CN106559986A - 多价流感病毒样颗粒(vlp)及其作为疫苗的用途 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了组合物，其包含病毒样颗粒(VLP)的混合物，所述病毒样颗粒表达不同的单个的流感血凝素(HA)蛋白，所述流感血凝素(HA)蛋白引起对多种流感病毒具有广泛反应性的免疫应答。例如，所述组合物可包含至少两种不同的流感VLP，含有第一HA多肽的第一VLP和含有第二流感HA多肽的第二VLP，其中所述第一和第二HA多肽是不同的亚型和/或来自不同的流感病毒，以及药学上可接受的载体和/或佐剂。提供了使用所公开的聚合流感VLP组合物以刺激针对流感病毒的免疫应答——例如，作为大流行前疫苗或季节性疫苗——的方法。

Description

多价流感病毒样颗粒(VLP)及其作为疫苗的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年6月20日提交的美国临时申请62/014,821的优先权，所述临时申请以引用的方式纳入本文。

技术领域

本公开内容涉及组合物，其包含病毒样颗粒(VLP)的混合物，所述病毒样颗粒表达单独的流感血凝素(HA)蛋白，所述流感血凝素蛋白广泛地引起对多种流感病毒的反应性免疫应答，以及涉及所述组合物刺激免疫应答的用途，例如作为疫苗的用途。

背景技术

流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成员。有三种类型的流感病毒，被命名为A型流感、B型流感和C型流感。A型流感病毒不仅感染人类，还感染鸟类和哺乳动物的许多物种，根据它们的表面蛋白——血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)——的亚型对A型流感病毒进行分类。A型流感病毒体包含节段负义RNA基因组，其编码以下蛋白：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白1(M1)、质子离子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、PB1-F2、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)、PA-X、非结构蛋白1(NS1)和非结构蛋白2(NS2)。HA、NA、M1和M2与膜结合，而NP、PB1、PB2、PA是核壳结合蛋白，PB1-F2、NS2和PA-X蛋白是非结构蛋白。HA和NA蛋白是包膜糖蛋白，其中HA负责病毒附着以及病毒颗粒侵入至细胞内，NA负责病毒释放，并且HA和NA蛋白是病毒中和作用和保护性免疫的主要免疫显性表位的来源。

流感导致的公共健康负担巨大，在美国平均住院例数＞200000每年，在美国季节性流感导致的死亡率为3000至49000例每年。在流感大范围流行的年份，这些总数可急剧升高。在1918年，记载的最严重的流感流行中，在美国675000人死亡，全球最高达5000万人死亡。另外，具有大多数人对其没有任何免疫力的HA和NA亚型的新型流感毒株可在动物(例如鸟类和猪)中出现并传播至人类。可接着发生源自动物的疾病爆发流行，其可能导致大范围流行。在过去的几年中，猪H1N1病毒适应了人类而导致2009年的大流行。适应鸟类的H5N1、H9N2、H7N9、H10N8和H6N1毒株均已导致了人类感染，其通常具有显著的死亡率。

自2009年大流行以来，已观察到了源自动物的H5N1、H7N9、H3N2v感染以及最近的H6N1和H10N8感染，这增强了对广泛的反应性疫苗或通用疫苗方法的需求，这种疫苗超越了针对确定的循环季节性变体的保护，其可通过充当大流行前疫苗而有助于预防或减轻未来的大流行。经肌肉内递送的灭活疫苗不产生稳健的粘膜免疫应答，而流感减毒活疫苗是有问题的，因为它们是过度减毒的，具有受限的用法指导原则，还因为由于与野生型病毒重配的风险而不能使用表达不存在于季节性毒株中的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)亚型的活病毒。因此，需要能够产生保护性免疫应答的广泛的反应性疫苗，而不需要利用减毒活病毒。通用流感疫苗方法所面对的主要困难是不同的HA和NA亚型的抗原变异性。通用疫苗能够充当大流行前疫苗，不仅提供针对季节性流感病毒毒株的保护，还提供针对动物源性流感感染的保护，或同时提供两者。

发明内容

本文提供了安全的、广泛的反应性疫苗，该疫苗通过鼻内递送表达单独的流感血凝素(HA)肽(例如来自A型流感或B型流感的HA肽)的病毒样颗粒(VLP)的混合物而能够同时引发粘膜免疫和全身免疫。在一些实例中，本文中称为多价VLP的VLP混合物包括各自表达不同HA亚型的VLP或VLP群体(例如两个VLP群体，各自表达不同的HA亚型)，并且还可包括表达神经氨酸酶(NA)亚型的VLP或VLP群体(例如两个VLP群体，各自表达不同的NA亚型)。不希望局限于特定的理论，提出了HA头部和茎部结构域中的保守表位使得可以生产交叉反应性疫苗。多价组合物中单独的VLP上的不同HA(在一些实例中为NA)亚型的表达促进了对在不同HA亚型之间保守的茎部抗原和HA受体结合结构域抗原的应答，并且在一些实例中刺激了NA抗原的免疫原性，因为NA抗原不依赖于免疫显性的HA而在VLP上表达。使用这些多价VLP所产生的免疫应答能够提供针对多种流感病毒的广泛的保护性免疫。在一个实例中，多价VLP包括各自表达来自A型流感的不同HA肽的一种或多种VLP群体，在一些实例中还包括各自表达来自A型流感的不同NA肽的一种或多种VLP群体，其中所述VLP可表达或可不表达A型流感基质蛋白(例如M1和/或M2)。这样的多价VLP群体可用于提供广泛的保护性“通用”流行前疫苗。在另一个实例中，多价VLP包括两种或多种VLP群体，其中一种VLP群体表达来自A型流感的HA肽(例如16种HA蛋白中任一种之一)，且第二VLP群体表达来自B型流感的HA肽，在一些实例中还包括表达来自A型流感的NA肽(例如9种NA蛋白中任一种之一)的VLP群体，并且第二VLP群体表达来自B型流感的HA肽，其中所述VLP可表达或可不表达A型流感和/或B型流感基质蛋白。这样的多价VLP群体(其包括A型和B型流感VLP)可用于提供广泛的保护性季节性疫苗。因此，本公开内容通过添加B型流感HAVLP而提供了广泛的保护性“通用”流行前疫苗和更广泛的反应性季节性疫苗。

本文提供了包含至少两种不同的A型流感VLP的组合物，第一VLP具有第一A型流感HA多肽，且第二VLP具有第二A型流感HA多肽，其中所述第一和第二HA多肽是不同的亚型。在一些实例中，所述第一A型流感HA多肽是HA亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13或H16，且所述第二A型流感HA多肽是HA亚型H3、H4、H7、H10、H14或H15。本领域技术人员将理解，所述组合物可包含额外的VLP或VLP群体。例如，所述组合物可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种不同的VLP或VLP群体，各个群体具有或表达不同的HA亚型。这样的组合物也可包含药学上可接受的载体、佐剂或两者。在一些实例中，将所述公开的组合物配制为用于粘膜免疫，例如鼻内给药。还提供了包含所公开的组合物的注射器或容器。在一些实例中，所述包含A型流感VLP的组合物可用作流行前疫苗。

本文还提供了包含至少两种不同的B型流感VLP的组合物，第一VLP具有第一B型流感HA多肽且第二VLP具有第二B型流感HA多肽，其中所述第一和第二HA多肽是B型流感HA的不同抗原谱系(antigenic lineage)。在一些实例中，所述第一B型流感HA多肽来自Yamagata系HA谱系，且所述第二B型流感HA多肽来自Victoria系HA谱系。本领域技术人员将理解，所述组合物可包含额外的VLP或VLP群体。例如，所述组合物可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种不同的VLP或VLP群体，各个群体具有或表达不同的A型流感HA亚型或B型流感HA谱系。这样的组合物也可包含药学上可接受的载体、佐剂或两者。在一些实例中，将所述公开的组合物配制为用于粘膜免疫，例如鼻内给药。还提供了包含所公开的组合物的注射器或容器。在一些实例中，所述同时包含A型流感和B型流感VLP的组合物可用作季节性疫苗。

本文提供了包含至少两种不同的流感VLP的组合物，第一VLP具有第一A型流感HA多肽且第二VLP具有第一B型流感HA多肽。在一些实例中，所述第一A型流感HA多肽是HA亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13或H16且所述第二B型流感HA多肽是Victoria系或Yamagata系B型流感HA。本领域技术人员将理解，所述组合物可包含额外的VLP或VLP群体。例如，所述组合物可包括至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种不同的VLP或VLP群体，各个群体具有或表达不同的A型流感病毒HA亚型或B型流感病毒HA型。这样的组合物也可包含药学上可接受的载体、佐剂或两者。在一些实例中，将所述公开的组合物配制为用于粘膜免疫，例如鼻内给药。还提供了包含所公开的组合物的注射器或容器。在一些实例中，所述包含A型流感和B型流感VLP的组合物可用作季节性疫苗。

在一些实例中，公开的组合物还包含具有或表达A型或B型流感神经氨酸酶(NA)多肽的VLP，或可包含具有或表达A型流感NA多肽的第一VLP群体以及具有或表达B型流感NA多肽的第二VLP群体。因此，在一些实例中，公开的组合物还包含两种或更多种不同的VLP或VLP群体，各个具有或表达不同的NA多肽，例如A型流感NA亚型或B型流感病毒Victoria系和/或Yamagata系NA多肽。

在一些实例中，表达HA或NA的VLP包含其他蛋白，例如流感基质蛋白，例如A型流感M1、流感M2，或两者(例如在包含A型流感HA或NA的VLP中)，或B型流感基质蛋白(例如M1、BM2或两者)(例如在包含B型流感HA或NA的VLP中)。

在一些实例中，所述组合物中的VLP是通过使用转染哺乳动物细胞或感染昆虫细胞的方法而产生的。例如，可通过采用编码HA多肽的载体或病毒或者编码NA多肽的载体转染哺乳动物宿主细胞(或感染昆虫细胞)来产生VLP。任选地，还采用编码流感基质蛋白(例如A型流感M1蛋白、M2蛋白或两者；或B型流感M1、BM2或两者)的载体或病毒转染/感染细胞。然而，在一些实例中，从与HA或NA蛋白相同的载体或病毒中表达所述基质蛋白。在足以使HA、NA和/或基质蛋白表达的条件下孵育细胞。

提供了使用公开的多价VLP组合物的方法。在一个实例中，所述组合物用于在受试者中引起对流感病毒的免疫应答。在一个实例中，所述VLP包括表达来自A型流感的HA的VLP群体(在一些实例中也包括表达NA的VLP群体)，并且所述疫苗可用作流行前疫苗。在另一个实例中，所述VLP包括表达来自A型流感和B型流感的HA的VLP群体(在一些实例中也包括表达NA的VLP群体)(即一个VLP群体表达A型流感HA，另一个VLP群体表达B型流感HA)，并且所述疫苗可用作季节性疫苗。

所述方法可包括将治疗有效量的公开的组合物给予受试者，从而在受试者中引起对流感病毒的免疫应答。在一些实例中，引起针对A型流感、B型流感或两者的免疫应答，例如针对H1N1(例如1918 H1N1或2009 H1N1)、H2N1、H2N2(例如1957H2N2)、H3N2(例如1968H3N2)、H5N1、H6N1、H7N9、H9N2、H10N8、H10N1以及主要的B型流感病毒抗原谱系(例如Yamagata系和/或Victoria系)中的一种或多种的免疫应答。在一个实例中，所述组合物用于使受试者对流感病毒(例如A型流感、B型流感或两者)免疫。所述方法可包括将治疗有效量的公开的组合物给予受试者，从而使受试者对流感病毒免疫。在一些实例中，使受试者对H1N1(例如1918 H1N1或2009 H1N1)、H2N2(例如1957 H2N2)、H2N1、H3N2(例如1968 H3N2)、H5N1、H6N1、H7N9、H9N2、H10N8、H10N1以及主要的B型流感病毒抗原谱系(例如Yamagata系和/或Victoria系)中的一种或多种免疫。在一些实例中，经鼻内给予所述组合物。在一些实例中，所给予的组合物包括于组合物中的至少两种不同的VLP，每种约1μg至约25μg。在一些实例中，所述受试者为可能变得感染(或感染了)A型流感的受试者，例如哺乳动物或鸟类，如人、鸡、水禽、火鸡、猪、马、狗或猫，或或者可能变得感染(或感染了)B型流感的受试者，例如人或海豹。

上述内容和本公开内容的其他目的和特征将从以下参考附图进行的详细描述中变得更加显而易见。

附图说明

图1A-1C提供了本文提供的示例性流感多价VLP组合物的示意图。

图2A-2C是数字图像，其示出了表达M1和M2以及(A)和(B)NA或(C)HA的VLP的电子显微镜图像。

图3是存活曲线，其示出了采用同源NA或采用异源N1进行NA VLP接种的动物的存活率为100％，而假接种组中无存活。采用仅包含NA的VLP对小鼠进行经鼻内接种，所述VLP表达高致病性禽流感攻击病毒(challenge virus)A/Vietnam/1203/2004(H5N1)[VN/1203]的同源N1 NA或2009年大范围流行的病毒A/California/04/2009(H1N1)[CA/09]的NA，在第3周对小鼠进行加强免疫，然后采用10x小鼠50％致死剂量(MLD₅₀)的VN/1203进行攻击。来自Easterbrook等人，Virology，432：39-44，2012。

图4是存活曲线，其示出了来自两个接种组的接种了多价HA VLP的动物的存活率为100％。采用仅包含HA的VLP的多价混合物经鼻内接种小鼠，所述VLP表达4种不同的HA亚型(H2、H3、H5和H7)。对小鼠进行接种以使一个组首先接受H2和H5 VLP并在第3周用H3和H7VLP的混合物进行加强免疫。第二组首先采用H3和H7 VLP进行接种，然后采用H2和H5 VLP进行加强免疫。第三组进行假接种。在第6周，采用致死剂量(10xMLD₅₀)的1918 H1N1 A型流感病毒来攻击所有动物。注意到，采用不包含H1亚型的HA VLP的多价疫苗混合物，从H1亚型病毒的致死性攻击中观察到完全的异亚型(heterosubtypic)保护。

图5是存活曲线，其示出了来自两个接种组的接种了多价HA VLP的动物的存活率为100％。在两组中，采用仅包含HA的VLP的多价混合物对小鼠进行经鼻内接种(组1：H1、H2、H3和H7；组2：H1、H3、H5和H7)，所述VLP表达4种不同的HA亚型。对小鼠进行接种以使一个组首先接受H1和H3VLP并在第3周采用H2和H7VLP的混合物进行加强免疫。第二组首先采用H3和H5VLP进行接种，然后采用H1和H7VLP进行加强免疫。第三组进行假接种。在第6周，采用致死剂量(10xMLD₅₀)的H6N1 A型禽流感病毒来攻击所有动物。注意到，采用不包含H6亚型的HAVLP的多价疫苗混合物，从H6亚型病毒的致死性攻击中观察到完全的异亚型保护。

图6是存活曲线，其示出了在添加佐剂或不添加佐剂的情况下，接种了单价H1 VLP的动物的存活率为100％。

图7为示出了接受含MPL佐剂的VLP疫苗(右)的小鼠具有比不接受佐剂(左)的小鼠更高的中和效价的图。

图8A-8C为示出了VLP疫苗接种保护小鼠免受各HA亚型的致命流感的攻击的图。(A)多价疫苗接种完全保护针对采用表达相同(同源)HA蛋白的流感病毒的攻击。采用1918H1N1(i，ii；n＝5)或H7N1(iii，iv；n＝5)攻击小鼠。(B)接种的小鼠受到保护，免受采用H5N1(i，ii；n＝10)或H7N9(iii，iv；n＝15)病毒的亚型内(异源)攻击。(C)采用异亚型A型流感病毒(H2N1(i，ii；n＝10)、H6N1(iii，iv；VLP n＝24，假接种组n＝15)、H10N1(v，vi；n＝10)或H11N1(vii，viii；VLP n＝10；假接种组n＝5))攻击被接种的小鼠。

图9A-9D为示出了在VLP接种的小鼠的肺中病毒复制减少的图。对小鼠进行接种并采用(A)H7N9、(B)H2N1、(C)H6N1或(D)H10N1攻击。在感染后第3天，采集肺脏并通过噬菌斑试验测定效价。

图10A-10B为示出了VLP疫苗接种的保护性效力的图。(A)VLP疫苗接种保护小鼠免受接种后6个月的致命攻击。对8周龄小鼠进行VLP接种(实心正方形；实线)或假接种(圆圈；点线)。在首次接种后6个月，采用H7N9(i，ii；n＝5)或H10N1(iii，iv；n＝5)攻击小鼠并在攻击后的14天中记录体重。(B)疫苗接种保护老龄小鼠免受致命的攻击。对8月龄小鼠进行接种。在接种后50天采用H10N1嵌合流感病毒攻击小鼠。在感染后的14天中监测体重减轻(i)和存活率(ii)(n＝5)。在感染后第3天，采集肺脏(iii)并通过噬菌斑试验测定效价(n＝5)。与假接种小鼠相比，在经接种的小鼠中体重减轻(Ai；Aiii；Bi)和肺部效价(Biii)显著降低(p＜0.05)。

序列表

使用如37 C.F.R.1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码示出了在所附序列表中列出的核酸序列和氨基酸序列。仅示出了各核酸序列的一条链，但是应理解为通过对所示链的任何提及而包含互补链。

SEQ ID NO：1和2分别为示例性的A型流感HA亚型1(H1)核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：CY017275.1和ABK40634.1)。编码序列为SEQ ID NO：1的核苷酸19-1719。信号肽为氨基酸1-17，结构域HA1为氨基酸18-344，且结构域HA2为氨基酸345-566。

SEQ ID NO：3和4分别为示例性的A型流感HA亚型1(H1)核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：AF117241.1和AAD17229.1)。编码序列为SEQ ID NO：3的核苷酸1-1701。信号肽为氨基酸1-19，结构域HA1和HA2为氨基酸20-566。

SEQ ID NO：5和6分别为示例性的A型流感HA亚型2(H2)核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：CY018877.1和ABM21949.1)。编码序列为SEQ ID NO：5的核苷酸29-1717。信号肽为氨基酸1-15，结构域HA1为氨基酸16-340，且结构域HA2为氨基酸341-562。

SEQ ID NO：7和8分别为示例性的A型流感HA亚型2(H2)核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：J02127.1和AAA43185.1)。编码序列为SEQ ID NO：7的核苷酸47-88(信号肽)、CDS核苷酸89-1060和核苷酸1064-1729。信号肽为氨基酸2-15，结构域HA1为氨基酸16-339，且结构域HA2为氨基酸341-562。

SEQ ID NO：9和10分别为示例性的A型流感HA亚型3(H3)核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：CY019197.1和ABM66853.1)。信号肽的CDS为SEQ ID NO：9的核苷酸9-56，HA1为核苷酸57-1043，且HA2为核苷酸1044-1706。信号肽为氨基酸1-16，结构域HA1为氨基酸17-345，且结构域HA2为氨基酸346-566。

SEQ ID NO：11和12分别为示例性的A型流感HA亚型5(H5)核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：CY053877.1和ADA82200.1)。信号肽为核苷酸8-54，CDS HA1为核苷酸44-1032，且HA2为核苷酸1033-1698。信号肽为氨基酸1-16，HA1为17-342，且HA2为343-564。

SEQ ID NO：13和14分别为示例性的A型流感HA亚型7(H7)核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：CY022749.1和ABR37495.1)。信号肽的编码序列为核苷酸6-59，CDSHA1为核苷酸60-1022，且HA2为核苷酸1023-1685。信号肽为氨基酸1-18，结构域HA1为氨基酸19-339，且结构域HA2为氨基酸340-560。

SEQ ID NO：15和16分别为示例性的A型流感NA亚型1(N1)核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：FJ966084.1和ACP41107.1)。

SEQ ID NO：17和18分别为示例性的A型流感NA亚型1(N1)核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：HM006761.1和ADD97097.1)。CDS为SEQ ID NO：17的核苷酸21-1370。

SEQ ID NO：19为示例性的A型流感基质(M1和M2)核酸序列(GenBank登录号：CY002697.1)。M1的编码序列为核苷酸22-780，M2的编码序列为连接核苷酸(join nt)(22..47，736..1003)。

SEQ ID NO：20为示例性的A型流感基质(M1)蛋白序列(GenBank登录号：ABA12718.1)。

SEQ ID NO：21为示例性的A型流感基质(M2)蛋白序列(GenBank登录号：ABA12719.1)。

SEQ ID NO：22和23分别为来自B/Yamagata的示例性的B型流感HA核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：CY018765.1和ABL77255.1)。编码序列为SEQ ID NO：1的核苷酸18-1769。结构域HA为氨基酸18-583。

SEQ ID NO：24和25分别为来自B/Victoria的示例性的B型流感HA核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：CY152650.1和AGX19007.1)。编码序列为SEQ ID NO：1的核苷酸16-1773。结构域HA为氨基酸18-585。

SEQ ID NO：26和27分别为来自B/Wyoming的示例性的B型流感HA核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：CY187812.1和AIC73926.1)。编码序列为SEQ ID NO：1的核苷酸1-1755。结构域HA为氨基酸18-584。

SEQ ID NO：28和29分别为来自B/Victoria的示例性的B型流感NA核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：AB036870.1和BAB32609.1)。NA序列由核苷酸8-1408编码。

SEQ ID NO：30和31分别为示例性的B型流感NA核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：NC_002209.1和NP_056663.1)。NA序列由核苷酸8-1408编码。

SEQ ID NO：32和33分别为来自B/Kanagawa的示例性的B型流感NA核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：D14855.1和BAA03583.1)。NA序列由核苷酸8-1408编码。

SEQ ID NO：34和35分别为来自B/Shangdong的示例性的B型流感基质核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：AY044171.1和AAK95902.1)。基质序列由核苷酸1-747编码。

SEQ ID NO：36和37分别为来自B/Victoria的示例性的B型流感基质核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：AY504605.1和AAT69429.1)。基质序列由核苷酸25-771编码。

SEQ ID NO：38和39分别为来自B/Yamagata的示例性的B型流感基质核酸和蛋白序列(GenBank登录号分别为：AB120274.1和BAD29821.1)。基质序列由核苷酸1-747编码。

具体实施方式

除非另外解释，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。分子生物学中普通术语的定义可参见BenjaminLewin，Genes V，Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(eds.)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology andBiotechnology：a Comprehensive Desk Reference.VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。

单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数指代物，除非上下文中另外明确地说明。类似地，术语“或”意欲包括“和”，除非上下文中另外明确地说明。因此，“包括A或B”意指包括A，或B，或A和B。还应理解，所给出的核酸或多肽的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值是近似的，并且提供它们是为了进行描述。尽管与本文所描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可用于实践或检验本公开内容，下面描述了适合的方法和材料。所有出版物、专利申请、专利、登录号或本文提及的其他参考文献以引用的方式全文纳入。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括术语解释)为准。此外，所述材料、方法和实施例仅为说明性的，不意欲进行限制。

为了有助于本公开内容的各实施方案的综述，提供了以下具体术语的解释：

佐剂：非特异性地增强对抗原(例如，流感HA和/或NA)的免疫应答的物质或载体。佐剂可与本文公开的VLP一起使用，例如作为本文提供的流感多价VLP药物组合物的一部分。佐剂可包括矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液，抗原被吸附到所述矿物质上；或可包括油包水乳剂，其中抗原溶液乳化在矿物油中(例如弗氏不完全佐剂)，有时包含灭活的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的那些)也可用作佐剂(例如，参见美国专利第6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116、6,339,068、6,406,705和6,429,199号)。佐剂还包括生物分子，例如共刺激分子。示例性的生物佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L和41 BBL。在一个实例中，所述佐剂为一种或多种toll样受体(TLR)激动剂，例如TLR1/2(其可以是合成的配体)(例如Pam3Cys)、TLR2(例如CFA、Pam2Cys)、TLR3(例如polyI：C、poly A：U)、TLR4(例如MPLA、脂质A和LPS)、TLR5(例如鞭毛蛋白)、TLR7(例如，gardiquimod、咪喹莫特(imiquimod)、洛索立宾(loxoribine)，瑞喹莫德)、TLR7/8(例如R0848)、TLR8(例如咪唑并喹啉类、ssPolyU、3M-012)、TLR9(例如ODN 1826(B型))、ODN 2216(A型)、CpG寡核苷酸和/或TLR11/12(例如肌动蛋白抑制蛋白)的激动剂。在一个实例中，所述佐剂为脂质A，例如来自肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)血清型Minnesota Re 595(例如，Sigma Aldrich目录编号#L6895)的单磷酰脂质A(MPL)。

给予：如本文所使用，将组合物(例如一种包含VLP的组合物)给予受试者意指给予、应用所述组合物或使所述组合物与受试者接触。可通过多种途径的任一种实现给予，所述途径例如局部、口服、皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内、鞘内和真皮内。在一个实例中，给予是经粘膜给予的，例如口服、鼻内、经肺、经直肠或经阴道。

抗体：由B淋巴细胞产生的具有特定氨基酸序列的免疫球蛋白分子。在人和其他动物中抗体由特定的抗原(免疫原，例如HA和NA)引起。抗体的特征在于，以一些可证明的方式与抗原发生特异性反应，抗体和抗原各自依据它们中的另一种来定义。“引起抗体应答”是指抗原或其他分子诱导抗体产生的能力。

抗原或免疫原：能够在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收到动物中的组合物。抗原与特异性体液免疫或细胞免疫的产物(包括由异源免疫原诱导的那些)反应。在公开的组合物和方法的一些实施方案中，所述抗原为流感HA蛋白、流感NA蛋白或两者。如本文所使用的，“免疫原组合物”是包含抗原(例如具有不同的流感HA蛋白的多个VLP)的组合物。

血凝素(HA)：一种流感病毒表面糖蛋白。HA介导病毒颗粒结合至宿主细胞以及随后病毒进入宿主细胞。HA也导致红细胞凝集。多种流感HA蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列是本领域已知的并且可为公众获得，例如保存于数据库的那些。HA(以及NA)是两种主要的流感病毒抗原决定簇之一。

表1中提供了可从数据库获得的来自A型流感的16种HA亚型和来自B型流感的HA实例的示例性HA序列(提供了登录号)。

表1：可用于公开的VLP的示例性HA序列

免疫应答：免疫系统的细胞(例如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞)对刺激物如抗原或疫苗(例如A型或B型流感HA和/或NA蛋白)的反应。免疫应答可包括宿主防御应答中涉及的机体的任何细胞，包括例如，分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于，固有免疫应答或炎症。如本文所使用的，保护性免疫应答是指保护受试者免受感染(预防感染或预防与感染相关的疾病的发展)的免疫应答。测量免疫应答的方法是本领域中公知的，包括，例如测量淋巴细胞(例如B细胞或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等。其他实例是本领域已知的并且在本文中提供。

使......免疫：使受试者(例如哺乳动物)受到保护而免于传染性疾病(例如流感)，例如通过疫苗接种。

流感病毒：属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的节段负链RNA病毒。有三种类型的流感病毒，A型、B型和C型。

A型流感病毒(IAV)：一种负义、单链、节段RNA病毒，其具有编码11种蛋白的8个RNA节段(PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA和NA)，所述11种蛋白包括RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、血凝素(亚基HA1和HA2)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)。该病毒倾向于通过错误蛋白聚合酶以及通过节段重配而快速进化。A型流感的宿主范围是非常多变的，包括人类、鸟类(例如鸡和水生鸟类)、马、海洋哺乳动物、猪、蝙蝠、小鼠、雪貂、猫、虎、豹和狗。在动物中，大多数A型流感病毒导致呼吸道和消化道的轻度局限性感染。但是，高致病性A型流感毒株如H5N1在家禽中导致全身性感染，其中致死率可达到100％。被A型流感感染的动物通常充当流感病毒的贮库(reservoir)，已显示某些亚型跨越物种障碍而传播至人类。

根据编码表面糖蛋白——即病毒附着和细胞释放所需的血凝素

(HA)和神经氨酸酶(NA)——的两个基因的抗原活性区中的等位基因变异，可将A型流感病毒分成亚型。目前有18种不同的A型流感病毒HA抗原亚型(H1至H18)和11种不同的A型流感病毒NA抗原亚型(N1至N11)。H1-H16和N1-N9存在于野生鸟类宿主中并且对人类构成流行病威胁。已记载了H17-H18和N10-N11存在于蝙蝠宿主中，并且目前未被认为对人类构成流行病威胁。

A型流感的具体实例包括但不限于：H1N1(例如1918 H1N1)、H1N2、H1N7、H2N2(例如1957 H2N2)、H2N1、H3N1、H3N2、H3N8、H4N8、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H6N1、H6N2、H6N5、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N1、H10N7、H10N8、H11N1、H11N6、H12N5、H13N6和H14N5。在一个实例中，A型流感包括已知的在人类中传播的那些，例如H1N1、H1N2、H3N2、H7N9和H5N1。

在动物中，大多数A型流感病毒导致哺乳动物的呼吸道和/或鸟类的肠道中的自限的局限性感染。但是，高致病性A型流感毒株如H5N1在家禽中导致全身性感染，其中致死率可达到100％。2009年，H1N1流感是人流感最常见的原因。一种猪源H1N1新毒株在2009年出现并被世界卫生组织宣布为大范围流行。该毒株被称为“猪流感”。H1N1A型流感病毒也是造成1918年西班牙流感大流行、1976年Fort Dix爆发和1977-1978年俄罗斯流感流行的原因。

B型流感病毒(IBV)：一种负义、单链的RNA病毒，其具有8个RNA节段。IBV的壳体被包膜包被，而其病毒体包括包膜、基质蛋白、核蛋白复合体、核壳和聚合酶复合体。表面突起由神经氨酸酶(NA)和血凝素组成。该病毒比A型流感病毒更少倾向于进化，但是它突变足够多，使得尚未实现持久的免疫。B型流感的宿主范围比A型流感更窄，已知B型流感仅感染人类和海豹。

B型流感病毒未被分成亚型，但是可进一步分为谱系和毒株。B型流感的具体实例包括但不限于：B/Yamagata、B/Victoria、B/Shanghai/361/2002和B/Hong Kong/330/2001。

分离的：“分离的”生物组分(例如核酸、蛋白、VLP或病毒)已被从其他生物组分(例如细胞碎片或其他蛋白或核酸)中基本上分离或纯化。已被“分离的”生物组分包括通过标准纯化方法纯化的那些组分。所述术语也包括重组的核酸、蛋白、病毒和VLP，以及化学合成的核酸或肽。

基质蛋白：A型流感病毒具有两种基质蛋白M1和M2。M1是在病毒包膜内发现的结构蛋白。M1是双功能的膜/RNA结合蛋白，其介导RNA核蛋白核心的壳体化而进入膜包膜。M1由通过接头序列连接的两个结构域组成。M2蛋白是单次跨膜蛋白，其形成具有H+离子通道活性的四聚体，并且当被核内体(endosome)中的低pH激活时，其使病毒体的内部酸化，促使病毒体脱壳。已记载了B型流感病毒中的同源蛋白M1和BM2。

众多A型流感M1和M2蛋白以及B型流感基质蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列是本领域已知的并可被公众获得，例如保存于数据库的那些。以下表2中提供了可从获得的示例性序列(提供了登录号)。

表2：可用于所公开的VLP中的示例性M1和M2序列

神经氨酸酶(NA)：一种流感病毒膜糖蛋白。NA通过从被感染的细胞表面上的碳水化合物部分中裂解末端唾液酸残基而参与病毒HA的细胞受体的破坏。NA也从病毒蛋白中裂解唾液酸残基，阻止病毒聚集。NA(以及HA)是两种主要的流感病毒抗原决定簇之一。多种流感NA蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列是本领域已知的并可被公众获得，例如保存于数据库的那些。

以下表3中提供了可从数据库获得的示例性NA序列(例如在鸟类中发现的IVA NA)(提供了登录号)。

表3：可用于产生所公开的VLP的来自IAV(N1-N9)或IBV的示例性NA序列

可操作地连接：当第一核酸序列被放置在与第二核酸序列的功能性关系中时，则第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在必需连接两个蛋白编码区的情况下位于相同的读码框中。

爆发：如本文所使用的，流感病毒“爆发”是指在给定的一年中来自一个国家或地区内的病毒分离株的采集。

药学上可接受的的载体：适用于本公开内容的药学上可接受的的载体是常规的。E.W.Martin所著的Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第15版(1975)记载了适用于一种或多种治疗组合物(例如一种或多种本文公开的流感VLP组合物)的药物递送的组合物和制剂，以及其他的药物试剂。

多肽或蛋白：其中单体为通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸为α-氨基酸时，可使用L-光学异构体或D-光学异构体。术语“多肽”或“蛋白”包括任何氨基酸序列并且包括修饰的序列如糖蛋白。术语“残基”或“氨基酸残基”包括对被并入蛋白中的氨基酸的指代。

保守氨基酸置换为当进行置换时对原始蛋白的性质干扰最小的那些置换，即所述蛋白的结构、特别是功能是保守的并且不因这样的置换而被显著改变。可对蛋白中的原始氨基酸进行置换且可被认为是保守置换的氨基酸的实例包括：Ser置换Ala；Lys置换Arg；Gln或His置换Asn；Glu置换Asp；Ser置换Cys；Asn置换Gln；Asp置换Glu；Pro置换Gly；Asn或Gln置换His；Leu或Val置换Ile；Ile或Val置换Leu；Arg或Gln置换Lys；Leu或Ile置换Met；Met、Leu或Tyr置换Phe；Thr置换Ser；Ser置换Thr；Tyr置换Trp；Trp或Phe置换Tyr；以及Ile或Leu置换Val。

通过使用更低保守性的置换来产生更显著的变化，例如选择这样的残基，它们对于维持以下特征的影响方面具有更显著的区别：(a)置换区域中肽骨架的结构，例如，作为片状构象或螺旋构象；(b)靶点处多肽的电荷或疏水性；或(c)侧链的大小。通常预期为产生多肽功能上的最大变化的置换为那些置换，即其中：(a)用亲水残基(例如丝氨酸或苏氨酸)置换(或被置换为)疏水残基(例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸)；(b)用半胱氨酸或脯氨酸置换(或被置换为)任何其他残基；(c)用具有带正电的侧链的残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)置换(或被置换为)带负电的残基(例如谷氨酸或天冬氨酸)；或(d)用具有大侧链的残基(例如苯丙氨酸)置换(或被置换为)没有侧链的残基(例如甘氨酸)。可通过分析突变蛋白(例如突变HA或NA蛋白)的功能，通过分析变异蛋白刺激免疫应答的能力来评估这些氨基酸置换(或其他缺失或添加)的影响。

预防、治疗或缓解疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的完全发展。“治疗”是指在疾病或病理状况已经开始发展后缓解其征象或症状的治疗性干预。“缓解”是指减少疾病征象或症状的数量和严重性。

启动子：启动子是指导核酸(例如编码流感HA、NA或基质(例如M1或M2)蛋白的核酸)转录的一组核酸控制序列。启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列。启动子也任选地包括远端增强子或阻遏成分。“组成型启动子”是具有持续活性的启动子，并且不受外部信号或分子的调控。相反，“诱导型启动子”的活性由外部信号或分子(例如转录因子)的调控。在一些实例中，所述启动子是CMV启动子或SV40启动子。

纯化的：术语“纯化的”不要求绝对的纯度，意欲将其作为相对术语。因此，例如，纯化的蛋白、病毒、VLP或其他化合物是从天然相关的蛋白或其他污染物中完全或部分分离的物质。在某些实施方案中，术语“基本上纯化的”是指已经从细胞、细胞培养基或其他粗制备物中分离并进行分级分离以除去初始制备物的多种组分(例如蛋白、细胞碎片和其他组分)的蛋白、病毒、VLP或其他活性化合物。

重组的：重组的核酸、蛋白、病毒或VLP是具有非天然存在的序列或具有通过两种另外分离的序列节段的人工重组而形成的序列的核酸、蛋白、病毒或VLP。人工重组通常是通过化学合成或更通常地是通过分离的核酸节段的人工操控(例如通过遗传工程技术)而完成的。

序列同一性：氨基酸序列或核酸序列之间的相似性以所述序列之间的相似性(或者称为序列同一性)来表达。序列同一性经常以同一性(或相似性或同源性)百分数来测量；百分数越高，则两个序列越相似。当使用标准方法进行比对时，给定基因或蛋白的同源物或变体具有相对高的序列同一性。

用于比较的序列比对方法是本领域公知的。多种程序和比对算法记载于以下文献中：Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444，1988；Higgins and Sharp，Gene 73：237-244，1988；Higgins and Sharp，CABIOS 5：151-153，1989；Corpet et al.，Nucleic Acids Research 16：10881-10890，1988；and Pearsonand Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444，1988；Altschul et al.，NatureGenet.6：119-129，1994。

NCBI基本局部比对检索工具(BLAST^TM)(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)可从若干来源获得，包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和互联网上，以与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx一起使用。

通常，本文公开的流感HA、NA、M1和M2蛋白的变体和本文公开的编码序列的特征通常在于，使用NCBI Blast 2.0(空位blastp被设置为默认参数)进行全长比对时，与氨基酸序列具有至少约80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。为了比较多于约30个氨基酸的氨基酸序列，使用Blast2序列函数，其中默认BLOSUM62矩阵被设置为默认参数(空位存在罚分为11，每个残基的空位罚分为1)。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，应当使用Blast 2序列函数来进行比对，其中PAM30矩阵被设置为默认参数(开放的空位为9，延伸空位1罚分)。当通过该方法评估时，与参照序列具有甚至更大相似性的蛋白将显示出增大的同一性百分数，例如至少95％、至少98％或至少99％序列同一性。当比较少于全部序列的序列同一性时，同源物和变体在10-20个氨基酸的短窗口内通常具有至少80％的序列同一性，并且可具有至少85％或至少90％或至少95％的序列同一性，这取决于其与参照序列的相似度。用于测定在这样的短窗口内的序列同一性的方法可在互联网上的NCBI网站获得。本领域技术人员将理解，仅为了指导而提供这些序列同一性范围；完全可能获得落在所提供的范围之外的非常显著的同源物。因此，变异的流感HA、NA或基质蛋白(或编码序列)可与SEQ ID NO：1-39中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性(以及与表1-3中提供的任何登录号的序列具有这样的序列同一性)，并且它们可用于本文提供的方法和组合物。

受试者：活的多细胞脊椎动物生物体——同时包括人和非人哺乳动物(例如非人灵长类动物)的类别。在一个实施方案中，受试者是可感染A型流感或B型流感的受试者，例如人、鸟类(例如鸡、火鸡)、马、猪、蝙蝠、小鼠、雪貂、猫、虎、豹、海豹和狗。

治疗有效量：在采用特定试剂治疗的受试者中足以实现所需效果的该特定试剂的量。例如，这可以是适用于在受试者中引起免疫应答和/或预防由流感病毒引起的感染或疾病的多价VLP组合物的量。在一个实例中，多价VLP组合物的治疗有效量是在受试者中足以增强对由流感病毒(例如A型流感、B型流感或两者)引起的感染的抵抗力，预防、缓解和/或治疗由流感病毒(例如A型流感、B型流感或两者)引起的感染，而不导致显著的细胞毒性作用的量。适用于在受试者中增强对感染的抵抗力，预防、缓解和/或治疗感染的多价VLP组合物的有效量将取决于，例如，被治疗的受试者、治疗组合物的给予方式和其他因素。

转化的：转化的细胞是通过例如分子生物学技术已将核酸分子引入其中的细胞。如本文所使用的，术语“转化”包括可将核酸分子引入这样的细胞中的所有技术，包括采用病毒载体(例如杆状病毒)的转染、采用质粒载体的转化，以及通过电穿孔、脂质转染和粒子枪加速而引入裸DNA。

疫苗：能够刺激免疫应答的免疫原性物质的制剂，给予该制剂以预防、缓解或治疗疾病(例如传染性疾病)。所述免疫原性物质可包括本文公开的多价VLP组合物。疫苗可同时引起预防性(预防性)和治疗性反应。给予方法根据疫苗而变化，但是可包括接种、摄食、鼻内或其他给予形式。可将疫苗随佐剂一起给予以增强免疫应答。

载体：载体是允许插入外源核酸而不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。插入型载体能够将其自身插入到宿主核酸中。载体也可包括一种或多种选择性标记物基因和其他遗传因子。表达载体是包含必需的调控序列以使插入的一个基因或多个基因转录和翻译的载体。在本公开内容的一些实施方案中，所述载体编码流感HA、NA、M1或M2蛋白。在一些实施方案中，所述载体为pCAGGS表达载体或pFastBacl杆状病毒转移载体质粒。

病毒样颗粒(VLP)：由一种或多种病毒结构蛋白组成，但是缺少病毒基因组的类似于病毒的包膜结构。因为VLP缺少病毒基因组，它们是非传染性的。此外，可通过异源表达而产生和纯化VLP。本文提供的VLP表达或包含HA或NA蛋白，并且还可包含驱动出芽并从宿主细胞中释放颗粒的病毒核心蛋白(例如流感M1、M2或两者)。当提及表达HA或NA蛋白的VLP时，这表明VLP呈递出正确折叠的、功能性、多聚化的HA(或NA)。例如，表达HA的VLP能够结合上皮细胞或红细胞上的受体，表达NA的VLP具有裂解唾液酸的酶活性。图2A-2C提供了VLP的示例性图像。

在本文的一些实施方案中，流感VLP表达或包含A型流感HA或A型流感NA蛋白，以及A型流感M1、A型流感M2或A型流感M1和A型流感M2蛋白两者。在本文的其他实施方案中，流感VLP表达或包含B型流感HA或B型流感NA蛋白，以及B型流感基质蛋白M1或B型流感M1和BM2蛋白两者。可通过采用编码HA或NA蛋白以及任选的基质蛋白(例如，M1、M2或M1和M2蛋白)的质粒转染宿主细胞而产生流感VLP。在孵育被转染的细胞适合的时间以使蛋白表达(例如孵育约72小时)之后，可从细胞培养物上清液中分离VLP。

概述

A型流感是造成每年全世界多达50万人死亡的原因。尽管若干亚型通常在人类中传播，新亚型可在任何时间通过动物源感染(例如H5N1或H7N9)而被引入。尽管每年更新季节性疫苗，这些动物源传播是不可预期的并且在疫苗中未被考虑。目前可获得的疫苗是不充分的，因为：(1)灭活IM疫苗不产生稳健的粘膜免疫应答；以及(2)活体减毒流感疫苗(LAIV)是有问题的，因为它们是过度减毒的，具有受限的使用准则，并且由于与野生型病毒重配的风险，无法使用具有不存在于季节性毒株中的HA和NA亚型的LAIV。目前可获得的疫苗被设计为具有针对特定毒株的保护性并且每年重新制备，这样的疫苗不提供普遍保护。针对禽流感病毒的特定的大流行前疫苗(灭活疫苗和LAIV)不具有非常强的免疫原性。旨在避免动物源流感感染成为大流行的通用疫苗能够补充当前的季节性疫苗，并且将有益于公众健康。在一些实例中，通用疫苗提供针对所有16种鸟类HA亚型(H1至H16)的保护并且可在流行爆发的情况下快速制备。

本公开内容提供了多价VLP疫苗策略，所述疫苗可经鼻内递送以广泛引起对流感病毒HA头部和茎部上的保守表位以及对NA表位的反应性免疫，因此赋予针对宽泛的A型流感病毒的保护。尽管HA在抗原性方面是多变的，HA受体结合结构域和茎部结构域中的保守表位仍允许产生交叉反应性疫苗。在一个实例中，公开的组合物(例如疫苗)包括各自包含单一A型流感HA亚型(或单一NA亚型)的流感VLP的多价混合物以避免HA的免疫优势超过NA的问题。在一些实例中，所述组合物还包含含有A型流感NA蛋白的VLP(例如，表达单一NA亚型的另外的VLP或VLP群体)。在一些实例中，所述VLP还包含A型流感基质蛋白，例如M1、M2或两者。鼻内递送或给予用于引起粘膜免疫或全身免疫。这些多价VLP是非传染性的、安全的并且易于制备和使用。这些多价VLP可用于提供具有广泛保护性的“通用”大流行前疫苗和具有更广泛反应性的季节疫苗。

在另一个实例中，公开的组合物(例如疫苗)包括流感VLP的多价混合物，所述VLP各自包含来自A型流感或B型流感的单一HA亚型。在一些实例中，所述组合物还包含含有A型流感或B型流感NA蛋白的VLP(例如，各自表达A型流感NA亚型或B型流感NA的另外的VLP群体)。在一些实例中，所述VLP还包含A型流感或B型流感基质蛋白(例如，表达A型流感NA或HA的VLP还可表达A型流感M1、M1或两者，而表达B型流感NA或HA的VLP还可表达B型流感基质蛋白，例如B型流感M1、BM2或两者)。鼻内递送或给予用于诱导粘膜免疫和全身免疫。这些多价VLP是非传染性的、安全的并且易于制备和使用。这些多价VLP(其包含表达A型流感或B型流感HA的VLP群体的混合物)可用于提供具有广泛反应性的季节性疫苗。

本文表明，经鼻内接种了单价HA VLP的小鼠受到保护而免于异源致命性攻击。此外，接种了作为佐剂的TLR激动剂的小鼠与接受单独的疫苗的小鼠相比显示出降低的发病率。因此，多价VLP混合物可用于提供针对致命性A型流感病毒(例如1918 H1N1、1957 H2、2004 H5N1和2013 H7N9)的保护。

多价VLP混合物

本文提供了包含两种或更多种不同的流感病毒样颗粒(VLP)(例如两种或更多种不同的VLP群体)的组合物。这样的组合物被称为流感多价VLP(或含多价VLP的组合物)。例如，所述组合物可包含表达不同的流感血凝素(HA)多肽的VLP，例如包含(或表达)第一HA多肽的第一VLP以及包含(或表达)第二HA多肽的第二VLP，其中所述第一和第二HA多肽是不同的亚型(或来自不同的流感病毒，例如A型流感和B型流感)。因此，所述组合物可包含多种不同的VLP，其各自表达或包含不同的HA亚型或来自不同的流感(例如A型和B型流感)的HA。这样的组合物除了包含VLP，可包含其他试剂，例如药学上可接受的载体和/或佐剂。

在一个实例中，所述组合物包含至少两种不同的VLP，例如至少两种不同的VLP群体，各VLP或VLP群体包含一种HA亚型(或包含来自一种流感病毒如A型流感和B型流感的HA)。例如，如图1A所示，组合物100可包含含有第一HA亚型(H-X)的第一VLP 102以及含有不同的HA亚型(H-Y)的第二VLP 104。因此，在一个实例中，所述第一VLP 102可包含来自B型流感的第一HA(H-X)，且所述第二VLP 104可包含来自B型流感的第二但不同的HA(H-Y)，或所述第一VLP 102可包含来自A型流感的第一HA(H-X)，且所述第二VLP 104可包含来自A型流感的第二但不同的HA(H-Y)。或者，所述第一VLP 102可包含来自A型流感的第一HA(H-X)，且所述第二VLP 104可包含来自B型流感的第二HA(H-Y)。各VLP102和104可包含多个VLP，各群体102、104包含不同的HA亚型(或来自不同的流感病毒的HA)。

本领域技术人员将理解，组合物100中可包含多于两种不同的VLP。因此，所述组合物可包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种不同的VLP或VLP群体，各自表达不同的流感HA亚型和/或来自不同的流感病毒，例如2-8、2-6、5-6或4-6种不同的VLP或VLP群体(其中各VLP或VLP群体具有不同的HA蛋白亚型和/或来自不同病毒的HA)。例如，第一VLP可表达第一A型流感HA多肽，所述HA多肽选自HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16；而第二VLP可表达第二A型流感HA多肽，所述HA多肽选自HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16，其中所述第一和第二HA多肽是不同的亚型。因此，如果所述组合物包括第三VLP，例如第三VLP群体，所述第三A型流感HA多肽将选自HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16，其中所述第三HA多肽亚型不同于所述第一和第二HA多肽亚型。

在另一个实例中，所述第一VLP可表达第一A型流感HA多肽，所述HA多肽选自HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16；而第二VLP可表达第一B型流感HA多肽，例如Yamagata系或Victoria系抗原。如果所述组合物包含第三VLP，例如含有第二A型流感HA多肽的第三VLP群体，所述HA多肽将选自HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16，其中所述第二A型流感HA多肽亚型不同于所述第一A型流感HA多肽亚型。如果所述组合物包含第三VLP，例如含有第二B型流感HA多肽的第三VLP，所述第二B型流感HA将不同于所述第一B型流感HA。在一个具体的实例中，所述组合物包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的VLP(或VLP群体)，其中至少一种VLP群体包含A型流感HA亚型，至少一种VLP群体包含B型流感HA，以及任选地至少一种VLP群体包含A型流感NA亚型。

在一个实例中，所述组合物包含单独的VLP(或VLP群体)，其中第一VLP群体表达A型流感H1，第二VLP群体表达A型流感H3，第三VLP群体表达A型流感H5，第四VLP群体表达A型流感H7，第五VLP群体表达A型流感N1，第六VLP群体表达A型流感N2，第七VLP群体表达B型流感Yamagata系或Victoria系抗原，以及任选地第八VLP群体表达B型流感Yamagata系或Victoria系抗原(其与所述第七VLP群体不同)。这样的组合物可用作季节性疫苗或用作大流行前疫苗。

从种系发生学上讲，有两种主要的A型流感病毒HA组：组1包含H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16，组2包含H3、H4、H7、H10、H14和H15亚型。因此，在一个实例中，所述组合物包含表达至少一种组1的HA多肽(即H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13或H16)的第一VLP或第一VLP群体，以及表达至少一种组2的HA多肽(即H3、H4、H7、H10、H14或H15)的第二VLP或第二VLP群体。在另一个实例中，所述组合物包含至少两种不同的VLP或不同的VLP群体，各自表达不同的组1的HA多肽(即H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13或H16)。在另一个实例中，所述组合物包含至少两种不同的VLP或不同的VLP群体，各自表达不同的组2的HA多肽(即H3、H4、H7、H10、H14或H15)。类似地，尽管B型流感病毒HA不具有不同的亚型，有两种主要的抗原谱系——Victoria系和Yamagata系，其在种系发生学上也是不同的。

在一个具体的实例中，所述组合物包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的VLP(或VLP群体)，各自包含不同的组1的A型流感HA多肽(即H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13或H16)。在一个具体的实例中，所述组合物包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种，至少六种，例如2、3、4、5或6种不同的VLP(或VLP群体)，各自包含不同的组2的A型流感HA多肽(即H3、H4、H7、H10、H14或H15)。

在一个具体的实例中，所述第一A型流感HA多肽是HA亚型H1、H2或H5，并且所述第二A型流感HA多肽是HA亚型H3、H7或H9。在另一个具体的实例中，所述第一A型流感HA多肽是HA亚型H1、H2、H3、H5、H7或H9，并且所述第二A型流感HA多肽是HA亚型H1、H2、H3、H5、H7或H9，其中所述第一和所述第二HA多肽是不同的亚型。在又一些其他具体的实例中，(i)所述第一A型流感HA多肽为HA亚型H2并且所述第二A型流感HA多肽为HA亚型H5；(ii)所述第一A型流感HA多肽为HA亚型H3并且所述第二A型流感HA多肽为HA亚型H7；(iii)所述第一A型流感HA多肽为HA亚型H1并且所述第二A型流感HA多肽为HA亚型H3；(iv)所述第一A型流感HA多肽为HA亚型H2并且所述第二A型流感HA多肽为HA亚型H7；(v)所述第一A型流感HA多肽为HA亚型H5并且所述第二A型流感HA多肽为HA亚型H3；或(vi)所述第一A型流感HA多肽为HA亚型H1并且所述第二A型流感HA多肽为HA亚型H7。

在一个具体的实例中，所述组合物包含至少四种不同的VLP群体，其中第一VLP群体包含A型流感HA亚型H1，第二VLP群体包含A型流感HA亚型H3，第三VLP群体包含A型流感HA亚型H5，第四VLP群体包含A型流感HA亚型H7。在一些实例中，所述组合物还包含第五VLP群体，其包含A型流感HA亚型H9。在一些实例中，所述组合物还包含第六VLP群体，其包含A型流感NA，如N1或N2。在一些实例中，所述组合物还包含第七和第八VLP群体，其包含A型流感NAN1(第七群体)和N2(第八群体)。在一些实例中，这样的VLP还包含M1和M2。

本公开内容的VLP除了具有HA蛋白，也可表达流感基质蛋白(例如，A型流感M1、A型流感M2或两者)。如图1B所示，组合物106可包含具有第一HA亚型H-X和基质蛋白M1的VLP或VLP群体108，以及具有第二HA亚型H-Y和基质蛋白M1的VLP或VLP群体110。M2也可存在于VLP108和/或VLP 110中。或者，VLP或VLP群体108可包含来自A型流感的第一HA(H-X)和A型流感基质蛋白M1(M2也可存在)，并且第二VLP或VLP群体110可包含来自B型流感的第二HA(H-Y)和B型流感基质蛋白M1。

所公开的组合物除了包含表达HA的VLP之外，可包含表达流感神经氨酸酶(NA)多肽的VLP(或VLP群体)。在一些实例中，所述组合物包含两种或更多种不同的VLP或VLP群体，各自具有不同的流感NA多肽。因此，所述组合物还可包含含有第一流感NA多肽的第一VLP，含有第二流感NA多肽的第二VLP，或同时包含两者，其中所述第一和第二NA多肽是不同的亚型或来自不同的流感病毒。例如，如图1C所示，组合物112包含VLP或VLP群体114和116，其各自具有不同的HA亚型(或来自不同的流感病毒的NA)，并且还包含具有NA亚型N-X的VLP或VLP群体。所述VLP 114、116、118也可包含流感基质蛋白(即M1、M2或两者)。

从种系发生学上讲，有两组A型流感病毒NA：组1包含N1、N4、N5和N8，并且组2包含N2、N3、N6、N7和N9。因此，在一个实例中，所述含多价VLP的组合物还包含第一VLP或第一VLP群体，其包含至少一种组1的NA多肽(即N1、N4、N5或N8)；以及第二VLP或第二VLP群体，其包含至少一种组2的NA多肽(即N2、N3、N6、N7或N9)。在另一个实例中，所述含多价VLP的组合物还包含至少两种不同的VLP或不同的VLP群体，其各自包含不同的组1的NA多肽(即N1、N4、N5或N8)。在另一个实例中，所述含多价VLP的组合物还包含至少两种不同的VLP或不同的VLP群体，其各自包含不同的组2的NA多肽(即N2、N3、N6、N7或N9)。

在一个具体的实例中，所述含多价VLP的组合物还包含1、2、3或4种不同的VLP(或VLP群体)，其各自包含不同的组1的NA多肽(即N1、N4、N5或N8)。在一个具体的实例中，所述组合物包含1、2、3、4或5种不同的VLP(或VLP群体)，其各自包含不同的组2的NA多肽(即N2、N3、N6、N7或N9)。

类似地，尽管B型流感病毒NA不具有不同的亚型，有两种主要的抗原谱系——Victoria系和Yamagata系，其在种系发生学上也是不同的。因此，在一个实例中，所述含多价VLP的组合物还包含第一VLP或第一VLP群体，其包含至少一种B型流感NA多肽(例如Victoria系)，以及第二VLP或第二VLP群体，其包含至少一种B型流感NA多肽(例如Yamagata系)。

本公开内容的NA-VLP除了具有NA蛋白之外，也可包含流感基质蛋白(例如，A型流感M1、A型流感M2或两者；或B型流感M1、B型流感BM2或两者)。

所公开的组合物除了VLP之外，还包含一种或多种佐剂，例如单磷酰脂质A、Flt3配体、免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)或其组合。

在一些实例中，将所公开的组合物配制为用于鼻内给予，例如用于粘膜免疫。

还提供了包含本文提供的多价VLP的小瓶或注射器(例如具有喷雾器的小瓶或注射器)。在一些实例中，所公开的含VLP的组合物为冷冻干燥的或冻干的。

所公开的含多价VLP的组合物也可以是试剂盒的一部分。例如，所述试剂盒可包括容器或小瓶，其在一些实例中各自包含不同的VLP。容器中的VLP可位于悬浮液中，例如与PBS或其他药学上可接受的载体一起。或者，所述VLP可为干燥形式或粉末形式，例如冻干的或冷冻干燥的，然后，其可由终端使用者复原(例如与PBS或其他药学上可接受的载体一起)。例如，第一容器可包括具有第一HA亚型(或来自第一流感病毒的HA)的VLP，第二容器可包括具有第二HA亚型(或来自第二流感病毒的HA)的VLP。在一些实例中，第三容器包括具有第一NA亚型的VLP，等等。在一些实例中，所述容器包含本文提供的VLP的混合物。试剂盒中的容器可包含佐剂，或所述佐剂可位于试剂盒的单独的容器中。在一些实例中，所述容器可包含药学上可接受的载体如PBS，或者药学上可接受的载体如PBS可位于单独的容器中(例如如果VLP是冷冻干燥的或冻干的)。在一些实例中，试剂盒中的容器还包括一种或多种稳定剂。在一些实例中，所述试剂盒也包括允许将VLP给予受试者的装置。这样的装置的实例包括注射器或注射器喷雾器(例如鼻部药物递送装置，例如来自Life MedicalsSupplier，Sunrise，FL的那些)。

在一个实例中，所述试剂盒包括第一VLP群体，其包含A型流感HA亚型H1；第二VLP群体，其包含A型流感HA亚型H3；第三VLP群体，其包含A型流感HA亚型H5；以及第四VLP群体，其包含A型流感HA亚型H7。在一些实例中，所述试剂盒另外或任选地包括第五VLP群体，其包含A型流感HA亚型H9。在一些实例中，所述试剂盒还包括第六VLP群体，其包含A型流感NA，例如N1或N2。在一些实例中，所述试剂盒还包括第六和第七VLP群体，其包含A型流感NA N1(第六群体)和N2(第七群体)。在一些实例中，所述试剂盒还包括表达B型流感Yamagata系或Victoria系抗原的第八VLP群体，以及任选地表达B型流感Yamagata系或Victoria系抗原的第九VLP群体(其与第八VLP群体不同)。这样的组合物可用作季节性疫苗或用作大流行前疫苗。

在一些实例中，这样的VLP也包含M1和M2。在一些实例中，这样的试剂盒中的VLP群体位于单独的容器中，或可合并在单一容器中(例如在小瓶中或注射器中)。

1.血凝素(HA)

HA是病毒表面糖蛋白，其表达为同源三聚体，通常代表约25％的总病毒蛋白。在感染早期，HA负责使病毒颗粒附着于宿主细胞并穿透进入宿主细胞。对于病毒而言，需要使病毒HA0前体裂解为HA1和HA2亚节段以感染细胞。因此，需要裂解以将宿主细胞中的新病毒颗粒转化为能够感染新细胞的病毒体。裂解发生在完整的HA0膜蛋白从被感染细胞的内质网转运到质膜期间。在转运过程中，HA经历一系列共翻译修饰和翻译后修饰，包括前体HA经蛋白水解而裂解为氨基端片段HA1和羧基端HA2。

存在于本文提供的VLP中的HA肽序列可为A型流感HA序列(例如鸟类HA序列)或B型流感HA序列。在具体的实例中，存在于本文提供的VLP中的A型流感HA肽序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或表1中通过其登录号提供的任何氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％的序列同一性。在具体的实例中，存在于本文提供的VLP中的B型流感HA肽序列与SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27或表1中通过其登录号提供的任何氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％的序列同一性。在一些实例中，VLP中的HA肽不包含信号序列(其约为加工前的HA蛋白序列的氨基酸1-15、1-16、1-17、1-18或1-19)。因此，在一些实例中，存在于本文提供的VLP中的HA肽序列可以是具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、或SEQ ID NO：27的成熟形式或表1中通过其登录号提供的(即没有信号序列)任何氨基酸序列的成熟形式至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列。

在一个实例中，所述HA多肽是H1。在一些实例中，存在于VLP中的H1具有与SEQ IDNO：2至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列；或具有与SEQ ID NO：4至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实例中，存在于VLP中的H1具有包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2组成的氨基酸序列，包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4组成的氨基酸序列。在一些实例中，存在于VLP中的H1具有与SEQ ID NO：2的残基18-566至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列；或具有与SEQ ID NO：4的残基20-566至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。

在一个实例中，所述HA多肽是H2。在一些实例中，存在于VLP中的H2具有与SEQ IDNO：6至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列；或具有与SEQ ID NO：8至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实例中，存在于VLP中的H2具有包含SEQ ID NO：6或由SEQ ID NO：6组成的氨基酸序列，包含SEQ ID NO：8或由SEQ ID NO：8组成的氨基酸序列。在一些实例中，存在于VLP中的H2具有与SEQ ID NO：6的残基16-562至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列；或与SEQ ID NO：8的残基16-562至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。

在一个实例中，所述HA多肽是H3。在一些实例中，存在于VLP中的H3具有与SEQ IDNO：10至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实例中，存在于VLP中的H3具有包含SEQ ID NO：10或由SEQ ID NO：10组成的氨基酸序列。在一些实例中，存在于VLP中的H3具有与SEQ ID NO：10的残基17-566至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。

在一个实例中，所述HA多肽是H5。在一些实例中，存在于VLP中的H5具有与SEQ IDNO：12至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实例中，存在于VLP中的H5具有包含SEQ ID NO：12或由SEQ ID NO：12组成的氨基酸序列。在一些实例中，存在于VLP中的H5具有与SEQ ID NO：12残基17-564至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。

在一个实例中，所述HA多肽是H7。在一些实例中，存在于VLP中的H7具有与SEQ IDNO：14至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实例中，存在于VLP中的H7具有包含SEQ ID NO：14或由SEQ ID NO：14组成的氨基酸序列。在一些实例中，存在于VLP中的H7具有与SEQ ID NO：14残基19-560至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。

在一个实例中，所述HA多肽来自B型流感。在一些实例中，存在于VLP中的HA具有与SEQ ID NO：23至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列；具有与SEQ ID NO：25至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列；或具有与SEQ ID NO：27至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实例中，存在于VLP中的HA具有包含SEQ ID NO：23或由SEQ IDNO：23组成的氨基酸序列，包含SEQ ID NO：25或由SEQ ID NO：25组成的氨基酸序列，包含SEQ ID NO：27或由SEQ ID NO：27组成的氨基酸序列。在一些实例中，存在于VLP中的HA具有与SEQ ID NO：23的残基18-583至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列；具有与SEQ ID NO：25的残基18-585至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列；或具有与SEQ ID NO：27的残基18-584至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。

在其他实施方案中，VLP中的HA氨基酸序列相对于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：23、SEQID NO：25、SEQ ID NO：27或表1中通过其登录号提供的任何氨基酸序列，具有至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多15个、至多20个、至多40个或至多50个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。例如，在一些实例中，存在于VLP中的HA多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27或表1中通过其登录号提供的任何氨基酸序列，具有2至20、2至15、1至10、2至20、5至40、5至50、5至15或5至10个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。

在其他实施方案中，HA多肽的氨基酸序列包含：(i)相对于SEQ ID NO：2至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；(ii)相对于SEQ ID NO：4至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；(iii)相对于SEQID NO：6至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；(iv)相对于SEQ ID NO：8至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；(v)相对于SEQ ID NO：10至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；(vi)相对于SEQ ID NO：12至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；(vii)相对于SEQ ID NO：14至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；(viii)相对于SEQ ID NO：23至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；(ix)相对于SEQ ID NO：25至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；(x)相对于SEQ ID NO：27至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；或(x)相对于表1中通过其登录号提供的任何氨基酸序列至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。

当将这样的变异HA序列(例如VLP的一部分)给予受试者(例如哺乳动物或鸟类)时，所述序列保留其诱导免疫应答的能力。

在一些实例中，VLP中的流感HA多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO：2的残基18-566、SEQ ID NO：4的残基20-566、SEQ ID NO：6的残基16-562、SEQ ID NO：8的残基16-562、SEQ ID NO：10的残基17-566、SEQ ID NO：12的残基17-564、SEQID NO：14的残基19-560、SEQ ID NO：23的残基18-583、SEQ ID NO：25的残基18-585、SEQ IDNO：27的残基18-584或表1中通过其登录号提供的没有信号肽序列的氨基酸序列。

在其他实例中，VLP中的HA多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQID NO：14、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27或表1中通过其登录号提供的任何氨基酸序列。

还提供了编码本文公开的重组HA多肽的分离的核酸分子。在一些实施方案中，为了在哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达，对所述核酸分子进行了密码子优化的。为了RNA稳定性，还可进一步对所述核酸分子进行优化。基于所提供的HA蛋白序列，可使用常规技术设计核酸分子。此外，本文提供了示例性的HA编码序列。在一个实例中，用于产生本文提供的VLP的HA编码序列可以是与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26或表1中通过其登录号提供的任何核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％序列同一性的核酸序列。在一些实例中，用于产生本文提供的VLP的HA编码序列可以是这样的核酸，其编码的HA蛋白相对于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：26或表1中通过其登录号提供的任何氨基酸序列具有至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多15个、至多20个、至多40个或至多50个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。例如，用于产生本文提供的VLP的HA编码序列可以是这样的核酸，其编码的HA蛋白相对于SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26或表1中通过其登录号提供的任何氨基酸序列具有2至20、2至15、1至10、2至20、5至40、5至50、5至15或5至10个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。

本公开内容也提供了包含编码重组HA多肽的这些核酸分子的载体。所述载体可以是任何适合用于表达HA多肽的载体，例如哺乳动物表达载体或杆状病毒载体。在特定的实例中，所述载体为pCAGGS表达载体或pFastBacl杆状病毒转移载体质粒。本领域技术人员将理解，可使用用于转染或杆状病毒表达的任何表达载体。

在一些实例中，所述载体包含与编码HA多肽的核酸序列可操作地连接的启动子。在特定的实例中，所述启动子为CMV或SV40启动子。

还提供了包含公开的表达HA的分离的细胞。在一些情况下，所述细胞为产生和表达VLP的任何适合的细胞类型，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞。

2.神经氨酸酶(NA)

神经氨酸酶(NA)是流感病毒的第二膜糖蛋白，表达为同源四聚体。已经在来自鸟类的流感病毒中鉴定了9种不同的NA亚型(N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9)，虽然在B型流感病毒中不存在不同的NA亚型，但是两种主要的抗原谱系在人类中传播(Yamagata系和Victoria系)。NA通过从被感染的细胞表面上的碳水化合物部分中裂解末端神经氨酸(也称为唾液酸)残基而参与病毒HA的细胞受体的破坏。NA还从病毒蛋白中裂解唾液酸残基，防止病毒聚集。使用这种机制，假设NA通过防止新形成的病毒颗粒沿着细胞膜积聚以及通过促进病毒穿过存在于粘膜表面上的粘液的转运而促进病毒后代的释放。

存在于本文提供的VLP中的NA肽序列可以是A型流感NA序列(例如鸟类NA序列)或B型流感序列。在具体实例中，存在于本文提供的VLP中的NA肽序列与SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33或与表3中通过其登录号提供的任何氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％的序列同一性。

在具体实施方案中，流感NA多肽是N1多肽。在一些实例中，N1多肽具有与SEQ IDNO：16至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列；具有与SEQ ID NO：18至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列；具有包含SEQ ID NO：16、由SEQ ID NO：16组成、包含SEQ ID NO：18或由SEQ ID NO：18组成的氨基酸序列。

在具体的实施方案中，流感NA多肽是N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9多肽，并且具有与表3中所示的GenBank登录号相关的任何序列至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列，包含与表3中所示的GenBank登录号相关的任何序列，或由与表3中所示的GenBank登录号相关的任何序列组成。

在具体实施方案中，流感NA多肽是B型流感NA多肽。在一些实例中，B型流感NA多肽具有与SEQ ID NO：29至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列；具有与SEQ ID NO：31至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列；具有与SEQ ID NO：33至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列；具有包含SEQ ID NO：29、由SEQ ID NO：29组成、包含SEQ IDNO：31、由SEQ ID NO：31组成、包含SEQ ID NO：33或由SEQ ID NO：33组成的氨基酸序列。

在其他实施方案中，存在于VLP中的NA多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18，或相对于表3中通过其登录号提供的任何氨基酸序列具有至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个，至多9个，至多10个，至多20个或至多40个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。例如，在一些实例中，存在于VLP中的NA多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18，或相对于表3中通过其登录号提供的任何氨基酸序列可具有2至20、2至15、1至10、2至20、5至40、5至50、5至15或5至10个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。在其他实施方案中，NA多肽的氨基酸序列包含：(i)相对于SEQ ID NO：16至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个的氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；(ii)相对于SEQ ID NO：18至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个的氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；(iii)相对于SEQ ID NO：29至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个的氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；(iv)相对于SEQ ID NO：31至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个，至多3个、至多2个或至多1个的氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；(v)相对于SEQ ID NO：33至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个的氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)；或(vi)相对于表3中通过其登录号提供的任何氨基酸序列至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个的氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。

当将这样的变体NA序列(例如当其为VLP的一部分时)给予受试者(例如哺乳动物或鸟)时，所述序列保留其诱导免疫应答的能力。

在一些实例中，流感NA多肽包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：29、SEQID NO：31、SEQ ID NO：33或由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33组成。

还提供了编码本文公开的NA多肽的分离的核酸分子。在一些实施方案中，为了在哺乳动物或昆虫细胞中表达，对所述核酸分子进行了密码子优化。为了RNA稳定性，可进一步对所述核酸分子进行优化。基于所提供的NA蛋白序列，可以使用常规技术设计核酸分子。此外，本文提供了示例性NA编码序列。在一个实例中，用于产生本文提供的VLP的NA编码序列可以是与SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32，或与表3中通过其登录号提供的任何核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实例中，用于产生本文提供的VLP的NA编码序列可以是编码NA蛋白的核酸，其相对于SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33，或相对于表3中通过其登录号提供的任何氨基酸序列具有至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多15个、至多20个、至多40个或至多50个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。例如，用于产生本文提供的VLP的NA编码序列可以是编码NA蛋白的核酸，其相对于SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33，或相对于表3中通过其登录号提供的任何氨基酸序列具有2至20、2至15、1至10、2至20、5至40、5至50、5至15或5至10个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。

本公开内容也提供了包含这些编码重组NA多肽的核酸分子的载体。所述载体可以是任何适合用于表达NA多肽的载体，例如哺乳动物表达载体。在具体的实例中，所述载体是pCAGGS表达载体或pFastBac1杆状病毒转移载体质粒。本领域技术人员将理解，可以使用用于转染或杆状病毒表达的任何表达载体。

在一些实例中，所述载体包含可操作地连接于编码NA多肽的核酸序列的启动子。在具体实例中，启动子是CMV或SV40启动子。

还提供了包含所公开的NA表达载体的分离的细胞。在一些情况下，所述细胞是用于产生和表达VLP的任何合适的细胞类型，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞。

3.基质蛋白

本文公开的VLP，除了具有或表达HA亚型或NA亚型之外，还可以包含流感基质蛋白，例如M1、M2或两者(例如，图1B)。流感基质蛋白来自与HA或HA相同的流感类型(例如，如果VLP中的HA或NA来自A型流感，则基质蛋白来自A型流感，但是如果VLP中的HA或NA来自B型流感，则基质蛋白来自B型流感)。存在于本文提供的VLP中的基质肽序列可以是A型流感M1、M2或M1和M2序列，例如禽类M1、M2或M1和M2序列，或B型流感基质肽(例如M1、BM2或M1和BM2两者)。在一个实例中，VLP包含A型流感M1蛋白(例如，参见图1B)(例如，如果VLP包含A型流感NA或HA蛋白)。在另一个实例中，VLP包括A型流感M1和A型流感M2蛋白两者(例如如果VLP包括A型流感NA或HA蛋白)。在另一个实例中，VLP包含B型流感基质肽(例如如果VLP包含B型流感NA或HA蛋白)。在另一个实例中，VLP包含B型流感M1和B型流感BM2蛋白两者(例如，如果VLP包含B型流感NA或HA蛋白)。

在具体实例中，本文提供的VLP包含M1蛋白，例如与SEQ ID NO：20或与表2中通过其登录号提供的任何M1氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％序列同一性的M1蛋白。在一些实例中，存在于VLP中的M1具有包含SEQID NO：20的氨基酸序列或由SEQ ID NO：20组成的氨基酸序列。在其他实例中，VLP中的M1多肽包含表2中通过其登录号提供的任何M1氨基酸序列的氨基酸序列或由表2中通过其登录号提供的任何M1氨基酸序列的氨基酸序列组成。

在一个实例中，本文提供的VLP包含M2蛋白，例如与SEQ ID NO：21或与表2中通过其登录号提供的任何M2氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％序列同一性的M2蛋白。在一些实例中，存在于VLP中的M2具有包含SEQID NO：21的氨基酸序列或由SEQ ID NO：21组成的氨基酸序列。在其他实例中，VLP中的M2多肽包含表2中通过其登录号提供的任何M2氨基酸序列的氨基酸序列或由表2中通过其登录号提供的任何M2氨基酸序列的氨基酸序列组成。

在具体实例中，本文提供的VLP包含B型流感基质蛋白，例如与SEQ ID NO：35、SEQID NO：37或SEQ ID NO：39或与表2中通过其登录号提供的任何B型流感基质蛋白氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％序列同一性的B型流感基质蛋白。在一些实例中，存在于VLP中的B型流感基质蛋白具有包含SEQ ID NO：35、由SEQ ID NO：35组成、包含SEQ ID NO：37、由SEQ ID NO：37组成、包含SEQ ID NO：39或由SEQ ID NO：39组成的氨基酸序列。在其他实例中，VLP中的B型流感基质蛋白包含表2中通过其登录号提供的任何B型流感基质蛋白序列的氨基酸序列或由表2中通过其登录号提供的任何B型流感基质蛋白序列的氨基酸序列组成。

在其他实施方案中，VLP中的基质蛋白氨基酸序列相对于SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39或相对于表2中通过其登录号提供的任何氨基酸序列具有至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多15个、至多20个、至多40个或至多50个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。例如，在一些实例中，存在于VLP中的基质多肽的氨基酸序列相对于SEQID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39或相对于表2中通过其登录号提供的任何氨基酸序列可具有2至20、2至15、1至10、2至20、5至40、5至50、5至15或5至10个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。在其他实施方案中，M1多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：20包含至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。在其他实施方案中，M2多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：21包含至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。在一些实例中，M1和/或M2多肽的氨基酸序列相对于表2中通过其登录号提供的任何氨基酸序列包含至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。在其他实施方案中，B型流感基质蛋白的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39包含至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。在一些实例中，B型流感基质蛋白的氨基酸序列相对于表2中通过其登录号提供的任何氨基酸序列包含至多50个、至多40个、至多20个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。

还提供了编码本文公开的基质多肽的分离的核酸分子。在一些实施方案中，为了在哺乳动物或昆虫细胞中表达，对所述核酸分子进行了密码子优化。为了RNA稳定性，可进一步对所述核酸分子进行优化。基于所提供的基质蛋白序列，可以使用常规技术设计核酸分子。此外，本文提供了示例性的基质蛋白编码序列。在一个实例中，用于产生本文提供的VLP的M1编码序列可以是与SEQ ID NO：20或与表2中通过其登录号提供的任何核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％序列同一性的核酸序列。在一个实例中，用于产生本文提供的VLP的M2编码序列可以是与SEQ ID NO：21或与表2中通过其登录号提供的任何核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％序列同一性的核酸序列。在一个实例中，用于产生本文提供的VLP的B型流感基质蛋白编码序列可以是与SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38或与表2中通过其登录号提供的任何核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％序列同一性的核酸序列。

在一些实例中，用于产生本文提供的VLP的基质蛋白编码序列可以是下述的编码基质蛋白的核酸，其相对于SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38或相对于表2中通过其登录号提供的任何氨基酸序列具有至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多15个、至多20个、至多40个或至多50个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。例如，用于产生本文提供的VLP的基质蛋白编码序列可以是下述的编码基质蛋白的核酸，其相对于SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38或相对于表2中通过其登录号提供的任何氨基酸序列具有2至20、2至15、1至10、2至20、5至40、5至50、5至15或5至10个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。

本公开内容还提供了包含编码基质蛋白的这些核酸分子的载体。所述载体可以是任何适合用于表达基质多肽的载体，例如哺乳动物表达载体。在具体的实例中，所述载体是pCAGGS表达载体或pFastBac1杆状病毒转移载体质粒。本领域技术人员将理解，可以使用用于转染或杆状病毒表达的任何表达载体。

在一些实例中，所述载体包含可操作地连接到编码基质多肽的核酸序列的启动子。在具体实例中，所述启动子是CMV或SV40启动子。

还提供了包含所公开的表达基质蛋白的分离的细胞。在一些情况下，所述细胞是用于产生和表达VLP的任何合适的细胞类型，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞。

4.组合物的其他示例性组分

本文提供的含流感多价VLP的组合物可以包含其他试剂。在一些实例中，VLP存在于药学上可接受的载体，例如盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、芝麻油、乙醇及其组合中。所述载体和组合物可以是无菌的。所述组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。所述组合物还可含有常规的药物添加剂材料，例如调节渗透压的药学上可接受的盐、缓冲剂、防腐剂等。所述组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉末。在一个实例中，所述组合物是液体，或冻干或冷冻干燥的粉末。可采用传统的粘合剂和载体(例如甘油三酯)将所述组合物配制成栓剂。口服制剂可包括标准的载体，例如药品级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。

在一些实例中，所述含多价VLP的组合物包含药学上可接受的载体和佐剂，例如粘膜佐剂，例如CpG寡脱氧核苷酸、Flt3配体和单磷酰脂质A(MLA)中的一种或多种。在一个实例中，佐剂包括MLA，例如临床等级制剂，例如(3-O-脱酰基-4′-单磷酰脂质A)佐剂。

5.用于粘膜给予的制剂

可将本文提供的含流感多价VLP的组合物配制为用于粘膜免疫接种，例如鼻内给予。粘膜免疫接种可通过许多途径实现，包括经口的、鼻内的、肺的、直肠的和阴道的。在具体实例中，这通过鼻内给予实现。因此，在一些实例中，将所公开的组合物配制为用于鼻内给予。

例如，所公开的组合物可包含一种或多种可生物降解的粘膜粘附聚合物载体。可包括聚合物如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、壳聚糖、藻酸盐和卡波姆。亲水性聚合物，如海藻酸钠和卡波姆，通过形成氢键而吸附到粘液，因此增加在鼻中的停留时间，因此可以包含在所公开的组合物中。

在一个实例中，所述组合物包含藻酸钠，其是线性共聚物并且由1-4-连接的β-d-甘露糖醛酸和1-4-连接的α-1-古罗糖醛酸残基组成。在一些实例中，所述组合物包含藻酸盐微球。在一个实例中，所述组合物包含卡波姆(一种交联的聚丙烯酸聚合物)，例如与淀粉组合。在一些实例中，所述组合物包含壳聚糖，其是可通过壳多糖脱乙酰化而产生的无毒线性多糖。在一个实例中，壳聚糖是壳聚糖纳米颗粒的形式，例如基于N-三甲基壳聚糖(TMC)的纳米颗粒。

在一个实例中，将所述组合物配制为用于鼻内给予的微粒递送系统。在一个实例中，所述含VLP的组合物可包含脂质体、免疫刺激复合物(ISCOM)和/或聚合物颗粒，例如病毒体。在一个实例中，脂质体是表面修饰的(例如，包被有乙二醇壳聚糖或寡甘露糖)。在一个实例中，脂质体是融合的或阳离子融合的。

所述含VLP的组合物还可包含一种或多种细菌来源的脂肽或其合成的衍生物。脂质部分的实例包括三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酸(Pam3Cys)、二棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酸(Pam2Cys)、单/多链棕榈酸和脂氨基酸(LAA)。

所述含VLP的组合物还可包含一种或多种佐剂，例如粘膜佐剂，例如CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)、Flt3配体和单磷酰脂质A(MLA)中的一种或多种。在一个实例中，所述佐剂包括临床等级MLA制剂，例如(3-O-脱酰基-4′-单磷酰脂质A)佐剂。

制备VLP的方法

存在于所公开的组合物中的VLP可通过在宿主细胞中表达所需的流感HA或NA蛋白，并且在一些实例中还表达所需的流感基质蛋白(例如流感M1、M2或两者)来制备。在足以在细胞中表达HA多肽或NA多肽，并且在一些实例中还表达基质蛋白(例如流感M1、M2或其两者)的条件下，采用(1)编码流感HA多肽的载体或病毒，或编码流感NA多肽的载体或病毒并且在一些实例中还采用(2)编码流感基质蛋白(例如流感M1、M2或两者)的载体或病毒来转染或感染宿主细胞，例如哺乳动物或昆虫细胞。在一些实例中，不是由单独的载体表达，而是从与基质蛋白相同的载体中来表达NA或HA。采集或收集上清液中的VLP(例如通过上清液的离心)，并可进一步纯化和/或浓缩(例如使用不连续的蔗糖梯度或本领域已知的其他方法)。

在一个实例中，通过表达HA或NA多肽而在重组细胞中产生VLP。在一些实例中，通过表达HA或NA多肽以及流感基质蛋白(例如流感M1、M2或两者)而在重组细胞中产生VLP。HA或NA多肽以及基质蛋白可以通过已被转染或感染到细胞中的载体或病毒来表达，所述细胞例如哺乳动物细胞(例如293细胞)或昆虫细胞(例如，Sf9细胞)。在一些实例中，所述方法包括将HA或NA序列克隆到载体或病毒中。类似地，从载体或病毒(其可以是与含有HA或NA的载体/病毒相同或不同的载体/病毒)中表达基质蛋白序列。在一些实例中，所述方法包括将基质蛋白序列克隆到载体或病毒中。产生流感VLP的其他方法是已知的(参见，例如，美国专利申请公开号2006/0263804、2008/0031895、2010/0166769和2010/0239610)。

1.在哺乳动物细胞中产生VLP

在哺乳动物细胞中产生VLP的方法是已知的(例如，参见Easterbrook等人，Virology 432：39-44，2012，其通过引用并入本文)。简言之，将编码所需HA蛋白或所需NA蛋白的核酸分子(在一些实例中，连同编码流感基质蛋白的核酸分子)各自克隆到表达质粒(例如pCAGGS)中。本文提供了示例性的HA、NA、M1和M2序列(例如，参见表1-3)，并且本公开内容不限于使用特定的HA、NA、M1或M2序列。在一些实例中，为了在哺乳动物细胞中表达，可对M1、M2、NA和/或HA编码序列进行密码子优化。在一些实例中，将所得的含有HA或NA的载体与含有基质蛋白的载体一起转染到细胞中。在一些实例中，从与HA或NA相同的载体中表达基质蛋白。在一个实例中，转染是瞬时转染。可使用的细胞的实例包括293细胞、Vero细胞、A549细胞等。

将细胞在允许细胞表达HA或NA(在一些实例中还有M1、M2或两者)的条件下孵育。例如，哺乳动物细胞可在37℃下孵育约72小时。收集来自重组细胞的上清液，例如在培养约72小时后，并且可以通过低速离心(例如，在2000g下10分钟)、过滤(例如，使用0.2μm无菌过滤器)或两者除去碎片。

使用超速离心(例如，在100000g下2至4小时)浓缩VLP。可使用20-60％不连续的蔗糖梯度在130000g下将VLP进一步纯化16小时。在一些实例中，所述方法包括确定哪些级分对HA或NA活性是阳性的，其中收集阳性级分并通过在100000g下超速离心2h来浓缩。可将所得的含有VLP的沉淀重新悬浮于pH 7.2的PBS中并储存(例如，在2至8℃下冷藏或在-20至-80℃下冷冻)。可使用Bradford BCA测定(Pierce，Rockford，IL)对总蛋白进行定量，并通过考马斯亮蓝染色和半定量光密度测定分析法测量总蛋白中的HA或NA比例。掺入VLP中的蛋白的量可通过蛋白质印迹或其他免疫测定来确定。

2.在昆虫细胞中产生VLP

在昆虫细胞中产生VLP的方法是已知的(例如，参见Smith等人，Vaccine 31：4305-13，2013，其通过引用并入本文)。

简言之，将编码HA蛋白或NA蛋白的核酸分子(在一些实例中，连同编码流感基质蛋白的核酸分子)各自克隆到杆状病毒转移载体质粒(例如，pFastBac1、Invitrogen、Carlsbad、CA)中。在一些实例中，从与HA或NA相同的杆状病毒转移载体表达基质蛋白。在一些实例中，HA、NA、M1和/或M2的表达处于苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV)多角体蛋白启动子的转录控制之下。本文提供了示例性的流感HA、NA、M1和M2序列(例如，参见表1-3)，并且本公开内容不限于使用特定的序列。在一些实例中，为了在昆虫细胞中表达，可对M1、M2、NA和/或HA编码序列进行密码子优化。可将各个重组杆状病毒构建体进行噬斑纯化并制备总的原种种株，鉴定其特性，并用于制备工作病毒原种。可使用快速滴定试剂盒(例如，BacPak杆状病毒快速滴定试剂盒；Clontech，Mountain View，CA)测定杆状病毒总的原种和工作原种的效价。

将昆虫细胞，例如草地贪夜蛾(S.frugiperda)Sf9昆虫细胞(ATCC CRL-1711)作为悬浮培养物保持在27±2℃下的昆虫无血清培养基(例如，HyQ-SFX HyClone，Logan，UT)中。可通过在每细胞＜0.01噬斑形成单位(pfu)的低感染复数(MOI)下感染细胞并在感染后68-72h(hpi)收集而制备重组杆状病毒原种。

将所得的含有HA或NA的杆状病毒载体(其还可包含基质蛋白编码序列)，在一些实例中连同含有杆状病毒载体的基质蛋白一起用于感染细胞。在一个实例中，采用含有HA或NA的杆状病毒载体(在一些实例中连同含有基质蛋白的杆状病毒载体)感染约2-3×10⁶个细胞/ml。将所得的感染细胞在27±2℃下连续搅拌孵育，并收集约68-72hpi，例如通过离心(例如，4000×g，15分钟)。可从感染细胞培养基中纯化VLP。例如，可使用中空纤维切向流过滤来浓缩培养基并针对缓冲液进行透析。VLP与杆状病毒和其他污染物的分离可使用阴离子交换、随后通过凝胶过滤色谱法进行。可对在PBS中的纯化的VLP进行过滤(例如，0.2μm无菌过滤器)并储存(例如，在2至8℃下冷藏或在-20至-80℃下冷冻)。

刺激免疫应答的方法

本文提供了使用所公开的多价VLP和含VLP的组合物的方法。在一个实例中，所述方法包括在受试者中引起对流感病毒(例如A型流感、B型流感或两者)的具有广泛反应性的免疫应答。在另一个实例中，所述方法包括使受试者对流感病毒(例如A型流感、B型流感或两者)免疫或进行免疫接种。

例如，所公开的多价流感VLP可刺激具有广泛反应性的免疫应答，使得所述受试者(给予了多价VLP的动物)免受由多种A型流感病毒造成的严重疾病或死亡，而不需要攻击菌株和疫苗组成之间的匹配。本文显示，在多价VLP不合有与攻击菌株相同的HA亚型的情况下(例如，攻击菌株为H1N1，但VLP不表达H1或N1)，实现了宽泛的交叉保护。因此，所公开的多价流感VLP可用作大流行前疫苗(例如，当VLP包含含有流感HA或NA的VLP的混合物时)。

因此，在一些实例中，免疫应答针对以下的一种或多种(例如以下的至少2种、至少3种、至少4种或至少5种)：H1N1、H1N2、H1N7、H2N1、H2N2、H3N1、H3N2、H3N1、H3N1、H3N2、H3N8、H4N8、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H6N1、H6N2、H6N5、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N1、H10N7、H10N8、H11N1、H11N6、H12N5、H13N6和H14N5。在一些实例中，免疫应答针对H1N1、H1N2、H3N2、H7N9和H5N1中的一种或多种。在一些实例中，这种免疫提供针对以下的一种或多种(例如以下的至少2种、至少3种、至少4种或至少5种)的攻击的保护(例如，预防感染或阻止与感染相关的疾病的发展)：H1N1、H1N2、H1N7、H2N1、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H4N8、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H6N1、H6N2、H6N5、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N1、H10N7、H10N8、H11N1、H11N6、H12N5、H13N6和H14N5。在一些实例中，这种免疫提供针对H1N1、H1N2、H3N2、H7N9和H5N1中的一种或多种的攻击的保护(例如，预防感染或阻止与感染相关的疾病的发展)。在一个实例中，本文公开的流感VLP可用作流感疫苗，以引起针对H1N1和/或H6N1流感病毒的保护性免疫应答。

在一些实例中，免疫应答或免疫作用是采用表达不同HA或NA亚型的VLP群体，从而实现至少一种免疫应答或保护。例如，如果给予受试者表达H2、H3、H5和H7的VLP的混合物，则实现至少一种对H1流感病毒(例如H1N1)的免疫应答或免疫作用。

在一个实例中，所公开的多价流感VLP(其包含表达A型流感HA的至少一个VLP群体和具有B型流感HA的至少一个VLP群体)可刺激具有广泛反应性的免疫应答，使得受试者(给予了多价VLP的动物)免受由各种大流行前的大流行性A型流感病毒或季节性A型流感病毒和B型流感病毒造成的严重疾病或死亡，而不需要攻击菌株与疫苗组成之间的匹配。因此，所公开的多价流感VLP可用作季节性疫苗(例如，当组合物包含具有A型流感和B型流感HA或NA蛋白－－例如A型流感H1、H3、H7、H7、N1和N2，以及B型流感Yamagata系和/或Victoria系——的VLP的混合物时)。

在一些实施方案中，使用任何合适的给药途径给予所公开的多价VLP或含VLP的组合物，例如鼻内给予。在一些实施方案中，所述含VLP的组合物包含药学上可接受的载体和/或佐剂。例如，所述药学上可接受的载体可以是盐水，例如无菌PBS pH 7.2-pH 7.4。例如，所述佐剂可以是免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)、Flt3配体和单磷酰脂质A(MLA)中的一种或多种。

所公开的含VLP的组合物可用于在受试者中刺激或引起对流感病毒(例如A型流感、B型流感或两者)的免疫应答。在一些实例中，所述方法包括给予受试者治疗有效量的含有本文所提供的多价VLP的组合物，从而在受试者中引起对流感病毒的免疫应答。确定是否已经被刺激或引起免疫应答的方法是已知的，并且本文提供了一些实例。在一些实例中，如果观察到的疾病减轻(例如，更少的体重减轻、症状减轻、肺脏病理学减轻)、病毒效价降低和/或免于死亡，则实现了阳性免疫应答或免疫作用。因此，在一些实例中，所公开的方法和/或组合物将体重减轻降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％(例如在攻击后6至15天内)，例如与未接受VLP的等同受试者相比。在一些实例中，所公开的方法和/或组合物将流感感染的症状减轻至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，例如与未接受VLP的等同受试者相比。在一些实例中，所公开的方法和/或组合物将由于流感感染引起的肺脏病理学减轻至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，例如与未接受VLP的等同受试者相比。在一些实例中，所公开的方法和/或组合物将肺部病毒效价降低至少50％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍，例如与未接受VLP的等同受试者相比。在一些实例中，所公开的方法和/或组合物在随后的病毒攻击后将存活率提高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％或至少94％，例如与未接受VLP的等同受试者相比。

所公开的含VLP的组合物可用于对受试者(例如哺乳动物受试者或禽类受试者)进行针对流感病毒的免疫或免疫接种。在一些实例中，所述方法包括给予受试者治疗有效量的含有本文所提供的多价VLP的组合物，从而使受试者对流感病毒免疫。在一些实例中，如果观察到的疾病减轻(例如，更少的体重减轻、症状减轻、肺脏病理学减轻)、病毒效价降低和/或免于死亡，则实现了阳性免疫应答或免疫作用。

可给予所公开的多价流感VLP组合物的受试者的实例包括可能(或已经)感染流感的受试者。这些受试者的实例包括但不限于哺乳动物和禽类受试者，例如人、猪、鸡、火鸡、马、狗和猫。

在引起免疫应答或免疫受试者的方法的一些实施方案中，给予受试者(例如，鼻内)约1至约25μg于组合物中的至少两种不同VLP中的每一种。在具体实例中，给予受试者(例如，鼻内)约1至约5μg于组合物中的至少两种不同VLP中的每一种，约5至约20μg于组合物中的至少两种不同VLP中的每一种，约10至约15μg于组合物中的至少两种不同VLP中的每一种。在一个具体的非限制性实例中，给予受试者(例如，鼻内)约1.5μg或15μg于组合物中的至少两种不同VLP中的每一种。然而，本领域技术人员能够确定给予受试者的VLP的治疗有效量(例如提供针对H1N1流感病毒感染的保护的量)。

1.给予方法

可通过通常用于将VLP引入受试者中的任何途径将所公开的多价VLP和含VLP的组合物给予受试者。给予方法包括但不限于，真皮内、肌肉内、腹膜内、肠胃外、静脉内、皮下、粘膜、阴道、直肠、鼻内、吸入或口服。肠胃外给于，例如皮下、静脉内或肌肉内给予，通常通过注射来实现。注射剂可以以常规形式制备，作为液体溶液或悬浮液，适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或作为乳液。注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒、片剂等制备。给予可以是全身的或局部的。

将给予受试者的含多价流感VLP的组合物与至少一种药学上可接受的载体一起施予。药学上可接受的载体部分地由待给予的特定组合物以及通过用于给予组合物的特定方法来确定。因此，本公开内容的药物组合物有多种合适的制剂。药学上可接受的载体包括但不限于，盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、芝麻油、乙醇及其组合。所述组合物还可含有常规的药物添加剂材料，例如调节渗透压的药学上可接受的盐、缓冲剂、防腐剂等。所述载体和组合物可以是无菌的，并且制剂与给予模式相匹配。所述组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。所述组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂，胶囊剂、缓释制剂或粉末。

肠胃外给予的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化的林格氏试剂或不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。还可存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

一些组合物可潜在地作为药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐给予，其通过与无机酸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸以及有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸反应而形成，或通过与无机碱如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾以及有机碱如单烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、芳基胺和取代的乙醇胺反应而形成。

在具体实例中，将本文提供的组合物配制为用于粘膜免疫接种，例如经口的、鼻内的、肺的、直肠的和阴道的。在具体实例中，这是通过鼻内给予实现的。所公开的组合物可包含一种或多种可生物降解的粘膜粘附聚合物载体。可包括聚合物如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、壳聚糖(例如以壳聚糖纳米颗粒的形式，例如N-三甲基壳聚糖(TMC)基纳米颗粒)、藻酸盐(例如藻酸钠)和卡波姆。在一个实例中，所述组合物包含一种或多种亲水性聚合物，如海藻酸钠和卡波姆。在一个实例中，所述组合物包含卡波姆，例如与淀粉组合。在一个实例中，将组合物配制为用于鼻内给予的微粒递送系统。因此，所述含VLP的组合物可包括脂质体、免疫刺激复合物(ISCOM)和/或聚合物颗粒，例如病毒体。所述含VLP的组合物还可包含一种或多种细菌来源的脂肽或其合成的衍生物，例如Pam3Cys、Pam2Cys、单/多链棕榈酸和脂氨基酸(LAA)。所述含VLP的组合物还可包含一种或多种佐剂，例如CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)、Flt3配体和单磷酰脂质A(MLA)中的一种或多种。在一个实例中，所述佐剂包括临床等级MLA制剂，例如(3-O-脱酰基-4′-单磷酰脂质A)佐剂。

2.给予时间

所公开的含有两种或更多种VLP的组合物作为单剂量或多剂量(例如，加强剂量)而给予。在一些实例中，第一次给予之后是第二次给予。例如，第二次给予的含VLP的组合物可以与所给予的第一含VLP的组合物相同的或不同。在具体实例中，第二次给予的是与所给予的第一含VLP的组合物相同的含VLP的组合物。在另一个具体实例中，第二次给予的是与所给予的第一含VLP的组合物不同的含VLP的组合物。例如，如果所述第一含VLP的组合物包含第一HA亚型和第二HA亚型，则所述第二含VLP的组合物可包含第三HA亚型和第四HA亚型，其中所有四种亚型是不同的(例如H1、H2、H3、H5、H7和H9中的四种)。

在一些实例中，将含有两种或更多种VLP的组合物作为多剂量给予，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量(例如2-3个剂量)。在这些实例中，剂量之间的时间可以是至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少6周、至少8周、至少12周、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少1年、至少2年或至少5年，例如1-4周、2-3周、1-6个月、2-4个月、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、12周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、5年或10年，或其组合(例如在存在至少三次给予的情况下，其中第一剂量和第二剂量之间以及第二剂量和第三剂量之间的时间可以相同或不同)。

3.剂量

在本公开的上下文中给予受试者的剂量应足以随时间在受试者中诱导有益的治疗反应，或者抑制或预防流感病毒感染。所需要的剂量可根据受试者的物种、年龄、体重和一般状况，待治疗的感染的严重性，待使用的具体组合物及其给予方式而变化。合适的剂量可由本领域普通技术人员仅使用常规实验而确定。

在一些实施方案中，给予(例如鼻内)受试者约1至约100μg于组合物中的至少两种不同VLP中的每一种，例如约1μg至约50μg、，1μg至约25μg、1μg至约5μg、约5μg至约20μg或约10μg至约15μg于组合物中的至少两种不同VLP中的每一种。在一个具体的非限制性实例中，给予(例如鼻内)受试者约15μg于组合物中至少两种不同VLP中的每一种。在另一个具体的非限制性实例中，给予(例如鼻内)受试者约10μg于组合物中的至少两种不同VLP中的每一种。在一个具体的非限制性实例中，给予(例如鼻内)受试者约20μg于组合物中的至少两种不同VLP中的每一种。在一个具体的非限制性实例中，给予(例如鼻内)受试者约1μg或2μg于组合物中的至少两种不同VLP中的每一种。

4.测定免疫应答的方法

用于确定本文公开的含VLP的组合物是否可以或者确实引起或刺激免疫应答(例如实现成功的免疫作用)的方法是本领域已知的。例如，参见Cottey等人的CurrentContent in Immunology 19.11.1-19.11.32，2001(通过引用并入本文)。虽然本文提供了示例性的测定，但本公开不限于使用特定测定。

在给予本文提供的多价流感VLP组合物后，可进行一种或更多种测定以评估所得的免疫应答。在一些实例中，还在给予VLP之前进行测定，以用作基线或对照。在给予VLP组合物后从受试者中收集样品，例如血液样品或血清样品。在一些实例中，在第一次VLP给予后至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周或至少8周(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周)后收集样品。也可以获得随后的样品，例如在随后的VLP给予之后。

a.血凝素效价测定

在一个实例中，在产生和纯化本文提供的含VLP的组合物之后，进行血凝素效价测定。可进行这样的测定以测量或评价血凝单位(HAU)。这被用于评价VLP表达功能性HA三聚体，并且可被用于对VLP制剂中的HA蛋白进行定量。血凝素效价也用于对攻击病毒使用的流感病毒的量进行定量，或例如用于对存在于受攻击的动物的肺部或呼吸道中的病毒的量(效价测定)进行定量。与假接种的受试者相比，接种的受试者可表现出病毒效价的降低。

该测定可用于对VLP的量进行定量或也用于对样品中的病毒进行定量，例如来自在给予本文提供的含VLP的组合物之前接受病毒攻击的受试者的肺脏样品。将VLP或病毒原种进行系列稀释(例如，从1∶4至1∶4096的2倍稀释法)，然后加入到含有红血细胞(RBC)的孔中。将RBC溶液(例如0.75％至1％RBC)加入到孔中。然后将混合物在室温下孵育30分钟，这使RBC沉降。然后分析样品的所得凝集模式，例如通过检查其中含有样品的微量滴定孔。例如，在放置在其边缘上的微量滴定板中，RBC对照孔中的RBC将流动成为特征性泪珠形状(不存在流感病毒，因此不存在凝集)。含有流感病毒的孔将不同程度地使RBC凝集。具有最大量病毒的孔将出现混浊，因为病毒已经交叉结合了所有的红血细胞，防止其沉淀。在后续孔中更少量的病毒可导致部分凝集，但是沉淀物不会类似于RBC对照孔中的沉淀物流动成为泪珠形状。终点通常被确定为导致RBC完全凝集的VLP或病毒样品的最大稀释度。

可以测定待滴定样品中的血凝单位(HAU)的数量。HA效价是显示RBC完全凝集的一系列孔的最后一个的稀释度的倒数(例如，如果最后一次稀释度为1∶640，样品的效价为640HA单位/5μl样品)。

b.血细胞凝集抑制(HAI)测定

在一个实例中，在给予本文提供的含VLP的组合物后，进行血细胞凝集抑制(HAI)测定。流感病毒可使红血细胞凝集，这是一种被称为血细胞凝集的过程，如上所述。在存在针对表面血凝素的特异性抗体的情况下，血细胞凝集被阻断。这种现象提供了HAI测定的基础，其用于检测并对血清中的特异性抗病毒抗体进行定量。因此，HAI测量阻断HA受体结合的抗体的存在(如通过RBC的血细胞凝集评估)。

在一个实例中，采用受体破坏酶(RDE)在37℃下过夜处理血清，该血清待评估抗血凝素的头部的抗体的存在。第二天，通过在56℃下孵育1小时使RDE失活。所使用的测定板是96孔、非无菌的、非组织培养处理的、圆底微量滴定板。对从B行至G行的平板下的每个样品进行两倍系列稀释。将50μl病毒抗原的工作稀释液(一定数量的HAU)加入到微量滴定板的所有孔中，H行(RBC对照孔)和抗原对照孔除外。将平板在室温下孵育30min。向所有孔中加入50μl 1％RBC于PBS中的悬浮液，并将平板在室温下孵育30至45min。分析微量滴定板以读取凝集模式。阴性对照孔(含有无抗流感抗体的正常血清的孔)将出现混浊，因为流感病毒已完全使RBC凝集。阳性对照孔(含有已知的抗流感抗血清的孔)将具有在外观上类似于H行对照沉淀物的RBC沉淀物，只要有足够的抗流感抗体抑制凝集即可。随着血清稀释度的增加，抗体的量将减少，以使得增加的RBC凝集的量将变得明显。每个血清样品的血细胞凝集抑制(HAI)效价是完全抑制RBC凝集的最大稀释度的倒数(即，形成RBC沉淀物的稀释系列中的最后一个孔)。每个样品的HAI效价是其平行两份稀释系列的终点效价的平均值。如果平行两份的效价相差超过一个两倍稀释，则可对该样品重复测定HAI效价。

c.流感病毒中和测定

在一个实例中，在给予本文提供的含VLP的组合物后，进行中和测定。在该测定中，将来自接受本文提供的含VLP的组合物的受试者的血清样品稀释，加入流感病毒，并测定防止病毒生长所需的血清量。中和评估抑制病毒复制的抗体的存在。例如，针对HA茎部的抗体可以中和病毒复制，但不影响血细胞凝集，因为表位不在受体结合结构域周围。结合至头部并抑制血细胞凝集的抗体通常是中和的。

在一些实例中，将血清样品在组织培养基(例如含有抗生素的DMEM/5％FBS)中孵育，例如在96孔、圆底、组织培养物处理过的微量滴定板中。将血清样品进行系列稀释，例如在微孔板的两个相邻孔中(例如最初以1∶10稀释至1∶640的样品稀释液)。可将先前测定了效价的(任何亚型的)流感病毒稀释至含有1TCID50/50μl。将等量的工作原种病毒(例如约50TCID₅₀)加入到各血清样品(包括系列稀释液)中，并在37℃下孵育1小时。采用该方案，如果病毒的最终量在10至100TCID₅₀之间，则获得相同的中和效价。孵育后，向血清样品(例如，向微量滴定板的所有孔)中加入含有2.5×10⁵个MDCK细胞/ml(或其他细胞)的组织培养基(例如含有抗生素的DMEM/5％FBS)。将其在加湿的37℃、5％CO2培养箱中孵育过夜。注意一些流感病毒在34℃至35℃的温度下生长更好，因此在一些实例中使用这些温度。除去培养基，并替换为含有胰蛋白酶(例如0.0002％)的组织培养基(例如含有抗生素的DMEM)，并将混合物在加湿的37℃、5％CO2培养箱中孵育4天。随后，加入无菌的0.5％RBC/PBS溶液，将混合物在4℃下孵育1小时，并检查孔中是否存在凝集。特定血清样品的病毒中和效价被定义为在两个孔都不显示RBC凝集的情况下最高血清稀释度的倒数。

含有足够浓度的流感病毒中和抗体的样品(例如，在微孔中)将防止病毒感染细胞，从而不会发生病毒增殖。向这些孔中加入RBC将导致RBC沉淀物的形成。相比之下，不合有或含有低于中和浓度的抗流感抗体的样品(例如，在微孔中)将在4天孵育结束时存在流感病毒。加入到这些样品中的RBC将凝集。流感病毒交叉结合红血细胞，抑制它们在微孔中的沉降，因此孔显现混浊。

d.神经氨酸酶抑制(NI)抗体的效价测定

如果组合物中的VLP含有NA蛋白，则可以测定神经氨酸酶抑制(NI)抗体的效价。为了测量NI抗体的效价，可产生含有合适的NA的重配病毒，例如通过使用基于质粒的反向遗传法(例如，参见Sandbulte等人，Influenza Other Respir Viruses 3：233-40，2009)。合适的NA将是与存在于给予受试者的VLP中的NA相同的NA。可使用胎球蛋白作为NA底物进行NI测定(例如，参见Cate等人，Vaccine 28：2076-9，2010，其通过引用并入本文)。下面提供示例性的方法。

NI效价是提供至少50％的NA活性抑制的血清的最大稀释度的倒数。预期使用本文公开的VLP将降低或甚至消除接受多价VLP组合物的受试者中的攻击病毒效价。例如，预期接受多价VLP组合物的受试者在肺脏中比未接受多价VLP组合物的受试者(例如，假接种)具有少至少10倍、至少20倍、至少50倍或甚至100倍的病毒。

NI抗体效价可在酶联凝集素测定法中测定，其使用过氧化物酶标记的花生凝集素(PNA-PO)结合脱唾液酸化的胎球蛋白。NA活性可通过在胎球蛋白包被的微量滴定板上孵育纯化的、全长NA的系列稀释液来测定。在室温下孵育30min后，洗涤平板并加入PNA-PO。在室温下孵育1h后，再次洗涤平板并加入过氧化物酶底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，并进行10min的显色。停止显色，测量平板的OD450。测定对应于95％NA活性的稀释度。

可在血清的1∶20稀释度下开始，然后在96孔U形底组织培养板中进行2倍系列稀释来测量针对NA亚型的NI效价。将对应于95％最大活性的NA加入到稀释的血清中，并在室温下孵育30min，之后将血清/NA样品转移至胎球蛋白包被的微量滴定板中。将平板在37℃下孵育2h，洗涤并加入PNA-PO。将平板在室温下再孵育1小时，洗涤并加入过氧化物酶底物TMB。10min后停止显色，测量平板的OD450。NI效价是50％NA活性被抑制的稀释度的倒数。该测定的定量下限为20；低于20的效价被认为是阴性的并且赋值为10。在一些实例中，良好的或阳性响应产生＞30的值，而差的或无响应产生＜20的值。

e.病毒的肺部效价和病理学

可测定病毒的肺部效价和病理学。将组织样品如肺脏样品(例如，充气的肺脏样品)固定(例如，在10％甲醛中固定24h)、包埋(例如在石蜡中)、切成切片(例如1至10μm，例如5μm)并安放。

流感病毒抗原分布可通过免疫组织化学使用适当的抗体(例如，可使用对用于攻击受试者的病毒特异性的或与不同流感病毒毒株具有交叉反应性的多克隆或单克隆抗体)进行评估。预期使用本文公开的VLP将降低或甚至消除接受多价VLP组合物的受试者中的病毒效价。例如，预期接受多价VLP组合物的受试者在肺部比未接受多价VLP组合物的受试者(例如，假接种)具有少至少10倍、至少20倍、至少50倍或甚至100倍的病毒。在另一个实例中，预期使用本文公开的VLP将在接受多价VLP组合物的受试者中降低或甚至消除流感感染的症状，例如支气管炎、细支气管炎、肺泡炎和/或肺水肿。例如，预期接受多价VLP组合物的受试者相对于未接受多价VLP组合物的受试者(例如，假接种)具有至少20％、至少50％、至少75％或至少90％更少的支气管炎、细支气管炎、肺泡炎和/或肺水肿(或这些症状的严重程度的这种降低)。

F.其他示例性测定

在一些实例中，评估受试者的呼吸性IgA和全身性IgG、T细胞应答。这样的方法是常规的(例如，参见Gauger等人，Methods Mol Biol.1161：303-12，2014；Larsen等人，VetMicrobiol.74(1-2)：117-31，2000；Steitz等人，PLoS One.5(5)：e10492，2010)。

在一些实例中，通过转录组学和细胞因子ELISA或其他细胞因子免疫测定来分析免疫应答。这样的方法是常规的。

在一些实例中，通过微量中和来分析免疫应答。这样的方法是常规的(例如，参见Gauger等人，Methods Mol Biol.1161：313-24，2014)。

在一些实例中，通过抗HA茎部的测定来分析免疫应答。这样的方法是常规的(例如，Wu等人，PLoS One 7(8)：e42363，2012)。

实施例1

HA VLP的产生

该实施例描述了用于产生含有不同HA亚型的VLP的方法。然而，本领域技术人员将理解，可使用其他HA序列(例如，可使用其他H1序列)，并且可使用NA序列(例如本文提供的那些)代替HA序列。此外，应当理解，可使用杆状病毒/昆虫细胞系统作为下述载体/哺乳动物系统的替代物来产生VLP。

Easterbrook等人的一般方法(Virology 423：39-44，2012，通过引用并入本文)被用于制备VLP，除了使用HA代替NA之外。产生了以下VLP：(1)H1+M1+M2，(2)H2+M1+M2，(3)H3+M1+M2，(4)H5+M1+M2和(5)H7+M1+M2。

简言之，(1)H1：A/mallard/Ohio/265/1987(H1N9)登录号CY017275.1(SEQ ID NO：1)，或H1：A/South Carolina/1/1918(H1N1)登录号AF117241.1(SEQ ID NO：3)；(2)H2：A/green-winged teal/Ohio/175/1986(H2N1)登录号CY018877.1(SEQ ID NO：5)，或H2：A/Japan/305/1957(H2N2)登录号J02127.1(SEQ ID NO：7)；(3)H3 A/pintail/Ohio/339/1987(H3N8)登录号CY019197.1(SEQ ID NO：9)；(4)H5 A/mallard/Maryland/802/2007(H5N1)登录号CY017781.1(SEQ ID NO：11)；和(5)H7：A/Environment/Maryland/261/2006(H7N3)CY022749.1(SEQ ID NO：13)的HA基因节段各自分别克隆到pCAGGS表达质粒中，并与在pCAGGS中的A/New York/312/2001(H1N1)M基因节段(GenBank登录号CY002697.1，SEQ IDNO：19)一起，使用Polyjet DNA转染试剂(SignaGen，Rockville，MD，USA)转染到293T细胞中。在一些实例中，将HA和M的节段克隆到pFasBac表达载体多角体启动子的紧邻下游中并使用标准杆状病毒表达系统产生VLP(例如，将含有HA和M1基因的两个单独的杆粒用于产生H1 VLP，或将含有侧翼HA/M1基因的单个杆粒用于产生H3、H5和H7 VLP)。72h后收集细胞培养上清液，通过在2000g下离心10min除去碎片。

通过在100000g下超速离心2h来浓缩VLP，并使用20-60％不连续蔗糖梯度在130000g下纯化16h。收集对HA活性而言阳性的级分，并通过在100000g下超速离心2h来浓缩。使用Bradford BCA测定(Pierce，Rockford，IL)对总蛋白进行定量，并通过考马斯亮蓝染色和半定量光密度测定分析法测量总蛋白的NA比例。掺入VLP中的M和其他细胞蛋白的量被确定为大约＜25％；通过蛋白印迹，没有检测到M2。

使用血细胞凝集测定法测量VLP的HA活性。

通过阴性染色透射电子显微镜(TEM)证实HA和NA VLP的结构和形状(图2A-2C)。

实施例2

在小鼠中刺激针对H1N1和H6N1的保护性免疫应答

本实施例描述了用于使用实施例1中描述的VLP对小鼠进行免疫的方法。然而，本领域技术人员将理解，可使用其他VLP(例如，可使用其他HA-VLP和/或NA-VLP)，并且可类似地如对小鼠所描述的那样对其他动物(例如，白鼬、人、鸟等)进行免疫。

在公开的实验中，在不存在HA抗原的情况下，仅NA VLP免疫接种的小鼠完全免受致命性H5N1攻击(图3；Easterbrook等人，Virology.432：39，2012)。这证明了NA免疫在减轻病毒感染和保护动物免于致命感染中的重要性。

在免疫或病毒攻击前，采用补充有O2(1.5L/min)的异氟烷轻轻地麻醉7-8周龄的雌性BALB/c小鼠的组(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME；n＝10/治疗组)。采用50μl1.5μg的各HA亚型(H1、H2、H3、H5和/或H7)对小鼠(n＝10/组)进行鼻内(i.n.)免疫，以引起粘膜以及血清、抗体应答。采用PBS处理“假接种的”小鼠。

在初次接种后三周，通过相同的途径采用相同量的VLP对小鼠进行加强免疫。初次接种后6周(加强后3周)或感染后6周，将小鼠麻醉，并采用于50μl DMEM中的10×MLD₅₀的1918H1N1或鸟类H6N1进行鼻内攻击。监测存活率和体重14天，如果初始体重减轻超过25％，则对小鼠实施安乐死。

在一个实验中，采用表达4种不同HA亚型(H2、H3、H5和H7)的仅含HA的VLP的多价混合物对小鼠进行鼻内接种。对小鼠进行接种，使得一组最初接受H2和H5VLP，并在第3周用H3和H7VLP的混合物加强接种。第二组最初用H3和H7VLP接种，接着用H2和H5 VLP加强接种。第三组是进行假接种。在第6周时，采用致死剂量(10×MLD₅₀)的1918 H1N1A型流感病毒攻击所有动物。如图4所示，在采用H2+H3+H5+H7接种但未采用H1接种的小鼠中，在采用1918 H1N1病毒的10×MLD₅₀致死攻击后实现了100％的存活率。采用不合H1亚型的HA VLP的多价疫苗混合物从H1亚型病毒的致命攻击中观察到了完全的异亚型保护。

在另一个实验中，在两组(组1：H1、H2、H3和H7；组2：H1、H3、H5和H7)中，采用表达4种不同HA亚型的仅含HA的VLP的多价混合物对小鼠进行鼻内接种。对小鼠进行接种，使得第一组最初接受H1和H3VLP，并在第3周用H2和H7VLP的混合物加强接种。第二组最初用H3和H5VLP接种，接着用H1和H7VLP加强接种。第三组是进行假接种。在第6周时，采用致死剂量(10×MLD₅₀)的鸟类H6N1A型流感病毒攻击所有动物。如图5所示，在采用H1+H2+H3+H5或H7接种但未采用H6接种的小鼠中，在采用鸟类H6N1病毒的10×MLD₅₀致命攻击后实现了100％的存活率。采用不合HA VLP的H6亚型的多价疫苗混合物从H6亚型病毒的致命攻击中观察到了完全的异亚型保护。

因此，不同HA VLP的多价混合物可完全保护免受与1918 H1N1(图4)或鸟类H6N1(图5)流感病毒的异源致命攻击。交叉保护性免疫由VLP引起，因为所用的多价疫苗不含有随后的致命攻击病毒的HA亚型。

实施例3

在小鼠中刺激针对H1N1和H6N1的保护性免疫应答

如实施例1中所描述的产生VLP，并如实施例2中所描述的给予所述VLP。

简言之，采用表达4种不同HA亚型(H1、H3、H5、H7)的仅含HA的VLP(各1.5μg的HA)的多价混合物对小鼠进行鼻内接种。采用相同的混合物在第3周对小鼠进行加强接种。第二组小鼠进行假接种。在第6周时，采用致死剂量(10×MLD₅₀)的1918H1N1病毒、高致病性H5N1、H7N9、1957大流行H2N2、鸟类H6N1或鸟类H10N1病毒攻击动物。将监测小鼠的存活率。

预期该VLP的多价混合物将保护小鼠免受所有这些病毒的攻击。

实施例4

添加佐剂刺激保护性免疫应答

采用含有和不含10μg MPL佐剂(TLR激动剂)的5μg表达单价鸟类H1的VLP(使用实施例1的方法产生)或PBS对小鼠进行接种。随后采用相同的VLP或PBS对小鼠进行加强接种。加强接种后3周，采用致死剂量的1918H1N1病毒攻击小鼠。如图6所示，所有接种的小鼠存活。

在1918病毒攻击之前，血清学研究表明在接受MPL佐剂化的VLP疫苗的小鼠中观察到更高的中和效价(图7)。

实施例5

VLP疫苗的产生和在小鼠中的测试

将如实施例1所描述的产生多价鼻内疫苗制剂，其包含分别表达H1、H3、H5和H7的HA VLP的混合物，并将其如实施例2所描述的给予小鼠(但是两次给予的VLP将是相同的，如在实施例3中那样)。VLP也将包含M1和M2。本领域技术人员将理解，可类似地测试本文提供的其他多价流感VLP组合物。

随后(第一次VLP给予后4至6周)分别采用致死剂量(10×MLD₅₀)的多种致病性流感病毒攻击小鼠，所述致病性流感病毒包括1918 H1N1、1957H2N2和2009H1N1大流行病毒，高致病性H5N1、H7N9、H6N1和H10N1禽流感病毒，以及其他相关的攻击病毒(例如H7N1、H7N9和H11N1)。

将评价小鼠的存活率和接种诱导的免疫，例如，通过血细胞凝集抑制、微中和、抗HA茎部的试验以及神经氨酸酶抑制试验。还将通过转录组学和细胞因子ELISA评估接种的动物的呼吸性IgA和全身性IgG、T细胞应答、病毒的肺部效价和病理学以及免疫应答。

在一个实例中，采用各1.5μg的H1、H3、H5和H7VLP(总计6μg)对八至九周龄的雌性BALB/c小鼠进行鼻内接种，或采用PBS进行假接种。VLP还含有M1。在免疫后第21天对小鼠进行加强接种。在初次免疫后第50天，采用致死剂量(参见表4)的多种攻击性A型流感病毒攻击小鼠，并每日称重。攻击病毒如下产生。使用基于标准反向遗传学的系统来产生A型流感病毒。使用来自流感A/Green Wing Teal/Ohio/175/1986(H2N1)的PB1、PB2^E627K、PA、NP、NA、M和NS基因节段，以及如之前所述的(35)H6、H7或H10HA节段来恢复的等基因嵌合病毒。嵌合体也使用来自A/South Carolina/1/1918(H1N1)、A/Japan/305/1957(H2N2)的HA节段以及A/green-winged teal/Ohio/340/1987(H11N9)的实验室变体来产生。野生型(WT)流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)和A/Vietnam/1203/04(H5N1)也被用作攻击病毒。所有WT和嵌合病毒在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞中传代1至2次。使用噬斑测定法对病毒进行序列验证并测定效价。在生物安全水平3增强实验室(BSL3+)条件下处理病毒和样品。根据国立卫生研究院(NIH)、疾病控制与预防中心(CDC)和美国农业部(USDA)的选择试剂(Select Agent)指南，在BSL3+条件下处理A型流感/H5N1病毒和传染性样品。

表4.所使用的攻击病毒的性质和攻击后的存活率

＊攻毒病毒：使用来自流感A/Green Wing Teal/Ohio/175/1986(H2N1)的PB1、PB2^E627K、PA、NP、NA、M和NS基因节段，以及H6、H7或H10 HA节段来恢复的嵌合病毒。嵌合体也使用来自A/South Carolina/1/1918(H1N1)、A/Japan/305/1957(H2N2)的HA节段以及A/green-winged teal/Ohio/340/1987(H11N9)的实验室变体来产生。野生型(WT)流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)和A/Vietnam/1203/04(H5N1)也被用作攻击病毒。

小鼠接种和感染是如下进行的。对8-9周龄雌性BALB/c小鼠(JacksonLaboratories，Bar Harbor，ME)进行小鼠50％致死剂量(MLD₅₀)测定，以评估如前所述的(Qi等，mBio 5：e02116，2014)嵌合病毒和WT病毒的小鼠致病性。对于接种研究，在第0天，采用稀释在总计50μl PBS中的各1.5μg H1、H3、H5和H7VLP对8-9周龄雌性BALB/c小鼠(JacksonLaboratories，Bar Harbor，ME)(n＝5-10/治疗组)进行鼻内(i.n.)接种。观察小鼠并在第21天采用相同的6μg剂量进行鼻内加强接种。在接种小鼠的同时，采用50μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)对假接种小鼠同龄组进行鼻内接种和加强接种。为了评价在年老小鼠中的疫苗效力，在第0天和第21天，对37周龄Balb/c雌性小鼠进行鼻内接种和加强接种。在第50天，采用于50μlDulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)中稀释的10×MLD₅₀病毒对小鼠进行鼻内攻击。为了评估保护的长久性，在攻击前将小鼠再饲养6个月。根据NIH、CDC和USDA的选择试剂(Select Agent)指南，在ABSL3+条件下处理A型流感/H5N1病毒和传染性样品。监测存活率和体重14天，如果初始体重减轻超过25％，则对小鼠实施人道的安乐死。通过Kaplan-Meier存活率分析(Graph Pad Prism，LaJolla，CA)分析存活率和平均死亡时间。使用Student′st检验评估重量减轻最低值百分数、肺部病毒效价和抗体应答方面的差异。如果p＜0.05，则认为平均差异具有统计学显著性。在感染后第3天从H6N1感染的、H10N1感染的和AnhuiH7N9感染的动物中收集小鼠肺脏以进行病毒滴定。如前所述测定各肺脏样品的病毒效价(Id.)。

VLP接种的(图8A-C实心正方形)和假接种的(图8A-C圆圈)小鼠的重量减轻(i、iii、v、vii)表示为初始重量±SD的平均百分数。评估攻击后14天的VLP接种的(图8A-C实线)和假接种的(图8A-C虚线)小鼠的存活率(ii、iv、vi、viii)。在感染后第3天，收集肺脏并通过噬斑测定在测量肺部的病毒复制(图9A-9D)。对一些小鼠进行接种但直到接种后6个月还未被攻击(图10A)或在约1岁时进行接种(图10B)。

这种VLP的多价混合物表现出在小鼠中提供对所有这些病毒的致命攻击的显著保护(图8A-8C)。总之，与假接种小鼠5.3％的存活率(4/75只动物；p＜0.001)相比，94.4％的接种的小鼠在攻击中存活(84/89只动物)。当采用表达与疫苗中所含有的那些相同的HA的病毒攻击时(采用1918H1N1和鸟类H7N1的同源攻击；图8A)，接种的小鼠表现出100％的存活率，只有最小的重量减轻最低值(对于1918H1N1为0.6％，对于H7为3.0％)。假接种的动物在攻击后全部死亡。在第二组实验中，两种攻击病毒表达来自相同亚型的不同菌株的HA，但不与疫苗HA在抗原性方面匹配(采用H5N1和H7N9进行的亚型内异源攻击；图8B)。此时，接种的小鼠在A/Anhui/1/2013(H7N9)病毒攻击后(体重减轻最低值3.7％)也表现出100％的存活率，以及在A/Vietnam/1203/2004高致病性H5N1病毒攻击后(体重减轻最低值10.4％)表现出90％的存活率。假接种的动物表现出迅速的体重减轻和总计96％的致死率(24/25)。在第三组实验中，四种表达HA亚型的攻击病毒不包含在疫苗中(异亚型攻击)：表达1957大流行H2(H2N1)的病毒，以及鸟类H6N1、H10N1和H11N1 IAV病毒(图8C)。这些接种的动物在采用H2N1(体重减轻最低值17.2％)、H10N1(体重减轻最低值11.7％)和H11N1(体重减轻最低值4.7％)攻击后均表现出100％的存活率，并且用H6N1(体重减轻最低值6.7％)攻击后表现出83.3％的存活率。假接种的动物针对这四种攻击病毒表现出迅速的体重减轻和总计92.5％的致死率(37/40)。因此，如图8A-8C所示，对于所有攻击组，与假接种的小鼠相比，接种的小鼠具有显著降低的体重减轻(双尾、未配对的Student’s t检验；Welch’s校正；p＜0.01)。

此外，与假接种的小鼠相比，对于四种病毒中的每一种，接种的小鼠具有显著降低的病毒肺部效价(例如约0.5-5log₁₀ PFU)(图9A-9D，每组n＝5，双尾Student’s t检验；p＜0.01)。接种但直到接种后6个月还未被攻击的小鼠也表现出对H7N9和H10N1流感病毒亚型的致死攻击的显著保护(图10A)。在采用H7N9进行异源(亚型内)攻击后，小鼠表现出100％的存活率，在采用H10N1进行异亚型攻击后，表现出80％的存活率(图10A)。在每种情况下，假接种的动物在攻击后均表现出80％的致死率。

年老的成年动物在IAV感染后尤其易感染严重疾病，并且在该组中，疫苗比在年轻的成年动物中的有效性低。为了在年老动物中评价VLP混合物，对8月龄的小鼠进行接种并如上进行加强接种，然后采用H10N1进行异亚型攻击。年老小鼠(在约1岁时接种)也被显著保护免受H10N1流感病毒攻击(图10B)。与假接种的年老小鼠的无存活相比，66.7％的VLP接种的年老小鼠在致命性H10N1病毒攻击中存活(图10B)；与假接种的动物相比，病毒肺部效价降低约1log₁₀ PFU。

实施例6

VLP疫苗的产生和在小鼠中的测试

如实施例1所描述的，产生多价鼻内疫苗制剂，其包含分别表达H1、H2、H3、H5、H7和任选的H9的HA VLP以及分别表达N1和N2的NA VLP的混合物，并将其如实施例2所描述的给予小鼠(但是两次给予的VLP是相同的，如在实施例3中的那样)。VLP也将含有M1和M2。多价VLP组合物还将含有MPL作为佐剂。本领域技术人员将理解，可类似地测试本文提供的其他多价流感VLP组合物。

随后(在第一次VLP给予后4至6周)，分别采用致死剂量(10×xMLD₅₀)的多种致病性流感病毒攻击小鼠，所述致病性流感病毒包括1918 H1N1、1957 H2N2、1968 H3N2和2009H1N1大流行流感病毒、高致病性H5N1、H7N9和H6N1禽流感病毒，以及其他相关的攻击病毒。

评价小鼠的存活率和疫苗诱导的免疫，例如通过血细胞凝集抑制、微中和和抗HA茎部试验以及神经氨酸酶抑制试验。还通过转录组学和细胞因子ELISA评估接种的动物的呼吸性IgA和全身性IgG、T细胞应答、病毒肺部效价和病理学以及免疫应答。

预期这种VLP的多价混合物将保护小鼠免受所有这些病毒的攻击。

实施例7

VLP疫苗的产生和在白鼬中的测试

如实施例1所描述的，产生多价鼻内疫苗制剂，其包含分别表达H1、H2、H3、H5、H7和任选的H9的HA VLP描以及分别表达N1和N2的NA VLP的混合物，并将其如实施例2所述的给予白鼬(但是两次给予的VLP是相同的，如在实施例3中的那样)。VLP也将含有M1和M2。多价VLP组合物还将含有MPL作为佐剂。本领域技术人员将理解，可类似地测试本文提供的其他多价流感VLP组合物。

Fitch白鼬(Mustela putorius furo，雌性，6-12月龄)，未接触过流感的且脱除气味的(de-scented)，可购自Marshall Farms(Sayre，PA，USA)。将白鼬成对饲养在含有Sani-chips实验室动物垫层(P.J.Murphy Forest Products，Montville，NJ，USA)的不锈钢笼子(Shor-line，Kansas City，KS，USA)中。为白鼬提供Teklad全面白鼬饮食(Harlan Teklad，Madison，WI，USA)和无限制的淡水。

在第0周，鼻内给予白鼬两个剂量的多价流感VLP组合物(各自含HA/NA 2-10μg)，然后在第3周采用相同剂量进行加强接种。在接种方案期间，每周监测动物的不良事件，包括体重减轻、体温、运动减少、流鼻涕、打喷嚏和腹泻。在接种之前，通过HAI测定确认动物对于流行性A型流感和B型流感病毒是血清阴性的。在每次接种后14至21天，经由前腔静脉从麻醉的白鼬中采集血液并转移到微量离心管中。将离心管离心，去除血清并在-80±5℃下冷冻。可分析血清的免疫应答，例如通过HAI血清抗体效价。

在最后接种后一至三周，分别采用致死剂量(10×MLD₅₀)的对种致病性流感病毒对白鼬进行鼻内攻击，所述致病性流感病毒包括1918 H1N1、1957 H2N2、1968 H3N2和2009H1N1大流行流感病毒、高致病性H5N1、H7N9和H6N1禽流感病毒，以及其他相关的攻击病毒。感染后，感染后14天每天监测白鼬的体重减轻、疾病症状和死亡。在接种后的每一天记录每组的个体体重、疾病评分和死亡。接种后，通过每天将3ml PBS滴入麻醉的白鼬的鼻孔中进行鼻洗涤7天。收集洗涤液并储存在-80℃备用。也可以收集血清。

将评价白鼬的存活率和疫苗诱导的免疫，例如通过血细胞凝集抑制、微中和和抗HA茎部试验以及神经氨酸酶抑制试验。还将通过转录组学和细胞因子ELISA评估接种的动物的呼吸性IgA和全身性IgG、T细胞应答、病毒肺部效价和病理学以及免疫应答。

预期这种VLP的多价混合物将保护白鼬免受所有这些病毒的攻击。

实施例8

人临床试验

在选择最佳的在实验动物中具有广泛交叉反应性的VLP疫苗后，将采用多价流感VLP(例如使用药品生产质量管理规范(GMP)而生产的，例如来自Paragon Bioservice，Baltimore，MD)在人类志愿者中进行研究。在一些实例中，所述VLP还将含有M1和M2。在一些实例中，多价VLP组合物还将含有MPL作为佐剂。

将使用GMP方法而生产的多价鼻内疫苗制剂，其包含分别表达H1、H2、H3、H5、H7和H9的HA VLP以及分别表达N1和N2的NA VLP的混合物，并将其鼻内给予人体。本领域技术人员将理解，可类似地测试本文提供的其他多价流感VLP组合物。

简言之，采用VLP的多价混合物(10μg-20μg，例如的各HA/NA)对人进行鼻内接种。约3-12周后(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周后)，采用相同的混合物对人进行加强接种。第二组人进行假接种(例如用盐水)。可获得血液和鼻腔样品并将它们储存。在研究过程中，将监测患者的任何不良事件(AE)。由于VLP疫苗不具有传染性，因此预期它们具有优异的安全性。

如果在I期试验中显示VLP组合物是安全的，则将使用人类志愿者流感攻击模型进行II期效力试验，如在NIH临床中心所开发的(例如，参见Memoli等人，Validation of aWild-Type Influenza A Human Challenge Model：H1N1pdMIST，An A(H1N1)pdm09DoseFindingIND Study)。将筛选受试者的健康状态，并通过HAI测定针对2009大流行H1N1病毒攻击的低效价(＜1∶10)来筛选受试者。参与研究的经过筛选的患者将采用VLP的多价混合物(群组1)进行鼻内接种或者采用盐水(群组2)进行假接种。将在第三周时对他们进行加强接种，然后在第六周时，通过HAI或其他试验来评估他们的血清学效价，并且将采用一定剂量的验证过的病毒攻击受试者，以在多于60％的攻击前HAI效价＜1∶10的受试者中诱导流感疾病和脱落(shedding)。将通过对接种的血清学应答的发展、症状减轻、病毒效价降低和/或病毒脱落持续时间的减少来评估疫苗效力。

考虑到可应用本公开的原理的许多可能的实施方案，应当认识到，所示出的实施方案仅仅是本公开的实例，并且不应被视为是对本发明范围的限制。相反，本公开的范围由所附的权利要求限定。因此，申请人要求保护所有落入这些权利要求的范围和精神内的内容作为申请人的发明。

Claims (29)

1.一种组合物，其包含：

至少两种不同的流感病毒样颗粒(VLP)，含有第一流感血凝素(HA)多肽的第一VLP和含有第二流感HA多肽的第二VLP，其中所述第一和第二HA多肽是不同的亚型和/或来自不同的流感病毒；以及

药学上可接受的载体。

2.权利要求1或2的组合物，其中：

所述第一流感HA多肽包含A型流感HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16；和

所述第二流感HA多肽包含A型流感HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16，其中所述第一和第二A型流感HA多肽是不同的亚型。

3.权利要求1或2的组合物，其中：

所述第一流感HA多肽包含A型流感HA亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13或H16；

所述第二流感HA多肽包含A型流感HA亚型H3、H4、H7、H10、H14或H15。

4.权利要求1或2的组合物，其中：

(i)所述第一流感HA多肽包含A型流感HA亚型H1、H2或H5；且

所述第二流感HA多肽包含A型流感HA亚型H3、H7或H9；或

(ii)所述第一流感HA多肽包含A型流感HA亚型H1、H2、H3、H5、H7或H9；且

所述第二流感HA多肽包含A型流感HA亚型H1、H2、H3、H5、H7或H9，其中所述第一和第二A型流感HA多肽是不同的亚型。

5.权利要求1至4中任一项的组合物，其中：

所述第一流感HA多肽包含A型流感HA亚型H2且所述第二流感HA多肽包含A型流感HA亚型H5；

所述第一流感HA多肽包含A型流感HA亚型H3且所述第二流感HA多肽包含A型流感HA亚型H7；

所述第一流感HA多肽包含A型流感HA亚型H1且所述第二流感HA多肽包含A型流感HA亚型H3；

所述第一流感HA多肽包含A型流感HA亚型H2且所述第二流感HA多肽包含A型流感HA亚型H7；

所述第一流感HA多肽包含A型流感HA亚型H5且所述第二流感HA多肽包含A型流感HA亚型H3；或

所述第一流感HA多肽包含A型流感HA亚型H1且所述第二流感HA多肽包含A型HA流感亚型H7。

6.权利要求1的组合物，其中所述第一流感HA多肽包含A型流感HA多肽且所述第二流感HA多肽包含B型流感HA多肽。

7.权利要求6的组合物，其中

(i)所述第一流感HA多肽包含A型流感HA亚型H1、H3、H5、H7或H9；且

(ii)所述第二流感HA多肽包含B型流感Yamagata系谱系HA或B型流感Victoria系谱系HA。

8.权利要求1至7中任一项的组合物，其还包含：

第一VLP，其包含第一流感神经氨酸酶(NA)多肽。

9.权利要求8的组合物，其还包含：

第二VLP，其包含第二流感NA多肽，其中所述第一和第二NA多肽是不同的亚型和/或来自不同的流感病毒。

10.权利要求9的组合物，其中：

(i)所述第一流感HA多肽包含A型流感HA亚型H1；

(ii)所述第二流感HA多肽包含A型流感HA亚型H3；且所述组合物还包含：

(iii)第三VLP，其包含第三A型流感HA HA亚型H5；

(iv)第四VLP，其包含第四A型流感HA HA亚型H7；

(v)第五VLP，其包含A型流感N1；

(vi)第六VLP，其包含A型流感N2；

(vii)第七VLP，其包含B型流感Victoria系HA或B型流感Yamagata系HA；和

(viii)任选的第八VLP，其包含与第七VLP不同的B型流感Victoria系HA或B型流感Yamagata系HA。

11.权利要求1至10中任一项的组合物，其中所述至少两种不同的流感VLP还包含流感基质多肽。

12.权利要求11的组合物，其中所述至少两种不同的流感VLP还包含：

(i)A型流感基质多肽M1、M2或M1和M2两者；或

(ii)B型流感基质多肽M1、BM2或M1和BM2两者。

13.权利要求1的组合物，其中：

所述第一流感HA多肽包含A型流感HA亚型H1且所述第二流感A型流感HA多肽包含HA亚型H3；

所述组合物还包含含有A型流感HA亚型H5的第三VLP以及含有A型流感HA亚型H7的第四VLP；且

其中所述第一至第四VLP还包含A型流感基质蛋白1(M1)和基质蛋白2(M2)。

14.权利要求11的组合物，其中：

所述第一流感HA多肽包含A型流感HA亚型H1且所述第二流感HA多肽包含A型流感HA亚型H2；

所述组合物还包含含有A型流感HA亚型H3的第三VLP，含有A型流感HA亚型H5的第四VLP，含有A型流感HA亚型H7的第五VLP，含有A型流感HA亚型H9的第六VLP，含有A型流感N1的第七VLP以及含有A型流感N2的第八VLP；且

其中所述第一至第四VLP还包含A型流感基质蛋白1(M1)和A型流感基质蛋白2(M2)。

15.权利要求1至14中任一项的组合物，其还包含佐剂。

16.权利要求15的组合物，其中所述佐剂是单磷酰(MPL)脂质A。

17.权利要求1至16中任一项的组合物，其被配制为用于鼻内给予。

18.权利要求1至17中任一项的组合物，其中所述至少两种不同的流感VLP通过在足以使HA多肽或NA多肽和基质多肽表达的条件下，采用以下转染宿主细胞而产生的：

(i)编码HA多肽的载体或编码NA多肽的载体；和

(ii)编码流感基质多肽的载体。

19.一种注射器，其包含权利要求1-18中任一项的组合物。

20.一种在受试者中引起对流感病毒的免疫应答的方法，其包括给予受试者治疗有效量的权利要求1-18中任一项的组合物，从而在受试者中引起对流感病毒的免疫应答。

21.一种使受试者对流感病毒免疫的方法，其包括给予受试者治疗有效量的权利要求1-18中任一项的组合物，从而使受试者对流感病毒免疫。

22.权利要求20或21的方法，其中对流感病毒的免疫应答包括对A型流感、B型流感或两者的免疫应答。

23.权利要求20至22中任一项的方法，其中鼻内给予所述组合物。

24.权利要求20至23中任一项的方法，其中给予受试者约1至约25μg的所述至少两种不同VLP中的每一种。

25.权利要求24的方法，其中给予受试者约15μg的所述至少两种不同VLP中的每一种。

26.权利要求20至25中任一项的方法，其中所述受试者是哺乳动物或鸟。

27.权利要求20至25中任一项的方法，其中所述受试者是人。

28.一种试剂盒，其包括：

第一容器，其包含表达第一流感血凝素(HA)多肽的第一流感病毒样颗粒(VLP)；

第二容器，其包含含有第二流感HA多肽的第二VLP，其中所述第一和第二HA多肽是不同的亚型和/或来自不同的流感病毒；以及

任选的第三容器、注射器或两者，其包含含有第一流感NA多肽的第三VLP。

29.一种试剂盒，其包括：

第一容器，其包含至少两种不同的流感病毒样颗粒(VLP)，含有第一流感血凝素(HA)多肽的第一VLP和含有第二流感HA多肽的第二VLP，其中所述第一和第二HA多肽是不同的亚型和/或来自不同的流感病毒；以及

任选的第二容器、注射器或两者，其包含含有第一流感NA多肽的第三VLP。