO: 2를, "M2SR-3"는 SEQ ID NO: 3을 지칭한다. 백신의 바이러스 성분을 설명할 때, "M2SR"은 기능적인 M2 단백질을 발현하지 않는 재조합형 인플루엔자 바이러스를 지칭한다. 백신을 설명할 때, "M2SR"은 M2SR 재조합 바이러스를 포함하는 백신을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "M2SR 바이러스"는 기능적인 M2 단백질을 발현하지 않는 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 일부 실시예에서, M2SR 바이러스는 다른 인플루엔자 바이러스들의 유전자를 포함한다. 일부 실시예에서, 바이러스는 인플루엔자 A/Brisbane/10/2007 류(- like) A/Uruguay/716/2007(H3N2)의 HA 및 NA 유전자를 포함한다. 일부 실시예에서 M2SR 바이러스는 A/California/07/2009 (CA07)(H1N1pdm) 바이러스의 HA 및 NA 유전자를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "BM2SR"은 단일 복제(SR) BM2-결핍 재조합 인플루엔자 바이러스를 지칭한다. 본 명세서에서 설명된 전형적인 BM2SR 인플루엔자 바이러스들은 그것이 사용되는 상황에 따라, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 및/또는 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 및/또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 바이러스, 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 및/또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 바이러스를 포함하는 백신을 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에서 증명된 BM2 유전자의 돌연변이들을 설명할 때, "BM2SR"은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및/또는 SEQ ID NO: 11을 지칭한다. 특히 "BM2SR-1"은 SEQ ID NO: 6을, "BM2SR-2"는 SEQ ID NO: 7을, "BM2SR-3"는 SEQ ID NO: 8을, "BM2SR-4"는 SEQ ID NO: 9를, "BM2SR-5"는 SEQ ID NO: 10을, "BM2SR-0"는 SEQ ID NO: 11을 지칭한다. 백신의 바이러스 성분을 설명할 때, "BM2SR"은 예를 통해, 하지만 제한적이지 않게B/Lee/40(핵단백질, NP), 중합효소 유전자(PA, PB1, PB2), 비구조적(NS1 및 NS2), NB, 매트릭스(BM1)의 내부 유전자들을 보유하지만 기능적 BM2 단백질을 발현하지 않는 재조합 인플루엔자 바이러스를 지칭한다. 백신을 설명할 때, "BM2SR"은 BM2SR 재조합 바이러스를 포함하는 백신을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "BM2SR 바이러스"는 B/Lee/40(뉴클레오단백질(NP)), 중합효소 유전자(PA, PB1, PB2) 비구조적(NS1 및 NS2), 매트릭스(BM1)의 내부 유전자를 가지고 있지만, 기능적 BM2 단백질을 단독으로 또는 다른 바이러스 성분들 및/또는 다른 바이러스 성분들을 암호화하는 유전자들과 결합하여 발현하지 않는 재조합형 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 일부 실시예에서, BM2SR 바이러스는 다른 인플루엔자 바이러스의 유전자들을 포함한다. 일부 실시예에서, 바이러스는 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008 류(-like) B/Brisbane/60/2008(B Victoria 혈통)의 HA 및 NA 유전자들을 포함한다. 일부 실시예에서 M2SR 바이러스는 B/Wisconsin/1/2010 류(B Yamagata 혈통) 바이러스의 HA 및 NA 유전자를 포함한다. 일부 실시예에서, BM2SR 바이러스는 최근의 인플루엔자 B 바이러스들의 내부 유전자들(NP, PA, PB1, PB2, NS1 및 NS2, BM1)를 가지고 있다.
Ⅱ. 인플루엔자 A 바이러스와 인플루엔자 B 바이러스
A. 총괄적인(General)
인플루엔자는 미국 성인들의 주요 사망 원인이다. 인플루엔자의 원인 물질은 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 및 인플루엔자 C 바이러스를 포함하는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) 패밀리(family)의 바이러스들이다.
인플루엔자 A 바이러스는 싸여 있고(enveloped) 음성-균주 RNA 바이러스다. 인플루엔자 A 바이러스의 게놈은 8개의 단일(비쌍성) RNA 균주들에 포함되어 있으며, 11개의 단백질(HA, NA, NP, M1, M2, NS1, NEP, PA, PB1, PB1-F2, PB2)에 대한 코드의 보완을 이루고 있다. 총 게놈 크기는 약 14,000개의 염기서열(base)들이다. 게놈의 분할된 특성은 세포 동거 동안 서로 다른 바이러스 균주들 사이의 전체 유전자의 교환을 가능하게 한다. 8개의 RNA 세그먼트는 다음과 같다. 1) HA는 혈구응집소(1개의 비리온을 만들기 위해 약 500개의 혈구응집소 분자가 필요하다)를 암호화한다, 2) NA는 뉴라미니다아제(1개의 비리온을 만들기 위해 약 100개의 뉴라미니다아제 분자가 필요하다)를 암호화한다, 3) NP는 뉴클레오프로테인을 암호화한다, 4) M은 상이한 판독 프레임들을 사용하여 동일한 RNA 세그먼트(1개의 비리온을 만드는 데 약 3000 M1 분자가 필요함)로부터 2개의 단백질(M1과 M2)을 암호화하며; 5) NS는 동일한 RNA 세그먼트로부터 상이한 판독 프레임들을 사용하여 2개의 단백질(NS1 및 NEP)을 암호화하고 6) PA는 RNA 중합효소를 암호화하며, 7) PB1은 동일한 RNA 세그먼트로부터 상이한 판독 프레임들을 사용하여 RNA 중합효소 및 PB1-F2 단백질(세포예정사를 유발한다)을 암호화하고, 8)PB2는 RNA 중합효소를 암호화한다.
인플루엔자 B 바이러스 또한 싸여 있고 음성-균주 RNA 바이러스다. 인플루엔자 B 바이러스의 게놈은 8개의 단일(페어링되지 않은) RNA 균주들에 포함되어 있으며, 11개의 단백질에 대해 어떤 코드의 보완을 한다. 이들 단백질 중에서 인플루엔자 A 바이러스에서도, 3개의 RNA 의존성 RNA 중합효소 서브유닛들(PB1, PB2, PA), 혈구응집소(HA), 핵단백질(NP), 뉴라미니다아제(NA), 매트릭스 단백질(M1 또는 BM1), 및 2개의 비구조성 단백질(NS1 그리고 NEP라고도 알려진 NS2) 총 9개가 발견된다. NB와 BM2라는 2개의 단백질은 인플루엔자 B 바이러스에 고유한 것이다. 총 게놈 크기는 약 14,500개의 염기서열이다. 게놈의 분할된 성질은 세포 동거 동안 상이한 바이러스 균주들 사이의 전체 유전자들의 교환을 가능하게 하는데, 이것은 재분배라고 알려진 과정이다. 길이 감소순으로 번호가 매겨진 8개의 RNA 세그먼트는 다음과 같다. 세그먼트 1, 2, 3은 각각 RNA 중합효소 서브유닛인 PB1, PB2, PA를 암호화한다. 세그먼트 4는 HA(혈구응집소)를 암호화한다. 세그먼트 5는 NP(핵단백질)를 암호화한다. 세그먼트 6은 NB(NB 단백질, 그 기능은 알려져 있지 않음)와 NA(뉴라미니다아제)를 모두 인코딩한다. 세그먼트 7은 BM1(매트릭스 단백질)과 BM2(이온 채널) 모두를 바이시스토닉 mRNA에 의해 암호화하며, 그 변환 전략은 고유한 것이다. BM2 개시 코돈은 BM1 종단 코돈(TAATG, 스톱-스타트 펜타뉴클레오티드 모티프)과 중복된다. BM2 단백질은 인플루엔자 A 바이러스의 M2 단백질과는 달리 이러한 스톱-스타트 변환 메커니즘에 의해 번역되고, 이 단백질은 혼합된 mRNA로부터 번역된다. 세그먼트 8은 동일한 RNA 세그먼트의 상이한 판독 프레임들을 사용함으로써 NS1과 NEP 모두를 암호화한다.
인플루엔자 A와 B는 모두 항원성 표류 과정에 의해 항원적으로 진화하는데, 이 과정에서 혈구응집소(HA) 단백질에 대한 돌연변이는 바이러스가 기존의 인간의 면역성을 벗어나고 인구를 지속시킨다. 인플루엔자 A에는 몇 가지 서브타입이 존재하는데, H 번호(혈구응집소의 유형에 관한)와 N 번호(뉴라미니다아제의 유형에 관한)에 따라 이름이 지어진다. 현재 알려진 H 항원은 16개(H1 내지 H16)이고, 알려진 N 항원은 9개(N1~N9)이다. 각각의 바이러스 서브타입은 일부는 한 종으로, 일부는 다른 종으로, 일부는 여러 종으로, 병원성 프로파일이 서로 다른 다양한 균주들로 변질되었다. 사람에게서 확인된 전형적인 인플루엔자 A 바이러스 서브타입으로는 "스페인 독감"과 2009년 돼지 독감을 일으킨 H1N1, 1950년대 후반 "아시아 독감"을 일으킨 H2N2, 1960년대 후반 홍콩 독감을 일으킨 H3N2, 2000년대 중반에 그것의 전파를 통해 세계적인 유행성 독감으로 간주된 H5N1; 인간과 돼지에 현재 특정되는 H7N7; H1N2; 및 H9N2, H7N2, H7N3, H5N2, H10N7들이 있지만 이들에 국한되지 않는다.
인플루엔자 B 바이러스의 2가지 항원적, 유전적으로 구별되는 혈통은 적어도 1988년 이후 인간에게 공동 순환되어 질병을 일으켰다. Victoria 혈통의 인플루엔자 바이러스는 1980년대에 세계적으로 순환하는 유행했던 B형 균주들이었고, Yamagata 혈통은 1990년대 초에 우세한 B형 바이러스가 되었다. 1991년 이후 Victoria 혈통 바이러스는 드물게 격리되었고 거의 전적으로 동아시아에 국한되었다. 2002년에 Victoria 바이러스가 재조명되었고 그 이후 Yamagata 혈통와 Victoria 혈통이 공존하였다.
1940년부터 2016년까지 격리된 인플루엔자 B 바이러스의 진화 관계는 최신식 분리(modern isolate)들의 BM1 및 BM2 단백질들 B/Lee/40보다 서로 더 밀접하게 관련되어 있음을 나타낸다.
인플루엔자 바이러스들은 바이러스 유형, 격리된 종(인간 아닌 경우), 격리된 위치, 격리 수, 격리 연도 및 인플루엔자 A 바이러스의 경우에만 HA 및 NA 서브타입을 포함하는 표준 명명법을 가진다. 따라서 B/Yamagata/16/88은 1988년 Yamagata(일본)에서 취해진 인간 인플루엔자 B 바이러스의 격리 번호(16)이었다.
일부 인플루엔자 A 변종들은 가장 유사한 것으로 알려진 격리 상태에 따라 식별되고 명명되며, 따라서 그것들의 전형적인 호스트(예: 인간 독감 바이러스)에 따라; 그것들의 서브타입(예: H3N2)에 따라; 및 그것들의 병균성(예: LP, 저병원성)에 따라 혈통을 공유하는 것으로 추정된다. 따라서 격리 A/Fujian/411/2002(H3N2)와 유사한 바이러스로부터의 독감은 Fujian 독감, 인간 독감, H3N2 독감이라고 불릴 수 있다.
또한, 인플루엔자 변종들은 가끔 균주가 한 지역에 한정되거나 적합하게 된 종들(호스트)에 따라 이름이 지어지거나 변형되기도 한다. 이러한 규정을 사용하여 명명된 주요 변종으로는 조류독감, 인간독감, 돼지인플루엔자, 말 인플루엔자, 개 인플루엔자 등이 있다. 변종들도 가금류, 특히 닭의 병균성에 따라서도 이름이 지어졌는데, 예를 들면 저병원성 조류인플루엔자(LPAI), 고병원성 조류인플루엔자(HPAI) 등이 그것이다.
B. 라이프 사이클과 구조
인플루엔자 바이러스들의 라이프 사이클은 일반적으로, 셀 표면 수용체에 대한 부착, 셀에 대한 진입 및 바이러스 핵산의 코팅 해제를 수반하며, 그 다음에 셀 내부의 바이러스 유전자들의 복제가 수반된다. 바이러스 단백질과 유전자의 새로운 복사본이 합성된 후, 이러한 성분들은 자손 바이러스 입자로 결합되어 셀에서 나온다. 상이한 바이러스 단백질들이 이 단계들 각각에서 역할을 한다.
인플루엔자 A 입자는 바이러스 핵을 캡슐화하는 지질막으로 이루어져 있다. 엔빌로프의 안쪽은 매트릭스 단백질(M1)로 정렬되어 있고, 바깥쪽 표면은 혈구응집소(HA)와 뉴라미니다아제(NA)의 2가지 유형의 글리코프로틴 스파이크들을 그 특징으로 한다. 트랜스멤브레인 이온 채널 단백질인 M2도 지질 엔빌로프의 일부분이다. 예: 도 1 참조. 인플루엔자 B 입자는 유사한 구조를 포함한다.
삼량체(trimeric) 타입 I 멤브레인 단백질인 HA 단백질은 호스트 셀 표면 글리코프로틴들 또는 글리콜리피드들에서 시알릴리골리고사카라이드(갈락토스에 연결된 터미널 시알릭산을 함유한 올리고당)에 대한 결합을 담당한다. 이 단백질은 또한 내포 작용에 의한 비리온 내부화에 이어 바이러스 셀막과 호스트 셀막 사이의 융합을 담당한다.
뉴라미니다아제(Neuraminidase, NA)는 삼량체 타입 II 멤브레인 단백질로, 호스트 셀들과 HA, NA의 글리코콘주게이트로부터 터미널 시알산 잔류물을 분쇄하는 시알리다아제로서 수용체 파괴 효소로 인식된다. 이 시알리다제 활동은 다른 글리코프로틴들과 바이러스 HA들의 결합 활동으로 인한 자손 응집(aggregation)의 예방뿐만 아니라 호스트 셀 표면에서 자손 비리온들을 효율적으로 방출하기 위해 필요하다. 따라서, HA의 수용체 결합 활동과 NA의 수용체 파괴 활동은 인플루엔자의 효율적인 복제가 가능하게 하는, 균형을 이루는 역할을 할 가능성이 있다.
게놈 세그먼트들은 바이러스 입자의 핵심으로 포장된다. RNP(RNA+뉴클레오프로틴, NP)는 각각의 세그먼트와 연관된 3개의 바이러스성 중합효소 폴리펩타이드들이 있는 나선형 형태로 되어 있다.
인플루엔자 바이러스 라이프 사이클은 HA를 호스트 셀의 표면에 있는 시알산 함유 수용체들에 결합하는 것으로 시작하여, 수용체 매개 내포 작용이 뒤따른다(도 1). 늦은 엔도솜(late endosome)들에서의 낮은 pH는 HA의 배좌 시프트를 유발하여 HA2 서브유닛(이른바 퓨전 펩타이드)의 N-단자를 노출시킨다. 융합 펩타이드가 바이러스막과 내염소체막의 융합을 시작하고, 매트릭스 단백질(M1)과 RNP 복합체가 세포질에 방출된다. RNP들은 vRNA를 캡슐화하는 뉴클레오프로틴(NP)과 PA, PB1, PB2 단백질로 구성된 바이러스성 중합효소 복합체로 구성된다. RNP들은 전사와 복제가 이루어지는 핵으로 운반된다. RNA 중합효소 복합체는 (1) 5' Cap과 3' PolyA 구조를 가진 mRNA의 합성, (2) 완전 길이 보완 RNA(cRNA), 및 (3) cDNA를 템플릿으로 사용하는 게놈 vRNA의 3가지 상이한 반응을 촉매한다. 새로 합성된 vRNA들, NP, 및 중합효소 단백질들을 RNP들로 조립하여 핵에서 내보낸 후, 혈장막으로 운반하는데, 여기에서 자손 바이러스 입자의 싹이 생긴다. 뉴라미니다아제(NA) 단백질은 시알릭산을 시알릴롤리고사카리드에서 제거하여 셀 표면에서 새로 조립된 바이러스를 방출하고 바이러스 입자의 자기집합을 방지함으로써 감염에 늦는 역할을 한다. 비록 바이러스 어셈블리는 단백질-단백질 및 단백질-vRNA 상호작용을 수반하지만, 이러한 상호작용의 성격은 대부분 알려지지 않고 있다.
C. M2 및 BM2 단백질의 역할
전술한 바와 같이, 인플루엔자 A 바이러스막에 걸치는 것은 혈구응집소(HA), 뉴라미미다아제(NA), M2의 3가지 단백질이다. HA와 NA의 세포외 영역(ectodomain)들은 상당히 가변적인 반면, M2의 세포외 영역은 기본적으로 인플루엔자 A 바이러스 사이에 불변성이 있다. M2 이온 채널 단백질은 바이러스 게놈 복제에 영향을 주지 않지만 바이러스 성장에 필수적이다. 단일 복제(SR) 바이러스들은 인플루엔자 A M2나 인플루엔자 BM2 이온 채널 단백질과 같이 바이러스 유입이나 방출에서 기능하는 바이러스 단백질에 결함이 있다. 이와는 대조적으로, 기존의 약독화된 살아있는 바이러스 백신은 바이러스 복제 기계에 여러 가지 변이체를 포함하고 있어 표현형이 매우 약독화된다. 이론에 얽매이기를 바라지 않고, 인플루엔자 A 바이러스에서는 이온 채널 활동을 가지고 있는 M2 단백질이 호스트 셀 침투와 바이러스 RNA의 코팅 해제 사이의 바이러스 라이프 사이클 초기 상태에서 기능하는 것으로 생각된다. 일단 바이러스가 내포 작용을 거치게 되면, 동형 사중체 나선형 묶음인 바이러스 연관된 M2 이온 채널은, 양성자들이 내분자에서 바이러스 내부로 흘러들어 불안정한 산의 M1 단백질-리보뉴클레오단백질 복합체(RNP) 상호작용을 방해하게 하여, RNP가 세포질로 방출되는 것을 촉진하는 것으로 여겨진다. 또한, HA가 셀 내부로 분해되는 일부 인플루엔자 균주들(예: A/fowl plagues/Rostock/34) 중에서, M2 이온 채널은 트랜스-골기(trans-Golgi) 네트워크의 pH를 상승시켜 이 컴파트먼트(compartment)의 낮은 pH의 상태로 인한 HA의 순응적(conformational) 변화를 방지하는 것으로 생각된다. 또한 M2 트랜스멤브레인 영역 자체가 이온 채널로서 기능할 수 있다는 것이 밝혀졌다. M2 이온 채널 활동을 차단하는 아만타딘 염산염은 바이러스 복제를 억제하는 것으로 나타났기 때문에 M2 단백질 이온 채널 활동은 인플루엔자 바이러스의 라이프 사이클에서 필수적인 것으로 생각된다. 그러나 인플루엔자 A 바이러스의 복제에서 이러한 활동의 요건은 직접적으로 입증되지 않았다. 인플루엔자 B 바이러스들에서의 인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 기능적 대안은 BM2로 알려진 타입 III 트랜스멤브레인 단백질이다.
D. 백신들로서의 M2 및 BM2 바이러스 변이체들
M2SR은 SR(단일 복제) 바이러스 백신의 새로운 종류에 속한다. SR 바이러스는 독감 M2 이온 채널 단백질과 같이 바이러스 유입이나 방출에서 기능하는 바이러스 단백질에서 결함이 있으며, 바이러스 게놈 복제에 영향을 미치지 않지만 바이러스 성장에 없어서는 안 된다. 이와는 대조적으로, 기존의 실시간 감쇠 백신은 바이러스 복제 기계에 여러 가지 변이체를 포함하고 있어 표현형이 매우 감쇠된다. 따라서 2가지 다른 백신 바이러스 메커니즘은 면역 반응의 보호와 유도에 영향을 미치는 바이러스 감염 키네틱스와 항원 생산에 영향을 미친다. 복제-결함 바이러스는 MHC 등급 I과 II 등급 경로에 의해 항원이 효율적으로 제시될 수 있도록 셀 내에 바이러스 유전자 제품을 표현함으로써 비활성 바이러스 백신의 안전성과 살아있는 바이러스 백신의 면역성을 결합한 독특한 형태의 바이러스 백신을 제공한다. 단일 복제 바이러스들은 또한 톨과 같은(Toll-like) 수용체와 다른 선천적인 면역 반응 경로를 활성화시켜 그들 자신의 보조제 역할을 할 수 있다. 또한 이러한 바이러스는 면역체계의 기능을 탐색하는 도구로 사용될 수 있다. 이들 변이체 바이러스는 바이러스 어셈블리 후에 기능하는 비리온 단백질에 결함이 있다. 그 바이러스들은 없어진 유전자 제품을 표현하는 셀들을 보완하는 데 전파된다. 정상적인 셀들에서는 복제 주기가 정상적으로 일어나고 자손의 비리온들이 생성된다. 그러나 이들 바이러스는 감염되지 않아 그러한 감염은 2차 세포로 전염되지 않는다.
Ⅲ. M2 및 BM2 바이러스 변이체들
일 양태에서, 변이체 M2 vRNA 시퀀스를 숨기는 인플루엔자 A 바이러스가 공개된다. 일반적으로 이러한 변이체들은 M2 이온 채널 활성도가 없으며, 생체 내 성장속성이 저하되고, 감염성 유전자가 생성되지 않으며, 비병원성 또는 감염 피험자 내 병원 생성이 감소한다. 다른 양태에서는 변이체 BM2 vRNA 시퀀스를 숨기는 인플루엔자 B 바이러스가 공개된다. 일반적으로 이러한 변이체들은 BM2 이온 채널 활성도가 없으며, 생체 내 성장 속성이 약화되며, 감염성 유전자를 생성할 수 없으며, 비병원성 또는 감염 피험자 내 병원균 발생 감소 현상을 보인다. 이러한 변이체 바이러스들은 면역성이 있으며, 백신으로 사용될 경우 야생형 및/또는 다른 병원성 바이러스로 감염으로부터 보호된다. 추가적으로, 본 명세서에서 공개된 M2 및 BM2 변이체는 안정적이며, 사용된 호스트 셀에 관계 없이 기능적인 M2 또는 BM2 폴리펩타이드로 표현하기 위해 변이체를 일으키지 않는다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시예에서는 이러한 변이체의 M1 단백질이 기능에 대한 검출 가능한 변경 없이 생성된다. 일부 실시예에서 변이체 M2 또는 BM2 핵산 시퀀스를 포함하는 바이러스는 해당 야생형 바이러스가 전파될 수 있는 호스트 셀에서 복제할 수 없다. 예를 들면, 하지만 제한적이지 않게, 일부 실시예에서는 야생형 바이러스가 MDCK 셀들, CHO 셀들 및/또는 Vero 셀들의 배양시 재배, 전파 및 복제될 수 있는 반면, 변이체 M2 또는 BM2 시퀀스를 숨기는 해당 바이러스는 동일한 유형의 셀들에서 성장, 복제 또는 전파될 수 없다.
위에서 언급한 바와 같이, 일부 실시예들에서는 M2 또는 BM2 변이체 바이러스가 안정적이며, 호스트 셀에서 기능적인 M2 또는 BM2 단백질을 암호화하는 야생형 또는 비와일드형 시퀀스로 변형하거나 복귀하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시예에서 M2나 BM2 변이체 바이러스는 호스트 셀에서 2개의 통로, 3개의 통로, 5개의 통로, 10개의 통로, 12개의 통로, 15개의 통로, 20개의 통로, 25개 이상의 통로에 대해 안정적이다. 일부 실시예에서, 호스트 셀은 변형되지 않은 호스트 셀이다. 일부 실시예에서, 호스트 셀은 M2를 트랜스 방식으로 안정적으로 제공하는 임의의 포유동물 셀이다. 다른 실시예들에서, 호스트 셀은 M2 또는 BM2 단백질을 발현하는 MDCK 셀 또는 베로 셀과 같이 변형된 호스트 셀이다.
일부 실시예들에서, M2 또는 BM2 변이체들은 하나 이상의 핵산 대체 및/또는 삭제(deletion)가 포함된다. 일부 실시예에서 변이체들은 M2 또는 BM2 단백질의 세포외 영역, M2 또는 BM2 단백질의 트랜스멤브레인 영역 및/또는 M2 또는 BM2 단백질의 세포질 꼬리 중 하나 이상을 코드화하는 핵산에서 국부화된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시예에서 하나 이상의 핵산 변이체는 M2 또는 BM2 펩타이드의 스플라이스 변종, 하나 이상의 정지 코돈 및/또는 하나 이상의 아미노산 삭제를 초래한다. 일부 실시예에서는 변이체 M2 또는 BM2 핵산을 운반하는 바이러스들이 비기능성 M2 또는 BM2 폴리펩티드를 생성한다. 일부 실시예에서는 변이체 M2나 BM2 핵산을 운반하는 바이러스들이 M2나 BM2 폴리펩타이드를 생성하지 않는다. 일부 실시예에서는 변이체 M2 또는 BM2 핵산을 운반하는 바이러스들이 잘린(truncated) M2 또는 BM2 폴리펩티드를 생성한다.
아래 표 1 내지 표 3에 3가지 예시적이고 제한 없는 M2 바이러스 변이체들(M2SR-1, M2SR-2 및 M2SR-3)가 제공된다. 표들에서 소문자는 M2 시퀀스에 해당하고, 대문자는 M1 시퀀스와 비코딩 영역에 해당하며, 변이체 시퀀스(예: 정지 코돈들, 스플라이스 결함)는 굵고 밑줄이 그어져 있다. M2SR-2 변이체의 밑줄(하부 케이스)은 M2SR-1 및 M2SR-3 변이체들에서 삭제된 영역을 나타낸다. 하부 케이스 기울임꼴 베이스에는 M과 M2가 겹치는 영역이 포함된다.
표 1: M2SR-1 (SEQ ID NO: 1) M2 ectodomain + 2 stop codons + TM deletion (PR8 M segment + 2 stops (786-791) without 792-842 (TM)).
3'AGCAAAAGCAGGTAGATATTGAAAGatgagtcttctaaccgaggtcgaaacGTACGTACTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCACAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCAGGGAAGAACACCGATCTTGAGGTTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTTAATGGGAACGGGGATCCAAATAACATGGACAAAGCAGTTAAACTGTATAGGAAGCTCAAGAGGGAGATAACATTCCATGGGGCCAAAGAAATCTCACTCAGTTATTCTGCTGGTGCACTTGCCAGTTGTATGGGCCTCATATACAACAGGATGGGGGCTGTGACCACTGAAGTGGCATTTGGCCTGGTATGTGCAACCTGTGAACAGATTGCTGACTCCCAGCATCGGTCTCATAGGCAAATGGTGACAACAACCAATCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTTTTAGCCAGCACTACAGCTAAGGCTATGGAGCAAATGGCTGGATCGAGTGAGCAAGCAGCAGAGGCCATGGAGGTTGCTAGTCAGGCTAGACAAATGGTGCAAGCGATGAGAACCATTGGGACTCATCCTAGCTCCAGTGCTGGTCTGAAAAATGATCTTCTTGAAAATTTGCAGgcctatcagaaacgaatgggggtgcagatgcaacggttcaagtgat TAATAG gatcgtctttttttcaaatgcatttaccgtcgctttaaatacggactgaaaggagggccttctacggaaggagtgccaaagtctatgagggaagaatatcgaaaggaacagcagagtgctgtggatgctgacgatggtcattttgtcagcatagagctggagtaaAAAACTACCTTGTTTCTACT
이러한 변이체로부터 생성된 M2 폴리펩타이드 시퀀스는 다음과 같다:
*MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD. (SEQ ID NO: 4).
표 2: M2SR-2 (SEQ ID NO: 2) M2 ectodomain + 2 stops + splice defect (PR8 M segment + 2 stops (786-791) +splice defect nt 52).
3'AGCAAAAGCAGGTAGATATTGAAAGatgagtcttctaaccgaggtcgaaac C TACGTACTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCACAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCAGGGAAGAACACCGATCTTGAGGTTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTTAATGGGAACGGGGATCCAAATAACATGGACAAAGCAGTTAAACTGTATAGGAAGCTCAAGAGGGAGATAACATTCCATGGGGCCAAAGAAATCTCACTCAGTTATTCTGCTGGTGCACTTGCCAGTTGTATGGGCCTCATATACAACAGGATGGGGGCTGTGACCACTGAAGTGGCATTTGGCCTGGTATGTGCAACCTGTGAACAGATTGCTGACTCCCAGCATCGGTCTCATAGGCAAATGGTGACAACAACCAATCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTTTTAGCCAGCACTACAGCTAAGGCTATGGAGCAAATGGCTGGATCGAGTGAGCAAGCAGCAGAGGCCATGGAGGTTGCTAGTCAGGCTAGACAAATGGTGCAAGCGATGAGAACCATTGGGACTCATCCTAGCTCCAGTGCTGGTCTGAAAAATGATCTTCTTGAAAATTTGCAGgcctatcagaaacgaatgggggtgcagatgcaacggttcaagtgat TAATAG actattgccgcaaatatcattgggatcttgcacttgacattgtggattcttgatcgtctttttttcaaatgcatttaccgtcgctttaaatacggactgaaaggagggccttctacggaaggagtgccaaagtctatgagggaagaatatcgaaaggaacagcagagtgctgtggatgctgacgatggtcattttgtcagcatagagctggagtaaAAAACTACCTTGTTTCTACT
이 변이체로부터는 어떠한 M2 폴리펩타이드 시퀀스도 생성되지 않는다.
표 3: M2SR-3 (SEQ ID NO: 3) M2 ectodomain + 2 stops + splice defect + TM deletion (PR8 M segment + 2 stops (786-791) without 792-842 (TM)+splice defect nt 52).
3'AGCAAAAGCAGGTAGATATTGAAAGatgagtcttctaaccgaggtcgaaac C TACGTACTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCACAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCAGGGAAGAACACCGATCTTGAGGTTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTTAATGGGAACGGGGATCCAAATAACATGGACAAAGCAGTTAAACTGTATAGGAAGCTCAAGAGGGAGATAACATTCCATGGGGCCAAAGAAATCTCACTCAGTTATTCTGCTGGTGCACTTGCCAGTTGTATGGGCCTCATATACAACAGGATGGGGGCTGTGACCACTGAAGTGGCATTTGGCCTGGTATGTGCAACCTGTGAACAGATTGCTGACTCCCAGCATCGGTCTCATAGGCAAATGGTGACAACAACCAATCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTTTTAGCCAGCACTACAGCTAAGGCTATGGAGCAAATGGCTGGATCGAGTGAGCAAGCAGCAGAGGCCATGGAGGTTGCTAGTCAGGCTAGACAAATGGTGCAAGCGATGAGAACCATTGGGACTCATCCTAGCTCCAGTGCTGGTCTGAAAAATGATCTTCTTGAAAATTTGCAGgcctatcagaaacgaatgggggtgcagatgcaacggttcaagtgat TAATAG gatcgtctttttttcaaatgcatttaccgtcgctttaaatacggactgaaaggagggccttctacggaaggagtgccaaagtctatgagggaagaatatcgaaaggaacagcagagtgctgtggatgctgacgatggtcattttgtcagcatagagctggagtaaAAAACTACCTTGTTTCTACT
이 변이체로부터는 어떠한 M2 폴리펩타이드 시퀀스도 생성되지 않는다.아래 표 4에는 야생형 M1 및 M2 코딩 시퀀스가 제공된다.
표 4: M1/M2 wild-type nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 5)
3'AGCAAAAGCAGGTAGATATTGAAAGatgagtcttctaaccgaggtcgaaacGTACGTACTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCACAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCAGGGAAGAACACCGATCTTGAGGTTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTTAATGGGAACGGGGATCCAAATAACATGGACAAAGCAGTTAAACTGTATAGGAAGCTCAAGAGGGAGATAACATTCCATGGGGCCAAAGAAATCTCACTCAGTTATTCTGCTGGTGCACTTGCCAGTTGTATGGGCCTCATATACAACAGGATGGGGGCTGTGACCACTGAAGTGGCATTTGGCCTGGTATGTGCAACCTGTGAACAGATTGCTGACTCCCAGCATCGGTCTCATAGGCAAATGGTGACAACAACCAATCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTTTTAGCCAGCACTACAGCTAAGGCTATGGAGCAAATGGCTGGATCGAGTGAGCAAGCAGCAGAGGCCATGGAGGTTGCTAGTCAGGCTAGACAAATGGTGCAAGCGATGAGAACCATTGGGACTCATCCTAGCTCCAGTGCTGGTCTGAAAAATGATCTTCTTGAAAATTTGCAGgcctatcagaaacgaatgggggtgcagatgcaacggttcaagtgatcctctcactattgccgcaaatatcattgggatcttgcacttgacattgtggattcttgatcgtctttttttcaaatgcatttaccgtcgctttaaatacggactgaaaggagggccttctacggaaggagtgccaaagtctatgagggaagaatatcgaaaggaacagcagagtgctgtggatgctgacgatggtcattttgtcagcatagagctggagtaaAAAACTACCTTGTTTCTACT
아래 표 5에는 비제한적인 BM2SR 바이러스 변이체들(BM2SR-1, BM2SR-2, BM2SR-3, BM2SR-4, BM2SR-5, and BM2SR-0)이 제공된다.
표 5: BM2SR Sequences
M segment 7 sequences of BM2SR influenza viruses containing null mutations in BM2 genes.
BM2SR-1 (SEQ ID NO: 6) influenza B/FL/4/2006 Segment 7 with intact BM1 + total BM2 deletion of 329 bp (indicated by -) (mRNA sense).5'AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCATTGACAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGACTCTGCCTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGATGCTTAACTGACATACAGAAAGCACTAATTGGCGCCTCTATCTGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCCTATCAGGAATGGGGACAACAGCAACAAAAAAGAAGGGCCTGATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTGAGCTTCCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGTTACTATATTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTGTGCGAAAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCTGGAGTGAGACGGGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTTCAAAAACTGGCAGAAGAACTGCAAAGCAACATTGGAGTATTGAGATCTCTTGGGGCAAGTCAAAAGAATGGGGAAGGAATTGCAAAGGATGTAATGGAAGTGCTAAAGCAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAAGAAATACCTATAA-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ATTCAATTTTTACTGTACTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGCAAATAAACTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACT
BOLD UPPER CASE = BM1 ORF Stop Codon
- = designates deleted nucleotides
BM2SR-2 (SEQ ID NO: 7) influenza B/FL/4/2006 Segment 7 with intact BM1 + partial BM2 deletion of 296 bp (indicated by -) + insertion of stop codons in 3 frames. (mRNA sense).
5'AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCATTGACAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGACTCTGCCTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGATGCTTAACTGACATACAGAAAGCACTAATTGGCGCCTCTATCTGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCCTATCAGGAATGGGGACAACAGCAACAAAAAAGAAGGGCCTGATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTGAGCTTCCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGTTACTATATTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTGTGCGAAAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCTGGAGTGAGACGGGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTTCAAAAACTGGCAGAAGAACTGCAAAGCAACATTGGAGTATTGAGATCTCTTGGGGCAAGTCAAAAGAATGGGGAAGGAATTGCAAAGGATGTAATGGAAGTGCTAAAGCAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAAGAAATACCTATAATGCTCGAACCATTTCAGATTCTTTCAATTTGTtagAtagC------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------taaATTCAATTTTTACTGTACTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGCAAATAAACTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACT

BOLD UPPER CASE = BM1 ORF Stop Codon
bold lower case= Inserted BM2 Stop Codons
- = designates deleted nucleotides
BM2SR-3 (SEQ ID NO: 8) influenza B/FL/4/2006 Segment 7 with intact BM1 + BM1 M86V mutation + partial BM2 deletion of 296 bp (indicated by -) + insertion of stop codons in 3 frames. (mRNA sense). 5'AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCATTGACAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGACTCTGCCTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGATGCTTAACTGACATACAGAAAGCACTAATTGGCGCCTCTATCTGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCCTATCAGGA gTG GGGACAACAGCAACAAAAAAGAAGGGCCTGATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTGAGCTTCCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGTTACTATATTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTGTGCGAAAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCTGGAGTGAGACGGGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTTCAAAAACTGGCAGAAGAACTGCAAAGCAACATTGGAGTATTGAGATCTCTTGGGGCAAGTCAAAAGAATGGGGAAGGAATTGCAAAGGATGTAATGGAAGTGCTAAAGCAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAAGAAATACCTATA A TGCTCGAACCATTTCAGATTCTTTCAATTTGT tagAtagC------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------taaATTCAATTTTTACTGTACTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGCAAATAAACTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACT

Bold Underline Mixed Case = BM1 M86V Mutation Codon
BOLD UPPER CASE = BM1 ORF Stop Codon
UNDERLINE UPPERCASE = BM2 ORF remnant
bold lower case= Inserted BM2 Stop Codons
- = designates deleted nucleotides
BM2SR-4 (SEQ ID NO: 9) influenza B/FL/4/2006 Segment 7 with intact BM1 + partial BM2 deletion of 90 bp (indicated by -) + insertion of 3 stop codons in 3 frames. (mRNA sense).5'AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCATTGACAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGACTCTGCCTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGATGCTTAACTGACATACAGAAAGCACTAATTGGCGCCTCTATCTGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCCTATCAGGAATGGGGACAACAGCAACAAAAAAGAAGGGCCTGATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTGAGCTTCCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGTTACTATATTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTGTGCGAAAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCTGGAGTGAGACGGGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTTCAAAAACTGGCAGAAGAACTGCAAAGCAACATTGGAGTATTGAGATCTCTTGGGGCAAGTCAAAAGAATGGGGAAGGAATTGCAAAGGATGTAATGGAAGTGCTAAAGCAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAAGAAATACCTATA A TGCTCGAACCATTTCAGATTCTTTCAATTTGT tagAtagCtaa---------------------------------------------------------------------------AAGGGGCCAAATAAAGAGACAATAAACAGAGAGGTATCAATTTTGAGACACAGTTACCAAAAAGAAATCCAGGCCAAAGAAGCAATGAAGGAAGTACTCTCTGACAACATGGAGGTATTGAGTGACCACATAGTAATTGAGGGGCTTTCTGCTGAAGAGATAATAAAAATGGGTGAAACAGTTTTGGAGGTAGAAGAATTGCAT TAA ATTCAATTTTTACTGTACTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGCAAATAAA-CTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACT

BOLD UPPER CASE = BM1 ORF Stop Codon
UNDERLINE UPPERCASE = BM2 ORF remnant
BOLD UNDERLINE UPPERCASE = BM2 ORF Stop Codon
bold lower case= Inserted BM2 Stop Codons
- = designates deleted nucleotides
BM2SR-5 (SEQ ID NO: 10) influenza B/FL/4/2006 Segment 7 with intact BM1 + BM1 M86V mutation + partial BM2 deletion of 90 bp (indicated by -) + insertion of 3 stop codons in 3 frames. (mRNA sense).5'AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCATTGACAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGACTCTGCCTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGATGCTTAACTGACATACAGAAAGCACTAATTGGCGCCTCTATCTGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCCTATCAGGA gTG GGGACAACAGCAACAAAAAAGAAGGGCCTGATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTGAGCTTCCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGTTACTATATTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTGTGCGAAAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCTGGAGTGAGACGGGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTTCAAAAACTGGCAGAAGAACTGCAAAGCAACATTGGAGTATTGAGATCTCTTGGGGCAAGTCAAAAGAATGGGGAAGGAATTGCAAAGGATGTAATGGAAGTGCTAAAGCAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAAGAAATACCTATA A TGCTCGAACCATTTCAGATTCTTTCAATTTGT tagAtagCtaa---------------------------------------------------------------------------AAGGGGCCAAATAAAGAGACAATAAACAGAGAGGTATCAATTTTGAGACACAGTTACCAAAAAGAAATCCAGGCCAAAGAAGCAATGAAGGAAGTACTCTCTGACAACATGGAGGTATTGAGTGACCACATAGTAATTGAGGGGCTTTCTGCTGAAGAGATAATAAAAATGGGTGAAACAGTTTTGGAGGTAGAAGAATTGCAT TAA ATTCAATTTTTACTGTACTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGCAAATAAA-CTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACT
Bold Underline Mixed Case = BM1 M86V Mutation Codon
BOLD UPPER CASE = BM1 ORF Stop Codon
UNDERLINE UPPERCASE = BM2 ORF remnant
bold lower case= Inserted BM2 Stop Codons
BOLD UNDERLINE UPPERCASE = BM2 ORF Stop Codon
- = designates deleted nucleotides
BM2SR-0 (SEQ ID NO: 11) ) influenza B/Lee/1940 Segment 7 with intact BM1 + total BM2 deletion of 329 bp (indicated by -) (mRNA sense).
5'AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCACTAATAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCTGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGATTCTGCTTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGGTGCCTAACTGATATACAAAAAGCACTAATTGGTGCCTCTATATGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAAGAAAGAAAAAGGAGATTCATCACAGAGCCCCTGTCAGGAATGGGAACAACAGCAACAAAGAAGAAAGGCCTAATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTAAGCTTTCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCACGAAAGCTCAGCATTACTATATTGTCTTATGGTCATGTACCTAAACCCTGAAAACTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTATGCGAGAAACAAGCATCGCACTCGCATAGAGCCCATAGCAGAGCAGCAAGGTCTTCGGTACCTGGAGTAAGACGAGAAATGCAGATGGTTTCAGCTATGAACACAGCAAAGACAATGAATGGAATGGGAAAGGGAGAAGACGTCCAAAAACTAGCAGAAGAGCTGCAAAACAACATTGGAGTGTTGAGATCTCTAGGAGCAAGTCAAAAGAATGGAGAAGGAATTGCCAAAGATGTAATGGAAGTGCTAAAACAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAGGAAATACTTATAA-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GCCCAATTTTCACTGTATTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGTGAATAAAACTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACTBOLD UPPER CASE = BM1 ORF Stop Codon
- = designates deleted nucleotides
인플루엔자 B 게놈 세그먼트 7은 복제에 필요한 두 가지 주요 폴리펩타이드인 BM1 매트릭스 단백질과 BM2 양성자 채널을 발현한다. BM1과 BM2 폴리펩타이드의 표현은 부분적으로 BM1 ORF과 BM2 ORF 사이의 접합부에 위치하는 펜타뉴클레오티드 모티프의 변환 슬리피지에 의해 규정된다. 펜타뉴클레오티드 모티프인 TAATG는 M1 변환의 종료를 위한 TAA 스톱 코돈과 대체-1 판독 프레임에서 M2의 시작을 위한 ATG 스타트 코돈 모두를 포함한다. 이 펜타뉴클레오티드 모티프와 플랭킹 시퀀스는 M1 단백질의 표현 규정을 위해 중요한 것으로 밝혀졌다.아래 표 6에는 BM1과 BM2 코딩 시퀀스 및 굵게 밑줄이 그어진 펜타뉴클레오티드 모티프를 보여주는 야생형 인플루엔자 B 세그먼트 7이 제공된다.
표 6: Wild-type BM1 and BM2 coding sequence (SEQ ID NO: 12) influenza B/Lee/40 Segment 7.
AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCACTAATAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCTGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGATTCTGCTTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGGTGCCTAACTGATATACAAAAAGCACTAATTGGTGCCTCTATATGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAAGAAAGAAAAAGGAGATTCATCACAGAGCCCCTGTCAGGAATGGGAACAACAGCAACAAAGAAGAAAGGCCTAATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTAAGCTTTCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCACGAAAGCTCAGCATTACTATATTGTCTTATGGTCATGTACCTAAACCCTGAAAACTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTATGCGAGAAACAAGCATCGCACTCGCATAGAGCCCATAGCAGAGCAGCAAGGTCTTCGGTACCTGGAGTAAGACGAGAAATGCAGATGGTTTCAGCTATGAACACAGCAAAGACAATGAATGGAATGGGAAAGGGAGAAGACGTCCAAAAACTAGCAGAAGAGCTGCAAAACAACATTGGAGTGTTGAGATCTCTAGGAGCAAGTCAAAAGAATGGAGAAGGAATTGCCAAAGATGTAATGGAAGTGCTAAAACAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAGGAAATACTTA TAATG CTCGAACCACTTCAGATTCTTTCAATTTGTTCTTTCATTTTATCAGCTCTCCATTTCATGGCTTGGACAATAGGGCATTTGAATCAAATAAGAAGAGGGGTAAACCTGAAAATACAAATAAGGAATCCAAATAAGGAGGCAATAAACAGAGAGGTGTCAATTCTGAGACACAATTACCAAAAGGAAATCCAAGCCAAAGAAACAATGAAGAAAATACTCTCTGACAACATGGAAGTATTGGGTGACCACATAGTAGTTGAAGGGCTTTCAACTGATGAGATAATAAAAATGGGTGAAACAGTTTTGGAGGTGGAAGAATTGCAATGAGCCCAATTTTCACTGTATTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGTGAATAAAACTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACT
Ⅳ. 셀-기반 바이러스 생성 시스템(Cell-based virus production system)A. "1세대" 변이체 바이러스들의 생성
변이체 M2 핵산을 운반하는 바이러스와 같은 변이체 바이러스는 본 명세서에 그 전문이 참조로 통합되어 있고 Generation of influenza A viruses entirely from clone cDNAs라는 제목으로 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9345-9350 (1999)에 Neumann 등에 의해 설명된 플라스미드 기반의 역유전학에 의해 발생할 수 있다. 변이체 BM2 핵산을 운반하는 것과 같은 변이체 바이러스는 유사한 방법으로 발생할 수 있다. 간단히 말해서, 진핵 호스트 셀들은 8개의 바이러스 RNA를 암호화하는 하나 이상의 플라스미드로 감염된다. 각 바이러스 RNA 시퀀스는 RNA 중합효소 I 프로모터와 RNA 중합효소 I 종료기에 의해 측면 처리된다. 특히, M2 단백질을 인코딩하는 바이러스 RNA는 변이체 M2 핵산 시퀀스를 포함한다. 호스트 셀은 야생형 M2 단백질을 포함하여 바이러스 단백질(예: 중합체, 핵단백질 및 구조 단백질)을 암호화하는 하나 이상의 표현식 플라스미드로 추가적으로 감염된다. 호스트 셀과 바이러스 RNA 플라스미드가 융합되면 8개의 인플루엔자 바이러스 RNA가 모두 합성되는데, 그 중 하나는 변이체 M2 시퀀스를 숨긴다. 공동감염된 바이러스 중합체 및 뉴클레오프로틴은 바이러스 RNA를 복제 및 기록되는 기능적 vRNP들로 결합하여 궁극적으로 변이체 M2 핵산 시퀀스를 가지는 전염성 인플루엔자 바이러스를 형성하지만, 기능적 M2 폴리펩타이드가 바이러스 지질 엔빌로프에 통합된다.
"제1세대" 변이체 바이러스를 생산하는 대체 방법들로는 본 명세서에 그 전문이 참조로 통합되어 있고 High-efficiency formation of influenza virus transfectants, J. Virol. 65(5):2711-2713에서 Enami와 Palese에 의해 설명한 바와 같이, 인플루엔자 바이러스 유전자를 체외 생성 재조합형 RNA 분자로 대체할 수 있는 리보뉴클레오프로틴(RNP) 트랜스펙션 시스템을 들 수 있다.
바이러스 RNA는 체외에서 합성되며, RNA 트랜스크립트(transcript)는 본 명세서 참조로 통합되는 Amplification, expression, and packaging of a foreign gene by influenza virus, Cell 59:1107-1113에 Luytjes 등에 의해 입증된 바와 같이 감염된 셀에서의 생물학적으로 활성 RNP 역할을 하는 바이러스 뉴클레오프로틴(NP)과 중합효소 단백질들로 코팅된다.
RNP 형질주입 방법은 4단계로 나눌 수 있다. 즉, 1) RNA 준비: 인플루엔자 바이러스 세그먼트에 대한 플라스미드 DNA 코딩이 체외 전사 반응에서 음감(negative-sense) RNA로 기록되고, 2) RNA의 캡슐화: 그 후, 생물학적으로 활동적인 RNP 콤플렉스를 형성하기 위해, 전술한 RNA는 분열된 인플루엔자 바이러스로부터 격리된 구배 정제된 NP 및 중합효소 단백질들 혼합된다. 3) 캡슐화된 RNA의 감염과 구조: 인공 리보핵캡시드는 이전에 구조되는 사람과는 다른 유전자를 포함하고 있던 도우미(helper) 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포로 전염된다; 도우미 바이러스는 전염된 RNA를 증폭시킬 것이다; 4) 전염된 유전자의 선택: 구조된 유전자를 포함하고 있는 도우미 바이러스와 트랜스펙턴트 모두 배양상층액에 있기 때문에, 감염된 유전자를 가진 바이러스를 격리시키기 위해 항체를 이용한 적절한 선택 시스템이 필요하다.
그러한 선택 시스템은 특정한 생물학적, 분자적 특성을 가진 새로운 전염성 인플루엔자 바이러스를 생성할 수 있게 해준다. 표적 표면 단백질에 대한 항체 선택은 양 또는 음의 선택에 사용될 수 있다.
예를 들어, M2 단백질을 표현하지 않는 M2 유전자를 포함하고 있는 감염성 또는 변이체 바이러스는 야생형 기능성 M2 단백질을 안정적으로 표현하기 위해 변형된 적절한 포유류 세포 라인에서 자랄 수 있다. 야생형 M2 유전자를 발현하는 도우미 바이러스, 따라서 막 표면의 M2e 단백질의 복제를 방지하거나 억제하기 위해 M2e에 대한 항체를 사용할 수 있다. 그러한 항체는 상업적으로 이용가능하며 도우미 바이러스의 복제를 억제하며 변이체 M2를 포함하는 전염성/자성 바이러스가 상청액에서 자라고 농축될 수 있도록 한다. M2e 항체에 의한 인플루엔자 바이러스 복제의 억제는 "인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질인 바이러스 증식의 단종 항체 제한과 바이러스 내 M2 검출"이라는 제목으로 쓰여진, J Virol 62:2762-2772(1988) 및 Treanor 등에 의한 "M2 단백질에 대한 단일 클론 항체를 수동 전달하여 생쥐에서의 인플루엔자 바이러스 복제를 억제한다"라는 제목으로 쓰여진 J. Virol 64:1375-1377(1990)에서 전술되었다.
추가적으로 또는 대체적으로, 도우미 바이러스를 '포획'하고 트랜스펙턴트의 농축을 허용하기 위해 동일한 항체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체는 조직 배양 접시의 바닥에 코팅하는 데 사용될 수도 있고, 상청액이나 용출액에서 트랜스펙턴트에게 농축이 가능하도록 칼럼 매트릭스에 사용될 수도 있다.
트랜스펙턴트 바이러스는 M2에서 제한 희석에 의해 다중 웰 플레이트의 세포를 발현하여 배양한 다음, 예를 들어 복제판을 만들어 식별하고 복제할 수 있다. 예를 들어, 성장한 바이러스를 포함하고 있는 멀티-웰(multi-well) 플레이트의 주어진 웰 반쪽은 M2 단백질을 발현하는 MDCK 셀을 감염시키는 데 사용될 수 있다. 트랜스펙턴트 바이러스와 도우미 바이러스는 모두 M2 단백질을 표현하는 MDCK 셀에서 자랄 것이다. 그러나 표준 MDCK 셀에는 오직 도우미 바이러스만이 자라 트랜스펙턴트를 함유하는 멀티-웰 플레이트의 웰을 식별할 수 있게 된다. 이 전염성 바이러스는 M2 단백질을 표현하는 셀들에서 추가로 정제된 플라크가 될 수 있다.
B. 바이러스 변이체들을 전파
일부 실시예에서는 여기에 설명된 바이러스 변이체가 호스트 셀에 유지되고 전달된다. 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 변이체들과 같은 인플루엔자 바이러스 변이체의 성장에 적합한 전형적인 호스트 셀(예: 인플루엔자 바이러스 변이체)는 마딘-다르비 카닌 신장(MDCK) 셀들, 아프리카 녹색 원숭이 셀들(예: 베로 셀들), CV-1 셀들 및 레수스(rhesus) 원숭이 신장 셀들(예: LLcomk.2 셀들)과 같은 시미안(simian) 셀들, 보빈(bovine) 셀들(예: MDBK 셀들), 돼지 셀들, 페렛(fetter) 셀들(예: 밍크 폐 셀들) BK-1 셀들, 설치류 셀들(예: 중국 햄스터 난소 셀들), 예컨대 배아 인간 망막 셀들과 같은 인간 셀들(예: PER-C6), 293T 인간 배아 신장 셀들 및 배아 섬유아세포들을 포함하는 조류 셀들을 포함하되 이에 국한되지 않은 임의의 개수의 진핵 생물 셀들을 포함한다.
추가적으로 또는 대체적으로 일부 실시예들에서는, 예를 들어, 호스트 셀의 바이러스 감염을 증가시키거나 바이러스 성장률을 높임으로써, 진핵 호스트 셀은 바이러스 생성을 향상시키기 위해 변형된다. 예를 들어, 일부 실시예에서는 호스트 셀을 변형하여 세포 표면에 2,6 링크된 시알산을 표현하거나 표현을 증가시켜 변이체 또는 야생형 인플루엔자 A 바이러스에 의한 이러한 세포의 보다 효율적이고 효과적인 감염을 가능하게 한다. 예컨대, 전문이 본 명세서에 참조로 통합되어 있는 미국 특허 출원 번호 2010-0021499 및 미국 특허번호 7,176,021을 참조하라. 따라서 일부 예시적 실시예에서는 2,6-시알릴전달효소 유전자(ST6GAL 1)의 최소한 한 카피(copy)를 발현하기 위해 변형된 중국 햄스터 난포 셀들(CHO 셀들) 및/또는 베로 셀들을 사용한다. 예를 들어, 제한에 의한 것은 아니지만, 접근 번호 BC040009.1로 나타내는 호모 사피엔스 ST6 베타-갈라토사미드 알파-2,6-시알릴 트랜스퍼페라제 유전자 염기서열은 CHO 세포에 통합되어 표현할 수 있는 ST6Gal Ⅰ유전자의 한 예다. 기능성 ST6Gal I 유전자 생성물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 카피를 셀로 만들 수 있다. 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 12개 를 초과하는 ST6Gal I 유전자를 표현하기 위해 안정적으로 변형된 세포가 사용될 수 있다. 단일 표현식 카세트는 표현될 ST6Gal I 유전자의 사본을 하나 이상 포함할 수 있는데, 이 유전자는 발기인, 강화인, 터미네이터 및 폴리아데닐레이션 신호 시퀀스와 같은 규제 요소와 작동하여 ST6Gal I 유전자 또는 그 카피의 표현을 용이하게 할 수 있다. 또는, 단일 표현식 카세트는 ST6Gal I 유전자의 한 카피와 호스트 셀 게놈에 통합된 다중 표현식 카세트를 표현하도록 설계될 수 있다. 따라서, 일부 실시예들에서는 적어도 하나의 ST6Gal I 유전자가 호스트 셀의 게놈에 통합되어 셀이 ST6Gal I 유전자와 그 효소 단백질 제품을 표현한다. 카피 번호에 따라, 단일 호스트 셀은 많은 기능성 ST6Gal I 유전자 단백질들을 표현할 수 있다.
복제, 전염, 안정적이고 변형된 세포 라인을 생산하는 데 적합한 벡터들은 관련 분야에서 공지되어 있다. 한 가지 제한되지 않는 예는 pcDNA3.1 벡터(인비트로겐)를 포함한다.
추가적으로 또는 대체적으로, 일부 실시예들에서는 진핵 호스트 셀이 변이체 바이러스 유전자의 야생형 버전을 생산하기 위해 변형되어, 그 유전자를 트랜스 방식으로 바이러스에 공급한다. 예를 들어 변이체 M2 단백질을 포함하는 바이러스 균주는 야생형 M2 단백질을 생성하는 호스트 셀에 침투할 때 증강된 성장율(예: 바이러스 생성량 증가)을 보일 수 있다. 일부 실시예에서 변이체 M2 단백질을 숨기는 바이러스 균주는 야생형 M2 유전자를 표현하지 않는 셀에서 자라거나 복제되지 않을 수 있다. 또한, 그러한 호스트 셀은 예를 들어, 그러한 호스트에는 반전에 대한 선택적 압력이 없기 때문에, 기능적 M2 시퀀스로의 바이러스 반환을 늦추거나 방지할 수 있다.
발현 벡터들과 변형된 호스트 셀들 모두를 만드는 방법은 관련 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, M2 발현 벡터는 아래 진핵식 발현 벡터에서 M2 핵산 시퀀스(M2 ORF 시퀀스; 즉 코돈(표 7)을 중지하기 위한 "와일드형" M2 시작 코돈)를 배치하여 만들 수 있다. BM2에도 유사한 방법을 사용할 수 있으며, 그 순서는 아래 표 7에 제공된다.
표 7: Wild-type M2 nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 13)
ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAACGGTTCAAGTGATCCTCTCACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAATACGGACTGAAAGGAGGGCCTTCTACGGAAGGAGTGCCAAAGTCTATGAGGGAAGAATATCGAAAGGAACAGCAGAGTGCTGTGGATGCTGACGATGGTCATTTTGTCAGCATAGAGCTGGAGTAA
표 8: Wild-type BM2 nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 14)
ATGCTCGAACCACTTCAGATTCTTTCAATTTGTTCTTTCATTTTATCAGCTCTCCATTTCATGGCTTGGACAATAGGGCATTTGAATCAAATAAGAAGAGGGGTAAACcTGAAAATACAAATAAGGAATCCAAATAAGGAGGCAATAAACAGAGAGGTGTCAATTCTGAGACACAATTACCAAAAGGAAATCCAAGCCAAAGAAACAATGAAGAAAATACTCTCTGACAACATGGAAGTATTGGGTGACCACATAGTAGTTGAAGGGCTTTCAACTGATGAGATAATAAAAATGGGTGAAACAGTTTTGGAGGTGGAAGAATTGCAATGAGCCCAATTTTCACTGTATTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGTGAATAAAACTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACT
호스트 셀(예: MDCK 셀들)는 예를 들어, TransIT LT1(Mirus Bio, Madison, WI)와 같이 상업적으로 이용 가능한 시약과 키트를 사용하는 것과 같이, 관련 분야에 공지된 방법에 의해 전염될 수 있다. 예를 들어, 하지만 제한적이지 않게, 검출 가능한 마커 또는 선택 가능한 마커(예: 저자극 저항성)로 동시형질주입에 의한 것 및/또는 예를 들면 M2 항체를 사용한 간접 면역 체계에 의한 스크리닝에 의해 M2 발현에 대해 셀들이 선택되고 테스트될 수 있다. M2 발현은 간접 면역, 유동 세포측정학 또는 ELISA에 의해 결정될 수 있다.예를 들어 293T 인간 배아 신장 세포와 마딘-다르비 카닌 신장(MDCK) 셀은 각각 10%의 태아 종아리 혈청을 보충한 덜베코의 변형된 이글 매개체와 5%의 신생 종아리 혈청을 함유하고 있는 최소 필수 매개체(MEM)에서 유지되었다. 모든 셀은 5%의 CO2에서 37℃로 유지되었다. A/Pufero Rico/8/34(H1N1)로부터 안정적으로 M2 단백질을 발현하는 히그로마이신(Hygromycin)-내성 MCAGS/M2 셀은 히그로마이신 저항 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pRHyg와 동시형질주입에 의해 확립되었으며, 전체 길이 M2 단백질을 1:1의 비율로 발현한다. M2를 발현하는 안정적 MDCK 셀 복제품(M2CK)은 항-M2(14C2) 단세포 항체를 이용한 간접 면역성 검사(Iwatsuki 등, JVI, 2006, vol.80, No.1, p.5233-5240)로 0.15mg/mL를 함유한 매체에서 선정되었다. M2CK 셀은 10%의 태아 종아리 혈청 및 0.15mg/mL의 히그로마이신을 보충한 MEM에서 배양되었다. M2CK 셀들에서, M2의 발현 수준과 국소화는 바이러스 감염 셀들의 것들과 유사했다(데이터는 나타나지 않았다). BM2-반현 BM2CK 셀들도 유사한 방식으로 만들 수 있고, M2- 또는 BM2-발현 베로 셀들도 유사한 방식으로 만들 수 있다.
일부 실시예들에서, 셀들과 바이러스 변이체들은 관련 분야에서 공지된 방법들에 의해 배향되고 전파된다. 예를 들면, 하지만 제한적이지 않게 일부 실시예들에서는 호스트 셀들이 10%의 태아 종아리 혈청으로 보충된 MEM 앞에서 성장한다. M2나 BM2를 발현하는 셀들은 PBS로 씻은 후 37℃에서 흡착 바이러스가 발생하여 0.001의 MOI에서 감염된다. 일부 실시예들에서는 트립신/TPCK을 함유하는 바이러스성 성장 매체를 첨가하고 세포질 효과가 관찰될 때까지 2~3일 동안 세포를 배양한다.
이러한 라인들을 따라, 일회용 생체 반응기 시스템은 바이러스가 있든 없든 포유류 세포를 위해 개발되었으며, 이점에는 더 빠른 시설 설치와 교차 오염의 위험 감소 등이 포함된다. 예를 들어, 여기에 설명된 셀은 스테딤(Stedium), SAFC 생물과학의 바이오아제 백(Bioeaze bag)들, Cellexus Biosytems로부터의 HybridBagTM 또는 HyClone의 단일 사용 바이오리엑터 또는 Lonza의 Celltainer로부터의 것들과 같은 과 같은 일회용 백들에서 배양될 수 있다. 바이오리엑터들은 1L, 10L, 50L, 250L, 1000L 크기 형식들이 될 수 있다. 일부 실시예에서는 동물성 생성물이 없는 혈청 없는 최적화된 매체로 셀이 정지 상태로 유지된다. 이 시스템은 예를 들어 1L에서 10L로 단일 백에서 배양이 확장될 수 있는 페드-배치(fed-batch) 시스템이거나, 동시에 배양 배지에서 잠재적으로 독성이 있는 부산물이 축적되는 것을 방지하면서 영양분을 지속적으로 공급할 수 있는 관류(perfusion) 시스템일 수 있다.
장기간 보관을 위해, 변이체 바이러스는 동결된 스톡(stock)들로서 저장될 수 있다.
Ⅴ. 백신들과 투여 방법
A. 면역원성 조성물들과 백신들
여기에 공개된 세포 기반의 바이러스 생산 시스템에서 만들어질 수 있는 다양한 종류의 백신이 있다. 본 개시물은 실시간 약독화 바이러스 백신, 단일 복제 백신, 복제 결함 백신, 바이러스 벡터 백신, 비활성된 바이러스 백신, 전체 바이러스 백신, 분할 바이러스 백신, 비로좀(virosomal) 바이러스 백신, 바이러스 표면 항원 백신 및 이들의 혼합물의 제조 및 생산에 국한되지 않는다. 따라서 이러한 백신 유형의 적절한 조성이 면역반응(예: 체계적 면역반응)을 생성할 수 있는 다양한 인플루엔자 바이러스에 특정한 보호 면역반응을 생산할 수 있는 수많은 백신이 있다. 살아있는 약독화 바이러스 백신 또한 호흡기의 국소 점막 면역성을 자극할 수 있다는 장점이 있다.
일부 실시예들에서, 본 명세서에서 설명된 조성물들에서 사용된 백신 항원들은 "직접" 항원, 즉 DNA로 투여되는 것이 아니라 항원 그 자체다. 이러한 백신들은 바이러스성 다당류 하지만 이것에 국한되지 않은 전체 바이러스 또는 바이러스의 부분만을 포함할 수 있고, 이는 그것들이 단독이거나 캐리어 단백질, 살아있는 약독화된 전체 미생물, 비활성된 미생물, 재조합 펩타이드 및 단백질, 글리코프로틴, 글리콜리피드들, 리포펩타이드들, 합성 펩타이드들, 또는 "분할" 백신이라고 하는 백신의 경우에서의 파열된 미생물과 같이, 캐리어 요소들에 접합된 것인지는 관계 없다.
일부 실시예들에서는, 완전한 비리온 백신에 제공된다. 완전한 비리온 백신은 초정밀화에 의해 농축된 다음 지역 원심분리기 또는 크로마토그래피로 정화할 수 있다. 전형적으로, 그러한 비리온은 예를 들어 포르말린이나 베타-프로피올락톤을 사용하여 정화하기 전이나 후에 비활성화된다.
일부 실시예들에서는 서브유닛 백신이 제공되고, 이러한 서브유닛 백신은 정제된 글리코프로틴들을 포함한다. 그러한 백신은 다음과 같이 마련될 수 있는데, 즉 예를 들어, 세제로 치료하여 분해한 바이러스 중단제를 사용하여 표면 항원을 정제한다. 따라서 그러한 서브유닛 백신은 주로 HA 단백질과 NA를 함유한다. 사용되는 세제는 헥사데실 트리메틸 암모늄 브롬화물과 같은 양이온성 세제, 디옥시콜산암모늄과 같은 음이온성 세제 또는 TRITON X100이라는 이름으로 상용화된 것과 같은 비이온성 세제일 수 있다. 혈구응집소는 또한 브로멜린과 같은 프로테아제로 바이러스를 처리한 후 표준적인 방법으로 정제될 수 있다.
일부 실시예들에서는 분리 백신이 제공되는데, 이 백신은 지질을 용해하는 물질로 치료를 받아온 바이러스들로 구성되어 있다. 분리 백신은 다음과 같이 준비될 수 있다: 위와 같이 얻은 정제된 바이러스의 수용성 서스펜션은 활성화되지 않았든 활성화되지 않았든 저으면서 세제와 관련된 에틸 에테르나 클로로포름과 같은 지질 용제에 의해 처리된다. 바이러스 엔빌로프 지질의 용해들은 바이러스 입자의 분열을 초래한다. 수용성 상은 원래 지질 환경이 제거된 혈구응집소와 뉴라미니다아제로 주로 구성된 분할 백신과, 코어 또는 그것의 분해 산물을 함유하여 회복된다. 그러면 이것이 이미 행해지지 않았다면 잔류 감염 입자들이 비활성화된다.
일부 실시예들에서는, 비활성화된 인플루엔자 바이러스 백신들이 제공된다. 일부 실시예들에서는, 비활성화된 백신들은 포르말린이나 ß프로피올락톤 처리와 같은 하지만 이것에 국한되지 않는 알려진 방법을 사용하여 바이러스를 비활성화함으로써 만들어진다. 발명에 사용될 수 있는 비활성 백신 종류는 전체 바이러스(WV) 백신이나 SV(Subvirion) (분할) 백신들을 포함할 수 있다. WV 백신은 온전하고 비활성된 바이러스를 포함하고 있으며, SV 백신은 지질 함유 바이러스 엔빌로프를 용해하는 세제로 인해 교란된 정제된 바이러스를 함유하고 있으며, 그 다음 화학적인 잔류 바이러스 비활성화가 이어진다.
추가적으로 또는 대체적으로 일부 실시예들에서는, 살아있는 감쇠된 인플루엔자 바이러스 백신이 제공된다. 이러한 백신은 알려진 방법 단계들에 따라 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 실시예들에서는, 약독화는 감약 기증자 바이러스의 감쇠된 유전자를 알려진 방법에 따라 격리 또는 재분배된 바이러스로 전송함으로써 한 번에 이루어진다(예: Murphy, Infect. Dis. Clin. Pract. 2, 174 (1993). 일부 실시예들에서는 바이러스가 하나 이상의 바이러스 핵산 시퀀스의 변이체에 의해 감쇠되어 변이체 바이러스가 발생한다. 예를 들어, 일부 실시예에서는 결함이 있는 단백질 제품의 변이체 바이러스 핵산 시퀀스 코드. 일부 실시예에서는 단백질 제품이 기능이 저하되었거나 기능이 저하되지 않았다. 다른 실시예에서는 변이체 바이러스 핵산으로부터 단백질 생산물이 생산되지 않는다.
여기서 설명한 단일 복제 바이러스는 동물(예: 조류 및/또는 포유류)의 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물(예: 백신)으로서 알려진 방법에 따라 제형화하고 투여할 수 있다. 이러한 약독화된 또는 비활성화된 백신이 임상 격리 또는 거기서 파생된 고성장 변종과 유사한 항원을 유지하는지 여부를 결정하는 방법은 관련 분야에서 잘 알려져 있다. 이러한 알려진 방법에는 기증자 바이러스의 항원결정자를 발현하는 바이러스를 제거하기 위한 항체 또는 항체의 사용, 화학적 선택(예: 아만타딘 또는 리모티딘), HA 및 NA 활동 및 억제, 항원결정자를 인코딩하는 기증자의 유전자를 확인하기 위한 DNA 검사(예: 프로브 하이브리드화 또는 PCR)가 포함된다. 감쇠된 바이러스에는 HA 또는 NA 유전자) 또는 기타 변이체 시퀀스(예: M2)가 존재하지 않는다. 예를 들어, Robertson 등에 의한, Giornale di Igiene e Medicina Preventiva, 29, 4(1988); Kilbourne, Bull. M2 세계 보건 기구, 41, 643(1969); 및 로버트슨 등의 생물학(Biologicals), 20, 213(1992)를 참조하라.
일부 실시예들에서는, 백신이 기능성 M2 단백질의 발현이 결여되는 단일 복제 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 일부 실시예들에서, 변이체 바이러스는 M2 단백질을 발현하는 셀에서 잘 복제되지만, 해당 야생형 셀들에서는 전염성 자손 비리온들 바이러스를 생성하지 않고 바이러스 단백질들을 발현한다.
비강내 투여, 피부내 투여, 접종 또는 비경구 투여 또는 경구 투여에 적합한 현재 기술의 제약학적 조성물들은 감쇠 또는 비활성 인플루엔자 바이러스를 포함하며, 선택적으로 무균 수용성 또는 비수용성 용액들, 서스펜션들 및 에멀전들을 포함할 수 있다. 그러한 조성물들은 관련 분야에서 공지된 바와 같이 보조제 또는 흥분제를 포함할 수 있다. 예를 들어, Berkow 등에 의한, The Merck Manual, 15판, Merck and Co, Rahway, N.J.(1987), Goodman 등에 의한, eds, Goodman 및 Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y.(1990); 에이버리의 약물 치료: 임상 약학과 치료의 원칙과 실천, 제3판, ADIS Press, LTD, 윌리엄스와 윌킨스, 볼티모어, Md. (1987); 및 Katzung, ed., Basic and Clinical Pharmacology, 제5판, Appleton and Lange, Norwalk, Conn. (1992)을 참조하라.
일부 실시예들에서, 비강내 전달을 위한 액체 준비물은 용액이나 서스펜션들의 형태를 취할 수 있으며, 예를 들면 염화나트륨, 덱스트로즈 또는 만니톨과 같은 강장 조절제, 예를 들면 벤잘코늄 염화제, 티오메탈, 페닐틸알코올과 같은 보존제, 및 서스펜딩, 버퍼링, 안정화 및/또는 분사제와 같은 기타 구성제들과 같은 기존의 부형제들을 함유할 수 있다.
일부 실시예들에서는, 비경구적 투여를 위한 준비물에는 불임 수용성 또는 비유해 해결책, 일시 중단 및/또는 에멀젼이 포함되며, 관련 분야에서 알려진 보조제 또는 흥분제를 포함할 수 있다. 비수성 용제의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유 등의 식물성 오일, 에틸 올레산염과 같은 주입식 유기 에스테르 등이 있다. 캐리어들 또는 밀폐된 드레싱을 사용하여 피부 투과성을 높이고 항원 흡수를 강화할 수 있다. 구강 투여를 위한 액체 투여 형태는 일반적으로 액체 투여 형태를 함유하는 지질 용액으로 구성될 수 있다. 리포좀들을 서스펜드하기에 적합한 형태로는 정제수와 같이 일반적으로 기술에서 사용되는 불활성 희석제를 함유한 유화제, 중단제, 용액, 시럽 및 유막이 있다. 불활성 희석제 외에도, 그러한 성분에는 애주분, 습윤제, 유화제 및 부유제, 또는 감미료, 향미료 또는 향료제가 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물이 개인에 대한 투여를 위해 사용될 때, 그것은 추가로 조성물의 효능을 향상시키기 위해 바람직한 소금, 완충제, 보조제 또는 기타 물질로 구성될 수 있다. 백신의 경우, 보조제(특정 면역 반응을 증가시키는 물질)를 사용할 수 있다. 일반적으로 보조제와 조성물은 면역체계에 제시하기 전에 혼합되거나, 별도로 제시되지만, 면역되는 유기체의 동일한 부위로 나타난다.
일부 실시예들에서, 본 개시물은 적어도 2개의 인플루엔자 변종에서 나온 바이러스들을 포함하는 다가 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시예들에서, 다가 면역원성 조성물은: (a) 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 재조합 바이러스로서, 그러한 설계된 인플루엔자 A 바이러스는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 변이체 M2 유전자를 포함하는, 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 재조합 바이러스; (b) 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 재조합 바이러스로서, 그러한 설계된 인플루엔자 B 바이러스는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 포함하는, 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 재조합 바이러스를 포함한다.
일부 실시예들에서는 인플루엔자 A 바이러스가 H1N1 및 H3N2 서브타입 그룹에서 선택되며, 인플루엔자 B 바이러스는 B/Yamagata와 B/Victoria 혈통들의 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시예들에서는, 본 개시물이 2개의 M2-결핍 인플루엔자 A M2SR 바이러스, 즉 모두 SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는 A/California/07/2009(H1N1) 및 A/Brisbane/10/2007(H3N2)와, 2개의 BM-2 결핍 인플루엔자 B BM2SR 바이러스들, 즉 모두 SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR-0 변이체를 포함하는 B/Brisbane/60/2008 (Victoria) and B/Wisconsin/01/2010 (Yamagata)를 포함하는 4가의 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시예들에서, 이러한 면역원성 조성물은 4가의 인플루엔자 백신으로서 제형화된다.
일부 실시예들에서, 본 개시물은 적어도 하나의 인플루엔자 A 변종 및 적어도 하나의 인플루엔자 B 변종으로 구성된 다가 면역원성 조성물의 필요 대상자에 대한 투여로 구성된 인플루엔자 A와 인플루엔자 B에 대한 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 다가 면역원성 조성물은 (a) 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 재조합 바이러스로서, 설계된 인플루엔자 A 바이러스들은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 변이체 M2 유전자를 포함하는, 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 A M2-결핍 재조합 바이러스와, (b) 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 재조합 바이러스로서, 설계된 인플루엔자 B 바이러스는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 포함하는, 적어도 하나의 설계된 약독화된 인플루엔자 BM2-결핍 재조합 바이러스를 포함한다.
일부 실시예들에서, 인플루엔자 A 바이러스들은 H1N1 및 H3N2 서브타입 그룹에서 선택되며, 인플루엔자 B 바이러스들은 B/Yamagata와 B/Victoria 혈통들의 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시예들에서, 본 개시물은 인플루엔자 A와 인플루엔자 B에 대한 면역 반응을 자극하는 방법을 제공하며, 필요로 하는 대상체이 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 이러한 면역원성 조성물은 2개의 M2 결핍 인플루엔자 A M2SR 바이러스: 즉 SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는 A/California/07/2009(H1N1)와, SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는 A/Brisbane/10/2007(H3N2)과, 2개의 BM2-결핍 인플루엔자 B BM2SR 바이러스들, 즉 SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR-0 변이체를 포함하는 B/Brisbane/60/2008(Victoria)와, SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR-0 변이체를 포함하는 B/Wisconsin/01/2010(야마타)를 포함한다. 일부 실시예들에서, 이러한 면역원성 조성물은 4가 인플루엔자 백신으로 제형화된다.
일부 실시예들에서, 여기에 설명된 바와 같이 4가 인플루엔자 백신으로 제형화된 면역원성 조성물은 약독화된 병독성을 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시예들에서는 4가 백신으로 감염된 생쥐가 인플루엔자 B 1가 백신들만으로 감염된 생쥐에 비해 인플루엔자 A 챌린지 후 후-감염(post-infection) 수명이 증가한다. 일부 실시예들에서는 4가 백신으로 감염된 생쥐가 인플루엔자 A 1가 백신에만 감염된 생쥐에 비해 인플루엔자 B 챌린지 후 평균 후-감염 수명이 증가했다.
본 발명에 따른 제약학적 조성물은 또한 또는 추가적으로 예컨대 유전자 치료의 경우, 면역억제제, 항염증제 또는 면역억제제, 또는 감마 글로불린, 아만타딘, 구아니딘, 하이드록시벤지미다졸, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 종양 괴사 인자-α, 티오스미카르바존(tiosmicarbarzones), 메티사존, 리팜빈, 리바비린, 피리미딘 아날로그, 퓨린 아날로그, 포스카르넷, 인산, 아시클로비르, 디데옥시뉴클레오시드들, 프로테아제 억제제, 또는 산사이클로비르를 포함하지만 이들에 국한되지 않는 항바이러스제 등 적어도 하나의 화학요법 화합물을 포함할 수 있다.
그러한 조성물은 또한 가변적이지만 소량의 엔도톡신이 없는 포름알데히드와, 본 발명의 조성물이 투여되는 유기체에서 안전하며 바람직하지 않은 효과에 기여하지 않는 보존제가 포함될 수 있다.
B. 투여
본 명세서에 공개된 면역원성 조성물(예: 백신)은 통상적으로 백신에 사용되거나 권장되는 경로 중 하나를 통해 투여될 수 있는데, 즉 주입식 또는 분무식 액체, 분무식 또는 분무식 건조된 제조 또는 공기 건조 등 다양한 형태가 있을 수 있다. 백신은 주사기를 사용하거나 근육 내, 피하 또는 피부 내 주입용 바늘이 없는 주사기를 사용하여 투여할 수 있다. 백신은 또한 비강, 폐, 질 또는 직장 등 점막에 마른 분말이나 액체 스프레이를 전달할 수 있는 분무기를 사용하여 투여할 수 있다.
본 명세서에 공개된 백신은 수동적 예방접종 또는 능동적 예방접종에 의해 하나 이상의 인플루엔자 변종에 대한 내성을 부여할 수 있다. 액티브 면역에서는 활성화되지 않거나 감쇠된 살아있는 백신 구성을 숙주(예: 포유류)에게 예방적으로 투여하고, 투여에 대한 숙주의 면역 반응은 감염 및/또는 질병으로부터 보호한다. 패시브 예방접종을 위해, 도출된 항진제를 회복하여 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 균주에 의해 유발된 감염을 의심받는 환자에게 투여할 수 있다.
따라서 본 발명은 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 균주에 의한 감염과 같은 질병이나 장애를 예방하거나 약화시키는 것이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 백신은 투여 시 병의 증상이나 상태에 대한 전체 또는 부분 감쇠(즉, 억제) 또는 개인의 전체 또는 부분 면역이 발생할 경우 질병을 예방하거나 약독화시킨다고 한다.
본 발명의 적어도 하나의 활성화되지 않거나 약독화된 인플루엔자 바이러스 또는 그 조성물은 전술한 바와 같이 의약품 조성물을 사용하여 의도된 목적을 달성하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 그러한 조성물의 투여는 피하, 정맥내, 피부 내, 근육 내, 복강 내, 비강 내, 경구 또는 외피 경로들 같은 다양한 비경구 경로들 의해 이루어질 수 있다. 비경구 투여는 볼루스(bolus) 주입에 의해 또는 시간이 지남에 따라 점진적인 관류를 통해 이루어질 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 명세서에서 공개된 바와 같은 면역원성 조성물은 근육 내 또는 피하적 적용(application)에 의해 이루어진다.
일부 실시예들에서, 인플루엔자 바이러스와 관련된 병리학을 예방, 억제 또는 치료하기 위한 요법은 단일 치료로서 투여되거나 또는 1주와 약 24개월들 사이를 포함하여 최대 1주 내지 24개월 동안 또는 임의의 범위 또는 값으로 복용량들을 감화하거나 끌어올림으로 반복되는, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 효과적인 양의 백신 조성물의 투여를 포함한다. 일부 실시예들에서, 본 명세서에서 개시된 인플루엔자 백신은 매년 투여된다.
본 발명의 기술에 따르면, 백신 조성물의 "유효량"은 바라는 생물학적 효과를 달성하기에 충분한 양이다. 일부 실시예에서는 유효량이 수령자의 연령, 성별, 건강 및 체중, 동시치료의 종류, 만약 있다면 치료 빈도, 및 원하는 효과의 성질에 따라 좌우되는 것으로 이해된다. 아래에 제공된 유효 선량의 범위들은 제한되는 것으로 의도되지 않으며 전형적인 선량(dose) 범위를 나타낸다. 따라서 일부 실시예에서 용량은 당업자에 의해 이해되고 결정될 수 있는 바와 같이, 개별 주제에 맞게 조정될 것이다. 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 투여량은 약 101 내지 1010 플라크(plaque) 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예들에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 102 내지 1010 플라크 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 103 내지 1010 플라크 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 104 내지 1010 플라크 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 105 내지 1010 플라그 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서, 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 106 내지 1010 플라크 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 107 내지 1010 플라그 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 108 내지 1010 플라그 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 109 내지 1010 플라그 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 109 내지 1010 플라그 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 1010 플라그 형성 단위(PFU)/kg 보다 클 수 있다. 비활성화된 백신의 선량은 예컨대 혈구응집소 단백질의 50㎍과 같이 약 1 내지 200의 범위에 있을 수 있다. 하지만, 그러한 선량은 시작 점으로서 기존의 백신들을 사용하여 종래의 방법들에 의해 결정된 것과 같이 안전하고 효과적인 양이어야 한다.
C. 피부내 방출(Intracutaneous delivery)
살아 있는 독감 백신은 전통적으로 자연적인 감염 경로를 모방하고 자연적인 바이러스 감염과 유사한 면역 반응을 촉진하기 위해 내부로 전달된다. 대안으로, 본 명세서에 공개된 것은 피부내 방출의 면역학적 이점을 활용하기 위해 새로운 마이크로니들 장치를 사용하는 것과 관련된 피부내 방출 방법들이다. 일부 실시예에서는 약독화된 바이러스(예: M2 및/또는 BM2 바이러스 변이체)가 피부 내 투여를 위한 백신 조성물에서 사용된다. 일부 실시예에서는 감염성 자손 바이러스를 생성하지 않는 M2와 BM2 바이러스 변이체들이 4가 백신에서 제공된다. 따라서 야생형 순환성 인플루엔자 바이러스들과의 재분류의 임의의 가능성은 사실상 제거된다.
본 명세서에서 개시된 실시예들에서는, 피부 내 방출(피내)가 백신을 피부에 투여한다. 일부 실시예들에서는 마이크로니들 전달 장치를 사용하여 피부내 방출을 수행한다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 피부내 방출은 많은 장점을 가지고 있다. 예를 들어, 백신의 면역성은 피부 면역 체계의 면역학적 잠재력을 촉발시킴으로써 강화된다. 이러한 백신은 피부의 유력한 항원 전달 수지상 셀들, 즉 표피 랑게르한스 셀들과 피부 수지상 셀들에의 직접적인 접근을 가진다. 피부 셀들은 피부를 통해 유입된 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 염증전 신호들을 생성한다. 또한 피부 면역 체계는 항원 특유의 항체와 세포 면역 반응들을 만들어낸다. 피부 내 방출은 백신 투여량을 줄이는 것(sparing)을 허용하는데, 즉 위 요인들에 비추어 볼 때 피부 내에 방출될 때 더 낮은 양의 항원 투여량이 효과적일 수 있다.
그리고, 백신이 장치의 마이크로니들 배열을 통해 피부에 방출되기 때문에, 의도되지 않은 니들 찌름(needle-stick)들의 위험이 감소되고, 마이크로니들 배열을 통한 피부 내 백신 방출은 종래의 니들 및 주사기를 이용하는 근육 내 주사들에 비해 상대적으로 아프지 않다.
예를 들면, 공표된 미국 특허 출원들인 2012/0109066, 2011/0172645, 2011/0172639, 2011/0172638, 2011/0172637, 및 2011/0172609에서 설명된 바와 같은 마이크로니들 장치들이 관련 분야에 알려져 있다. 마이크로니들 장치들은, 예를 들면 웨트 에칭(wet etching)에 의해 스테인리스강 시트들(예: 트리니티 브랜드 공업, 조지아; SS 304; 50㎛의 두께)로부터의 제작에 의해 만들어질 수 있다. 일부 실시예에서 개별 마이크로니들들의 길이는 예컨대 약 750㎛와 같이 약 500㎛와 1000㎛ 사이에 있고, 폭은 예컨대 약 약 200㎛와 같이 100㎛ 내지 500㎛ 사이의 범위에 있다. 그럴 경우 백신은 코팅으로서 마이크로니들에 도포될 수 있다. 예를 들어 하지만 제한적이지 않게, 코팅 용액에는 1%(w/v) 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨 염(낮은 점도, USP grad, Carbo-Mer, San Diego CA), 0.5%(w/v) Lutrol F-68 NF(BASF, Mt. Olive, NJ) 및 항원(예컨대, 5ng/㎖의 용해 가능한 HA 단백질; 본 명세에서 설명된 M2 및 BM2 변이체 바이러스와 같은 살아 있는 약독화된 바이러스 등). 더 높은 백신 농도에 도달하기 위해 코팅 용액은 상온(~23℃)에서 5 내지 10분 동안 증발될 수 있다. 코팅은 딥(dip) 코팅 프로세스에 의해 수행될 수 있다. 마이크로니들들의 열(row) 당 백신의 양은 마이크로니들들을 200㎕의 인산염 완충된 식염수(PBS)에 5분 동안 잠근 후 관련 분야에서 알려진 방법들에 의해 항원에 대한 검사를 하여 결정할 수 있다.
일부 실시예들에서는 마이크로니들 장치는 주로 간단한 스냅 핏(snap fit)들과 히트 씰(heat seal)들과 함께 맞추어지는 폴리프로필렌과 스테인리스 스틸 1차 컷 피스(piece)들로 만들어진다. 일부 실시예에서 장치는 완전히 자가 수용되며 백신, 펌프 메커니즘, 활성화 메커니즘 및 마이크로니들 유닛을 포함한다. 이들 성분들은 플라스틱 커버 안에 숨겨져 있다. 이러한 장치를 가지고, 백신 주입은 작동 버튼을 눌러 시작된다. 버튼을 동시에 누르면 마이크로니들들이 피부에 삽입되어 1차 약품 용기에 압력을 가하는 펌핑 메커니즘이 시작된다. 스프링 메커니즘이 백신 저장장치에 충분한 압력을 가하면, 백신은 마이크로니들 어레이를 통해 피부 속으로 흐르기 시작한다. 일부 실시예들에서는 백신 선량을 투여하는 것이 장치의 작동 후 약 2분 이내에 완료된다. 주입이 완료된 후, 장치는 피부에서 서서히 제거된다.
일부 실시예들에서는, 마이크로니들 장치를 사용하여 면역원성 조성물(예: 4가 백신)의 피부내 투여를 위한 방법이 제공된다. 일부 실시예에서 마이크로니들 장치는 구멍 뚫기 메커니즘과, 피부에 구멍을 뚫을 수 있고 면역원성 조성물을 피부 내로 투여할 수 있는 복수의 마이크로니들을 포함하는 면역원성 조성물 층을 포함한다. 일부 실시예들에서, 그 방법은 구멍 뚫기 메커니즘을 낮추는 것을 포함한다. 일부 실시예에서 면역원성 조성물(예컨대 4가 백신)은 발현되는 변이체 M2 및 BM2 단백질 또는 발현되지 않은 변이체 M2 및 BM2 단백질을 암호화하는 핵산 염기서열을 포함하는 바이러스를 포함하고, 여기서 발현된 변이체 M2 단백질은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3에 의해 암호화된 아미노산 염기서열을 포함하거나 그러한 염기서열로 구성되며, BM2 단백질은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 11에 의해 암호화된 아미노산 염기서열을 포함하거나 그러한 염기서열로 구성된다. 일부 실시예들에서 마이크로니들 어레이는 처음에 장치 하우징 안에 위치하며, 레버가 작동하면 마이크로니들이 장치 바닥을 통해 확장되고 피부에 삽입되어 백신 액체가 피부 내로 주입되는 것을 허용한다.
본 명세서에서 설명된 전달 장치는 원하는 물질을 전달하기 위해 사용할 수 있다. 일 실시예에서 전달될 물질은 약이며, 전달 장치는 약물을 대상자에게 전달하도록 구성된 약물전달장치다. 여기서 "약물"이라는 용어는 치료 목적, 예방적 또는 의약적 목적(예: 백신, 의약품, 영양소, 건강 기능 식품 등)을 위해 대상자에게 전달되는 임의의 물질을 포함하는 것으로 의도된다. 일 실시예에서, 약물 전달 장치는 대상자에게 선량의 백신을 전달하도록 구성된 백신 전달 장치다. 일 실시예에서, 전달 장치는 독감 백신을 전달하도록 구성되어 있다. 본 명세서에서 논의된 실시예들은 주로 물질을 피부를 통해 전달하도록 구성된 장치와 관련이 있다. 일부 실시예에서 장치는 피부 이외의 장기에 직접 물질을 전달하도록 구성될 수 있다.
예들
전술한 바와 같이, 본 출원은 인플루엔자 A와 인플루엔자 B에 대한 포유류의 면역 반응을 이끌어내는 데 유용한 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 변이체 변종들을 포함하는 새로운 4가 면역원성 조성물을 제공한다. 다음 예들은 다가 백신들로 제조된 변이체들로 면역 반응을 이끌어내는 방법들과, 다가 제형들의 약독화된 병독성을 시험하는 방법들을 예시하기 위해 제시된다.
이어지는 예들은 그림으로만 제공되며, 제한적이지 않다. 당업자는 본질적으로 동일하거나 유사한 결과들을 산출하기 위해 변경되거나 변형될 수 있는 다양한 비임계(non-critical) 매개변수를 쉽게 인식할 것이다. 이러한 예들은 첨부된 청구항들에 의해 규정된 본 발명의 기술의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.
예 1: BM2SR 변이체들은 4가 백신으로서 제형된 인플루엔자 B 바이러스에 대한 항체 반응을 이끌어낸다.
BM2SR 변이체 바이러스가 4가 백신으로 제형화되었을 때 항체 반응들을 이끌어낸다 것을 증명하기 위한 실험을 수행했다. 다음 4개의 1가 백신들: 즉 SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는A/CalifoKrnia/07/2009(H1N1), SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는 A/Brisbane/10/2007(H3N2), SEQ ID NO: 11을 포함하는 MM2SR-0 변이체를 포함하는 B/Brisbane/60/2008(Victoria) 및 SEQ ID NO: 11을 포함하는 MM2SR-0 변이체를 포함하는 B/Wisconsin/01/2010 (Yamagata)이 함께 제형화되었다. 각각의 4가 선량이 생쥐 1마리당 4×106 TCID50이 되도록 각각의 1가의 1×106 TCID50이 함께 혼합된다. 표 1 및 표 5에는 M2SR-1 및 BM2SR-0 변이체 구조들 각각의 시퀀스가 제공된다.
생후 6주 된 BALB/c 암컷 생쥐는 생쥐 1마리당 4×106 TCID50의 용량으로 4가 제형으로 코 내로 접종하였다. 쥐의 통제 그룹은 PBS를 받았다. 세럼 샘플들은 프라임 접종 후 7, 14, 21일에, 그리고 28일에 두 번째 접종 후 35, 42, 49일에 채취되었다. 혈청 샘플들에서 나온 항-HA IgG 항체 역가(titer)들은 B/Wisconsin/01/2010 및 B/Brisbane/60/2008에 대한 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 결정되었다. 체액 반응은 도 2에 나타나 있는데, 도 2는 4가 M2SR과 BM2SR 백신이 2개의 인플루엔자 B 혈통들(B/Bris/60 and B/Wisc/01)을 나타내는 인플루엔자 B 항원들 모두에 대해 대조군 PBS 그룹보다 높은 항 인플루엔자 바이러스 항체들을 상승시켰다는 것을 보여준다. 4가 백신에 의해 촉진된 생쥐는 최초 선량(prime dose) 후보다 두 번째 면역 후 더 높은 수준의 항 인플루엔자 HA 항체들을 가지고 있었다.
이들 결과는 각각의 1가 MB2SR 백신이 4가 제형으로 항원 특정 반응들을 이끌어낼 수 있음을 예증한다.
예 2: M2SR 및 BM2SR 변이체들은 다가 백신들로 제형화된 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스에 대한 항체 반응들을 이끌어낸다.
A. BM2SR 변이체들은 다가 백신들로 제형화된 인플루엔자 B 바이러스에 대한 앙체 반응들을 이끌어낸다.
BM2SR 변이체 바이러스들이 인플루엔자 A H1N1 또는 H3N2 M2SR 백신들을 가지고 1가, 2가, 3가 또는 4가 백신으로 제형화되었을 때 항체 반응을 이끌어낸다는 것을 증명하기 위한 실험이 행해졌다. 표 A는 다음과 같은 4개의 1가 M2SR 및 BM2SR 백신들, 즉 A/California/07/2009(H1N1)(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), A/Brisbane/10/2007(H3N2)(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), B/Brisbane/60/2008(Victoria)(SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR-0 변이체를 포함하는), B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)(SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR-0 변이체를 포함하는)의 상이한 제형들이 어떻게 함께 제형화되는지를 보여준다.
표 A. M2SR 및 MB2SR의 다가 제형들
6주 된 BALB/c 암컷 생쥐는 표 A에 도시된 선량들로 1가, 2가, 3가 또는 4가 백신을 코 내로 접종했다. 쥐의 대조군은 PBS를 받았다. 세럼 샘플은 프라임 접종 후 7, 14, 21일에, 그리고 28일에 두 번째 접종 후 35, 42, 49일에 채취되었다. 혈청 샘플들에서 나온 항-HA IgG 항체 역가들은 B/Wisconsin/01/2010 및 B/Brisbane/60/2008에 대한 ELISA에 의해 결정되었다. 도 3a 및 도 3b에 나타난 체액 반응은 2개의 인플루엔자 B 혈통들을 다가 제형들로 나타내는 인플루엔자 B 항원들 모두에 대한 대조군 PBS 그룹보다 BM2SR 백신 성분들(Bris60과 WI01) 모두가 더 높은 항인플루엔자 바이러스 항체들을 높였음을 보여준다.
이들 결과들은 다가 백신들로 제형화될 때 1가 성분들 사이의 간섭(interference)이 존재하지 않음을 증명한다.
B. M2SR 변이체들은 다가 백신들로 제형화된 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항체 반응들을 이끌어낸다.
M2SR 변이체 바이러스들이 인플루엔자 B Yamagata 또는 Victoria 혈통 BM2SR 백신들을 가지고 1가, 2가, 3가 또는 4가 백신으로 제형화되었을 때 항체 반응들을 이끌어낸다는 것을 증명하기 위한 실험이 행해졌다. 표 A는 다음과 같은 4개의 1가 M2SR 및 BM2SR 백신들, 즉 A/California/07/2009(H1N1)(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), A/Brisbane/10/2007(H3N2)(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), B/Brisbane/60/2008(Victoria)(SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR-0 변이체를 포함하는), B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)(SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR 변이체를 포함하는)의 상이한 제형들이 어떻게 함께 제형화되는지를 보여준다.
6주 된 BALB/c 암컷 생쥐는 표 A에 도시된 선량들로 1가, 2가, 3가 또는 4가 백신을 코 내로 접종했다. 쥐의 대조군은 PBS를 받았다. 세럼 샘플은 프라임 접종 후 7, 14, 21일에, 그리고 28일에 두 번째 접종 후 35, 42, 49일에 채취되었다. 혈청 샘플들에서 나온 항-HA IgG 항체 역가들은 A/California/07/2009(H1N1) 및 A/Brisbane/10/2007(H3N2)에 대한 ELISA에 의해 결정되었다. 도 3c 및 도 3d에 나타난 체액 반응은 다가 제형들로 H1N1 및 H3N2 서브타입들을 나타내는 인플루엔자 A 항원들 모두에 대한 대조군 PBS 그룹보다 인플루엔자 A M2SR 백신 성분들(H1N1 및 H3N2) 모두가 더 높은 항인플루엔자 바이러스 항체들을 높였음을 보여준다.
이들 결과들은 다가 백신들로 제형화될 때 1가 성분들 사이의 간섭이 존재하지 않음을 증명한다.
예 3: BM2SR 변이체들은 치사 인플루엔자 B 바이러스 챌린지로부터 생쥐를 1가 또는 4가 제형화들로서 보호한다.
BALB/c 암컷 생쥐(N=8)는 첫 번째 접종 후(증가 후 3주 후) 49일 만에 B/Malaysia/2506/2004 바이러스(20 마우스 50% 치사량(MLD50))의 치사량에 공격당했다. 도 4a 및 도 4b에 도시된 바와 같이, BM2SR과 4가 백신들을 접종한 모든 생쥐는 공격에 살아남아 몸무게를 잃지 않았다. 그러나 PBS만 투여받은 대조군 생쥐는 체중이 줄었고, 공격 날짜부터 9일이 지나도 살아남지 못했다. 공격 후 4일째 되는 날, 폐들을 얻었고 플라크 분석으로 MDCK 셀들에서 바이러스 역가들이 결정되었다. 도 4c에 나타낸 바와 같이, BM2SR에서의 폐 바이러스 역가들과 4가 백신 접종된 생쥐는 검출 한도 미만인 반면, 투여받지 않은 대조군 PBS 생쥐는 BM2SR과 4가 백신들이 교차 보호를 주고 공격 바이러스의 복제를 제한한다는 것을 나타내는 높은 바이러스 역가들을 가졌다.
예 4: 4가 M2SR 백신은 치사 인플루엔자 A 바이러스 공격으로부터 생쥐를 보호한다
BALB/c 암컷 생쥐(N=8)는 첫 번째 접종 후(증가 후 3주 후) 49일 만에 A/Aichi/02/1968(H3N2) 바이러스(40마우스 50% 치사량(MLD50)의 치사량에 공격당했다. 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이, 1가 H1N1 또는 H3N2 M2SR 및 4가 M2SR 백신을 접종한 모든 생쥐는 공격에서 살아남았고 일시적인 몸무게는 줄었지만 완전히 회복되었다. 그러나 PBS만 투여받은 대조군 생쥐는 체중이 줄었고, 공격일로부터 8일이 지나도 살아남지 못했다. 공격 후 4일째 되는 날, 폐들을 얻었고 플라크 분석으로 MDCK 셀들에서 바이러스 역가들이 결정되었다. 도 5c에서 묘사된 것처럼, M2SR 1가들과 4가 M2SR 백신 접종된 생쥐의 폐 바이러스 역가들은 투여받지 않은 대조군 PBS 생쥐보다 적어도 1 로그(a log) 낮았다는 것은, M2SR 1가들과 4가 M2SR백신들이 교차 보호를 주고 임의의 백신 성분과 일치하지 않는 공격 바이러스의 복제를 제한한다는 것을 나타낸다.
예 5: BM2SR 변이체들은 4가 백신으로서 제형화된 인플루엔자 B 바이러스에 대한 항체 반응들을 이끌어낸다
BM2SR 변이체 바이러스가 4가 백신으로 제형화되었을 때 항체 반응을 이끌어낸다는 것을 증명하는 실험이 행해졌다. 다음 4가지 1가 백신들, 즉 SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는 H1N1 인플루엔자 A 바이러스, SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는 H3N2 인플루엔자 A 바이러스, SEQ ID NO: 9를 포함하는 BM2SR-4 변이체를 포함하는 Victoria 혈통의 인플루엔자 B 바이러스, 및 SEQ ID NO: 9를 포함하는 BM2SR-4 변이체를 포함하는 Yamagata 혈통의 인플루엔자 B 바이러스가 함께 제조되었다. 각각의 4가 선량이 생쥐 1마리당 최대 3×106 TCID50까지가 되도록 각각의 1가의 0.2 내지 1×106 TCID50이 함께 혼합되었다. 표 1과 표 5에는 M2SR-1과 BM2SR-4 변이체 구조들 각각의 시퀀스가 제공된다.
생후 6주 된 BALB/c 암컷 생쥐는 생쥐 1마리당 최대 3×106 TCID50의 선량으로 4가 제형으로 코 내에 접종되었다. 생쥐의 대조군은 PBS를 받았다. 혈청 샘플들은 프라임 접종 후 14일에 채취되었다. 혈청 샘플들에서 나온 항체 IgG 항체 역가들 인플루엔자 항원들(B/Victoria 및 B/Yamagata 혈통들)에 대한 ELISA에 의해 결정되었다. 도 6a 및 도 6b에 도시된 바와 같이, 4가 M2SR과 BM2SR 백신은 2개의 인플루엔자 B 혈통들을 대표하는 인플루엔자 B 항원들 모두에 대해 대조군 PBS 그룹보다 높은 항 인플루엔자 바이러스 항체를 상승시켰다.
이들 결과는 각각의 1가 BM2SR 백신이 4가 제형으로 항원 특정 반응들을 이끌어낼 수 있다는 것을 증명한다.
예 6: M2SR과 BM2SR 변이체들은 다가 백신들로 제형화된 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스들에 대한 항체 반응들을 이끌어낸다
A. BM2SR 변이체들은 다가 백신들로 제형화된 인플루엔자 B 바이러스에 대한 항체 반응들을 이끌어낸다.
인플루엔자 A H1N1 또는 H3N2 M2SR 백신들을 가지고 1가, 3가 또는 4가 백신으로 제형화될 때 BM2SR 변이체 바이러스들이 항체 반응들을 이끌어낸다는 것을 입증하는 실험이 행해진다. 다음 4개의 1가 M2SR 및 BM2SR 백신들, 즉 H1N1(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), H3N2(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), B/Victoria-혈통(SEQ ID NO: 9를 포함하는 BM2SR-4 변이체를 포함하는), B/Yamagata(SEQ ID NO: 9를 포함하는 BM2SR-4 변이체를 포함하는)가 함께 제조된다.
생후 6주 된 BALB/c 암컷 생쥐는 1가, 3가, 또는 4가 백신들로 코 내에 접종되었다. 생쥐의 대조군은 PBS를 받았다. 혈청 샘플들은 프라임 접종 후 14일에 채취되었다. 혈청 샘플들로부터의 항-HA IgG 항체 역가들은 인플루엔자 B 항원들에 대한 ELISA에 의해 결정된다. 도 7c 및 도 7d에 도시된 바와 같이, BM2SR 백신 성분들 모두는 다가 제형들로 2개의 인플루엔자 B 혈통들을 대표하는 인플루엔자 B 항원들에 대해 대조군 PBS 그룹보다 높았다.
이들 결과는 다가 백신들로 제형화될 때 1가 성분들 사이에는 간섭이 존재하지 않음을 증명한다.
B. M2SR 변이체들은 다가 백신들로 제형화된 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항체 반응들을 이끌어낸다.
인플루엔자 B Yamagata 또는 Victoria 혈통 BM2SR 백신들을 가지고 1가, 3가 또는 4가 백신으로 제형화될 때 M2SR 변이체 바이러스들이 항체 반응들을 이끌어낸다는 것을 입증하는 실험이 행해졌다. 다음 4개의 1가 M2SR 및 BM2SR 백신들, 즉 H1N1(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), H3N2(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), B/Victoria-혈통(SEQ ID NO: 9를 포함하는 BM2SR-4 변이체를 포함하는), B/Yamagata(SEQ ID NO: 9를 포함하는 BM2SR-4 변이체를 포함하는)가 함께 제조되어었다.
생후 6주 된 BALB/c 암컷 생쥐는 1가, 3가, 또는 4가 백신들로 코 내에 접종되었다. 생쥐의 대조군은 PBS를 받았다. 혈청 샘플들은 프라임 접종 후 14일에 채취되었다. 혈청 샘플들로부터의 항-HA IgG 항체 역가들은 H1N1 및 H3N2 인플루엔자 A 바이러스에 대한 ELISA에 의해 결정된다. 도 7a 및 도 7b에 도시된 바와 같이, BM2SR 백신 성분들(H1N1 및 H3N2) 모두는 다가 제형들로 H1N1 및 H3N2 서브타입들을 나타내는 인플루엔자 A 항원들 모두에 대한 대조군 PBS 그룹보다 높은 항 인플루엔자 바이러스 항체들을 상승시켰다.
이들 결과는 다가 백신들로 제형화될 때 1가 성분들 사이에는 간섭이 존재하지 않음을 증명한다.
예 7: MM2SR 변이체들은 1가, 3가, 또는 4가 제형들로서 치사 인플루엔자 B 바이러스 공격으로부터 생쥐를 보호한다
BALB/c 암컷 생쥐(N=4)는 접종 후 22일 만에 이질아형 인플루엔자 B 바이러스, B/Malaysia/2506/2004 바이러스(20마우스 50% 치사량(MLD50)의 치사량으로 공격당했다. BM2SR-4 1가, 3가, 및 4가 백신들을 접종한 모든 생쥐는 공격에서 살아남았고(도 8b), 몸무게는 줄지 않았다(도 8a). 그러나 PBS만 투여받은 대조군 생쥐는 체중이 줄었고, 공격으로부터 살아남지 못했다. 이들 결과들은 1가 BM2SR-4 백신들(공격 바이러스와는 상이한 각각의 것), 3가 및 4가 백신들이 공격 바이러스에 대항하여 교차 보호를 준다는 것을 나타낸다. 이들 결과들은 다가 제형들에서 1가 성분들 사이에 간섭이 존재하지 않음을 증명한다.
예 8: 4가 M2SR 백신은 생쥐를 치사 인플루엔자 A 바이러스 공격으로부터 보호한다
BALB/c 암컷 생쥐(N=4)는 접종 후 22일 만에 A/Aichi/02/1968(H3N2) 바이러스(40마우스 50% 치사량(MLD50)와 같은 이종 인플루엔자 A 바이러스의 치사량으로 공격당했다. 3가(H1N1(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), H3N2(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), 및 B/Yamagata(SEQ ID NO: 9를 포함하는 BM2SR-4 변이체를 포함하는)) 또는 4가 M2SR 백신들(H1N1(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), H3N2(SEQ ID NO: 1을 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하는), B/Victoria 혈통(SEQ ID NO: 9를 포함하는 BM2SR-4 변이체를 포함하는) 및 B/Yamagata(SEQ ID NO: 9를 포함하는 BM2SR-4 변이체를 포함하는))을 접종한 모든 생쥐는 공격 후 더 많은 생존자들을 가졌고(도 9b), 일시적 체중 감소가 있었지만 7일째 회복을 시작하였다(도 9a). 하지만 PBS만 투여받은 대조군 생쥐는 체중이 줄었고, 공격 날짜로부터 7일이 경과한 때에도 살아남지 못했다. 이들 결과들은 3가 및 4가 B2SR/BM2SR 백신들이 임의의 백신 성분과 매치되지 않는 공격 바이러스에 대항하여 교차 보호를 준다는 것을 증명한다.
예 9: 1가 M2SR 및 BM2SR 및 4가 M2SR 백신들에 의해 이끌어내진 면역 반응들과 흰담비 모델에서의 보호 효험
A. 요약
이 예는 4가 M2SR 백신에 의해 도출된 면역 반응들이 흰담비 모델에서의 1가 M2SR 및 BM2SR 백신 각각과 유사하다는 것을 증명한다. 즉, 4가 M2SR은 간섭을 나타내지 않고 각 성분에 대한 보호 면역 반응을 이끌어낸다. M2SR 및 BM2SR 후보 바이러스 각각은 1×107 TCID50(1가) 또는 4×107 TCID50(4가)의 선량 수준에서 12마리의 수컷 흰담비에 비강 내로 투여되었다. 대조군으로서, 한 그룹의 흰담비들에는 위약(placebo) 제어로 OPTI-MEMTM이 투여되었다. 각 치료 그룹에 대해 최고 수준의(prime-boost) 예방접종 요법을 활용했다. 흰담비에는 프라임 백신(0일차)과 28일 후 증강 백신(28일차)을 투여했다. 각 예방접종 후 사망에 대한 접종 후 14일 동안 흰담비가 관찰되었으며, 체중, 체온, 임상 징후가 매일 측정되었다. 혈청은 백신접종 후 모든 흰담비에서 21일, 35일, 56일에 채취되어 시간이 지남에 따라 항체 레벨들을 평가하였다.
모든 동물은 70일차에 A/California/07/2009(H1N1pdm)의 1×106 PFU로 비강재로 공격을 받았다. 공격 후에, 흰담비들은 사망에 대한 접종 후 14일 동안 관찰되었고, 체중, 체온, 임상 징후는 매일 측정되었다. 세비액들은 각 그룹의 흰담비들(N=8)로부터 바이러스 역가들에 대해 1일차, 3일차, 5일차, 7일차에 수집되었다. 또한 분석을 위해 생존한 흰담비에서 공격 후(82일차) 혈청을 채취하였다. 공격 후 3일차(73일)에 그룹당 4개의 흰담비에 대해 부검이 수행되었다. 공격 후 바이러스 부하(역가들)의 결정을 위해 장기들을 수집했다.
5개 그룹 중 백신과 관련된 부작용은 관찰되지 않았다. 공격 후, 위약 대고군은 체중 감소(~15%)를 보였다. 또한, 항원적으로 일치하지 않는 1가 H3N2 M2SR 및 BM2SR 백신 그룹들에서 체중 감소가 관찰되었지만, 감소(~5-8%)는 위약 그룹에서 관찰된 것보다 적었다. 4가 M2SR과 H1N1pdm M2SR은 공격 후 어떠한 상당한 체중 감소도 나타내지 않았다.
B. 재료들과 방법들
백신 바이러스 접종. 흰담비들은 표 B에 도시된 것처럼, 1×107 TCID50의 선량으로 1가의 M2SR 또는 BM2SR 백신의 2개의 선량들로 비강내 접종되거나 4×107 TCID50의 선량으로 4가의 M2SR의 2개의 선량들로 비강내 접종되었다. 동결된 스톡(stock) 한 병을 실온에서 최소한 10분 동안 해동한 다음 사용할 때까지 냉장 보관(또는 젖은 얼음 위에 보관)했다. 흰담비들은 케타민/자일라진으로 마취되었고 바이러스 선량은 500μL(네어(nare)당 250μL)의 비강 내로 투여되었다. 각 예방접종 후 7일 동안 동물들이 매일 관찰되었다. 체중, 체온, 임상 징후 등을 7일간 관찰했다.
1 비강 내로 접종된
2 검시를 위해 할당되지 않은 동물들로부터 수집된 세비액들
3 바이러스 역가 분석을 위해 그룹 당 4마리의 흰담비들로부터 수집된 장기들(비갑개, 기관, 폐(좌측 및 우측 두개골 및 뒤엽들))
4 후 예방 접종 혈청 수집물들
M2SR 바이러스는 기능적 M2 단백질을 발현하지 않는 재조합 인플루엔자 A 바이러스로, SEQ ID NO: 1를 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하고, 인플루엔자 A/Brisbane/10/2007-like A/uruguay/716/2007(H3N2) 또는 A/California/07/2009(H1M1pdm)의 HA 및 NA 유전자들을 암호화한다. BM2SR 바이러스는 기능성 BM2 단백질을 발현하지 않는 재조합 인플루엔자 B 바이러스로, SEQ ID NO: 11을 포함하는 BM2SR-0 변이체를 포함하고, B/Brisbane/60/2008(Victoria) 또는 B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)의 HA와 NA를 암호화한다. 4가 M2SR은 H1N1, H3N2, B/Victoria, B/Yamagata HA 및 NA용으로 암호화하는 2개의 M2SR과 2개의 BM2SR 바이러스로 구성되어 있다.
동물들과 동물 보호. 수컷 흰담비 80마리를 트리플 F 팜(Farm)들에서 구입하였으며 그러한 흰담비들 중 72마리가 연구되었다. 연구 개시 당시 동물들은 대략 생후 4개월이었다. 이 동물들은 공급자로부터 건강하며 전염병에 대한 항체가 없다는 인증을 받았다. 도착하자마자 그 동물들은 매달려 있는 와이어 케이지(wire cate)들에서 슬래트 바닥들이 있는 단일 통에 담겨 있었고, 종이로 된(paper-lined) 웨이스트 팬(waste pan)들 위에 매달려 있었다. 동물 보호 시설(room)과 우리(cage)들은 동물 수령 전에 허용된 동물 보호 절차와 관련 표준 운영 절차에 따라 청소하고 소독했다. 공인된 Teklad Global Ferret Diet #2072(Teklad Diets, Madison WI)와 시카고 시 수돗물은 임의로 제공되었고 최소 일주일에 3번 다시 공급되었다. 동물실의 형광등은 12시간의 밝은/어두운 주기로 유지되었다. 동물실 온도 및 상대습도는 각각의 프로토콜 한계들 내에 있었고, 20.0℃와 25.0동물과 동물 보호. 남성 페렛 80개를 트리플 F 팜에서 구입하였으며 72개의 페렛을 연구하였다. 연구 개시 당시 동물들은 대략 4개월이었다. 이 동물들은 공급자로부터 건강하며 전염병에 대한 항체가 없다는 인증을 받았다. 도착하자마자 그 동물들은 매달려 있는 철사 통에 슬래트 바닥이 있는 단일 통에 담겨 있었고, 종이로 된 휴지통 위에 매달려 있었다. 동물 보호 시설과 우리들은 동물 수령 전에 허용된 동물 보호 절차와 관련 표준 운영 절차에 따라 청소하고 위생했다. Teklad Global Ferret Diet #2072(Teklad Diets, Madison WI)와 시카고 시 수돗물은 애드리비툼으로 제공되었고 최소 일주일에 3번 이상 개운했다. 동물실의 형광등은 12시간의 조명/어두운 주기로 유지되었다. 동물실 온도 및 상대습도는 각 프로토콜 한계 이내였고, 연구 중 그 범위는 각각 20.0°C와 25.0°C 사이와 30%와 63% 사이의 범위에 있었다.
동물 검역 및 무작위화. 흰담비들은 무작위화되기 전 7일간 격리되어 매일 관찰되었다. 동물들의 일반적인 건강상태를 나타내는 매일의 관찰에 근거하여 흰담비들은 무작위화 및 검사를 위해 격리 상태로부터 방출되었다. 격리 후 흰담비들은 유사한 그룹 평균 값들을 생성한 체중들에 기초한 전산화된 무작위화 절차를 사용하여 체중 측정이 이루어졌고 치료 그룹들에 할당되었다[ToxData® 버전 2.1.E.11(PDS Pathology Data Systems, Inc., 스위스 바젤)]. 그룹 내에서, 모든 체중은 그것들 평균의 20% 이내였다. 연구를 위해 선택된 동물들은 이어 태그(ear tag)와 트랜스폰더로 영구적인 식별 번호를 받고, 개별적인 케이지 카드들 또한 개별적인 번호와 그룹으로 연구동물을 식별했다. 할당된 식별 번호들은 연구 내에서 고유한 것이었다.
실험 설계(Experimental Design). 백신 효험을 평가하기 위해, 흰담비들은 각 M2SR, BM2SR 또는 4가 M2SR 바이러스에 면역되거나 매체(OPTI-MEMTM)에 의해 모의 면역되었다. 흰담비 체중, 체온, 임상 증상을 모니터링하고 면역 반응을 평가했다. 연구 개시시 생후 4개월된 72마리의 수컷 흰담비(Triple F Farms, Sayre PA)가 연구에 활용되었다. 모든 동물 절차들은 IIT 연구소의 동물 보호 및 사용 위원회가 승인한 프로토콜들에 따라 동물 바이오세이프티(biosafety) 수준-2 시설에서 수행되었다. 접종에 앞서 3일간 흰담비들을 관찰해 체중을 측정하고 기준(baseline) 체온을 설정했다. 온도 판독값은 각 흰담비에서 피하 이식된 트랜스폰더(바이오메딕 데이터 시스템즈, Seaford, DE)를 통해 매일 기록되었다. 혈액은 연구 시작 전에 채취되었고, 혈청은 인플루엔자 항체들에 대해 검사했다. 예방접종 전 혈청 샘플은 수용체 파괴 효소(RDE)로 처리하여 비특정 억제제를 제거한 후 연속적으로 희석하여 규정된 양의 인플루엔자 바이러스 A/California/07/2009-like(H1N1pdm), A/Switzerland/9715293/2013(H3N2), 인플루엔자 B 바이러스, B/Brisbane/60/2008(Victoria 혈통) 및 B/Wisconsin/01/2010(Yamagata 혈통)에 대해 테스트되었고, 0.5%의 칠면조 적혈구들 또는 0.75-1.0%의 기니피그 적혈구들과 혼합되었다. 항체 역가들은 적혈구 응집반응의 억제를 유발하는 가장 낮은 혈청 희석에 의해 규정된다. 본 연구에서는 40 미만의 HAI(Heagglutination적혈구응집반응 억제) 역가들 있는 흰담비들만 혈청 반응 음성으로 간주하여 사용하였다. 연구동물들은 무작위로 분류되어 표 B에 도시된 바와 같이 6개의 그룹들(12개의 흰담비/그룹들)로 나누었다.
흰담비들은 0일과 28일에 M2SR 또는 BM2SR 바이러스의 1×107 TCID50 1회 용량 또는 0일과 28일에 4가 M2SR의 4×107 TCID50 1회 용량으로 비강 내로 접종되었다. 대조군은 0일과 28일에 OPTI-MEMTM으로 비강 내로 모의 접종했다. 접종 후 흰담비 체온, 체중, 임상 증상이 14일 동안 매일 관찰되었다. 세비액 샘플들은 -65℃로 보관되었다. 혈액은 접종 전(3일 전부터 5일전까지)과 21, 35, 56일에 수집되었고, 혈청은 ELISA와 HAI 평가에 의해 항체 역가를 측정할 때까지 -65℃로 유지되었다.
C. 결과들
혈청 샘플들로부터의 항-HA IgG 항체 역가들은 A/Brisbane/10/2007(H3N2), A/California/07/2009(H1N1pdm), B/Wisconsin/01/2010(Yamagata 혈통), 및 B/Brisbane/60/2008(Victoria 혈통)에 대해 ELISA에 의해 결정되었다. 간략하게, ELISA 플레이트(plate)들은 각 변종의 재조합 HA 단백질에 의해 코팅되었고, BSA(bovine serum albumin)에 의해 차단되었으며, 샘플들이 적용되었다. 흰담비 IgG 항체들은 항-흰담비 IgG-염소 항체들(KPL, Inc., Gaithersburg, MD)와 SureBlue TMB(KPL, Inc.) 기질로 라벨이 붙여진 홍당무 과산화 효소에 의해 검출되었다.
예상된 것처럼, 면역력이 있는 그룹들 각각에서의 흰담비들은 그것의 각각의 항원에 대한 혈청에서의 항-HA 항체의 상당한 상승을 보여주었다. 더 중요하게는, 4가 M2SR 그룹들이 4개의 항원(도 10) 모두에 대한 혈청에서의 항-HA 항체의 상당한 상승이 다가 제형의 성분들 사이에 간섭이 존재하지 않음을 가리킨다는 것을 증명하였다. 이러한 데이터는 M2SR, BM2SR, 및 4가 M2SR 바이러스들이 흰담비들에서 상당한 면역 반응들을 이끌어낸다는 것을 암시한다.
혈청 샘플들은 HAI 평가에 의해, ELISA가 검출한 항체들의 기능적 활동을 증명하기 위해 분석되었다. 혈청 샘플들은 비특정 적혈구응집반응의 억제제들을 제거하기 위해, 수용체 파괴 효소(RDE)(Denka Seiken, Tokyo, Japan)로 처리되었다. RDE는 제조업체 지침에 따라 재구성되었다. 혈청은 RDE에서 1:3으로 희석되었고 37℃±2℃의 물 욕조에 18-20시간 배양되었다. 동등한 부피의 2.5%(v/v)의 구연산나트륨을 첨가한 후 샘플들이 56±2℃의 물욕탕(water bath)에서 30±5분간 배양되었다. RDE 처리 후 1:10의 최종 혈청 희석액에 0.85% NaCl이 각각의 샘플에 첨가되었다. 희석된 샘플들은 인산염 완충된 식염수(PBS)에 중복하여 4개의 2배(two-fold) 희석액(1:10 내지 1:80)으로 희석된 후 A/Brisbane/10/2007(H3N2), A/Californal/07/2009(H1N1Pdm), B/Wisconsin01/10(Yaagata 혈통) 및 B/Brisbane/60/2008(Victoria 혈통) 인플루엔자 바이러스들의 4개의 적혈구 응집 유닛들로 배양되었다. 배양 후 각각의 샘플에 0.5%의 조류 적혈구들이 추가되어 30±5분간 배양하였다. 그 후 적혈구 응집반응의 존재 또는 부재가 기록되었다.
도 11a 및 도 11b에 도시된 바와 같이, 모든 M2SR 면역화된 흰담비들은 그것들 각각의 테스트 바이러스에 대한 상당한 HAI 항체 역가들을 증명하였다. 4가 M2SR은 모든 4개의 테스트 바이러스들에 대한 상당한 HAI 항체 역가들을 증명하였다. CDC는 40의 혈청 HAI 항체 역가들이 개체군들에서 인플루엔자 감염이나 질병에 대한 위험을 최소 50% 감소시키는 것과 관련이 있다고 밝혔다. 따라서 이러한 결과는 바이러스들이 4가 백신으로 함께 제조되었을 때 유지되는 보호 면역 반응들을 M2SR과 BM2SR 바이러스들이 이끌어낸다는 것을 암시한다.
A/California/09/2009(H1N1pdm)로 공격한 후 모든 동물에서 6일째 공격 후 5 내지 8%의 체중 감소가 관찰되었다. 14일간의 관찰 기간 내내 OPTI-MEMTM이 관리하는 흰담비들(위약 그룹)이 가장 많은 체중(15%)을 잃어버린 것을 제외하고, 동물 체중은 초기 체중보다 낮게 유지되었다. 백신 접종된 흰담비들 중에서의 체중 감량은 백신의 항원에 좌우되었다. 일치하는 H1N1pdm M2SR 또는 4가 M2SR(H1N1pdm M2SR을 함유하는)을 받은 흰담비들은 임의의 상당한 체중 감소를 나타내지 않았다. 이질성 H3N2 M2SR 또는 BM2SR 백신들을 받은 흰담비들은 약 5-8%의 체중 감소를 나타냈다.
세비액 샘플들은 모든 흰담비로부터 1, 3, 5, 7일 공격시에 채취되었으며, MDCK 셀들에서의 플라크 평가에 의한 공격 바이러스의 존재 여부를 평가하였다. 도 12는 4가 M2SR이 1가 상동 H1N1pdm M2SR과 유사한 방식으로 공격 바이러스 복제를 제어했음을 보여준다. 위약과 BM2SR 1가 백신들은 감염 후 5일까지 최소 5건(log)의 바이러스가 검출되면서 공격 바이러스를 제어하지 못했다. 이질적 H3N2 M2SR 그룹은 상동 H1N1과 쿼드(Quad) M2SR과 같은 공격 바이러스를 제거하지 않았지만 위약 그룹에 대한 바이러스 복제를 부분적으로 제어했다.
4마리의 흰담비에서 3일째에 감염 후의 수확한 호흡 기관들은 공격 바이러스의 제어를 증명했다. H1N1 M2SR 및 쿼드 M2SR은 도 13a, 도 13b 및 도 13c에 도시된 바와 같이 공격 바이러스가 상부 및 하부 호흡 조직들(비갑개, 기관, 폐)에서 복제하는 것을 전혀 허용하지 않았다. 이와는 대조적으로, 그러한 공격 바이러스는 다른 그룹들의 상부 호흡 조직들(비갑개와 기관들)에 있는 높은 역가들로 성장했다. 하부 호흡 계통(폐)에서, 1가 M2SR 백신들은 위약 그룹에 상대적인 공격 바이러스를 제어했다. 이러한 결과는 동질적이고 4가 M2SR이 인플루엔자 감염이 스스로 확립되는 것을 막고 관련이 없는 M2SR 백신들이 감염의 심각성(severity)을 감소시킨다는 것을 암시한다.
D. 결론
이 예는 4가 M2SR 백신 바이러스의 비강 내 투여가 임의의 백신-관련된 부작용 사례들(예컨대, 상승된 체온, 체중 손실 또는 임상 증상들)과 연관되지 않았음을 보여준다. 이들 결과들은 4가 M2SR 바이러스가 다가 제형에 함유된 각 변종에 대한 보호 면역 반응을 이끌어내며, 비강 내 인플루엔자 백신으로서 유용하다는 것을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> FLUGEN, INC. <120> IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AGAINST INFLUENZA <130> 090248-0163 <140> PCT/US2018/019653 <141> 2018-02-26 <150> 62/464,019 <151> 2017-02-27 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 976 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 agcaaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact 60 ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120 tgcagggaag aacaccgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180 gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240 aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa 300 catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc 360 caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata 420 caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga 480 acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 540 aatcagacat gagaacagaa 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aatggaagtg 720 ctaaaacaga gctctatggg aaattcagct cttgtgagga aatacttata agcccaattt 780 tcactgtatt tcttactatg catttaagca aattgtaatc aatgtcagtg aataaaactg 840 gaaaaagtgc gttgtttcta ct 862 <210> 12 <211> 1191 <212> DNA <213> Influenza B virus <400> 12 agcagaagca cgcactttct taaaatgtcg ctgtttggag acacaattgc ctacctgctt 60 tcactaatag aagatggaga aggcaaagca gaactagctg aaaaattaca ctgttggttc 120 ggtgggaaag aatttgacct agattctgct ttggaatgga taaaaaacaa aaggtgccta 180 actgatatac aaaaagcact aattggtgcc tctatatgct ttttaaaacc caaagaccaa 240 gaaagaaaaa ggagattcat cacagagccc ctgtcaggaa tgggaacaac agcaacaaag 300 aagaaaggcc taattctagc tgagagaaaa atgagaagat gtgtaagctt tcatgaagca 360 tttgaaatag cagaaggcca cgaaagctca gcattactat attgtcttat ggtcatgtac 420 ctaaaccctg aaaactattc aatgcaagta aaactaggaa cgctctgtgc tttatgcgag 480 aaacaagcat cgcactcgca tagagcccat agcagagcag caaggtcttc ggtacctgga 540 gtaagacgag aaatgcagat ggtttcagct atgaacacag caaagacaat gaatggaatg 600 ggaaagggag aagacgtcca aaaactagca gaagagctgc aaaacaacat tggagtgttg 660 agatctctag gagcaagtca aaagaatgga gaaggaattg ccaaagatgt aatggaagtg 720 ctaaaacaga gctctatggg aaattcagct cttgtgagga aatacttata atgctcgaac 780 cacttcagat tctttcaatt tgttctttca ttttatcagc tctccatttc atggcttgga 840 caatagggca tttgaatcaa ataagaagag gggtaaacct gaaaatacaa ataaggaatc 900 caaataagga ggcaataaac agagaggtgt caattctgag acacaattac caaaaggaaa 960 tccaagccaa agaaacaatg aagaaaatac tctctgacaa catggaagta ttgggtgacc 1020 acatagtagt tgaagggctt tcaactgatg agataataaa aatgggtgaa acagttttgg 1080 aggtggaaga attgcaatga gcccaatttt cactgtattt cttactatgc atttaagcaa 1140 attgtaatca atgtcagtga ataaaactgg aaaaagtgcg ttgtttctac t 1191 <210> 13 <211> 294 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 13 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgcct atcagaaacg aatgggggtg cagatgcaac 60 ggttcaagtg atcctctcac tattgccgca aatatcattg ggatcttgca cttgacattg 120 tggattcttg atcgtctttt tttcaaatgc atttaccgtc gctttaaata cggactgaaa 180 ggagggcctt ctacggaagg agtgccaaag tctatgaggg aagaatatcg aaaggaacag 240 cagagtgctg tggatgctga cgatggtcat tttgtcagca tagagctgga gtaa 294 <210> 14 <211> 421 <212> DNA <213> Influenza B virus <400> 14 atgctcgaac cacttcagat tctttcaatt tgttctttca ttttatcagc tctccatttc 60 atggcttgga caatagggca tttgaatcaa ataagaagag gggtaaacct gaaaatacaa 120 ataaggaatc caaataagga ggcaataaac agagaggtgt caattctgag acacaattac 180 caaaaggaaa tccaagccaa agaaacaatg aagaaaatac tctctgacaa catggaagta 240 ttgggtgacc acatagtagt tgaagggctt tcaactgatg agataataaa aatgggtgaa 300 acagttttgg aggtggaaga attgcaatga gcccaatttt cactgtattt cttactatgc 360 atttaagcaa attgtaatca atgtcagtga ataaaactgg aaaaagtgcg ttgtttctac 420 t 421

Claims (1)

  1. 면역원성 조성물(immunogenic composition)에 있어서,
    상기 조성물은 적어도 2개의 인플루엔자 균주(influenza strain)들로부터의 재조합 바이러스들을 포함하는 다가 조성물(multivalent composition)인, 면역원성 조성물.
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