TWI390038B - 流感病毒重組ｈａ似病毒顆粒及其疫苗組成物 - Google Patents

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流感病毒重組HA似病毒顆粒及其疫苗組成物
本發明係關於藉由桿狀病毒表現系統製造流感病毒重組HA似病毒顆粒(VLP)，及其用於製備具有雞隻保護性之流感VLP疫苗組成物。
流行性感冒病毒(簡稱流感病毒)在病毒分類上屬於正黏液病毒科(Orthomyxoviridae )，根據其內部核蛋白(ribonucleoprotein,NP)和基質蛋白(matrix protein,M)的差異分為A型、B型及C型病毒。其中B和C型流感病毒主要感染人，A型流感病毒在自然界的宿主範圍較廣，包括人、豬、馬、鯨魚、海豹、野生鳥類及家禽類等。目前令人聞之色變的「禽流感」屬於A型流感病毒。流感病毒內部的基因體則由多個負股的RNA片段所組成，其中A型及B型流感病毒的基因體是由8個片段組成，C型流感病毒則只含有7個片段。A型流感病毒的8段基因可以調控10個蛋白的表現，包括核蛋白(ribonucleoprotein,NP)，3個聚合酶蛋白單元(PA、PB1及PB2)，2個基質蛋白(M1及M2)，2個非構造性蛋白(NS1與NS2)，2個外部醣蛋白，包括紅血球凝集素(hemagglutinin，HA)及神經胺酶(neuraminidase，NA)。流感病毒顆粒在外觀上皆帶有脂質封套(envelope)，是病毒在budding的過程中從宿主細胞膜上取得，在封套的表面嵌有HA和NA兩個蛋白以及為數較少的M2蛋白，封套內部表面則有含量最多的M1蛋白貼附。HA蛋白的功能和病毒顆粒結合到宿主細胞有關，以及在進入宿主細胞後促使封套與細胞膜融合(membrane fusion)發生而釋放病毒基因體；NA蛋白的功能則是幫助新形成的病毒顆粒可以脫離細胞表面，並進而感染鄰近的細胞。
A型流感病毒依其表面紅血球凝集素(HA)及神經胺酸酶(NA)抗原性的不同，可分為16種HA亞型(H1~H16)及9種NA亞型(N1~N9)，目前已知只有H1-H3和N1-N2的亞型組合可以直接感染人，並透過人與人之間傳播。雖然這些亞型病毒對野生水禽類通常不會致病，但一般家禽類感染後的死亡率卻極高，因此每年對於家禽產業都造成的相當大的經濟損失。
自1997年在香港首度爆發H5N1流感病毒感染人類事件開始，之後陸續在亞洲地區傳出災情並且迅速擴散到中國大陸，中東、歐洲甚至到很少出現流感疫情的非洲等58個國家，至今(96年7月31日，WHO統計資料)造成319人感染，192人死亡，死亡率高達60%。為了有效預防流感的發生，最主要的措施是以施打流感疫苗為主。目前上市的流感疫苗是利用雞胚培養病毒，加以去活化後製成的疫苗。每年世界衛生組織與美國疾病管制中心都會根據前幾年在全世界調查的資料，推測次年可能流行的病毒種類，而建議出疫苗的成份。最近幾年，因為一直有H1N1與H3N2病毒的同時流行，所以人用流感疫苗的成分都包括了這兩種A型流感病毒與一種B型流感病毒。然而此種疫苗卻無法對目前流行的H5及H7亞型流感病毒強毒株提供足夠的保護能力。另外，由於高度致病性的H5及H7病毒會殺死雞胚，因此無法以直接接種到雞胚胎蛋的方式來達到大量生產的目的，而必須先將分離到的高病原性野生病毒株轉換成弱病毒株，這勢必造成疫苗製程之複雜性。
流感病毒顆粒表面的醣蛋白HA蛋白決定病毒本身的病原性，具有功能性的HA蛋白在結構上是以三聚體(trimer)的型式存在，HA蛋白可以和宿主上呼吸道上皮細胞表面醣蛋白分子上的末端醣基sialic acid結合，使得病毒顆粒得以利用細胞內噬作用(endocytosis)進入細胞內，HA蛋白在endosome的酸性環境下(pH4~5)會促使膜融合(membrane fusion)發生而釋放出病毒的基因體。HA蛋白在細胞內可以破裂解成HA1和HA2次單位，兩個次單位間以雙硫鍵(disulfide bond)連接在一起，高病原性的HA蛋白裂解部位帶有多個連續性的鹼性氨基酸序列(-PQRERRRKKR/GL-)，因此在疫苗製備時需改變為弱毒株的氨基酸序列(PQ----RETR/G)及NA之後，再與其他6個來自PR8病毒株(A/PR/8/1934，H1N1)的基因片段製成重組型病毒(reassortant virus)，接著再利用反向基因法(reverse genetics)製成弱毒性疫苗株，由此種方法製成的疫苗株很適宜當作疫苗的原型株或模擬疫苗株(Mock-up vaccine)。在1997年香港爆發H5N1疫情後，日本及美國都曾經以當時自病患或罹病野鴨分離到的H5N1強毒株利用反向基因法製成弱毒性流感疫苗，結果在測試的實驗動物接踵2次後血清中都沒有有效率的產生HI抗體反應(國家衛生研究院電子報第213期2007-08-10)。
大腸桿菌(E. coli )是目前使用最廣泛的蛋白質表現系統，具有生長快速、產量高及低成本的優點。但由於大腸桿菌為原核生物(prokaryote)無法進行醣化作用(glycosylation)，因此無法生產醣蛋白，又產物常會形成不可溶性的包涵體(inclusion body)而使得蛋白質本身不具生物活性或只有很低的生物活性。相反地，哺乳動物細胞系統(Mammalian cell system)具有複雜的醣化作用及完整的後轉譯修飾，所製造出來的蛋白質較不會形成包涵體，與天然蛋白質的特性較相似，而且大部分蛋白質會分泌到培養液中，容易回收。其缺點為開發時間長、產量低、培養基昂貴、不易量產，因此目前除了一些大型生技公司(如Amgen、Genentech、Genetics Institute等)掌握關鍵性技術而能工業化以外，其他業界仍在急起直追的階段。相較於前兩者，桿狀病毒表現系統為近年來新興的技術，具有綜合前兩套系統的優點。桿狀病毒是一種桿狀、含有雙股DNA基因體的昆蟲病毒，因為其有幾個極強的啟動子(p10、polyhedrin promoter)，在1980年代初期即被開發成有效的外源蛋白質生產工具。
有關流感VLPs在桿狀病毒表現系統中的研究，首先是由Latham和Galarza所發表(T. Latham與J. M. Galarza,2001(Latham,T.,and J. M. Galarza. 2001. Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. J Virol 75:6154-65.)，他們將流感病毒A/Udorn/72(H3N2)的HA，NA，M1及M2基因構築於同一桿狀病毒載體上，並在Sf-9昆蟲細胞中表現，感染後的培養基上清液含有流感VLPs，並且以穿透電子顯微鏡獲得證明。此篇報導證實了流感VLPs可以藉由HA，NA，M1及M2基因的共表現而形成，所產生的VLPs在外型上具多型性與真實病毒極為相似，直徑約在80-120nm之間。隨後Pushko等人(P. Pushko等人，2005(Pushko,R.,T. M. Tumpey,F. Bu,J. Knell,R. Robinson,and G. Smith. 2005. Influenza virus-like particles comprised of the HA,NA,and M1 proteins of H9N2 influenza virus induce protective immune responses in BALB/c mice. Vaccine23: 5751-9.))亦將流感病毒A/Hong Kong/1073/99(H9N2)的HA，NA和M1基因構築於桿狀病毒上，並於Sf-9細胞中共表現此三種蛋白，在培養基的上清液中也證實了H9N2 VLPs的存在，外型結構也與前述作者索所發表的無顯著差異。除此之外，Pushko等人也以10μg的VLP疫苗接種BALB/c老鼠，在經過2次的皮下接種(在第0天與第28天)及攻毒(challenge)後，結果顯示流感VLPs不僅在老鼠內引發高效價的HI抗體(128-256倍)達到保護的效果，並且在攻毒後也顯示在接種VLP疫苗的老鼠肺部及鼻分泌液中比控制組中所能偵測的流感病毒顆粒顯著降低，表示流感病毒無法在接種疫苗的老鼠體內有效複製。此篇報導證實了以桿狀病毒表現系統發展人用流感疫苗上的潛力。類似的實驗也可見於Bright等人的研究(R. A. Bright等人，2007)(Bright,R. A.,D. M. Carter,S. Daniluk,F. R. Toapanta,A. Ahmad,V. Gavrilov,M. Massare,P. Pushko,N. Mytle,T. Towe,G. Smith,T. M. Ross.2007. Vaccine 25:3871-3878.)，他們在Sf-9細胞中共表現流感病毒A/Fujian/411/2002(H3N2)的HA，NA和M1基因，並以樣品中HA蛋白濃度為基礎定量VLPs的量。Bright等人以不同量的VLPs(24ng-3μg)與去活化的H3N2流感病毒(600ng)和純化的重組HA蛋白(600ng)去免疫BALC/c老鼠和雪貂(Fitch ferret)以比較它們的效果。結果顯示老鼠體內的HI抗體效價高低與所接受的VLPs量有關，接種越高的劑量可誘發越高的HI抗體，由此可看出使用流感VLPs當疫苗，可引起較佳的保護效果，可能比傳統的去活化病毒疫苗及次單位蛋白疫苗更適合用於流感病毒的預防。
而本發明則首先發現，藉由桿狀病毒表現系統，HA蛋白可以獨自組裝成VLPs，並不需要M1蛋白或M1與NA蛋白的共同作用。過去其他以昆蟲表現系統從事相關研究的報導，只有少數證明HA蛋白可以嵌入桿狀病毒的封套上而在感染的過程中被釋放到培養基中。截至目前為止，還未曾有其他文獻明確指出，HA蛋白在沒有其他流感蛋白的協助下可以自行組裝成VLPs。
因此，於一方面，本發明係提供一種包含流感病毒醣蛋白HA蛋白之重組似病毒顆粒(VLP)，其中該重組似病毒顆粒具有直徑介於80~150nm之間。
於本發明之一項具體態樣，該重組似病毒顆粒係藉由將HA蛋白基因單獨於桿狀病毒表現系統中進行表現而製得。
於另一項本發明之具體態樣，該重組似病毒顆粒係藉由將HA蛋白基因與M1蛋白基因共同於桿狀病毒表現系統中進行表現而製得。於又另一項具體態樣，該重組似病毒顆粒係藉由將HA蛋白基因與M1蛋白及NA蛋白基因共同於桿狀病毒表現系統中進行表現而製得。
於另一方面，本發明提供一種流感VLP疫苗組成物，其包含藉由桿狀病毒表現系統製得之流感病毒重組HA似病毒顆粒(VLP)作為有效組成，及製藥學上可接受之載劑。於一項具體態樣，該流感病毒為流感病毒H7亞型病毒。
而於本發明之一項具體態樣，該流感病毒重組HA似病毒顆粒(VLP)係藉由將HA蛋白基因單獨於桿狀病毒表現系統中進行表現而製得。
於另一項本發明之具體態樣，該流感病毒重組HA似病毒顆粒(VLP)進一步含有M1蛋白。於又另一項具體態樣，該流感病毒重組HA似病毒顆粒(VLP)進一步含有M1蛋白及NA蛋白。
本發明的其他特徵與優點，將從下列圖式及數項具體實施例之詳細描述，亦從附屬之申請專利範圍顯而易見。
本發明係藉由桿狀病毒表現系統，製造流感病毒重組HA似病毒顆粒(VLP)。根據本發明之方法，首先發現於桿狀病毒表現系統，HA蛋白可以獨自組裝成VLPs，並不需要M1蛋白或M1與NA蛋白的共同作用。且由雞隻免疫試驗及HI抗體效價分析顯示，本發明之流感病毒重組HA似病毒顆粒可有效誘導產生足夠保護效果的HI抗體，而能夠利用於製造次流感單位疫苗組成物。
實施例
以下，本發明將詳細描述特殊的具體實施例。這些具體實施例經由發明解釋提供，並非意欲用以限制本發明。在發明的範圍及精神內，本發明存在傾向於包括這些及其他變更及變動。
實施例1.流感病毒重組HA似病毒顆粒(VLP)之製備及特徵化
a.重組質體的構築及桿狀病毒的取得
流感病毒H7N1的HA基因事先已構築於pCRII-TOPO質體上(pCRII-H7)，由中興大學獸醫微生物所張伯俊老師所提供。為了構築桿狀病毒表現系統可用的載體以得到可供表現用的重組桿狀病毒，首先將包含全長HA基因的片段和刪減的(truncated)eHA7h片段(去除C端的transmembrane和cytoplasmic domain序列，增加6xHis tag序列)構築於pBlueBac4載體上，得到兩個重組質體，分別為pBB4-H7和pBB4-eHA7h。之後利用Invitrogen的Bac-N-Blue transfection kit將以上兩個重組質體轉染入Sf9昆蟲細胞中分別取得重組桿狀病毒，vBac-H7和vBac-eHA7h。由於先前的研究報導證實，可以利用蛋白共表現的方式在昆蟲細胞中生產流感似病毒顆粒，因此為了探討與比較不同組成分的似病毒顆粒與重組HA蛋白在雞隻內所引起的免疫效果，吾等另行利用Bac-to-Bac系統(Invitrogen)構築了2株共表現感染用的重組桿狀病毒，vBac-MH與vBac-HMN，該等構體之插入基因圖譜係如圖1所示。
簡述Bac-N-Blue系統中共轉染作用(cotransfection)及病毒篩選過程如下：將4μg的重組質體pBB4-H7和pBB4-eHA7h分別與0.5μg線形AcNPV DNA、25μl lipofectin和1ml Grace’s培養基混合，靜置15分鐘備用。接種1×106 Sf-9細胞於6cm的培養皿，以些許Grace’s培養基清洗細胞2次。將上述的混合液加入培養皿內，培養於28℃至少5小時。以2ml含10%胎牛血清的TNM-FH培養基取代之前的混合液，並繼續培養於28℃。5~7天之後收取上層液進行重組桿狀病毒的純化。病毒的純化：Sf-9細胞以稀釋的病毒液感染1小時後，以含0.5% agarose和150μg/ml X-gal的培養基覆蓋細胞，放在28℃培養7天。挑取藍色的病毒斑感染Sf-9細胞，收集感染後上清液，離心去除細胞殘渣後存放於4℃，此為第一代病毒母液。以第一代病毒母液重複感染Sf-9細胞將病毒效價放大至109 pfu/ml以上備用。
簡述Bac-to-Bac系統及病毒篩選過程如下：將構築於pFastBacl的重組質體轉型到E. coli DH10Bac勝任細胞中，以含有50μg/ml kanamycin、10μg/ml tetracyclin、7μg/ml gentamycin、40μg/ml IPTG和100μg/ml X-gal的培養基篩選。挑選白色的轉型株培養於小量LB，抽取其bacmid。取1μg重組bacmid DNA、20μl Cellfectin及1ml Grace’s培養基混合均勻，靜置室溫15分鐘備用。接種1×106 Sf-9細胞於6cm的培養皿，以些許Grace’s medium清洗細胞2次。將上述的混合液加入培養皿內，培養在28℃至少5小時。以2ml含10%胎牛血清的TNM-FH培養基取代之前的混合液，並繼續培養於28℃。5天後收取上層液，離心去除細胞殘渣後存放於4℃，此為第一代病毒母液。以第一代病毒母液重複感染Sf-9細胞將病毒效價放大至109 pfu/ml以上備用。
b.重組蛋白於桿狀病毒表現系統的表現
將Hi-5昆蟲細胞先行培養於含有10ml ESF921培養基的250ml-shaker flask中，起始細胞密度約為5×105 cells/ml，於28℃，250rpm(TKS orbital shaking incubator)的條件下培養。逐漸擴增至培養物總體積為300ml。當細胞密度增加至1.5-2.0×106 細胞/ml時，以moi=5的前述重組桿狀病毒進行感染，於感染72小時後收取細胞液。離心(3000×g,10分鐘)後將細胞沈澱置於-80℃保存，或直接進行蛋白的純化。上清液則進行流感VLPs的純化與分析。
在蛋白的表現上，Hi-5細胞經以上兩株新構築的重組病毒感染後，皆能表現出所攜帶基因的蛋白，以圖2A顯示經定量後比較HA蛋白在不同病毒感染後的表現量，其中以攜帶單一HA基因病毒vBac-H7感染Hi-5，其HA表現量為9.0±0.1μg/ml；以共表現HA與M1基因病毒vBac-MH感染Hi-5，其HA表現量明顯升高至69.8±2.9μg/ml；以共表現HA、NA與M1基因病毒vBac-HMN感染Hi-5，其HA表現量則與感染vBac-H7時無顯著差異，約為8.2μg/ml。如圖2B之結果所示，以vBac-H7感染Hi-5細胞，HA蛋白約有2.0%被分泌至培養基中；當以vBac-MH感染，HA與M1蛋白共表現於細胞內，HA蛋白被釋出的比例略為增加至3.1±0.7%；以vBac-HMN感染，HA、NA與M1蛋白共表現時，HA蛋白被釋出的比例明顯增高至7.5±2.5%。
c.流感VLPs的純化
將Hi-5細胞感染後的上清液(300ml)以0.45μm的過濾膜(Pall corp.)過濾，再於4℃環境下利用低溫濃縮機(LabscaleTM TFF system,Millipore)將濾液以500kDa-濃縮膜(PelliconXL,Biomax 500,Millipore)濃縮至約60ml。將濃縮液進行超高速離心(OptimaTM XL-80K，SW41i rotor，Beckman)，離心條件27,000rpm，4℃，3小時。將離心後的沉澱物回溶於2ml TNE buffer(10mM Tris[pH8.0],100mM NaCl,1mM EDTA)中。將回溶樣本加入20%-60%(20-40-50-60)蔗糖梯度溶液的上方，進行超高速離心，離心條件27,000rpm，4℃，16小時。由上而下每1ml收取分層(fraction)。以血球凝集試驗測定各分層的HA titer，並以密度偵測儀(Milton Roy Company)測定各分層蔗糖溶液密度，用西方轉漬法(Western blot)偵測蛋白的分佈，結果如圖3所示。
圖3A為單獨表現HA的結果，HA蛋白訊號主要分佈在分層4~7，最強的訊號出現在分層4，此層的HA titer為1：512，蔗糖密度相當於1.101g/cm3 。圖3B為共表現HA與M1蛋白的結果，HA蛋白訊號主要分佈在分層5~7，M1蛋白訊號主要分佈在分層5，兩者最強的訊號都出現在fraction 5，此層的HA titer為1：2048，蔗糖密度相當於1.124g/cm3 。圖3C為共表現HA、NA與M1蛋白的結果，HA蛋白訊號主要分佈在分層4~9，NA蛋白訊號主要分佈在分層5和6，M1蛋白訊號主要分佈在分層4~9，各蛋白最強的訊號出現在分層5，此層的HA titer為1：2048，蔗糖密度相當於1.146g/cm3 。圖3B與圖3C證明當昆蟲細胞以vBac-MH或vBac-HMN感染時，流感蛋白(HA與M1蛋白或HA、NA與M1蛋白)會被共同釋出細胞外，並且可以在共同的蔗糖梯度離心分層中被純化到，這個結果暗示HA與M1蛋白或HA、NA與M1蛋白可以組裝成VLPs。另外，當細胞以vBac-H感染時，HA也會被釋出細胞外，並且也可以在蔗糖密度相當相當於VLPs的分層中被純化到，這個結果暗示單獨表現HA蛋白時也可組裝成VLPs。
d.流感病毒重組HA似病毒顆粒(VLP)之特徵化
從蔗糖梯度離心後所收集的分層當中，我們可以確定HA單獨、以及HA與M1及/或NA蛋白共表現的結果，由於這些不同大小的蛋白經離心後分佈在同一密度的蔗糖溶液中，顯示其組裝成VLPs的可能性很高。為了驗證此點，我們將蔗糖梯度離心後的樣品進行濃縮後以穿透式電子顯微鏡觀察，結果如圖4-6所示。我們所觀察到的流感VLPs，外形上的多形性頗類似於真實的流感病毒顆粒，大部分呈現圓形或是橢圓形，少數為不規則形狀，直徑約在80~150nm之間，並且可以清楚地看到表面的蛋白突出(HA蛋白)與膜狀結構。令人訝異的是，當以相同的方法去處理單獨表現HA蛋白的樣品時，電子顯微鏡的觀察也顯示H-VLPs的存在(參見圖6)。這個結果證明HA蛋白可以獨自組裝成VLPs，並不需要M1蛋白或M1與NA蛋白的共同作用。
實施例2.流感病毒重組HA似病毒顆粒(VLP)之免疫試驗及紅血液凝集抑制(HI)抗體效價分析
為了測試本研究中所生產的重組HA蛋白及流感似病毒顆粒的免疫效果，以作為日後新型流感疫苗的開發，我們以SPF雞隻進行小規模的免疫試驗。我們以疫苗中所含的HA蛋白為定量標準，將接種的雞隻分為8個族群，包括H-VLP(2μg)、H-VLP(0.2μg)、MH-VLP(2μg)、MH-VLP(0.2μg)、HMN-VLP(2μg)、HMN-VLP(0.2μg)、eHA7h(100μg)及PBS，名稱代表所接種抗原的種類及疫苗中所含的HA蛋白量。由於流感疫苗的免疫抗原性較差，因此每隻雞給予免疫接種兩次，並在疫苗中添加佐劑以增加免疫反應的效果，第一次注射使用完全Freund’s佐劑，相隔兩週後的第二次免疫則使用不完全Freund’s佐劑。每次採血所得到的免疫血清以血球凝集抑制試驗及ELISA，分別測量血清中的HI抗體效價及抗-HA的抗體效價，所得的結果如圖7所示。
HI抗體效價是用來判斷血清中保護性抗體存在及疫苗效果的重要指標，其係以96孔V型微量測定盤進行試驗。分裝25μl 0.85%NaCl至V型盤的每個孔中，並於第1孔中加入25μl待測血清，由第1孔開始進行兩倍連續序列稀釋，稀釋至最後一孔丟棄25μl。於全盤每孔加入25μl含8凝集單位(HAU)的稀釋病毒液，輕拍盤子使混合均勻，在室溫中放置15分鐘。再於全盤每孔加入50μl 0.9%雞紅血球懸浮液，輕拍盤子使混合均勻，在室溫中放置約60分鐘後判讀血球凝集抑制的現象並紀錄。將盤子傾斜，如血球呈淚滴狀流下並且流下之速度與血球對照組相同者表示血球完全沉降，凝集被抑制。血球完全沉降之最高稀釋倍數，即代表血清之HI抗體效價。目前國際上皆以血清HI抗體效價≧4log2為最低保護閥值，意即當血清稀釋16倍時，仍能在標準的血球凝集抑制試驗中達到完全抑制紅血球凝集的功能。結果列示於下表1及圖7。
從表1及圖7可知，在接受2μg似病毒顆粒疫苗的組別當中，所有雞隻在第一次免疫後的兩週內(week 2)即可在其血清中測得大於4log2 的HI抗體力價，各組平均力價的log2 值分別為5.5±0.6(H-VLP)、5.8±1.1(MH-VLP)和5.5±0.7(HMN-VLP)。第二次免疫後，所有接受2μg的似病毒顆粒疫苗的雞隻血清其HI抗體力價在一周或兩週內達到最高，各組的最高平均力價的log2 值分別為8.0±0.4(H-VLP)、9.3±1.8(MH-VLP)和7.5±0.7(HMN-VLP)。另外，當我們把似病毒顆粒疫苗中的HA抗原量減少為原來的1/10(0.2μg)時，雖然所有的雞隻在第一次免疫完後並沒有偵測到大於標準閥值的血清力價存在，然而在第二次免疫後的第二週(week 4)，所有的血清HI抗體力價都到達各組中的最高點，其力價的log2 值分別為8.3±1.8(H-VLP)、4.8±1.4(MH-VLP)和6.0±0.0(HMN-VLP)，其中接受0.2μg H-VLP和0.2μg NMN-VLP的HI抗體力價在第3週時已上升超過標準閥值，而接受0.2μg MH-VLP的雞隻一直到第4週時，才可在其血清中偵測到超過標準閥值的HI抗體力價(4.8±0.4log2 )。反觀在給予重組HA蛋白(eHA7h)的組別中，即使抗原量高達100μg，免疫兩次後仍無法有效地誘導產生足夠保護效果的HI抗體；當我們持續在第5週時給予這一組的雞隻第3次的免疫，其血清在第6週後才可測得含有超過標準閥值的HI抗體力價(week 6-8)。值得一提的是，就血清中HI抗體力價維持在16倍以上的時間長短而言，2μg的似病毒顆粒疫苗的效果很明顯的比0.2μg的似病毒顆粒疫苗和重組eHA7h次單位疫苗能維持較長的一段時間。從表一及圖7的結果可知，所有免疫2μg似病毒顆粒疫苗的雞隻，其血清HI抗體力價在升到最高值之後的每週採血測試中並沒有顯著的減低，甚至在第16週時(第二次免疫後98天)仍可測得至少32倍的力價，由此顯示2μg似病毒顆粒疫苗所誘導的有效HI力價至少維持98天以上；相反的，接受0.2μg似病毒顆粒疫苗與接受100μg eHA7h重組蛋白的雞隻，其血清能維持有保護作用的力價的時間較短，總體而言在第12週時力價以降低到標準以下。由此可知，2μg的流感似病毒顆粒疫苗可以在雞隻中引起較有效的免疫反應，而且所產生的保護效果可以維持一段較長的時間。由此可知，在流感疫苗的選擇上，不管是就效果或使用量或成本而言，似病毒顆粒遠遠優於重組的蛋白，更適合成為新一代流感疫苗的開發首選。
其他具體態樣
本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。於是，本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。
從前述之說明，習於該項技藝人士可容易地確定本發明之基本特徵，且在未偏離其範圍下，可進行本發明之各種改變與修飾，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。
圖1為共表現感染的重組桿狀病毒插入基因片段圖譜。所有重組桿狀病毒構築只顯示同質性重組交換(homologous recombination)區域，構築時相關的限制酵素辨認序列統一標示於單一基因表現病毒vBac-H上。其它標示：Tn7R/7L，同質性重組序列；Gm，gentamycin抗性基因；PolH，polyhedrin啟動子序列；p(A)，polyadenylation序列。
圖2列示共表現的Hi-5細胞中的HA蛋白表現量(A)及HA、M1蛋白在共表現感染時釋出至胞外的比例(B)。A圖為Hi-5細胞以桿狀病毒vBac-H、vBac-MH、vBac-HMN感染時的HA蛋白表現量，所有定量樣品取自moi=5感染72小時後的細胞。B圖上方為胞內、胞外的HA和M1蛋白，以westernblot分析，經定量後的HA和M1蛋白釋出至胞外的比例顯示於B圖下方。
圖3為蔗糖梯度(20~60%)離心分析感染後的Hi-5細胞上清液(culture supernatant)。其中以moi=5重組桿狀病毒(A)vBac-H、(B)vBac-MH、(C)vBac-HMN感染300ml Hi-5細胞液，於感染72小時後收取細胞液。離心後分離細胞與培養基上清液。將上清液的部份以流感VLPs純化方法處理之(實施例1.c)，並以western blot及血球凝集試驗分析。圖下方顯示各分層所測得的蔗糖密度(g/cm3 )及HA力價。
圖4為MH-VLP的穿透式電子顯微鏡影像圖。影像來自同一樣品，在不同的視野下放大10萬倍拍攝而得。各圖中的bar等於100nm。
圖5為HMN-VLP的穿透式電子顯微鏡影像圖。影像來自同一樣品，在不同的視野下放大10萬倍拍攝而得。各圖中的bar等於100nm。
圖6為H-VLP的穿透式電子顯微鏡影像圖。影像來自同一樣品，在不同的視野下放大10萬倍拍攝而得。各圖中的bar等於100nm。
圖7列示以重組次單位疫苗及似病毒顆粒疫苗免疫SPF雞隻的血清HI抗體反應。重組次單位疫苗為以IMAC純化的eHA7h蛋白，每次每隻注射約100μg。似病毒顆粒疫苗為感染後之上清液經20%-60%蔗糖梯度離心後所收集的分層中含HA效價最高者，每次每隻注射量所含的HA蛋白量如表一所示。實驗中各組雞隻的數目除注射重組次單位疫苗為3隻外，其餘各組包括控制組(注射PBS)在內皆為兩隻。”#”：其中一隻死於第一次注射前。HI抗體的效價計算以各組的平均值±標準誤差(standard deviation)表示。Preimmune血清在第一次免疫前採集；week 2血清在第二次免疫前採集，隨後每週採集血液一次，第8週後每隔4週採血一次。

Claims (8)

  1. 一種流感重組似病毒顆粒(VLP)，其係僅由流感病毒醣蛋白HA蛋白所組成，其中該重組似病毒顆粒具有直徑介於80~150nm之間。
  2. 根據申請專利範圍第1項之流感重組似病毒顆粒(VLP)，其係藉由將HA蛋白基因單獨於桿狀病毒表現系統中進行表現而製得。
  3. 一種流感VLP疫苗組成物，其包含藉由桿狀病毒表現系統製得之根據申請專利範圍第1項之流感病毒重組HA似病毒顆粒(VLP)作為有效組成，及製藥學上可接受之載劑。
  4. 根據申請專利範圍第3項之流感VLP疫苗組成物，其中該流感病毒為A型流感病毒。
  5. 根據申請專利範圍第4項之流感VLP疫苗組成物，其中該流感病毒為流感病毒H7亞型病毒。
  6. 根據申請專利範圍第5項之流感VLP疫苗組成物，其中該流感病毒進一步包含其他不同亞型流感病毒。
  7. 根據申請專利範圍第3項之流感VLP疫苗組成物，其中該流感病毒重組HA似病毒顆粒(VLP)係藉由將HA蛋白基因單獨於桿狀病毒表現系統中進行表現而製得。
  8. 根據申請專利範圍第3項之流感VLP疫苗組成物，其中該流感VLP疫苗組成物係用於保護雞隻不受流感病毒流感。
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