CN101643721B

CN101643721B - 广谱安全型动物用抗甲型流感病毒疫苗

Info

Publication number: CN101643721B
Application number: CN2009101046374A
Authority: CN
Inventors: 许雁; 曹永长; 李卓; 诺曼·吉利卡
Original assignee: NOVARTIS BIOTECHNOLOGY (WUHAN) CO Ltd
Priority date: 2009-08-17
Filing date: 2009-08-17
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2029-08-17
Also published as: CN101643721A

Abstract

含有甲型流感病毒基质蛋白M1、表面膜蛋白HA、NA、及M2eNP融合蛋白，或它们中的至少一个突变体与其余蛋白修饰后的重组病毒样颗粒，且该重组病毒样颗粒是非复制型的；其中：所述M2eNP融合蛋白为基质蛋白M2胞膜外端的一个M2e多肽或多个M2e多肽构成的多聚体，或经人工修饰后的一个M2e多肽或修饰后的多个M2e多肽构成的多聚体与核蛋白NP融合而成；所述核蛋白NP经重组表达后与重组基质蛋白M1偶联，且包埋于所述重组病毒样颗粒内。所述重组病毒样颗粒生产的疫苗，可直接应用于预防各类动物免于甲型流感病毒的感染及传播。这种疫苗使用安全，免疫效果显著。生产周期短，技术操作简单，不需纯化，因此疫苗成本低廉。

Description

广谱安全型动物用抗甲型流感病毒疫苗

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及应用昆虫杆状病毒——昆虫细胞表达系统重组的病毒样颗粒及含有所述重组的病毒样颗粒的动物用抗甲型流感病毒疫苗。

背景技术

甲型流感病毒可在人类、哺乳类及禽鸟类中传播。如禽流感是一种在禽鸟中包括养殖的家禽中广泛传播的传染病。这种传染病病毒，尤其是属于高致病性亚型病毒H5N1，对禽鸟造成的危胁非常大，其发生病症的特点是：突然暴发严重疾病，并迅速蔓延，死亡率可在48小时内达到100％，据报道，所有的高致病性禽流感的暴发均由H5和H7亚型病毒引起。近10年来，由这种高致病性禽流感病毒引发的大规模家禽鸟类的死亡的记载有增无减，并由亚洲向世界其它地域迅速蔓延，包括了欧洲、非洲及拉丁美洲，对家禽养殖业造成了重大的经济损失且难以有效地控制。另一个对甲型流感病毒的关注点是其潜在的，可能转化成对人类健康产生巨大威胁的人传人的人类流感大爆发。令人谈虎色变的“1918年西班牙流感”造成的人类死亡数达4-5千万人之多。1957年由猪流感引发的人流感暴发，造成全球2百多万人死亡。因此有效地阻断甲型流感病毒，尤其是高致病性H5N1型禽流感病毒的传播繁殖尤为重要。而要做到这一点，应用免疫疫苗进行预防是一有效手段，尤其是从家禽鸟类着手，及早杜绝上游方的病灶原，以防传播蔓延。

提及甲型流感病毒，需知道此病毒的结构特点。甲型流感病毒属反义单链核苷酸病毒，呈隋圆状，大小为200-300纳米，其遗传基因组物质总共由8条反义单链核苷酸条组成，控制病毒全部的10个蛋白质的合成。病毒的外壳是一层由脂质及脂蛋白构成的膜，包裹着病毒的遗传物质及核蛋白。共有四种蛋白质，属于病毒表面结构蛋白，它们是：

——基质蛋白M1，形成病毒外壳的主体蛋白；

——基质蛋白M2，主要形成膜上的离子通道；

——红细胞凝集素HA，病毒外壳表面膜上的主要糖蛋白，共有16个亚型。是诱发宿主机体产生抗体的主要抗原体。

——神经氨酸苷酶NA，亦是病毒外壳表面膜上的一种糖蛋白，共有9个亚型，同样是诱发抗体产生抗体的主要抗原体。

目前国内生产的用于预防家禽禽流感疫病的疫苗大部份是采用传统的鸡胚法培养活病毒，经化学灭活后，生产成疫苗。这种技术又分为两种不同的制备法：一是直接用野生型病毒感染鸡胚；另一种是先采用逆向遗传法改造野生病毒的遗传性，然后用此改造后的病毒感染鸡胚，生产疫苗。还有一类疫苗是将禽流感病毒的基因重组入另一类温和的禽鸟类病毒遗传物质内，然后培养出这种嵌合体活病毒做为抗禽流感的疫苗。最后一类疫苗是直接用重组的HA蛋白质作为疫苗的抗原体。这些禽流感疫苗制备技术有其优点，但亦存在着很大的缺陷。尤其是高致病性禽流感病毒的与众不同特性——高频率突变，双重及多重亚型病毒之间遗传物质重组及抗原性漂变等——使这些疫苗的长期安全性及有效性受到了极大的挑战，甚至产生了无效型疫苗，难以应付新的突变型H5N1禽流感病毒的传染。除此以外，这些疫苗制剂还存在着以下的不足：

1、生产周期长：从获得新的亚型病毒株到疫苗生产上市，耗时5-8个月，难以遏制新的疫情大爆发。

2、生产条件高：为预防人为的污染环境及生产的活病毒的泄漏扩散，整套生产必须按规定在严格控制的条件下进行，病毒的灭活必须保证完全，彻底。

3、无法区别被免疫过的禽鸟与受真正病毒感染的禽鸟。

如前所述，禽流感病毒的表面膜蛋白HA和NA是引起机体产生免疫应答的主要诱发物，而基质蛋白M1是形成病毒外壳的主体，亦可作为组织型免疫应答的诱发物【文献1，2，3，4】。有关的研究证明，基质蛋白M1的正确表达，是保证病毒外壳形成的重要环节【文献5，6】，而膜蛋白NA的功能之一是把病毒实体从宿主细胞表面剥离下来，形成病毒颗粒【文献7】。因此禽流感病毒的结构蛋白M1、HA和NA可合成病毒样颗粒做新型抗禽流感病毒疫苗。新近研究报告指出，M2基质蛋白的位于膜外端的M2e片段具有保守性的表位构想，可有效地刺激机体产生广谱性的免疫应答【文献8，9】。核蛋白NP不但可诱发机体产生一定的细胞型免疫应答【文献8，10，11】，还能在病毒颗粒形成过程中，与M1蛋白的中间部位相偶联，共同一致向宿主细胞膜下集结，为最终形成病毒颗粒铺垫好道路【文献12，13】。核蛋白NP还能携带从宿主细胞质中返回至细胞核内的M1蛋白重回到细胞质中，从而增加了M1蛋白的有效生成量【文献14】。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的甲型流感病毒样颗粒，用于生产安全，高效的动物用抗甲型流感病毒疫苗。

本发明提供的抗甲型流感病毒疫苗的工作原理如下：

(1)甲型流感病毒样颗粒的生成原理：

将病毒的基质蛋白及表面膜蛋白和核蛋白的基因，构建于昆虫杆状病毒的表达载体质粒内，并使其重组入昆虫杆状病毒的遗传物质DNA内，利用宿主昆虫细胞表达这些外源蛋白，然后自动组装成不含任何甲型流感病毒遗传物质的病毒样颗粒，并释放入细胞培养液中。

(2)甲型流感病毒样颗粒疫苗的免疫原理：

甲型流感病毒引起宿主产生免疫应答是因其外壳膜上的表面糖蛋白及内源的结构蛋白。新型甲型流感病毒样颗粒作为疫苗抗原体，不但其外壳膜上含有高密度的表面糖蛋白，同时颗粒内还带融合蛋白3xM2eNP。M2e多肽具有广谱抗原性，NP核蛋白能诱发细胞型免疫应答。病毒样颗粒本身还具有与野生病毒相似的体积，能快捷地被宿主免疫细胞识别及处理，因而诱导机体产生功能性抗体，并使机体产生记忆性应答。甲型流感病毒样颗粒疫苗具有野生病毒的整体外部特征，却唯独不具病毒的遗传物质。因此，病毒样颗粒疫苗无需进行任何化学灭活，其表面糖蛋白的构象空间没被破坏，与野生病毒一致。另外，生产的疫苗上清原液还含有大量游离的3xM2eNP融合蛋白分子，使蛋白分子抗原诱发动物机体免疫应答的作用也得到了发挥。因此这种动物用抗甲型流感病毒疫苗，真正达到了既安全又有效的目的。

根据上述原理，本发明所指的甲型流感病毒样颗粒为：含有甲型流感病毒基质蛋白M1、表面膜蛋白HA、NA、及M2eNP融合蛋白，或它们中的至少一个突变体与其余蛋白修饰后的重组病毒样颗粒，且该重组病毒样颗粒是非复制型的；其中：所述M2eNP融合蛋白为基质蛋白M2胞膜外端的一个M2e多肽或多个M2e多肽构成的多聚体，或经人工修饰后的一个M2e多肽或修饰后的多个M2e多肽构成的多聚体与核蛋白NP融合而成；所述核蛋白NP经重组表达后能与重组基质蛋白M1偶联，增加了病毒样颗粒的生成，且包埋于所述重组病毒样颗粒内。

上述蛋白M1、HA、NA和NP来自H5N1亚型株和/或其它甲型流感病毒株。

本发明以昆虫杆状病毒——昆虫细胞表达系统为基础，利用甲型流感病毒的基质蛋白及表面膜蛋白共同重组构建出甲型流感病毒的空壳，作为动物用抗甲型流感病毒疫苗的抗原体。同时，利用此病毒内源结构蛋白NP能与M1蛋白相结合的特性，将NP蛋白带入病毒样颗粒内。并将具有广谱抗原性的人工设计合成的三聚M2e(3xM2e)多肽引入NP蛋白，形成一融合蛋白3xM2eNP。

根据上述表达系统，所述基质蛋白M1、表面膜蛋白HA、NA，及3xM2eNP融合蛋白，或它们的突变体的基因转录盒，分别自上游至下游依次带有如下组份：昆虫杆状病毒启动子PH和/或P10、Kozak碱基序列(CCACC)、上述蛋白的基因序列、SV40多聚腺嘌呤序列；此基因转录盒整合到含有昆虫杆状病毒基因组的质粒bacmid内，此bacmid质粒经转入到Sf-9昆虫细胞内后，自动生成带有此基因转录盒的重组昆虫杆状病毒，用于转染昆虫细胞Sf-21，合成重组病毒样颗粒，该重组病毒样颗粒存在于所述的重组昆虫杆状病毒转染的昆虫细胞培养上清液中，此细胞培养上清液不需纯化使用。

本发明提供的上述重组病毒样颗粒，或细胞培养上清液与一种或多种药学上可以接受的载体或/和佐剂组合后构成用于预防动物甲型流感疫病的重组病毒样颗粒疫苗。

上述病毒样颗粒疫苗具有以下特征：

(1)抗原体病毒样颗粒具有野生病毒颗粒完全相似的外观结构及体积，图1是病毒样颗粒在电子显微镜下的图像。

(2)抗原体病毒样颗粒带有野生病毒(如野生H5N1病毒)的全部结构蛋白，基质蛋白M1，基质蛋白M2的重要表位肽M2e，红血球凝集素HA，神经氨酸苷酶NA和核蛋白NP。见图5。

(3)抗原体病毒样颗粒表面膜上的糖蛋白HA的凝血功能及特点与报道的野生病毒具有的凝血功能一样。见图6。

(4)抗原体病毒样颗粒的免疫原性达到商品化的疫苗所具有的程度。动物血清抗体效价HI滴度检测结果显示，由病毒样颗粒疫苗诱发宿主机体产生的抗体可与商品化疫苗诱发的水平相媲美。见附表3，4。

(5)抗原体病毒样颗粒带有的3xM2eNP融合蛋白能刺激机体免疫细胞释放出大量不同亚型的血清抗体IgG(图13)和抗病毒的细胞因子γ-干扰素(图14)，保护动物，如小鼠，在注射了H5N1禽流感病毒样颗粒疫苗后，可免于甲型流感病毒H5N1的侵染。见本文中的表2。

(6)甲型流感病毒样颗粒疫苗同时具有高度的特异性。如H5N1禽流感病毒样颗粒疫苗能诱发宿主禽类免疫系统产生特异性抗体，中和H5N1禽流感病毒的侵染。见图10.

(7)核蛋白NP的表达及与基质蛋白M1的偶联，可一定程度上增加抗原体病毒样颗粒的形成，提高其产量。见图7.

(8)重组昆虫杆状病毒——昆虫细胞培养上清液，既含有多个结构蛋白组合而成的病毒样颗粒，又带有大量游离的融合蛋白3xM2eNP分子。用未纯化的上清液制得的油乳化肌注剂型疫苗能达到诱发机体免疫系统产生抗体并维持抗体稳定性的功效。见图9。

(9)医用白油、吐温和司本是制备肌注剂型抗禽类禽流感病毒样颗粒疫苗不可或缺的重要成分。见附表3

重组甲型流感病毒样颗粒的构建、合成及用H5N1禽流感病毒样颗粒疫苗免疫小鸡、小鸭、小鼠和小猪的动物实验采用以下的技术步骤：

(1)将人工合成的甲型流感病毒的基质蛋白M1基因，表面膜上的糖蛋白HA、NA及融合蛋白3xM2eNP基因分别插入到昆虫杆状病毒的表达质粒上，形成重组的表达质粒，并整合到昆虫杆状病毒的遗传物质DNA内。

(2)利用重组昆虫杆状病毒大分子质粒作为载体，将外源流感病毒基因带入相应的宿主昆虫细胞株Sf-9细胞中，合成重组的带有外源流感病毒基因的活的昆虫杆状病毒。

(3)选用适当的方法及条件，培养受重组昆虫杆状病毒转染的宿主昆虫细胞Sf-21，使其得以高效地表达外源流感病毒的结构蛋白，并将自动组装成的甲型流感病毒样颗粒释放到细胞培养液中。

(4)收集带有病毒样颗粒的细胞培养上清液。纯化小量样品，做为电镜观察用。

(5)用H5N1禽流感病毒样颗粒疫苗免疫无特殊病原体污染的小鸡、小鸭，免疫二星期后开始采血取样，进行分析；或者免疫6周龄无特殊病原体污染的小猪，共免疫两次，每次免疫后的第二个星期采血取样分析；或者免疫6-8周龄无特殊病原体污染的BALB/c雌性小鼠，共免疫三次，每次免疫二星期后采血取样。第三次免疫三周后，用H5N1病毒攻毒，检测病毒样颗粒疫苗的免疫保护性。

其中步骤(1)中的M1、HA、NA、NP四个基因的DNA，是参照公开的H5N1亚型病毒A/duck/Guangdong/1/2000(H5N1)各基因序列【文献15】。采用人工化学合成法而获得。

根据HA基因序列，设计的一对引物HA_BamHI_5/HA_Not I_3，其两端分别加上了BamHI/NotI的酶切位点，引物序列如下：

HA_BamHI_5，5’-GGGGGATCCATGGAGAAAATAGTGCTTCTTG-3’

HA_NotI_3，5’-GGGGCGGCCGCTTAAGTGCAAATTCTGCATTG-3’

根据NA基因序列设计的一对引物NA_SmaI_5/NA_NheI_3，其两端分别加上了SmaI和NheI的酶切位点，这二个引物序列分别是：

NA_SmaI_5，5’-GGGCCCGGGATGAATCCAAATCAGAAGATAA-3’

NA_NheI_3，5’-GGGGCTAGCCTACTTGTCAATGGTGAATGG-3’

根据NP基因序列，设计的一对引物NP_BamHI_5/NP_NotI_3，其两端分别加上了BamHI/NotI的酶切位点，引物序列如下：

NP_BamHI_5，5’-AAAAGGATCCCCACCATGGCGTCTCAAGGCACCAAACG-3’

NP_NotI_3，5’-AAAAGCGGCCGCCTTTAATTGTCATATTCCTCTG-3’

M1基因所用的一对引物M1_BamHI_5/M1_NotI_3是根据M1基因序列而设计，并将两端分别加上了BamHI及NotI酶切位点，这对引物的序列如下：

M1_BamHI_5，5’-GGGGGATCCATGAGTCTTCTAACCGAGGTC-3’

M1_NotI_3，5’-CCCGCGGCCGCAGTAGAAACAAGGTAGTTT-3’

三聚M2e(3xM2e)多肽链的DNA片段所用的一对引物M2e_BamHI_5/M2e_NcoI_3是根据其DNA序列而设计，并将两端分别加上了NcoI及BamHI酶切位点，这对引物的序列如下：

M2e_BamHI_5，5’-GGATCCCCACCATGTCGTTGTTGA-3’

M2e_NcoI_3，5’-CCATGGGGTCCGACGAGTCCCCC-3’

合成的M1基因长度为1.0Kb，HA基因长度为1.7Kb，NA基因长度是1.35Kb，NP基因的长度是1.5Kb，3xM2e DNA片段的长度为203bp。HA、NA、M1、NP和3xM2e的DNA序列均经过测序，确定无突变后，再进行下一步重组质粒的构建工作。

步骤(1)中的昆虫杆状病毒表达质粒pFastBac-Dual(购自美国Invitrogen公司)，具有调控外源蛋白质在昆虫细胞中有效表达的昆虫杆状病毒启动子PH和P10。将目的基因HA、NA、M1、核蛋白NP及3xM2e DNA片段分别进行酶切消化，同时将昆虫杆状病毒表达质粒亦用相应的限制性内切酶消化之。经纯化后，分别用DNA连接酶将相应的目的基因连接插入到表达质粒的对应位置上，获得的连接产物直接转化入大肠杆菌DH5a，经氨卞青霉素筛选出阳性克隆，后者再经PCR筛选及DNA序列测序，获得所需的第一次重组表达质粒。用此质粒再进行第二次酶切、插入、转化及筛选，使二个目的基因HA和NA全部组装入昆虫杆状病毒的表达质粒上。或者将3xM2e DNA片段插入到NP基因的5’端，构成3xM2eNP融合基因。M1重组表达质粒只需进行一次克隆及筛选重组的表达质粒。所有重组的表达质粒经纯化后，再转入带有昆虫杆状病毒基因组物质的大型质粒Bacmid的特殊大肠杆菌DH10Bac细胞中(购于美国Invitrogen公司)，在三种抗生素(四环素，庆大霉素及卡那霉素)的筛选和IPTG的诱导及X-Gal底物反应后的颜色变化，从培养盘中挑选出白色的阳性克隆。经进一步PCR筛选及DNA序列测序，获得最终所需的带有目的基因HA、NA、M1或3xM2eNP的大型质粒Bacmid，抽提纯化后，这些大分子DNA将做为合成重组昆虫杆状病毒的物质。

其中步骤(2)中选用的Sf-9昆虫细胞株(购于美国Invitrogen公司)，属于昆虫杆状病毒的有效宿主细胞，在昆虫细胞转化试剂Cellfectin(购于美国Invitrogen公司)的作用下，带有目的基因的重组大分子质粒Bacmid被有效地带入Sf-9细胞内。经过27℃，4-5天的细胞培养，大量生成的活的重组昆虫杆状病毒被释放入细胞培养液中，用收集的细胞培养上清液再一次侵染新的Sf-9细胞，获得放大后高滴度的重组昆虫杆状病毒，以备后用。

病毒滴度的测定，采用传统的空斑计数法：将昆虫细胞Sf-9铺盘后，用不同稀释浓度的细胞培养上清液转染，再盖上一层低熔点的琼脂糖凝胶(购于美国Sigma公司)，于27℃培养箱中培养一星期后，加入3％中性红染液(购于美国Sigma公司)，继续培养过夜，第二天计数培养盘中的白色空斑。根据相应的稀释倍数，推算出活病毒最终滴度；或采用MTT微量读盘法测定病毒滴度：将96孔细胞培养板的每一孔内，加入50微升含5000个Sf-9细胞的Sf-900II培养液(购于美国Invitrogen公司)，再加入10微升不同稀释倍数(从1to 1×10^-10)的病毒培养上清液转染。6天后，每孔加入10微升MTT(购于美国Sigma公司)溶剂(5克/升)。室温下摇动孵育2小时，离心10分钟(2000g)后，除去上清，加入50微升DMSO(购于美国Sigma公司)。细胞培养板置入读板机内读数(570nm)，测每孔的吸收值。根据公式计算出活病毒的最终滴度(图8)。

其中步骤(3)中，生产病毒样颗粒使用的活病毒量为5个病毒/每个细胞(即MOI：5)具体而言，将1升体积的摇瓶中，放入200ml含有2×10⁶/ml的昆虫细胞Sf-21(购于美国Invitrogen公司)混合液。按每个细胞被5个病毒转染，以及活病毒的滴度，计算出所需的病毒量，加入到上述的1升摇瓶内，侵染昆虫细胞。摇瓶放入摇床内，温度保持在27℃，摇速为100rpm，共培养3天。表达的四种禽流感结构蛋白利用宿主细胞提供的条件，自动组装成禽流感病毒的外壳，即禽流感病毒样颗粒，释放入细胞培养液中。

其中步骤(4)中，收集全部的细胞培养物，经离心(转速3000rpm，温度4℃，共30分钟)后，保存其上清液，弃之细胞沉淀物。

电镜观察用的样品纯化，是采用常规的庶糖浓度梯度超速离心的方法。庶糖溶液浓度分别配成20％、30％及60％，超速离心速度为29,000rpm，时间1小时，共离心二次。然后收集位于20％与30％及30％与60％浓度交界处的二条带，其内含有纯化的病毒样颗粒。

其中步骤(5)中的免疫动物血清抗体测定，病毒中和反应，病毒攻毒试验及细胞因子的测定，是根据现行使用的甲型流感病毒动物免疫实验方法进行的。检测免疫小鸡的血清抗体HI滴度实验，是选用无特殊病原体污染的21天龄小鸡，免疫二星期后采血取样，进行分析。具体操作如下：给21天龄的小鸡，颈部皮下注射0.5ml乳化后的H5N1禽流感病毒样颗粒疫苗，两周后开始于小鸡翅膀下静脉采血。以后每周采血一次，取血清进行血凝抑制(HI)滴度测定。即：在血凝板每孔内加0.05ml的生理盐水，进行等量系列倍比稀释被检抗体，每孔稀释后的体积仍为0.05ml。再加入等量的4单位抗原混匀，放置室温约20分钟后加入等量的1％鸡红细胞。能完全抑制红细胞凝集的被检抗体的最高稀释度为该被检抗体的HI滴度。

免疫小鸡血清抗体的病毒中和反应实验步骤如下：用96孔细胞培养板进行被检血清抗体的系列倍比稀释，终体积为0.05ml/孔。加入0.05ml稀释后的流感病毒(100TCID50/0.05ml)，混匀后放37℃温箱作用2小时。每孔再加入100微升含15000个MDCK细胞的培养液，37℃温箱孵育18-22小时。弃去微量培养板中的细胞液，加入100微升/孔固定液。弃去固定液，用PBS洗涤微量板中的细胞。每孔加OPD底物100ul，显色10分钟，再加入1M硫酸100ul终止反应。在ELISA测定仪上(490纳米)读出每孔OD值。

实验小鼠病毒攻毒试验，采用将90只6-8周龄BALB/c雌性小鼠随机分成6组，分别用肌肉注射或滴鼻免疫法给各实验组的小鼠免疫三次，每次间隔两周。第三次免疫后的第三周，用H5N1病毒进行滴鼻攻毒处理。每天观察测量下列数据：体温、体重、活动力、皮毛是否光滑，是否流涕或者腹泻，记录小鼠死亡情况等。

最后一次免疫后2周和攻毒处理4天后，每组2-3只小鼠取脾脏分离细胞。用ELISPOT检测细胞因子γ-干扰素的表达水平。其步骤简述如下：取实验小鼠的脾脏，研磨分离，制作成细胞悬浮液。离心后加入3-5ml Lympho-Spot^TM无血清培养基重悬，500万个细胞/ml。再按5×10⁵细胞/孔的比率，接种到包被好相应捕获抗体和封闭好的ELISPOT板内，加入相应的刺激物，37度0.5％CO2培养箱中培养18-19小时。PBS洗涤细胞3次，加入生物素化的抗鼠IgG二抗孵育60min。再洗三次，链亲和素标记的碱性磷酸酶孵育60min。PBS洗3次，用底物BCIP/NBT显色后，终止显色反应，用ELISPOT读板仪进行计数。

甲型流感病毒样颗粒，除了做为一种新型的动物用抗甲型流感病毒的疫苗外，还具有其它的重要应用价值。应用之一是将病毒样颗粒作为其它不同疫苗免疫抗原尤其是只能用简单蛋白质或多肽分子做为免疫抗原的疫苗的载体。其做法是将这些蛋白质分子或多肽分子与HA表面膜蛋白的位于膜内的片段形成融合蛋白，甚至可以将两种以上不同的免疫原蛋白或多肽分子融合于HA的膜内片段上，经表达及自身组合后，病毒样颗粒表面膜上的外源免疫原蛋白或多肽分子可达数百个，形成一个表面高密度抗原蛋白嵌合型大颗粒，以增强机体的免疫应答及产生组织型和细胞型的免疫抗体及记忆。

其它应用之二，甲型流感病毒样颗粒，可作为安全，有效的检测试剂，用于检测家禽、家畜体内是否含有特异性抗HA和NA的抗体，以尽早鉴别动物是否受流感病毒的感染。

本发明产生的有益效果：

与目前市场上销售的动物用抗流感病毒疫苗相比，本发明生产的甲型流感病毒样颗粒疫苗具有明显的优点和效果。

(1)病毒样颗粒疫苗能引起机体免疫系统产生组织型和细胞型免疫应答，因此免疫力强。

(2)病毒样颗粒具有与野生病毒相同的外壳结构，却不具病毒活性，无传染力，因而非常安全，有效。生产过程无需特殊环境控制(诸如生物安全水平2或水平3的车间)以防病毒外泄。

(3)可同时将两种以上的亚型病毒的外壳膜蛋白HA和NA集于同一病毒样颗粒上，起到一种疫苗同时预防几种亚型流感。

(4)生产周期短，完全适应于甲型流感，尤其是高致病性H5N1禽流感病毒的快速多突变特性。从分离出突变株的结构蛋白基因到疫苗产品一般只需短短十几周时间，一旦重组昆虫杆状病毒合成后，病毒样颗粒的生产过程，少于一周时间。

(5)人工控制的昆虫细胞发酵，可大规模生产所需的疫苗，保证疫苗质量的稳定性。

(6)生产工序简便，因病毒样颗粒不含病毒的遗传物质，故无需进行化学灭活处理。

(7)可区别出被人工免疫了的家禽、家畜与被野生病毒感染的家禽、家畜。病毒样颗粒不含甲型流感病毒的其它非结构蛋白，诸如NS、PB1、PB2等，因此进行血清测试时，用病毒样颗粒疫苗免疫的动物，将不会产生特异性抗NS或PB的抗体。

附图说明

图1、纯化后的病毒样颗粒在电子显微镜下的图象。

图2、人工合成的M1，HA，NA和NP基因经PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。

图3、重组昆虫杆状病毒表达质粒示意图。

A、重组昆虫杆状病毒表达质粒pFastBac-Dual-M1示意图。

B、重组昆虫杆状病毒表达质粒pFastBac-Dual-HANA示意图。

C、重组昆虫杆状病毒表达质粒pFastBac-Dual-3xM2eNP示意图。

图4、M1蛋白表达后的考马斯亮兰染色分析。

图5、蛋白HA、NA、M1，NP和3xM2eNP在昆虫杆状病毒——昆虫细胞表达系统中的Western blots分析。

A)、M1蛋白Western blots分析。

B)、HA、NA蛋白Western blots分析。

A：纯化后的病毒样颗粒样品

B：Sf-21细胞裂解液做为空白对照

C：共转染后的细胞裂解液

D：Ds-Red重组病毒转染后的细胞裂解液做为阴性对照

C)、NP、3xM2eNP蛋白Western blots分析。

A：转染的细胞裂解液

B：转染的细胞培养上清液

C：纯化后的病毒样颗粒样品

D：第一次超速离心后的样品上清液

1.只含有HA，NA，M1的病毒样颗粒样品

2.含有HA，NA，M1和NP的病毒样颗粒样品

3.含有HA，NA，M1和3xM2eNP的病毒样颗粒样品

图6、合成的病毒样颗粒表面膜上的糖蛋白HA具有的凝血功效及滴度的测定。

图7、微量读盘法测HA滴度。

A、由HA、NA和M1组成的病毒样颗粒的HA滴度测定。

B、由HA、NA、M1和NP组成的病毒样颗粒的HA滴度测定。

C、PBS对照。

图8、MTT法测重组杆状病毒的滴度。

A、重组杆状病毒Bac-M1的滴度。

B、重组杆状病毒Bac-HANA的滴度。

C、重组杆状病毒Bac-3xM2eNP的滴度。

图9、病毒样颗粒乳化油苗免疫的家禽血清中抗体稳定性测定。

图10、免疫小鸡血清抗体的病毒微量中和反应

图11、免疫小鸭血清抗体效价HI滴度的测定

图12、免疫小猪血清抗体效价HI滴度的测定

图13、病毒样颗粒疫苗免疫的小鼠抗体IgG及其亚型的测定

A：肌注免疫小鼠的血清抗体IgG

B：粘膜免疫小鼠鼻腔冲洗液中的抗体IgG

C：肌注免疫小鼠的血清抗体IgG1

D：肌注免疫小鼠的血清抗体IgG2a

E：肌注免疫小鼠的血清抗体IgG2b

F：肌注免疫小鼠的血清抗体IgG3

图14、细胞因子γ-干扰素的测定。

M1基因序列(SEQ ID NO：1)，M1蛋白质序列(SEQ ID NO：2)，HA基因序列(SEQID NO：3)，HA蛋白质序列(SEQ ID NO：4)，NA基因序列(SEQ ID NO：5)，NA蛋白质序列(SEQ ID NO：6)，NP基因序列(SEQ ID NO：7)，NP蛋白质序列(SEQ ID NO：8)，M2e DNA序列(SEQ ID NO：9)，M2e多肽序列(SEQ ID NO：10)，3xM2eNP融合基因序列(SEQ ID NO：11)，3xM2eNP融合蛋白质序列(SEQ ID NO：12)。

具体实施方式：

通过下面给出的本发明的具体实施例子可以进一步清楚地理解本发明。但下述实施例子不是对本发明的限定。

实施列1：H5N1亚型禽流感病毒基因M1、HA、NA和NP及融合基因3xM2eNP的合成。

(1)人工设计M2e多肽链DNA的序列：所有公布的中国甲型禽流感M2蛋白序列均下载于生物御防及公共健康数据库生物信息资源中心(BioHealthBase)。使用特别设计的软件Perl将所有M2e的序列保存下来，然后用软件ClustalW进行配对分析，并用Jalview确定了一段最具保守性的序列。这段多肽序列(SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD)被反转译成DNA序列，成为M2e的DNA序列。

(2)人工化学合成M1、HA、NA、NP基因和3xM2e DNA片段：所有这些基因和三聚M2e(3xM2e)DNA片段的人工化学合成交由加拿大的Bio Basic Inc公司完成。人工合成方法大致如下：根据各基因序列，用DNA合成仪合成一系列带有相应重叠部分的核苷酸短链。将这些核苷酸短链混合在一起，进行以各自互为模板的多聚酶链式反应。再用这些反应产物为模板，加入各基因的5’端和3’端的两个引物(见附表5)，进行多聚酶链式反应，扩增成完整的目的基因DNA，见图2。

人工合成的M1基因，其DNA序列如SEQ ID NO 1所示，M1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，长度为252个氨基酸。人工合成的HA基因，其DNA序列如SEQ ID NO 3所示，HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示，长度为567个氨基酸。人工合成的NA基因，其DNA序列如SEQ ID NO 5所示，NA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示，长度为449个氨基酸。人工合成的NP基因，其DNA序列如SEQ ID NO 7所示，NP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示，长度为498个氨基酸。人工设计的M2e DNA片段，其DNA序列如SEQ ID NO 9所示，M2e多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO 10所示，长度为23个氨基酸。

(3)融合基因3xM2eNP的生成：将克隆好的pFastBac-Dual-NP质粒(见实施例2)用BamHI和NcoI双酶切，人工合成的含有上述三个重复M2e(3xM2e)的DNA片段亦用同样双酶切处理后，插入到NP基因上游5’端，形成所需的3xM2eNP融合基因。这样酶连的融合基因，其DNA序列如SEQ ID NO 11所示，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 12所示，长度为569个氨基酸。

实施例2：构建表达M1，HA、NA和3xM2eNP基因的昆虫杆状病毒表达质粒及在昆虫细胞中合成重组的昆虫杆状病毒。

(1)构建表达M1基因的重组质粒：昆虫杆状病毒表达质粒pFastBac-Dual(Invitrogen公司产品)经限制性内切酶BamHI/NotI 37℃过夜消化水解后，用凝胶电泳及过柱抽提纯化。在T4 DNA连接酶的作用下，酶切后的质粒与酶切后的M1基因DNA片段于16℃连接过夜。反应体系如下：10×T4连接缓冲液1ul，M1酶切回收的DNA片段3ul，酶切pFastBac-Dual质粒回收产物1ul，T4DNA连接酶1ul，ddH2O补至10ul。采用热休克方法将连接产物转导入E.coli DH5a感受态细菌中。具体操作如下：将50ul DH 5a感受态细胞移入到一小塑料离心管中，加入5ul的连接反应液，混匀后将小管置于冰上30min，转入42℃水浴中热休克45s，迅速放回冰上，2min后加入950ul LB培养液。37℃摇床培养1小时。取100ul菌液涂布于LB固体培养基(含有100ug/ml氨卞西林)上，37℃培养16小时，从平板上挑取阳性克隆菌落，用特异性引物M1 Bam HI/M1NotI进行PCR筛选，挑取筛选的阳性单克隆菌落接种于2ml LB培养液(含100ug/ml氨卞西林)中，37℃ 250rpm振摇培养16小时。离心收集菌体，抽提质粒。DNA序列测定后，获得重组质粒pFastBac-Dual-M1

(2)构建表达HA和NA基因的重组质粒：昆虫杆状病毒表达质粒pFastBac-Dual经限制性内切酶BamHI/NotI水解后，在T4 DNA连接酶的作用下，将被同样的内切酶水解后的HA基因DNA片段插入到PH启动子的下方，此连接产物随后经热体克法转导入E.coli DH5a感受态细胞中，培养、抽提数个阳性克隆菌落的重组质粒DNA，序列测序确定无误后，挑选其中的一个重组质粒DNA，进行第二次酶切水解。所用的限制性内切酶为SmaI/NheI。用同样的内切酶水解NA基因DNA片段，并将其插入到重组质粒的另一个启动子P10的下方，经转化、筛选、培养、抽提，获得二度重组的质粒。DNA测序后，即为所需的重组昆虫杆状病毒表达质粒pFastBac-Dual-HANA。整个实验操作步骤及条件与上述构建pFastBac-Dual-M1质粒所叙相同。

(3)构建表达融合蛋白3xM2eNP基因的重组质粒：昆虫杆状病毒表达质粒pFastBac-Dual经限制性内切酶BamHI/NotI水解后，在T4DNA连接酶的作用下，将被同样的内切酶水解后的NP基因DNA片段插入到PH启动子的下方。用热休克法将重组质粒转导入E.coli DH5a感受态细胞中，筛选数个阳性克隆菌落，抽提其重组质粒DNA。经序列测序确定无突变后，选用其中的一个重组质粒pFastBac-Dual-NP DNA，进行第二次BamHI/NcoI酶切水解，并用同样的内切酶水解3xM2e DNA片段，将其插入到NP基因的5’端。经转化、筛选、培养、抽提，获得二度重组的3xM2eNP质粒。DNA测序后，即为所需的重组昆虫杆状病毒表达质粒pFastBac-Dual-3xM2eNP。整个实验操作步骤及条件与上述构建pFastBac-Dual-HANA质粒所述相同。

(4)重组昆虫杆状病毒基因组的合成及提取：将纯化的重组pFastBac-Dual-M1和pFastBac-Dual-HANA及pFastBac-Dual-3xM2eNP质粒分别转导入特殊的E.coli感受态细胞株DH10BAC细胞中(Invitrogen公司产品)。转导方法仍采用热体休克方法，条件与步骤同上所述一样。DH10BAC细胞含有一特殊的大分子质粒Bacmid，其内包含有昆虫杆状病毒AcMNPV的全部基因组。一旦重组的表达质粒整合入大分子质粒Bacmid的特别位点后，经三种抗菌素(庆大霉素、四环素和卡那霉素)的筛选及IPTG的诱导和X-Gal底物转化显色，阳性克隆菌落呈白色，而非重组的野生菌落呈兰色。实验条件均按照Invitrogen公司提供的实验手册指导而设定。挑选的阳性克隆菌置于3ml的LB培养液中(含上述三种抗生素)，37℃摇荡培养24小时。按照实验手册标明的大分子质粒Bacmid小量制备法，提取纯化的带有M1基因或HANA基因或3xM2eNP基因的重组大分子质粒Bacmid。

(5)重组昆虫杆状病毒的合成：昆虫细胞株Sf-9细胞(Invitrogen公司产品)培养于无血清的sf-900II昆虫细胞培养液中(Invitrogen公司产品)，温度设置为27℃，根据Invitrogen公司提供的实验手册所示，采用脂质体转入法，将纯化的重组大分子质粒Bacmid与脂质液Cellfectin(Invitrogen公司产品)混合，并转化入Sf-9细胞中。27℃培养4至5天后，收集细胞培养上清液，获得低浓度的重组昆虫杆状病毒，再用此上清液转染新培养的Sf-9细胞。3天后收集细胞培养上清液(4℃，离心3000rpm，10分钟)，即为所需的放大培养后的高浓度重组昆虫杆状病毒，命名为Bac-M1、Bac-HANA和Bac-3xM2eNP。

(6)重组杆状病毒滴度的测定：采用空斑计数法，将昆虫细胞Sf-9铺入6孔细胞培养板内，每孔1×10⁶细胞。加入以1∶10的倍数稀释法稀释的重组病毒上清液，转染细胞5小时后，盖上一层低熔点的琼脂糖凝胶(Sigma公司产品)，于27℃培养箱中培养一星期。加入3％中性红染液(Sigma公司产品)，继续培养过夜，第二天计数培养盘中的白色空斑。根据相应的稀释倍数，推算出活病毒的最终滴度。采用MTT微量读盘法测定病毒滴度：将96孔细胞培养板的每一孔内，加入50微升含5000个Sf-9细胞的Sf-900II培养液，再加入10微升不同稀释倍数(从1到1×10^-10)的病毒培养上清液转染。6天后，每孔加入10微升MTT溶剂(5克/升)。室温下摇动孵育2小时，离心10分钟(2000g)后，除去上清，加入50微升DMSO(Sigma公司产品)。细胞培养板置入读板机内读数(570nm)，测每孔的吸收值。用Prism 5(GraphPad Software)软件中的∑剂量反应公式，找出曲线的拐点，并根据以下公式计算出活病毒的最终滴度【文献17】。图8给出的是用MTT微量读盘法检测的重组杆状病毒Bac-M1，Bac-HANA和Bac-3xM2eNP的病毒滴度。

logTCID50/mL＝0.912(log TCLD50/mL)+1.674[Eq.1]

pfu/mL＝TCID50/mL×0.69[Eq.2]

用MTT微量读盘法和空斑计数法测得的重组病毒滴度较为接近。MTT微量读盘法的结果只稍高于空斑计数法，但操作简便，重复性好。

实施例3：M1、HA、NA和融合蛋白3xM2eNP基因在共同转染的悬浮培养的昆虫细胞Sf-21中的表达及分析。

(1)凝胶蛋白电泳检测M1基因的表达：用于放大培养重组杆状病毒Bac-M1的细胞离心沉淀物，经细胞裂解缓冲液处理后，4℃离心(13,000rpm)10分钟，收集上清液，进行凝胶电泳，分析基质蛋白M1是否在昆虫细胞Sf-21中表达。简单而言，给10ul细胞裂解上清液样品中加入10ul的2XSDS上样缓冲液，100℃处理5min后，快速离心5秒。将所有20ul的混合样品加入4％-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen公司产品)点样孔中。设置电泳条件为恒定电压100V，温度为4℃，时间2小时。电泳缓冲液为Tris-甘氨酸。待指示液溴酚兰接近凝胶底部时，停止电泳。凝胶置于1％R型考马斯亮蓝染色液中，摇晃染色1小时，然后置于脱色液中脱色过夜，并拍照。如图4所示，M1蛋白在昆虫细胞中进行了表达，分子量为28kD。

(2)Western blots检测分析M1、HA、NA和3xM2eNP基因的蛋白表达：200mlSf-21细胞混合液悬浮培养于1升体积的三角摇瓶中，细胞培养液为无血清的Sf-900II，摇床的摇速为100rpm，温度恒定于27℃。当细胞浓度达到2×10⁶/ml时，用Bac-M1、Bac-HANA和Bac-3xM2eNP重组昆虫杆状病毒共同转染Sf-21细胞。三种病毒的MOI比例为2(Bac-M1)∶2(Bac-HANA)∶1(Bac-3xM2eNP)。转染的细胞经恒温摇动培养3天后，收集所有样品，4℃离心30分钟，离速为3000rpm，收集上清液。离心下来的细胞沉淀物用细胞裂解液处理后，4℃离心10分钟，离速13,000rpm。保留离心后的上清液，即细胞裂解液。作为设置的阴性对照，构建合成的另一重组的非禽流感病毒蛋白的昆虫杆状病毒Bac-DsRed被用于转染悬浮培养的sf-21细胞，MOI为5。转染后的细胞培养、收集及细胞裂解的条件和步骤与上述实验一样。收集的所有样品，用于Western blots分析。其实验操作如下：每个样品(包括阴性对照)分别取10ul的细胞裂解抽提液及细胞培养上清液，再各自加入10ul的2×SDS上样缓冲液。100℃处理5min后，将所有20ul的混合样品加入4％-12％SDS聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中。设置恒定电压120V，温度为4℃，时间2小时，电泳缓冲液为Tris-甘氨酸。当兰色指示剂溴酚兰完全靠入凝胶底端时，停止电泳，取出凝胶。剪一张与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜及两张滤纸，与凝胶一起浸入室温下新鲜配制的转移缓冲液中，按海绵——滤纸——凝胶——硝酸纤维素膜——滤纸——海绵的顺序安装入转印夹。将夹中靠近凝胶的一侧接负极，恒压100V，4℃下转移电泳1小时。用镊子夹取出硝酸纤维素膜，转移至5％的脱脂奶粉/PBS溶液中，摇荡温育一小时。将硝酸纤维素膜转入一塑料袋中，加入3ml以1∶500稀释于5％脱脂奶粉/PBS中抗M1或HA或NA或NP的兔源多克隆抗体(第一抗体)，封口后，置于4℃，平缓摇动过夜。翌日，取出纤维素膜，用PBS-T漂洗液洗三次，每次15分钟，将此硝酸纤维素膜再装入另一新的塑料袋中，加入5ml以1∶10000稀释于5％脱脂奶粉/PBS中的辣根过氧化物酶标记的羊抗免IgG(第二抗体)，室温下摇动温育1小时。弃二抗。PBS-T漂洗纤维素膜3次，每次15分钟，将漂洗后的硝酸纤维素膜移至一平皿中，加入底物混合液，反应一分钟后，放入夹箱内，盖上底片。暴光冲洗后，可见在各自相对应的分子量位置上，M1、HA、NA、NP和3xM2eNP的特异性条带。而所设的空白及阴性对照样则无相应的条带，说明M1，HA、NA、NP和3xM2eNP基因在转染的悬浮Sf-21昆虫细胞中有效地表达了(见图5)。

(3)生成的病毒样颗粒HA滴度的测定：将96孔细胞培养板的第一列(A-H)的每孔内加入0.18ml的PBS，再加入0.02ml待检测的病毒样颗粒样品，进行1∶10倍的稀释。剩余的其它每孔内移入0.10ml PBS，将样品进行1∶2的倍比稀释。设置最后一行为PBS空白对照。用多排加样枪向每一孔内加入0.1ml的1％浓度的鸡红血球细胞，混匀，放置室温40分钟后，查看血凝情况。血凝现象消失的那一孔的样品稀释倍数的倒数即为该样品的HA滴度。如图6所示，在1升摇瓶中，工作容积为200ml的细胞上清液中的病毒样颗粒产量要比小摇瓶(125ml或250ml)的产量高。纯化后的病毒样颗粒HA滴度可高达5120.

实施例4：核蛋白NP的介入可提高病毒样颗粒的产量。

如前所述，核蛋白NP能与基质蛋白M1相偶联，并能将再进入宿主细胞核内的M1蛋白带回到细胞质中来【文献14】。M1蛋白的合成量直接决定着甲型流感病毒颗粒体的形成数量【文献5，6】。将已经知道病毒滴度的重组昆虫杆状病毒Bac-M1和Bac-HANA共转染昆虫细胞Sf-21。同时，将已知病毒滴度的重组昆虫杆状病毒Bac-M1，Bac-HANA和Bac-3xM2eNP共转染另一摇瓶中的昆虫细胞Sf-21。经27℃培养三天后，收集两摇瓶中的细胞上清液，用微量读板计数法检测其病毒样颗粒的H A滴度。具体操作如下：在96孔细胞培养板的各孔内加入PBS。将第一、二、三排(A-C)的第一孔内各加入等量的三组份(含M1，HA和NA三种蛋白)病毒样颗粒上清液；将第四、五、六排(D-F)的第一孔内各加入等量的四组份(含M1，HA，NA和3xM2eNP四种蛋白)病毒样颗粒上清液，进行1∶2^0.5倍比稀释。设置最后一排为PBS空白对照。然后每孔加入鸡的红血球细胞(2×10⁷cells/ml)90ul，混匀。室温下放置2小时后，置于微量读板机内，于700nm波长处读OD吸收值。用Prism 5(GraphPad Software公司，美国)软件中的∑剂量反应公式，找出曲线的拐点，即病毒样颗粒样品HA的滴度【文献16】。图7结果显示，与三组份(M1，HA和NA三种蛋白)的病毒样颗粒样品相比，四组份(M1，HA，NA和3xM2eNP四种蛋白)的病毒样颗粒上清液中，HA的滴度要高出24％。

实施例5：病毒样颗粒的纯化、分析及电镜拍片。

将上述离心收集的细胞上清液装入13ml的超速离心管内，称重、平衡、封管后，放入超速离心机(Beckman公司产品)内，离心1小时，速度为29,000rpm，温度为4℃。取出离心管后，小心倒掉上清液，保留离心管底的沉淀物。加入5ml的PBS，放入4℃冰箱内，溶解24小时。次日，在另一个13ml的超速离心管内，先小心地加入1ml 60％的庶糖溶液，然后依次加入1ml 30％及3ml 20％的庶糖溶液，最后将5ml的溶解后的样品液置于其上。精确称重、平衡后，封管上超速离心机。4℃离心1小时，离速为29,000rpm。取出离心管，分别收集位于20％与30％及30％与60％浓度交界处的二条带，即纯化的病毒样颗粒。Western blots分析纯化后的病毒样颗粒样品。其操作步骤与上述实施例3中Western blots分析一样，只是将所取的样品进行了稀释，即1ul的病毒样颗粒样品，加入9ul的水，再加入10ul的2×SDS上样缓冲液。100℃变性5min后，上样入4％-12％聚丙烯酰氨凝胶样品槽内。Western blots结果显示，从这二条带所获得的大分子颗粒，的确是由M1、HA、NA和3xM2eNP构成的病毒样颗粒(见图5)。说明转染后，M1、HA、NA和3xM2eNP蛋白在宿主细胞中有效地自我组装成病毒空壳，并释放入细胞培养上清液中。进一步的电镜结果证实了这一点。

电镜拍片实验操作如下：将少量的纯化浓缩后的病毒样颗粒样品固定处理后，置于新制备的无负荷的塑胶/碳包被网络格上，用数滴蒸馏水轻轻冲洗几次后，加上2％磷钨酸钠溶液进行负染色。电子显微镜下观察并拍片。如图1所示，病毒样颗粒的外观及体积大小与报道的野生病毒颗粒极为相近。外壳膜上都有一圈清晰的呈放射状的突起，即为HA和NA膜蛋白。

实施例6：水-油乳化剂做为制备动物用病毒样颗粒肌注型疫苗的有效佐剂。

水-油乳化剂是一种常见的疫苗佐剂，与其它的疫苗佐剂相比，更具有安全、有效、方便、价廉等特点，尤其受动物疫苗产业的青睐。水-油乳化剂的功能同样表现在作为病毒样颗粒疫苗的佐剂，能非常有效地增强机体对肌肉注射型疫苗的免疫应答。具体实验方法简述如下：(a)、未纯化的含有病毒样颗粒的细胞培养上清液的乳化：向80ml禽流感H5N1病毒样颗粒原液中加入4ml吐温-80，使其完全溶解。将9.6ml司本-80和160ml进口白油混合后，加入病毒样颗粒原液-吐温-80溶液，搅拌乳化制成油乳疫苗。为了检验疫苗是否完全乳化好，取1ml乳化液，放入一台式离心小管中，3000rpm离心15分钟，观察效果。若没有任何水、油分层出现，表明乳化完全，可作为有效疫苗进行肌肉注射。(b)、乳化与未乳化原液效价的比较：用21天龄的SPF小鸡40只，分成4组，每组10只，即病毒样颗粒(VLP)上清原液组、病毒样颗粒(VLP)乳化油苗组、禽流感H5灭活油苗组(由广东大华农动物保健品有限公司提供)和空白对照组。每只鸡按组分别注射VLP上清原液、VLP乳化油苗、禽流感H5灭活油苗、生理盐水，注射量均为0.3ml。免疫后的第14天，第21天和第28天，对每只鸡采血，检测血清抗体效价HI。共测三个周次，抗体效价检测即结束。实验结果显示，注射VLP上清原液的小鸡，其血清抗体滴度HI很低，平均不到1.0。而注射VLP乳化油苗的小鸡，其血清抗体滴度HI大大提高，平均达到6.0(21天)和7.3(28天)(附表3)。可见水-油乳化剂作为病毒样颗粒肌注型疫苗的佐剂，能非常有效地增强小鸡机体免疫系统对H5N1病毒样颗粒抗原刺激的反应。

实施例7：注射禽流感病毒样颗粒乳化油苗的家禽血清中免疫抗体稳定性测定。

(a)、无特殊病原体污染(SPF)小鸡的聊化：将SPF受精鸡蛋置于37℃聊化箱内聊化21天后，小鸡出壳。全部转移入与外界隔离的SPF鸡舍内，养殖21天时，准备注射疫苗。

(b)、免疫注射及血样的采集：将20只21天龄的小鸡颈部皮下注射0.5ml上面所述的禽流感病毒样颗粒乳化油苗。于免疫后的第二周开始采集血清样品，直至第11周为止。具体做法是：小鸡翅膀静脉采血1ml，置于事先预备好的小瓶中，待血凝后，离心收集上清液，4℃冰箱保存。

(c)、抗体效价HI的测定：血凝板上1～11孔全部加入0.05ml的生理盐水，于第一孔内加入等量的被检血清，对等倍数稀释至第10孔，弃去0.05ml。再加入等量的4单位抗原至第11孔，第11孔为抗原对照，12孔为生理盐水对照。混匀，放置室温约20分钟，然后加入等量的1％鸡红细胞。再放置室温约25分钟后，观察结果。能完全抑制红细胞凝集的被检血清的最高稀释度的倒数为该血凝抑制反应的终点，该孔稀释度即为被检血清的HI效价。实验小鸡的血清中免疫抗体效价HI的测定见图9。结果显示，禽流感病毒样颗粒疫苗能完全有效地激发机体免疫系统产生相应抗体，并能保持其稳定性。

实施例8：免疫小鸡血清抗体的流感病毒微量中和反应：

流感病毒微量中和反应，可用于检测血清中抗流感病毒亚型中和抗体水平，其特异性及敏感性均高于血凝抑制HI实验。原理是当血清中的抗流感病毒特异性中和抗体与病毒表面血凝素蛋白结合后，能有效地抑制流感病毒感染MDCK细胞。通过用ELISA检测MDCK细胞内是否有病毒核蛋白(NP)的表达，确定血清中特异性中和抗体的效价。该实验操作步骤如下：

96孔细胞培养板中加入10微升待检血清于第1排A1-A11，将待检血清作系列倍比稀释(A-H)。再于第1孔加入200TCID50/100微升病毒工作液，做系列倍比稀释。然后每孔加入50微升病毒稀释液。摇匀病毒-血清混合物，放37℃温箱作用2小时。加100微升细胞液(1.5×10⁴细胞/孔)于含有病毒-血清混合物以及倍比稀释病毒工作液的微量板中，37℃温箱孵育18-22小时。弃去细胞培养液，用PBS洗一次，加固定液固定10分钟。弃去固定液，让细胞培养板室温干燥。用PBS洗涤微量培养板3次，每孔加入100微升按1∶4000稀释的抗体1(抗流感病毒核蛋白-NP单克隆抗体)，室温作用1小时。PBS洗板4次以除去抗体1。加入1∶2000稀释后的100微升抗体2(HRP标记的羊抗鼠IgG)，室温作用1小时，用250微升洗涤液洗涤板6次以除去抗体2。每孔加底物100微升(10毫升磷苯二胺(OPD)+20毫升柠檬酸缓冲液+10微升30％双氧水，即用即配)。室温放10分钟显色后，每孔加1M硫酸100微升终止反应。在ELISA测定仪上(490纳米)读出每孔OD值。用下列公式判定中和反应结果：

(细胞阳性对照平均OD值-细胞阴性对照平均OD值)/2+细胞阴性对照平均OD值＝X

X＝细胞半数感染阈值，每孔OD值低于X值时，判定为中和反应阳性，中和反应阳性血清最高稀释度即为血清中和抗体滴度。

图10显示的免疫小鸡血清抗体的病毒微量中和反应结果表明，禽流感病毒样颗粒乳化油苗免疫的小鸡血清，其特异性抗体中和病毒的能力与商品化疫苗的能力在同一水品。换言之，禽流感病毒样颗粒疫苗可使家禽获得免疫性保护。

实施例9：免疫小鸭血清抗体效价HI滴度的测定。

小鸭免疫实验，是在浙江易邦生物技术有限公司的实验动物房进行。21天龄的小鸭分成两组，每组20只，饲养在家禽隔离器内。第一组注射油乳化的病毒样颗粒疫苗；第二组为空白对照，不注射疫苗。每只免疫小鸭皮下注射0.5ml疫苗，共免疫两次。于免疫后的第二周开始采集血清样品，直至第七周为止。免疫后的第四周进行了二免。血清抗体效价HI滴度的测定方法是：小鸭翅膀静脉采血1ml，置于事先预备好的小离心管中，待血凝后，离心收集上清液，4℃冰箱保存。按上面所述的HI滴度检测步骤，测得各小鸭血清中抗体效价，结果见图11。尽管用于检测的抗原病毒与病毒样颗粒的模板病毒属于不同的亚株，但病毒样颗粒疫苗诱导小鸭免疫系统产生的抗体，依然能有效地显示血凝抑制作用。

实施例10：免疫小猪血清抗体效价HI滴度的测定。

免疫小猪实验，在浙江易邦生物技术有限公司的实验动物房进行。6周龄的小猪共6只，5只用于注射病毒样颗粒乳化油苗，1只为空白对照，不注射疫苗。免疫前6只小猪血清抗体效价检测均为零。免疫后的第三周开始，每周一次采血取样，共采血样四次。用上面所述方法，检测免疫小猪血清抗体效价HI的滴度(图12)。结果表明，病毒样颗粒乳化油苗同样能诱导小猪免疫系统产生相应的抗体。

实施例11，免疫小鼠血清抗体效价HI滴度的测定。

年龄均为6周的90只雌性BALB/C小鼠被随机分为6组，每组15只。分组形式及疫苗的配制详见附表1.

附表1免疫疗法及疫苗的配制

分组	小鼠数量	给药方式	注射量	佐剂
					VLP(三种蛋白组成)	15	肌注	100ul	油乳化
VLP-M2eNP(四种蛋白组成)	15	肌注	100ul	油乳化
					VLP(三种蛋白组成)	15	滴鼻	100ul	--------
VLP-M2eNP(四种蛋白组成)	15	滴鼻	100ul	--------
					H5灭活油苗	15	肌注	100ul	油乳化
生理盐水	15	肌注/滴鼻	100ul	--------

4组肌注免疫的小鼠，在注射疫苗前须进行麻醉处理，具体操作如下：将5ml的Ketamine HCl(100mg/ml)加入1ml Xylazine(20mg/ml)，混匀后，每只实验小鼠注射0.03-0.04ml.

实验疫苗分油乳化苗及未乳化苗二种。乳化方法如前所述。油乳化苗进行肌注，未乳化苗进行滴鼻给药。另设二组对照组：一组为阳性对照，使用H5灭活油苗，进行肌注；另一组为阴性对照，只注射生理盐水。所有实验小鼠的给药方式为三次免疫。每次给药量为100μl，，再次给药间隔时间二周。每次给药免疫二周后采集血清样本，进行抗体效价HI滴度测定，结果见附表4。

实施例12：融合蛋白3xM2eNP的免疫抗原作用1：提高抗体IgG及其各亚型的分泌量。

将采集的上述实验小鼠血清样本进行抗体IgG及亚型的测定(见图13)。具体检测步骤是：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃包被过夜。次日洗涤3次。每孔加0.25ml封闭液，37℃封闭1小时。加稀释后的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中，37℃孵育1小时，洗涤。同时做空白、阴性及阳性孔对照。于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(HRP-羊抗鼠IgG，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)0.1ml，37℃孵育60分钟，洗涤。加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。加入2M硫酸0.05ml终止反应。在ELISA检测仪上，于450nm读取数值。

病毒样颗粒疫苗能有效地激发机体免疫系统产生抗体，从而起到保护作用。实验结果显示，融合蛋白3xM2eNP能进一步增强实验小鼠免疫抗体的生成。如图13B所示，用含有融合蛋白3xM2eNP的病毒样颗粒疫苗，滴鼻给药方式免疫小鼠。免疫攻毒后的鼻腔粘液中所含的IgG抗体，比无3xM2eNP融合蛋白的疫苗以同样给药方式及攻毒后产生的抗体，要明显高出近300％。用肌注给药方式免疫小鼠，虽然免疫攻毒前两种病毒样颗粒油乳苗刺激小鼠机体产生的IgG亚型抗体无明显差异，但攻毒后小鼠体内应答分泌的各种IgG亚型抗体，显现出较大变化。经3xM2eNP融合蛋白激活，机体产生出更多的各种IgG亚型抗体，尤其是IgG1，IgG2b和IgG3，以应对病毒的侵染(图13C，13D，13E，13F)。

与H5灭活油乳疫苗相比，两种病毒样颗粒油乳疫苗肌肉注射产生的抗体水平，无论是总体IgG、还是各IgG亚型水平，都有明显差别。病毒样颗粒油乳疫苗的免疫能力远远大于灭活的油苗。参见图13A，13C，13D，13E，13F。

实施例13：融合蛋白3xM2eNP的免疫抗原作用2：细胞因子r-干扰素分泌量的增加。

细胞因子γ-干扰素的检测：上述实验小鼠第三次免疫注射二周后，从每一实验组中随机挑取3只小鼠，及病毒攻毒后的第四天，再随机挑取3只小鼠，杀死后摘取其脾脏，取样测细胞因子γ-干扰素的合成分泌量。具体操作如下：摘取脾脏，小心用PBS冲洗干净，研磨成浆，用氯化铵(0.1M，PH7.4)溶液处理。除去红细胞后，用PBS反复洗几遍。加入小鼠淋巴细胞分离剂EZ-sep，离心30分钟(离心速度800g)。沉淀的细胞再次用无血清淋巴点样剂Lympho-spot悬浮，并染色(0.4％trypan blue，)后，计数测活细胞比率。用酶联免疫点样分析法检测分泌γ-干扰素的小鼠淋巴细胞数量。操作步骤简述如下：在预先包被了抗鼠源γ-干扰素的96孔板的每孔内加入200μl无血清淋巴点样剂及5×10⁵/孔免疫小鼠的悬浮脾细胞。在设置的样品孔内，加纯化的病毒样颗粒刺激免疫小鼠的脾细胞。在设置的对照孔内，或加入PMA(10ng/ml)和ionomycin(5000ng/ml)做为阳性对照，或加入PBS作为阴性对照。将此96孔板置于37C，5％CO2的细胞培养箱中培养20小时后，用0.05％PBS-Tween-20溶液完全清洗3次，加入生物素化的抗鼠源γ-干扰素抗体，放入37℃培养箱中，1.5小时后，重复上述洗净过程，然后加入碱性磷酸化酶偶联检测试剂，再入37C培养箱中1.5小时。反复洗涤3次后，加入BCIP/NBT底物，显微镜下观察显色反应，显色后及时终止反应，ELISPOT读板仪(Bioreader4000，Bio-Sys，德国)进行计数(图14)。

实施例14：融合蛋白3xM2eNP的免疫抗原作用3：免疫攻毒保护。

在第三次免疫后的第15天，对上述实验小鼠进行H5N1攻毒，其用量为每只实验小鼠滴鼻100μl含1×10⁶pfu病毒的PBS。记录病毒侵染后所有实验小鼠的发病症状，包括体重的减轻、竖毛、不活动、体温升高、打喷嚏、流鼻涕和腹泻等。实验结果表明，无论是用未乳化的病毒样颗粒疫苗滴鼻免疫，还是用油乳化的病毒样颗粒疫苗肌注免疫，都能100％的保护小鼠免于病毒的侵染和致病。其中带有3xM2eNP融合蛋白的病毒样颗粒疫苗，滴鼻免疫和肌注免疫都更高一筹，即免疫攻毒后的小鼠，无任何行动异常，也无体重减轻等征兆；而灭活病毒油乳苗只具90％的保护率；生理盐水对照组小鼠的死亡率更高达50％.详细数据见下面附表2所示。

附表2.实验小鼠的病理及病毒学分析

A、活动性：0＝活动无异常；1＝行为反常，耸背，竖毛；2＝严重耸背，竖毛，根本不活动(对刺激无反应).

B、呼吸困难程度：0＝呼吸正常；1＝呼吸急促，气喘吁吁

C、攻毒后第九天小鼠体重的百分率。

D、攻毒后第八天小鼠存活百分率。

附表3、油乳化佐剂对禽类疫苗作用的影响

附表4：免疫小鼠血清抗体效价HI滴度的测定(用2ⁿ表示)

组别	成分	样本数	第一次免疫后14天(平均值)	第二次免疫后14天(平均值)	第三次免疫后14天(平均值)
						1	VLP(三种蛋白组成)	15	2	4	6.5

2	VLP-M2eNP(四种蛋白组成)	15	3	4.75	7.25
						3	H5灭活油苗	15	2	4.75	6.0
4	阴性对照，PBS免疫	15	0	0	0

附表5：合成各基因的引物

M1_BamHI_5	GGGGGATCCATGAGTCTTCTAACCGAGGTC
		M1_NotI_3	CCCGCGGCCGCAGTAGAAACAAGGTAGTTT
HA_BamHI_5	GGGGGATCCATGGAGAAAATAGTGCTTCTTC
		HA_NotI_3	GGGGCGGCCGCTTAAGTGCAAATTCTGCATTG
NA_SmaI_5	GGGCCCGGGATGAATCCAAATCAGAAGATAA
		NA_NheI_3	GGGGCTAGCCTACTTGTCAATGGTGAATGG
NP_BamHI_5	AAAAGGATCCCCACCATGGCGTCTCAAGGCACCAAACG
		NP_NotI_3	AAAAGCGGCCGCCTTTAATTGTCATATTCCTCTG
M2e_BamHI_5	GGATCCCCACCATGTCGTTGTTGA
		M2e_Nco_3	CCATGGGGTCCGACGAGTCCCCC

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与本发明有关的基因序列表

<110>诺华生物科技(武汉)有限责任公司

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<130>1234

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1007

<212>DNA

<213>甲型流感病毒

<400>1

ccaccatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct ctctatcatc ccgtcaggcc 60

ccctcaaagc cgagatcgcg cagaaacttg aagatgtctt tgcaggaaag aacaccgatc 120

tcgaggctct catggagtgg ctgaagacaa gaccaatcct gtcacctctg actaaaggga 180

ttttgggatt tgtattcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg aggactgcag cgtagacgct 240

ttgtccagaa tgccctaaat ggaaatggag atccaaataa tatggatagg gcagttaagc 300

tatataagaa gctgaaaaga gaaataacat tccatggggc taaagaggtt tcactcagct 360

actcaaccgg tgcacttgcc agttgcatgg gtctcatata caacaggatg ggaacggtga 420

ctacggaagt ggcttttggc ctagtgtgtg ccacttgtga gcagattgca gattcacagc 480

atcggtctca caggcagatg gcaactatca ccaacccact aatcaggcat gaaaacagaa 540

tggtgctggc cagcactaca gctaaggcta tggagcagat ggcgggatca agtgagcagg 600

cagcggaagc catggaggtc gctaatcagg ctaggcagat ggtgcaggca atgaggacaa 660

ttggaactca tcctaactct agtgctggtc tgagagataa tcttcttgaa aatttgcagg 720

cctaccagaa acgaatggga gtgcagatgc agcgattcaa gtgatcctct tgttgttgcc 780

gcaagtatca ttgggatctt gcacttgata ttgtggattc ttgatcgtct tttcttcaaa 840

tgcatttatc gtcgccttaa atacggtttg aaaagagggc cttctaagac aggggtacct 900

gagtctatga gggaagagta ccggcaggaa cagcagagtg ctgtggatgt tgacgatggt 960

cattttgtca acatagaatt ggagtaaaaa actaccttgt ttctact 1007

<210>2

<211>252

<212>PRT

<213>甲型流感病毒

<400>2

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro

1 5 10 15

Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Lys Leu Glu Asp Val Phe

20 25 30

Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr

35 40 45

Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe

50 55 60

Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val

65 70 75 80

Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala

85 90 95

Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala

100 105 110

Lys Glu Val Ser Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met

115 120 125

Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Val Ala Phe

130 135 140

Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg

145 150 155 160

Ser His Arg Gln Met Ala Thr Ile Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu

165 170 175

Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met

180 185 190

Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Asn Gln

195 200 205

Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Asn

210 215 220

Ser Ser Ala Gly Leu Arg Asp Asn Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr

225 230 235 240

Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys

245 250

<210>3

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<212>DNA

<213>甲型流感病毒

<400>3

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tttgcattgg ttaccatgca aacaactcga cagagcaggt tgacacaata atggaaaaga 120

acgttactgt tacacatgct caagacatac tggaaaagac acacaacggg aagctctgcg 180

atctagatgg agtgaaacct ctaattttga gagattgtag tgtagctgga tggctcctcg 240

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ccaacccagc caatgacctc tgttacccag gggatttcaa cgactatgaa gaactgaaac 360

acctattgag cagaataaac cattttgaga aaattcagat catccccaaa agttcttggt 420

ccaatcatga agcctcatca ggggtgagct cagcatgtcc ataccaggga aagtcctcct 480

ttttcagaaa tgtggtatgg cttattaaga agaacagtac atacccaaca ataaagagga 540

gctacaataa taccaaccaa gaagatcttt tggtactgtg ggggattcac catcctaatg 600

atgcggcaga gcagacaaag ctctatcaaa acccaaccac ctatatttcc gttggaacat 660

caacactaaa ccagagattg gtaccaaaaa tagctactag atccaaagta aacgggcaaa 720

gtggaaggat ggagttcttc tggacaattt taaaaccgaa tgatgcaatc aacttcgaga 780

gcaatggaaa tttcattgct ccagaatatg catacaaaat tgtcaagaaa ggggactcag 840

caattatgaa aagtgaattg gaatatggta actgcaacac caagtgttac actccaatgg 900

gggcgataaa ctctagtatg ccattccaca atatacaccc tctcaccatc ggggaatgcc 960

ccaaatatgt gaaatcaaac agattagtcc ttgcgactgg gctcagaaat agccctcaaa 1020

gagagagaag aaaaaagaga ggactatttg gagctatagc aggtttcata gagggaggat 1080

ggcagggaat ggtagatggt tggtatgggt accatcatag caatgagcag gggagtgggt 1140

acgctgcaga caaagaatcc actcaaaagg caatagatgg agtcaccaat aaggtcaact 1200

cgatcattga caaaatgaac actcagtttg aagccgttgg aagggaattt aataacttag 1260

aaaggagaat agagaattta aacaagaaga tggaagacgg attcctagat gtctggactt 1320

ataatgctga acttctggtt ctcatggaaa atgagagaac tctagacttt catgactcaa 1380

atgtcaagaa cctttacgac aaggtccgac tacagcttag ggataatgca aaagagctgg 1440

gtaacggttg tttcgagttc tatcacaaat gtgataatga atgtatggaa agtgtaagaa 1500

acggaacata tgactacccg cagtattcag aagaagcaag actaaaaaga gaggaaataa 1560

gtggagtaaa attggagtca atgggaactt accaaatact gtcaatttat tcaacagtgg 1620

cgagttccct agcactggca atcatggtag ctggtctatc tttatggatg tgctccaatg 1680

gatcgttaca atgcagaatt tgcacttaa 1709

<210>4

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<212>PRT

<213>甲型流感病毒

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Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Asn Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asn His Glu Ala Ser

130 135 140

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe

145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

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210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

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Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

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Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly

275 280 285

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Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

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Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

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Pro Gln Arg Glu Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

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Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly

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Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu

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Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile

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Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly

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Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser

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Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg

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Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr

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Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu

530 535 540

Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser

545 550 555 560

Leu Gln Cys Arg Ile Cys Thr

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ccaccatgaa tccaaatcag aagataataa ccatcggatc aatctgtatg gtaattggaa 60

tagttagctt aatgttacaa attgggaaca tgatctcaat atgggtcagt cattcaattc 120

agacagggaa tcaacaccaa gctgaaccaa tcagcaatac taattttctt actgagaaag 180

ctgtggcttc agtaacatta gcgggcaact catctctttg ccccattagc ggatgggctg 240

tacacagtaa ggacaacagt ataaggatcg gttccaaggg ggatgtgttt gttgtaagag 300

agccgttcat ctcatgctcc cacttggaat gcagaacttt ctttttgact cagggagcct 360

tgttgaatga caagcactcc aatgggaccg tcaaagacag aagccctcac agaacattaa 420

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acaatggggc tgtggctgta ttgaaataca atggcataat aacagacact attaagagct 600

ggaggaacaa catactgaga actcaagagt ctgaatgtgc atgtgtaaat ggctcttgct 660

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aaaaagggaa agtggttaaa tcagtcgaat tggatgctcc taattatcac tatgaggagt 780

gctcctgtta tcctgatgcc ggcgaaatca catgtgtgtg cagggataat tggcatggct 840

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gtggagtttt cggagacaat ccacgcccca atgatggaac tggtagttgt ggtccggtgt 960

cccctaacgg ggcatatggg gtaaaagggt tttcatttaa atacggcaat ggtgtttgga 1020

tcgggagaac caaaagcact aattccagga gcggctttga aatgatttgg gatccaaatg 1080

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<213>甲型流感病毒

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Trp Val Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Asn Gln His Gln Ala Glu Pro

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Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Ser Gly Trp Ala Val His

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Val Lys Asp Arg Ser Pro His Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Val Gly

130 135 140

Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser

145 150 155 160

Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Thr Ser Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser

165 170 175

Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile

180 185 190

Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu

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Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Val Met Thr Asp

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Gly Pro Ser Asn Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Lys Met Glu Lys

225 230 235 240

Gly Lys Val Val Lys Ser Val Glu Leu Asp Ala Pro Asn Tyr His Tyr

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340 345 350

Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Ser Ser Phe Ser

355 360 365

Val Lys Gln Asp Ile Val Ala Ile Thr Asp Trp Ser Gly Tyr Ser Gly

370 375 380

Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro

385 390 395 400

Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser Thr Ile

405 410 415

Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr

420 425 430

Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp

435 440 445

Lys

<210>7

<211>1512

<212>DNA

<213>甲型流感病毒

<400>7

ccaccatggc gtctcaaggc accaaacgat cttatgaaca gatggaaact ggtggagaac 60

gccagaatgc tactgagatc agggcatctg ttggaagaat ggttagtggc attgggaggt 120

tctacataca gatgtgcaca gaactcaaac tcagtgacta tgaagggagg ctgatccaga 180

acagcataac aatagagaga atggtactct ctgcatttga tgaaagaagg aacagatacc 240

tggaagaaca ccccagtgcg gggaaggacc cgaagaaaac tggaggtcca atttatcgga 300

ggagagacgg gaaatgggtg agagagctga ttctgtacga caaagaggag atcaggagga 360

tttggcgtca agcgaacaat ggagaggacg caactgctgg tcttacccac atgatgatat 420

ggcattccaa tctaaatgat gccacatatc agagaacaag agctctcgtg cgtactggaa 480

tggaccccag gatgtgctct ctgatgcaag ggtcaactct cccgaggaga tctggagctg 540

ccggtgcagc agtaaaaggg gtagggacaa tggtgatgga gctgattcgg atgataaaac 600

gagggatcaa cgaccggaat ttctggagag gcgaaaatgg aagaagaaca aggactgcat 660

atgagagaat gtgcaacatc ctcaaaggga aattccaaac agcagcacaa agagcaatga 720

tggatcaagt gcgagagagc agaaatcctg ggaatgctga aattgaagat ctcatttttc 780

tggcacggtc tgcactcatc ctgagaggat cagtggccca taagtcctgc ttgcctgctt 840

gtgtgtacgg acttgcagtg gccagtgggt atgactttga gagagaaggg tactctctgg 900

ttggaataga tcctttccgt ctgcttcaaa acagccaggt ctttagtctc attagaccaa 960

atgagaatcc agcacataag agtcaattag tgtggatggc atgccactct gcagcatttg 1020

aggaccttag agtctcaagt ttcatcagag ggacaagagt ggtcccaaga ggacagctat 1080

ccaccagagg ggttcaaatt gcttcaaatg agaacatgga agcaatggac tccaacactc 1140

ttgaactgag aagtagatat tgggctataa gaaccagaag cggaggaaac accaaccagc 1200

agagggcatc tgcaggacag atcagcgttc agcccacttt ctcggtacag agaaaccttc 1260

ccttcgaaag aacgaccatt atggcagcat ttacaggaaa tactgagggc agaacgtctg 1320

acatgaggac tgaaatcata agaatgatgg aaagtgccaa accagaagat gtgtcattcc 1380

aggggcgggg agtcttcgag ctctcggacg aaaaggcaac gaacccgatc gtgccttcct 1440

ttgacatgag taatgaagga tcttatttct tcggagacaa tgcagaggaa tatgacaatt 1500

aaaggcggcc gc 1512

<210>8

<211>498

<212>PRT

<213>甲型流感病毒

<400>8

Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly

1 5 10 15

Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met

20 25 30

Val Ser Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys

35 40 45

Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu

50 55 60

Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Arg Tyr Leu Glu

65 70 75 80

Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile

85 90 95

Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Val Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp

100 105 110

Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp

115 120 125

Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn

130 135 140

Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp

145 150 155 160

Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser

165 170 175

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu

180 185 190

Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg

195 200 205

Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Thr Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn

210 215 220

Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp

225 230 235 240

Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu

245 250 255

Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His

260 265 270

Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly

275 280 285

Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe

290 295 300

Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Phe Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu

305 310 315 320

Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala

325 330 335

Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Thr Arg Val

340 345 350

Val Pro Arg Gly Gln Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn

355 360 365

Glu Asn Met Glu Ala Met Asp Ser Asn Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg

370 375 380

Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg

385 390 395 400

Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg

405 410 415

Asn Leu Pro Phe Glu Arg Thr Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn

420 425 430

Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met

435 440 445

Glu Ser Ala Lys Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe

450 455 460

Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp

465 470 475 480

Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr

485 490 495

Asp Asn

<210>9

<211>69

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>人工合成的片段：M2e

<400>9

tcgttgttga cggaagtgga aacgccgacg agaaacgaat gggaatgtag atgttcggac 60

tcgtcgg ac 69

<210>10

<211>23

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>人工合成的片段：M2e

<400>10

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu

1 5 10 15

Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp

20

<210>11

<211>1715

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>融合蛋白

<400>11

ccaccatgtc gttgttgacg gaagtggaaa cgccgacgag aaacgaatgg gaatgtagat 60

gttcggactc gtcggactcg ttgttgacgg aagtggaaac gccgacgaga aacgaatggg 120

aatgtagatg ttcggactcg tcggactcgt tgttgacgga agtggaaacg ccgacgagaa 180

acgaatggga atgtagatgt tcggactcgt cggaccccat ggcgtctcaa ggcaccaaac 240

gatcttatga acagatggaa actggtggag aacgccagaa tgctactgag atcagggcat 300

ctgttggaag aatggttagt ggcattggga ggttctacat acagatgtgc acagaactca 360

aactcagtga ctatgaaggg aggctgatcc agaacagcat aacaatagag agaatggtac 420

tctctgcatt tgatgaaaga aggaacagat acctggaaga acaccccagt gcggggaagg 480

acccgaagaa aactggaggt ccaatttatc ggaggagaga cgggaaatgg gtgagagagc 540

tgattctgta cgacaaagag gagataagga ggatttggcg tcaagcgaac aatggagagg 600

acgcaactgc tggtcttacc cacatgatga tatggcattc caatctaaat gatgccacat 660

atcagagaac aagagctctc gtgcgtactg gaatggaccc caggatgtgc tctctgatgc 720

aagggtcaac tctcccgagg agatctggag ctgccggtgc agcagtaaaa ggggtaggga 780

caatggtgat ggagctgatc cggatgataa aacgagggat caacgaccgg aatttctgga 840

gaggcgaaaa tggaagaaga acaaggactg catatgagag aatgtgcaac atcctcaaag 900

ggaaattcca aacagcagca caaagagcaa tgatggatca agtgcgagag agcagaaatc 960

ctgggaatgc tgaaattgaa gatctcattt ttctggcacg gtctgcactc atcctgagag 1020

gatcagtggc ccataagtcc tgcttgcctg cttgtgtgta cggacttgca gtggccagtg 1080

ggtatgactt tgagagagaa gggtactctc tggttggaat agatcctttc cgtctgcttc 1140

aaaacagcca ggtctttagt ctcattagac caaatgagaa tccagcacat aagagtcaat 1200

tagtgtggat ggcatgccac tctgcagcat ttgaggacct tagagtctca agtttcatca 1260

gagggacaag agtggtccca agaggacagc tatccaccag aggggttcaa attgcttcaa 1320

atgagaacat ggaagcaatg gactccaaca ctcttgaact gagaagtaga tattgggcta 1380

taagaaccag aagcggagga aacaccaacc agcagagggc atctgcagga cagatcagcg 1440

ttcagcccac tttctcggta cagagaaacc ttcccttcga aagaacgacc attatggcag 1500

catttacagg aaatactgag ggcagaacgt ctgacatgag gactgaaatc ataagcaatga 1560

tggaaagtgc caaaccagaa gatgtgtcat tccaggggcg gggagtcttc gagctctcgg 1620

acgaaaaggc aacgaacccg atcgtgcctt cctttgacat gagtaatgaa ggatcttatt 1680

tcttcggaga caatgcagag gaatatgaca attaa 1715

<210>12

<211>569

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>融合蛋白

<400>12

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu

1 5 10 15

Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr

20 25 30

Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp Ser

35 40 45

Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Cys Arg

50 55 60

Cys Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser

65 70 75 80

Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile

85 90 95

Arg Ala Ser Val Gly Arg Met Val Ser Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile

100 105 110

Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile

115 120 125

Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu

130 135 140

Arg Arg Asn Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro

145 150 155 160

Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Val

165 170 175

Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg

180 185 190

Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met

195 200 205

Ile Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala

210 215 220

Leu Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly

225 230 235 240

Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly

245 250 255

Val Gly Thr Met Val Met Glu Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile

260 265 270

Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Thr

275 280 285

Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala

290 295 300

Ala Gln Arg Ala Met Met Asp Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly

305 310 315 320

Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile

325 330 335

Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr

340 345 350

Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser

355 360 365

Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Phe

370 375 380

Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val

385 390 395 400

Trp Met Ala Cys His Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser

405 410 415

Phe Ile Arg Gly Thr Arg Val Val Pro Arg Gly Gln Leu Ser Thr Arg

420 425 430

Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Ala Met Asp Ser Asn

435 440 445

Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly

450 455 460

Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln

465 470 475 480

Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg Asn Leu Pro Phe Glu Arg Thr Thr Ile

485 490 495

Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg

500 505 510

Thr Glu Ile Ile Arg Met Met Glu Ser Ala Lys Pro Glu Asp Val Ser

515 520 525

Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn

530 535 540

Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe

545 550 555 560

Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr Asp Asn

565

Claims

1.含有甲型流感病毒基质蛋白M1、表面膜蛋白HA、NA、及M2eNP融合蛋白的重组病毒样颗粒，且该重组病毒样颗粒是非复制型的；其中：所述M2eNP融合蛋白为基质蛋白M2胞膜外端的一个M2e多肽或多个M2e多肽构成的多聚体，或经人工修饰后的一个M2e多肽或修饰后的多个M2e多肽构成的多聚体与核蛋白NP融合而成；所述核蛋白NP经重组表达后与重组基质蛋白M1偶联，增加了病毒样颗粒的生成，且包埋于所述重组病毒样颗粒内。

2.根据权利要求1所述的重组病毒样颗粒，其特征是其中的蛋白M1、HA、NA和NP来自H5N1亚型株或其它甲型流感病毒株。

3.根据权利要求1所述的重组病毒样颗粒，其特征是所述M2e多肽的DNA序列是SEQ ID №：9。

4.根据权利要求1或2所述的重组病毒样颗粒，其特征是所述基质蛋白M1、表面膜蛋白HA、NA，及3xM2eNP融合蛋白，或它们的突变体的基因转录盒，分别自上游至下游依次带有如下组份：昆虫杆状病毒启动子PH和/或P10、Kozak碱基序列(CCACC)、上述蛋白的基因序列、SV40多聚腺嘌呤序列；此基因转录盒整合到含有昆虫杆状病毒基因组的质粒bacmid内，此bacmid质粒经转入到Sf-9昆虫细胞内后，自动生成带有此基因转录盒的重组昆虫杆状病毒，用于转染昆虫细胞Sf-21，以合成重组病毒样颗粒。

5.根据权利要求1所述的重组病毒样颗粒，其特征是存在于权利要求4所述的重组昆虫杆状病毒转染的昆虫细胞培养上清液中，此细胞培养上清液不需纯化使用。

6.一种用于预防动物甲型流感疫病的重组甲型流感病毒样颗粒疫苗，其特征是：它包含了权利要求1所述的重组病毒样颗粒或权利要求5所述的细胞培养上清液。

7.根据权利要求6所述的预防动物甲型流感疫病的重组病毒样颗粒疫苗，其特征是：还包含佐剂。

8.根据权利要求7所述的重组病毒样颗粒疫苗，其特征是：疫苗为肌肉注射剂型时，佐剂是由医用白油，吐温和司本按40∶1∶2.4的比例或修改的比例组成的复合溶剂。

9.权利要求6、7或8中之一用于预防动物甲型流感疫病的重组病毒样颗粒疫苗，其特征是为预防禽流感疫病的重组禽流感病毒样颗粒疫苗。