CN104726416A - 提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒及其方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒及其方法和应用，由依据昆虫细胞偏爱密码子优化后的H5N1流感NA-HA-M1基因与经酶切的pFastBac1载体连接，制得重组杆状病毒Bacmid质粒，并转染昆虫细胞得到重组杆状病毒，用该病毒接种昆虫细胞后，表达得到所述病毒样颗粒，其中，优化后的H5N1流感NA-HA-M1基因序列如SEQ ID NO.1所示。具有生产成本低，产量高，免疫原性高，安全性好，便于大规模生产等优点，小鼠实验证明H5N1流感病毒样颗粒能够诱导较强的体液免疫和细胞免疫，对现在主要流行的H5N1 2.3.2.1和2.3.4谱系的流感病毒具有很好的免疫和预防效果。

Description

提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒及其方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，微生物领域及生物制药领域，特别涉及一种提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒及其方法和应用。

背景技术

A型流感病毒病毒感染能够引起呼吸道疾病对人类健康和世界经济造成严重影响，1997年第一次报道人感染高致病性H5N1(HPAI)流感病毒感染，据世界卫生组织报道截止到2014年1月9号全球共报道649人感染病例，并引起385人死亡，从2003年开始高致病性H5N1成为主要的人兽共患病之一并且不断的衍生出新的谱系，高致病H5N1主要在中国，越南，印度尼西亚，埃及，哥伦比亚和孟加拉国等地流行，其中2.3.2.1和2.3.4谱系成为主要的流行谱系，但是现在也很难预测不同的H5N1谱系中哪个会造成大规模的流行，因此现在急需发明一种疫苗能够交叉保护不同H5N1谱系的病毒。

现在主要通过鸡胚进行流感疫苗的大量生产，但是在流感大流行季节这种生产方式很难满足流感疫苗的大量生产，并且常常需要花费数月的时间来确定新的流感流行谱系，更重要的是最近在亚洲流行的H5N1流感病毒能够造出鸡胚的死亡。然而基于重组杆状病毒生产的流感病毒样颗粒能够解决H5N1流感疫苗生产中的问题，因此病毒样颗粒成为一种无生物安全风险，低成本，和高产出的流感疫苗生产方 式。流感病毒样颗粒具有和天然病毒相似的HA结构，因为其HA结构避免了常规灭活疫苗生产中的化学物质的破坏，从而能够产生更好的免疫保护作用。

目前流感病毒样颗粒包括由流感HA、NA和流感基质蛋白M1或者HA和M1在小鼠实验中能够产生真对流感高滴度的特异性抗体，这些颗粒能够展示出很好的针对异源流感病毒的保护活性，但是还没有文献报道与灭活的全病毒疫苗相比流感病毒真对不同H5N1谱系的保护活性。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒及其方法和应用。本发明利用昆虫杆状病毒表达系统生产包含流感NA-HA-M1的H5N1流感病毒样颗粒，并且在小鼠体内研究在弗式佐剂时与灭活的流感疫苗相比针对不同谱系的流感的病毒的保护活性。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒，由依据昆虫细胞偏爱密码子优化后的H5N1流感NA-HA-M1基因与经酶切的pFastBac1载体连接，制得重组杆状病毒Bacmid质粒，并转染昆虫细胞得到重组杆状病毒，用该病毒接种昆虫细胞后，表达得到所述病毒样颗粒，其中，优化后的H5N1流感NA-HA-M1基因序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述优化后的H5N1流感NA-HA-M1基因与pFastBac1载体酶切的限制性内切酶为Not I和Sph I。

进一步的，所述优化遵循：编码的氨基酸序列不变；将稀有密码子去除；将影响mRNA稳定性和核糖体结合的茎环结构破坏。

进一步的，所述病毒样颗粒的纯化方式为，在4℃离心机中用2,000rpm离心20min去掉细胞碎片，用30,000rpm离心60分钟进行浓缩，用PBS溶解沉淀过夜后经20％-30％-60％的蔗糖30,000rpm离心1小时进行纯化。

上述提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、重组杆状病毒Bacmid质粒的构建：将优化的NA-HA-M1基因和pFastBac1载体的基因进行多克隆位点分析，选择载体上提供而目的片段中没有的两个限制性内切酶：Not I和Sph I，双酶切后回收目的片段插入到昆虫细胞表达载体pFastBac1中，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞；

步骤二、重组杆状病毒的拯救：用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒；

步骤三、高致病性H5N1流感病毒样颗粒的制备：将获得的重组杆状病毒按MOI＝3接种昆虫细胞，3天后收获上清，即得高致病性H5N1流感病毒样颗粒。

进一步的，所述步骤一中，具体操作为：：取1μlpFastBac-NA-HA-M1加入到50μl感受态DH10Bac细胞中，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入1ml无抗性的LB培养基，37℃培养48h，挑取白斑菌落，加入LB培养基,37℃ 200rpm/min摇床培养12h，提取质粒DNA进行PCR鉴定，鉴定正确的阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒。

进一步的，所述步骤二、三中使用的昆虫细胞为Sf9细胞。

进一步的，所述步骤二中待Sf9细胞的细胞汇合达到80％以上时方进行转染。

上述提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒在制备特异性疫苗预防流感方面的应用。

上述提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒在保护同源2.3.2.1病毒和异源2.3.4病毒的攻击方面的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来生产高致病性H5N1流感病毒病毒样颗粒在流感大流行季节这种生产方式能够满足流感疫苗的大量生产的优势，具有产量高，生产陈本低，免疫原性好，无生物安全风险等优点。本发明的流感病毒病毒样颗粒，以杆状病毒作为表达载体，以Sf9细胞作为生物反应器，制备的高致病性H5N1流感病毒病毒样颗粒具有产量高，生产陈本低，免疫原性好，便于大规模生产等优点，且小鼠实验证明对同源2.3.2.1和异源2.3.4病毒具有良好的免疫和预防效果。

附图说明

图1(A)为本发明实施施例1中重组杆状病毒NA-HA-M1的基因构建示意图，PolH为pFastBac1的5′端多角体启动子，p(A)为pFastBac13′端转录终止信号。(B)和(C)为重组杆状病毒感染SF9细胞后间接免疫荧光结果(B)为重组杆状病毒rBV-NA-HA-M1感染组，(C)为正常细胞组，(D)为重组杆状病毒感染细胞上清的电镜观察结果，标尺代表100nm。

图2为重组杆状病毒感染上清的血凝抑制结果和纯化后H5N1病毒样颗粒的SDS-PAGE蛋白电泳和WB结果：(A)重组杆状病毒感 染上清以0.85％鸡红细胞血凝实验表明可以产生2⁷的血凝效价，正常细胞上清(Mock)组没有观察到血凝现象。(B)以纯化的H5N1病毒样颗粒10,2.5和0.6μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色后结果，(C)WB鉴定结果，可以看到相应的HA，NA和M1的分子量70,52and 25kDa，M：标准分子量蛋白。

图3为小鼠体液免疫和中和抗体产生情况。(A)(B)分别为在免疫0,3,5周后针对A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(A)和A/duck/Jilin/JL-SIV/2013(B)血凝抑制抗体产生情况，(C)(D)分别为在免疫0,3,5周后针对AA/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(C)和A/duck/Jilin/JL-SIV/2013(D)IgG特异性抗体产生情况，(E)为针对A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012IgG1和IgG2a抗体亚型的分类，(F)为免疫后5周针对SH-1和JL-SIV的血清中和抗体产生。数据表示平均值±SD(每组5只),*P<0.05,**P<0.01与灭活疫苗组相比。

图4为针对同源A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(clade2.3.2.1)和异源A/duck/Jilin/JL-SIV/2013(clade2.3.4)小鼠攻毒保护实验结果。每组5只小鼠。(A)和(B)分别为同源A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(clade2.3.2.1)攻毒后小鼠体重变化(A)和生存率变化(B)。(C)和(D)分别为异源A/duck/Jilin/JL-SIV/2013(2.3.4谱系)攻毒后小鼠体重变化(C)和生存率变化(D)。

图5为攻毒后4天小鼠脾淋巴细胞细胞因子分泌情况。细胞因子IFN-γ(A)and IL-4(B)在攻毒后4天分离脾淋巴细胞，用纯化后的灭活病毒A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012刺激脾淋巴细胞，单独细胞组 (Cell alone)，灭活病毒刺激组(inactive SH-1)，分泌细胞因子数代表每10⁶脾淋巴细胞的细胞因子分泌情况。数据表示平均值±SD(每组3只),**P<0.01与灭活疫苗组相比.

图6为攻毒后4天肺病毒滴度。在免疫后4天取小鼠肺组织，进行感染鸡胚滴定其在鸡胚中的半数感染量EID₅₀/ml。数据表示平均值±SD(每组3只),**P<0.01，***P<0.001与灭活疫苗组相比.

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1H5N1流感病毒样颗粒的制备及鉴定

1材料

供体质粒pFastBac1，菌种E.coli DH10Bac,昆虫细胞Sf9,购自Invitrogen公司。IPTG，X-gal够自大连宝生物公司，T4DNA连接酶，凝胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒购自Axygen公司，脂质体Lipofection2000购自Invitrogen公司，氨苄青霉素，四环霉素，卡纳霉素，庆大霉素购自Sigma公司，胎牛血清为长春西诺生物科技有限公司生产，TMN昆虫细胞培养基购自Applichem公司，H5鸡阳性血清为本实验自制，FITC标记的兔抗鸡二抗购自博奥森公司，HRP标记的兔抗鸡二抗购自Sigma公司。

2.方法

2.1病毒基因序列测定

高致病性禽流感H5N1病毒A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(SH-1；clade2.3.2.1)和A/duck/Jilin/JL-SIV/2013(JL-SIV；clade2.3.4)由中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所二室从猫鼬和鸭中分离得到,并进行序列测定和谱系鉴定，分别属于2.3.2.1和2.3.4谱系，从H5N1A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(SH-1；clade2.3.2.1)中测得HA，NA和M1的核苷酸序列，分别根据昆虫细胞对密码子的偏爱性，将获得的HA，NA和M1序列进行优化，优化遵循以下几点：编码的氨基酸序列不变；将稀有密码子去除；将影响mRNA稳定性和核糖体结合的茎环结构破坏。

2.2病毒样颗粒的构成和蛋白的表达

优化后的A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(SH-1；clade2.3.2.1)的HA、NA和M1基因由上海生物工程公司合成，所得基因的序列如SEQ ID NO.1所示，基因设计Not I和Sph I两个酶切位点克隆至pFastBac 1载体。最终的质粒pFastBac-NA-HA-M1转化至带有AcMNPV杆状病毒基因组的E.coli DH10Bac感受态中。重组的杆状病毒质粒用脂质体Lipofection 2000转染至每孔有1×10⁶个Sf9细胞的六孔板中。培养72小时后在细胞上清中收集重组的杆状病毒置于4℃保存。

重组的杆状病毒感染Sf9细胞3天后在细胞上清中得到病毒样颗粒。

如图2所示，为重组杆状病毒感染上清的血凝抑制结果和纯化后H5N1病毒样颗粒的SDS-PAGE蛋白电泳和WB结果：(A)重组杆 状病毒感染上清以0.85％鸡红细胞血凝实验表明可以产生2⁷的血凝效价，正常细胞上清(Mock)组没有观察到血凝现象。(B)以纯化的H5N1病毒样颗粒10,2.5和0.6μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色后结果，(C)WB鉴定结果，可以看到相应的HA，NA和M1的分子量70,52and 25kDa，M：标准分子量蛋白。在4℃离心机中用2,000rpm离心20min去掉细胞碎片，用30,000rpm离心60分钟进行浓缩，用PBS溶解沉淀过夜后经20％-30％-60％的蔗糖30,000rpm离心1小时进行纯化。

用间接免疫荧光试验检测HA、NA和M1蛋白的表达。重组杆状病毒感染Sf9细胞后27℃培养48小时，弃上清后细胞用80％预冷丙酮置于-20℃固定2小时。细胞经PBS清洗，将免疫H5N1灭活毒的鸡血清稀释200倍后37℃孵育细胞2小时，然后用PBS清洗细胞，再用FITC表记的兔抗鸡的二抗和0.1％伊文斯兰37℃孵育细胞1小时。最后，细胞经PBS清洗后用荧光显微镜观察。

2.3Western blot试验

流感病毒样颗粒用12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色和蛋白印记试验。纯化后的病毒样颗粒总蛋白按照10μg、2.5μg和0.6μg的梯度上样，之后将膜用封闭液室温封闭1小时，然后用鸡的抗体(1:500)4℃孵育过夜。用辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡的IgG二抗(1:50,000)孵育1小时后显影观察。

2.4电镜观察

取重组杆状病毒感染的Sf9细胞，再用1％磷钨酸作用1-2分钟 固定组装好的病毒样颗粒用以检测。用吸水纸吸走多余的液体，再室温晾置1-3分钟。流感病毒样颗粒在40,000×的透射电镜下观察。

3结果：

使用重组杆状病毒NA-HA-M1感染Sf9细胞获得高致病性禽流感H5N1的病毒样颗粒。经昆虫杆状病毒密码子优化后NA,HA和M1基因然后与PolH和p(A)连接如图1(A)所示，然后构建表达pFastBac-NA-HA-M1重组杆状病毒。使用浓度为0.85％的鸡血红细胞检测感染重组杆状病毒NA-HA-M1的细胞上清结果显示具有2⁷–2⁸的血凝效价，然后用间接免疫荧光反映了SF9细胞中HA-NA-M1蛋白的表达水平。在感染感染重组杆状病毒的细胞中发现特异性的荧光，而在正常细胞中则没有发现特异性的荧光，重组杆状病毒感染的Sf9细胞进行电镜观察，可以见到表面呈球形不规则的刺突，大小为100nm左右的H5N1流感病毒样颗粒。

此外，纯化的H5N1病毒样颗粒通过使用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色和用WB进行鉴定。可以看到在纯化后的H5N1的病毒样颗粒中发现HA、NA和M1的条带。这些结果说明了H5N1病毒样颗粒所包含的HA、NA和M1具有功能活性，并且在形态大小结构上都具有完整性。

实施例2H5N1病毒样颗粒小鼠免疫实验

1材料

BCA蛋白检测试剂盒购自Thermo公司，完全弗氏佐剂购自Sigma公司，HRP标记羊抗鼠IgG,IgG1or IgG2a购自Southern  Biotechnology公司，IFN-γ和IL-4ELISpot检测试剂盒购自Mabtech AB公司，TMB购自Sigma公司。6–8周龄的BALB/c雌性小鼠购自长春试验动物繁育中心。

2.方法

2.1免疫和攻毒 

用BCA检测试剂盒测流感病毒样颗粒的蛋白浓度。在0周和3周肌肉注射0.2毫升含有10μg的病毒样颗粒或病毒样颗粒加完全弗氏佐剂(VLP,VLP+CFA组)，灭活病毒组(WIV组)用含有2⁷HA单位的灭活A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012病毒进行免疫，PBS免疫作为对照组(Mock组)。在第二次免疫两周后用乙醚麻醉小鼠，用A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012和A/duck/Jilin/JL-SIV/2013两种毒的10倍MLD₅₀滴鼻攻毒。每天称量小鼠体重并观察死亡率，所有的试验条件和试验程序都遵从国际疼痛研究协会的的道德准则，并且中国人民解放军动物护理和实用委员会批准了试验程序(编号为No:SYXK2009-045)。

2.2抗体检测和血凝抑制效价

在免疫后0、3和5周眼眶采血，血液室温放置2小时后经3,000rpm离心10分钟获得血清。攻毒后4天取肺组织，破碎组织后3,000rpm离心10分钟收集上清，置于-80℃保存备用。

用ELISA试验检测血清和肺组织中的流感病毒特定的IgG、IgG1和IgG2a。用灭活的A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012或A/duck/Jilin/JL-SIV/2013病毒5μg/ml在4℃过夜包被96孔板，用含 有Tween 20(0.05％)和BSA(1％)的PBS在25℃封闭2小时，在96孔板中加入稀释好的血清样品25℃孵育2小时。用PBST清洗后再用HRP标记的羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a在25℃作用1小时，用PBST清洗后加入TMB在25℃作用30分钟，之后加入50μl的2MH₂SO₄终止反应。用分光光度计在450nm处检测结果。用0.85％的鸡红细胞和灭活的A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012或A/duck/Jilin/JL-SIV/2013病毒的四单位抗原进行血凝抑制滴度检测。

2.3肺的病毒滴定和微量中和试验

肺匀浆按1:10稀释后接种鸡胚，病毒最低检测量是10^1.2EID₅₀/ml。用MDCK细胞做病毒中和试验，血清56℃作用30分钟进行灭活，100TCID₅₀的A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012和A/duck/Jilin/JL-SIV/2013分别加入到连续2倍稀释血清中，再将混合物加入到单层的MDCK细胞中37℃作用1小时。没有细胞病变的最高血清稀释度记为中和抗体的滴度。

2.4ELISPOT检测细胞因子 

用ELISpot检测由病毒样颗粒诱导的病毒活化的抗原特异性T细胞。用鼠IFN-γ和IL-4抗体包被96孔板。每孔铺1×10⁶个攻毒4天后分离的脾细胞，用含有10％FBS的1640培养基在37℃封闭2小时。每孔加0.2μg的A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012灭活病毒刺激，之后用生物素标记的抗体和亲和素置于37℃、5％CO2孵育24小时。最终，用BCIP/NBT底物溶液在37℃条件下避光孵育20分钟产生斑点，用ELISpot阅读系统计算斑点形成单位。

3结果

3.1H5N1病毒样颗粒和灭活病毒在小鼠体内激发的免疫应答

流感病毒特异性血凝抑制抗体显示在免疫后第0,3,5周，VLP和VLP+CFA组的血清针对A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012病毒血凝抑制抗体(HAI)滴度上得到了很大的提高，达到了128-256，如图3(A)所示。在第五周时VLP和VLP+CFA组的针对A/duck/Jilin/JL-SIV/2013病毒的交叉HAI的活性滴度达到了32，如图3(B)所示。血清特异性IgG抗体显示针对A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012图3(C)和A/duck/Jilin/JL-SIV/2013图3(D)的特异性IgG抗体随着免疫的时间的增长而逐渐的增长，这表明有特异性抗体的产生。如图3(E)所示，所有免疫组针对A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012的IGg2a的滴度比IGg1的滴度高，这就说明了病毒产生特异性免疫反应的抗体以IGg2a为主。如图3(F)所示，微量中和实验表明VLP和VLP+CFA组中针对A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012和A/duck/Jilin/JL-SIV/2013的中和抗体滴度比WIV组中的中和抗体的滴度要高2到3个滴度。结果表明VLP和VLP+CFA组的免疫原性比WIV组的免疫原性高，并且VLP能够诱导产生A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012和A/duck/Jilin/JL-SIV/2013特异性的免疫反应。

3.2H5N1病毒样颗粒能够保护同源和异源流感毒的攻击

如图4所示，VLP和VLP+CFA组小鼠在致死性的A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012和A/duck/Jilin/JL-SIV/2013病毒的攻 击下全部存活(图4(B)和(D))。相比之下，灭活病毒组WIV和对照组在流感病毒感染下体重下降显著(图4(A)和(C))，对照组完全死亡，VLP和VLP+CFA组小鼠表现出体重丢失较少，并且所有的小时能够完全存活。与此相反，WIV组在A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012和A/duck/Jilin/JL-SIV/2013毒株的感染下，体重损失较多，并且分别只有80％和40％的生存率，这些结果表明，VLP和VLP+CFA组能够保护同源A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012和异源A/duck/Jilin/JL-SIV/2013病毒的致死性攻击。

3.3H5N1病毒样颗粒能够诱导产生细胞免疫

如图5所示，从攻毒后第四天的小鼠身上分离出脾细胞，并用灭活的A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012病毒进行刺激，然后检测特异性的IFN-γ和IL-4的分泌情况。与WIV组相比VLP和VLP+CFA免疫的小鼠能够诱导产生较多的IFN-γ和IL-4的表达量。VLP和VLP+CFA组能够诱导更高的IFN-γ表达，这些结果都表明H5N1病毒样颗粒可以诱导产生细胞免疫的产生。

3.4H5N1病毒样颗粒能够抑制流感病毒的复制

如图6所示，从攻毒后第四天的小鼠肺组织中测定H5N1流感病毒的病毒载量，与灭活组相比VLP组和VLP+CFA组小鼠中A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012和A/duck/Jilin/JL-SIV/2013病毒载量都要低，表明H5N1病毒样颗粒疫苗能够抑制流感病毒在小鼠肺中的复制。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并 不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。 

序列表

Claims (10)

1.一种提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒，其特征在于，由依据昆虫细胞偏爱密码子优化后的H5N1流感NA-HA-M1基因与经酶切的pFastBac1载体连接，制得重组杆状病毒Bacmid质粒，并转染昆虫细胞得到重组杆状病毒，用该病毒接种昆虫细胞后，表达得到所述病毒样颗粒，其中，优化后的H5N1流感NA-HA-M1基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的病毒样颗粒，其特征在于，所述优化后的H5N1流感NA-HA-M1基因与pFastBac1载体酶切的限制性内切酶为Not I和Sph I。

3.根据权利要求1所述的病毒样颗粒，其特征在于，所述优化遵循：编码的氨基酸序列不变；将稀有密码子去除；将影响mRNA稳定性和核糖体结合的茎环结构破坏。

4.根据权利要求1所述的病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒的纯化方式为，在4℃离心机中用2,000rpm离心20min去掉细胞碎片，用30,000rpm离心60分钟进行浓缩，用PBS溶解沉淀过夜后经20％-30％-60％的蔗糖30,000rpm离心1小时进行纯化。

5.一种提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、重组杆状病毒Bacmid质粒的构建：将优化的NA-HA-M1基因和pFastBac1载体的基因进行多克隆位点分析，选择载体上提供而目的片段中没有的两个限制性内切酶：Not I和Sph I，双酶切后回收目的片段插入到昆虫细胞表达载体pFastBac1中，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞；

步骤二、重组杆状病毒的拯救：用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒；

步骤三、高致病性H5N1流感病毒样颗粒的制备：将获得的重组杆状病毒按MOI＝3接种昆虫细胞，3天后收获上清，即得高致病性H5N1流感病毒样颗粒。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，具体操作为：：取1μl pFastBac-NA-HA-M1加入到50μl感受态DH10Bac细胞中，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入1ml无抗性的LB培养基，37℃培养48h，挑取白斑菌落，加入LB培养基,37℃ 200rpm/min摇床培养12h，提取质粒DNA进行PCR鉴定，鉴定正确的阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤二、三中使用的昆虫细胞为Sf9细胞。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤二中待Sf9细胞的细胞汇合达到80％以上时方进行转染。

9.提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒在制备特异性疫苗预防流感方面的应用。

10.提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒在保护同源2.3.2.1病毒和异源2.3.4病毒的攻击方面的应用。