CN104093422B - 基于副流感病毒5的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供基于病毒表达载体的安全、稳定、有效、以及有成本效益的疫苗，这些病毒表达载体包含一种副流感病毒5(PIV5)基因组，该基因组包含表达一种异源多肽的一种异源核苷酸序列。在一些实施例中，与该PIV5基因组的血凝素‑神经氨酸酶(HN)基因与大RNA聚合酶蛋白(L)基因之间相比，该异源核苷酸序列更靠近该PIV5基因组的前导序列插入。在一些实施例中，该异源核苷酸序列插入在该PIV5基因组的小疏水蛋白(SH)基因与血凝素‑神经氨酸酶(HN)基因之间。

Description

基于副流感病毒5的疫苗
继续申请数据
本申请要求2012年1月24日提交的美国临时申请序号61/590,070、2012年1月24日提交的美国临时申请序号61/590,056、以及2012年8月16日提交的61/683,810的权益，这些申请各自通过引用以其全部内容结合在此。
政府资助
本发明是根据由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批准号R01AI070847和R56AI081816在政府支持下进行。政府在本发明中享有某些权利。
背景
灭活的流感疫苗自20世纪40年代以来已经可获得，并且针对匹配的流感病毒毒株是60％至80％有效的，但针对抗原漂移变体是不太有效的并且针对不同的亚型是无效的。因此，需要每年疫苗接种以预防来自新的毒株或亚型的感染。当前的季节性流感疫苗由两种甲型流感病毒(H1N1和H3N2)和一种或两种乙型流感病毒组成。此外，疫苗接种覆盖率和生产仍然是世界范围内的问题。当前许可的流感病毒疫苗是在鸡蛋中生产，从而要求数百万个蛋的可获得性和疫苗株的鉴别与疫苗的可用性之间的大量的时间。另外，这种疫苗接种策略不提供针对出人意料的毒株、爆发或大流行病的保护。需要新的疫苗接种策略以用于预防和控制流感病毒感染。
发明概述
本发明包括一种病毒表达载体，该病毒表达载体包含一种副流感病毒5(PIV5)基因组，该基因组包含表达一种异源多肽的一个异源核苷酸序列，其中该异源核苷酸序列不是插入在该PIV5基因组的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因与大RNA聚合酶蛋白(L)基因之间。
在一些实施例中，与该PIV5基因组的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因与大RNA聚合酶蛋白(L)基因之间相比，该异源核苷酸序列更靠近该PIV5基因组的前导序列插入。
在一些实施例中，该异源核苷酸序列插入在该PIV5基因组的小疏水蛋白(SH)基因与血凝素-神经氨酸酶(HN)基因之间。
在一些实施例中，该异源核苷酸序列插入在该PIV5基因组的F基因与SH基因之间。
在一些实施例中，该异源核苷酸序列插入在该PIV5基因组的VP基因与基质蛋白(M)基因之间。
在一些实施例中，该异源核苷酸序列插入在该PIV5基因组的M基因与F基因之间。
在一些实施例中，该异源核苷酸序列插入在该PIV5基因组的核壳蛋白(NP)基因与V/P基因之间。
在一些实施例中，该异源核苷酸序列插入在该PIV5基因组的前导序列与核壳蛋白(NP)基因之间。
在一些实施例中，PIV5的一部分F或HN基因已经被该异源核苷酸序列替代。
在一些实施例中，该异源核苷酸序列替代该SH基因核苷酸序列。
在一些实施例中，该异源核苷酸序列插入该SH基因核苷酸序列内、该NP基因核苷酸序列内、该V/P基因核苷酸序列内、该M基因核苷酸序列内、该F基因核苷酸序列内、该HN基因核苷酸序列内、和/或该L基因核苷酸序列内。
在一些实施例中，该PIV5基因组进一步包含一个或多个突变。在一些实施例中，突变包括V/P基因的突变、V蛋白和P蛋白的共享N-末端的突变、V蛋白和P蛋白的共享N-末端的残基26、32、33、50、102、和/或157的突变、缺乏V蛋白的C-末端的突变、缺乏小疏水(SH)蛋白的突变、融合(F)蛋白的突变、磷蛋白(P)的突变、大RNA聚合酶(L)蛋白的突变、并入来自犬副流感病毒的残基的突变、诱导细胞凋亡的突变、或其组合。在一些实施例中，突变包括PIV5VΔC、PIV5ΔSH、PIV5-P-S308G、或其组合。在一些实施例中，该PIV5基因组进一步包含一个或多个突变。
在一些实施例中，该异源多肽是源自人免疫缺陷病毒(HIV)、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、副流感病毒4、人呼吸道合胞病毒、牛呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、禽流感、犬流感、禽偏肺病毒、尼帕(Nipah)病毒、亨德拉(Hendra)病毒、狂犬病病毒、埃博拉(Ebola)病毒、猪环状病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒、新城疫病毒(NewCastle disease virus)、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、犬瘟热病毒(distemper virus)、猫白血病病毒、人杯状病毒、兽医杯状病毒、人诺如病毒、兽医诺如病毒、牛瘟病毒、结核分枝杆菌、和/或人或动物中的一种新兴流感病毒。在一些实施例中，该异源多肽是源自一种细菌或一种寄生虫。
本发明包括一种病毒表达载体，该病毒表达载体包含一种副流感病毒5(PIV5)基因组，该基因组包含表达一种异源多肽的一个异源核苷酸序列，其中该异源核苷酸序列插入在该PIV5基因组的血凝素-神经氨酸酶(HN)与大RNA聚合酶蛋白(L)基因之间，并且其中该PIV5基因组进一步包含一个或多个突变。在一些实施例中，突变包括V/P基因的突变、V蛋白和P蛋白的共享N-末端的突变、V蛋白和P蛋白的共享N-末端的残基26、32、33、50、102、和/或157的突变、缺乏V蛋白的C-末端的突变、缺乏小疏水(SH)蛋白的突变、融合(F)蛋白的突变、磷蛋白(P)的突变、大RNA聚合酶(L)蛋白的突变、并入来自犬副流感病毒的残基的突变、诱导细胞凋亡的突变、或其组合。在一些实施例中，该突变包括PIV5VΔC、PIV5ΔSH、PIV5-P-S308G、或其组合。
在一些实施例中，该异源多肽是源自人免疫缺陷病毒(HIV)、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、副流感病毒4、人呼吸道合胞病毒、牛呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、禽流感、犬流感、禽偏肺病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、猪环状病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒、新城疫病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、犬瘟热病毒、猫白血病病毒、人杯状病毒、兽医杯状病毒、人诺如病毒、兽医诺如病毒、牛瘟病毒、结核分枝杆菌、和/或人或动物中的一种新兴流感病毒。在一些实施例中，该异源多肽是源自一种细菌或一种寄生虫。
本发明包括一种病毒表达载体，该病毒表达载体包含一种副流感病毒5(PIV5)基因组，该基因组包含表达一种异源多肽的一个异源核苷酸序列，其中该异源多肽包含一种流感核壳蛋白(NP)。在一些实施例中，该异源核苷酸序列插入在该PIV5基因组的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因与大RNA聚合酶蛋白(L)基因之间。在一些实施例中，与该PIV5基因组的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因与大RNA聚合酶蛋白(L)基因之间相比，该异源核苷酸序列更靠近该PIV5基因组的前导序列插入；插入该PIV5基因组的核壳蛋白(NP)基因的上游；紧接该PIV5基因组的前导序列的下游插入；插入在该PIV5基因组的小疏水蛋白(SH)基因与血凝素-神经氨酸酶(HN)基因之间；插入在该PIV5基因组的F基因与SH基因之间；插入在该PIV5基因组的VP基因与基质蛋白(M)基因之间；插入在该PIV5基因组的M基因与F基因之间；插入在该PIV5基因组的核壳蛋白(NP)基因与V/P基因之间；插入在该PIV5基因组的前导序列与核壳蛋白(NP)基因之间；其中PIV5的一部分F或HN基因已经被该异源核苷酸序列替代；替代该SH基因核苷酸序列；插入该SH基因核苷酸序列内、该NP基因核苷酸序列内、该V/P基因核苷酸序列内、该M基因核苷酸序列内、该F基因核苷酸序列内、该HN基因核苷酸序列内、和/或该L基因核苷酸序列内。在一些实施例中，该PIV5基因组进一步包含一个或多个突变。在一些实施例中，突变包括V/P基因的突变、V蛋白和P蛋白的共享N-末端的突变、V蛋白和P蛋白的共享N-末端的残基26、32、33、50、102、和/或157的突变、缺乏V蛋白的C-末端的突变、缺乏小疏水(SH)蛋白的突变、融合(F)蛋白的突变、磷蛋白(P)的突变、大RNA聚合酶(L)蛋白的突变、并入来自犬副流感病毒的残基的突变、诱导细胞凋亡的突变、或其组合。在一些实施例中，突变包括PIV5VΔC、PIV5ΔSH、PIV5-P-S308G、或其组合。
在在此所描述的一种病毒表达载体的一些实施例中，该异源多肽包含一种流感血凝素(HA)、一种流感神经氨酸酶(NA)、一种流感核壳蛋白(NP)、M1、M2、PA、PB1、PB2、PB1-F2、NS1或NS2。在一些实施例中，其中流感包括甲型流感、乙型流感、或丙型流感病毒。
在一些实施例中，其中该异源多肽包含来自甲型流感病毒株亚型H1至H18的一种血凝素(HA)。在一些实施例中，该异源多肽包含来自甲型流感病毒株H5N1、H3N2、或H1N1的一种血凝素(HA)。在一些实施例中，该异源多肽包含来自甲型流感病毒亚型N1至N10的一种流感神经氨酸酶(NA)。在一些实施例中，NP、M1、M2、PA、PB1、PB2、PB1-F2、NS1或NS2是来自甲型流感病毒株H1至H17，并且NA是来自甲型流感病毒株N1至N10。
本发明包括一种如在此所描述的病毒表达载体，该病毒表达载体具有表达一种异源多肽的两个或更多个异源核苷酸序列。
本发明包括一种病毒颗粒，该病毒颗粒包含如在此所描述的一种病毒表达载体。
本发明包括一种如在此所描述的病毒表达载体或病毒颗粒的组合物。
本发明包括一种在细胞中表达一种异源多肽的方法，该方法包括使该细胞接触或感染如在此所描述的一种病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物。
本发明包括一种在受试者中诱导针对一种异源多肽的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者给予如在此所描述的一种病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物。在一些实施例中，免疫应答包括一种体液免疫应答和/或一种细胞免疫应答。
本发明包括一种在受试者中表达一种异源多肽的方法，该方法包括向受试者给予如在此所描述的一种病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物。
本发明包括一种对受试者进行疫苗接种的方法，该方法包括向受试者给予如在此所描述的一种病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物。
在在此所描述的这些方法的一些实施例中，病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物是鼻内、肌内、局部、口服、或卵内给予。
术语“和/或”意指所列举的要素的一个或所有或所列举的要素的任何两个或更多个的组合。
词语“优选的”和“优选地”是指本发明的在某些情况下可以提供某些益处的实施例。然而，在相同或其他情况下，其他实施例也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施例的叙述不意味着其他实施例不是有用的，并且不旨在将其他实施例排除在本发明的范围之外。
术语“包含”及其变化形式在这些术语出现在说明书和权利要求书中时不具有限制意义。
除非另外说明，“一个(a)”、“一个(an)”、“该”、以及“至少一个”可互换使用，并且意指一个或多于一个。
而且在此，通过端点叙述的数值范围包括该范围内所包括的所有数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
对于在此所披露的包括不连续的步骤的任何方法来说，可以按任何可行的顺序来进行这些步骤。并且，在适当时，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。
除非另外指明，本说明书和权利要求书中使用的表达组分的量、分子量等等的所有数值应被理解为在所有情况中被术语“约”修饰。因此，除非另外相反地指明，在本说明书和权利要求书中列出的数值参数是近似值，这些近似值可以取决于本发明所寻求获得的所希望的特性而不同。至少，并且不是试图限制权利要求的范围的等效物的原则，每个数值参数至少应根据所报道的有效位的数值并且通过应用一般舍入方法被解释。
虽然列出本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实例中列出的数值是尽可能精确报道的。然而，所有数值固有地包含必然由其对应的测试测量中所发现的标准偏差所产生的范围。
本发明的以上概述不旨在说明本发明的每个披露的实施例或每个实现方式。下面的说明更具体地举例说明示意性实施例。在本申请全文的几处，通过实例的列举提供了指导，这些实例可以以不同组合使用。在每个例子中，所叙述的列表仅作为代表性组并且不应被解释为排他性列表。
在全文中，所有标题都是为了方便读者，并且不应用来限制标题后正文的含义，除非这样说明。
附图简要说明
图1示出PIV5基因组结构。PIV5基因组包含七个已知的转录单元并且转录八种已知的病毒mRNA。V mRNA和P mRNA均通过被称为假模板化(pseudo-templated)转录的一种RNA编辑方法来源于同一V/P基因。V mRNA是从V/P基因忠实转录的，而P mRNA源于在V mRNA转录过程中由于RNA聚合酶口吃(stuttering)所致的两个非模板化G残基在特定位点处的插入。前导序列和尾随序列对于病毒RNA合成和转录起始来说是重要的。对于负链RNA病毒来说，转录仅在前导序列处起始，并且最靠近前导序列的基因转录最多。
图2A至图2D示出PIV5-H5保护免受致死H5N1激发。图2A是ZL48的示意图，ZL48具有插入在HN与L之间的H5(还被称为PIV5-H5HL)。图2B示出在H5N1激发后的重量损失。将小鼠(n＝10/组)用106 pfu的PIV5、ZL48、ZL46、以及灭活的流感A/VN/03/04株(HPAI H5N1)进行接种。ZL46具有在SH与HN基因之间的H5插入。在接种后21天时，用致死剂量的H5N1感染小鼠。记录小鼠的重量并且呈现重量损失。图2C示出存活率。图2D示出激发后肺中的病毒滴度。在用H5N1激发后四天时，收集感染的小鼠的肺并且测定这些肺中的H5N1的滴度。
图3A至图3C示出PIV5-N1(H5N1)保护免受致死H5N1激发。图3A示出表达H5N1或H1N1的NA的PIV5的示意图。图3B示出在H5N1激发后的重量损失。将小鼠(n＝10/组)用106pfu的PIV5、rPIV5-N1(H5N1)、rPIV5-N1(H1N1)、以及表达H5N1的HA和NA的重组流感病毒(rgA/VN-PR8)进行接种。在接种后21天时，用致死剂量的H5N1感染小鼠。记录小鼠的重量并且呈现重量损失。图3C示出存活率。
图4A至图4C示出PIV5-NP(H5N1)保护免受致死流感病毒激发。图4A示出表达H5N1的NP的PIV5的示意图。PIV5-NP-P-S308G具有在P蛋白的残基S308处的突变。PIV5ΔSH-NP具有SH蛋白的缺失。图4B示出在致死H1N1激发后的重量损失。将小鼠(n＝10/组)用105 pfu的PIV5、rPIV5-NP(H5N1)、或流感病毒X31株进行接种。在接种后21天时，用致死剂量的H1N1(100 TCID50)感染小鼠。记录小鼠的重量并且呈现重量损失。图4C示出存活率。
图5呈现PIV5-H5HL和PIV5-H5LN的示意图。H5可以插入在HN与L之间以便产生PIV5-H5HL或插入在前导序列与NP之间以便产生PIV5-H5LN。示出了H5插入的更详细的图解。指示了对于病毒mRNA合成的起始和终止来说重要的基因起始(GS)序列、基因间区(I)序列以及基因终止(GE)序列。
图6A至6C示出H5N1 PIV5H5影响的免疫性的HA的表达水平。图6A示出表达H5N1的HA的PIV5的示意图。指示了H5插入的位点。图6B示出免疫接种的小鼠的ELISA抗体滴度。将小鼠用1000 pfu的病毒(这是图2中所使用的剂量的1/1,000)进行接种。在接种后21天时，将小鼠取血并且使用ELISA测量抗流感病毒的滴度。图6C示出免疫接种的小鼠的中和抗体滴度。图6B中的这些样品用于中和抗体滴度测定中。
图7A和图7B示出表达NP的突变体PIV5具有更好的保护。图7A示出在致死H1N1激发后的重量损失。将小鼠(n＝10/组)用105 pfu的PIV5、rPIV5-NP、PIV5-NP(S308G)、PIV5ΔSH-NP或流感病毒X31株进行接种。PBS(一种盐水缓冲液)作为对照被包括在内。在接种后21天时，用致死剂量的H1N1(1000 TCID50)(图4中的剂量的10倍)感染小鼠。记录小鼠的重量并且呈现重量损失。图7B示出存活率。PIV5-NP(ΔSH)与PIV5ΔSH-NP相同。
图8A和图8B示出表达H5的突变体PIV5对抗体滴度具有影响。图8A示出表达H5的PIV5突变体的示意图。ZL48是PIV5-H5，ZL128是PIV5ΔSH-H5，ZL127是PIV5VΔC-H5，并且ZL154是PIV5VΔCΔSH-H5。图8B示出由表达H5的突变体PIV5产生的免疫性。将小鼠(n＝10/组)用1000pfu的PIV5、rPIV5-H5、PIV5ΔSH-H5、或PIV5VΔC-H5(克隆1和3)进行接种。在接种后21天时，将小鼠取血并且用ELISA测量抗-H5 IgG滴度。
图9示出用于产生一种改进的PIV5载体的示意图，该改进的PIV5载体是表达替代PIV5蛋白的来自预定疫苗靶标的病毒蛋白的嵌合PIV5。
图10A至图10C示出基于PIV5的HIV候选疫苗。图10A示出表达HIV的EnV或Gag的PIV5的示意图。图10B示出PIV5-Env-感染的细胞中Env的表达。将海拉细胞用PIV5-Env感染。将细胞溶解产物用于蛋白质印迹中。图10C示出PIV5-Gag-感染的细胞中Gag的表达。将海拉细胞用PIV5-Gag感染。将细胞溶解产物用于蛋白质印迹中。
图11A和图11B示出无PIV5暴露的情况下狗中抗-PIV5抗体的滴度。将八只PIV5初试狗用8×107 PFU的PIV5或rPIV5-H3病毒的一个剂量通过鼻内途径进行免疫。将这些狗分成两组：感染PIV5的狗和感染rPIV5-H3的狗。在感染后0天和21天时收集血液样品，以用于ELISA(图11A)和病毒中和抗体(nAb)测定(图11B)。灰色柱指示PIV5 nAb滴度小于10，该测定中的检测限。黑色柱指示nAb滴度等于或高于10。
图12A和图12B示出无PIV5暴露的情况下狗中PIV5的复制。在感染后3天和5天时收集狗的鼻拭子，并且将这些鼻拭子放置在含有0.5 mL的具有2％FBS的DMEM的小瓶中。图12A示出用RT-PCR检测病毒。图12B示出用噬斑测定检测病毒。在BHK21细胞上通过噬斑测定来检查拭子样品。各连续稀释的拭子样品(1∶100至1∶102)的两个重复用于该测定中。
图13示出用rPIV5-H3接种的PIV5初试狗中的免疫应答。在感染后0天和21天时收集狗血液样品。将4 HAU的甲型流感病毒(A/Udorn(乌隆)/72，H3N2亚型)与连续稀释的狗血清在96孔圆底平板中进行混合。将血凝抑制(HAI)滴度评分为完全抑制血凝的最高稀释抗血清的倒数。该图示出各狗的重复孔的平均值。指示了HAI滴度的检测限(10)。
图14A和图14B示出在PIV5疫苗接种的狗中抗-PIV5抗体的滴度。将已经用活PIV5疫苗接种的八只狗用一个剂量的于1 mL中的8×107 PFU的rPIV5-H3病毒或PBS经由鼻内途径进行免疫。将这些狗分成两组：两只狗接受PBS；剩余的六只狗接受rPIV5-H3。在感染后0天和21天时收集血液样品，以用于ELISA(图14A)和病毒中和抗体测定(图14B)。将数据呈现为重复孔的平均值。在中和抗体测定中，白色柱指示PIV5 nAb滴度等于或高于10。
图15A和图15B示出在预先PIV5疫苗接种的情况下狗中PIV5的复制。在3和5 dpi时收集狗的鼻拭子。与图12中相同地进行病毒检测。图15A是RT-PCR的结果并且图15B是噬斑测定的结果。
图16示出用rPIV5-H3接种的PIV5-疫苗接种的狗中的免疫应答。在0和21 dpi时收集狗血液样品。使用与图13中相同的方法来测定抗-PIV5和抗-HAI滴度。
图17A和图17B示出人中的PIV5抗体。从18至50岁的健康个体获得45份人血清样品。图17A是抗-PIV5抗体水平和抗-MuV抗体水平的比较。在血清连续稀释的情况下在涂覆有纯化的PIV5或纯化的MuV的平板上进行ELISA。对于每份人血清样品来说，在320倍稀释时示出PIV5或流行性腮腺炎病毒特异性ELISA OD450值。图17B示出人血清中针对PIV5的中和抗体的滴度。抗体滴度的数据是重复孔的平均值并且针对每份人样品呈现。白色柱指示PIV5 nAb滴度小于10(检测限)。黑色柱指示nAb滴度等于或高于10。
图18A和图18B呈现表达H5的重组PIV5的信息。图18A是表达H5N1HA的重组PIV5的示意图。含有多元氨基酸残基的切割位点是缺失的并且示出序列。图18B示出表达H5N1 HA原种的重组PIV5的滴度。将噬斑纯化的病毒生长在MDBK细胞中并且在BHK细胞中滴定。NSPQRERRRKKRGLFG是SEQ ID NO：1并且NSPQGLFG是SEQ ID NO：2。
图19A至图19C示出在PIV5基因组的HN与L之间表达H5N1 HA的重组PIV5的产生和分析。图19A是使用免疫印迹法确认H5N1 HA表达。将MDBK细胞用ZL48感染并且在24 hpi时溶解。将溶解产物在SDS-PAGE凝胶上运行并且用抗-H5N1 HA进行免疫印迹。图19B是使用免疫荧光法(IF)确认H5N1 HA表达。将MDBK细胞用ZL48感染并且用抗-H5N1 HA染色。用于IF的抗体在该图的左侧上示出。图19C示出rPIV5-H5的生长速率。将MDBK细胞用PIV5或ZL48在0.1的MOI下感染。在24小时间隔时收集培养基。使用噬斑测定来测定培养基中病毒的滴度。
图20A至图20D示出用rPIV5-H5接种的小鼠中的免疫应答。将小鼠用PIV5或ZL48在106 pfu的剂量下经由鼻内途径感染。图20A示出抗-HA的ELISA滴度。将小鼠用106 pfu的ZL48或PIV5感染。在21 dpi时，将小鼠取血。使用ELISA测定抗-HA的滴度。图20B示出抗-HA滴度的加强。将图20A中的小鼠在28 dpi时加强并且在35 dpi时取血。使用ELISA测量抗-HA的滴度。图20C示出中和滴度。如材料和方法中所描述来测定用PIV5或ZL48疫苗接种的小鼠的血清中针对H5N1的nAb的滴度。图20D示出细胞介导的应答。在疫苗接种后第12天时如通过ELISpot分析测定纵膈淋巴结中产生IFN-γ的淋巴细胞(n＝每组3只小鼠的池)。数据呈现为平均值±SEM。
图21A和图21B示出小鼠中针对rgVN-PR8(H5N1)激发的rPIV5-H5的功效。将小鼠用PBS、PIV5或ZL48(n＝每组10只)在每只小鼠106 pfu的剂量下接种。在21 dpi时，将小鼠用rgVN-PR8(H5N1)在1,000 TCID50的剂量下激发。在激发后4天时收集肺。使用噬斑测定来测定小鼠的肺中rgPR8H5N1的滴度。
图22A至图22C示出小鼠中针对HPAI H5N1激发的rPIV5-H5的功效。将小鼠用PBS、PIV5或ZL48(n＝每组15只)在每只小鼠106 pfu的剂量下接种。在21 dpi时，将小鼠用HPAIH5N1在10 LD50的剂量下激发。图22A示出用H5N1激发的小鼠的重量。在激发之后每日监测重量持续15天。将重量绘制为原始重量(激发当天)的百分比的平均值。图22B示出存活率。图22C示出用H5N1激发的小鼠的肺滴度。将小鼠(N＝5)在H5N1激发后4天时处死。在MDCK细胞中使用噬斑测定来测定滴度。
图23A和图23B是表达H5N1 HA的重组PIV5的分析。图23A是感染表达H5N1 HA的重组PIV5的细胞中H5N1 HA表达的分析。将细胞用ZL46、ZL47以及ZL48连同PIV5在1的MOI下感染。如材料和方法中所描述使用流式细胞术来测定感染的细胞中H5N1 HA的表达水平。图23B示出组织培养细胞中重组病毒的生长速率。将细胞用病毒在0.1的MOI下感染。在24小时间隔时收集来自感染的细胞的培养基并且用于噬斑测定以测定病毒的滴度。
图24示出体内重组病毒的生长。将小鼠(n＝5)用病毒在106 pfu的剂量下经由鼻内途径感染。在4 dpi时，收集肺并且用于噬斑测定以测定病毒的滴度。
图25A至图25D示出针对HPAI H5N1激发的表达H5N1 HA的重组PIV5的功效。将小鼠用PIV5或ZL48在103、104、或105 pfu的剂量下经由鼻内途径感染。在24d pi时，将小鼠用10LD50的H5N1激发。每日监测小鼠的重量。图25A是用10 LD50的A/越南(Vietnam)/1203/04激发的小鼠的对数秩存活率分析。用103 pfu(图25B)、104 pfu(图25C)、或105 pfu(图25D)疫苗接种并且用10 LD50的HPAI H5N1激发的小鼠的相对重量。用rgVN-PR8疫苗接种的小鼠接受2000 pfu的病毒。
图26A至图26C示出表达RV-G蛋白的重组PIV5(rPIV5-RV-G)的产生。图26A是rPIV5-RV-G的示意图。NP，核蛋白；P，磷蛋白；V，V蛋白；M，基质蛋白；SH，小疏水蛋白；F，融合蛋白；HN，血凝素-神经氨酸酶蛋白；L，RNA-依赖性RNA聚合酶。前导序列和尾随序列对于PIV5 RNA复制来说是重要的。图26B示出使用IFA检测RV-G表达。使用小鼠抗-RV-G抗体通过间接免疫荧光测定(IFA)在感染rPIV5-RV-G的MDBK细胞中鉴别RV-G表达，同时感染PIV5的细胞用作阴性对照。图26C示出使用WB检测RV-G表达。使用小鼠抗-RV-G抗体通过蛋白质印迹法(WB)在感染rPIV5-RV-G的MDBK细胞中检查RV-G表达，其中感染PIV5的细胞作为阴性对照。
图27A和图27B是细胞中PIV5和rPIV5-RV-G的生长动力学的比较。图27A是多周期生长测定。PIV5和rPIV5-RV-G的多周期生长曲线是在MDBK细胞中在0.01的MOI下进行。在24小时间隔时收获来自细胞培养的上清液的等分试样直到感染后第120小时。图27B是单周期生长测定。PIV5和rPIV5-RV-G的单周期生长曲线是在MDBK细胞中在5的MOI下进行。在12小时间隔时收获来自细胞培养的上清液的等分试样直到感染后第60小时。在BHK21细胞中通过噬斑测定来测定上清液中的病毒滴度。值表示来自两个独立实验的结果的平均值，并且误差条示出标准偏差。
图28示出rPIV5-RV-G病毒粒子中RV-G的并入。将病毒颗粒通过10％至80％(wt/vol)蔗糖梯度纯化。将病毒蛋白通过使用10％SDS-PAGE进行分析并且用针对RV-G的小鼠抗体经受蛋白质印迹分析。指示了RV-G蛋白的位置。
图29A和图29B示出小鼠中针对狂犬病激发的rPIV5-RV-G的初次-加强免疫的功效。将多组小鼠(每组n＝10)用10倍稀释的rPIV5-RV-G病毒(103 PFU至106 PFU)进行鼻内免疫。将对照小鼠用106 PFU的PIV5或用PBS进行接种。在初次疫苗接种之后三周，将动物用相同量的疫苗加强。在加强之后一周，将所有小鼠用50 LD50的CVS-24株通过I.C.途径激发。图29A是VNA测试。在激发之前收集血清样品并且用于通过快速荧光聚焦抑制测试(RFFIT)测量针对狂犬病病毒的VNA滴度。简单地说，将血清中的VNA滴度与已知标准进行比较，该已知标准包含已知浓度的每毫米溶液国际单位(IU)。在106 PFU与105 PFU、105 PFU与104 PFU接种之间的VNA滴度是统计学上有意义的(P值分别是0.0001和0.0004，这些P值是使用学生t检验计算的)；104 PFU与103 PFU之间的VNA滴度无统计学差异(P值是0.06)。图29B示出存活率。针对狂犬病的临床征兆每日观察感染的动物持续22天，并且将存活率绘制成图。
图30A和图30B示出小鼠中针对狂犬病激发的rPIV5-RV-G的一个剂量免疫的功效。将多组小鼠(每组n＝10)用10倍稀释的rPIV5-RV-G病毒(105 PFU至107 PFU)鼻内免疫，或用rPIV5-RV-G病毒(106 PFU至108PFU)肌内疫苗接种。将对照小鼠用106 PFU的PIV5接种。在三周之后，将每组所有小鼠用50 LD50的CVS-24株通过I.C.途径激发。图30A是VNA测试。在激发之前收集血清样品并且用于通过RFFIT测量针对狂犬病病毒的VNA滴度。在IN 107与106PFU、IM 107与106 PFU之间的VNA滴度是统计学上有意义的(P值分别是0.018和0.008)。在IN106与105 PFU、IM 107与108 PFU之间的VNA滴度无统计学差异(P值分别是0.11和0.402)。图30B示出存活率。针对狂犬病的临床征兆每日观察感染的动物持续22天。
图31A和图31B示出小鼠中针对狂犬病激发的rPIV5-RV-G的口服免疫的功效。将多组小鼠(每组n＝10)用106 PFU的rPIV5-RV-G的一个剂量鼻内免疫，或用108 PFU的rPIV5-RV-G病毒以IM或口服途径疫苗接种。作为阳性对照，将一组小鼠用1×107 FFU的狂犬病疫苗株LBNSE通过IM途径进行免疫。将对照小鼠用106 PFU的PIV5或用PBS进行接种。在三周之后，将每组所有小鼠用50 LD50的CVS-24株通过I.C.途径激发。图31A是VNA测试。在激发之前收集血清样品并且用于通过RFFIT测量针对狂犬病病毒的VNA滴度。IN(106 PFU)与IM(108PFU)之间的VNA滴度无统计学差异(P值是0.66，使用学生t检验计算的)。口服与IN或IM之间的VNA滴度是在统计学上有意义的(P值分别是0.03和0.003)。图31B示出存活率。针对狂犬病的临床征兆每日观察感染的动物持续22天。
图32示出用PIV5-H5经由卵内途径接种的鸡的抗流感抗体滴度。将18天大的SPF胚胎使用100μl的PIV5-H5进行卵内疫苗接种(滴度在各组下面示出)。将鸡在孵化(ah)之后第14天和第28天取血。按照OIE建议来测定血凝-抑制(HI)滴度。y轴是呈log2的HI滴度。来自12只鸡(对于对照来说10只鸡)的平均滴度和适当的标准偏差以柱形式示出。每只共混的非疫苗接种接触鸡的HI滴度在适当的柱上面。
图33示出表达H5N1的HA的重组PIV5的示意图。PIV5-H5(ZL48)具有在PIV5的HN基因与L基因之间的H5插入。PIV5ΔSH-H5缺乏SH基因。PIV5VΔC-H5缺乏V蛋白的保守的C-末端。这种病毒的两种不同的分离株(isolate)已经获得并且将进行测试。SH缺失和保守的C-末端缺失已经进行组合以制备PIV5VΔCΔSH-H5。SH或VΔC的缺失引起小鼠中的减毒作用。
图34A至图34D示出PIV5-H5将HA并入至病毒粒子中并且在感染过程中表达H5。图34A是示出ZL48和ZL48的基因组的示意图，其指示H5HA基因插入的位置。在图34B中，将MDBK细胞用PIV5、ZL48、或ZL46感染(MOI＝0.1)持续72小时，并且收集上清液并且将这些上清液与在SDS-PAGE凝胶上分离的纯化的上清液进行比较，并且通过考马斯蓝(Coomassie blue)染色成像。在图34C中，将MDBK细胞用PIV5、ZL48、或ZL46感染(MOI＝5)，在24小时之后溶解，在SDS-PAGE凝胶上分离，转移至PVDF，并且用对PIV5的V/P蛋白有特异性的单克隆抗体和来自感染rgA/VN-PR8的小鼠的超免疫血清进行印迹以检测HA。大小以kDa表示。在图34D中，将Vero细胞用PIV5或ZL46感染或进行模拟感染。在24 h p.i.时，将细胞固定并且用抗-H5和抗-V/P单克隆抗体染色。免疫荧光显微照片是在X20放大率下取得的(条，200μm)。
图35A至图35E示出用活的PIV5-H5免疫诱导HA-特异性免疫应答。将BALB/c小鼠(每组n＝5)用PIV5 IN、ZL46 IN或IM、灭活的ZL46 IM(iZL46)、或灭活的A/VN/1203/04(iA/VN/1203/04)IM免疫。将小鼠在免疫后第7天、第14天以及第21天时取血。汇集血清以用于分析。在图35A中，使用IgG(H&L)特异性ELISA在血清样品中测量HA(H5)特异性抗体滴度。虚线表示检测限。图35B示出免疫后血清中的rg A/VN-PR8-中和抗体滴度。将小鼠用PIV5、ZL46、或亚致死剂量的rgA/VN-PR8进行IN或IM免疫，并且鼻洗涤(图35C)和支气管肺泡灌洗(BAL)(图35D)在感染后第14天或第21天时进行。汇集样品以用于通过HA-特异性IgG ELISA的分析。图35E示出在疫苗接种后第12天时如通过ELISpot分析测定的纵膈淋巴结中产生IFN-γ的淋巴细胞(n＝每组3只小鼠的池)。数据呈现为平均值±SEM。
图36A至图36C示出用活的PIV5-H5免疫保护免受HPAI激发。将BALB/c小鼠用PIV5、rPIV5-H5(ZL46)IN或IM，灭活的rPIV5-H5(iZL46)IM，亚致死剂量的rgA/VN-PR8 IN，或rgA/VN-PR8 IM免疫。在28天p.i.时，将小鼠用10 LD50 A/VN/1203/04 IN激发。在图36A中，监测小鼠的重量并且将重量呈现为它们的激发前体重的平均百分比±SEM(n＝8)。图36示出激发后存活的小鼠的百分比。图36C示出在激发后第3天时如在MDCK细胞上通过TCID50测量的肺中的激发病毒滴度(每组n＝5)。数据被呈现为平均值对数转化的TCID50/ml肺匀浆±SEM。检测限是100TCID50/ml。
图37A至图37C示出用PIV5-H5加强增强HA-特异性抗体应答。将BALB/c小鼠(每组n＝5)用PIV5 IN、ZL46 IN或IM、灭活的ZL46 IM(iZL46)、或灭活的A/VN/1203/04 IM(iA/VN/1203/04)免疫。将小鼠在免疫后第7天、第14天以及第21天时取血。在免疫后第28天时，将小鼠如之前进行加强并且在加强后第7天和第14天时收集血清。汇集血清以用于分析。在图37A中，使用IgG特异性ELISA在血清样品中测量HA(H5)特异性抗体滴度。虚线表示检测限。图37B示出免疫后血清中的rgA/VN-PR8-中和抗体滴度。将小鼠用rgA/VN-PR8激发并且在激发后第3天时如在MDCK细胞上通过TCID50测量肺中的病毒滴度(每组n＝5)。数据被呈现为平均值对数转化的TCID50/ml肺匀浆±SEM。检测限是100 TCID50/ml。在图38C中，将小鼠用rgA/VN-PR8激发，并且在激发后第3天时通过TCID50测量肺中的病毒滴度(每组n＝5)。
图38是PIV5-NP病毒PIV5基因组的示意图，该PIV5基因组包含按3′-NP-V/P-M-F-SH-HN-L-5′顺序的七个基因，其中前导区和尾随区位于该基因组的末端处。H5N1-NP基因在所指示的基因接点处插入至PIV5基因组中。
图39A和图39B示出体外和体内PIV5和PIV5-NP-HN/L的生长。图39A示出组织培养细胞中PIV5和PIV5-NP-HN/L的多步生长曲线。将MDBK细胞用PIV5或PIV5-NP-HN/L在0.1的MOI下感染，并且在24小时间隔时收集培养基。在BHK细胞上通过噬斑测定来测定病毒滴度。在图39B中，将小鼠用105 pfu的PIV5或PIV5-NP-HN/L鼻内疫苗接种。在疫苗接种后第3天时对小鼠实施安乐死以测定肺病毒滴度。
图40示出由PIV5-NP-HN/L诱导的小鼠中的NP-抗体水平。将小鼠用106 pfu的PIV5、PIV5-NP-HN/L或105 pfu的X31鼻内疫苗接种。在疫苗接种后第21天时，收集血液样品并且制备血清。根据制造商的说明书(KPL公司)使用纯化的H5N1-NP进行ELISA。
图41示出由PIV5-NP-HN/L诱导的小鼠中的T细胞应答。将小鼠用PBS、107 pfu的PIV5、PIV5-NP-HN/L或0.1 LD50的PR8鼻内疫苗接种(每组n＝5)。在疫苗接种后第21天时，将小鼠处死并且收集脾。将脾细胞用Flu-NP、作为阴性对照的Ebola GP P2、或作为阳性对照的PMA/离子霉素(ionomycin)再刺激。将结果呈现为每106个脾细胞分泌细胞因子的细胞的平均数目。
图42A至图42C示出针对H1N1激发的PIV5-NP-HN/L的保护将小鼠用PBS、106 pfu的PIV5、PIV5-NP-HN/L或105 pfu的X31鼻内疫苗接种(每组n＝10)。在疫苗接种后第21天时，将小鼠用10 LD50A/PR/8/34(H1N1)激发。在激发后每日监测重量损失(图42A)和存活率(图42B)持续14天。将重量损失呈现为原始重量(激发当天)的平均百分比。图42C示出用H1N1激发的小鼠的肺滴度。将小鼠(n＝5)在激发后3天时处死。使用MDCK细胞使用TCID50测定来测定滴度。
图43A和图43B示出针对H5N1 HPAI激发的PIV5-NP-HN/L的保护。将小鼠用PBS、107pfu的PIV5或PIV5-NP-HN/L疫苗接种(每组n＝10)。在疫苗接种后第21天时，将小鼠用10LD50 H5N1 HPAI激发。在流感病毒激发后监测重量损失(图43A)和存活率(图43B)持续16天。
图44A至图44C示出表达NP的重组PIV5的分析。图44A示出PIV5病毒和PIV5-NP病毒的多步生长曲线。将MDBK细胞用PIV5病毒或PIV5-NP病毒在0.1的MOI下感染，并且在24小时间隔时收集培养基。使用BHK细胞通过噬斑测定来测定病毒滴度。图44B示出感染PIV5-NP病毒的细胞中的H5N1-NP表达水平。将MDBK细胞用PIV5病毒或PIV5-NP病毒在5的MOI下感染。通过流式细胞术来检查H5 NP与PIV5-VP的MFI的比值。图44C示出体内PIV5病毒和PIV5-NP病毒的生长。将小鼠用105 pfu的PIV5病毒和PIV5-NP病毒鼻内疫苗接种。在疫苗接种后第3天时对小鼠实施安乐死以测定肺病毒滴度。
图45示出PIV5-NP病毒引发T细胞应答。将小鼠用PBS、107 pfu的PIV5病毒或PIV5-NP病毒、或0.1 LD50的PR8鼻内疫苗接种(每组n＝5)。在疫苗接种后第21天时，将小鼠处死并且收集脾。将脾细胞用Flu-NP、埃博拉(Ebola)GP P2、或PMA/离子霉素再刺激。将结果呈现为每106个脾细胞分泌细胞因子的细胞的平均数目。
图46A和图46B示出针对H5N1 HPAI激发的PIV5-NP病毒的保护。将小鼠用PBS、107pfu的PIV5病毒或PIV5-NP病毒、或2000 pfu的rgA/VN-PR8鼻内疫苗接种(每组n＝10)。在疫苗接种后第21天时，将小鼠用20LD50 H5N1 HPAI激发。在流感病毒激发后监测重量损失(图46A)和存活率(图46B)持续14天。将重量损失绘制为原始重量(激发当天)的平均百分比。
图47A和图47B示出表达H5N1抗原的重组PIV5的示意图。在图47A中，PIV5基因组内的默认插入位点是HN与L基因之间的接点。对于不在HN与L基因之间的插入来说，在重组病毒的末端处添加基因接点。例如，SH与HN基因之间的H5的插入是rPIV5-H5-SH-HN。所插入的基因侧接有来自转录所要求的PIV5的基因起始序列、基因终止序列以及连接序列。在图47B中，PIV5基因组内的默认插入位点是SH与HN基因之间的接点。对于P-S308A突变对疫苗的作用的测试来说，基因将被插入在HN与L基因之间的接点处，以便对病毒基因表达具有最小影响。
图48示出表达待产生的狂犬病病毒抗原的重组PIV5的示意图。虽然PIV5基因组内的用于初始研究的默认插入位点是HN与L基因之间的接点，但还将利用另外的插入位点。
图49A至图49H示出不同OPIV5抗原构建体的示意图。图49A示出表达RSV抗原F和G的PIV5的示意图。图49B示出表达尼帕病毒抗原F和G的PIV5的示意图。图49C示出表达结核分枝杆菌抗原85A、85B以及ESAT6的PIV5的示意图。图49D示出表达PRRSV抗原的PIV5的示意图。图49E示出表达猪环状病毒(PCV2)抗原的PIV5的示意图。图49F示出表达克氏锥虫(T.cruzi)抗原Ts的PIV5的示意图。图49G示出表达诺如病毒抗原的PIV5的示意图。图49H示出表达HIV抗原Env(gp160、gp140或gp120和Gag)的PIV5的示意图。
示意性实施方式的详细说明
副流感病毒5(PIV5)(一种负链RNA病毒)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)的腮腺炎病毒属的成员，副粘病毒科包括许多重要的人和动物病原体如流行性腮腺炎病毒、2型和4型人副流感病毒、新城疫病毒、仙台病毒(Sendai virus)、HPIV3、麻疹病毒、犬瘟热病毒、牛瘟病毒、以及呼吸道合胞病毒。PIV5之前被称为猿猴病毒-5(SV5)。虽然PIV5是感染许多动物和人的一种病毒，但在人中没有已知的症状或疾病已经与PIV5相关。与大多数副粘液病毒不同，PIV5以很小的致细胞病变作用感染正常细胞。作为一种负链RNA病毒，PIV5的基因组是非常稳定的。因为PIV5在其生命周期中不具有DNA阶段，并且它仅在细胞质中复制，所以PIV5不能整合到宿主基因组中。因此，使用PIV5作为载体避免来自宿主细胞DNA的遗传修饰的可能的不希望的后果。PIV5可以在细胞中生长至高滴度，这些细胞包括已经由WHO和FDA批准用于疫苗生产的Vero细胞。因此，PIV5呈现出作为疫苗载体的许多优点。
本发明提供PIV5构建体并且在PIV5的基因组内鉴别改进PIV5作为病毒表达载体(包括用作改进的疫苗载体)的功效的突变。本发明的疫苗载体可以基于多种野生型、突变或重组(rPIV5)株中的任何一种。野生型株包括但不限于，PIV5株W3A、WR(编号VR-288TM)、犬副流感病毒株78-238(ATCC编号VR-1573)(埃佛曼(Evermann)等人，1980，美国兽医协会杂志(JAm Vet Med Assoc)；177：1132-1134；和埃佛曼等人，1981，病毒学文献(ArchVirol；)；68：165-172)、犬副流感病毒株D008(ATCC编号VR-399)(比恩(Binn)等人，1967，实验生物学与医学会会报(Proc Soc Exp Biol Med)；126：140-145)、MIL、DEN、LN、MEL、隐病毒(cryptoVirus)、CPI+、CPI-、H221、78524、T1以及SER。参见，例如，Chatziandreou等人，2004，普通病毒学杂志(J Gen Virol)；85(Pt 10)：3007-16；肖邦(Choppin)，1964，病毒学(Virology)：23：224-233；以及鲍姆加特纳(Baumgartner)等人，1987，国际病毒学(Intervirology)；27：218-223。此外，可以使用商业犬舍咳疫苗，例如像，BI疫苗、FD疫苗、默克(Merck)疫苗、以及梅里亚(Merial)疫苗中使用的PIV5株。
PIV5疫苗载体可以使用多种方法中的任何一种进行构建，这些方法包括但不限于，何等人(病毒学；237(2)：249-60，1997)中更详细地描述的反向遗传学系统。图1示出PIV5基因组结构。PIV5编码八种病毒蛋白。核壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)以及大RNA聚合酶(L)蛋白对于病毒RNA基因组的转录和复制来说是重要的。V蛋白在病毒发病机制以及病毒RNA合成中起重要作用。融合(F)蛋白(一种糖蛋白)以一种pH-独立的方式介导细胞与细胞和病毒与病毒融合二者，该方式对于病毒进入细胞中来说是必要的。已经确定了F蛋白的结构并且已经鉴别了用于有效融合的关键氨基酸残基。血凝素-神经氨酸酶(HN)(另一种病毒糖蛋白)也涉及在病毒进入和从宿主细胞的释放中。基质(M)蛋白在病毒组装和出芽(budding)中起重要作用。疏水(SH)蛋白是44个残基的疏水整合膜蛋白并且定向在膜中，其中其N末端处于细胞质中。关于副粘液病毒的分子生物学的综述，参见，例如，蕙兰(Whelan)等人，2004，微生物学与免疫学的当前课题(Curr Top Microbiol Immunol)；283：61-119；和兰姆(Lamb)与帕克斯(Parks)，(2006)副粘液病毒科：病毒及其复制(Paramyxoviridae：theviruses and their replication.)于费氏病毒学(Fields Virology)中，第5版，第1449至1496页，由D.M.奈普(D.M.Knipe)与P.M.豪利(P.M.Howley)编辑，费城(Philadelphia)，宾夕法尼亚州(PA)：利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams &Wilkins)。本发明的PIV5病毒疫苗还可以在这八种蛋白质的一种或多种中具有突变、改变或缺失。
PIV5可以感染人(雄(Hsiung)等人，1965，免疫学杂志(J Immunol)；94：67-73)，但它还未与任何已知的疾病相关。PIV5感染小鼠和仓鼠，但不会在动物中引起任何症状。PIV5可以以高达1×108 pfu/ml的滴度在细胞中生长并且释放到培养基中，从而指示其作为安全的基因递送载体的潜力和用于病毒的大批量生产的一种可能的有成本效益的方式。迄今为止的所有证据均指示PIV5不是一种猿猴病毒。不存在令人信服的证据表明PIV5在人中引起疾病，尽管在20世纪70年代完全没有根据的推测是PIV5可能与多种疾病相关，这些疾病包括多发性硬化症(MS)、亚急性硬化性全脑炎(SSPE)、克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、天疱疮、动脉粥样硬化、佩吉特氏病(Paget′s disease)、肝炎、以及普通感冒。随后的研究已经排除了PIV5作为任何这些疾病的病原体。该病毒被重新命名为副流感病毒5(PIV5)2009。
PIV5(一种非节段性负单链RNA病毒(NNSV))是用于疫苗研发的一种良好病毒候选载体，因为它在其生命周期中不具有DNA阶段，并且因此避免宿主细胞DNA通过重组或插入的遗传修饰的可能的不希望的后果。与正链RNA病毒相比，PIV5的基因组结构是稳定的。已经生成了表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组PIV5并且GFP基因被维持超过10代。因此，PIV5比正链RNA病毒更适合作为疫苗载体，因为正链RNA病毒的基因组重组并且经常快速缺失所插入的外源基因。并且，PIV5感染大范围的细胞类型，包括原代人细胞以及已建立的人细胞系。鉴于PIV5抗原与针对HPIV2和流行性腮腺炎病毒的抗体有交叉反应性的可能性，这可能是使用PIV5作为疫苗载体的一个关注点。然而，因为在小鼠中，针对PIV5的中和抗体不预防PIV5感染(扬(Young)等人，1990，病毒学杂志(J Virol)；64(11)：5403-11)，所以在人中与PIV5交叉反应的抗体将不太可能预防PIV5感染。实例2是基于PIV5的载体可能在狗(包括具有循环抗-PIV5抗体滴度的狗)中有效的首次证明。
异源核苷酸序列可以插入PIV5基因组中的多个位置的任何一个中。例如，异源核苷酸序列可以插入在PIV5基因组的血凝素-神经氨酸酶(HN)与大RNA聚合酶蛋白(L)基因之间。在一些实施例中，异源核苷酸序列未插入在PIV5基因组的血凝素-神经氨酸酶(HN)与大RNA聚合酶蛋白(L)基因之间的一个位置处。
在一些实施例中，异源核苷酸序列插入在除了PIV5基因组的血凝素-神经氨酸酶(HN)与大RNA聚合酶蛋白(L)基因之间以外的一个位置处。例如，与PIV5基因组的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因与大RNA聚合酶蛋白(L)基因之间相比，异源核苷酸序列可以更靠近该PIV5基因组的前导序列插入。例如，异源核苷酸序列可以插入PIV5基因组的核壳蛋白(NP)基因的上游。在一些实施例中，异源核苷酸序列未插入PIV5基因组的核壳蛋白(NP)基因的上游。
在一些实施例中，异源核苷酸序列可以插入在PIV5基因组的核壳蛋白(NP)基因与V/P基因之间。例如，异源核苷酸序列可以紧接PIV5基因组的前导序列的下游插入。例如，异源核苷酸序列可以插入在PIV5基因组的M基因与F基因之间。例如，异源核苷酸序列可以插入在PIV5基因组的F基因与SH基因之间。例如，异源核苷酸序列可以插入在PIV5基因组的VP基因与基质蛋白(M)基因之间。例如，异源核苷酸序列可以插入在PIV5基因组的小疏水蛋白(SH)基因与血凝素-神经氨酸酶(HN)基因之间。例如，异源核苷酸序列可以插入在PIV5基因组的前导序列与核壳蛋白(NP)基因之间。
在一些实施例中，异源核苷酸序列未插入在PIV5基因组的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因与大RNA聚合酶蛋白(L)基因之间。在一些实施例中，异源核苷酸序列可以插入在PIV5基因组的血凝素-神经氨酸酶(HN)与大RNA聚合酶蛋白(L)基因之间，并且其中该PIV5基因组进一步包含一个或多个突变。
在一些实施例中，异源核苷酸序列编码一种流感核壳蛋白(NP)并且插入在PIV5基因组的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因与大RNA聚合酶蛋白(L)基因之间。
本发明包括PIV5疫苗构建体，该PIV5疫苗构建体具有插入如于此包括的任何附图和实例中所示的位置中的异源核苷酸序列。
可以插入异源核苷酸序列以替代PIV5基因组内的所有或部分PIV5基因。例如，异源核苷酸序列可以替代PIV5基因组的F、HN、或SH基因。在一些实施例中，编码(例如)流感HA或NA的异源核苷酸序列可以替代PIV5基因。在一些实施例中，HA或NA流感基因可以替代一部分PIV5 F或HN基因。
异源核苷酸序列可以插入PIV5基因内，从而导致嵌合多肽的表达。例如，异源核苷酸序列可以插入PIV5基因组的SH基因核苷酸序列内、NP基因核苷酸序列内、V/P基因核苷酸序列内、M基因核苷酸序列内、F基因核苷酸序列内、HN基因核苷酸序列内、和/或L基因核苷酸序列内。
PIV5可以在许多细胞类型中以很小的致细胞病变作用(CPE)有效地感染细胞。在一些细胞类型中，PIV5感染引起合胞体的形成，即许多细胞融合在一起，从而导致细胞死亡。突变可以包括促进合胞体形成的一个或多个突变(参见，例如，帕特森(Paterson)等人，2000，病毒学；270：17-30)。
PIV5感染不会诱导细胞凋亡(何等人，2001，病毒学杂志；75：4068-4079)。然而，缺乏SH的重组PIV5(rPIV5ΔSH)在L929细胞中通过肿瘤坏死因子(TNF)-γ介导的外在细胞凋亡途径诱导细胞凋亡(何等人，2001，病毒学杂志；75：4068-4079；何等人，1998，病毒学；250：30-40；以及林等人，2003，病毒学杂志；77：3371-3383)。
PIV5的V蛋白在阻断由病毒诱导的细胞凋亡中起关键作用。缺乏V蛋白的保守的富含半胱氨酸的C-末端的重组PIV5(rPIV5VΔC)在多种细胞中通过内在细胞凋亡途径诱导细胞凋亡，很可能是通过内质网(ER)-应激起始的(孙等人，2004，病毒学杂志；78：5068-5078)。在V/P基因产物的N-末端中具有突变的突变体重组PIV5(如rPIV5-CPI-)也诱导细胞凋亡(温斯利(Wansley)和帕克斯，2002，病毒学杂志；76：10109-10121)。突变包括但不限于，rPIV5ΔSH、rPIV5-CPI-、rPIV5ΔC、及其组合。
突变包括但不限于，V/P基因的突变、V蛋白和P蛋白的共享N-末端的突变、V蛋白和P蛋白的共享N-末端的残基26、32、33、50、102、和/或157的突变、缺乏V蛋白的C-末端的突变、缺乏小疏水(SH)蛋白的突变、融合(F)蛋白的突变、磷蛋白(P)的突变、大RNA聚合酶(L)蛋白的突变、并入来自犬副流感病毒的残基的突变、和/或增强合胞体形成的突变。
突变可以包括但不限于，rPIV5-V/P-CPI-、rPIV5-CPI-、rPIV5-CPI+、rPIV5VΔC、rPIV-Rev、rPIV5-RL、rPIV5-P-S157A、rPIV5-P-S308A、rPIV5-L-A1981D和rPIV5-F-S443P、rPIV5-MDA7、rPIV5ΔSH-CPI-、rPIV5ΔSH-Rev、及其组合。
本发明的PIV5疫苗包含一种包含在此所描述的任何一个或多个突变的重组PIV5构建体，包括在于此包括的附图和实例中描述的任何一种或多种构建体。
本发明的PIV5病毒表达载体包含一个异源核苷酸序列。这种异源核苷酸序列可以编码，例如，异源DNA、异源RNA、和/或异源多肽。在一些方面，异源核苷酸序列可以编码异源多肽或其片段。这种多肽可以是抗原性的并且具有作为疫苗的效用。这种抗原性多肽可以来自影响人和/或动物的多种多样的病原体和疾病中的任何一种。在一些方面，异源多肽可以源自人免疫缺陷病毒(HIV)、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、副流感病毒4、人呼吸道合胞病毒、牛呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、结核分枝杆菌、禽偏肺病毒、克氏锥虫、尼帕病毒、亨德拉病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、猪环状病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒、新城疫病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、犬瘟热病毒、猪流感、人杯状病毒、兽医杯状病毒、人诺如病毒、兽医诺如病毒、牛瘟病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、或人和动物中的一种新兴流感病毒。在一些方面，异源多肽可以源自一种细菌或一种寄生虫。在一些方面，异源多肽可以是一种癌症抗原。
在一些方面，异源多肽是来自一种流感病毒，包括但不限于甲型流感、乙型流感、或丙型流感。流感是正粘病毒科中的一种负义、节段性RNA病毒。基于主要抗原性表面糖蛋白、血凝素(HA)以及神经氨酸酶(NA)，它被分为多种亚型。迄今存在17种不同的HA亚型和9种不同NA亚型，所有均包含禽来源的区段。流感具有重排的能力，由此基因区段进行交换，从而产生新的流感病毒，群体对于该新的流感病毒是免疫学上幼稚的。异源多肽可以是来自一种流感病毒的血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核壳蛋白(NP)、M1、M2、PA、PB1、PB2、NS1或NS2。HA、NA、NP、M1、M2、PA、PB1、PB2、NS1、或NS2可以(例如)来自甲型流感病毒株H5N1、H3N2、或H1N1。
HA可以来自(例如)甲型流感亚型H1、甲型流感亚型H2、甲型流感亚型H3、甲型流感亚型H4、甲型流感亚型H5、甲型流感亚型H6、甲型流感亚型H7、甲型流感亚型H8、甲型流感亚型H9、甲型流感亚型H10、甲型流感亚型H11、甲型流感亚型H12、甲型流感亚型H13、甲型流感亚型H14、甲型流感亚型H15、或甲型流感亚型H16。HA可以(例如)来自甲型流感病毒株H5N1、H3N2、或H1N1。在一些方面，HA多肽可以包含突变以防止裂解。
NA可以来自(例如)甲型流感的甲型流感亚型N1、甲型流感亚型N2、甲型流感亚型N3、甲型流感亚型N4、甲型流感亚型N5、甲型流感亚型N6、甲型流感亚型N7、甲型流感亚型N8、或甲型流感亚型N9。NA可以(例如)来自甲型流感病毒株H5N1、H3N2、或H1N1。
异源多肽包括于此包括的附图和实例中所描述的那些中的任何一种。
狂犬病病毒(RABV)感染在温血动物(包括人)中导致狂犬病，其特征在于在无暴露后治疗的情况下，在早期时的急性脑炎和在晚期时的死亡(鲁普雷希特(Rupprecht)等人，2006，抗感染治疗专家评论(Expert Rev Anti Infect Ther)；4：1021-1038)。未治疗的狂犬病病毒(RABV)感染导致死亡。疫苗和暴露后治疗在预防RABV感染中一直有效。然而，由于成本，狂犬病疫苗接种和治疗尚未在发展中国家广泛使用。每年存在由狂犬病引起的55,000人死亡。流浪狗、野生食肉动物以及蝙蝠是野生(field)RABV的天然储主，并且这些狂犬病携带者是人和家养动物的公共健康风险。人狂犬病发生在很大程度上归因于发展中国家中流浪狗的咬伤，其中动物的疫苗接种是有限的，尤其是在农村地区。需要有效的和有成本效益的狂犬病疫苗。在一些方面，异源多肽是一种或多种狂犬病多肽。
如在此所描述的PIV5病毒表达载体可以证明疫苗载体的增强的功效。
PIV5病毒表达载体可以包含一个或多个突变，包括但不限于在此所描述的那些中的任何一种。在一些方面，两个或更多个(两个、三个、四个、五个、六个、七个、或更多个)突变的组合可能是有利的并且可以展示增强的活性。
先前，为了测试使用PIV5作为活疫苗载体的可行性，将来自甲型流感病毒株A/乌隆/72(H3N2)的血凝素(HA)基因插入到PIV5基因组中作为血凝素-神经氨酸酶(HN)基因与大(L)聚合酶基因之间的额外基因。回收含有乌隆的HA基因的重组PIV5(rPIV5-H3)，并且将它与野生型PIV5类似地进行复制(体外和体内二者)。将由感染rPIV5-H3的细胞表达的HA蛋白并入到这些病毒粒子中，并且添加HA基因不会增加小鼠中的病毒毒力。对rPIV5-H3作为活疫苗的功效进行了检测，并且单剂量接种提供针对甲型流感病毒感染的广泛且相当大的免疫性(汤普金斯(Tompkins)等人，2007，病毒学；362(1)：139-50)。因此，在一些方面，本发明不包括汤普金斯等人，2007，病毒学；362(1)：139-50的PIV5病毒构建体。例如，在一些方面，本发明不包括表达来自甲型流感病毒株A/乌隆/72(H3N2)的血凝素(HA)基因的PIV5病毒载体构建体。例如，在一些方面，本发明不包括表达来自甲型流感病毒H3N2的血凝素(HA)基因的PIV5病毒载体构建体。例如，在一些方面，本发明不包括表达来自甲型流感病毒的血凝素(HA)基因的PIV5病毒载体构建体。例如，在一些方面，本发明不包括rPIV5-HA。例如，在一些方面，本发明不包括表达插入到PIV5基因组中作为血凝素-神经氨酸酶(HN)基因与大(L)聚合酶基因之间的额外基因的来自甲型流感病毒株A/乌隆/72(H3N2)的血凝素(HA)基因的PIV5病毒载体构建体。例如，在一些方面，本发明不包括表达插入到PIV5基因组中作为血凝素-神经氨酸酶(HN)基因与大(L)聚合酶基因之间的额外基因的来自甲型流感病毒株H3N2的血凝素(HA)基因的PIV5病毒载体构建体。例如，在一些方面，本发明不包括表达插入到PIV5基因组中作为血凝素-神经氨酸酶(HN)基因与大(L)聚合酶基因之间的额外基因的甲型流感血凝素(HA)基因的PIV5病毒载体构建体。例如，在一些方面，本发明不包括表达插入到PIV5基因组中作为血凝素-神经氨酸酶(HN)基因与大(L)聚合酶基因之间的额外基因的多肽的PIV5病毒载体构建体。例如，在一些方面，本发明不包括制备或使用在本段中所描述的一种或多种PIV5病毒载体构建体的方法。
此外，在一些方面，本发明不包括表达绿色荧光蛋白(GFP)的PIV5病毒载体构建体。在一些方面，本发明不包括表达一种可检测的标记的PIV5病毒载体构建体。
虽然先前已经证明，表达流感病毒的HA的PIV5提供免疫性，但本发明出人意料地证明基于PIV5的病毒载体在表达流感NA蛋白和NP蛋白的情况下导致保护性水平的免疫性的产生。HA免疫原性很强，并且许多载体能够产生抗-HA免疫性。然而，从一种给定表达载体导致表达HA和针对HA的免疫性的表现来看，不能假定相同载体将适用于表达其他蛋白质(例如像流感病毒的NA或NP)并且产生针对这些其他蛋白质的免疫应答。这通过用腺病毒(AdV)载体和新城疫病(NDV)载体二者起作用得以证明。虽然两种载体均可以表达HA以用于产生免疫性，但它们在用于表达NA或NP时不产生免疫性。如在此所描述的导致产生保护性免疫的这些PIV5病毒载体是新颖的和出人意料的。
在一些方面，本发明的病毒表达载体是多价的，从而表达来自多于一种来源，例如来自两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、或更多种来源的异源多肽。
还包括于本发明中的是包含一种PIV5基因组的病毒粒子和传染性病毒颗粒，该PIV5基因组包含表达如在此所描述的一种异源多肽的一个或多个异源核苷酸序列。
还包括于本发明中的是包含如在此所描述的一种或多种病毒构建体或病毒粒子的组合物。这种组合物可以包含药学上可接受的载体。如所用，药学上可接受的载体是指适用于向人或其他脊椎动物给予的一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质。这种载体可以是不含致热原的。本发明还包括制备和使用在此所描述的这些病毒载体和组合物的方法。
本披露的组合物可以以适于所选择的给药途径的多种形式配制在药物制剂中。本领域的普通技术人员将理解该组合物将取决于给药模式和剂量单位而变化。本发明的药剂可以以多种方式给予，包括但不限于，静脉内、局部、口服、鼻内、皮下、腹膜内、肌内、以及肿瘤内递送。在一些方面，本发明的药剂可以配制用于控释或缓释。
如在此所包括的实例中所示，用PIV5-H5肌内或鼻内免疫诱导HA-特异性免疫应答。鼻内免疫的一个优点是诱导粘膜免疫应答的潜力。与通常在气道和消化道上皮细胞中复制的流感病毒不同，PIV5具有更广泛的细胞向性的潜力。这种特征使得它成为用作一种活的肌内疫苗的有吸引力的候选物。用PIV5-H5肌内免疫诱导稳健的HA-特异性和中和血清抗体应答，其可比得上鼻内免疫。此外，它提供用于将这种疫苗与其他可注射疫苗、以及一种可注射疫苗配制品组合的机会，这对于农业应用来说可能是有吸引力的。
还包括于本发明中的是制备和使用PIV5病毒表达载体(包括但不限于在此所描述的那些中的任何一种)的方法。
例如，本发明包括通过使细胞接触或感染如在此所描述的一种病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物来在该细胞中表达一种异源多肽的方法。
例如，本发明包括通过向受试者给予如在此所描述的一种病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物来在该受试者中诱导针对一种异源多肽的免疫应答的方法。免疫应答可以包括一种体液免疫应答和/或一种细胞免疫应答。免疫应答可以增强一种先天性和/或获得性免疫应答。
例如，本发明包括通过向受试者给予如在此所描述的一种病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物来在该受试者中表达一种异源多肽的方法。
例如，本发明包括通过向受试者给予如在此所描述的一种病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物来对该受试者进行疫苗接种的方法。
在本发明的这些方法的情况下，可以使用多种给药模式中的任何一种。例如，给予可以是静脉内、局部、口服、鼻内、皮下、腹膜内、肌内、肿瘤内、卵内、母系等。在一些方面，给予是至粘膜表面。疫苗可以通过大批量(mass)给药技术给予，如通过将疫苗放置于饮用水中或通过喷洒动物的环境。当通过注射给予时，免疫原性组合物或疫苗可以肠胃外给予。肠胃外给药包括，例如，通过静脉内、皮下、肌内、或腹膜内注射给予。
本披露的药剂可以一次给予，或可以分成待以一定时间间隔给予的许多多次剂量。例如，本发明的药剂可以重复给予，例如，至少2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、或更多次，或可以通过连续输注给予。应理解，精确的剂量和治疗持续时间根据所治疗的疾病而变化，并且可以使用已知的测试方案或通过从体内或体外测试数据外推来凭经验确定。应指出浓度和剂量值还可以随着待减轻的病状的严重程度而变化。应进一步理解，对于任何具体的受试者，具体剂量方案应根据个体需要和给予或监督给予组合物的人员的专业判断随时间的推移进行调整，并且在此所列出的任何浓度范围仅是示例性的，并且不旨在限制所要求保护的组合物和方法的范围或实践。
在一些治疗性实施例中，药剂的“有效量”是导致至少一个病理参数降低的一种量。因此，例如，在本披露的一些方面，有效量是与未用该药剂治疗的个体中的参数的预期降低相比，有效于实现至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％的降低的量。
在一些方面，在发明人何标(Biao He)于2013年1月24日提交的PCT申请PCT/US2013/022898“PIV5作为一种肿瘤消解剂(PIV5 as an Oncolytic Agent)”(该PCT申请特此通过引用以其全文结合在此)中所描述的任何基于PIV5的构建体和方法可以用于本发明中。
如在此所用，术语“受试者”表示一种生物体，包括，例如，哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，人、非人灵长类动物、以及其他非人脊椎动物。受试者可以是“个体”、“患者”、或“宿主”。非人脊椎动物包括家畜动物(如但不限于，牛、马、山羊、以及猪)、家养宠物或伴侣动物(如但不限于狗或猫)、以及实验室动物。非人受试者还包括非人灵长类动物以及啮齿类动物，如但不限于大鼠或小鼠。非人受试者还包括但不限于，家禽、马、牛、猪、山羊、狗、猫、豚鼠、仓鼠、貂、以及兔。
在一些实施例中，可以向家禽给予本发明的PIV5疫苗，并且虽然根据本发明的疫苗可以有效地用于鸡中，但其他家禽，例如像火鸡、珍珠鸡、鸭、以及鹧鸪也可以成功地接种。鸡包括但不限于，母鸡、公鸡、肉仔鸡、公鸡(roaster)、种鸡、种母鸡的子代、以及蛋鸡(layer)。可以在孵化之前或之后向家禽给予本发明的疫苗。家禽可以在多个年龄时接受疫苗。例如，肉仔鸡可以在一天大时卵内疫苗接种或在2至3周龄时卵内疫苗接种。产蛋家畜或繁育家畜可以例如在约6至12周龄时疫苗接种并且在约16至20周龄时加强。这种产蛋家畜或繁育家畜可以在约6、在约7、在约8、在约9、在约10、在约11、或在约12周龄时疫苗接种。这种产蛋家畜或繁育家畜可以在约16、在约17、在约18、在约19、或在约20周龄时加强。在这种PIV5疫苗的情况下，该疫苗可以表达源自对于家禽具有传染性的病原体的一种或多种免疫原。这类免疫原可以源自，例如，马立克氏病病毒(MDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、产蛋下降综合征(EDS)病毒、火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)、痘病毒、或呼肠孤病毒。
如在此所用，“体外”是在细胞培养中并且“体内”是在受试者的身体内。如在此所用，“分离的”是指以下材料：使用重组技术产生的已经从其自然环境(例如，如果它是天然存在的，那么是自然环境)移除的、抑或化学或酶合成的并且因此“通过人工”从其自然状态改变的。
术语“和/或”意指所列举的要素的一个或所有或所列举的要素的任何两个或更多个的组合。
词语“优选的”和“优选地”是指本发明的在某些情况下可以提供某些益处的实施例。然而，在相同或其他情况下，其他实施例也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施例的叙述不意味着其他实施例不是有用的，并且不旨在将其他实施例排除在本发明的范围之外。
术语“包含”及其变化形式在这些术语出现在说明书和权利要求书中时不具有限制意义。
除非另外说明，“一个(a)”、“一个(an)”、“该”、以及“至少一个”可互换使用，并且意指一个或多于一个。
除非另外指明，本说明书和权利要求书中使用的表达组分的量、分子量等等的所有数值应被理解为在所有情况中被术语“约”修饰。因此，除非另外相反地指明，在本说明书和权利要求书中列出的数值参数是近似值，这些近似值可以取决于本发明所寻求获得的所希望的特性而不同。至少，并且不是试图限制权利要求的范围的等效物的原则，每个数值参数至少应根据所报道的有效位的数值并且通过应用一般舍入方法被解释。
虽然列出本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实例中列出的数值是尽可能精确报道的。然而，所有数值固有地包含必然由其对应的测试测量中所发现的标准偏差所产生的范围。
对于在此所披露的包括不连续的步骤的任何方法来说，可以按任何可行的顺序来进行这些步骤。并且，在适当时，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。
说明书举例说明示意性实施例。在本申请全文的几处，通过实例的列举提供了指导，这些实例可以以不同组合使用。在每个例子中，所叙述的列表仅作为代表性组并且不应被解释为排他性列表。
所有标题都是为了方便读者，并且不应用来限制标题后正文的含义，除非这样说明。
本发明通过以下实例进行说明。应理解，具体实例、材料、量以及工序应根据如在此所列出的本发明的范围和精神广义地解释。
实例
实例1
副流感病毒(PIV5)作为一种疫苗载体
为了测试表达流感病毒的HA的PIV5是否能够保护H5N1激发，生成了一种致死性高致病性禽流感H5N1(HPAI)和流感病毒的最强毒株——一种表达H5N1的HA的重组PIV5(PIV5-H5)，并且在动物中对该病毒的功效进行了测试。如图2A至图2D中所示，PIV5-H5的单剂量接种保护了致死性H5N1激发，从而证明PIV5是用于疫苗研发的一种优异载体。
流感病毒的NA是用于疫苗研发的一种潜在有价值的靶标。然而，表达NA作为抗原的努力尚未成功。在表达NA的新城疫病(NDV)的情况下，该重组病毒不提供任何保护(纳亚克(Nayak)等人，2010，病毒学杂志；84(5)：2408-20)。为了测试PIV5是否是一种更好的疫苗载体，产生了一种表达H5N1的HA的重组PIV5，rPIV5-N1(H5N1)，和一种表达大流行H1N1的NA的重组PIV5，rPIV5-N1(H1N1)。如图3A至3C中所示，表达NA的重组PIV5提供针对致死性HPAIH5N1激发的消除性免疫。有趣的是，rPIV5-N1(H1N1)甚至提供针对H5N1激发的部分免疫性。这是一种表达NA的基于病毒载体的疫苗首次提供针对H5N1激发的免疫性。与任何其他病毒载体相比，这种基于PIV5的载体在提供针对流感病毒激发的免疫性方面是迄今为止最佳的。
针对一种通用流感病毒。流感病毒的NP蛋白在所有流感病毒株之中是高度保守的，并且它被认为是用于研发广泛保护性流感病毒疫苗的一个优异靶标。然而，研发基于NP的疫苗的努力尚未成功。表达NP的痘苗病毒(VV)不针对流感病毒激发进行保护(劳森(Lawson)等人，1994，病毒学杂志；68(6)：3505-11)。为了检查PIV5是否可以是一种用于表达NP的良好载体，产生了一种表达H5N1的NP基因的重组PIV5(PIV5-NP)。难以置信地，PIV5-NP提供了针对来自H1N1以及H5N1的激发的保护，从而证明基于PIV5的NP疫苗可以保护异型流感病毒激发(图4A至图4C)。已知基于NP的细胞免疫应答(基于T细胞的免疫应答)是保护性的，而体液免疫应答(基于抗体的免疫应答)对于HA介导的免疫性是足够的(格雷厄姆(Graham)和布拉恰莱(Braciale)，1997，实验医学杂志(J Exp Med)；186(12)：2063-8；克劳福德(Crawford)等人，1999，疫苗(Vaccine)；17(18)：2265-74；以及空(Kong)等人，2006，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)；103(43)：15987-91)。基于PIV5的疫苗可能通过细胞免疫应答提供保护是新颖的和出人意料的。此外，因为保护是经由PIV5通过表达NP而提供的，所以有可能产生一种基于PIV5和NP的通用流感病毒疫苗。
外源基因更靠近前导序列插入以提高疫苗的功效。负链RNA病毒(如PIV5)起始3’端前导序列的转录，并且这些病毒基因的转录水平受其与前导序列的距离的影响。例如，PIV5的最靠近前导序列的NP基因是最大量转录的，而位于距离前导序列最远的L基因是最少转录的(图5)。外源基因已经插入在HN基因与L基因之间，距前导序列(事实上的启动子序列)最远端的基因接点，因为这是具有最小破坏病毒复制潜力的接点(何等人，1997，病毒学；237：249-260；汤普金斯等人，2007，病毒学；362(1)：139-50；以及孙(Sun)等人，2011，医药化学杂志(JMed Chem)；54(5)：1126-39)。该候选疫苗将通过增加抗原的表达水平而得以增强。为了增加抗原如H5N1病毒的HA基因(H5)的表达水平，将H5基因紧接前导序列的下游和NP基因的上游插入(PIV5-H5LN)(图5)。令人遗憾的是，与其他副粘液病毒如RSV不同，外源基因在前导序列与NP基因之间的插入未产生一种存活的病毒。已经生成了PIV5-H5HL(还被称为ZL48)。这种重组病毒保护了致死性高致病性禽流感H5N1(HPAI)激发(参见图2)。已经尝试了其他基因接点，并且确定V/P与M之间的接点和SH与HN之间的接点适合于外源基因的插入。当H5基因更靠近前导序列时，外源基因的表达水平更高。最重要地，具有更靠近前导序列的H5的重组PIV5在产生针对所希望的抗原的免疫性方面表现更好(图6A至图6C)。
突变体PIV5病毒作为疫苗载体。细胞凋亡在抗原呈递中起重要作用。凋亡细胞是专职性APC如树突细胞的抗原的来源。据认为通过病毒感染激活的细胞凋亡途径也可以在抗原呈递中起作用，并且不同的细胞凋亡途径可能不同地影响抗原呈递。野生型PIV5感染不会诱导细胞死亡。然而，已经证明缺乏小疏水(SH)基因的突变体PIV5病毒(PIV5ΔSH)或缺乏V蛋白的保守区的突变体PIV5病毒(PIV5VΔC)在感染的细胞中经由不同的细胞凋亡途径诱导细胞凋亡(孙等人，2004，病毒学杂志；78(10)：5068-78；以及林(Lin)等人，2003，病毒学杂志；77(6)：3371-83)。还已经报道，PIV5的V/P基因中的突变诱导细胞凋亡以及细胞因子表达(孙等人，2009，科学公共图书馆·病原学(PLoS Pathog)；5(7)：e1000525)。很可能地，诱导细胞凋亡以及细胞因子的突变体PIV5病毒将是比野生型PIV5更好的用于呈递外源抗原如H5N1蛋白的载体。已经生成了表达外源抗原如H5N1的H5和NP的突变体重组PIV5，并且一些突变导致更好的保护，而一些突变对于一些抗原导致更少的保护。在rPIV5-NP、rPIV5ΔSH-NP以及rPIV5-P-S308G-NP(其包含在P蛋白的G的残基S308处的点突变)之中，rPIV5-P-S308G-NP具有最佳保护(图7A和图7B)。虽然rPIV5ΔSH-NP在致死性流感病毒激发后具有与rPIV5-NP相同的存活率，但是rPIV5ΔSH-NP损失了稍微多些的重量并且它们似乎比rPIV5-NP-免疫的小鼠病得更重。因此，从PIV5缺失SH基因似乎并未增强对于NP的免疫性，并且甚至可能是稍微有害的。有趣的是，在rPIV5-H5、rPIV5ΔSH-H5及rPIV5VΔC-H5-1以及rPIV5VΔC-H5-3的情况下，SH的缺失对免疫原性没有影响，其V/P基因中的突变似乎不利地影响免疫原性(图8A和图8B)。因为NP-介导的免疫性需要细胞免疫性，并且体液免疫性经常在HA-介导的免疫性中有效，所以SH的缺失可能不利地影响细胞免疫性并且V/P基因突变可能影响体液免疫性。
嵌合PIV5作为一种疫苗。为了降低基于PIV5的疫苗中来自生成PIV5的免疫性的干扰，希望降低靶向PIV5的宿主免疫性。PIV5蛋白将被来自预定的疫苗靶标的蛋白质替代。例如，PIV5的F和HN将被流感病毒的HA和NA替代(图9)。这将生成一种表达疫苗靶标的抗原的存活的嵌合PIV5，以最小化生成PIV5蛋白的免疫性的作用。
正在研发中的另外的候选疫苗。如在该实例中所示，PIV5是一种用于许多病原体(病毒以及细菌)的优异疫苗载体。另外的候选疫苗正在研发中，包括但不限于人疫苗，例如像，PIV5-HIV、PIV5-PIV2(副流感病毒2)、PIV5-RSV(呼吸道合胞病毒)、PIV5-尼帕病毒(对于人和猪来说)、以及PIV5-埃博拉病毒；和动物疫苗，例如像PIV5-狂犬病病毒(对于动物来说)、PIV5-PCV(猪环状病毒)、PIV5-PRRSV(猪生殖与呼吸综合征病毒)、以及PIV5-猪流感病毒。例如，基于PIV5的HIV候选疫苗已经生成并且在组织培养细胞中进行了测试，如图10A至图10C中所示。
实例2
在具有针对副流感病毒5的预先存在的免疫性的宿主中评估一种基于副流感病毒5的疫苗
关于PIV5用作载体的一个关键问题是先前暴露于PIV5是否将防止基于PIV5的疫苗的使用。在该实例中，在针对PIV5免疫的狗中对一种表达甲型流感病毒亚型3的血凝素(HA)的重组PIV5(rPIV5-H3)的免疫原性进行了检查。据发现用rPIV5-H3对含有针对PIV5的中和抗体的狗进行疫苗接种产生了针对甲型流感病毒的免疫性，从而指示基于PIV5的疫苗在具有先前暴露的狗中具有免疫原性。此外，对人群体中PIV5的暴露进行了检查。已经在45份人血清样品中的13份(约29％)中检测了针对PIV5的中和抗体(nAb)。人中的nAb滴度低于疫苗接种的狗中的nAb滴度，从而表明人中的nAb不太可能防止PIV5成为人中的一种有效载体。
据信PIV5可能导致狗中的狗舍咳(比恩等人，1967，实验生物学与医学会会报；126：140-145；罗森博格(Rosenberg)等人，1971，美国流行病学杂志(Am J Epidemiol)；94：147-165；康沃尔(Cornwell)等人，1976，兽医记录(Vet Rec)；102：293-301；以及畔高(Azetaka)和小西(Konishi)，1988，日本兽医科学杂志(Nippon Juigaku Zasshi)；50：851-858)。虽然用PIV5感染狗不会导致狗舍咳(克拉代克(Chladek)等人，1981，美国兽医研究杂志(Am J Vet Res)；42：266-270；和孔托尔(Kontor)等人，1981，美国兽医研究杂志；42：1694-1698)，但是含有减毒活PIV5的狗舍咳疫苗已经用于狗中30余年了。对狗进行鼻内疫苗接种，并且狗经常在疫苗接种期间打喷嚏，从而暴露兽医工作者以及所有者。含有活PIV5的狗舍咳疫苗的广泛使用表明PIV5可能是人中的一种安全的疫苗。表达亚型3(H3)的血凝素(HA)的重组PIV5的单剂量接种在小鼠中保护免受流感病毒激发(汤普金斯等人，2007，病毒学；362：139-150)，并且一种表达H5N1的HA的重组PIV5的低至1,000个噬斑形成单位(PFU)的单剂量疫苗接种在小鼠中保护高致病性禽流感病毒H5N1的致死性激发(参见实例3和李等人，2012，病毒学杂志；87(1)：354-62)。
关于PIV5用作载体的一个关键问题是先前暴露于PIV5是否将防止基于PIV5的疫苗的使用。该实例检查了一种表达流感病毒的HA(PIV5-HA)的重组PIV5在针对PIV5免疫的狗中的功效。此外，该实例检查了人中PIV5的暴露。
材料和方法
病毒和细胞。MDBK、BHK21以及Vero细胞在含有10％胎牛血清(FBS)和100 IU/ml青霉素-100μg/ml链霉素的杜氏改良的伊格尔培养基(DMEM)(英杰公司)中生长。如之前所描述来构建rPIV5-H3病毒(汤普斯金等人，2007，病毒学；362：139-150)，该rPIV5-H3病毒含有甲型流感病毒(A/乌隆/72，H3N2亚型)血凝素(HA)基因。使用含有2％FBS的DMEM使PIV5病毒在MDBK细胞中生长4至5天，并且如之前所报道通过在BHK21细胞上的噬斑测定来检查病毒滴度(何等人，1997，病毒学；237：249-260)。简单地说，将6孔板中的BHK21细胞用连续稀释的病毒(1∶101至1∶107)感染。在2小时(h)之后，将接种混合物去除并且用4 ml含有2％FBS、100 IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、以及1％低熔点琼脂糖的DMEM替代。在感染后4至6天(dpi)时对噬斑进行计数。每个时间点的两个重复被建立用于滴度计算。流行性腮腺炎病毒杰瑞尔林恩(Jeryl Lynn)(JL)疫苗株在Vero细胞中生长并且在4至7 dpi时收获。如之前所描述在Vero细胞中通过噬斑测定来测量病毒滴度(许(Xu)等人，2011，病毒学；417：126-136)。流感A/乌隆/72病毒在蛋中生长(帕特森和兰姆，1993，流感病毒和副粘液病毒的分子生物学(The molecular biology of influenza virruses and paramyxoviruses.)，于戴维森·A(Davidson A)、艾略特·RM(Elliott RM)编辑，分子病毒学：实用方法(MolecularVirology：A Practical Approach.)牛津：牛津大学出版社(Oxford：IRL OxfordUniversity Press.)第35至73页中)。
为了纯化PIV5和流行性腮腺炎病毒以用于ELISA测定，将澄清的上清液中的病毒在赛默科技(Thermo Scientific)超速离心机类型F40L-8×100转子中在37,000 rpm下沉淀1小时。然后将沉淀再悬浮于TNE缓冲液(10 mM Tris[pH 7.4]、100 mM NaCl、1 mM EDTA)中，并且负载到10％至80％蔗糖梯度上并且在TH-641转子中在37,000 rpm下离心1小时。收集病毒条带并且将其在F40L-8×100转子中在37,000 rpm下沉淀1小时。将纯化的病毒再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH 7.4)中。
关于动物使用的伦理声明。该研究是严格按照美国国立卫生研究院的实验室动物的护理和使用指南中的建议进行的。该方案经美国乔治亚大学(University of Georgia)的动物实验伦理委员会(Committee on the Ethics of Aninal Experiments)批准(许可号：A2011 12-012-Y1-A3)。尽全力使痛苦最小化。该研究中所使用的狗根据实验室动物的护理和使用指南(第八版)进行圈养和护理。
用PIV5或rPIV5-H3感染狗。该研究中使用的为特定目的饲养的狗购自科文斯研究产品公司(Covance Research Products)(弗吉尼亚州，坎伯兰郡，弗伦奇斯商店路482号(482 Frenchs Store Road，Cumberland，VA))。在第一实验中，将总计八只3个月大的PIV5疫苗初试的小猎犬分成两组，四只狗各自用PIV5或rPIV5-H3鼻内(IN)感染。用0.05至0.1mg/kg剂量的乙酰丙嗪(PromAce公司，道奇堡(Fort Dodge)，爱荷华州(IA))以肌内方式使狗镇静但不麻醉，以用于疫苗接种，以及根据需要用于血液收集和鼻拭子。在第0天(前血)和感染后第21天时收集血液样品。将血清从血液样品中分离并且储存在-20℃下。在感染后第3天和第5天(dpi)时获得鼻拭子。在第二实验中，将八只5个月大的PIV5疫苗接种的小猎犬分成经由鼻内途径免疫的PBS对照组(n＝2)和rPIV5-H3组(n＝6)。将狗在第0天和免疫后第21天时取血。在3 dpi和5 dpi时获得鼻拭子。各IN免疫涉及给予1 mL的PBS或含有8×107个噬斑形成单位(PFU)的rPIV5-H3。
使用RT-PCR检测病毒。为了从狗中获得鼻拭子，将聚酯尖端的柔性铝轴式涂覆器(普瑞登公司(Puritan)，缅因州(Maine)，美国)插入到鼻孔中直到在鼻咽处感受到阻力，然后旋转180度并且抽出。将拭子涂覆器移开并且将吸收性拭子放置到含有0.5 mL的具有2％FBS的DMEM的小瓶中。将小瓶储存在-70℃下。将样本进行涡旋，并且140μL体积用于使用QIAamp病毒RNA提取微型试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，加利福尼亚州(CA))根据制造商说明书进行总RNA提取。如之前所描述进行RT-PCR(孙等人，2011，病毒学杂志；85：8376-8385)。简单地说，使用上标(Superscript)III逆转录酶(英杰公司)将30μL总体积中的11μL纯化的RNA模板在20μL反应体积中进行扩增以生成病毒cDNA。随机引物用于RT中，而退火至基因组RNA的PIV5 P/V和M基因的基因特异性引物P/V-F1和M-R1用于PCR中。P/V-F1引物是5′-CCAGTGAGGCTCAGCTAATTGACCTC(SEQ ID NO：3)并且M-R1引物是5′-GGTATTCCCCCGATCCTGTTCGTAG(SEQ ID NO：4)。将来自RT的20μL总体积中的5μL cDNA用于50μL反应体积中的PCR。将病毒基因组的相对水平与具有已知滴度的PIV5病毒的病毒基因组水平进行比较。
ELISA。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定PIV5或流行性腮腺炎病毒特异性抗体滴度。将用100μl/孔的于PBS(pH 7.4)中的100 ng纯化的全PIV5病毒蛋白涂覆过夜的九十六孔ELISA板(赛默科技)首先用于洗涤溶液(KPL公司)中的0.5％BSA和0.5％脱脂奶粉封闭1小时，并且然后用KPL洗涤溶液洗涤三次。在封闭缓冲液中制备来自狗或人的血清的连续稀释液，并且将这些连续稀释液在室温下孵育1小时。将板洗涤三次并且用1∶2,000稀释的第二抗体，辣根过氧化酶(HRP)共轭的山羊抗狗IgG(圣克鲁斯公司(Santa Cruz)，加利福利亚洲)或山羊抗人IgG(KPL公司，盖瑟斯堡(Gaithersburg)，马里兰州(MD))孵育1小时。将板洗涤三次并且用SureBlue TMB 1-组分微孔过氧化酶底物(KPL公司)显影。通过添加相等体积的1N HC1终止显影，并且使用BioTek板阅读器在450nm下读取光密度(OD)。ELISA终点滴度被定义为最高血清稀释度，在该稀释度下重复孔的平均OD值是高于血清的平均OD值加2个标准偏差(SD)＞2倍。
测定针对PIV5的中和抗体(nAb)滴度。在血清样品中通过病毒中和测定来测量PIV5中和抗体滴度。将血清在含有2％FBS的50μl DMEM中连续稀释。将200 TCID50的PIV5病毒添加至稀释的血清中并且在37℃下孵育2小时。将血清和病毒添加至含有90％至100％汇合的MDBK细胞的96孔微量滴定板并且在37℃下孵育3天。通过间接免疫荧光测定(IFA)对单独的孔进行检查。将细胞用于PBS(pH 7.4)中的3.7％甲醛固定10分钟，并且然后用于PBS中的0.1％曲通X-100加1％FBS在室温下透化30分钟。将固定的细胞用第一抗体(在1∶400稀释下的小鼠抗-PIV5 NP抗体)在37℃下孵育1小时。FITC-共轭的山羊抗小鼠(1∶400稀释；KPL公司)用作第二抗体。中和抗体滴度是完全中和200 TCID50的PIV5病毒的最高血清稀释度。
HAI测定。血凝抑制(HAI)测定是根据关于动物流感诊断和监视的WHO手册(关于动物诊断和监视的WHO(2002)手册)进行。简单地说，将鸡红细胞(cRBC)洗涤并且在PBS中再悬浮至0.5％的最终浓度。将甲型流感病毒(A/乌隆/72，H3N2亚型)在PBS中调整至每25μl 4个血凝单位(HAU)。在96孔圆底板中，将25μl的单独RDE-处理的血清样品以两倍方式连续稀释。在制备连续稀释的血清之后，添加25μl(4 HAU)的稀释的病毒。将板轻轻地混合并且在室温下孵育1小时。然后将50 ul的0.5％cRBC添加至各孔中，轻轻地混合，并且在室温下孵育30至45分钟。通过将板以45度角倾斜来对血凝进行评分。HAI滴度是完全抑制血凝的最后稀释抗血清的倒数。
人血清样品。从45位随机志愿者收集人血液样品。参与者是健康的非妊娠的18至50岁的并且重量超过110磅。志愿者签署知情同意书表单。志愿者是匿名的。不收集个人数据。人受试者方案经乔治亚大学(UGA)机构审查委员会批准。在无抗凝剂的情况下将10mL静脉血通过静脉穿刺抽出到10mL管中。在凝固后，将血液样品在400g下离心5分钟。将不含细胞的上清液通过0.22μm孔径过滤器单元过滤并且用作血清。将血清样品储存在-80℃下。
统计分析。在该研究中，使用皮尔逊(Pearson)相关方法进行PIV5和JL的抗体的相关分析。选择在l∶320下的OD450读数，因为这些读数处于血清稀释的线性范围中。分析是在统计包R中使用cor.测试函数进行的(RDC团队(2003)威斯康星大学(University ofWisconsin)统计计算的R项目，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(WI))。当P值小于0.05时，考虑统计显著性差异。结果指示在PIV5与JL之间不存在显著相关，其中皮尔逊r等于0.06(p值＝0.6941)。
结果
用PIV5和rPIV5-H3感染“初试”狗。虽然于此包括的另外实例指示rPIV5-H3在小鼠中产生针对流感病毒的免疫性方面是有效的，但相同病毒是否可以在狗中产生免疫性方面有效尚不清楚。因此，将狗用rPIV5-H3经由鼻内途径接种，并且测定狗中病毒的复制，并且测量针对该病毒的免疫应答。将狗在低龄时(早在3周大时)用含有活PIV5的疫苗常规疫苗接种。通过动物销售商的安排，获得8只无活PIV5疫苗接种的12周龄的狗。使用ELISA和中和测定来测定这些狗中PIV5抗体的滴度。所有狗在ELISA中对于PIV5呈阳性(图11A)。然而，中和抗体(nAb)滴度是不可检测的(图11B)。将狗(n＝4)用PIV5或rPIV5-H3经由鼻内(IN)途径感染。在感染后第3天和第5天时，从感染的狗取得鼻拭子并且针对病毒的存在进行测定。虽然在使用噬斑测定分析拭子时没有检测到病毒(图12)，但在感染后3天(dpi)时在8只狗中的7只中检测到RT-PCR产物，并且在5 dpi时在8只狗中的5只中检测到非常弱的RT-PCR信号，从而表明在感染后3天时感染的狗的鼻孔中PIV5的有限复制并且感染在感染后5天时正在被清除。将狗在感染后21天时取血。在所有狗中检测到抗PIV5滴度的增加，从而表明狗被感染。使用HAI测定测量抗HA滴度指示所有rPIV5-H3接种的狗出现血清转化并且在感染后3周时具有平均42.5(从20至80的范围)的HAI滴度(图13)。在用PIV5接种的狗中没有检测到HAI。
用PIV5-HA感染暴露于PIV5的狗。为了检查具有先前PIV5暴露的狗是否仍然能够用基于重组PIV5的疫苗进行疫苗接种，获得针对PIV5多次疫苗接种并且具有抗PIV5中和抗体的狗(图14)。将狗用rPIV5-H3经由IN途径感染。在3和5 dpi时使用噬斑测定在感染的狗的鼻孔中没有检测到病毒。在3 dpi时使用RT-PCR测试到八只狗中的一只呈阳性(图15)。然后将狗在感染后3周时取血。用rPIV5-H3疫苗接种的狗具有在40至80之间范围(平均77，1只在40并且5只在80)的HAI滴度(图16)，从而指示rPIV5-H3疫苗接种产生针对流感病毒的免疫性(HAI滴度的4倍增加或40的HAI滴度被认为是针对流感病毒感染有保护性的)。针对PIV5的nAb滴度也在感染rPIV5-H3的狗中增加，从而证实这些狗被rPIV5-H3感染。
在人中暴露于PIV5。如之前所报道，已经在人中检测到抗PIV5抗体(戈斯瓦米(Goswami)等人，1984，普通病毒学杂志(J Gen Virol)；65：1295-1303；和戈斯瓦米等人，1987，自然(Nature)；327：244-247)。为了确定人中抗PIV5是否是由于来自针对密切相关的副粘液病毒的抗体的交叉反应性，在人血清中检查PIV5和流行性腮腺炎病毒的抗体滴度。流行性腮腺炎病毒(MuV)是与PIV5最密切相关的，因为它们具有相同的基因组结构。因为在美国由于疫苗接种和自然感染，人中流行性腮腺炎病毒暴露接近100％，所以预期在美国在从18至50岁收集的所有样品中进行抗流行性腮腺炎病毒抗体的检测。如所预期的，所有45份样品都是针对流行性腮腺炎病毒呈阳性的(图17A)。有趣的是，所有血清针对PIV5抗原以及在ELISA时都是阳性的(图17A)。如果人血清中针对PIV5抗原的反应性源于来自抗流行性腮腺炎病毒的交叉反应性，那么抗PIV5的滴度应与抗流行性腮腺炎病毒的滴度相关。然而，统计分析指示在血清中的抗-MuV滴度与血清中的抗-PIV5滴度之间不存在相关，从而表明人血清对PIV5的反应性不是由于来自流行性腮腺炎病毒的交叉反应性。此外，在人血清中检查针对PIV5的nAb的滴度并且在45份样品中的13份中(约29％)检测到抗-PIV5 nAb(图17B)。
讨论
自发现PIV5以来，将人中的许多疾病与PIV5相关联，其最终全部被证明是错误的。回想起来，存在为什么PIV5可能与这些疾病相关联的几种可能的解释。一个是基于在人研究中用于病毒分离的条件，即，实验室使用可以被PIV5持续感染的猴细胞系，并且这些细胞经常不显示可检测的致细胞病变作用(雄，1972，医学病毒学进展(Prog Med Virol)；14：241-274；和Chatziandreou等人，2004，普通病毒学杂志；85：3007-3016)。另一种可能性是PIV5与普遍存在的副粘液病毒如流行性腮腺炎病毒的抗原交叉反应性，这些副粘液病毒与PIV5密切相关并且在人群体中具有几乎100％暴露(兰德尔(Randall)和扬，1988，普通病毒学杂志；69(Pt 8)2051-2060；鹤留(Tsurudome)等人，1989，病毒学；171：38-48；以及驹田(Komada)等人，1991，病毒学文献；116：277-283)。该实例检查了PIV5在人群体中的暴露并且在人血清中发现抗PIV5抗体。有趣的是，没有检测到抗流行性腮腺炎病毒与抗PIV5的滴度之间的相关，从而表明PIV5阳性的人，至少他们中的一些可能已经暴露于PIV5。约29％的人血清样品具有针对PIV5的中和抗体。这些人血清样品中的一些不具有针对流行性腮腺炎病毒的稳健抗体(图17)，从而表明至少一些人已经与流行性腮腺炎病毒分开地暴露于PIV5。很可能狗与人之间的紧密接触可能是人暴露于来自狗的PIV5的影响因素。狗进行鼻内疫苗接种，并且经常在疫苗接种期间打喷嚏，从而暴露兽医工作者以及所有者。此外，在3dpi时使用RT-PCR在初试狗中检测到PIV5，从而表明有可能疫苗接种的狗可以在疫苗接种之后传播病毒，从而导致人暴露于该病毒。这与包含活PIV5的狗舍咳疫苗的广泛使用和大约40％的美国人群是狗所有者是一致的。
令人鼓舞的是，在较大百分比的美国人群中检测到PIV5抗体而未引起临床疾病，从而表明PIV5在人群体中是安全的。然而，因为较大百分比的美国人群可能已经暴露于PIV5，所以它带来了以下问题：PIV5是否将是用于在人中疫苗研发的有效载体。载体的先前暴露的同样问题已经对于使用基于腺病毒的载体用于疫苗研发造成了主要障碍。该实例发现表达HA的重组PIV5在具有针对PIV5的预先存在的免疫性的狗中具有免疫原性，从而指示基于PIV5的疫苗载体可以克服预先存在的免疫性。这些结果与在小鼠中针对PIV5的中和抗体不能预防PIV5感染的先前报道(扬等人，1990，病毒学杂志；64：5403-5411)一致。狗清除PIV5感染的能力仍未确定。在小鼠中，据认为细胞介导的免疫应答在清除PIV5感染中起关键作用(扬等人，1990，病毒学杂志；64：5403-5411)。由于PIV5在狗中具有自限制复制，所以很可能细胞介导的免疫性也在清除感染中起关键作用。因为细胞介导的免疫性需要时间来应答并且有效，所以该时间段为基于PIV5的活疫苗进行复制和产生稳健的免疫应答提供机会窗。这与PIV5感染所有种类的细胞(包括原代细胞)的观察结果一致(Arimilli等人，2006，病毒学杂志；80：3416-3427；汤普金斯等人，2007，病毒学；362：139-150；以及张等人，2011，病毒学；421：67-77)。
在疫苗接种的狗中针对PIV5的nAb滴度高于“初试”狗并且高达300(图14B)。所有具有针对PIV5的nAb的狗在rPIV5-H3的单剂量IN接种之后出现血清转化，并且抗H3抗体的滴度与针对PIV5的nAb滴度没有相关性，从而进一步证实PIV5的nAb在测定狗中针对基于PIV5的疫苗的免疫应答中不具有预测价值。人中针对PIV5的nAb的最高滴度是60，低于狗中针对PIV5的nAb的滴度。因此，人中针对PIV5的中和抗体可能将不防止基于PIV5的候选疫苗产生保护性免疫。
犬甲型流感病毒亚型H3的爆发已经在犬群体中出现(克劳福德等人，2005，科学(Science)；310：482-485；戴利(Daly)等人，2008，新兴传染病(Emerg Infect Dis)；14：461-464；以及李等人，2010，传染、遗传和进化(Infect Genet Evol)；10：1286-1288)。rPIV5-H3使狗出现血清转化并且产生被认为是保护性的免疫性的事实表明表达H3的重组PIV5可能是针对犬流感病毒的一种有效疫苗。此外，这些结果表明PIV5可以是用于表达其他抗原以用于狗、其他动物以及人的疫苗研发的一种新颖载体。
此外，猪已经感染了PIV5。虽然在感染后5天(dpi)时在鼻拭子中检测到PIV5，但在35 dpi时在内脏器官或组织中没有检测到PIV5，从而表明PIV5没有在猪中形成持续感染。
该实例已经为陈(Chen)等人，“在具有针对副流感病毒5的预先存在的免疫性的宿主中评估基于副流感病毒5的疫苗(Evaluating a Parainfluenza Virus 5-BasedVaccine in a Host with Pre-Existing Immunity against Parainfluenza Virus 5)”，公共科学图书馆·综合(PLoS One)；2012；7(11)：e50144；doi：10.1371/杂志.pone.0050144，2012年11月20日电子出版公开，该文献通过引用以其全文结合在此。
实例3
表达甲型流感病毒H5N1的HA的重组副流感病毒5保护小鼠免受致死性高致病性禽流感病毒H5N1激发
安全和有效的疫苗是预防人群体中大规模高致病性禽流感病毒(HPAI)H5N1爆发的最佳方式当前FDA批准的H5N1疫苗具有严重的局限性。迫切需要更有效的H5Nl疫苗。如在此所示，单剂量的表达来自H5N1亚型的H5N1的HA基因的活的重组PIV5(rPIV5-H5)提供针对小鼠中致死剂量的HPAI H5N1感染的消除性免疫。此外，在检查H5N1 HA插入在PIV5基因组内的不同位置处对基于PIV5的疫苗的功效的作用的情况下，显示H5Nl HA插入在前导序列(PIV5的事实上的启动子)与第一病毒基因NP之间不会产生存活的病毒。H5N1 HA插入在NP与下一个基因V/P之间产生在生长中有缺陷的病毒。H5N1 HA插入在SH基因与HN基因之间的接点处得到针对HPAI H5N1激发的最佳免疫性：低至1000个噬斑形成单位(PFU)的剂量足以在小鼠中保护免受致死性HPAI H5N1激发。因此，表达H5N1 HA的重组PIV5具有作为HPAIH5N1疫苗的巨大潜力。该实例测试了具有顺序插入在邻近前导序列的位点处的HA转基因的重组PIV5病毒的有效性。此外，PIV5用于表达H5N1高致病性禽流感(HPAI)病毒的HA并且在已建立的致死性HAPI激发小鼠模型中对其作为候选疫苗的有效性进行了测试。
材料和方法
细胞。BSR T7细胞的单层培养物维持在含有10％胎牛血清(FBS)、10％胰蛋白胨磷酸盐肉汤(TPB)以及400μg/ml G418的DMEM中。Vero细胞、MDBK细胞、MDCK细胞以及BHK细胞的单层培养物维持在含有10％FBS、100 IU/ml青霉素、以及100μg/ml链霉素的DMEM中。将所有细胞在37℃、5％C02下孵育使感染病毒的细胞生长在含有2％FBS的DMEM中。使用BHK细胞进行PIV5的噬斑测定并且使用MDCK细胞进行流感病毒的噬斑测定。
流感病毒。所使用的甲型流感病毒包括VNH5N1-PR8/CDC-RG(H5N1；由佐治亚州亚特兰大(Atlanta，GA)，CDC的鲁本·多尼斯博士(Dr.Ruben Donis)提供的rgVN-PR8)和A/越南/1203/04(H5N1；由田纳西州孟菲斯市(Memphis，TN)，圣犹大儿童研究医院(St.JudeChildren’s Research Hospital)的理查德·韦比(Richard Webby)提供)。将A/VN-PR8在37℃下在含胚胎的母鸡蛋的尿囊腔中繁殖48至72小时。β-丙内酯(BPL)-灭活的A/越南/1203/04是由来自圣犹大儿童研究医院(田纳西州孟菲斯市)的理查德·韦比提供。将A/越南/1203/04在37℃下在含胚胎的母鸡蛋的尿囊腔中繁殖24小时。将所有病毒分成等分并且储存在-80℃下。使用活的、高致病性禽流感病毒的所有实验经乔治亚大学的生物安全性项目机构审查并且批准，并且按照由CDC批准的选择药剂的使用指南在3级生物安全等级增强型防护下进行。
小鼠。雌性6至8周大的BALB/c小鼠(查尔斯河实验室(Charles River Labs)，弗雷德里克(Frederick)，马里兰州)用于所有研究。使用BSL2病毒的小鼠免疫和研究是在HEPA过滤的隔离器中的增强的BSL2设施中进行。小鼠HPAI感染是按照由乔治亚大学的生物安全性项目机构批准的和由CDC批准的选择药剂使用的指南在HEPA过滤的隔离器中的增强的BSL3设施中进行。所有动物研究是在经佐治亚大学的动物护理和使用委员会审查并且批准的方案下进行。
重组质粒的构建。为了生成ZL48(rPIV5-H5-HN/L)质粒，将含有PIV5的全长基因组和在HN与L基因之间的额外EGFP基因插入的质粒BH311中的GFP的编码序列用H5N1的HA基因替代。为了生成ZL46(rPIV5-H5-SH/HN)、ZL209(rPIV5-H5-NP/VP)、ZL215(rPIV5-H5-Le/NP)质粒，将含有PIV5的全长基因组的质粒BH276用作载体。为了生成ZL47(rPIV5-H5-VP/M)质粒，将含有PIV5的全长基因组的质粒pSV5-M-NS用作载体。含有H5N1 HA基因、无切割位点的质粒用作DNA模板以用于使用适当的寡核苷酸引物对进行PCR扩增。
拯救和序列重组PIV5。如之前所描述进行传染性重组PIV5的拯救(何等人，1997，病毒学；237：249-260)。简单地说，用Plus和Lipofectamine(英杰公司)将具有在HN与L基因之间的HA基因插入的编码PIV5的全长基因组的质粒pZL48、具有在SH与HN基因之间的HA基因插入的编码PIV5的全长基因组的质粒pZL46、具有在V/P与M基因之间的HA基因插入的编码PIV5的全长基因组的质粒pZL47、具有在NP与V/P基因之间的HA基因插入的编码PIV5的全长基因组的质粒pZL209、或具有在前导序列与NP基因之间的HA基因插入的编码PIV5的全长基因组的质粒pZL215，和编码NP蛋白、P蛋白以及L蛋白的三种辅助质粒pPIV5-NP、pPIV5-P、以及pPIV5-L在95％汇合下在6-cm板中共转染到BSR T7细胞中。所使用的质粒的量如下：5μg pZL48/ZL46/ZL47/ZL209/ZL215、1μg pPIV5-N、0.3μgpPIV5-P、以及1.5μg pPIV5-L。在3小时孵育之后，将转染培养基用含有10％FBS和10％TPB的DMEM替代。在37℃下72小时孵育之后，收获培养基，并且通过低速离心(3,000 rpm，10分钟)使细胞碎片沉淀。噬斑测定用于获得重组病毒的单个克隆。如之前所描述对ZL48、ZL46、ZL47、以及ZL209病毒的噬斑纯化的单个克隆的全长基因组进行测序(孙等人，2009，科学公共图书馆·病原学；5：e1000525；和孙等人，2011，病毒学杂志；85：8376-8385)。使用病毒RNA提取试剂盒(凯杰有限公司(Qiagen Inc)，加州瓦伦西亚(Valencia，CA))来纯化来自感染ZL48、ZL46、ZL47、以及ZL209病毒的Vero细胞的培养基的总RNA。使用随机六聚体(random hexamer)来制备cDNA，并且然后将该cDNA的等分试样使用适当的寡核苷酸引物对在PCR反应中进行扩增。
重组PIV5在体外和体内的生长。将于6孔板中的MDBK细胞用PIV5、ZL48、ZL46、或ZL47在0.1的MOI下感染。然后将这些细胞用PBS洗涤并且维持在DMEM-2％FBS中。在0、24、48、72、96、以及120 hpi时收集培养基。在BHK细胞上通过噬斑测定来测定病毒的滴度。
为了比较病毒在小鼠中的生长，将6周大的野生型BALB/c小鼠用100 1体积中的106 pfu的PIV5、ZL48、ZL46、或ZL47鼻内感染。在感染后4天时对小鼠实施安乐死并且收集肺以测定病毒滴度。
蛋白质表达的检测。在于6孔板中的MDBK细胞上进行免疫印迹，这些MDBK细胞用PIV5和ZL48在5的MOI下感染。在24 hpi时，将细胞用全细胞提取缓冲液(WCEB)(50 mMTris-HCl[pH 8]、280 mM NaCl、0.5％NP-40、0.2 mM EDTA、2 mM EGTA、以及10％甘油)溶解。将溶解产物在SDS-PAGE凝胶上运行并且用抗-H5N1 HA和抗-PIV5抗体进行免疫印迹。
H5N1 HA表达的免疫荧光在于24孔板中的MDBK细胞中进行，这些MDBK细胞用PIV5和ZL48在0.1的MOI下感染。在2 dpi时，将细胞用PBS洗涤并且然后固定在0.5％甲醛中。将细胞在0.1％PBS-皂苷溶液中透化，用以1∶200稀释的多克隆抗-PIV5-VP或抗-H5N1 HA孵育30分钟，然后将FITC-标记的山羊抗小鼠抗体添加至细胞中。将细胞孵育30分钟并且使用尼康(Nikon)FXA荧光显微镜进行检查并且照相。
使用于6孔板中的MDBK细胞来比较感染病毒的细胞中H5N1 HA的表达水平，这些MDBK细胞用PIV5、ZL48、ZL46、或ZL47在1的MOI下模拟感染。将细胞在24 hpi时收集并且用0.5％甲醛固定一小时。将固定的细胞通过离心沉淀并且然后再悬浮于500μl的含有胎牛血清(FBS)-DMEM(50∶50)的溶液中。将细胞在70％乙醇中透化过夜。将细胞用PBS洗涤一次并且然后用于PBS/1％BSA(1∶200)中的小鼠抗-H5N1 HA抗体在4℃下孵育1小时。将细胞用以藻红蛋白标记的抗小鼠抗体(1∶200)在4℃下在黑暗中染色1小时并且然后用PBS/1％BSA洗涤一次。使用流式细胞仪测量荧光强度。
ELISA。使用IgG ELISA测量HA(H5N1 HA)特异性血清抗体滴度。将Immulon 2 HB96孔微量滴定板(赛默实验室系统(ThermoLabSystems))用2μg/ml重组H5N1 HA蛋白涂覆并且在4℃下孵育过夜。然后将板用KPL洗涤溶液(KPL公司)洗涤并且将孔用200μl具有5％脱脂奶粉和0.5％BSA(封闭缓冲液)的KPL洗涤溶液在室温下封闭1小时。(在封闭缓冲液中)制备血清样品的连续稀释液并且将其转移至涂覆过的板中并且孵育1小时。为了检测结合的血清抗体，每孔添加100μl的于封闭缓冲液中的1∶1000稀释的碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG(KPL公司)并且在室温下孵育1小时。将板通过每孔添加100μl pNPP磷酸酶底物(KPL公司)显影并且使反应在室温下显影。在Bio-Tek Powerwave XS板阅读器上在405 nm下测量光密度(OD)。IgG滴度被测定为最低血清稀释度，其中OD大于初试血清的平均值加高于平均OD的2个标准偏差。
用PIV5感染小鼠。对于用PIV5和rPIV5-H5疫苗接种来说，将于50μlPBS中的106PFU PIV5、rPIV5-ZL46、或rPIV5-ZL48鼻内给予至用在叔戊醇中的2，2，2-三溴乙醇(阿佛丁(Avertin)；奥德里奇化学品公司(Aldrich Chemical Co))麻醉的小鼠。对于亚致死性rgVN-PR8感染来说，如针对PIV5疫苗接种所描述的给予于50μl PBS中的2000 PFU病毒。对于BPL灭活的A/VN/1203/04疫苗接种来说，然后将于50μl PBS中的256个血凝单位(HAU)/ml注射到各尾部大腿肌肉中。在免疫后第21天时收集血液。如果进行了加强，那么在初次后第28天重复这一过程。每日监测小鼠，并且对于一些实验来说，每隔一日记录体重。
中和抗体滴度的测量。用ELISA终点通过微中和测定在血清中测量流感中和抗体滴度。将热灭活的血清在具有1％BSA、抗生素/抗真菌剂、以及1μg/ml TPCK胰蛋白酶的DMEM中连续稀释。然后将稀释的血清与1000TCID50rg A/VN-PR8或rg A/Anhui-PR8在37℃下孵育两小时。然后添加MDCK细胞并且在37℃下孵育18至24小时。在孵育结束时，将孔用冰冷的甲醇和丙酮(对应地80∶20)固定并且如以上所描述进行ELISA。中和滴度被测定为能够中和1000 TCID50 rgA/VN-PR8或rgA/Anhui-PR8的最低血清稀释度，如通过高于背景OD两倍的OD读数所确定。
细胞应答。如所描述进行检测淋巴细胞中针对灭活的A/VN/1203/04的T细胞应答的ELISpot(汤普金斯等人，2007，新兴传染病；13：426-435)。将细胞用于50μl完全肿瘤培养基(CTM)中的灭活的A/VN/1203/04(相当于每孔10 HAU)、作为不相关的肽的埃博拉GP P2EYLFEVDNL(1μg/ml)、以及PMA/离子霉素(分别25 ng/ml；1.25 ng/ml)再刺激。使用AIDViruSpot阅读器(细胞技术公司(Cell Technology，Inc))对斑点进行计数。
用甲型流感病毒感染小鼠。如以上所描述将BALB/c小鼠首先用野生型PIV5、rPIV5-ZL46、rPIV5-ZL48 IN、或灭活的A/VN/1203/04 IM疫苗接种。在疫苗接种后21天，将小鼠经由尾静脉取血以用于血清分析。在疫苗接种后第24天时，将小鼠麻醉并且用稀释于50μl PBS中的10 LD50A/越南/1203/04鼻内接种。然后针对发病率和死亡率每日监测小鼠，同时每隔一日测量体重。在激发后第3天时，对多组小鼠实施安乐死并且将其肺收集到1.0ml PBS中并且均质化。然后通过离心使匀浆澄清。然后如所描述使用TCID50测定来测定澄清的匀浆中的病毒滴度(索伯斯基(Soboleski)等人，2011，公共科学图书馆·综合；6：e21937)。
结果
体外生成并且分析表达H5N1的HA的重组PIV5(rPIV5-H5)为了测试表达H5N1的HA的重组PIV5是否能够保护小鼠免受致死性激发HPAIH5N1，将无多元切割位点的HPAI H5N1的HA基因(堀本(Horimoto)和河冈(Kawaoka)，1994，病毒学杂志；68：2130-3128；以及Suguitan等人，2012，病毒学杂志；86：2706-2714)插入到在PIV5(ZL48)的HN与L基因之间的接点处含有PIV5的全长cDNA基因组的质粒中(图18A)。如之前所描述通过将该质粒连同编码NP、P以及L的质粒转染到BSR T7细胞中来回收传染性病毒ZL48(rPIV5-H5)(孙等人，2011，病毒学杂志；85：8376-8385)。将回收的病毒进行噬斑纯化并且在Vero细胞中生长。使用直接RT-PCR测序对噬斑纯化的病毒的全长基因组进行测序。使大批病毒在MDBK细胞中生长。病毒的滴度是108 pfu/ml(图18B)。使用免疫印迹(图19A)和免疫荧光(图19B)来证实来自感染ZL48的细胞的H5N1 HA的表达。ZL48与野生型PIV5类似地生长，如低MOI生长曲线中所示(图19C)。
小鼠中rPIV5-H5的免疫原性。为了确定ZL48是否能够在体内产生HA特异性免疫，将小鼠用106 pfu的ZL48或野生型PIV5的单个剂量鼻内感染，并且将免疫应答与用H5N1反向遗传学疫苗构建体(rgVN-PR8)感染的或用灭活的H5N1病毒(iA VN)免疫的小鼠进行比较。将小鼠在接种/免疫后21天时取血。使用ELISA测定抗-HA IgG的血清水平(图20A和图20B)。ZL48感染产生与灭活的H5N1病毒粒子和包含来自PR8的内部基因和来自H5N1的HA和NA的重组H5N1相当的和平衡水平的IgG1和IgG2a。来自感染ZL48的小鼠的血清的中和抗体(nAb)滴度较低(图20C)。然而，在21dpi时的加强使血清nAb的水平提高至被认为是保护性的水平。使用Elispot测定来检查细胞应答。感染ZL48的小鼠产生细胞应答(图20D)。虽然与感染反向遗传学H5N1病毒的小鼠相比，Th1(产生IFNγ的T细胞)应答是有限的，但与仅具有流感HA的ZL48相比，这些小鼠具有针对完整流感病毒的应答，包括包含在内部和非结构蛋白细胞中的免疫显性抗原(维迪耶罗(Vitiello)等人，1996，免疫学杂志；157：5555-5562)，并且将淋巴细胞用全病毒再刺激。
小鼠中针对重组H5N1流感病毒激发的rPIV5-H5的功效。由于成本和相对低的nAb滴度，首先使用包含来自PR8的所有内部基因和来自HPAI H5N1的HA和NA(其中HA内的多元切割位点被去除)的重组流感病毒rgVN-PR8(H5N1)在小鼠中检查针对同型病毒激发的ZL48的功效。这种病毒在小鼠中的毒性比野生型HPAI H5N1在小鼠中的毒性要低，并且可以用于BSL2生物防护(biocontainment)中。将小鼠用106 pfu的ZL48或野生型PIV5的单个剂量经由鼻内途径免疫。一组单独的小鼠接受灭活的H5N1病毒(iA VN)作为阳性对照。将小鼠在免疫后21天时用1,000 TCID50 rgA-PR8(H5N1)激发。因为rgVN-PR8(H5N1)不会在小鼠中造成死亡，所以在小鼠的肺中使用激发病毒的滴度来检查ZL48免疫的功效。在激发后4天时在ZL48免疫的小鼠的肺中没有检测到rgVN-PR8(H5N1)病毒(图21A和图21B)，从而表明ZL48在预防H5N1感染方面是有效的。
小鼠中针对HPAI H5N1激发的rPIV5-H5的功效。在小鼠中用A/越南/1203/2004株检查针对HPAI H5N1的ZL48的功效(Govorkova等人，2005，病毒学杂志；79：2191-2198)。将小鼠用106 pfu的ZL48的单个剂量经由鼻内途径免疫。将小鼠在免疫后21天时用H5N1激发。PIV5免疫的小鼠损失大量体重并且它们中的90％到激发后第10天死亡，并且所有都在激发后第14天时死亡(图225B)。相比之下，所有用ZL48免疫的小鼠在激发中存活并且在实验时间期间没有观察到重量损失(图22A)。此外，在ZL48免疫的小鼠的肺中没有检测到激发病毒(图22C)，从而指示ZL48在预防小鼠中的H5N1感染方面是有效的。
生成表达PIV5基因组内的不同位置处的H5N1的HA的重组PIV5(rPIV5-H5)并且在体外和体内对它们进行分析。与前导序列(PIV5的唯一事实上的启动子)的距离相反地影响基因表达水平。其中插入ZL48中的H5N1 HA的HN基因与L基因之间的基因接点与PIV5中的前导序列距离最远(图18A)。使H5N1 HA从HN-L基因接点移动更靠近前导序列将增加H5N1 HA蛋白的基因表达水平的水平。推理，增加H5N1 HA的表达水平将提高疫苗的功效，所以将H5N1 HA基因插入在前导序列与NP基因之间。令人遗憾的是，虽然生成了具有在前导序列与NP基因之间的一个插入的质粒，但该质粒不能生成存活的传染性病毒(图18)，从而表明插入对病毒生命周期来说是有害的。然后将H5N1 HA基因插入在下一个基因接点，NP与V/P基因接点处(ZL209)。虽然从质粒ZL209回收了重组病毒，但这些病毒在组织培养细胞中生长得不好。此外，这些病毒包含在其他位点处的突变(参见，例如，图18B)。将H5N1 HA基因插入在为V/P与M基因接点的下一个基因接点处(ZL47，图18)以及插入在SH与HN的接点处(ZL46，图18)。ZL46和ZL48与野生型PIV5类似地生长，而ZL47具有滴度的稍微降低(图23A)。H5N1HA的表达水平在感染ZL46的细胞中最高，而在感染ZL47的细胞中H5N1 HA的水平与感染ZL48的细胞中H5N1 HA的水平类似(图23B)。通过测定感染的小鼠的肺中病毒的滴度来比较这些病毒在小鼠中复制的能力。PIV5和ZL46的滴度在感染后4天时类似(图24)。感染ZL48和ZL47的小鼠的肺中病毒的滴度低于感染PIV5或ZL46的小鼠的肺中病毒的滴度。平均来说，ZL47最低(图24)(然而，ZL47与ZL48之间的差异不是统计学上有意义的)。
测定小鼠中针对HPAI H5N1激发的表达H5N1 HA的重组PIV5H5的功效。因为所有表达H5N1 HA的重组PIV5疫苗在单个高接种剂量(106 pfu)之后在小鼠中提供针对H5N1激发的完全保护，所以进行剂量-应答研究以确定PIV5基因组内H5N1 HA基因的位置是否改变疫苗的功效。将小鼠用ZL46、ZL47以及ZL48在103、104或105 pfu的剂量下经由鼻内途径感染。将小鼠在21 dpi时取血并且分析血清。
所有用104 pfu及以上的ZL46、ZL47或ZL48接种的小鼠在致死性H5N1激发中存活。然而，低剂量免疫揭示不同结果。一千(103)pfu的ZL46保护100％小鼠免受用HPAI H5N1的致死性激发，而ZL48保护70％免疫的动物并且ZL47仅保护30％的小鼠(图258A)，从而表明H5N1 HA基因插入在SH与HN之间能够实现保护性免疫应答的最有效的引发。检查体重损失，观察到类似趋势。在103接种物下，用ZL47免疫的小鼠具有最大的重量损失，而ZL46具有最小的重量损失(图25B)。在104接种物下，ZL48和ZL46类似地保护免受重量损失，而ZL47免疫的小鼠仍然损失10％至15％的其起始重量(图25C)。在105及更高免疫剂量下，所有小鼠均类似地保护免受由于HPAI感染所致的重量损失(图25D)。
讨论
在该实例中，在小鼠中针对用毒性最强的流感病毒HPAI H5N1激发对表达H5N1的HA的重组PIV5进行了测试。这种重组疫苗在保护小鼠免受HPAI H5N1激发方面是有效的(即使在非常低的剂量下)，从而指示PIV5是用于研发H5N1疫苗的存活载体。当前，针对H5N1的唯一FDA批准的疫苗具有严重局限性，特别是因为它必须被给予两次并且与常规流感疫苗相比要求显著更高浓度的疫苗来实现适度水平的功效。利用H5N1病毒的HA和NA的常规疫苗一直是免疫原性较弱的并且具有安全性和生产问题(综述于斯蒂芬森(Stephenson)等人，2004，柳叶刀：传染病(Lancet Infect Dis)；4：499-509中)。基于PIV5的H5N1疫苗具有超过当前FDA批准的H5N1疫苗的优点，因为基于PIV5的H5N1疫苗如ZL46能够在单个和低剂量(每只小鼠103 PFU)情况下产生保护性免疫，同时该疫苗能够在组织培养细胞中生长至108PFU/ml，而不需要不含特定病原体的蛋，并且该疫苗的生产不会对工人造成健康风险。此外，由于基于PIV5的H5N1疫苗具有成本效益性质，所以有可能在H5N1的动物载体如鸡上使用它。
副粘液病毒如PIV5仅起始前导序列处的转录。因此，与前导序列的距离与病毒基因的水平成反比例。HN基因与L基因之间的基因接点与PIV5中的前导序列距离最远。它已经经常用于插入外源基因以避免插入外源基因的任何潜在不良作用(何等人，1997，病毒学；237：249-260；和汤普金斯等人，2007，病毒学；362：139-150)(图18)。使H5N1 HA从HN-L基因接点移动更靠近前导序列会增加基因表达的水平。有趣的是，在前导序列与NP基因之间插入外源基因不会产生存活的病毒，从而表明插入对病毒生命周期来说是有害的，并且前导序列与NP基因之间的区域对于PIV5复制来说是关键的。虽然H5N1 HA插入在NP与V/P之间生成存活的病毒，但该病毒在其生长中是有缺陷的并且突变出现在回收的病毒的其他区域中，从而表明该区域对于病毒复制来说也是重要的。之前已经报道，NP表达与V/P基因表达的比例对于微型基因组系统中的最优病毒复制来说是关键的(林等人，2005，病毒学；338：270-280)。很可能H5N1 HA插入在NP与V/P之间破坏了NP与V/P的比例，从而导致病毒复制中的缺陷。这个结果与GFP插入在VSV的N与P之间类似。虽然ZL46、ZL47以及ZL48在小鼠中在低至每只小鼠104 pfu的单个接种剂量之后都提供针对H5N1激发的完全保护，但出人意料地H5N1HA插入在V/P与M之间不提供比ZL48(插入在HN与L之间)或ZL46(插入在SH与HN之间)更好的保护。有可能V/P与M之间的插入在体外(图23)和体内(图24)不利地影响重组病毒的复制，从而产生不太有效的候选疫苗。在一个以下实例中，显示活的重组PIV5是有效疫苗接种所需的。这些结果指示病毒在体内的适合度和PIV5基因组内的插入位点对候选疫苗的功效具有主要影响。
针对流感病毒的中和抗体是保护性免疫的标志。然而，在使用表达H5N1的H5N1 HA的重组PIV5的更低剂量的接种下，仅仅检测到较低水平的nAb，但小鼠仍被完全保护。这些结果表明来自活疫苗的细胞介导的免疫应答可能有助于针对高致病性流感病毒激发的保护。这通过利用流感的NP蛋白作为疫苗抗原的研究得到支持(爱泼斯坦(Epstein)等人，2005，疫苗；23：5404-5410)。有趣的是ZL48的加强在小鼠中增强了免疫性，从而表明初次接种不能预防再次免疫或基于PIV5的疫苗的感染。这与在小鼠中针对PIV5的中和抗体不能预防PIV5感染的报道(扬等人，1990，病毒学杂志；64：5403-5411)一致。虽然人们已经暴露于PIV5，但PIV5与人疾病不相关，从而表明PIV5对于在人中使用来说可能是安全的。
该实例已经为李等人，“表达甲型流感病毒H5N1的血凝素的重组副流感病毒5保护小鼠免受致死性高致病性禽流感病毒H5N1激发”，病毒学杂志，2013年1月；87(1)：354-62.doi：10.1128/JVI.02321-12.2012年10月17日电子出版公开，该文献通过引用以其全文结合于此。
实例4
基于一种表达狂犬病病毒糖蛋白的重组副流感病毒5的狂犬病疫苗
需要有效的和有成本效益的狂犬病疫苗。在该实例中，在小鼠中对以PIV5为载体的狂犬病疫苗进行了测试。将编码RABV糖蛋白(G)的重组PIV5(rPIV5-RV-G)经由鼻内(IN)、肌内(IM)以及口服接种给予至小鼠。将疫苗接种的小鼠用50致死性脑内狂犬病激发剂量(LD50)的CVS-24进行激发。当经由IN途径给予时，106 PFU的rPIV5-RV-G的单个剂量足以用于100％保护。用108 PFU的rPIV5-RV-G的单个剂量经由IM途径疫苗接种的小鼠提供非常稳健的保护(90％至100％)。有趣的是，用108 PFU的rPIV5-RV-G的单个剂量口服疫苗接种的小鼠显示50％存活率，这与减毒的狂犬病疫苗株rLBNSE-接种的小鼠的60％存活率是可比的。这是动物中基于PIV5作为载体的口服有效的狂犬病候选疫苗的首次报道，并且指示rPIV5-RV-G是用于新一代重组狂犬病疫苗的优异候选物并且PIV5是用于口服疫苗的潜在载体。
作为人兽互传疾病之一，狂犬病病毒(RABV)感染在温血动物(包括人)中导致狂犬病，其特征在于在无暴露后治疗的情况下，在早期时的急性脑炎和在晚期时的死亡(鲁普雷希特等人，2006，抗感染治疗专家评论；4：1021-1038)。未治疗的狂犬病病毒(RABV)感染导致死亡。疫苗和暴露后治疗在预防RABV感染中一直有效。然而，由于成本，狂犬病疫苗接种和治疗尚未在发展中国家中广泛使用。每年报道大约55,000例由狂犬病引起的人死亡，其中这些病例中的大多数出现在发展中国家(参见，例如，马丁内斯(Martinez)，2000，国际传染病杂志(Int J Infect Dis)；4：222-228)。流浪狗、野生食肉动物以及蝙蝠是野生RABV的天然储主，并且这些狂犬病携带者是人和家养动物的公共健康风险。人狂犬病发生在很大程度上归因于发展中国家中流浪狗的咬伤，其中动物的疫苗接种是有限的，尤其是在农村地区。
疫苗接种是针对RABV感染的最有效的暴露前治疗方法，并且已经在人和储主动物二者中使用。对于暴露后治疗来说，灭活的细胞培养疫苗的多次接种和免疫球蛋白的注射一起使用来预防狂犬病的发展。然而，狂犬病疫苗免疫和免疫球蛋白治疗对于发展中国家的农村或偏远地区中的家庭来说是相对昂贵的(克诺贝尔(Knobel)等人，2005，世界卫生组织通报(Bull World Health Organ)；83：360-368)。对流浪狗进行疫苗接种也是预防狂犬病感染的潜在具有成本效益的策略。因此，需要有效的和有成本效益的疫苗。为了对流浪狗进行疫苗接种，无针疫苗接种如口服免疫将是理想的。
当前，杀死的狂犬病疫苗是从鸡胚细胞、BHK细胞、或Vero细胞制备的，并且可供经由肌内(IM)注射用于人使用和宠物动物(吴(Wu)等人，2011，疫苗专家评论(Expert RevVaccines)；10：1597-1608)。暴露前狂犬病疫苗常规通过灭活疫苗的三次连续注射给予。对于家养动物和野生动物中的狂犬病预防来说，已经研发了减毒活狂犬病疫苗(基于SAD和ERA的改良的活狂犬病疫苗)和基于表达RABV G(V-RG)的痘苗病毒的重组狂犬病疫苗(基尼(Kieny)等人，1984，自然；312：4；梅斯兰(Meslin)等人，1994，微生物学和免疫学的当前课题；187：26；以及维克托(Wiktor)等人，1984，美国国家科学院院刊；81：7194-7198)。尽管这些疫苗在许多物种中产生良好的保护性免疫应答，但在狗和臭鼬中观察到较弱的保护性免疫(默里(Murray)等人，2009，美国兽医协会杂志；235：691-695；鲁普雷希特等人，2001，新英格兰医学杂志(N Engl J Med)；345：5；以及托尔森(Tolson)等人，1987，加拿大兽医学杂志(Can J Vet Res)；51：363-366)。使用减毒活RABV还提出了关于由于RNA基因组突变、由疫苗超剂量或靶物种的变化引起的残留毒力所致的回复至病原表型的安全问题。据报道痘苗病毒作为疫苗在人中引起局部和全身性不良反应，并且据报道以痘苗病毒为载体的狂犬病疫苗(V-RG)也在人中引起反应(CDC，2009，发病率和死亡率周报(MMWR)58：4；和鲁普雷希特等人，1990，J Wildl Dis；26：99-102)。虽然表达RV G的改良的痘苗病毒安卡拉(Ankara)(MVA)在此之后已经被研发为广泛使用的V-RG疫苗的更安全的替代物，但重组MVA的口服免疫在先前暴露的情况下未能在狗和浣熊中诱导记忆免疫应答(韦耶(Weyer)等人，2009，疫苗；27：7198-7201)。因此，需要研发用于动物以及人的一种有效的和安全的狂犬病疫苗。对于对野生动物进行疫苗接种来说，需要可以口服给予的狂犬病疫苗。
为弹状病毒科的狂犬病病毒属成员的RABV是一种具有弹状结构的单链反义基因组的包膜RNA病毒。RNA基因组编码五种结构基因，顺序如下：核蛋白(N)；磷蛋白(P)；基质蛋白(M)；糖蛋白(G)；以及病毒RNA聚合酶(L)(9)。N蛋白、P蛋白、L蛋白与病毒RNA基因组组合以形成核糖核蛋白(RNP)。RABV G是病毒中和抗体的主要抗原(科克斯(Cox)等人，1977，传染与免疫(Infect Immun)；16：754-759)。
5型副流感病毒(PIV5)是具有大小为约15千碱基的基因组的非节段性负链RNA病毒并且属于副粘液病毒科的家族。PIV5感染广泛细胞系而无显著的致细胞病变作用(CPE)，这支持PIV5在传代细胞系中生长以获得高滴度，从而提供用于大批量生产的经济手段。存在PIV5与人疾病的关联，不存在病毒基因组整合到宿主DNA中的风险，并且负链RNA病毒基因组优于正义RNA病毒的稳定性表明PIV5是一种良好的疫苗载体和蛋白质表达工具。因为含有活PIV5的狗舍咳疫苗已经在狗中使用了许多年，而没有引起对于动物或人的安全问题，所以表达RABV G的PIV5将是用于狗的一种有效的疫苗并且它可以容易地并入到现有狗疫苗接种计划中。该实例证明表达RABV G的PIV5作为一种新颖的狂犬病疫苗。
材料和方法
细胞。BHK21细胞、BSR-T7细胞以及BSR细胞(源自BHK21细胞的一种克隆细胞系)(沙曼托(Sarmento)等人，2006，病毒学研究(Virus Res)；121：144-151)维持在具有10％胰蛋白胨磷酸盐肉汤、10％胎牛血清(FBS)以及1％青霉素-链霉素的杜氏改良的伊格尔培养基(DMEM)中。MDBK细胞在具有10％FBS的DMEM中生长。小鼠成神经细胞瘤(NA)细胞维持在补充有10％FBS的RPMI 1640培养基中。将G418添加至BSR-T7细胞的培养基中以制得400μg/ml的最终浓度。对于病毒感染来说，将单细胞层用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并且然后用于DMEM加1％牛血清白蛋白中的病毒接种。然后将单细胞层用PBS洗涤并且用含有2％FBS的DMEM在37℃、5％CO2下孵育。
病毒。野生型PIV5在之前进行了描述(何等人，1997，病毒学；237：249-260)。为了浓缩PIV5，将含有病毒的上清液负载到20％蔗糖上并且在赛默科技超速离心机类型F40L-8×100转子中在37,000 rpm下沉淀1小时。然后将沉淀再悬浮于具有1％BSA的DMEM培养基中并且储存在-70℃下。将哺乳期小鼠脑适应的CVS-24狂犬病病毒株(其中CVS是激发病毒标准)在哺乳期小鼠中繁殖。狂犬病疫苗株LBNSE源自之前报道的L16株(温(Wen)等人，2011，病毒学杂志；85：1634-1644)，并且在BSR细胞中生长。激发病毒标准11(CVS-11)在NA细胞中繁殖。针对RV-N蛋白的异硫氰酸荧光素(FITC)共轭的抗体购自富士瑞必欧诊断产品公司(Fujirebio Diagnostics，Inc.)(宾夕法尼亚州马尔文(Malvem，PA))。
病毒感染性克隆的构建。PIV5感染性克隆质粒pBH311包含绿色荧光蛋白(GFP)基因作为PIV5基因组中HN基因与L基因之间的额外基因并且GFP进行了表达(何等人，1997，病毒学；237：249-260)。
全长RABV G基因(1，575个核苷酸)通过PCR从含有来自RABV ERA株的G基因的质粒进行扩增。引物序列是如下：
RV-G1，5′AACAAGCGGCGGCCGCCGCCACCATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGT AC(SEQ IDNO：5)；和RV-G2，5′AACAAGCGCGGCCGCTCACAGTCTGGTCTCACCCC CACTC(SEQ ID NO：6)。将PCR片段插入到PIV5感染性克隆载体中以生成在HN与L之间含有RABV G作为额外基因的质粒pPIV5-RV-G。rPIV5-RV-G基因组的长度被维持为6的倍数。
rPIV5-RV-G病毒的拯救。为了拯救rPIV5-RV-G病毒，将质粒pPIV5-RV-G(3μg)连同质粒pCAGGS-PIV5-L(1.5μg)、pCAGGS-PIV5-NP(1μg)、以及pCAGGS-PIV5-P(200 ng)转染到BSRT-7细胞中。在转染后4天，收集含有rPIV5-RV-G的上清液并且在BHK21细胞中噬斑纯化。选择噬斑(感染后4至7天[dpi]形成)并且在MDBK细胞中进一步扩增。使用QIAmp病毒RNA微型试剂盒从上清液提取RNA，并且用随机引物进行反转录(RT)。使用结合HN 3′端或L 5′端的特异性引物通过PCR进一步扩增反转录产物。引物序列是如下：311-10699-F1，5′CAGATTGTCCCATTTATCCGTCAGGTGAC(SEQ ID NO：7)；和311-11764-R1，5′AGGTCGATCTCATTTGGGAGGTTTCCAAG(SEQ ID NO：8)。对PCR产物进行测序。
生长曲线和噬斑测定。将于6孔板中的MDBK细胞用PIV5或rPIV5-RV-G在0.01的MOI下感染。在感染后0、1、2、3、4、以及5天时收集上清液。对于高MOI感染，将于6孔板中的MDBK细胞用PIV5或rPIV5-RV-G在5的MOI下感染，并且在感染后0、12、24、36、48、以及60小时时收集上清液。将于6孔板中的BHK21细胞用连续稀释(1∶10至1∶106)的病毒原种感染。在2小时之后，将接种混合物去除并且用5 ml含有2％FBS、100 IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、以及1％低熔点琼脂糖的DMEM替代。在感染后5至6天时对噬斑进行计数。每个时间点使用两个复制。
间接免疫荧光测定。为了检测RABV G的表达，将感染rPIV5-RV-G的MDBK细胞通过间接免疫荧光测定(IFA)进行检查(陈等人，2010，病毒学；398：87-97)。简单地说，将细胞用于PBS(pH 7.4)中的3.7％甲醛固定10分钟，并且然后用于PBS中的0.1％曲通X-100加1％FBS在室温下透化30分钟。将固定的细胞用第一抗体(在1∶200稀释下的小鼠抗-RABV-G抗体；诺伟思生物制剂公司(Novus biologicals，Inc))在37℃下孵育1小时。FITC-共轭的山羊抗小鼠(1∶200稀释；KPL公司)用作第二抗体。
蛋白质印迹法。将感染rPIV5-RV-G的MDBK细胞用全细胞提取缓冲液(WCEB)(50 mMTris-HC1[pH 8]、280 mM NaC1、0.5％NP-40、0.2 mM EDTA、2 mM EGTA、以及10％甘油)溶解(Timani等人，2008，病毒学杂志；82：9123-9133)。将溶解产物通过在4000 rpm下离心15分钟澄清并且将上清液与相同体积的2×SDS负载缓冲液(100 mM Tris-HC1[pH 6.8]、20％甘油、4％SDS、200 mM二硫苏糖醇[DTT]、以及0.1％溴酚蓝)混合，在95℃下加热5分钟，并且通过10％SDS-PAGE解析。使用iBlot干印迹系统(英杰公司)将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜与小鼠抗-RABV-G抗体(1∶2000稀释)或小鼠抗-PIV5-V/P抗体(1∶2000稀释，用于PIV5病毒感染对照)孵育(孙等人，2011，病毒学杂志；85：10261-10268)，接着与在1∶2000稀释下的用辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗小鼠第二抗体孵育。在洗涤之后，将PVDF膜与ECL Advance底物(通用电气医疗集团)孵育并且使用Kodak Image Station 440进行扫描。
病毒的纯化。为了确定RABV G是否并入到重组PIV5颗粒中，将澄清的上清液中的病毒负载到20％蔗糖上并且在赛默科技超速离心机类型F40L-8×100转子中在37,000 rpm下沉淀1小时。然后将沉淀再悬浮于TNE缓冲液(10 mM Tris[pH 7.4]、100 mM NaC1、1 mMEDTA)中，并且负载到10％至80％蔗糖梯度上并且在TH-641转子中在37，000 rpm下离心1小时。收集病毒条带并且将其在F40L-8×100转予中在37，000 rpm下沉淀1小时。将纯化的病毒再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH 7.4)中。使来自纯化的病毒颗粒的蛋白质经受SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。
动物研究。六至八周大的雌性BALB/c小鼠用于动物研究中。所有动物实验是按照经佐治亚大学的动物护理和使用委员会批准的方案进行的。小鼠免疫是通过鼻内(IN)、肌内(IM)、或口服途径进行。对于鼻内免疫来说，将六周大的BALB/c小鼠首先通过用阿佛丁(180至250 ul/kg)腹膜内注射麻醉并且然后通过在不同剂量下滴加100μl rPIV5-RV-G或PIV5鼻内接种。PBS处理的小鼠用作对照。三周之后，将小鼠通过两个剂量反应实验中的相同剂量的第一接种进行加强。小鼠还经由口服给予rPIV5-RV-G颗粒或在后肢的大腿肌肉中在不同剂量下用100μl rPIV5-RV-G肌内注射进行免疫。作为狂犬病疫苗对照，将一组小鼠用1×107 FFU的狂犬病疫苗株LBNSE通过IM途径进行免疫。将小鼠在激发之前从尾部取血以用于血清学评定。小鼠激发在免疫后3周时针对一个剂量实验进行或在加强后1周时针对两个剂量实验进行。将小鼠用50脑内(I.C.)50％致死剂量(LD50)的CVS-24株通过I.C.途径感染。针对狂犬病病毒感染的症状每日观察感染的动物持续22天。
狂犬病中和抗体测量。从不同组中的每只小鼠收集血液以用于使用快速荧光聚焦抑制测试(RFFIT)测量病毒中和抗体(VNA)，该测试是世界卫生组织(WHO)的标准化测试。简单地说，在Lab-Tek室载玻片(Nalge Nunc国际公司，纽约罗彻斯特(Rochester，NY))中制备50μl血清的连续五倍稀释液。将五十FFD50(50％荧光焦点剂量)的CVS-11添加至各室中并且在37℃下孵育90分钟。将NA细胞(105个细胞)添加到各室中并且将载玻片在37℃下孵育20小时。然后将细胞用冰冷的80％丙酮固定并且用FITC-共轭的抗-RV N抗体在37℃下染色l小时。在荧光显微镜下观察到各室中的二十个视野(field)，并且根据Reed-Meunch公式来计算50％终点滴度。将这些值与参考血清(从英国赫特福德郡(Herts，UK)的生物学标准与控制国家研究所(National Institute for Biological Standards and Control)获得)的值进行比较，该参考血清包含已知浓度(国际单位，IU/ml)的VNA。
结果
表达RABV G的重组PIV5的生成和分析。如下构建使用PIV5载体的重组狂犬病疫苗。将狂犬病EAR株的糖蛋白基因(RV-G)插入在PIV5的HN基因与L基因之间(图26A)。PIV5基因组中的RV-G基因侧接有来自NP基因与V/P基因的连接区域的基因起始(GS)序列、基因间区序列(I)以及基因终止(GE)序列，这产生高水平的转录(何等人，1997，病毒学；237：249-260)。回收病毒并且通过反转录(RT)-PCR分析和测序来确认基因组。
通过间接免疫染色测定(IFA)来检测感染rPIV5-RV-G的细胞中RV-G蛋白的表达。将感染rPIV5-RV-G的细胞通过针对RABV G的小鼠单克隆抗体进行染色，而感染PIV5的细胞不进行染色(图26B)。通过用针对RV G的小鼠单克隆抗体进行蛋白质印迹分析来证实感染rPIV5-RV-G的细胞中的RABV G表达(图26C)。重组RABV G的大小(约65kDa)预期是天然RABV的大小(周(Zhou)等人，2006，分子治疗学(Mol Ther)；14：662-672)。
为了确定RABV G基因的插入对病毒复制的影响，测定PIV5病毒和rPIV5-RV-G病毒的多步生长曲线和单步生长曲线。在多步生长曲线测定中，将MDBK细胞用每细胞0.01噬斑形成单位(PFU)的(感染复数，0.01的MOI)rPIV5或rPIV5-RV-G感染，并且在24小时间隔时收集上清液直到120小时。在单步生长曲线测定中，将MDBK细胞用5 MOI的rPIV5或rPIV5-RV-G感染，并且在12小时间隔时收集上清液直到60小时。通过BHK21细胞中的噬斑测定来量化病毒。如图27A和图27B中所示，两种病毒均具有类似的初始生长动力学，但rPIV5-RV-G的生长速率在多步生长中的第24小时至第96小时之间和单步生长中的第12小时至第48小时之间稍微低于野生型PIV5的生长速率。两种病毒在多步生长中的感染后(p.i.)约第120小时和单步生长中的60 h p.i.时达到类似的最大滴度。结果指示RABV G基因引入到PIV5基因组中作为额外表达单位不会显著影响PIV5病毒在体外的生长。
RABV G并入到rPIV5-RV-G病毒颗粒中的鉴别。因为RABV G是一种包膜蛋白，所以对其并入到PIV5颗粒中进行检查。PIV5和rPIV5-RV-G在MDBK细胞中生长并且进行纯化，并且通过SDS-PAGE和蛋白质印迹对多肽进行分析。SDS-PAGE使PIV5和rPIV5-RV-G的纯化的病毒粒子分离成主要的PIV5结构蛋白，包括L、HN、NP、F、P以及M(图28)。用RABV G特异性抗体进行的纯化病毒的蛋白质印迹分析在rPIV5-RV-G病毒粒子中检测到RABV G条带的存在，而在PIV5病毒粒子中没有发现RABV G条带(图28)。结果指示RABV G并入到重组PIV5颗粒中。
小鼠中经由鼻内接种的rPIV5-RV-G的功效。为了确定rPIV5-RV-G能够在小鼠模型中引出针对强狂犬病激发的足够的保护性免疫，进行了两个剂量免疫方案。因为含有活PIV5的当前疫苗经由IN途径给予至狗，所以首先使用IN疫苗接种对rPIV5-RV-G的功效进行测试。将四组小鼠用103、104、105、或106 PFU的rPIV5-RV-G进行IN疫苗接种。一个对照组通过IN途径接受PBS。在初次疫苗接种之后三周，将所有小鼠用相同量的初始接种物进行加强。一周之后，收集血清并且用于狂犬病VNA测定。在此之后将小鼠用50 LD50的狂犬病CVS-24株通过I.C.途径激发。按照WHO指南来测定RABV中和抗体(nAb)的滴度。如图29A和图29B中所示，存活率和RABV nAb水平二者均展示出剂量依赖性应答。用103、104、105或106 PFU的rPIV5-RV-G疫苗接种的组的平均VNA滴度和存活率(VNA/存活者)是0.53 IU/30％、1.52国际单位(IU)/77.8％、7.94 IU/100％、62.96 IU/100％，与PBS处理的组中的0 IU/0形成对比。0.5 IU被认为是保护性抗体的最低水平。各组中具有不小于0.5 IU的单个小鼠的比例与存活率密切相关，如在103 PFU的rPIV5-RV-G的组中，十只小鼠中的三只(30％)具有多于最低保护性抗体水平，存活率是30％。PBS组中的所用小鼠在用RABV激发之后9天内死亡。结果显示在两个剂量免疫程序的情况下，rPIV5-RV-G能够在小鼠中引出针对狂犬病激发的保护性免疫应答。用于100％保护的rPIV5-RV-G的最小有效两剂量是105 PFU的rPIV5-RV-G。
虽然两剂量方案测试的结果证明了rPIV5-RV-G针对狂犬病激发的免疫原性潜力，但对rPIV5-RV-G是否能够在小鼠中在一个剂量疫苗接种的情况下有效进行了进一步检查。将三组小鼠用105、106或107 PFU的rPIV5-RV-G进行IN疫苗接种。一个对照组通过IN途径接受107 PFU的PIV5。在免疫之后三周，将小鼠用50 LD50的狂犬病CVS-24株通过I.C.途径激发。如图30A和图30B中所示，用105、106或107 PFU的rPIV5-RV-G IN免疫的多组小鼠展示出平均VNA滴度的剂量依赖性增加，其中存活率是77.8％、100％以及100％。因此，用IN疫苗接种的106 PFU的rPIV5-RV-G的单个剂量是针对狂犬病病毒激发的100％保护的最小剂量。
小鼠中经由肌内接种的rPIV5-RV-G的功效。在一些情况下，IM疫苗接种可以是优选的。因此，对IM免疫的功效进行检查。在IN接种的同时，将三组小鼠用106、107或108 PFU的rPIV5-RV-G经由IM途径注射。免疫后三周，将小鼠用50 LD50的狂犬病CVS-24株通过I.C.途径激发。如图30A和图30B中所示，用106、107或108 PFU经由IM疫苗接种的多个组展示出平均VNA滴度的剂量依赖性增加，并且对应地显示60％、70％以及90％的存活率。
小鼠中经由口服接种的rPIV5-RV-G的功效。经由口服途径的有效疫苗接种对于野生动物的成功疫苗接种来说将是关键的。为了确定经由口服免疫的候选疫苗的功效，将三组小鼠用106 PFU的rPIV5-RV-G经由IN途径、108PFU的rPIV5-RV-G经由IM途径、或108 PFU的rPIV5-RV-G经由口服途径疫苗接种。两个阴性对照组接受用106 PFU的PIV5或PBS经由IN途径接种。此外，将一个对照组的小鼠用107 PFU的rLBNSE株(一种减毒的狂犬病疫苗)经由IM途径疫苗接种。在疫苗接种之后三周收集血清以用于RVVNA测定，并且将小鼠用50 LD50的狂犬病CVS-24株通过I.C.途径激发。如图31B中所示，所有接受经由IN途径的106 PFU的rPIV5-RV-G和经由IM途径的108 PFU的rPIV5-RV-G的小鼠在激发中存活。用108 PFU的rPIV5-RV-G经由口服途径疫苗接种的小鼠具有50％存活率，而60％的rLBNSE株疫苗接种的小鼠存活。PIV5组抑或PBS组中的所有小鼠在激发之后9天内死亡。在用106 PFU的rPIV5-RV-G经由IN途径的组中检测到VNA的最高平均水平(图31A)。总之，如所预期的，VNA的平均水平与存活率正相关。
讨论
在过去十年中，已经研发了多种基于减毒活RABV或表达RABV G(如V-RG)的重组病毒的重组狂犬病候选疫苗作为当前狂犬病疫苗的潜在替代物(葛(Ge)等人，2011，病毒学杂志；85：8241-8252；李等人，2006，病毒学；356：147-154；Tordo等人，2008，发育生物学(巴塞尔)(Dev Biol(Basel))；131：467-476；韦耶等人，2007，疫苗；25：4213-4222；韦耶等人，2009，疫苗；27：7198-7201；以及周等人，2006，分子治疗学；14：662-672)。虽然这些候选疫苗中的一些在经由IM给予时产生了保护性免疫，但缺乏关于用这些候选物口服免疫的功效的数据。在所报道的这些之中，用携带狂犬病G基因的犬腺病毒口服免疫不能在小鼠中赋予针对狂犬病感染的保护(李等人，2006，病毒学；356：147-154)。作为V-RG的更安全的替代，生成了表达狂犬病病毒糖蛋白基因的重组MVA疫苗并且在小鼠中对该疫苗进行了测试，并且结果显示仅在用高达109 PFU的剂量通过外周途径疫苗接种的小鼠中观察到保护(韦耶等人，2009，疫苗；27：7198-7201)。
该实例证明RABV的G基因插入在PIV5的HN与L基因之间提供一种经由口服免疫以及IN和IM免疫有效的有效疫苗。这是使用副粘液病毒作为疫苗载体的狂犬病病毒疫苗的小鼠中口服免疫功效的首次证明，从而指示PIV5可以用作研发口服递送为必要的疫苗的一种载体。
在小鼠中对三种免疫途径进行了测试。在这些之中，IN接种得到最佳免疫应答和保护，从而证明rPIV5-RV-G可以引出针对狂犬病的保护性免疫应答。IN免疫如狗舍咳疫苗接种已经在美国在许多宠物狗中使用了许多年。PIV5-RV-G经由IN免疫是有效的事实表明有可能将它并入到现有犬疫苗接种计划中。IM途径的免疫在更高剂量下更有效。很可能PIV5-RV-G的剂量越高，越多G蛋白在IM免疫中被注射，因为在纯化的PIV5-RV-G病毒粒子中检测到G。然而，如之前实例中所示，用基于PIV5的疫苗经由IM途径的高效免疫确实要求病毒是活的，因为经由IM给予的基于灭活的PIV5的疫苗仅提供部分免疫性(参见实例7和穆尼(Mooney)等人，2013，病毒学杂志；87(1)：363-71)。虽然单个剂量接种在小鼠中提供针对致死性狂犬病病毒激发的免疫性，但加强进一步提高了rPIV5-RV-G的功效：用105 PFU的rPIV5-RV-G初次加强提供100％保护对比由105 PFU的单个剂量经由IN途径的接种提供的77％保护。平均VNA滴度从105 PFU的一个剂量中的2.76 IU增加至两个剂量疫苗接种中的7.94 IU。更显著地，VNA在用一个剂量至用两个剂量的106 PFU的rPIV5-RV-G经由IN接种的小鼠中从4.73 IU增加至62.96 IU。在用rPIV5-RV-G疫苗接种的小鼠中引出了记忆免疫应答，从而表明先前暴露于PIV5不会防止针对以PIV5为载体的抗原的稳健免疫应答。使用rPIV5-RV-G疫苗的问题之一是预先存在的抗PIV5免疫性是否将不利地影响以PIV5为载体的疫苗的功效。
来自用活疫苗加强的稳健免疫应答表明针对病毒载体的预先存在的免疫性不会影响基于PIV5的疫苗的功效。此外，如实例2中所示，具有针对PIV5的中和抗体的狗在用表达甲型流感病毒的HA的PIV5免疫之后产生针对流感病毒的保护性免疫应答，从而证明基于PIV5的疫苗在具有先前暴露的狗中是有效的(参见实例2和陈等人，2012，公共科学图书馆·综合；7(11)：e50144)。在新生狗中使用狂犬病疫苗、尤其是减毒活疫苗是有限的，原因在于母体抗狂犬病抗体，该抗体可以持续长达6个月。基于PIV5的狂犬病疫苗提供对新生狗进行有效疫苗接种的一种替代物。
虽然IN免疫提供了针对rPIV5-RV-G的最佳保护，但对于对流浪狗或野生动物进行疫苗接种来说，口服免疫将是最佳途径。口服疫苗具有优于传统疫苗的优点，如其使用的方便性、与大规模免疫运动的相容性、以及接近难于接近的物种的能力(法伯尔(Faber)等人，2009，人兽共患病学和公共卫生(Zoonoses Public Health)；56：262-269)。研究中一半的小鼠用一个剂量疫苗接种进行保护。这比得上当前活狂犬病疫苗。对口服疫苗接种的保护机制了解甚少。来自口服疫苗接种的小鼠的外周血的血清的VNA滴度指示全身性免疫应答。来自口服接种的VNA滴度的范围是在0.1IU与3.8 IU之间，其中平均滴度在1.5 IU。PIV5可能能够通过口服途径将抗原递送至粘膜细胞，这产生特异性免疫应答，包括针对以PIV5为载体的抗原的全身性应答。有可能通过使用初次加强方案进一步增加口服接种的保护功效。此外，PIV5载体的修饰可能增加以PIV5为载体的狂犬病疫苗的功效。如在之前实例中所示，PIV5内的外源基因的插入位点影响基于PIV5的疫苗的免疫原性(也参见李等人，2013，病毒学杂志；87(1)：354-62)。例如，H5N1的HA插入在PIV5内的SH与HN之间产生一种候选疫苗，该候选疫苗在小鼠中产生比具有H5N1的HA插入在PIV5内的HN与L之间的疫苗更好的针对H5N1激发的免疫性。基于PIV5的疫苗的功效可以通过将G基因插入在PIV5基因组内的不同位置中得以进一步改进以用于口服免疫。此外，另外的狂犬病病毒抗原的表达可以增强基于PIV5的疫苗的效力。之前已经报道狂犬病RNP可能是保护性的。例如，使用PIV5表达狂犬病N蛋白、P蛋白或L蛋白中的一种连同G蛋白可以增强免疫保护功效。
如在该实例中所示，基于PIV5的狂犬病疫苗产生了稳健的免疫应答，该免疫应答保护致死性激发免于狂犬病病毒感染，并且证明PIV5作为用于控制狗中的狂犬病感染的狂犬病疫苗的潜力以及其作为狗和其他动物以及人中的其他传染性疾病的载体的潜力。
该实例也已经被公开为陈等人，“基于表达狂犬病病毒糖蛋白的重组副流感病毒5的一种新颖的狂犬病疫苗”，病毒学杂志；2012年12月26日[在付印之前以电子文档公开]，doi：10.1128/JVI.02886-12，该文献通过引用以其全部内容结合在此。
实例5
用于卵内疫苗接种的基于PIV5的疫苗的免疫原性
该实例证明基于PIV5的疫苗作为用于卵内接种的潜在疫苗的功效。如表1中所示，表达H5N1的HA的PIV5(PIV5-H5，还被称为ZL46；其中H5插入在PIV5基因组内的SH与HN基因之间)的卵内注射不会影响孵化率。
表1.用PIV5-H5接种的18天大的胚胎的孵化率。将54个18天大的SPF胚胎用如所列举的不同剂量的PIV5-H5或PBS(组c)感染。
然后，在孵化后14天和28天时在鸡中检查抗流感病毒抗体滴度。低至10个噬斑形成单位(PFU)的剂量能够产生稳健的抗流感病毒免疫性(图32)。简单地说，测定了用PIV5-H5经由卵内途径接种的鸡的抗流感抗体滴度。将18天大的SPF胚胎使用100μl的PIV5-H5进行卵内疫苗接种(滴度在图32中的各组下面示出)。疫苗接种是使用Inovoject自动装置(辉瑞动物保健品公司(Pfizer Animal Health)，之前的爱姆布莱克斯(Embrex))进行的。在孵化之后，将鸡保持在正压霍斯福尔-鲍尔(Horsfall-Bauer)单元中。为了研究疫苗接种的鸡是否传播病毒，将对照组的三个初试孵化对添加至各病毒接种的组中。将鸡在孵化(ah)之后第14天和第28天取血。按照OIE建议来测定血凝-抑制(HI)滴度。
还在初试和共混的鸡中检测到抗流感抗体，从而表明PIV5-H5(ZL46)的传播。虽然活疫苗的传播对于产生群体免疫性是潜在有益的，但它可能产生针对调控问题的挑战。因此，其他基于PIV5的H5疫苗将在卵内进行测试，以便鉴别在不传播的情况下产生强免疫性的一种基于PIV5的疫苗。
已经生成了为减毒的并且表达H5的几种PIV5构建体并且将如以上所描述对其进行测试。这包括但不限于，如于此包括的实例中描述的和图33中所示的构建体。图33示出表达H5N1的HA的重组PIV5的示意图。PIV5是一种具有反义RNA基因组的副粘液病毒。它编码八种已知的病毒蛋白。前导序列和尾随序列对于病毒RNA复制和转录来说是重要的。PIV5-H5(ZL46)的结果在表1和图32中示出。PIV5-H5(ZL48)具有在PIV5的HN基因与L基因之间的H5插入。PIV5ΔSH-H5缺乏SH基因。PIV5VΔC-H5缺乏V蛋白的保守的C-末端。SH缺失和保守的C-末端缺失已经进行组合以制备PIV5VΔCΔSH-H5。SH或VΔC的缺失引起小鼠中的减毒作用。
如之前，18天大的胚胎将用不同剂量(10,000、1,000、100以及10PFU/蛋)的病毒在卵内进行接种。每份稀释液将使用54个蛋。PBS接种将用作对照。将对病毒接种的蛋和PBS接种的蛋的孵化率进行比较。在孵化之后，将从各组取得10只鸡并且将其与来自阴性对照(PBS接种的)的5只鸡进行混合。为了分析病毒传播至何处，将从呼吸道或消化道、泄殖腔以及口咽取得拭子，并且将通过使用细胞病毒分离和/或通过qRT-PCR来确定病毒的存在。将在孵化后2天(第2天)、第5天、第7天、第14天时从每只鸡取得拭子并且针对病毒进行检查。孵化之后14天和28天，鸡将被取血并且将使用HI测试来测定抗HA滴度。
实例6
用于动物健康的疫苗
PIV5-犬流感疫苗研发为了研发用于犬流感的以PIV5-H3为载体的疫苗，将进行以下：
测定犬流感的H3基因的DNA序列；
选择表达控制元件；
在RG质粒系统的所希望的插入位点中合成并且克隆HA基因；
确认HA基因的序列和表达控制元件；
在适当的细胞系中转染并且拯救重组病毒；
确认来自重组病毒的HA蛋白的表达；
制备并且储存重组病毒原种；
噬斑纯化重组病毒；
确认H3蛋白表达的体外稳定性和DNA序列，包括在噬斑纯化的病毒的5、10以及15传代的启动子序列和终止子序列；
在P10-12处制备足够的病毒原种以进行至少两个动物研究；并且
在狗中进行POC动物研究。
PIV5-犬瘟热疫苗研发为了研发用于犬瘟热病毒(CDV)的以PIV5-F+H为载体的疫苗，将进行以下：
测定CDV的F基因和H基因的DNA序列；
选择表达控制元件；
在RG质粒系统的所希望的插入位点中克隆F基因和H基因；
确认F和H基因的序列和表达控制元件；
在适当的细胞系中转染并且拯救重组病毒；
确认来自重组病毒的F和H蛋白的表达；
制备并且储存重组病毒原种；
噬斑纯化重组病毒；
确认F和H蛋白表达的体外稳定性和DNA序列，包括在噬斑纯化的病毒的5、10以及15传代的启动子序列和终止子序列；
在P10-12处制备足够的病毒原种以进行至少两个动物研究；并且在狗中进行POC动物研究。
如果F基因+H基因二者不能被并入到一个单个疫苗载体中，那么将分开合成以PIV5-F为载体和以PIV5-H为载体的疫苗。
PIV5-FeLV疫苗研发计划。为了研发用于FeLV的以PIV5-gp70为载体的疫苗，将进行以下：
测定FeLv gp70的DNA序列；
选择表达控制元件；
在RG质粒系统的所希望的插入位点中合成并且克隆gp70基因；
确认gp70基因的序列和表达控制元件；
在适当的细胞系中转染并且拯救重组病毒；
确认来自重组病毒的gp70蛋白的表达；
制备并且储存重组病毒原种；
噬斑纯化重组病毒；
确认gp70蛋白表达的体外稳定性和DNA序列，包括在噬斑纯化的病毒的5、10以及15传代的启动子序列和终止子序列；
在P10-12处制备足够的病毒原种以进行至少两个动物研究；并且
在猫中进行POC动物研究。
PIV5-猫杯状病毒疫苗研发计划。为了研发用于猫杯状病毒的以PIV5-杯状病毒衣壳为载体的疫苗，将进行以下：
测定猫杯状病毒的衣壳基因的DNA序列；
选择表达控制元件；
在RG质粒系统的所希望的插入位点中合成并且克隆衣壳基因；确认衣壳基因的序列和表达控制元件；
在适当的细胞系中转染并且拯救重组病毒；
确认来自重组病毒的衣壳蛋白的表达；
制备并且储存重组病毒原种；
噬斑纯化重组病毒；
确认衣壳蛋白表达的体外稳定性和DNA序列，包括在噬斑纯化的病毒的5、10以及15传代的启动子序列和终止子序列；
在P10-12处制备足够的病毒原种以进行至少两个动物研究；并且
在猫中进行POC动物研究。
实例7
当鼻内或肌内递送时，编码流感血凝素的重组PIV5疫苗保护免受H5N1高致病性禽流感病毒感染
需要用于疫苗接种的新途径以预防流感病毒感染新兴病毒如H5N1高致病性禽流感(HPAI)病毒不仅造成大流行性威胁，而且提出疫苗研发和生产中的挑战。副流感病毒5(PIV5)是用于疫苗研发的一种有吸引力的载体。该实例在不同的疫苗方案中测试了PIV5-H5的功效，该PIV5-H5编码来自H5N1 HPAI病毒的HA。用活PIV5-H5的单次肌内或鼻内免疫快速诱导稳健的中和血清抗体应答并且保护免受HPAI激发，但是由鼻内免疫引发的粘膜IgA应答更有效地控制肺中的病毒复制。PIV5-H5疫苗将H5 HA并入到病毒粒子中，并且对灭活形式的该疫苗的功效进行了测试。灭活的PIV5-H5引发中和血清抗体应答并且控制H5N1病毒复制，但是与其他H5抗原疫苗类似，它要求加强免疫来引发保护性免疫应答。总而言之，这些结果表明PIV5-HA疫苗并且具体地说H5特异性疫苗可以以多种形式并且通过多种给药途径使用。这样可以避免基于单独鼻内给药的潜在禁忌症并且提供更广泛应用的机会，同时使用单个疫苗载体。
如实例3中所示，表达H5N1流感病毒的HA的PIV5疫苗在小鼠中作为活鼻内疫苗递送时有效于保护免受HPAI H5N1(A/VN/1203/04)激发。虽然鼻内(IN)免疫是有吸引力的，但存在缺点。在免疫受损的群体中存在关于使用活的鼻内病毒作为疫苗的潜在禁忌症。可注射的疫苗可以避免这个问题并且提供在农业应用中大规模疫苗接种的机会。该实例对通过替代途径递送的rPIV5-H5疫苗的功效进行比较，并且显示rPIV5-H5不仅在鼻内、而且在肌内给予时也是针对HPAI H5N1激发有保护性的。此外，灭活的PIV5-H5疫苗有效于保护免受H5N1感染，但是它要求加强免疫。
材料和方法
流感病毒。所使用的甲型流感病毒包括VNH5N1-PR8/CDC-RG(H5N1；rgVN-PR8；由佐治亚州亚特兰大，CDC的鲁本·多尼斯博士提供)和A/越南/1203/04(H5N1；由田纳西州孟菲斯市，圣犹大儿童研究医院的理查德·韦比提供)。将A/VN-PR8在37℃下在含胚胎的母鸡蛋的尿囊腔中繁殖48至72小时。β-丙内酯(BPL)-灭活的A/越南/1203/04是由来自圣犹大儿童研究医院(田纳西州孟菲斯市)的理查德·韦比提供。将A/越南/1203/04在37℃下在含胚胎的母鸡蛋的尿囊腔中繁殖24小时。将所有病毒分成等分并且储存在-80℃下。使用活的、高致病性禽流感病毒的所有实验经乔治亚大学的生物安全性项目机构审查并且批准，并且按照由CDC批准的选择药剂的使用指南在3级生物安全等级增强型防护下进行。
小鼠。雌性6至8周大的BALB/c小鼠(查尔斯河实验室(Charles River Labs)，弗雷德里克(Frederick)，马里兰州)用于所有研究。使用BSL2病毒的小鼠免疫和研究是在HEPA过滤的隔离器中的增强的BSL2设施中进行。小鼠HPAI感染是按照由乔治亚大学的生物安全性项目机构批准的和由CDC批准的选择药剂使用的指南在HEPA过滤的隔离器中的增强的BSL3设施中进行。所有动物研究是在经佐治亚大学的动物护理和使用委员会批准的指南下进行。
细胞。马丹-达尔比(Madin-Darby)犬肾(MDCK)细胞在具有5％FBS、5％L-谷氨酰胺、以及抗生素/抗真菌剂溶液(10,000 IU/ml青霉素、10,000 ug/ml链霉素、以及25 ug/ml两性霉素B)的DMEM(Cellgro Mediatech公司)中进行培养。Vero细胞在具有10％FBS和抗生素/抗真菌剂的极限必需培养基(MEM)(赛默/Hyclone)中进行培养。马丹-达尔比牛肾(MDBK)在具有5％FBS、5％L-谷氨酰胺、以及抗生素/抗真菌剂溶液(10,000 IU/ml青霉素、10,000 ug/ml链霉素、以及25 ug/ml两性霉素B)的DMEM(Cellgro Mediatech公司)中进行培养。将所有细胞在37℃、5％CO2下孵育。
重组病毒的构建。如之前实例中所描述来生成rPIV5-H5(ZL46)。简单地说，生成了为ZL46(rPIV5-H5-SH/HN)的含有HA基因的重组PIV5质粒。为了生成ZL46质粒，将含有PIV5的全长基因组的质粒BH276用作载体。将SH与HN基因之间的基因终止(GE)、基因间区以及基因起始(GS)序列添加到引物中以终止HA基因转录并且起始HN基因转录。然后将HA基因进行扩增。然后将病毒进行拯救并且如之前所描述进行测序。
将PIV5和rPIV5病毒原种在于含有2％FBS的DMEM中的MDBK细胞(＜p20)中生长5至7天直到其血细胞-吸附滴度达到稳定。收集培养基并且通过在Eppendorf台式离心机(5810R)中在3000 rpm下离心10分钟澄清。将牛血清白蛋白(BSA)添加至澄清的上清液中以使总溶液达到1％BSA。然后将病毒原种分成等分并且快速冷冻在干冰中并且储存在-80℃下。然后在VERO细胞上通过噬斑测定来测定病毒滴度。
病毒量化。在VERO细胞上通过噬斑测定来测定PIV5滴度。将VERO细胞与在具有1％BSA和抗生素/抗真菌剂的DMEM中制备的病毒样品的连续稀释液一起孵育。然后将病毒样品去除并且用1∶1低熔点琼脂糖和具有2％FBS和抗生素/抗真菌剂的DMEM覆盖并且在37℃下孵育5至6天。为了检测噬斑，然后将单细胞层用10％缓冲的福尔马林固定并且进行免疫染色。将细胞用具有2％FBS、0.1％叠氮化钠、以及0.5％皂苷的1X PBS(透化缓冲液)透化。使用1∶1000稀释的对于PIV5的V蛋白和P蛋白(V/P)的共享区域具有特异性的抗体来检测PIV5持续1小时。然后添加辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG(H&L)第二抗体(英杰公司)并且孵育30分钟。为了使噬斑可视化，添加TMB过氧化酶底物(根据制造商说明书制备的)(Vector Labs公司)。然后将板洗涤并且干燥并且对噬斑进行计数。通过如之前所描述的TCID50测定(索伯斯基等人，2011，公共科学图书馆·综合；6：e21937)抑或通过MDCK细胞上的噬斑测定来测定流感滴度。将MDCK细胞与在具有1 mg/ml TPCK处理的胰蛋白酶(沃辛顿生物化学公司(Worthington Biochemical))的MEM中制备的病毒样品的连续稀释液在37℃下孵育2小时。然后去除稀释的病毒样品并且将单细胞层用具有1mg/ml TPCK处理的胰蛋白酶的1.2％微晶纤维素Avicel覆盖。将板孵育72小时，将覆层用PBS轻轻地洗掉，用冷甲醇/丙酮(40％∶60％)固定，空气干燥，用结晶紫复染，并且使噬斑可视化。
PIV5病毒粒子的纯化和考马斯染色。将于T-150烧瓶中的MDBK细胞用PIV5、ZL48、或ZL46在0.1的MOI下感染。在3 dpi时收集培养基并且在3000 rpm下离心10分钟以去除细胞碎片。将澄清的培养基覆盖在于NTE缓冲液(0.1 M NaC1、0.01 M Tris-HC1、0.001 MEDTA(pH 7.4))中的20％蔗糖上。将样品在40,000 rpm下在4℃下离心1.5小时。将沉淀再悬浮于0.5ml的PBS中并且与1.3 ml的于NTE缓冲液中的80％蔗糖混合。添加于NTE缓冲液中的1.8 ml 50％蔗糖，然后添加于NTE缓冲液中的0.6 ml 10％蔗糖以得到梯度蔗糖溶液。然后将梯度蔗糖溶液在45,000 rpm下在4℃下离心3小时。收集由50％与10％蔗糖之间的界面处的病毒粒子形成的白色条带并且通过在40，000 rpm下在4℃下离心1.5小时沉淀。将沉淀再悬浮于0.5 ml PBS中。将PIV5、ZL48、ZL46或ZL47的病毒粒子通过10％SDS-PAGE凝胶进行分析并且用考马斯蓝进行染色。
蛋白质印迹。将Vero细胞用5 PFU/细胞的PIV5或ZL46的MOI感染，或模拟感染。感染后24小时将细胞使用具有2 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、罗氏完全小量蛋白酶抑制剂(罗氏应用科学(Roche Applied Science))、以及1％曲通-X-100(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)(西格玛(Sigma))的PBS溶解。如所描述地进行分离和蛋白质印迹法(加伯德(Gabbard)等人，2009，蛋白质工程、设计与选择(Prot Eng Des Sel)；22：189-198)。来自感染rg A/VN-PR8的小鼠的超免疫血清用作第一抗体来检测HA并且V/P-特异性单克隆抗体用于检测V/P。Precision Plus Protein WestemC(伯乐公司(BioRad))用作标准。
免疫荧光。将Vero细胞在24孔板中生长并且用PIV5或ZL46在5 PFU/细胞的感染复数(MOI)下感染，或模拟感染。在感染后24小时时，将细胞用5％缓冲的福尔马林在室温下固定10分钟。然后将细胞用透化缓冲液透化并且然后与1∶1000稀释(1μg/ml)的抗-HA(H5)A/VN/1203/04单克隆抗体(BEI资源公司)孵育1小时。应用1∶250稀释的PE山羊抗小鼠Ig(BDPharmingen)持续45分钟来检测HA。为了检测PIV5，然后添加V/P-特异性抗体(1∶1000稀释的)并且孵育1小时。为了使PIV5可视化，添加1∶500稀释的Alexa Fluor-488-标记的第二抗体(英杰公司)并且孵育30分钟，并且然后洗涤。将0.5 mL PBS添加至各孔中并且使用AMSEVOS fl荧光显微镜检查荧光。将细胞在各步骤之间用PBS充分洗涤。
动态光散射(DLS)。如所描述地进行DLS(Driskell等人，特里普(Tripp)，2011，分析家(Analyst)；136：3083-3090)。使用抗-HA(H5)A/VN/1203/04 mAb(BEI资源)。使用NAb蛋白G Spin试剂盒(赛默公司)根据制造商说明书从血清纯化IgG。然后使用zeba旋转脱盐柱(赛默公司)根据制造商说明书对纯化的IgG进行脱盐。然后使用Amicon Ultra-4离心过滤器单元(密理博公司(Millipore))根据制造商说明书将脱盐的IgG浓缩至大约2 mL的最终体积。使用皮尔斯(Pierce)BCA(双金鸡宁酸)蛋白质测定试剂盒(赛默公司)根据制造商说明书对蛋白质进行量化。测定PIV5、ZL46、ZL48、rg A/VN-PR8、病毒培养上清液、尿囊液、以及PBS。
免疫。对于用PIV5和rPIV5-H5疫苗接种来说，将于50μl PBS中的106PFU PIV5或rPIV5-ZL46鼻内给予至用于叔戊醇中的2，2，2-三溴乙醇(阿佛丁；奥德里奇化学品公司)麻醉的小鼠。对于亚致死性rg VN-PR8感染来说，将于50μl PBS中的2,000 PFU病毒如针对PIV5疫苗接种所描述地给予。对于rgA/VN-PR8肌内疫苗接种来说，将于50μl PBS中的2,000PFUrgA/VN-PR8给予在尾部大腿肌肉中。对于灭活的A/VN/1203/04免疫来说，将BPL-灭活的病毒在256个血凝单位(HAU)/ml下再悬浮于50μl PBS中，其被注射到各尾部大腿肌肉中(总计100μl 25 HAU)。在免疫后第21天时收集血液。在疫苗接种后14天或21天时使用0.5或1ml PBS分别进行鼻洗涤和支气管肺泡灌洗(BAL)。
ELISA。使用IgG ELISA测量HA(H5)-特异性血清抗体滴度。将Immulon 2 HB 96孔微量滴定板(赛默实验室系统)用2μg/ml重组H5蛋白涂覆并且在4℃下孵育过夜。然后将板用KPL洗涤溶液(KPL公司)洗涤并且将孔用200μl具有5％脱脂奶粉和0.5％BSA(封闭缓冲液)的KPL洗涤溶液在室温下封闭1小时。(在封闭缓冲液中)制备血清样品的连续稀释液并且将其转移至涂覆的板中并且孵育1小时。为了检测结合的血清抗体，每孔添加100μl的于封闭缓冲液中的l∶1000稀释的碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG(KPL公司)并且在室温下孵育1小时。将板通过每孔添加100μl pNPP磷酸酶底物(KPL公司)来显影并且使反应在室温下显影。在Bio-Tek Powerwave XS板阅读器上在405 nm下测量光密度(OD)。IgG滴度被测定为最低血清稀释度，其中OD大于初试血清的平均OD加2个标准偏差。
微量中和测定。用ELISA终点通过微量中和测定在血清中测量流感中和抗体滴度。将热灭活的血清在具有1％BSA、抗生素/抗真菌剂、以及1μg/ml TPCK胰蛋白酶的DMEM中连续稀释。然后将稀释的血清与1000 TCID50 rg A/VN-PR8在37℃下孵育两小时。然后添加MDCK细胞并且在37℃下孵育18至24小时。在孵育结束时，将孔用冰冷的甲醇和丙酮(对应地80∶20)固定并且如以上所描述进行ELISA。中和滴度被测定为能够中和1,000 TCID50rgA/VN-PR8的最低血清稀释度，如通过高于背景OD两倍的OD读数所确定。
淋巴细胞收获和Elispot。用PIV5、ZL46、或rg A/VN-PR8疫苗接种后十二天，从小鼠收获纵膈淋巴结(MLN)、收集并且进行均质化。在室温下使用格氏(Gey′s)平衡盐溶液(西格玛-奥德里奇公司)消减淋巴细胞中的红细胞持续5分钟并且去除碎片。然后使用Z2库尔特(Coulter)颗粒计数和大小分析器(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))对细胞进行计数。如所描述进行检测淋巴细胞中针对灭活的A/VN/1203/04的T细胞应答的ELISpot(汤普金斯等人，2007，新兴传染病；13：426-435)。将细胞用于50μl完全肿瘤培养基(CTM)中的灭活的A/VN/1203/04(相当于每孔10 HAU)、作为不相关的肽的埃博拉GP P2 EYLFEVDNL(1μg/ml)、以及伴刀豆球蛋白A(2μg/ml)再刺激。使用AID ViruSpot阅读器(细胞技术公司)对斑点进行计数。
病毒激发实验。将BALB/c小鼠首先如所描述进行疫苗接种并且然后如所指示进行取血。在最后一次取血后至少3天时，将小鼠麻醉并且用稀释于50μl PBS中的10 LD50 A/越南/1203/04或20,000 PFU的rg A/VN-PR8鼻内接种。然后针对发病率和死亡率每日监测小鼠，同时每隔一日测量体重。在激发后第3天时，对多组小鼠实施安乐死并且将其肺收集到1.0 ml PBS中并且均质化。然后通过离心使匀浆澄清。然后如所描述使用TCID50测定来测定澄清的匀浆中的病毒滴度(索伯斯基(Soboleski)等人，2011，公共科学图书馆·综合；6：e21937)。
统计分析。通过对数秩分析来确定存活率中的统计差异。通过ANOVA、接着邓尼特(Dunnett′s)多重比较检验来确定肺病毒滴度中的差异。P≤0.05被认为是有意义的。使用GraphPad Prism来进行统计分析。
结果
rPIV5-H5病毒粒子中HA的表达和并入。为了测试重组PIV5病毒的正常表达和包装，将MDBK细胞用PIV5、ZL48、ZL46感染，或模拟感染。ZL48具有插入在HN与L之间的H5基因(实例3)并且被包括作为之前公开的病毒的可比较对照。收集上清液，经蔗糖纯化，通过SDS-PAGE分离，并且进行考马斯蓝染色以使蛋白质条带可视化。在适于PIV5 HN蛋白、NP蛋白、F蛋白、M蛋白以及M蛋白的大小下的蛋白质条带在所有样品中是容易可见的，而在适于流感HA的大小下的条带在ZL48样品和ZL46样品中是可见的，但在PIV5样品中是不可见的(图34B)。这些条带的身份已经通过蛋白质印迹进行确认。
为了确认H5 HA并入到病毒粒子中，使用动态光散射(DLS)和金纳米颗粒(AuNP)标记来检测rPIV5病毒粒子对比ZL46病毒粒子表面上的HA。将PIV5、ZL46以及rgA/VN-PR8的澄清的病毒培养上清液与AuNP-标记的抗-HA(H5)抗体孵育并且然后如之前所描述针对AuNP探针的聚集进行测量(Driskell等人，特里普，2011，分析家；136：3083-3090)。AuNP聚集的程度与含有特异性HA的病毒的存在相关，其中病毒的增加增强聚集和Z位移。与PIV5相比，对于ZL46观察到8 nm的平均流体动力学直径(z-平均)的增加(分别是90.41±1.316对比82.08±0.605 nm)，从而指示在引入这些病毒后存在AuNP探针的抗原特异性聚集，从而表明HA存在于病毒粒子的表面上。对于PIV5所观察到的平均直径与单独的培养上清液或尿囊液的大小(分别是77.06±0.609和81.25±1.287 nm)大致相同。阳性对照rgA/VN-PR8病毒具有113.67±1.475 nm的平均直径。
为了确认天然HA在PIV5-H5感染过程中被表达，将Vero细胞用PIV5、ZL46(MOI＝5)感染或模拟感染，并且24小时之后溶解并且通过蛋白质印迹进行分析。用针对rgA/VN-PR8(H5N1)病毒产生的多克隆抗血清进行的检测使一种75 kD蛋白质可视化，该75 kD是ZL46细胞溶解产物中的流感HA0单体的大小，而不是PIV5或模拟溶解产物中(图34C)。用PIV5V/P-特异性mAb检测的46 kDa条带存在于所有感染的溶解产物中。为了确认H5 HA在感染的细胞的表面上被表达，进行免疫荧光染色。将感染PIV5、ZL46(MOI＝5)或模拟感染的Vero细胞用抗-HA(H5)mAb或对于PIV5的V/P蛋白具有特异性(抗-V/P)的单克隆抗体进行染色。在感染ZL46和PIV5的细胞中均检测到V/P的稳健的等效的表达，而仅在感染ZL46的细胞中检测到H5，从而证实HA在感染rPIV5-H5的细胞中被表达(图34D)。
用PIV5-H5肌内或鼻内免疫诱导HA特异性免疫应答。用表达H3病毒或来自HPAIH5N1的H5的HA的重组PIV5构建体的鼻内免疫在小鼠中显示是针对流感病毒激发有保护性的(实例3和汤普金斯等人，2007，病毒学；362：139-150)。然而，尚未对肌内免疫(广泛用于疫苗接种的一种免疫途径)进行测试。此外，因为在rPIV5-H5病毒粒子中检测到H5 HA，所以有可能灭活的疫苗可以诱导保护性免疫应答，与当前灭活的流感疫苗类似。为了确定rPIV5-H5在肌内(IM)给予时是否是免疫原性的，将小鼠用具有活病毒(ZL46)的rPIV5-H5IN、以及用活或灭活的(iZL46)病毒IM疫苗接种。最后一组小鼠给予灭活的A/VN/1203/04(iA/VN/1203/04)作为阳性对照，并且将所有组与鼻内(IN)给予PIV5的小鼠进行比较。将小鼠在第7、14以及21天时取血，并且将它们的血清针对HA-特异性IgG和H5N1流感中和抗体进行评定。用rPIV5-H5(ZL46)鼻内或肌内疫苗接种的小鼠分别早在免疫后7天或14天时产生高水平的IgG(图35A)，具有可比得上用灭活的全流感病毒(iA/VN/1203/04)免疫的小鼠的滴度。类似地，ZL46 IM或IN免疫引发稳健的中和血清抗体(图35B)，但灭活的流感病毒滴度到免疫后第21天时更高。相比之下，用灭活的ZL46(iZL46)IM疫苗接种的小鼠产生有限的IgG和中和抗体，从而表明HA抗原的量不足以引发有效的体液应答或可能需要PIV5复制来诱导免疫性。如所预期，PIV5-疫苗接种的小鼠未产生可检测的HA-特异性IgG抗体或rgA/VN-PR8中和抗体(图35A和图35B)。
鼻内免疫的一个优点是诱导粘膜免疫应答的潜力。为了评定用rPIV5-H5IM对比IN疫苗接种的小鼠中IgA应答的差异，将小鼠用PIV5、rPIV5-H5(ZL46)IM或IN疫苗接种，或用亚致死剂量的rgA/VN-PR8接种，并且在免疫后第14天或21天时进行鼻洗涤和支气管肺泡灌洗(BAL)。在用rPIV5-H5 IM疫苗接种的小鼠中的鼻灌洗液或BAL液中没有可检测的IgA。相比之下，rPIV5-H5的鼻内给予在免疫的小鼠的鼻通道和肺二者中均诱导稳健的IgA应答(对应地，图35C和图35D)。IgA水平在第14天时可比得上感染rgA/VN-PR8的小鼠，然而，流感接种的小鼠中的粘膜IgA应答在第14天之后继续上升，这可能是由于与rPIV5相比，在清除之前更长时间的病毒复制。
为了评定在给药途径下T细胞引发中的差异，对多组用rPIV5-H5或rgA/VN-PR8 IM或IN疫苗接种的小鼠在感染后第12天时实施安乐死并且针对流感特异性的、产生IFN-γ的T细胞对淋巴结淋巴细胞进行测定。用rPIV5-H5或流感病毒的鼻内疫苗接种在引流淋巴结中引发稳健的流感特异性的T细胞应答，而且与IM免疫的小鼠相比，具有增强的非特异性应答(图35E)。用rPIV5-H5(ZL46)IM疫苗接种比rgA/VN-PR8的IM给予更有效地引发A/VN/1203/04-特异性的T细胞应答，这可能是由于与流感病毒相比，PIV5在肌肉组织中的改进的复制。这对于用PIV5 IM疫苗接种来说将是一个优点，因为T细胞可以在保护免受流感病毒感染中起作用。
为了确定这种粘膜应答是否是保护免受流感病毒感染所必要的，即用rPIV5-H5IM免疫是否可以保护免受激发，将小鼠用IN或IM递送的PIV5、rPIV5-H5、或rgA/VN-PR8疫苗接种。一组小鼠还用灭活的PIV5-H5 IM(iZL46)疫苗接种以便确定所检测到的弱IgG应答(图35A)是否是保护性的。在免疫后第28天时，将小鼠用10 LD50 HPAI H5N1A/VN/1203/04激发。与之前的结果和观察到的抗体滴度一致，用rPIV5-H5 IN疫苗接种的小鼠被保护免于与HPAI H5N1激发相关的重量损失和死亡(图36A和图36B)。用ZL46 IM疫苗接种的小鼠也被保护免于H5N1激发，但在感染后期存在有限的死亡和重量损失，从而表明粘膜抗体应答对于完全保护来说是重要的。激发后三天在一子组小鼠中评定病毒滴度。H5N1病毒在用ZL46或rgA/VN-PR8 IN免疫的小鼠中是不可检测的。相比之下，与PIV5 IM免疫的小鼠相比，用ZL46 IM免疫的小鼠不具有病毒滴度的降低，而rgA/VN-PR8 IM免疫的小鼠也不具有可检测的病毒(图36C)。这再次表明由rPIV5-H5 IN免疫引发的粘膜IgA对于完全保护是重要的。可替代地，针对多重流感抗原的免疫应答的引发(如来自rgA/VN-PR8免疫的)可以克服对IgA应答的需要。在用灭活的rPIV5-H5(iZL46)疫苗接种的小鼠中没有观察到保护，从而证实活病毒、并且可能复制是保护性免疫的诱导所需的。因此，虽然两种给药途径均是保护性的(如通过重量损失和存活率所测量的)，但与IN免疫相关的粘膜IgA应答的诱导和/或增加的IFN-γT细胞数目限制肺中的感染和病毒复制。
加强增强与PIV5-H5免疫相关的HA-特异性免疫应答。用灭活的PIV5-HA单次IM免疫诱导有限的HA-特异性血清IgG(图34A)，但无中和抗体(图34B)并且不提供保护免受感染(图36)。已经用其他H5疫苗抗原观察到了类似结果(卢(Lu)等人，1999，病毒学杂志；73：5903-5911)，为了测试加强是否可以使免疫应答增加至保护性水平，将ZL46引发的小鼠每周取血，在引发后第28天时加强并且7天和14天之后收集血清。将用活ZL46 IN或IM免疫的小鼠与用灭活的ZL46(iZL46)或灭活的A/VN/1203/04(iA/VN/1203/04)IM免疫的小鼠进行比较。
再次，活ZL46到引发后21天时诱导稳健的IgG和中和抗体应答，而由iZL46得到更适度的IgG并且没有中和抗体应答。然而，在加强后一周，所有三种ZL46免疫方法(活IN、活IM、以及灭活的IM)都具有稳健的HA-特异性IgG和H5中和血清抗体应答(图37A和图37B)。在加强后六周，将小鼠用rgA/VN-PR8病毒激发并且三天之后实施安乐死以评定肺病毒滴度。突出地，与PIV5免疫的对照小鼠相比，所有疫苗接种的小鼠(ZL46 IN或IM、iZL46 IM、iA/VN/1203/04 IM)都具有显著降低的肺病毒滴度(图37C；P＜0.05，ANOVA，接着邓尼特多重比较检验)，而HA疫苗接种的组彼此之间没有显著不同。虽然用ZL46 IN免疫继续提供最佳保护(在激发后第3天时3/5小鼠具有不可检测的病毒滴度，而所有其他ZL46免疫的小鼠均具有可检测的病毒)，但用活的或灭活的PIV5-HA IM免疫有效于诱导保护性中和血清抗体应答，这可比得上全、灭活的野生型流感病毒。
针对HPAI H5N1病毒的灭活的疫苗在哺乳动物中通常是免疫原性较弱的，从而需要高抗原剂量、多次免疫，并且在一些情况下佐剂(尤里(Lipatov)等人，2006，传染病杂志；194：1040-1043；卢等人，1999，病毒学杂志；73：5903-5911；特雷纳(Treanor)等人，2001，疫苗；19：1732-1737；以及塔姆裴(Tumpey)等人，2001，病毒学杂志；75：5141-5150)。活的和灭活的HPAI疫苗二者均具有生产问题，包括在生产期间疫苗的降低的产率、生成种株的困难性以及安全问题(斯蒂尔(Steel)，2011，生物制药(BioDrugs)；25：285-298)。在本发明的情况下，已经研发了一种表达来自H5N1流感病毒的HA的新颖的重组副粘液病毒疫苗载体PIV5，该疫苗载体诱导针对HPAI病毒感染的保护性免疫(参见图34至图36和实例3)。在此，使用不同的免疫方法并且比较活的和灭活的疫苗来对这种疫苗的功效进行评定。
用活PIV5-H5鼻内免疫诱导对HA转基因具有特异性的稳健的血清和粘膜抗体应答。通过用无毒性PIV5-H5疫苗单次免疫诱导的HA-特异性应答可比得上通过用rgA/VN-PR8流感病毒亚致死性感染诱导的应答，其中流感免疫的小鼠具有疾病的临床病征并且损失高达15％的其重量(图35)。因此，PIV5提供一种用于鼻内免疫、而无由减毒活流感疫苗造成的关于重配的问题的有吸引力的方法。
与由于受体和蛋白酶需要量而通常在气道或消化道上皮细胞中复制的流感病毒不同(罗特(Rott)等人，1995，美国呼吸与危重症监护医学杂志；152：S16-19)，PIV5具有更广泛的细胞向性的潜力。这种特征使得它成为用作一种活肌内疫苗的有吸引力的候选物。虽然，这还提出PIV5疫苗可能散播至其他组织的可能性，但之前的研究没有发现鼻内PIV5感染后在其他组织中的病理学证据(汤普金斯等人，2007，新兴传染病；13：426-435)，从而表明用rPIV5载体的肌内免疫也将是安全的。
用PIV5-H5的肌内免疫诱导稳健的HA-特异性和中和血清抗体应答，可比得上用PIV5-H5的鼻内免疫或用全灭活的H5N1病毒的肌内免疫(图35)。用活PIV5-H5的肌内免疫也具有引发稳健的HA-特异性T细胞应答的附加的优点。虽然粘膜抗体应答的不存在使PIV5-H5肌内免疫有缺点，但它的确提供潜在地更适于具有哮喘或针对鼻内免疫的其他禁忌症的个体的一种免疫途径。此外，它提供用于将这种疫苗与其他可注射疫苗、以及一种可注射疫苗配制品组合的机会，这对于农业应用来说可能是有吸引力的。
粘膜抗体一直与来自同种和异种亚型免疫二者的保护作用相关。该实例发现活rPIV5-H5疫苗的肌内给予不能诱导粘膜IgA应答，但保护免受致死性H5N1激发(图35和图36)。用相同疫苗的粘膜(鼻内)免疫引发可比的病毒中和血清抗体滴度，而且诱导病毒特异性的肺和鼻IgA(图35)。这些小鼠还被保护免于与致死性H5N1感染相关的死亡，而且在感染后第3天时在肺中不具有可检测的病毒。相比之下，无可检测的IgA的小鼠(肌内免疫组)具有与对照动物类似的病毒滴度。因此，虽然肌内免疫可能具有优于鼻内免疫的一些优点，特别是对于具有慢性呼吸道疾病的个体来说，但鼻内免疫很可能是最有效的给药途径。
灭活的rPIV5-H5在一次肌内递送时不是有效的。有可能并入到病毒粒子中的HA的量不足以有效地引发针对流感感染的保护性抗体应答；但全病毒、灭活的流感疫苗在单次免疫之后未能诱导病毒中和血清抗体应答(尤里等人，2006，传染病杂志；194：1040-1043；和卢等人，1999，病毒学杂志；73：5903-5911)。在此，灭活的同种全病毒确实诱导中和抗体，这可能是由于高抗原剂量(25 HAU)；此外，全病毒具有引发针对多重流感抗原的应答的优点，其可以有助于保护免于激发。可替代地，流感病毒可以包含更有效地引发应答(即用作佐剂)的其他抗原或PAMP，并且PIV5病毒缺乏这些刺激分子。这反映在使用全病毒粒子疫苗所观察到的反应原性中(伯恩斯坦(Bemstein)等人，1982，儿科学(Pediatrics)；69：404-408)。在任一情况下，复制感受态rPIV5-H5克服这种缺陷，从而引发保护免受同种HPAI激发的T细胞应答和中和抗体应答二者。此外，用灭活的PIV5-H5疫苗(iZL46)的加强在激发后成功引发可比得上活PIV5-H5和灭活的H5N1疫苗的流感中和抗体应答(图37)。因为PIV5疫苗可以容易地在疫苗批准的细胞系(例如Vero细胞)中生长，所以PIV5-HA可以提供一种用于快速、安全生产传统HA特异性灭活的大流行性流感疫苗而无与流感疫苗种株的鉴别和研发相关的挑战的途径。具有佐剂的灭活的PIV5-HA疫苗的配制品可能能够使得用单次免疫引发中和抗体滴度，与其他基于H5 HA的疫苗类似(斯蒂尔，2011，生物制药；25：285-298)。
虽然rPIV5-HA的鼻内给予已经显示在小鼠中是安全的，但以活的复制病毒为载体的疫苗的呼吸道递送对于哮喘或免疫受损的患者来说可能是问题。肌内给予活疫苗或灭活疫苗的选择将提供鼻内免疫的有吸引的替代方案，而无疫苗平台的修改。这与当前替代方案形成对比，其中减毒活流感病毒疫苗抑或断裂的灭活野生型病毒疫苗分别鼻内或肌内递送。此外，用活的或灭活的PIV5-HA疫苗的肌内免疫可能能够使得与现有活的或基于抗原的(灭活的)疫苗共同配制，从而改进(具体地说)大规模疫苗接种运动的潜在效用。最后，多种给予和配制选择的可获得性对于农业疫苗接种计划来说将是有用的，其中用于不同应用的通用生产平台可以提供一种更安全且更具成本效益的选择并且改进疫苗接种。因此，PIV5-HA疫苗是用于生产保护免受新兴或大流行性流感病毒、并且具体地说H5N1 HPAI病毒侵袭的疫苗的一个通用疫苗平台。
实例8
表达来自H5N1的NP的重组副流感病毒5的单个剂量疫苗接种提供针对甲型流感病毒的广泛免疫性
尽管有之前的流感病毒感染和/或疫苗接种，流感病毒还是经常经由抗原性漂移和转变来逃避宿主免疫性。需要匹配流行的病毒株的疫苗以用于最佳保护。提供广泛交叉保护性免疫的通用流感疫苗的研发将具有巨大优点。甲型流感病毒的核蛋白(NP)在所有甲型流感病毒株中是高度保守的，并且已经作为用于研发一种通用流感病毒疫苗的抗原进行了探索。在该实例中，生成了在HN与L(PIV5-NP-HN/L)之间包含来自H5N1(A/越南/1203/2004)(高致病性禽流感(HPAI)病毒)的NP的重组副流感病毒5(PIV5)并且对其功效进行了测试。PIV5-NP-HN/L在小鼠中诱导体液和T细胞应答。PIV5-NP-HN/L的单次接种提供针对致死性异种亚型H1N1激发的完全保护和针对致死性H5N1 HPAI激发的50％保护。为了改进功效，将NP插入PIV5基因组内的不同位置中。在F与SH(PIV5-NP-F/SH)或在SH与HN(PIV5-NP-SH/HN)之间含有NP的重组PIV5提供比PIV5-NP-HN/L针对H5N1HPAI激发的更好保护。这些结果指示表达来自H5N1的NP的PIV5具有用作通用流感病毒疫苗的潜力。
流感病毒是一种具有节段化基因组的负链RNA病毒。甲型流感病毒与大流行病相关并且通过其两种主要表面糖蛋白，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)分类。存在在蛋白质同源性中相差约30％的17种HA亚型和9种NA亚型，其被用于将甲型流感病毒分类成多种亚型(例如，H1N1、H3N2、H5N1等)。表面糖蛋白的抗体结合位点中的点突变允许病毒逃避抗体介导的免疫性并且再次感染人和动物(抗原性漂移)。当不同甲型流感病毒亚型感染同一宿主时，可能发生基因区段的交换，从而产生具有病毒基因组的独特组合的新的病毒(抗原性漂移)，这可能引起大流行病。甲型流感病毒每年造成显著发病率和死亡率。在人中当前流行的毒株(即H1N1、H1N2、以及H3N2)感染高达15％的世界人口，并且造成美国平均36,000例死亡和226,000例住院治疗(哈珀(Harper)等人，2005，发病率和死亡率周报(MMWR RecommRep)；54：1-40)以及世界范围内数百万死亡(流感情况简报(Influenza fact sheet)，2003，疫情周报(Wkly Epidemiol Rec)；78：77-80)。大流行性流感的散发性爆发已经在过去的一个世纪里造成显著死亡率，最显著的是1918年的西班牙流感；并且已经在世界范围内造成了超过5千万人死亡(由尤里综述，韦伯斯特，2004，病毒学杂志；78：8951-8959)。初露端倪的是另一种潜在大流行性流感株H5N1。这种禽流感病毒已经最显著出现在东南亚并且导致了数百万禽类的毁灭，自2003年以来有608例报道的人病例，其中359人致命。
可以提供针对甲型流感病毒的不同亚型的广泛保护的疫苗将是理想的。靶向保守的流感病毒蛋白的候选疫苗已经作为潜在通用流感病毒疫苗进行了探索。使病毒基因组衣壳化的甲型流感病毒的核蛋白(NP)在具有超过90％的氨基酸残基同源性的所有流感病毒之中是高度保守的，并且已经被鉴别为一种用于研发通用流感病毒疫苗的组分。含有NP的腺病毒已经显示出提供针对同种以及异种亚型流感病毒激发的保护(普赖斯(Price)等人，2010，公共科学图书馆·综合；5：e13162)。此外，含有流感病毒的NP和M1的重组修饰的痘苗阿卡拉(MVA)病毒诱导CD8+T细胞应答，并且降低1期和2a期试验中人中的症状严重程度和病毒传播，从而表明NP可以用于研发一种潜在广泛保护性的流感病毒疫苗。表达流感抗原NP的重组DNA疫苗已经在动物模型中进行了测试并且显示诱导保护性抗体和T细胞应答；然而，重复给予DNA的需要可能是针对快速传播的流感病毒大流行病使用基于DNA的疫苗的障碍。
如在于此包括的实例中所示，以PIV5为载体的疫苗在动物中是有效的。如实例3中所示，低至103 pfu的表达甲型流感病毒H5N1的HA的PIV5的单个剂量鼻内(IN)接种在小鼠中保护免受致死性H5N1激发(也参见李等人，2013，病毒学杂志；87：354-362)。并且如在实例2中所示，基于PIV5的疫苗已经显示在暴露于PIV5的狗中诱导保护性免疫。在有和无先前PIV5暴露的狗中免疫性水平是可比的，从而指示预先存在的抗PIV5免疫性不会不利地影响基于PIV5的疫苗的免疫原性(也参见陈等人，2012，公共科学图书馆·综合；7：e50144)。
在该实例中，生成了包含来自H5N1 HPAI(A/越南/1203/2004)的NP基因的重组PIV5，并且对其在小鼠中保护免受致死性同种以及异种亚型流感病毒激发的功效进行了测试。
材料和方法
细胞。MDBK细胞、MDCK细胞以及Vero细胞的单层培养物维持在含有10％胎牛血清(FBS)、100 IU/ml青霉素、以及100μg/ml链霉素的DMEM中。BHK细胞和BSR-T7细胞维持在含有10％FBS、10％胰蛋白胨磷酸盐肉汤(TPB)的DMEM中。将G418添加至BSR-T7细胞中。将所有细胞在37℃、5％CO2下孵育。将感染病毒的细胞在含有减少的FBS(2％)的培养基中培养。如之前所描述使用BHK细胞进行PIV5病毒的噬斑测定(何等人，1997，病毒学；237：249-260)。如之前所描述使用MDCK细胞进行流感病毒的TCID50测定(索伯斯基等人，2011，公共科学图书馆·综合；6：e21937)。
流感病毒。将A/波多黎各(Puerto Rico)/8/34(H1N1；PR8)、X-31(H3N2；A/爱知(Aichi)/2/68 X PR8重配)(贝兹(Baez)等人，1980，传染病杂志；141：362-365)、以及rgA/VN-PR8(H5N1；由佐治亚州亚特兰大，CDC的鲁本·多尼斯博士提供)在含胚胎的母鸡蛋的尿囊腔中在37℃下繁殖48至72小时。将高致病性A/越南/1203/2004(H5N1；由田纳西州孟菲斯市，圣犹大儿童研究医院的理查德·韦比提供)在含胚胎的母鸡蛋的尿囊腔中在37℃下繁殖24小时。将所有病毒分成等分并且储存在-80℃下。使用活的、高致病性A/越南/1203/2004的所有实验都经乔治亚大学的生物安全性项目机构审查并且批准，并且按照由CDC批准的选择药剂的使用指南在增强型3级生物安全等级(BSL3+)防护下进行。
小鼠。6至8周大的雌性BALB/c小鼠(查尔斯河实验室，弗雷德里克，马里兰州)用于所有研究。将小鼠在所有鼻内疫苗接种和流感病毒激发之前经由腹膜内给予阿佛丁(2，2，2-三溴乙醇)进行麻醉。使用BSL2病毒的小鼠免疫和研究在HEPA过滤的隔离器中的增强的BSL2设施中进行。小鼠HPAI感染是按照由乔治亚大学的生物安全性项目机构批准的和由CDC批准的选择药剂的使用指南在HEPA过滤的隔离器中的增强的BSL2设施中进行。所有动物研究是在经佐治亚大学的动物护理和使用委员会批准的指南下进行。
重组质粒的构建。为了生成在PIV5基因组中的HN基因与L基因之间含有NP插入(PIV5-NP-HN/L)的质粒，使用含有PIV5的全长基因组和在HN与L基因之间的额外GFP基因的质粒BH311(何等人，1997，病毒学；237：249-260)。NP的ORF来自高致病性H5N1流感病毒(H5NI HPAI，A/越南/1203/2004)。为了生成在M与F(PIV5-NP-M/F)、F与SH(PIV5-NP-F/SH)、或SH与HN(PIV5-NP-SH/HN)之间含有NP插入的质粒，使用含有PIV5的全长基因组的质粒BH276(何等人，1997，病毒学；237：249-260)。为了获得NP基因，提取HPAI H5N1 RNA，并且生成cDNA。使用NP特异性引物对cDNA进行扩增以生成NP基因。使用pET-15b载体来构建编码His标记的H5N1-NP蛋白的表达质粒pET-15b-NP。
病毒拯救和测序。用Jetprime(Polyplus-transfection公司，纽约)将在所指示的基因接点处具有NP基因插入的编码PIV5的全长基因组的质粒PIV5-NP-M/F、PIV5-NP-F/SH、PIV5-NP-SH/HN、或PIV5-NP-HN/L，和编码NP蛋白、P蛋白以及L蛋白的三种辅助质粒pPIV5-NP、pPIV5-P、以及pPIV5-L在95％汇合下在6-cm板中共转染到BSR T7细胞中。所使用的质粒的量是如下：5μg全长PIV5-NP质粒、1μg pPIV5-NP、0.3μg pPIV5-P、以及1.5μgpPIV5-L。在37℃下72小时孵育之后，收获培养基，并且通过低速离心(3,000 rpm，10分钟)使细胞碎片沉淀。噬斑测定用于获得重组病毒的单个克隆。
对噬斑纯化的PIV5-NP病毒的全长基因组进行测序。使用病毒RNA提取试剂盒(凯杰有限公司，加州瓦伦西亚)来纯化来自感染PIV5-NP病毒的Vero细胞的培养基的总RNA。使用随机六聚体来制备cDNA，并且然后如之前所描述将该cDNA的等分试样使用适当的寡核苷酸引物对在PCR反应中进行扩增(实例3和李等人，2013，病毒学杂志；87：354-362)。对PCR产物进行测序。
病毒蛋白表达的检测。免疫荧光(IF)测定和免疫沉淀(IP)测定用于检测病毒蛋白的表达。对于IF测定来说，将于24孔板中的MDCK细胞模拟感染或用PIV5或PIV5-NP-HN/L在0.1的MOI下感染。在2 dpi时，将细胞用PBS洗涤并且然后固定在0.5％甲醛中。将细胞在0.1％PBS-皂苷溶液中透化，然后与单克隆抗-PIV5-V/P抗体或抗-H5N1-NP抗体孵育30分钟。将细胞用PBS/1％BSA洗涤并且与FITC-标记的山羊抗小鼠抗体孵育。将细胞孵育30分钟，洗涤并且检查，并且使用荧光显微镜(先进显微镜集团(Advanced Microscopy Group))进行照相。
对于IP来说，将于6孔板中的MDBK细胞模拟感染或用PIV5或PIV5-NP-HN/L在5的MOI下感染。在22 hpi时，将细胞用35S-Met/Cys Promix(100μCi/ml)标记持续2小时。将细胞在RIPA缓冲液中溶解并且使用单克隆抗-PIV5-V/P抗体或抗-H5N1-NP抗体对等分试样进行免疫沉淀。将沉淀的蛋白质通过15％SDS-PAGE进行解析并且使用Storm磷光成像仪(分子动力学公司(Molecular Dynamics)，加利福尼亚州森尼维尔市(Sunnyvale，CA))通过放射自显影术进行检查。
使用于6孔板中的模拟感染的或用PIV5、PIV5-NP-M/F、PIV5-NP-F/SH、PIV5-NP-SH/HN、或PIV5-NP-HN/L在5的MOI下感染的MDBK细胞来比较感染病毒的细胞中H5-NP的表达水平。将细胞在2 dpi时收集并且用0.5％甲醛固定1小时。将固定的细胞再悬浮于FBS-DMEM(50∶50)中，然后在70％乙醇中透化过夜。将细胞用PBS洗涤一次并且然后与于PBS/1％BSA(1∶200)中的小鼠抗-H5N1 NP抗体或抗-PIV5-V/P抗体在4℃下孵育1小时。将细胞用以藻红蛋白标记的抗小鼠抗体在4℃下在黑暗中染色1小时并且然后用PBS/1％BSA洗涤一次。使用流式细胞仪(BD LSR II)测量荧光强度。
病毒在体外和体内的生长。将于6孔板中的MDBK细胞用PIV5、PIV5-NP-M/F、PIV5-NP-F/SH、PIV5-NP-SH/HN、或PIV5-NP-HN/L在0.1的MOI下感染。然后将这些细胞用PBS洗涤并且维持在DMEM-2％FBS中。在0、24、48、72、96、以及120 hpi时收集培养基。在BHK细胞上通过噬斑测定来测定病毒的滴度。
为了比较病毒在小鼠中的生长，将6周大的野生型BALB/cJ小鼠用50μl体积中的105 pfu的PIV5、PIV5-NP-M/F、PIV5-NP-F/SH、PIV5-NP-SH/HN、或PIV5-NP-HN/L鼻内疫苗接种。在感染后3天对小鼠实施安乐死并且收获肺以测定病毒滴度。
ELISA。为了生成纯化的流感NP蛋白，将pET 15b-NP质粒转化到BL21(DE3)pLysS大肠杆菌感受态细胞中。将重组6X His-NP蛋白使用带镍树脂(Novagen公司)进行纯化并且通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色进行检查。为了生成免疫血清，将小鼠用106 pfu的PIV5、PIV5-NP-HN/L或105 pfu的X31鼻内疫苗接种并且在疫苗接种后第21天时收集血液样品。将2μg/ml的纯化的NP蛋白在96孔板中在4℃下涂覆过夜。按照制造商说明书(KPL公司)进行ELISA。将来自PIV5、PIV5-NP-HN/L以及X31接种的小鼠的血清样品的连续稀释液添加至涂覆的板中。添加与AP(KPL公司)共轭的山羊抗小鼠IgG并且使板显影。在Bio-Tek Powerwave XS板阅读器上在405 nm下测量光密度(OD)。
干扰素-γ(IFN-γ)ELISpot测定。为了检测疫苗接种的小鼠的脾中的CTL应答，进行IFN-γELISpot测定。将小鼠使用PBS、107 pfu的PIV5、PIV5-NP-F/SH、PIV5-NP-SH/HN、PIV5-NP-HN/L或0.1 LD50的PR8鼻内疫苗接种。在疫苗接种后第21天时，将小鼠处死并且收集脾。将脾均质化并且用HBSS介质洗涤。添加格氏溶液以去除红血细胞。将完全肿瘤培养基(CTM)中的脾细胞添加到用70％乙醇预处理并且用抗小鼠IFN-γ mAbAN18(Mab公司)涂覆的96孔板(Millipor MAIPSWU10)中。将细胞模拟再刺激或用Flu-NP 147-155肽(TYQRTRALV)(SEQ ID NO：9)、作为不相关的肽的埃博拉GP P2(EYLFEVDNL)(SEQ ID NO：10)、或PMA/离子霉素再刺激。将培养物在37℃、5％CO2下孵育48小时。去除脾细胞并且将板洗涤并且与生物素化的抗小鼠IFN-γmAb R4-6A2(Mabtech公司)在室温下孵育1小时。在洗涤之后，将板与链霉亲和素-碱性磷酸酶(KPL公司)孵育并且在室温下孵育1小时。将板使用BCIP/NBT(KPL公司)溶液显影。使用AID ViruSpot阅读器(细胞技术公司)对斑点进行计数。结果被呈现为分泌细胞因子的细胞的平均数目减去每106个脾细胞模拟刺激的平均数目。
用甲型流感病毒感染小鼠。将H1N1-小鼠用单个剂量的PBS、106 pfu的PIV5、PIV5-NP-HN/L或105 pfu的X31鼻内免疫。在疫苗接种后第21天时，将小鼠用10 LD50 A/PR/8/34(H1N1)激发。在激发后第3天时，对多组小鼠实施安乐死并且收集肺并且使肺均质化。TCID50测定用于测定澄清的匀浆中的病毒滴度。
将H5N1-小鼠用单次鼻内给予PBS、107 pfu的PIV5、PIV5-NP-HN/L、PIV5-NP-F/SH、PIV5-NP-SH/HN、或2000 pfu的rgA/VN-PR8进行免疫。在疫苗接种后第21天时，如所指示将小鼠用10或20 LD50 H5N1 HPAI激发。激发后，针对重量损失和存活率每日监测小鼠。将小鼠基于临床感染病征进行评分(发皱的皮毛，弓背的姿势，呼吸困难：每项1分，＜25％重量损失：1分，25％-35％重量损失：2分，＞35％重量损失：3分，神经学症状：3分)。在达到3分时对动物实施人道安乐死。涉及A/越南/1203/2004的激发是在ABSL3+防护中进行。所有动物研究是在经佐治亚大学的动物护理和使用委员会批准的指南下进行。
结果
PIV5-NP-HN/L的生成和分析。为了测试表达来自H5N1 HPAI的NP的重组PIV5是否能够在小鼠中提供针对不同亚型的流感病毒激发的保护，将H5N1 HPAI NP基因插入到PIV5的HN基因与L基因之间的cDNA中(图38)。如之前所描述将含有具有插入在HN与L基因之间的NP基因的PIV5基因组的质粒连同编码PIV5 NP基因、P基因以及L基因的三种辅助质粒转染到BSR-T7细胞中以回收传染性病毒(孙等人，2011，病毒学杂志；85：8376-8385)。将传染性PIV5-NP-HN/L病毒进行噬斑纯化并且使用如实例3中所描述的RT-PCR测序来测定PIV5-NP-HN/L的全长基因组序列(也参见李等人，2013，病毒学杂志；87：354-36221)。匹配该基因组序列的精确cDNA的一个噬斑纯化的克隆用于所有进一步的实验。
使用免疫荧光和免疫沉淀测定来确认来自感染PIV5-NP-HN/L的细胞的NP的表达。在感染PIV5-NP-HN/L的细胞中而不是在模拟感染的细胞或感染PIV5的细胞中检测到H5N1-NP蛋白。为了测试NP表达是否影响PIV5病毒蛋白表达水平，使用PIV5-V/P抗体对PIV5病毒蛋白进行免疫沉淀。没有在PIV5病毒与PIV5-NP-HN/L病毒之间观察到PIV5病毒蛋白表达水平的差异。
为了比较组织培养细胞中PIV5和PIV5-NP-HN/L的生长，使用MDBK细胞进行多步生长曲线。PIV5-NP-HN/L生长稍微慢于PIV5(图39A)。为了检查体内PIV5和PIV5-NP-HN/L的生长，将BALB/c小鼠用105 pfu的PIV5或PIV5-NP-HN/L鼻内疫苗接种。在感染后3天时测定免疫接种的小鼠的肺中的病毒滴度。PIV5-NP-HN/L疫苗接种的小鼠的肺中的滴度低于PIV5疫苗接种的小鼠的肺中的滴度；但是，在两组之间不存在显著差异(图39B)。
小鼠中针对PIV5-NP-HN/L接种的免疫应答。为了研究PIV5-NP-HN/L是否能够在体内产生NP特异性抗体，将小鼠用PIV5、PIV5-NP-HN/L或X31鼻内疫苗接种。在疫苗接种后第21天时，收集血液样品并且制备血清。来自细菌的纯化的His-标记的NP蛋白用于涂覆96孔板。将连续稀释的血清样品添加至板中。PIV5-NP-HN/L疫苗接种诱导稳健的抗NP血清IgG滴度，可比得上由活流感病毒感染诱导的那些(图40)。
为了检查PIV5-NP是否能够诱导细胞免疫应答，将小鼠用PBS、PIV5、PIV5-NP-HN/L或PR8鼻内疫苗接种。在疫苗接种后第21天时，对小鼠实施安乐死并且进行IFN-γELISpot测定。与PR8-疫苗接种的小鼠相比，PIV5-NP-HN/L-疫苗接种的小鼠诱导类似水平的NP特异性CD8+T细胞应答(图41)。
在小鼠中测定PIV5-NP-HN/L针对异种亚型H1N1激发的功效。为了检查PIV5-NP-HN/L是否能够提供针对异种亚型H1N1激发的交叉保护，将小鼠用单个剂量的PIV5-NP-HN/L鼻内免疫。在疫苗接种后第21天时，将小鼠用10 LD50A/PR/8/34(H1N1)激发。PBS和PIV5免疫的小鼠损失体重并且所有小鼠到激发后第10天死亡。相比之下，所有用PIV5-NP-HN/L免疫的小鼠在实验时间期间显示无显著重量损失并且所有小鼠在激发中存活(图42A和图42B)这与X31引发的阳性对照组是可比的。在激发后3天时在PIV5-NP-HN/L免疫的小鼠的肺中检测到流感病毒(图42C)并且虽然PIV5-NP-HN/L组中的病毒滴度低于PBS组中的病毒滴度，但是两个组之间不存在统计学上显著的差异。
在小鼠中测定PIV5-NP-HN/L针对H5N1 HPAI激发的功效。为了检查PIV5-NP-HN/L是否能够提供针对同种H5N1 HPAI激发的保护，将小鼠用单个剂量的PIV5-NP-HN/L鼻内免疫。在疫苗接种后第21天时，将小鼠用10LD50 H5N1 HPAI激发。所有PBS和PIV5免疫的小鼠损失体重并且死于感染。用PIV5-NP-HN/L免疫接种的小鼠在激发后展示50％存活率，其中存活的小鼠损失小于20％的其原始体重(图43A和图43B)。
表达PIV5基因组内不同位置处的H5N1 NP的PIV5的生成和分析。如实例3中所示，PIV5基因组内的插入位点影响所插入的抗原的免疫原性(还参见李等人，2013，病毒学杂志；87：354-36221)。为了研究PIV5基因组内不同位置处的NP的插入是否将产生疫苗功效的改进，将NP插入在PIV5基因组内的不同基因接点之间。前导序列与NP基因之间的NP插入未能产生一种存活的传染性病毒。因为在PIV5基因组内的M基因上游的外源基因的插入影响体外和体内病毒生长(实例3和李等人，2013，病毒学杂志；87：354-362)，所以将NP插入在PIV5基因组内的M基因下游的接点区域处。PIV5-NP-M/F、PIV5-NP-F/SH、PIV5-NP-SH/HN、以及PIV5-NP-HN/L彼此类似地生长并且与PIV5相比具有滴度的降低(图44A)。通过流式细胞术来检查NP与PIV5 V/P的平均荧光强度(MFI)比值以测定H5N1-NP蛋白表达水平。PIV5-NP-F/SH产生最高比值，而PIV5-NP-SH/HN和PIV5-NP-HN/L产生类似的比值。PIV5-NP-M/F产生最低比值。这些结果表明PIV5-NP-F/SH诱导NP的最高表达水平(图44B)。还对这些病毒在小鼠中复制的能力进行比较。虽然用PIV5-NP-F/SH、PIV5-NP-SH/HN、以及PIV5-NP-HN/L疫苗接种的小鼠中的肺病毒滴度稍微低于仅PIV5疫苗接种的小鼠的肺病毒滴度，但在疫苗接种后第3天时不存在显著差异(图44C)。
针对PIV5-NP病毒感染的细胞应答。为了确定NP的表达水平是否如所预期影响免疫应答，将小鼠用PBS、PIV5、PIV5-NP-F/SH、PIV5-NP-SH/HN、PIV5-NP-HN/L或PR8鼻内疫苗接种。在疫苗接种后第21天时，对小鼠实施安乐死并且进行IFN-anELISpot测定。PIV5-NP疫苗接种的小鼠比PIV5疫苗接种的小鼠诱导更高水平的NP-特异性CD8+T细胞应答。与其他PIV5-NP病毒和PR8疫苗接种的小鼠相比，PIV5-NP-F/SH疫苗接种的小鼠产生最高水平的NP-特异性CD8+T细胞应答(图45)，但是在PIV5病毒与PIV5-NP病毒之间、或在PIV5-NP病毒与PR8之间的差异不是统计学上有意义的。
在小鼠中测定PIV5-NP病毒针对H5N1 HPAI激发的功效。为了研究PIV5-NP-F/SH和PIV5-NP-SH/HN免疫是否能够提供针对H5N1 HPAI激发的更好保护，将小鼠用单个剂量的PIV5-NP病毒鼻内免疫。在疫苗接种后第21天时，将小鼠用20 LD50 H5N1 HPAI激发。这种更高激发剂量用于最大化不同候选疫苗之中任何可能的差异。所有PBS和PIV5免疫的小鼠损失体重并且到激发后第10天死于感染。相比之下，20％用PIV5-NP-HN/L疫苗接种的小鼠、30％用PIV5-NP-SH/HN疫苗接种的小鼠、以及67％用PIV5-NP-F/SH疫苗接种的小鼠在激发中存活，从而指示PIV5内F与SH之间NP的插入提供最佳保护(图46A和图46B)。
讨论
该实例是基于活病毒载体的表达单个NP基因的疫苗在小鼠中在稳健的激发模型(20 LD50激发)中针对致死性H1N1激发具有完全保护性并且提供针对高致死性H5N1激发的实质性保护(67％)的首次报道，从而指示PIV5是用于基于NP的疫苗的比AdV和VV更有效的病毒载体。
由NP产生的针对甲型流感病毒的保护性免疫通常被认为是细胞介导的，其中针对NP的抗体对于NP介导的保护来说不是必要的。但是最近，报道指示抗NP抗体可能在保护性免疫中起作用。与抗NP抗体不是关键的一致，没有观察到抗NP血清滴度与重量损失之间的相关。但是这种相关的缺乏不排除保护性免疫应答中抗体的贡献。在该实例中，PIV5-NP-HN/L产生稳健的NP特异性CD8+T细胞应答，如在IFN-γ ELISpot测定中证明的。PIV5-NP-HN/L免疫的小鼠诱导与亚致死性H1N1感染类似水平的NP特异性CD8+T细胞应答(图40B)。与细胞介导的免疫性不清除流感病毒感染的观察结果一致，PBS和免疫的小鼠的肺中激发流感病毒的滴度是类似的(图41C)。具有最多NP特异性CD8+T细胞的PIV5-NP-F/SH免疫的小鼠在用表达NP的不同重组PIV5免疫的多组小鼠之中在H5N1 HPAI激发之后具有最高存活率(67％)。
转录极性是在单股负链病毒(Mononegavirale)目中发现，该单股负链病毒目在基因组的3′末端中包含一个单个事实上的启动子，即，前导序列。更靠近该基因组的3′末端的病毒基因以比朝向5′末端的病毒基因更大丰度转录。在实例3中，来自H5N1 HPAI的HA在PIV5中SH与HN之间的插入(ZL46，PIV5-H5-SH/HN)产生比PIV5的NP与V/P、V/P与M、或HN与L的接点处的插入(ZL48，PIV5-H5-HN/L)针对H5N1 HPAI激发的更好保护，这可能是因为PIV5-H5-SH/HN产生最高的HA表达水平，而不会不利地影响病毒生长(还参见李等人，2013，病毒学杂志；87：354-36221)。为了改进这种基于PIV5的NP疫苗的功效，将NP基因插入PIV5的NP基因的上游，M基因与F基因、F基因与SH基因、以及SH基因与HN基因之间。如实例3中所报道，PIV5的NP基因上游的插入不会产生存活的重组PIV5，从而表明外源基因插入PIV5的NP基因的上游是致死性的。有趣的是，感染PIV5-NP-F/SH病毒的细胞产生最高的NP表达水平。包含最靠近3′末端前导序列插入的NP并且应当具有最高NP表达水平的PIV5-NP-M/F具有最低的NP表达水平(图43B)。
M与F之间的接点是PIV5基因组内所有接点之中最长的，并且从M至F的通读(readthrough)转录是PIV5的接点区域之中是最高的(帕克斯等人，2001，病毒学杂志；75：2213-2223)。同样地，破坏M-F接点不利地影响所插入的基因的表达。PIV5-NP-SH/HN和PIV5-NP-HN/L疫苗接种的小鼠诱导与PR8(H1N1)类似水平的NP特异性CD8+T细胞应答，PIV5-NP-F/SH疫苗接种的小鼠诱导稍微更高水平的T细胞应答，但是差异不是统计学上有意义的(图44)。有趣的是，在感染PIV5-NP病毒的细胞中产生的NP表达水平与NP特异性CD8+T细胞应答的水平相关，从而表明增加外源基因的表达水平可以造成由该外源基因产生的更高水平的细胞免疫应答。
这些候选疫苗的功效将通过增加接种剂量和/或通过使用初次-加强方案得以改进。PIV5-NP将与其他流感病毒抗原(如M2)组合以便进一步增强其功效，从而产生比单独PIV5-NP更有效的一种流感病毒疫苗。
实例9
基于副流感病毒5(PIV5)的H5N1疫苗
该实例将继续使用PIV5作为载体研发用于H5N1的疫苗并且探索使用PIV5作为用于通用流感病毒疫苗的载体。该实例将包括在雪貂中测试表达H5N1抗原的重组PIV5针对HPAI H5N1激发的功效。已经生成了表达H5N1抗原HA、NA、NP、M1以及M2的重组PIV5(被统称为PIV5-H5N1)。一些PIV5-H5N1的单个剂量接种在小鼠中提供针对致死性HPAI H5N1激发的完全保护(无死亡，无发病并且在肺中未检测到激发病毒，这被定义为消除性免疫)。将在另外的动物模型(包括但不限于雪貂动物模型)中对这些候选疫苗的功效进行测试。雪貂是用于流感病毒感染的最佳小动物模型。在雪貂与人之间存在肺生理学和形态学方面的显著相似性。雪貂对于流感病毒感染是高度易感的。将在雪貂中针对H5N1激发对候选疫苗进行测试。该实例将在小鼠以及雪貂中进一步研究由基于PIV5的候选疫苗产生的免疫性的机制。该实例将包括改进表达H5N1抗原的重组PIV5针对H5N1的功效和研发一种通用流感病毒疫苗。载体将进行进一步修饰以便实现更好的功效并且降低潜在安全风险。rPIV5-NP提供不仅针对H5N1激发，而且针对H1NI激发的保护。有趣的是，表达H1N1的HA的重组PIV5不仅完全地保护致死性H1N1激发，而且部分地保护免受致死性H5N1和H3N2激发。候选疫苗将进行进一步修饰，以便不仅增加针对H5N1的功效，而且提供针对异种亚型流感病毒激发的更好保护，从而产生一种通用疫苗。
PIV5是用于人的一种新颖的疫苗载体，用于H5N1的一种新颖的病毒载体，并且具有成为用于通用流感病毒疫苗的载体的潜力。用于流感病毒的基于PIV5的基于NA的疫苗将是新颖的。通过操纵载体诱导细胞凋亡的能力来开发增强免疫应答的新颖策略。通过调控IFN信号传导通路来开发增强免疫应答的新颖策略。
本实例中存在三个目的。目的一将是测试表达H5N1的HA的重组PIV5(PIV5-H5)作为用于H5N1的疫苗。为了测试表达H5N1的HA的重组PIV5是否能够保护小鼠免受致死性激发HPAI H5N1(小鼠中最具致死性的流感病毒)，已经生成了一种无切割位点的含有H5N1的H5的PIV5-H5，其使PIV5(ZL48病毒)的HN与L基因之间的接点处的HA蛋白的功能灭活。该病毒与野生型病毒生长一样好。所有用单个剂量的106 pfu的ZL48免疫的小鼠在激发中存活并且没有重量损失。在免疫的小鼠的肺中没有检测到H5N1。抗体转移实验证实抗H5抗体介导保护。虽然单个剂量的PIV5-H5接种完全保护小鼠免受致死性H5N1激发，但第二剂量进一步加强中和抗体滴度。预先存在的载体免疫性不防止用活病毒的加强这一事实与抗PIV5抗体不预防PIV5感染的报道一致(扬等人，1990，病毒学杂志；64(11)：5403-11)。参见实例3和李等人，2013，病毒学杂志；87(1)：354-62(59)。
增加H5的表达水平将可能改进重组病毒作为候选疫苗的功效。与前导序列(PIV5的唯一事实上的启动子)的距离相反地影响基因表达水平。HN基因与L基因之间的基因接点与PIV5中的前导序列距离最远。使感兴趣的基因从HN-L基因接点移动更靠近前导序列将增加基因表达的水平。H5N1的HA基因已经插入在PIV5基因组内的不同位置中(图47；实例3；以及李等人，2013，病毒学杂志；87(1)：354-62)。因为所有构建体在小鼠中在单个高剂量接种(106pfu)之后提供针对H5N1激发的完全保护，所以进行剂量反应研究(103、104、以及105pfu)。所有用104 pfu及以上的ZL46、ZL47或ZL48接种的小鼠在致死性H5N1激发中存活(实例3；和李等人，2013，病毒学杂志；87(1)：354-62)。103 pfu的ZL46保护100％小鼠免受H5N1致死性激发。
而在103 pfu的剂量下，ZL48保护70％的小鼠，ZL47仅保护30％的小鼠。因为常规人流感病毒免疫主要是通过IM进行并且减毒活流感病毒疫苗是通过IN进行接种，所以将IM与IN免疫的功效进行比较。虽然IM和IN二者均起作用，但IN提供比IM更好的保护。有趣的是，灭活的PIV5-H5不经由IM或IN保护，从而表明PIV5的复制对于其功效来说是必要的，即使在IM接种中。PIV5是一种呼吸道传染性病原体。在用PIV5-H5经由IN途径免疫的小鼠的支气管肺泡灌洗液和鼻洗液中检测到抗-HA IgA，从而表明基于PIV5的疫苗可以在呼吸道中产生稳健的粘膜免疫性。参见实例7和穆尼等人。
测试其他使用PIV5表达的H5N1蛋白作为用于疫苗的抗原的潜力。已经生成了表达H5N1蛋白NA、M1、M2以及NP的重组PIV5(图47A)并且对其作为针对H5N1的候选疫苗的功效进行了测试。还生成了表达H1N1的H1或N1的PIV5并且进行了测试。对于所有这些构建体来说，将这些基因插入在作为起始点的HN与L接点处以便避免对PIV5基因组复制的潜在有害作用。除了rPIV5-M2之外，所有病毒在组织培养细胞中均生长良好。
用含有H5N1的NA基因的ZL116(图47A)接种小鼠完全保护小鼠免受致死性H5N1激发。此外，在rPIV5-N1(H5N1)免疫的小鼠的肺中没有检测到H5N1。这个令人兴奋的结果是使用基于病毒载体的NA疫苗首次观察到针对H5N1的消除性免疫(无发病，无死亡并且在肺中未检测到激发病毒)。为了研究H5N1的N1介导的保护是否是特异性的并且仅限于H5N1的NA，对ZL108(表达来自H1N1的N1的PIV5)进行了测试。证实由NA产生的免疫性可能是保护性的，rPIV5-N1(H1N1)完全保护小鼠免受致死性H1N1激发。有趣的是，rPIV5-N1(H5N1)提供针对致死性H1N1激发的完全保护；rPIV5-N1(H1N1)也提供针对致死性H5N1激发的部分保护(60％)。为了进一步检查基于NA的保护是否可以是广泛的，将rPIV5-N1(H5N1)和rPIV5-N1(H1N1)针对致死性H3N2激发进行测试。出人意料地，rPIV5-N1(H1N1)部分地(40％)保护免受H3N2激发，而rPIV5-N1(H5N1)根本不保护。
甲型流感病毒的NP是高度保守的。由NP产生的免疫性被认为是细胞介导的。最近，NP已经被用作用于研发一种通用流感病毒疫苗的一种组分(索伯斯基等人，2011，公共科学图书馆·综合；6(7)：e21937)。生成了表达H5N1的NP的PIV5并且针对用H1N1病毒(PR8株)(与H5N1不同的一种亚型)的致死性激发对其功效进行测试。将小鼠用PIV5-NP的单个剂量接种提供针对致死性PR8株激发的100％保护。然而，存在一些重量损失(5％至10％)。与抗NP不是关键的一致，没有观察到抗NP滴度与重量损失之间的相关。而且，没有在免疫的小鼠的肺中检测到PR8病毒，这与NP介导的免疫性不预防流感病毒感染的先前报道一致。相比之下，表达NP的VV不提供针对相同病毒激发的任何保护，并且含有NP的腺病毒提供针对致死性N1N1激发的80％保护，但小鼠损失约30％体重。这些PIV5构建体比基于AdV和VV的NP疫苗作用更好这一事实证明PIV5是比AdV或VV(MVA)用于流感病毒的更好疫苗载体。
然后将PIV5-NP针对致死性H5N1激发进行测试并且观察到部分保护而免于死亡以及一些重量损失(10％至20％)。虽然针对H5N1的保护仅是50％，但这是已经针对用以病毒为载体的NP候选疫苗的单个剂量疫苗接种所报道的之中最好的。这将通过增加免疫剂量、改变PIV5基因组内NP插入的位点、修饰PIV5载体以及将这与在此所描述的其他流感病毒抗原进行组合来进行改进。
甲型流感病毒的M1蛋白是保守的。测定表达H5N1的HN与L之间的M1的重组PIV5(rPIV5-M1)的功效(图47A)。有趣的是，rPIV5-M1在小鼠中提供针对致死性PR8的部分保护(70％)。不够理想的保护最可能是由于M1基因的基因起始序列中的出人意料的突变。将生成具有更好功效的表达M1的重组PIV5。
生成了表达H5的PIV5突变体(图47A)。作为重组病毒的常规分析的一部分，将病毒的整个基因组进行噬斑纯化并且测序。虽然PIV5ΔSH-H5(ZL128)具有确切的输入序列，但PIV5VΔC-H5病毒的基因组中存在突变。之前，在将rPIV5VΔC在Vero细胞(一种干扰素缺陷的细胞系)中传代之后，具有突变的病毒恢复V蛋白的表达并且在其他位点处出现突变。这可能是由于C末端缺失的方式和V蛋白在病毒复制中的重要性。因为V mRNA和P mRNA二者均是从同一V/P基因转录的，所以整个编码序列不能在还缺失P蛋白的N末端(病毒RNA聚合酶复合物的必要部分)的情况下从PIV5基因组缺失V。相反，将多个点突变引入V/P基因的区域内，该基因对于转录两种mRNA以便迫使V/P基因仅制备P mRNA而不是V mRNA来说是关键的。对许多rPIV5VΔC-H5克隆进行测序并且它们都包含在不同位置处的突变。挑选消除V蛋白的C末端的表达的、除了预定突变之外还具有不同突变的回收的病毒的两个克隆并且进行测试。基本原理是如果所有突变体都具有相同作用并且共同特征是缺乏V的保守的C末端，那么很可能缺乏V的C末端是表型中的决定性因素。产生了由这些病毒产生的免疫性，并且在小鼠中对这些重组病毒针对致死性H5N1激发的功效进行了测试。PIV5ΔSH-H5产生了比PIV5-H5更好的抗体应答和细胞介导的应答。对PIV5VΔΔC-H5的两个克隆之一进行检查，一个产生针对H5的更好的抗体应答，并且另一个产生针对H5的更好的细胞介导的应答。所有突变体PIV5提供比野生型PIV5针对H5N1激发更好的保护。已经生成了rPIV5VΔCΔSH-H5突变体、rPIV5VΔC-NP突变体以及rPIV5ΔSH-NP突变体(图47A)并且对其进行了测试。
用rPIV5-H3免疫具有先前暴露于PIV5的狗。为了检查针对PIV5的预先存在的免疫性是否不利地影响使用PIV5作为疫苗载体，然后对PIV5初试的狗和针对PIV5多次疫苗接种的狗进行研究。确认了PIV5初试的狗中中和抗PIV5的缺乏，并且PIV5疫苗接种的狗中针对PIV5的中和抗体(nAb)滴度高达300(参见实例2和陈等人，2012，公共科学图书馆·综合；7(11)：e50144)。将狗用PBS、PIV5或rPIV5-H3经由IN途径疫苗接种。用rPIV5-H3疫苗接种的PIV5初试的狗用具有在20至80之间范围中(平均42)的HAI滴度。用rPIV5-H3疫苗接种的PIV5阳性的狗具有在40至80之间范围中(平均77)的HAI滴度(两组之间的HAI差异不是统计学上有意义的)，从而指示rPIV5-H3疫苗接种产生针对流感病毒的免疫性(HAI滴度的4倍增加或40的HAI滴度被认为是针对流感病毒感染有保护性的)，并且表明预先存在的抗PIV5nAb滴度不影响狗中基于PIV5的疫苗功效。这些结果与在小鼠中针对PIV5的nAb不能预防PIV5感染的先前报道(扬等人，1990，病毒学杂志；64(11)：5403-11)一致。狗清除PIV5感染的能力仍未确定。由于PIV5在狗中具有自限制复制，所以很可能细胞介导的免疫性也在清除感染中起关键作用。因为细胞介导的免疫性需要时间来应答并且有效，所以该时间延迟为基于PIV5的活疫苗在细胞中复制并且产生稳健的免疫应答提供机会窗。
目的一将在雪貂中测试表达H5N1抗原的重组PIV5针对H5N1激发的功效。已经获得了在小鼠中针对HPAI H5N1激发有效的基于PIV5的H5N1候选疫苗。将在另外的动物模型(包括雪貂)中对功效进行测试，因为雪貂是用于流感病毒感染的最佳小动物模型。许多候选疫苗已经在小鼠中进行了测试，包括图47中所列举的13种。将这些在雪貂中进行测试。既然第一目标是研发H5N1疫苗，那么将首先对PIV5-H5进行测试，因为针对H5的抗体是用于评价候选疫苗的功效的广泛接受的参数。对于PIV5-H5来说，将首先对ZL46进行测试，因为它是在所有野生型PIV5-H5之中最有效的。第二，将对PIV5ΔSH-H5(ZL128)进行测试，其是在突变体PIV5-H5之中最佳的并且还是稳定的。确定由rPIV5ΔSH-H5激活TNF-α是否影响获得性免疫应答将为设计新的疫苗提供信息。第三，将对PIV5-N1(H5N1)(ZL116)进行测试，因为还没有人报道以病毒为载体的NA疫苗在雪貂中的成功。该工作对于确定NA是否可以是一种有效抗原并且表达NA的PIV5是否可以在雪貂中针对流感病毒有效来说将是必要的。第四，将在雪貂中对PIV5-NP(ZL112)进行测试，因为基于NP的疫苗的免疫性被认为是通过细胞免疫应答介导的。不仅将测试表达NP的PIV5是否可以在雪貂中有效，而且将确定基于PIV5的疫苗是否可以在雪貂中产生稳健的细胞免疫应答。
PIV5-H5N1的安全性、稳定性以及免疫原性的检查。将对四组候选疫苗进行测试：PIV5-H5、PIV5ΔSH-H5、PIV5-N1以及PIV5-NP。PBS和PIV5将被包括作为各组的阴性对照。灭活的H5N1将用作阳性对照。对于PIV5ΔSH-H5(ZL128)疫苗来说，PIV5-H5(ZL48)还将被包括用于比较，因为它们二者均包含在PIV5基因组内的相同位置处的H5插入。一组6个中的雪貂将在麻醉下用106 PFU的重组PIV5亲代病毒(PIV5)或PIV5-H5N1、或0.5ml体积的PBS进行接种。作为免疫原性的阳性对照，3只雪貂将用15 ug的灭活的H5N1进行肌内(IM)免疫，其已经显示在雪貂感染模型中诱导HA特异性抗体应答并且保护免受致死性激发。将针对临床症状(发热、嗜睡、以及重量损失)对动物进行监测持续14天。在接种后第2、4、6、8、10、14以及21天，将收集鼻洗液并且将使用噬斑测定确定它们中的病毒滴度。还将使用HA-特异性IgAELISA针对粘膜抗体应答对鼻洗液进行测定。还将在第0、8、14、以及21天收集血清和全血以便测量CBC、临床化学、血清抗体应答和/或细胞介导的免疫应答。在接种后第四天(PIV5传播的最高点)，三只雪貂将被施以人道安乐死并且尸体剖检用于宏观病理学和微观病理学变化。此外，将收集肺和鼻甲并且将确定病毒的滴度。将收集另外的组织用于淋巴细胞(免疫应答)分析。将使用H&E染色检查病理学变化。剩余的雪貂将在免疫后第21天用H5N1进行激发。
对于稳定性研究来说，鼻洗液将用于获得病毒RNA以用于直接RT-PCR测序，和/或在Vero细胞中培养，并且然后在鼻洗液中不存在足够的病毒用于直接PT-PCR测序的情况下用于RT-PCR测序。对于病理学研究来说，在宏观病理学之后，组织将从安乐死的动物中去除，放置在栅格中，并且选择1 cm小片(代表整个器官)并且固定在10％缓冲的福尔马林中。将收集另外的小片用于通过噬斑测定分析病毒滴度。固定的组织将被包埋在石蜡中，在3微米下切片，用苏木精和曙红(H&E)染色，并且通过光学显微镜检查，并且由病理学家进行盲评分。如果H&E结果显示它，那么组织将用病毒特异性或淋巴细胞特异性(例如，CD4、CD8、B细胞)mAb进行免疫染色并且针对病毒抗原表达和/或淋巴细胞浸润的水平进行评分。
局部免疫。免疫应答的诱导位点可以改变免疫应答的性质并且显著地影响保护功效。粘膜免疫已经显示诱导保护免受匹配的和异种亚型激发二者的流感特异性粘膜IgA和IgG应答。鼻内PIV5免疫具有诱导介导针对流感激发的保护的局部流感特异性T细胞和免疫球蛋白应答的潜力。局部(即肺)PIV5特异性和流感特异性免疫应答将通过分析鼻洗液和肺(在安乐死当天)进行评定。将通过离心收集浸润淋巴细胞群体并且将针对粘膜Ig对BAL洗液进行分析。
细胞介导的免疫性(T细胞)分析。将通过抗原特异性IFN产生来测量由疫苗接种诱导的T细胞应答和在激发后T细胞应答中的变化。具体地说，将通过用灭活的H5N1、反向遗传学6：2 PR8：A/VN/1203/04、重组HA(NA或NP)、或H5N1 HA(或NA、NP)肽池再刺激来针对流感特异性T细胞应答对来自外周血、BAL、脾和/或引流淋巴结的淋巴细胞进行测定。将通过细胞内细胞因子染色、ELISA、和/或ELISPOT测定来测定IFN-γ应答。已经在流感病毒感染之后鉴别了多种HA特异性肽表位。虽然用于雪貂的A/越南/1203/04 HA中的特异性表位还未被鉴别，但HA肽文库可供用于H5N1流感病毒并且可以针对反应性对免疫细胞群体进行筛选以便根据需要鉴别肽表位。
体液免疫(抗体)分析。将使用同源(A/越南/1203/04)或异源(A/乌隆)病毒或重组HA(NA或NP)作为板结合的抗原通过标准ELISA测定来测量血清、鼻洗液、以及BAL洗液中的HA(NA或NP)特异性体液免疫应答。将使用雪貂类特异性抗体对IgA和IgG二者进行评定。还将通过病毒微量中和测定或HAI对HA特异性抗体滴度进行测量。将针对与A/安徽(Anhui)/1/2005(分化体2.3.4)的交叉分化体反应性对显示针对同源A/VN/1203/04(分化体1)HA的反应性的样品进行评定。所有血清样品和BAL洗液样品将与相应的免疫前或对照免疫的样品进行比较。
PIV5-H5N1针对H5N1激发的功效的检查。激发实验将在BSL3AG+防护中进行。如以上免疫的雪貂将用10 LD50的H5N1进行IN接种。将针对临床症状(包括活力、重量损失以及体温和存活率)监测雪貂持续14天。将在感染后第2、4、6、以及8天收集鼻洗液并且通过TCID50测定针对病毒滴度进行测定。在第14天，存活的动物将被取血以便测定流感特异性血清抗体。
将雪貂用野生型PIV5或rPIV5-H5(ZL46)感染并且使用ELISA和病毒中和测定测量针对H5的抗体滴度。这种候选疫苗在产生被认为是有保护性的抗H5抗体滴度中是有效的(图47B)。由于小鼠中使用PIV5-H5、PIV5-N1、以及PIV5-NP的结果，和雪貂中PIV5-H5的这个实验，预期PIV5-H5和PIV5-N1将是免疫原性的并且在保护雪貂免受致死性H5N1激发中是有效的。已经观察到来自用H5N1安徽(一种分化体2病毒)的PIV5-H5(H5N1，VN)免疫的小鼠的血清的稳健交叉反应性，从而表明PIV5-H5(VN，分化体1)将是针对来自分化体2病毒的激发有保护性的。
初始接种将以106 PFU(图47B)的候选疫苗开始。如果这不足以用于完全保护(无症状、无死亡并且无可检测的病毒)，那么剂量将被增加至高达108 PFU每只雪貂。如果单个剂量不足以用于完全保护，那么初次-加强方案将用于增强免疫性。所有流感病毒相关的试剂是容易可获得的并且纯化的NP和M1已经产生以用于T细胞分析。
对于在雪貂中的这个研究来说，有效免疫测定所需的试剂(如抗雪貂抗体)将从BEI获得并且可以使用其他商业来源和交叉反应性抗体。此外，将生成针对雪貂蛋白的单克隆抗体。为此目的，已经研发了雪貂的抗CD4的两个杂交瘤和雪貂的抗-IFN-β的三个杂交瘤。
目的二包括改进针对H5N1以及异种亚型流感病毒激发的表达H5N1抗原的重组PIV5的功效，以便进一步改进基于PIV5的H5N1疫苗以及一般潜在通用流感病毒疫苗。
并入诱导IFN表达并且阻断IFN信号传导的突变。已经知道激活先天性免疫应答(如IFN表达)增强获得性免疫应答。对于病毒载体来说，这是一把双刃剑。如果病毒载体诱导稳健的IFN表达，那么这种IFN诱导将反过来抑制载体的复制，从而降低载体的功效。允许诱导IFN产生并且仍然维持其阻断IFN信号传导的能力以便使其能够有效复制的病毒载体将是理想的。已经鉴别了PIV5蛋白内能够诱导细胞因子如I型干扰素的表达的残基(孙等人，2009，科学公共图书馆·病原学；5(7)：e1000525)。PIV5的P蛋白的S157的残基是宿主激酶PLK1的结合位点并且PIV5的P蛋白的S308的残基是PLK1的磷酸化位点。氨基酸残基A的突变S157或S308产生增加干扰素-β表达的病毒。最重要地，病毒仍表达阻断IFN信号传导的V蛋白。因此，这是可以诱导IFN表达而不会不利地影响其自身复制的一种病毒载体。将生成表达H5或NP的重组PIV5(图47B)并且确定在小鼠和雪貂中针对H5N1激发的免疫原性和功效。HA将用于测试P-S308A对抗体应答的作用并且使用NP来测试P-S308A对细胞介导的应答的作用。
测试用PIV5-NP与PIV5-NA、M1、M2和/或HA干的混合免疫作为一种通用疫苗的功效。因为rPIV5-NP保护H1N1以及H5N1，并且PIV5-N1(H1N1)不仅保护H1N1激发而且保护H3N2，所以预期表达NP以及其他流感病毒抗原的PIV5将是用于通用流感病毒疫苗的一种良好候选物。首先，将对两种疫苗的组合是否将提供保护的增效进行测试。如果它们提供，那么它们将被组合到一个单个病毒载体中。因为NP已知提供广泛保护，所以NP将用作与其他混合的基础。将在小鼠中并且然后在雪貂中用PIV5-NA、PIV5-M2和/或PIV5-M1以及PIV5-HA干(HA的干区)对PIV5-NP进行测试。
M2是流感病毒蛋白之中相对保守的。已经显示M2可以产生广泛的抗流感病毒免疫性。然而，当全长功能性M2是从PIV5表达时，本研究未检测到任何保护。很可能引出M2免疫应答的这种失效是感染PIV5-M2的细胞中M2的毒性。M2是一种离子通道并且已经鉴别了对于这种功能来说关键的残基。已知H37和W41对于离子通道活性来说是关键的。使这些残基突变废除离子通道活性而不影响M2的结构(M2是具有单个跨膜结构域的同源四聚体)。通过使M2的离子通道活性无效，将在不太快杀死感染的细胞的情况下生成表达高水平的M2的PIV5。而且，由于M2的表位是已知的并且它们是在M2的胞外域中，所以将生成在PIV5的SH与M2之间的一种杂合蛋白。PIV5的SH是具有7个氨基酸残基胞外域的一种44个氨基酸残基长的跨膜蛋白。M2的胞外域将被添加至SH的胞外域(SH-M2)。最近，已经报道识别为HA的干区的HA的保守区的抗体在预防流感病毒的所有亚型的感染中是有效的。将表达来自PIV5的HA的干区(图47B)并且在小鼠中检查其免疫原性。PIV5-M1构建体已经提供针对致死性PR8激发的70％保护。这种病毒将通过使用正确基因起始序列并且通过在SH与HN之间插入M1来得以进一步改进。
生成表达多于一种流感病毒抗原的PIV5。为了简洁并且避免不必要的调控负担起见，与使用表达不同抗原的PIV5的混合物相比，表达来自单一病毒的多种抗原可能是令人希望的。NP的表达将与来自同一PIV5的NA、HA干、M1和/或M2的表达组合(图47B)。
测试表达多种流感病毒抗原的PIV5作为通用疫苗的功效。一旦生成了表达NA、NP、M2 mut和/或M1的PIV5，将首先在小鼠中首先针对来自H1N1、H3N2以及H5N1的激发对其功效进行测试。如果它们在小鼠中是有效的，那么将在雪貂中对它们进行测试。
目的三包括增加基于PIV5载体的免疫性的理解的研究。将在小鼠以及雪貂中进一步测试由基于PIV5的候选疫苗产生的免疫性的机制。在传统的流感病毒疫苗的情况下，HA的中和抗体一般被认为是保护性免疫的标志。然而，用活疫苗的免疫增加体液免疫应答和细胞免疫应答二者产生的可能性。这些实例已经显示表达NA和NP的PIV5提供在之前一直未观察到的水平下的保护。通过重组PIV5病毒改变的抗原呈递将可能改进免疫应答。据认为细胞凋亡途径影响抗原呈递。因为导致由PIV5ΔSH和PIV5VΔC诱导的细胞凋亡的途径已经鉴别并且是不同的，所以这些病毒提供用表达相同抗原但激活不同细胞凋亡途径的病毒检查抗原呈递的独特机会。有可能一种细胞凋亡途径可能优先增强抗体应答，而其他可能影响T细胞应答。理解细胞凋亡如何影响针对病毒感染的免疫应答将不仅帮助设计更好的H5N1疫苗，而且提供关于疫苗设计和免疫应答的一般知识。基于PIV5-P-S308A的疫苗将允许研究IFN的诱导对获得性免疫应答的作用，而无关于IFN对病毒载体的复制的作用的问题。由rPIV5-H5、rPIV5-NA以及rPIV5-NP提供的保护的免疫机制将在该目的中得以解决。
将通过三种方法来检查PIV5诱导的保护的机制。为了确定抗体对于保护来说是否是足够的，将来自初试、PIV5、PIV5-H5N1(涉及含有或不含有突变、表达H5N1抗原的所有PIV5)或H5N1免疫小鼠的血清被动转移至初试小鼠。转移受体将用H5N1流感进行激发。一些动物将在激发后不同天时被处死用于病毒滴度分析并且其他小鼠将针对发病率和死亡率进行监测。为了确定抗体对于保护来说是否是必要的，在抗体产生中有缺陷的MT小鼠将用于免疫。如果免疫的小鼠在致死性激发中存活，那么将指示抗体不是必需的并且细胞介导的免疫应答对保护来说将是足够的。为了评定细胞免疫应答的作用，小鼠将如以上进行免疫并且通过mAb消减使免疫动物急性消减独特的T细胞亚群(CD4、CD8或二者)。在消减之后，小鼠将用H5N1流感激发并且保护将如以上进行评定。急性消减研究可能偶尔产生不确定的日期(inconclusive date)；例如CD4 T细胞和CD8 T细胞的消减不消除保护，但添加CD90消减导致保护的完全损失。存在关于这个不寻常的结果的多种潜在解释，包括使用CD4和CD8特异性mAb的不完全消减或CD4/CD8双阴性细胞在保护中的作用。另外，急性消减不仅去除引发的T细胞，而且去除初试T细胞，从而消除有助于保护的针对激发的初次应答的任何贡献。与被动血清转移类似，引发的T细胞过继转移至初试动物可以直接描述单独细胞群体在保护性免疫应答中的作用。作为急性消减的替代方案，I类缺陷的小鼠将用于评定CD8+(CTL)活性的贡献、免疫野生型和β2m缺陷的小鼠并且评定保护功效。II类(CD4+T细胞)缺陷的小鼠是另一种替代的方法，但具有诱导有效CTL和血清抗体应答的另外问题。
实例10
改进的狂犬病疫苗
狂犬病仍然是全世界范围的主要公共健康威胁，并且每年造成超过70,000人死亡。预防人狂犬病包括免疫宠物动物和野生动物携带者、处于风险中的人的暴露前免疫、以及被患狂犬病的动物咬伤的人的暴露后治疗。虽然从细胞培养制备的灭活的狂犬病病毒(RV)疫苗是安全和有效的，但它们具有缺点。首先，这些疫苗是昂贵的并且因此超出发展中国家中需要这些疫苗的大多数人的能力之外。此外，要求用灭活的疫苗重复免疫以便产生保护性免疫应答。此外，这些灭活的疫苗一直包含可能引起副作用的佐剂。因此，需要更安全、更便宜以及更有效的RV疫苗。
该实例具有三个目的。一，测试rPIV5-G在狗中的功效。将使用不同的疫苗接种途径(鼻内、口服以及肌内)在狗中检查rPIV5-G的功效并且确定rPIV5-G的剂量反应。二，改进表达G的重组PIV5的功效。抗原在PIV5基因组内插入的位点影响候选疫苗在动物中的免疫原性。在早期研究中，狂犬病病毒的G基因已经插入在HN与L基因之间。G将被插入在PIV5基因组内的其他位置处，并且在小鼠和狗中测试其功效。PIV5的修饰可以增强针对抗原的免疫应答。例如，与野生型PIV5相比，SH基因的缺失导致针对外源基因的增强的免疫性。PIV5的基因组将被修饰以获得针对G蛋白的最大免疫性。以及，三，测试其他狂犬病病毒蛋白的免疫性。虽然G足以产生针对狂犬病激发的保护性免疫，但狂犬病病毒蛋白N也已知产生保护性免疫。将构建表达N的重组PIV5并且对其进行测试。此外，将并入M(用于产生基于PIV5的病毒样颗粒(VLP)的病毒颗粒的关键组分)并且对其作为狂犬病疫苗的功效进行测试。
该实例将不仅产生一种可以经由多种途径递送的新颖的安全的和有效的狂犬病疫苗，而且提供一种研发用于狗并且可能野生动物的疫苗的新策略。从该工作得到的知识将指导用于其他疾病如HIV和结核分枝杆菌的基于PIV5的疫苗的设计。
测试rPIV5-G在狗中的功效。将使用不同的疫苗接种途径(鼻内、口服以及肌内)在狗中检查rPIV5-G的功效并且确定rPIV5-G的剂量反应。rPIV5-G在狗中的安全性、稳定性以及免疫原性的检查。已经在狗中对PIV5的安全性进行了基本性测试，因为它包含于狗舍咳疫苗中。将通过不同给药途径以最高可能的剂量对安全性和免疫原性进行进一步测试。一组8只中的狗将用108 pfu的重组PIV5亲代病毒(PIV5)或PIV5-G通过IM、口服或IN途径进行接种。作为对照，rLBSNE(主要是SAG-2，一种商业狂犬病疫苗)将经由IM被包括。将针对临床症状(发热、嗜睡、以及重量损失)对动物进行监测持续14天。在接种后第2、4、6、8、10、14以及21天，将收集鼻洗液并且将使用噬斑测定确定它们中的病毒滴度。还将在第0、7、14、以及21天收集血清和全血以便测量CBC和临床化学。在接种后第四天(PIV5传播的最高点)，狗(来自各组的4只)将被施以人道安乐死并且尸体剖检用于宏观病理学和微观病理学变化。此外，将收集肺和鼻甲并且将确定病毒的滴度。对于病理学研究来说，在宏观病理学之后，组织将从安乐死的动物中去除，放置在栅格中，并且选择1 cm小片(代表整个器官)并且固定在10％缓冲的福尔马林中。将收集另外的小片用于通过噬斑测定分析病毒滴度。固定的组织将被包埋在石蜡中，在3微米下切片，用苏木精和曙红(H&E)染色，并且通过光学显微镜检查，并且进行盲评分。如果H&E结果显示它，那么组织将用病毒特异性或淋巴细胞特异性(例如，CD4、CD8、B细胞)mAb进行免疫染色并且针对病毒抗原表达和/或淋巴细胞浸润的水平进行评分。
还将使用G-特异性IgA ELISA针对粘膜抗体应答对鼻洗液进行测定。还将在第0、7、14、以及21天收集血清和全血以便测量抗体应答和/或细胞介导的免疫应答。剩余的狗(来自各组的4只)将在免疫后第21天用狂犬病激发。
局部免疫。免疫应答的诱导位点可以改变免疫应答的性质并且显著地影响保护功效。粘膜免疫已经显示诱导保护免受匹配的和异种亚型激发二者的流感特异性粘膜IgA和IgG应答。鼻内PIV5免疫具有诱导介导针对狂犬病激发的保护的局部狂犬病特异性T细胞和免疫球蛋白应答的潜力。局部(即肺)PIV5特异性和狂犬病特异性免疫应答将通过分析鼻洗液和肺(在安乐死当天)进行评定。将通过离心收集浸润的淋巴细胞群体并且将针对粘膜Ig对BAL洗液进行分析。
细胞介导的免疫(T细胞)分析。将通过抗原特异性IFN产生来测量由疫苗接种诱导的T细胞应答和在激发后T细胞应答中的变化。具体地说，将通过用灭活的狂犬病病毒再刺激来针对狂犬病特异性T细胞应答对来自外周血、BAL、脾和/或引流淋巴结的淋巴细胞进行测定。将通过细胞内细胞因子染色、ELISA、和/或ELISPOT测定来测定IFN-γ应答。
体液免疫(抗体)分析。将使用纯化的狂犬病病毒作为板结合的抗原通过标准ELISA测定来测量血清、鼻洗液、以及BAL洗液中的狂犬病特异性体液免疫应答。将使用狗同种型特异性抗体对IgA和IgG二者进行评定。还将通过病毒微量中和测定对G特异性抗体滴度进行测量。所有血清样品和BAL洗液样品将与相应的免疫前或假免疫的样品进行比较。
将在细胞培养物和狗二者中对重组PIV5-G的稳定性进行测试。在细胞培养中，病毒将在Vero细胞中连续传代持续至少二十代。将在每次传代时收获病毒并且储存在-80C下。在狗中，病毒将通过口服途径连续传代持续十代。将病毒每隔一日从口腔分离持续6天。收获的或分离的病毒将用于所插入的G基因的RT-PCR以便确保转基因仍然在重组病毒的基因组中。鼻洗液将用于在鼻洗液中不存在足够的病毒用于分离活病毒的情况下获得病毒RNA以用于直接RT-PCR测序。
PIV5-G针对狂犬病激发的功效的检查。激发实验将在BSL3AG+防护中进行。如以上免疫的狗将用从墨西哥狗分离的500小鼠脑内LD50(MICLD50)的街狂犬病病毒(streetrabies virus)进行IC接种。将针对临床症状(包括活力、重量损失以及体温(使用微芯片植入物)和存活)监测狗持续45天。在第14天，存活动物将被取血以便测定狂犬病特异性血清抗体。在激发后第45天时，将处死狗并且从狗收集组织。除了常规的病理学研究之外，将确定任何狂犬病病毒是否存在于狗的大脑中。
狗中狂犬病病毒的单次注射导致在14天内的死亡。因此，出于成本节省，将在激发后观察狗持续45天。因为在小鼠中这种候选疫苗胜过SAG-2(一种商业狂犬病疫苗(活的、减毒的))，所以预期这种疫苗也将在狗中比SAG-2表现更好。因为IN和IM接种在小鼠中提供针对非常强的狂犬病激发的100％保护，所以预期狗的IN和IM接种将产生优异保护。然而，对于口服接种来说，有可能保护可能是不那么理想的(少于50％)，即使它比SAG-2好。如果情况是这样，那么将对来自具体目的二和三的更新的候选物进行测试。
改进表达G的重组PIV5的功效。抗原在PIV5基因组内插入的位点影响候选疫苗在动物中的免疫原性。包含具有在HN与L的接点处的外源基因插入的野生型PIV5基因组的基础模型工作良好这一事实是令人鼓舞的。狂犬病病毒的G基因已经插入在HN与L基因之间。虽然rPIV5-G在单个剂量的106pfu接种的情况下保护100％，但经由IM的100％保护要求108pfu并且108pfu口服接种仅保护50％小鼠(参见实例4)。提高IN和IM递送的功效将减少有效疫苗接种所需的病毒的量，因此，降低IN和IM疫苗接种的成本。提高口服接种的功效将增强候选疫苗在野生动物中的适用性。G将被插入在PIV5基因组内的其他位置处，并且在小鼠和狗中测试其功效。对PIV5的修饰可以增强针对抗原的免疫应答并且PIV5的基因组将被修饰以获得针对G蛋白的最大免疫性。
表达在SH与HN之间的G。已经知道HA插入在SH与HN之间得到针对H5N1的最佳免疫性。将生成在同一位置处表达G的重组PIV5(图48)(rPIV5-G-SH/HN)并且对其在小鼠和狗中的功效进行测试。在缺乏SH的PIV5中表达G。已经知道SH的缺失产生针对外源基因的增强的免疫性。SH将被G替代，这导致SH的缺失以及G基因放置在HN的上游(图48)，并且在组织培养细胞中对病毒进行分析，检查其在小鼠中的免疫原性并且对其在小鼠和狗中的功效进行测试。
并入诱导IFN表达并且阻断IFN信号传导的突变。已经知道激活先天性免疫应答(如IFN表达)增强获得性免疫应答。对于减毒活病毒来说，这是一把双刃剑。虽然许多活病毒可以诱导稳健的IFN表达，但这种IFN诱导将反过来抑制活病毒的复制。在PIV5VΔC的情况下，病毒诱导更高水平的IFN和IL-6表达，这是由于抑制IFN产生以及IFN信号传导的V的缺乏。允许诱导IFN产生并且仍然维持其阻断IFN信号传导的能力以便使其能够有效复制的病毒将是理想的。已经鉴别了PIV5蛋白内能够增强病毒基因表达并且诱导细胞因子如I型干扰素的表达的残基(孙等人，2009，科学公共图书馆·病原学；5(7)：e1000525)。PIV5的P蛋白的S157的残基是宿主激酶PLK1的结合位点并且PIV5的P蛋白的S308的残基是PLK1的磷酸化位点。氨基酸残基A的突变S157或S308产生增加病毒基因表达以及诱导干扰素表达的病毒。最重要地，病毒仍表达阻断IFN信号传导的V蛋白。将生成表达G或N的重组PIV5(图48)并且在小鼠和狗中检查其针对狂犬病激发的免疫原性和功效。G将用于测试P-S308A对抗体应答的作用并且使用N来测试P-S308A对细胞介导的应答的作用。如果P-S308A在引出针对狂犬病病毒抗原的更强的免疫应答中是有效的，那么P-S308A和ΔSH的突变将进行组合。将如以上所描述在小鼠和狗中针对安全性和免疫原性对这些重组病毒进行测试。
将首先在小鼠对这些候选疫苗的功效进行测试。然后提供比rPIV5-G更好保护的那些将在狗中进行测试。考虑到在小鼠中比rPIV5-G更好，候选物将在比rPIV5-G更低剂量的情况下经由IN和IM具有100％保护率，和/或经由口服接种好于50％保护率。
测试其他狂犬病病毒蛋白的免疫性。虽然G足以产生针对狂犬病激发的保护性免疫，但狂犬病病毒N蛋白也已知产生保护性免疫。为了进一步改进基于PIV5的狂犬病候选疫苗的功效，将构建表达另外的狂犬病病毒蛋白如N和M的重组PIV5并且对其进行测试(图48)。M已知是对于病毒组装和出芽来说关键的。如果G、N以及M都能够一起表达，那么在感染rPIV5-G-N-M的细胞中将产生狂犬病病毒的病毒样颗粒(VLP)。
生成并且测试表达N的重组PIV5。已经知道狂犬病的N是免疫原性的并且免疫性可能是保护性的。N将首先被插入在PIV5的HN与L之间，因为HN与L之间的接点是距离前导序列最远的，并且因此最不太可能对PIV5复制具有任何有害作用。然后N将被移动至SH与HN之间的接点，如在ZL46中(图48)。将首先在小鼠中通过它们自身以及与rPIV5-G组合对这些候选疫苗的功效进行测试。如果rPIV5-N与rPIV5-G的组合提供比单独rPIV5-G的任何保护，那么将在狗中对它进行测试。
生成并且测试表达M的重组PIV5。表达NA和NP的病毒载体对于流感病毒疫苗研发来说是不成功的，从而产生以下假设：NA和NP对于基于病毒载体的疫苗方法来说不是理想的抗原。然而，当从PIV5表达时，NA和NP则是有能力的抗原。因此，PIV5可以用于产生针对之前不为人所知为良好抗原的免疫性。还未测试M对针对狂犬病的免疫性的作用。将在基于PIV5的疫苗中对M作为抗原的潜力进行测试。如同N一样，M将被插入在HN与L之间，并且然后在SH与HN之间插入表达M的另一种重组PIV5(图48)。将首先在小鼠中通过它们自身以及与rPIV5-G组合对这些候选疫苗的功效进行测试。如果rPIV5-M与rPIV5-G的组合提供比单独rPIV5-G更好的保护，那么将在狗中对它进行测试。将在小鼠中、然后在狗中对rPIV5-G、rPIV5-N以及rPIV5-M的组合的功效进行测试。生成并且测试表达G和N、和/或M的重组PIV5。将生成表达G和N的重组PIV5(图48)。如果sPIV5-M提供针对狂犬病激发的免疫性，那么M将被插入(图48)。
实例11
PIV5作为针对结核分枝杆菌的疫苗
结核分枝杆菌(Mtb)(结核(TB)的病原体)是每年杀死大约140万人并且已经感染世界人口的三分之一的细胞内细菌病原体。来自超过一个世纪的研究和临床使用的结果已经显示，活疫苗提供针对Mtb气溶胶感染的最佳保护。目前使用的最广泛给予的疫苗是BCG，其是牛分枝杆菌的活的减毒的变体，在反刍动物中引起结核的一种密切相关的物种。BCG疫苗在世界上的大多数国家中是在出生时皮下给予的，但保护是可变的并且到青春期逐渐消失。BCG给予至免疫抑制的个体可能散播并且导致严重的威胁生命的感染。这种固有安全性风险仍然存在于第二代BCG疫苗中，这些第二代BCG疫苗进行了修饰以表达Mtb抗原和/或使细菌在宿主细胞内具有增强的存活的因子。另外，针对BCG疫苗接种的免疫应答与结核菌素皮肤测试(在世界上最广泛使用的TB测试)交叉反应，从而使得结果不可靠。出于这些原因，美国和加拿大公共卫生服务不推荐使用BCG疫苗。因此，需要一种安全和更有效的TB疫苗。该实例将研发一种基于副流感病毒5(PIV5)的新颖的TB疫苗。
PIV5将作为Mtb的疫苗进行测试。由于PIV5是一种呼吸道病毒，因此与其他病毒载体如痘苗病毒(其经由胃肠外途径引入)相比，它可以提供针对Mtb(一种呼吸道病原体)的优越的局部免疫性。该实例还将是首次使用PIV5来表达细菌抗原。
该实例包括以下目的。一，生成并且分析表达Mtb抗原85A(rPIV5PIV5-85A)和85B(rPIV5PIV5-85B)的重组PIV5。PIV5是一种负链RNA病毒。直接操纵其基因组是不可能的。因此，研发了一种反向遗传学系统，其中克隆了其整个RNA基因组的cDNA，从而使RNA基因组适用于操纵。该系统已经用于生成表达多种外源基因(包括流感病毒的HA基因)的传染性PIV5。为此目的，将生成并且确认表达Mtb抗原的重组病毒，并且在小鼠模型中对这些重组病毒的安全特性进行检查。二，评价重组病毒在体内的免疫原性和功效。将在疫苗接种的小鼠中对这些重组病毒的免疫原性进行检查。将通过Mtb气溶胶激发来评价在小鼠中产生稳健的免疫应答的病毒的保护功效。鼠科动物气溶胶感染模型被接受为用于在豚鼠和/或非人灵长类动物中的后续试验之前确定新疫苗的效力、安全性、免疫应答性以及功效的一线试验模型。
作为几乎在一个世纪以前研发的减毒形式的牛分枝杆菌的BCG疫苗常规地用于针对结核(TB)对新生婴儿进行疫苗接种。它在世界范围内被公共卫生机构接受为相对安全的并且在大多数国家中容易可获得。用BCG的免疫似乎在婴儿和幼儿中最有帮助的，从而降低严重的散播形式的TB的发病率。然而，已经建立对照试验：BCG在成人中提供针对更普遍的肺形式的该疾病的可变水平的保护。此外，BCG疫苗接种似乎在世界的被TB肆掠最强的一些地区具有最小的有效性，并且对全球TB流行病不具有明显影响。在世界范围内所估计的TB新病例的数目和人均发病率每年继续上升。尽管在美国TB的发病率不再上升，但该疾病仍然是免疫抑制的群体中并且许多城市中、尤其是在移民之中显著的问题。在美国，如其他地方一样，结核分枝杆菌(Mtb)的多重抗药性株的扩散威胁当前TB控制工作的功效。使TB的全球流行处于控制下的最佳希望是研发一种新的有效的TB疫苗。由于这种迫切的需求，全球研究工作正在进行中，并且大量候选疫苗正在进行检查。几种候选疫苗——包括过表达抗原85B(Ag85B)的一种重组BCG、过表达Ag85A(MVA-85A)的一种修饰的痘苗病毒、包含与佐剂组合的两种其他抗原(称为72f)的一种融合肽、含有Ag85B和ESAT-6的另一种佐剂化的融合蛋白、以及表达来自单核细胞增生李斯特氏菌的李斯特菌溶素(listeriolysin)O的一种重组BCG——处于I期或II期临床试验中。在三种一般类型的疫苗：活的减毒疫苗、杀死的或“亚单位”疫苗以及DNA疫苗中，活疫苗被认为产生针对TB的最强、最持久的保护，只要它们对于所有接受者(包括免疫抑制的)来说是可靠安全的。
抗原85复合物(Ag85A和Ag85B)的分泌的蛋白质组分是用于不同TB疫苗递送系统的一些最常见测试的Mtb抗原。这些蛋白质在人和动物中的天然感染过程中由感染Mtb杆菌表达，从而诱导体液和细胞介导的(CD4和CD8)免疫应答二者，并且在动物模型中作为感染前疫苗给予。表达这些抗原的不同疫苗构建体已经显示在通过胃肠外途径和气溶胶途径给予时在小鼠、豚鼠以及猴中提供多种水平的保护。一种具体的候选疫苗，表达Ag85A(MVA.85A)的活的重组修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)已经显示当在小脊椎动物模型中在BCG疫苗接种之后给予时的显著保护。它增强人中疫苗和天然引发的应答并且目前正在进行2期临床评价。在这些研究中，证明了肺免疫通过卷入疫苗递送媒介物利用了用于靶向肺中的抗原呈递细胞(主要是肺泡巨噬细胞)的位置和能力。同样地，该实例的疫苗构建体将针对其表达Ag85A和gAg85B的能力进行检查并且将经由气溶胶接种给予至测试动物。
实验设计
生成并且分析表达Ag85A或Ag85B的PIV5(PIV5-85A或85B)。将生成表达Mtb Ag85A或Ag85B的重组PIV5(PIV5-85A和PIV5-85B)并且在体外和体内分析病毒生长特征和安全性。
生成表达Ag85A或Ag85B的重组PIV5并且在体外分析这些病毒。来自流感病毒的H5基因插入在PIV5的HN基因与L基因之间(PIV5-H5)在小鼠中提供针对致死性H5N1激发的消除性免疫(实例3)。为了生成表达MtbAg85A和Ag85B的重组PIV5，将用采用商业销售商(金斯瑞公司(Genscript))的人细胞的优化的密码子使用来合成这些基因。然后Mtb基因将与对于PIV5的病毒mRNA合成来说重要的基因终止(GE)、基因间区(I)以及基因起始(GS)组合。这些序列将被插入在HN基因与L基因之间。将回收、确认并且分析PIV5-85A和PIV5-85B。将对这些重组病毒的整个基因组进行测序以便确认它们匹配输入cDNA序列。将对感染的细胞中这些病毒的生长动力学、病毒蛋白的表达水平以及Ag85A和Ag85B的表达水平和培养上清液中的分泌水平进行检查。
检查PIV5-85A或85B的安全性。候选疫苗病毒的高滴度原种将在Vero细胞中生长、分成等分并且储存在-80℃下用于在所有体内研究中使用。稀释之后的病毒滴度将在储存之前和在免疫PIV5感染许多细胞类型时通过噬斑测定进行确认，因为PIV5的HN结合至细胞表面上的唾液酸残基。为了研究PIV5-85A或85B是否具有超过PIV5的扩增向性，PIV5-85A或85B在裸小鼠中的分布将与PIV5进行比较。裸小鼠将用107 PFU的PIV5-85A、85B、于200μlPBS中的PIV5对照病毒或单独PBS经由尾部静脉进行注射。将每日监测小鼠的重量持续最初七天并且然后每三天持续两周。来自各组的四只小鼠将在接种后第0、3、7、以及14天时处死。一半的脑、肺、肝、脾、心脏以及肾将被收集、固定、并且处理以用于如前所述的H&E染色和病理学评分。一半的这些器官将被处理用于用PIV5抗体进行免疫组织化学染色。
此外，野生型小鼠将用106 PFU PIV5亲代病毒(PIV5)、PIV5-85A或85B、或PBS鼻内(i.n.)接种。将针对临床症状的任何病征(即重量损失、发皱的皮毛等)对免疫的动物进行监测。另外，将检查肺病毒滴度和肺病理学以便确认不同重组病毒维持其感染宿主并且不引起肺病理学的能力。对于病理学研究来说，将肺用10％缓冲的福尔马林经由支气管进行灌洗并且放置在福尔马林中用于固定。肺叶将被包埋在石蜡中，在5微米下切片，用苏木精和曙红(H&E)染色，并且通过光学显微镜检查。对于各样品，将在不知晓治疗组的情况下对四种主要肺变化(细支气管周浸润；血管周围浸润；实质浸润；胸膜下浸润)如下进行主观评分：0至3，其中0＝无变化并且3＝最大变化，并且确定总得分。如果H&E结果显示显著炎症，那么组织将用病毒特异性或淋巴细胞特异性(例如，CD4、CD8、B细胞)mAb进行免疫染色并且针对病毒抗原表达和/或淋巴细胞浸润的水平进行评分。
评价重组病毒在体内的免疫原性和功效。该激发研究被设计成将疫苗接种的组的肺和脾中的Mtb杆菌的对数CFU与非疫苗接种的(对照)组进行比较，通过单向方差分析来确定。BCG将用作阳性对照以用于比较。有效疫苗将在激发后第4周和第8周时减少肺和脾中Mtb杆菌的CFU的数目。
检查PIV5-85A或PIV5-85B的免疫原性。将在PIV5-85A或PIV5-85B免疫的小鼠中使用多个终点测量PIV5-和Mtb Ag85A-或Ag85B特异性免疫应答。作为对照，小鼠将用106 PFU的PIV5疫苗株鼻内抑或用105 CFU的牛分枝杆菌BCG株丹麦(哥本哈根国家血清研究所(Statens Semm Institut，Copenhagen)；SSI)皮下进行免疫。将从SSI获得牛分枝杆菌BCG株丹麦的冷冻的等分试样。这些等分试样中的BCG丹麦已经生长至精确的国际规格，分成等分并且在装运之前测定活力。将就在疫苗接种之前融化所需数目的等分试样。在免疫后的不同时间点，将测量针对PIV5和Ag85A或Ag85B的局部和全身免疫性。粘膜免疫已经显示诱导Mtb特异性粘膜IgA和IgG应答。因此，鼻内PIV5免疫具有诱导介导针对Mtb激发的保护的局部Mtb特异性T细胞和免疫球蛋白应答的潜力。局部(即肺)PIV5特异性和Mtb特异性免疫应答将通过分析在免疫或激发之后的不同时间点所收集的BAL样品进行评定。将通过离心收集浸润的淋巴细胞群体并且将针对粘膜免疫球蛋白对BAL洗液进行分析。全身应答将通过分析血清抗体和脾或纵膈淋巴结(MLN)淋巴细胞群体进行评定。
细胞介导的免疫(T细胞)分析。将通过抗原特异性IFN产生来测量由疫苗接种诱导的T细胞应答和在激发后T细胞应答的变化。具体地说，将通过用PIV5、Mtb Ag85A或Ag85B蛋白或PPD再刺激来针对PIV5-或Mtb特异性T细胞应答对来自BAL、脾和/或引流淋巴结的淋巴细胞进行测定。将通过细胞内细胞因子染色和/或ELISPOT测定来测定IFN-γ应答。其他研究者证明通过用实验性MVA85A疫苗(现在处于II期临床试验)免疫的小鼠进行的产生IFNγ的ELISPOTS可以用作疫苗效力测试(NIH/FDA TB疫苗专题讨论会)。
体液免疫(抗体)分析。虽然已知抗体不在Mtb免疫性中起关键作用，但仍然将对用PIV5-85A和PIV5-85B疫苗接种之后的体液免疫进行检查。PIV5是一种用于Mtb的新颖的疫苗载体。有可能PIV5-85A和PIV5-85B可以使用一种不同的和/或另外的保护机制。对于体液免疫研究来说，将在通过尾部静脉切口免疫之前1周从小鼠收集匹配的正常血清样品。将通过PIV5特异性ELISA来测量血清和BAL洗液中的抗PIV5抗体。类似地，将通过ELISA标准测定使用重组Ag85A或85B作为板结合的抗原来测量Mtb Ag85A-或Ag85B特异性体液免疫应答。在ELISA测定中，还将使用适当的第二抗体来测定这些抗体的同种型(IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、以及IgG3)。所有血清样品和BAL洗液样品将与相应的免疫前样品进行比较。
在小鼠激发模型中检查PIV5-85A/PIV5-85B的功效。鼻内PIV5-85A和PIV5-85B、皮下BCG以及非疫苗接种的小鼠(20个的组)将用50-100 CFU的Mtb激发，并且监测动物长达8周。毒性Mtb株Erdman由FDA在2005年建库并且对于研究者来说是可获得的。将在激发之前即刻融化所需数目的等分试样。将使用麦迪逊(Madison)气溶胶室使所有小鼠暴露于MtbErdman。在感染之前，Mtb的单细胞培养物将被放置在气溶胶室喷雾器罐中，其中暴露周期预先设定以便递送适当的感染剂量。在定时的暴露期之后，将用清洁的过滤的空气吹扫感染室并且小鼠组将返回至它们的笼中。在每个感染周期过程中，携带气溶胶化的Mtb杆菌的气流将被取样在一个含有磷酸盐缓冲盐水(PBS)的全玻璃冲击器中以便计算递送至各组的实际感染剂量(CFU)。来自每个冲击器的100μl的PBS(未稀释的，在PBS中1∶10、1∶100以及1∶1000稀释)将一式四份接种到7H11-OADC琼脂平板上并且在37C下孵育长达6周。此外，每次麦迪逊气溶胶室用于激发时，将在激发后第二天处死5只未疫苗接种的小鼠以便确认Mtb在肺中的实际暴露剂量是50至100 CFU。将确定各组的动物存活曲线长达8周，并且将在激发后第4周和第8周时评定组织病理学/细菌负担。将在第一周之中针对不适每日监测所有小鼠(不管疫苗接种途径)；还将在第一周感染期间测量体温。所有小鼠将每周进行称重以便检测厌食或可能影响重量的其他不良反应。将对皮下BCG注射的小鼠的注射部位首先每日并且然后每周进行目视检查。用于监测上呼吸道疫苗反应原性的评分系统将用于导出每只鼻内疫苗接种的小鼠的定量得分。评分系统的要素将是：外鼻孔的可见炎症(0至3)，表征为无、轻微浆液状的、显著浆液状的、轻微粘液脓性的、或显著粘液脓性的鼻涕(0至4)，以及已被证实为反映小鼠的鼻塞的指数的呼吸频率(0至3)。来自各实验组的10只小鼠(一组的一半)将在激发后第4周时处死并且另一半将在激发后第8周时处死。在安乐死之后，包括肺、肝、脾、以及鼻组织的组织将被收获并且分配至不同的实验。将由兽医病理学家使用已定义的评分系统进行宏观和微观组织病理学研究。如之前所描述的用于临床观察结果和病理学研究的评分系统还将用于产生定量测量。每个这些测量值将通过学生t检验针对组之间的显著差异进行比较。
实例12
另外的PIV5抗原构建体
已经制备了在图49A至图49H中所示的以下另外的PIV5抗原构建体。这包括表达RSV抗原F和G的PIV5构建体(图49A)、表达尼帕病毒抗原F和G的PIV5构建体(图49B)、表达结核分枝杆菌抗原85A、85B、以及ESAT6的PIV5构建体(图49C)、表达PRRSV抗原的PIV5构建体(图49D)、表达猪环状病毒(PCV2)抗原的PIV5构建体(图49E)、表达克氏锥虫抗原Ts的PIV5构建体(图49F)、表达诺如病毒抗原的PIV5构建体(图49G)、以及表达HIV抗原Env(gp160、gp140或gp120以及Gag)的PIV5构建体(图49H)。
实例13
另外的PIV5载体
在该实例的情况下，获得所有可商购的狗舍咳疫苗并且对这些PIV5株进行测序。对从以下商业狗舍咳疫苗分离的PIV5株进行测序：BI疫苗、FD疫苗、默克疫苗以及梅里亚疫苗。还进行测序的是保藏在ATCC中的两种PIV5分离株；犬副流感病毒株78-238(ATCC编号VR-1573)(埃佛曼等人，1980，美国兽医协会杂志；177：1132-1134；和埃佛曼等人，1981，病毒学文献；68：165-172)，和犬副流感病毒株D008(ATCC编号VR-399)(比恩等人，1967，实验生物学与医学会会报；126：140-145)。核苷酸序列在表2中进行了比较。这是常用实验室株(WR株)与狗舍咳疫苗株和野生型分离株(由从ATCC获得的两个株来代表)之间的序列的首次比较。
表2.PIV5(WR株)和其他株的序列比较。78-238和D008是来自ATCC的野生型株。BI(勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim))、FD(道奇堡公司)、默克以及梅里亚是从商业狗舍咳疫苗分离的疫苗株。
将生成PIV5构建体并且基于来自当前狗舍咳疫苗和ATTC保藏物的PIV5株进行测试。有趣的是，一种疫苗株(梅里亚)与一种野生型分离株(D008)几乎完全相同(99.9％基因组序列同一性)，表明人们很可能已经通过对其狗进行疫苗接种而暴露于野生型PIV5。但是，为了缓和安全性的潜在问题，将生成基于狗舍咳疫苗株的重组PIV5构建体。默克疫苗株将首先用作疫苗构建体的基础，因为它是与我们的PIV5株差异最大的(98.9％同一性)并且它已经在狗中广泛使用。将产生反向遗传学系统以用于将默克株和H5或NP插入到基因组中。将在小鼠和雪貂中对PIV5-H5对比默克-H5和PIV5-NP对比默克-NP的免疫原性进行比较。进一步的研究将利用表2中所列举的任何株和在此所描述的任何疫苗抗原构建体。
在此所引用的所有专利、专利申请、和出版物、以及以电子方式可获得的资料(包括，例如，在(例如)GenBank和RefSeq中的核酸序列提交，以及在(例如)SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，以及来自GenBank和RefSeq中的注释编码区的转译)的完整披露内容通过引用结合。在本申请的披露内容与通过引用结合在此的任何文献的一个或多个披露内容之间存在任何不一致性的情况下，将以本申请的披露内容为准。仅出于清楚理解起见给出以上详细说明和实例。不用将其理解成不必要的限制。本发明不限于所示和所描述的准确细节，因为对本领域技术人员来说显而易见的变化将包括在由权利要求所限定的本发明内。
序列表
SEQ ID NO：1、2、9、以及10 合成肽
SEQ ID NO：3-8 合成寡核苷酸引物

Claims (18)

1.一种副流感病毒5(PIV5)病毒表达载体，该病毒表达载体包含一种PIV5基因组，该基因组包含表达一种异源多肽的一种异源核苷酸序列，其中该异源核苷酸序列插入在该PIV5基因组的小疏水蛋白(SH)基因与血凝素-神经氨酸酶(HN)基因之间的基因内区，并且其中所述异源多肽包含流感血凝素(HA)。
2.如权利要求1所述的病毒表达载体，其中该流感包括甲型流感、乙型流感、或丙型流感病毒。
3.如权利要求1所述的病毒表达载体，其中该异源多肽包含来自甲型流感病毒株亚型H1至H8的一种血凝素(HA)。
4.如权利要求1所述的病毒表达载体，其中该异源多肽包含来自甲型流感病毒株H5N1、H3N2、或H1N1的一种血凝素(HA)。
5.如权利要求1-4的任一项所述的病毒表达载体，其中该PIV5基因组进一步包含一个或多个突变。
6.如权利要求5所述的病毒表达载体，其中突变包括V/P基因的突变、V蛋白和P蛋白的共享N-末端的突变、缺乏V蛋白的C-末端的突变、缺乏小疏水(SH)蛋白的突变、融合(F)蛋白的突变、磷蛋白(P)的突变、大RNA聚合酶(L)蛋白的突变、并入来自犬副流感病毒的残基的突变、诱导细胞凋亡的突变、或其组合。
7.如权利要求6所述的病毒表达载体，其中所述V蛋白和P蛋白的共享N-末端的突变包括V蛋白和P蛋白的共享N-末端的残基26、32、33、50、102、和/或157的突变。
8.如权利要求5所述的病毒表达载体，其中该突变包括PIV5VΔC、PIV5ΔSH、PIV5-P-S308G、或其组合。
9.如权利要求1所述的病毒表达载体，其中所述异源核苷酸序列进一步表达两种或更多种异源多肽。
10.一种病毒颗粒，该病毒颗粒包含如权利要求1至9中任一项所述的病毒表达载体。
11.一种如权利要求1至10中任一项所述的病毒表达载体或病毒颗粒的组合物。
12.如权利要求11所述的组合物，该组合物进一步包含一种佐剂。
13.一种在细胞中表达一种异源多肽的方法，该方法包括使该细胞与如权利要求1至12中任一项所述的病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物相接触。
14.如权利要求1至12中任一项所述的病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物在制备用于在受试者中诱导针对一种异源多肽的免疫应答的方法的药物中的用途，该方法包括向该受试者给予如权利要求1至12中任一项所述的病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物。
15.如权利要求14所述的用途，其中该免疫应答包括一种体液免疫应答和/或一种细胞免疫应答。
16.如权利要求1至12中任一项所述的病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物在制备用于在受试者中表达一种异源多肽的方法的药物中的用途，该方法包括向该受试者给予如权利要求1至12中任一项所述的病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物。
17.如权利要求1至12中任一项所述的病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物在制备用于对受试者进行疫苗接种的方法的药物中的用途，该方法包括向该受试者给予如权利要求1至12中任一项所述的病毒表达载体、病毒颗粒、或组合物。
18.如权利要求14至17中任一项所述的用途，其中该病毒表达载体、该病毒颗粒、或该组合物是鼻内、肌内、局部、口服、或卵内给予的。
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