KR101334047B1 - 백신 효율을 모니터하고 개선시키기 위해 변형된 인플루엔자 바이러스 - Google Patents

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Abstract

인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 분자의 면역원성은 HA 서열내 아미노산을 치환시켜 증가될 수 있다. H5 HA의 224번 위치에서 아스파라긴과 같은 특이적 HA 잔기의 치환은 수용체 특이성 및/또는 항체-항원 결합을 변형시켜 헤마글루티닌 억제(HI) 분석의 민감성을 증가시킨다. 당해 치환을 포함하는 HA 분자는 진단학적 참조 바이러스 및 개선된 인플루엔자 백신의 개발에 유용할 것이다.
헤마글루티닌(HA), 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 백신

Description

백신 효율을 모니터하고 개선시키기 위해 변형된 인플루엔자 바이러스{Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2005년 8월 4일자로 출원된 미국 가출원 번호 제60/705,808호에 대한 우선권을 주장하고 이의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다.
연방 정부 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명을 이끈 연구는 기관[National Institute of Allergy and Infectious Disease]으로부터 승인번호 AI95357 및 기관[National Institutes of Health]의 암 센터 지원(CORE) 승인 번호 CA21765하에 지원되었다. 따라서, 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
콤팩트 디스크 첨부서류에 대한 참조
해당 사항 없음.
일반적인 의미에서, 본 발명은 일군의 인플루엔자 바이러스 서브타입의 항원 성 및/또는 면역원성을 증가시키는 것에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스
인플루엔자 바이러스인 가장 명백한 특정 종(strain)의 A 및 B 바이러스는 전세계적으로 이환율 및 사망률에 대한 심각한 원인이고 해마다 질환을 발병시킨다.
주기적이지만 불규칙적인 간격의 유행병이 발생하고 특히 고 위험의 병 및 사망을 유발한다. 보편적인 유행병은 역사적으로 분절된 게놈의 재구성(항원 변화 (antigenic shift))에 의해 생성되는 신규 인플루엔자 A 바이러스 서브타입 때문인 반면, 연간 유행병은 일반적으로 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 표면 항원의 진화(항원 부동 (antigenic drift)) 때문이다. 사람 인플루엔자 바이러스는 흔히 조류 (avian) 인플루엔자 바이러스 종으로부터 유래하므로, 인플루엔자 감염은 인수전염병 (zoonosis)을 기초로 한다. 또한, 돼지가 사람에서 병원성인 신규 조류 기원 종의 발생에 대한 중간 숙주("혼합 매체(mixing vessel)")로서 작용할 수 있다는 증거가 있다(문헌참조: Scholtissek et al, Virology 1985, 147:287). 1997년도 홍콩에서 H5N1 인플루엔자 A의 발병은 고도로 병원성인 인플루엔자 A 바이러스가 또한 조류 종에서 사람으로 직접 전염될 수 있음을 보여주었다(문헌참조: Claas et al, Lancet 1998, 351:472; Suarez et al, J.Virol. 1998, 72:6678; Subbarao et al, Science 1998, 279:393; Shortridge, Vaccine 1999, 17 (Suppl. 1): S26-S29). 2003년도에, 동남 아시아의 H5N1 바이러스는 상이한 동시 유행 유전자형을 포함했지만 2004년도에는 "Z-유전자형"으로서 공지된 단일 유전자형이 지배적이었다(문헌참조: Li et al, Nature 2004, 430:209). 현재 증거는 치명적인 사람의 경우가 조류로부터 사람에게 당해 유전자형이 직접 전염되어 발생하고 또한 이것이 고양이를 감염시키고 이어서 고양이간에 직접 전염됨을 지적한다(문헌참조: Kuiken et al., Science 2004, 306:241). 당해 바이러스의 변화하는 숙주 범위 및 광범위 분포에 대한 당해 증거 및 기타 증거는 H5N1 바이러스가 사람간에 전염될 수 있는 특성을 획득할 수 있다는 걱정을 유발하였다. 사람은 당해 신규 H5N1 바이러스에 대해 어떠한 면역성도 갖지 않고, 이로써 당해 바이러스는 재난적인 유행성 인플루엔자를 유발할 수 있다(문헌참조: Fouchier et al, Nature 2005, 435:419). 동물 보유고에서 유행성의 막대한 수의 종으로부터 신규 병원성 종을 생성시키는 인플루엔자 바이러스의 잠재력은 질환을 억제하기 위해서는 당해 바이러스를 모니터하고 개선된 항바이러스 치료법 및 백신을 개발할 필요성이 있음을 지적한다. 신규 바이러스 종이 발생하는 속도로 인해 당해 모니터를 위한 노력이 경주되어야되고 여기에는 신규 종에 대한 백신의 효율을 평가하기 위한 기술의 개선이 포함된다.
오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae) 계열의 인플루엔자 A, B 및 C 모두는 감염된 세포의 핵에서 복제되는 분절된 네가티브 쇄 RNA 게놈을 갖고 약 13kb의 조합적인 암호화 능력을 가지며 10개의 바이러스 단백질에 대한 유전자 정보를 포함한다. 구체적으로, 인플루엔자 바이러스는 RNA-지시된 RNA 폴리머라제 단백질 (PB2, PBl 및 PA), 핵단백질 (NP), 뉴라미니다제 (NA), 헤마글루티닌 (효소적 절단 후 서브유니트 HA1 및 HA2가 연합되어 구성되는 HA), 매트릭스 단백질 (Ml 및 M2) 및 비구조 단백질 (NSl 및 NS2)를 포함하는 적어도 10개의 폴리펩타이드를 암호화하는 8개의 네가티브 센스 RNA(nsRNA) 유전자 분절을 갖는다(문헌참조: Krug et al, In The Influenza Viruses, R.M. Krug, ed., Plenum Press, New York, 1989, pp. 89-152)).
최근에 개발된 역 유전학 시스템은 인플루엔자 바이러스 게놈의 조작을 가능하게 하였다(문헌참조: Palese et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11354; Neumann and Kawaoka, Adv. Virus Res. 1999, 53:265; Neumann et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345; Fodor et al, J. Virol. 1999, 73:9679). 예를 들어, pol I 프로모터로부터 8개의 인플루엔자 nsRNA의 플라스미드 구동 발현 및 폴리머라제 복합 단백질의 동시발현이 감염성 인플루엔자 A 바이러스를 형성시키는 것으로 입증되었다(Hoffmann et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97:6108).
인플루엔자 바이러스의 바이러스 입자는 크기가 약 125nm이고 네가티브 센스 바이러스 RNA의 코어가 핵단백질과 연합되어 이루어져 있고 지질 이중층 구조를 갖는 바이러스 외피로 둘려싸여 있다. 바이러스 외피의 내층은 주로 매트릭스 단백질로 이루어져 있고 외층은 대부분 숙주 유래 지질 물질을 포함한다. 소위 "표면 단백질"인 뉴라미니다제 (NA)와 헤마글루티닌 (HA)은 바이러스 몸체 표면상에 스파이크로서 나타난다. 신규 인플루엔자 바이러스의 감염성은 특이적 숙주 프로테아제에 의한 HA 절단에 의존하는 반면 NA는 세포 표면으로부터 자손 비리온의 방출에 관여하고 새롭게 형성된 바이러스가 뭉치는 것을 방지한다.
바이러스 외피에 삽입된 HA 및 NA 단백질은 인플루엔자 바이러스의 주요 항원성 결정인자이다(문헌참조: Air et al, Structure, Function, and Genetics, 1989, 6:341-356; Wharton et al, In The Influenza Viruses, R. M. Krug, ed., Plenum Press, New York, 1989, pp. 153-174). 인플루엔자 분절된 게놈의 재구성으로 인해, 새로운 HA 및 NA 변이체가 계속적으로 만들어지게 되고 새롭게 감염된 유기체는 어떠한 기억 면역 반응을 갖지 못한다. HA 당단백질은 중화 항체에 대한 주요 항원이고 바이러스 입자를 숙주 세포상의 수용체에 결합시키는데 관여한다.
상이한 바이러스 종 기원의 HA 분자는 핵산과 아미노산 수준에서 상당한 서열 유사성을 보여준다. 당해 수준의 유사성은 상이한 서브타입의 종이 다른 것 보다 높은 수준의 유사성을 명백하게 나타내는 몇몇 종과 비교되는 경우 다양하다(Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7643). 아미노산 유사성 수준은 하나의 서브타입의 바이러스 종과 기타 서브타입의 바이러스 종간에 다양하다 (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7643). 당해 다양성은 상이한 종의 구분되는 서브타입 및 진화적 유대를 설정하기에 충분하지만 상이한 종의 DNA 및 아미노산 서열은 여전히 통상적인 생물정보학 기술을 사용하여 용이하게 정렬된다(Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7643; Suzuki and Nei, MoI. Biol. Evol. 2002, 19:501).
인플루엔자 백신
미국 및 유럽에서 사용하기 위해 공공 보건 기관에 의해 승인된 인플루엔자 백신은 현재 미국에서 생약독화된 FLUMIST 백신 뿐만 아니라 불활성화된 인플루엔자 백신이다. 유행병적으로 중요한 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B를 제공하는 바이러스는 닭 유정란에서 증식시키고 이어서 바이러스 입자를 정제하고 화학적 수단에 의해 불활성화시켜 백신 스톡을 형성한다. 해마다, WHO는 그 해의 백신 개발을 위해 유행할 가능성이 가장 높은 서브타입을 선별한다.
인플루엔자 백신은 사람 백신 접종을 위해 1940년 초기 이후 및 말 백신 접종을 위해 1960년 후반 이후에 사용되어왔지만 유행병을 유발할 수 있는 신규 인플루엔자 바이러스의 출현 위협과 더불어 다양한 동물 보유고의 존재는 바이러스를 퇴치하기 위한 신규 치료 방법에 대한 연구를 가속화시켰다. 인플루엔자 분야에서 최근 몇 해에 여러 중요한 진척이 이루어졌다(문헌참조: Cox and Subbarao, Lancet 1999, 354:1277-82). 예를 들어, 실험적 생약독화된 비강내 투여된 3가 인플루엔자 백신이 인플루엔자 A H3N2 및 인플루엔자 B로부터 어린이를 보호하는데 매우 효과적인 것으로 나타났다. 현재(사멸된) 인플루엔자 바이러스 백신의 효능을 개선시키기 위한 기타 방법은 특이적 약독화 돌연변이를 포함하는 냉각 처리되고 유전자 조작된 인플루엔자 바이러스의 작제를 포함한다(문헌참조: Palese et al, J. Infect. Dis., 1997, 176 Suppl l:S45-9). 이들 유전자 변형된 바이러스(여기서,유행성 종 기원의 HA 및 NA 유전자가 재구성에 의해 혼입되었다)가 안전한 생 인플루엔자 바이러스 백신으로서 사람에서 오래 지속적인 보호 면역 반응을 유발하는데 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 냉각 처리된 백신은 어린이 및 청소년에서 효과적인 것으로 나타나지만 이들은 너무 약독화되어 있어 노인에서 이상적인 면역 반 응을 자극시킬 수 없고 미국에서 2만 내지 4만명의 주요 집단이 인플루엔자 감염 결과로서 해마다 사망하고 있다.
용이하게 입수가능한 백신은 신생 유행성 인플루엔자에 대해 가장 효과적인 수단을 제공할 것이다. 1997년 홍콩에서 H5N1이 발병한 이후, 2개의 상이한 방법에 의해 제조된 백신은 사람에서 시험되었다. A/오리/싱가포르/3/97로부터 제조된 통상적인 서브유니트 H5 백신은 사람 면역원성이 불량하고 심지어 항원적으로 밀접하게 관련된 종에 대해서도 및 다중 백신 접종후에도 불량하다(문헌참조: Nicholson et al., Lancet 2001, 357:1937; Stephenson et al, Journal of Infectious Disease 2005, 191:1210). 애쥬반트 MF59의 사용은 당해 H5 백신의 항체 역가를 증가시켰다 (Stephenson et al, Vaccine 2003, 21:1687). 비병원성 A/오리/HK/836/80(H3N1) 바이러스로부터 유래된 불활성화된 "스플릿" 백신 및 A/HK/156/97 (H5N1) 기원의 변형된 H5 헤마글루티닌을 사용한 백신 접종은 중화 항체에 대해 거의 검출가능한 역가를 유도하지 못하였다(문헌참조: Takada et al, Journal of Virology 1999, 73:8303). 따라서, 당해 H5N1 백신은 널리 허용되었지만 이들은 면역원성이 불량한 것으로 나타났다. 현재, H5N1 바이러스 종에 대해 효과적인 백신의 부재는 이들 바이러스가 유행병을 유발할 위험을 증가시킨다.
인플루엔자 백신 면역원성
혈청 항체 역가 방법은 백신접종 후 또는 바이러스 감염 후 면역 보호에 대해 허용되는 대용 수단이다. 주로 사용되는 혈청 항체 역가 방법은 바이러스 중화 역가 분석 및 헤마글루티닌 억제(HI) 역가 분석이다. 이들 분석은 시험관내 조건하에서 항원과 가교 반응하는 사람 혈청 기원의 인플루엔자 항체의 능력을 기초로 한다. 분석은 일관되고 적용가능한 결과를 제공하는 이의 능력 뿐만 아니라 각 분석 유형에 대한 사용의 용이함 및 설비 요건을 기준으로 주어진 상황에 따라 선별된다.
간략하게 언급하면, 바이러스 중화 분석은 혈청 샘플 기원의 항체가 인플루엔자 바이러스에 의한 배양된 세포의 감염을 차단하는 능력을 조사한다. 당해 분석은 여러 희석된 혈청 샘플(역가)을 제조하고 이들 희석물 각각을 표준양의 감염성 바이러스와 배합함에 의해 수행된다. 이어서 각각의 희석 혼합물을 정의된 세포 배양에 제공하고 수득한 감염 속도를 분석한다. 바이러스 중화 역가 분석은 주어진 개체에 존재하는 면역보호 수준의 항체를 조사하기 위해 극히 유용하고 믿을 수 있는 시험인 것으로 간주된다. 그러나, 그것은 특수화된 세포 배양 설비에 의존하고 따라서 일반적으로 유용하지 못하다. 당해 방법은 또한 다수의 샘플을 스크리닝하기에는 적합하지 않아서 어렵고 시간 소모적이다.
헤마글루티닌 억제(HI) 분석은 표준화된 참조 바이러스와 결합하는 혈청 샘플 기원의 항체의 능력을 유사하게 조사한다. 당해 분석의 기초는 인플루엔자 바이러스가 적혈구와 결합하여 응집한다는 사실이다. HI 분석에서, 여러 희석된 혈청 샘플은 표준양의 참조 바이러스와 혼합하고 일정 항온처리 기간 후 적혈구에 첨가한다. 이어서 참조 바이러스와 적혈구의 복합체로의 연합은 가시적으로 검출된다. 헤마글루티닌을 억제하는 최고의 혈청 희석물은 헤마글루티닌 억제 역가로서 판독된다. 기타 분석과 같이 백신 면역원성이 민감하지는 않지만 HI 분석은 이의 비교적 단순한 기술 및 실험 요건때문에 널리 사용되고 있다.
인플루엔자 백신 개발 및 평가를 위해 유용한 현재 기술에 대해 상기 논의된 한계점 때문에, 백신 효능 뿐만 아니라 감염 후 면역 반응을 시험하는 면역원성 평가 기술을 개선시킬 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 HA의 항원성 및 면역원성을 변화시킬 수 있는 인플루엔자 A의 헤마글루티닌(HA) 분자에서 아미노산 치환을 제공한다. 이들 치환은 수용체 특이성 및/또는 항체 항원 결합을 변화시킴에 의해 항원 부위를 변화시킬 수 있다. 다양한 양태에서, 치환으로부터 비롯되는 증가된 항원성은 감염된 동물로부터 채취된 혈청에 대한 헤마글루티닌(HI) 분석의 민감성을 증가시키는데 유용할 수 있다. 당해 정보는 진단학적 참조 바이러스 및 인플루엔자에 대한 새로운 백신의 제조에서 중요하다. 바람직하게, 아미노산 치환은 H5 HA 위치 223에서 아스파라긴의 아미노산 치환을 특징으로 하는 면역원성을 갖는 분자를 생성시킨다.
따라서, 특정 측면내에서, 본 발명은, 수용체 결합 부위에서 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체에 대하여 당해 HA 분자가 보다 항원성이 되게하는 수용체 결합 부위내 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 분자를 포함한다. 인플루엔자 바이러스는 HA 분자가 H5 HA에서 223번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 아스파라긴을 포함하여 항원성이 증가되었고 여기서, 아스파라긴의 포함은 야생형 HA 분자를 갖는 인플루엔자 바이러스에 노출된 동물 기원의 항혈청과의 반응성을 증가시켰다. 인플루엔자 바이러스는 HA 분자가 H5 HA에서 223번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 아스파라긴을 포함하여 항원성이 증가되었고 여기서, HA 분자는 사람 H5분리물 A/HK/213/03로부터 기원하지 않으며 223번 위치에서 아스파라긴의 포함은 인플루엔자 바이러스에 노출된 동물로부터 유래하는 항혈청과의 반응성을 증가시켰다. 몇몇 양태에서, 아미노산 치환은 당화 부위를 변화시킨다. 몇몇 양태에서, 인플루엔자 바이러스는 사람 인플루엔자 A 바이러스이다. 예를 들어, 사람 인플루엔자 A 바이러스는 H5 서브타입의 일원일 수 있다. 사람 인플루엔자 A 바이러스는 A/베트남/1203/04(H5N1) 바이러스일 수 있다. 몇몇 양태에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스이다. 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스로부터 유래하는 항원성이 증가된 HA 분자를 갖는 인플루엔자 바이러스를 포함한다.
기타 측면에서, 본 발명은, 수용체 결합 부위내 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 수용체 결합 부위내 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 분자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 재조합 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스의 유전적 배경에서 H5N1 인플루엔자 바이러스로부터 유래하는 변형된 HA 분자를 포함할 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스는 마스터 종 바이러스일 수 있다. 재조합 바이러스는 헤마글루티닌 억제(HI) 분석에서 진단학적 참조 바이러스로서 사용될 수 있다. 재조합 인플루엔자 바이러스는 헤마글루티닌 억제(HI) 분석 키트에 포함될 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 또한, 수용체 결합 부위에서 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 수용체 결합 부위내 아미노산 치환을 포함하는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 분자를 포함하는 바이러스를 제조하기 위한 역 유전학 시스템을 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 또 다른 측면은, 수용체 결합 부위내에서 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 수용체 결합 부위내 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 분자를 포함하는 바이러스를 제조하는 방법을 포함한다. 몇몇 양태에서, 당해 방법은 역 유전학 시스템에서 항원성이 증가된 HA 분자를 발현하는 재조합 벡터를 도입함을 포함한다.
관련 측면에서, 본 발명은 동물에서 인플루엔자 바이러스 백신의 효능을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 몇몇 양태에서, 당해 방법은 인플루엔자 바이러스 백신에 존재하는 수용체 결합 부위에서 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 수용체 결합 부위내 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 분자와 백신 접종된 동물로부터 유래하는 항혈청을 반응시킴을 포함한다. 몇몇 양태에서, 항원성이 증가된 HA 분자는 사람 H5N1 분리물 A/HK/213/03으로부터 기원하고 H5N1 바이러스 기원의 HA에서 223번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴의 포함은 백신 접종된 동물로부터 유래하는 항혈청과의 반응성을 증가시켰다. 몇몇 양태에서, 동물은 사람이다. 기타 양태에서, 동물은 흰담비이다.
본 발명의 기타 관련된 측면은 또한 헤마글루티닌(HA) 분자를 포함하는 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법을 제공하고, 당해 방법은 역 유전학 시스템을 배양함을 포함하고 여기서, HA를 암호화하는 DNA는 역 유전학 과정에 의해 수용체 결합 부위내 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 수용체 결합 부위내 하나 이상의 아미노산 치환을 암호화한다.
본 발명은 또한 헤마글루티닌 억제(HI) 분석의 민감성을 증가시키는 방법을 제공하고, 당해 방법은 수용체 결합 부위내 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되게 하는 수용체 결합 부위내 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 분자와, 백신 접종되거나 감염된 동물로부터 유래하는 항혈청을 반응시킴을 포함한다. 몇몇 양태에서, HI 분석의 민감성을 증가시키는 방법은 헤마글루티닌 억제(HI) 분석의 민감성을 2배 이상 증가시킨다. 몇몇 양태에서, HI 분석의 민감성을 증가시키는 방법은 헤마글루티닌 억제(HI) 분석의 민감성을 4배 이상 증가시킨다.
본 발명의 또 다른 측면은 동물이 인플루엔자 바이러스에 노출되었는지의 여부를 측정하기 위한 방법을 포함한다. 몇몇 양태에서, 당해 방법은, 문제의 인플루엔자 바이러스로부터 유래하지만, 수용체 결합 부위내 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 수용체 결합 부위내 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하여 항혈청과의 반응성을 증가시키는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 분자를 포함하는 진단학적 참조 바이러스와 동물 기원의 항혈청을 반응시킴을 포함한다. 몇몇 양태에서, 당해 동물은 사람이다. 기타 양태에서, 동물은 흰담비이다.
본 발명은 또 다른 측면에서, 동물이 인플루엔자 바이러스에 노출되었는지의 여부를 측정하기 위한 방법을 포함한다. 몇몇 양태에서, 문제의 인플루엔자 바이러스로부터 유래하지만, H5HA내 223번에 상응하는 위치에서 아미노산 아스파라긴을 포함하는 변형된 인플루엔자 바이러스 HA 분자를 포함하는 진단학적 참조 바이러스와 동물 기원의 항혈청을 반응시킴을 포함하고, 여기서, 아스파라긴의 포함은 야생형 HA 분자와, 인플루엔자 바이러스에 노출된 동물로부터 유래하는 항혈청과의 반응성을 증가시킨다. 몇몇 양태에서, 동물이 인플루엔자 바이러스에 노출되었는지의 여부를 측정하기 위한 방법은 문제의 인플루엔자 바이러스로부터 유래하지만 H5HA내 223번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 아스파라긴을 포함하는 변형된 인플루엔자 바이러스 HA 분자를 포함하는 진단학적 참조 바이러스와, 동물로부터 유래하는 항혈청을 반응시킴을 포함하고, 여기서, 당해 HA 분자는 사람 H5 분리물 A/HK/213/03로부터 유래하지 않고 223번 위치에 아스파라긴의 포함은 인플루엔자 바이러스에 노출된 동물로부터 유래하는 항혈청과의 반응성을 증가시킨다. 몇몇 양태에서, 동물은 사람이다. 몇몇 양태에서, 동물은 흰담비이다.
본 발명은 또한 수용체 결합 부위내 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자에 대해 특이적인 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 수용체 결합 부위내 아미노산 치환을 포함하는 헤마글루티닌(HA) 분자를 포함하는 인플루엔자 백신 바이러스를 포함하고 당해 변형은 당해 백신 바이러스의 면역원성을 증가시킨다.
본 발명의 한 측면은 수용체 결합 부위내 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 수용체 결합 부위내 하나의 아미노산 치환을 포함하는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 분자를 암호화하는 분리된 핵산을 포함한다. 몇몇 양태에서, 분리된 핵산에 의해 암호화된 인플루엔자 바이러스 HA 분자는 H5HA에서 223번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 아스파라긴을 포함하고 이때, HA 분자는 사람 H5 분리물 A/HK/213/03으로부터 유래하지 않고 223번 위치에서 아스파라긴의 포함은 인플루엔자 바이러스에 노출된 동물로부터 유래하는 항혈청과의 반응성을 증가시킨다.
본 발명은 또한 수용체 결합 부위내 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체에 대해 당행 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 수용체 결합 부위내 하나 의 아미노산 치환을 포함하는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 분자를 암호화하는 핵산을 제조하는 방법을 포함한다. 몇몇 양태에서, 당해 방법은 수용체 결합 부위내 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자를 암호화하는 핵산에 뉴클레오타이드 서열을 도입함을 포함하고, 이것은 HA 분자의 서열내에서 아미노산을 치환시켜 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자에 대한 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되도록한다.
본 발명은 하기의 발명의 상세한 설명 및 실시예에서 보다 상세하게 제시된 바와 같이 본 발명의 이들 측면 및 기타 측면을 충족시킨다.
도 1은 2003년 및 2004년에 분리된 H5N1 인플루엔자 바이러스로 접종된 흰담비에서 HI 항체 역가를 지적하는 그래프(A) 및 ΔH5N1/03 및 ΔH5N1/04 바이러스로 면역화된 흰담비에서 HI 및 바이러스 중화 역가를 지적하는 그래프 (B)이다. 도 1A에서, 혈청은 접종 후 28일째에 수거하였고 H5N1 바이러스의 EID50은 106이고 상동성 바이러스의 4개의 헤마글루티닌화 유니트(HAU)에 대해 적정하였다. 데이터는 2개 또는 4개의 혈청으로부터의 대표적인 값이다. 도 1B에서, 혈청은 ΔH5N1/03 및 ΔH5N1/04 바이러스의 7 μg HA 를 사용하여 2회 백신 접종된 흰담비로부터 수거하였고 4개의 HAU에 대해 적정하였고 상동성 바이러스 각각의 TCID50은 100이다.
도 2는 A/베트남/1203/04(H5N1) 바이러스로 챌린지 후 백신 접종된 흰담비 및 대조군 흰담비의 비강 세척에서 바이러스 역가를 지적하는 그래프이다. ΔH5N1/04 또는 ΔH5/04 재조합 바이러스로 백신접종된 흰담비는 EID50이 106인 A/베트남/1203/04 바이러스로 비강내 접종하였다. 역가는 3마리의 흰담비의 비강 세척물에서 측정된 평균값 (log10 EID50/0.1ml)±SD이다.
백신 접종된 그룹과 대조군 그룹간의 역가의 차이는 쌍을 이루지 않은 t 시험 결과에 따라 유의적임을 주지한다(P 값 0.0028 - 0.0173).
도 3은 A/오리 /싱가포르 /3/97 (H5N3) 바이러스의 HA의 3D 구조에서 154번 및 223번의 아미노산 위치를 보여주는 H5HA 폴리펩타이드 분자 모델이다. 도 3A에 서, 3D 구조에서 아미노산의 수용체 결합 부위를 나타낸다. 도 3B에서, 원형은 보여지는 단량체와 3량체 HA에서 다른 2개의 단량체(보이지 않음)간의 접지면을 보여준다. 223번 위치에서 아미노산은 222번 위치에 일반적으로 존재하는 글루타민과 224번 위치에 일반적으로 존재하는 글라이신 사이의 수용체 결합 도메인의 220-루프에 위치한다.
본 발명은 변화가 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 분자의 아미노산 서열 변화를 제공한다. 당해 서열 변화는 치환 및 결실을 포함한다. 수득한 HA는 "항원성 증가된 HA"로서 언급된다.
항원성이 증가된 HA 분자는 변화가 혈청내 인플루엔자 바이러스에 대한 항체의 진단학적 시험의 민감성을 증가시킴으로써 백신 효능을 시험하는데 유용하다. 특정 양태에서, 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스이다. 또 다른 양태에서, 바이러스는 또한 인플루엔자 B 바이러스이고 또 다른 양태에서, 이것은 인플루엔자 C 바이러스일 수 있다. 인플루엔자가 인플루엔자 A 바이러스인 양태에서 이것은 H5-서브타입 인플루엔자 A 바이러스일 수 있다. 보다 특정 양태에서, H5-서브타입 HA 분자는 223번 위치(N223)에서 아미노산 아스파라긴을 포함하도록 변형되고 이것은 H5-서브타입 인플루엔자 바이러스에 노출된 동물로부터 유래하는 항혈청과의 반응성을 증가시킨다. 특정 양태에서, 본 발명의 HA 분자는 A/HK/213/03 HA 분자가 아니고 이것은 223번 위치에 아스파라긴을 갖는 천연의 H5-서브타입이다. 인플루엔자 바이러스는 A/베트남/1203/04 (H5N1) 바이러스를 포함하는 H5 서브타입의 사람 인플루엔자 A 바이러스일 수 있다.
HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 아미노산 변화는 예를 들어, 도 3A에 도시된 바와 같이 HA의 수용체 결합 도메인, 특히, 수용체 결합 도메인내 220 루프 영역내에서 만들어질 수 있다. 당해 변화는 적혈구상의 시알산 수용체로의 HA 결합을 감소시킬 수 있고 따라서 헤마글루티닌화를 억제하는 항-HA 항체의 능력을 증가시키고 헤마글루티닌화 억제 분석에서 항체 결합 활성의 효과를 증폭시킨다. 또한, HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 아미노산 변화는 HA 단백질상의 당화 부위, 특히, HA-특이적 항체에 의해 인지되는 HA상의 에피토프를 엄폐하는 당화 부위를 변화시키거나 결실시키도록 만들어질 수 있다. 또 다른 양태에서, 아미노산 변화는 H5 HA 서브타입의 잔기 223에 상응하는 아미노산 잔기에 대해 만들어질 수 있다. 본 발명의 모든 양태에서, HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 아미노산 변형은 특정 HA 서브타입에 대해 특이적인 항체를 사용하는 면역분석에 의해 용이하게 동정될 수 있다. HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 변형은 항체가 유발된 HA 분자와의 결합 활성에 비하여 명백하게 역가가 보다 높은 항체 결합 활성을 유도한다. 당해 분석은 헤마글루티닌 억제(HI) 분석을 포함한다.
특정 양태에서, H5-서브타입 HA 분자에서 세린 잔기(이것은 당화된 잔기일 수 있다)의 아스파라긴(이것은 당화되지 않거나 상이하게 당화된 것일 수 있다)으로의 치환은 항원성을 증가시킨다. 그러나, 다른 치환은 또한 항원성을 명백하게 증가시킬 수 있다. 당해 치환은 트레오닌의 세린으로의 치환 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환과 같은 보존성 치환일 수 있지만 그럴 필요는 없다. 이들은 세린 대신 아스파라긴, 또는 아스파르트산 대신 라이신과 같이 동일한 변화를 유지하는 것 없이 극성을 보존하면서 상대적 극성을 보존할 수 있다. 이것은 또한 폴리펩타이드 구조에 많은 영향을 미치지 않은 반응성 측쇄를 제거하는 글라이신 및 알라닌 잔기과 같은 잔기로의 치환이 고려된다. 최종적으로, 완전히 비보존성 변화가 가능하다. 또한, 단순한 면역분석은 특정 변화가 항원성을 증가시킬 것인지를 지적할 것이다.
중남부 아메리카에서 분리된 몇몇 조류 H5N1 바이러스는 223번 위치에 염기성 아미노산인 아르기닌을 갖는다. 223번 위치에 중성 아미노산인 아스파라긴은 사람 분리물 A/HK/213/03의 HA에서 발견된다. 이러한 아미노산 잔기는 222번 위치에 일반적으로 존재하는 글루타민과 224번 위치에 일반적으로 존재하는 글라이신 사이의 수용체 결합 도메인의 220-루프에 위치한다(도 3). 당해 실험적 증거는 보다 높은 HI 역가가 수용체 특이성에서의 변화를 반영하는 것임을 시사한다. 실질적으로, 222번 위치에 일반적으로 존재하는 글루타민과 224번 위치에 일반적으로 존재하는 글라이신은 시알산 수용체에 직접 결합한다. 220 루프 또는 이에 인접한 아미노산은 수용체 결합 포켓의 형태를 위해 중요하다(문헌참조: Ha et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98:11181). 본 발명은 관찰된 효과의 임의의 특정 설명에 의존하지 않지만 이것은 H5의 223번 위치에서 세린 대신 아스파라긴으로의 치환이 형태적 변화와 변형된 수용체 특이성을 유도할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명에 따라, 보다 항원성이도록 변형된 HA 분자는 또한 보다 면역원성이다. 당해 분자는 인플루엔자 백신의 성분으로서 보다 강하거나 보다 강력한 면역 반응을 유발할 수 있고 따라서 인플루엔자 감염으로부터 보다 큰 보호를 유도한다.
조류 보유고로부터 유래하는 인플루엔자 바이러스는 특히 대중 보건에 대해 관심대상이다. 이들 바이러스는 특히 사람에서 유행성 인플루엔자 발병을 유발할 가능성이 높은 것으로 사료된다. 항원성 및/또는 면역원성이 증가된 조류 서브타입 기원의 HA 분자는 따라서 백신 개발과 연계하여 수행되는 면역분석에 유용하다. H5와 관련하여 본원에 예시된 전략은 기타 HA 서브타입에 대하여 HI(헤마글루티닌 억제) 분석 역가를 증가시키는데 특히 유용하고 이것은 특히 조류 인플루엔자에 대한 면역을 평가하기 위해 유용하다. 몇몇 양태에서, 수용체 결합 부위에서 아미노산이 치환된 HA 분자는 포괄적으로 서브타입 H1 내지 H16을 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스로부터 유래할 수 있다.
본 발명의 한 측면은 면역 분석, 특히 HI 분석에서 참조 바이러스로서 HA 분자의 항원성이 증가된 재조합 인플루엔자 바이러스의 용도를 포함하고, 당해 분석을 수행하기 위한 키트를 포함한다. 예를 들어, H5 HA 분자내 223번 위치에서 아스파라긴의 아미노산 치환은 알파 2,6- 결합을 통한 적혈구(RBC) 시알산 수용체(예를 들어, 닭 기원의 수용체)로의 결합을 증가시키지만 N-글리코실 시알산 알파 2,3-결합을 통한 수용체(예를 들어, 말 기원의 수용체)로의 결합을 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 말 RBC에 대해 수득한 보다 낮은 결합이 헤마글루티닌화를 억제하는데 보다 소량의 항체를 요구할 것임을 시사한다. 항체 결합에 의해 측정되는 바와 같이 아미노산 치환을 도입하여 항원성을 증가시킨다는 당해 개념은 조류 인플루엔자 A 바이러스 기원의 것들을 포함하여 모든 16개 HA 서브타입에 적용될 수 있다.
본 발명은 동물에서 인플루엔자 바이러스 백신의 효과를 측정하기 위한 방법을 포함한다. 이러한 방법은 백신 접종된 동물 기원의 항혈청을 헤마글루티닌(HA) 분자의 항원성을 증가시키는 인플루엔자 바이러스와 반응시킴을 포함한다. 실시예에서 입증된 바와 같이, 동물에서 인플루엔자 바이러스 백신의 효과를 측정하는 방법의 몇몇 측면은 백신 접종된 동물로부터 유래하는 항혈청을, 223번에 위치에 아미노산 아스파라긴(N223)을 포함하는 인플루엔자 바이러스 H5-서브타입 HA 분자(예를 들어, 사람 H5N1 분리물 A/HK/213/03 기원의 HA 분자)와 반응시킴을 포함한다. 223번 위치에서의 아스파라긴은 상이한 H5 인플루엔자 바이러스에 노출된 동물로부터 유래하는 항혈청과의 반응성을 증가시켰다. 백신 접종된 동물은 흰담비 및 사람을 포함하는, 임의의 다수의 종일 수 있다.
또한, 본 발명은 항원성이 증가된 HA 분자를 포함하는 참조 바이러스를 사용하여 HI 분석의 민감성을 증가시키는 방법을 포함한다. 몇몇 양태에서, HA 분자가 A/HK/213/03 종의 사람 H5N1 분리물로부터 기원하는 경우에서와 같이, 223번 위치에서 아미노산이 아스파라긴으로 변화되어 A/베트남/1203/04와 같이, 223번 위치에서 상이한 아미노산 잔기를 갖는 H5 인플루엔자 바이러스에 노출된 동물로부터 유래하는 항혈청과의 반응성을 증가시킨다. 이러한 증가된 반응성은 반응성에서 2배 이상 또는 4배 이상의 증가를 포함하는 임의의 수준일 수 있다. 민감성에 있어서 2배 또는 4배 증가는 특히, 통상적인 적정 방법의 종점이 검출 한계 미만에 있는 상황에서 특히 중요할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 또한 223번 위치에서 아스파라긴 아미노산을 가져 H5 인플루엔자 바이러스에 노출된 동물로부터 유래하는 항혈청과의 반응성을 증가시키는 변형된 H5-서브타입 HA 분자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 진단학적 표준 바이러스로서 사용함을 포함한다. 특정 양태에서, 진단학적 참조 바이러스에서 H5 HA 분자는 A/HK/213/03 종의 사람 H5N1 분리물로부터 기원한다. 또 다른 양태에서, 아스파라긴(또는 글루타민)은 또 다른 인플루엔자 종 기원의 H5 분자의 223번 위치에서 치환된다. 동일한 방법이 임의의 인플루엔자 종 기원의 임의의 HA 분자에 적용될 수 있음은 명백하다. 다양한 양태에서, 동물은 흰담비 및 사람을 포함하는, 다수의 종일 수 있다.
사람 백신 임상적 시험에서 민감성이 증가된 참조 바이러스의 용도 뿐만 아니라, 당해 바이러스는 혈청역학적 연구에서 사용될 수 있다. 얼마나 많은 사람이 HI 분석 처럼 신속하고 단순한 검출 방법에 의해 H5N1 바이러스로 감염되는가를 보여주는 데이터의 유용성은 사람에서 만연되는 H5N1 바이러스에 대한 중요한 정보를 제공한다. 이러한 데이터를 사용하여 사람에서 사람으로 또는 조류와 사람간의 H5N1 바이러스 전염의 개연성을 평가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 동물로부터 유래하는 항혈청을 진단학적 참조 바이러스와 반응시킴에 의해 동물이 인플루엔자 바이러스에 노출되었는지의 여부를 측정하는 방법을 포함한다. 진단학적 참조 바이러스는 노출 바이러스와 동일한 종의 인플루엔자 바이러스로부터 유래하지만 참조 바이러스는 항원성이 증가된 HA 분자를 포함한다. 한 양태에서, 참조 바이러스는 H5HA에서 223번에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 갖는 HA 분자를 포함하고, 여기서, 아스파라긴의 내포는 야생형 HA 분자를 갖는 인플루엔자 바이러스에 노출된 동물로부터 유래하는 항혈청과의 반응성을 증가시킨다. 또 다른 양태에서, 참조 바이러스는 H5HA에서 223번에 상응하는 위치에서 아미노산 아스파라긴을 포함하는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 분자를 포함하고 HA 분자는 사람H5 분리물 A/HK/213/03으로부터 기원하지 않고 223번 위치에 아스파라긴의 포함은 인플루엔자 바이러스에 노출된 동물로부터 유래하는 항혈청과의 반응성을 증가시킨다. 특정 양태에서, 해당 바이러스는 H5N1 바이러스이고 참조 바이러스는 사람 H5N1 분리물 A/HK/213/03이고, 이것은 223번 위치에 아스파라긴을 포함하여 H5N1 특이적 항혈청과의 반응성이 증가된다. 본 발명의 상이한 측면에서, 동물은 흰담비 및 사람을 포함하는 임의의 종일 수 있다.
본 발명은 또한 항원성이 증가된 HA 분자를 포함하는 인플루엔자 백신을 포함한다. 특정 양태에서, 당해 바이러스는 사람 H5N1 분리물이다. 보다 특정 양태에서, HA는 A/HK/213/03로부터 유래한다. 또 다른 양태에서, HA는 223번 위치에서 아미노산 아스파라긴을 포함하도록 변형된 H5이다.
HA 분자에서 변형의 도입은 유전자 수준에서 조작되어야만 하고 이는 당업계에 널리 공지되어 있고 하기에서 보다 상세하게 설명된다. 변형된 HA 유전자를 제조하는 경우, 다수의 방법이 유용하고 예를 들어, 변형된 HA 분자를 인플루엔자 바이러스로 도입함에 따라 당해 바이러스는 백신 효과를 시험하기 위한 표준 바이러스 또는 동물-사람 바이러스 전염 및 사람-사람 바이러스 전염을 포함하는, 인플루엔자 유행병에 따른 진단학적 참조 바이러스가 될 수 있도록 하는, "역 유전학 (reverse genetics)" 방법이 있다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 변화가 결핍된 HA 분자에 대해 특이적인 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 하나 이상의 아미노산 서열 변화를 갖는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 분자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 아미노산 서열 번화는 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실을 포함할 수 있다. 변형된 HA 분자는 인플루엔자 A 바이러스의 유전적 배경에서 H5N1 인플루엔자 바이러스로부터 유래할 수 있다. 몇몇 양태에서, 인플루엔자 A 바이러스는 마스터 종 바이러스이다. 아미노산 서열 변화가 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체에 대해 보다 항원성인 변형된 HA 분자를 포함하는 재조합 바이러스는 헤마글루티닌 억제(HI) 분석에서 진단학적 참조 바이러스로서 사용될 수 있다. 재조합 바이러스는 또한 헤마글루티닌 억제(HI) 분석 키트에 포함될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 헤마글루티닌(HA) 분자를 포함하는 바이러스를 제조하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 한 측면은 변화가 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 하나 이상의 아미노산 변화를 갖는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 분자를 포함하는 바이러스를 제조하는 방법이다. 당해 방법은 역 유전학 시스템에서 변형된 HA를 발현하는 재조합 벡터를 도입함을 포함할 수 있다. 헤마글루티닌(HA) 분자를 갖는 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법은 역 유전학 시스템을 항온처리함을 포함할 수 있고, 당해 시스템에서 HA를 암호화하는 DNA는 역 유전학 과정에 의해 수용체 결합 부위에서 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체와 관련하여 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 수용체 결합 부위내에서 치환되는 아미노산을 암호화한다.
또한 본 발명은 헤마글루티닌(HA) 분자를 암호화하는 핵산을 제조하기 위한 방법을 포함한다. HA 분자는 변화가 결핍된 HA 분자에 특이적인 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 하나 이상의 아미노산 서열 변화를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 당해 방법은 수용체 결합 부위에서 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자를 암호화하는 핵산으로 뉴클레오타이드 서열을 도입하여 아미노산 치환이 결핍된 HA 분자에 대한 항체에 대해 당해 HA 분자를 보다 항원성이 되게하는 HA 분자내 아미노산을 치환함을 포함한다.
정의
용어 "인플루엔자 바이러스"는 본원에서 병원성 종이 인플루엔자 또는 감기로서 공지된 질환을 유발하는 바이러스 종을 정의하는데 사용된다.
용어 "마스터 종 (master strain) 바이러스"는 고증식 또는 약독화된 백신 종의 작제에 사용되는 바이러스 종을 언급한다. 이들 마스터 종은 전형적으로 6개의 유전자 분절들을 백신 바이러스 (PBl, PB2, PA, NP, NA, M 및 NS)에 제공한다. 마스터 종 바이러스는 또한, 바이러스 종 A/PR/8/34를 포함하여, 백신 성분으로서 사용되는 종일 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 아미노산 중합체를 언급하고 특정 길이의 생성물을 언급하지 않으며 따라서 펩타이드, 올리고펩타이드 및 단백질은 폴리펩타이드의 정의내에 포함된다. 당해 용어는 또한 폴리펩타이드의 해독후 변형, 예를 들어, 당화, 아세틸화, 인산화등을 언급하지 않거나 이를 배제한다.
본원에 사용된 바와 같이, "감염성"은 바이러스가 세포내에서 복제하여 바이러스 입자를 생산하는 능력을 언급한다. 감염성은 바이러스 즉, 바이러스 부하 (load)를 검출하거나 동물내 질환 진행을 관찰함에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 "개체" 또는 "피검체 " 또는 "동물"은 네가티브 쇄 RNA 바이러스 감염, 특히, 인플루엔자 바이러스 감염을 지지하는, 새(예를 들어, 물새 및 닭), 포유동물 종의 일원, 예를 들어, 개, 고양이, 이리, 족제비, 설치류(라신, 쥐등), 말, 소, 염소, 돼지 종 및 사람을 포함하는 영장류를 포함하지만 이에 제한되지 않는 척추동물을 언급한다. 특정 양태에서, 피검체는 인플루엔자를 연구하기 위해 양호한 동물 모델인 흰담비이다. 또 다른 양태에서, 피검체는 사람이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역원성"은 바이러스 또는 폴리펩타이드가 체액성 또는 세포성 면역 반응을 유발할 수 있음을 의미하고 바람직하게는 둘다를 유발할 수 있음을 의미한다. 면역원성 실체는 또한 항원성이다. 면역원성 조성물은 동물에게 투여되었을 때, 체액성 또는 세포성 면역 반응, 또는 둘다를 유발하는 조성물이다.
면역계의 항원 인지 분자, 예를 들어, 면역글로불린(항체) 또는 T 세포 항원 수용체와 특이적으로 반응할 수 있는 경우, 분자는 "항원성"이다. 항원성 폴리펩타이드는 약 5개 이상 및 바람직하게는 약 10개 이상의 아미노산의 에피토프를 포함한다. 본원에서 소위 "에피토프"라고 불리우는 폴리펩타이드의 항원성 부위는 항체 또는 T 세포 수용체 인지를 위한 부위일 수 있거나 항원성 부위를 면역화를 위해 담체 폴리펩타이드에 접합시킴에 의해 분자에 대한 항체를 생성시키는데 사용되는 부위일 수 있다. 항원성인 분자는 그 자체가 면역원성, 즉, 담체 없이 면역 반응을 유발할 수 있는 것일 필요는 없다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산 치환"은 당해 분자의 아미노산 서열중에 특정 위치에서의 아미노산의 존재를 언급한다. 아미노산 치환은 당해 위치를 차지할 수 있는 임의의 다른 아미노산에 상대적으로 존재한다. 아미노산 서열이 변화된 폴리펩타이드는 아미노산 치환 뿐만 아니라 임의의 기타 아미노산 변형 또는 당화, 아세틸화 또는 인산화와 같은 해독 후 변형을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "역 유전학 시스템"은 유전자 조작 방법에 의해 인플루엔자 바이러스 입자, 폴리펩타이드, 비리온 또는 핵산을 제조하는 방법을 언급한다. 당해 방법은 호프만(Hoffman) (Hoffmann et al, Vaccine 2002, 20:3165; 미국특허공보 2002/0164770A1, 7 November, 2002, 이의 전반적인 내용이 본원에 참조로서 인용된다)에 의해 기재된 바와 같은 "플라스미드 시스템"을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로 말해서, 역 유전학 시스템은 당업자에게 공지된 유전자 조작 방법에 의해 바이러스 입자, 폴리펩타이드 및/또는 핵산의 생성을 허용한다. 이들 시스템은 또한 하기에서 보다 상세하게 기재된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "수용체 결합 부위"는, 적혈구 세포상의 시알산 수용체와 같은 목적하는 수용체가 결합하는 HA 분자의 일부를 언급한다. A/오리/싱가포르의 H5 분자의 구조 및 H5 서브타입의 헤마글루티닌에 대한 수용체 결합 부위의 위치는 공지되어 있고 문헌 (Ha et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001 98:11181)에 기재되어 있다. 수용체 결합 부위를 포함하는 당해 H5 HA의 분자 모델은 도 3에 나타낸다.
용어 "진단학적 참조 바이러스"는 HA 항원성이 증진된 바이러스를 언급한다. 당해 진단학적 참조 바이러스는 면역 분석, 예를 들어, 헤마글루티닌 억제 분석에 사용될 수 있다.
용어 "노출 바이러스"는 개개의 동물이 노출되는 바이러스를 언급한다. 당해 노출은 감염된 피검체와의 접촉과 같이, 예를 들어, 감염성 인플루엔자 바이러스에 대한 사람의 노출을 유발하는, 매일 활성 과정중에 있을 수 있다. 당해 노출은 또한 흰담비와 같은 실험 동물이 의도적으로 바이러스에 노출되는 실험 시험 상황에서와 같이 특정 임상적 챌린지로 인한 것일 수 있다. 당해 노출은 인플루엔자 백신으로의 면역화를 통해 명백히 합성될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는"은 약제학적으로 허용되고 전형적으로 알레르기성 또는 유사한 적당치 못한 반응, 예를 들어, 사람에게 투여되었을 때 위장 전도, 졸음, 현기증등을 유발하지 않는 분자 실체 및 조성물을 언급한다. 바람직하게, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물 및 보다 특히 사람에 사용하기 위해 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 승인된 약전에 목록화된 것을 의미한다.
용어 "담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애쥬반트, 부형제 또는 비히클을 언급한다. 당해 약제학적 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들을 포함하는 멸균 액체(예를 들어, 물 및 오일), 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 미네랄유, 참깨유등일 수 있다. 물 또는 수용액 식염수 및 액상 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 바람직하게 담체로서, 특히, 주사용액용으로 사용된다. 적합한 약제학적 담체는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin, 18th Edition]에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "애쥬반트"는 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 화합물 또는 혼합물을 언급한다. 애쥬반트는 항원을 느리게 방출시키는 조직 데포우 및 또한 면역 반응을 비특이적으로 증진시키는 림프계 활성화 인자로서 작용할 수 있다 (Hood, et al, Immunology, Second Ed., Menlo Park, CA: Benjamin/Cummings, 1984. p. 384). 흔히, 애쥬반트 부재하의 항원 단독으로의 1차 챌린지는 체액성 또는 세포성 면역 반응을 유발하지 못한다. 애쥬반트는 완전 프로인트 애쥬반트, 불완전 프로인트 애쥬반트, 사포닌, 미네랄 겔, 예를 들어, 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 예를 들어, 리소렉시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리아니온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 및 잠재적으로 유용한 사람 애쥬반트, 예를 들어, N-아세틸-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(r-2'-디팔리미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민, BCG바실 칼메트 기에리피(bacille Calmette-Giierif)) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 애쥬반트는 약제학적으로 허용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분리된"은 참조 물질이 이의 천연 환경, 예를 들어, 세포 또는 바이러스로부터 제거됨을 의미한다. 따라서, 분리된 생물학적 물질은 몇몇 또는 모든 세포 성분, 즉, 천연 물질이 천연적으로 존재하는 세포 성분(예를 들어, 세포질 또는 막 성분)이 부재일 수 있다. 물질은 이것이 세포 추출물 또는 상등액중에 존재하는 경우, 분리된 것으로 간주된다. 핵산 분자의 경우, 분리된 핵산은 PCR 생성물인 분리된 mRNA, cDNA 또는 제한 단편을 포함한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 바람직하게 이것이 발견될 수 있는 염색체로부터 절단되고 보다 바람직하게는 비-암호화 영역에 더 이상 연결되어 있지않거나 인접해 있지 않거나(그러나, 이의 본래의 조절 영역 또는 이의 일부에 연결될 수 있다) 염색체중에서 발견되는 경우, 분리된 핵산 분자에 의해 함유된 유전자의 업스트림 또는 다운스트림에 위치한 기타 유전자에 더 이상 연결되어 있지 않거나 인접해있지 않을 수 있다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 하나 이상의 인트론이 결핍되어 있다. 분리된 핵산 분자는 즉, 이것이 키메라 재조합 핵산 작제물의 일부를 형성하는 경우, 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체등으로 삽입된 서열을 포함한다. 따라서, 특정 양태에서, 재조합 핵산은 분리된 핵산이다. 분리된 단백질은 이것이 세포에서 연합되어 있었던 기타 단백질 또는 핵산 또는 둘다와 연합되어 있을 수 있거나 이것이 막 연합 단백질인 경우 세포 막과 연합되어 있을 수 있다. 분리된 기관, 세포 또는 조직은 이것이 유기체에서 발견되는 해부학적 위치로부터 제거된다. 분리된 물질은 정제된 것일 수 있으나 그럴 필요는 없다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "정제된"은 비관련된 물질, 즉, 물질이 수득되는 천연 물질을 포함하는 오염물의 존재를 감소시키거나 이를 제거하는 조건하에서 분리된 물질을 언급한다. 예를 들어, 정제된 비리온 (virion)에는 바람직하게, 숙주 세포, 또는 조직 배양물 또는 난단백질, 비특이적 병원체등을 포함하는 배양 성분이 실질적으로 없다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 없는"은 물질의 분석 시험 과정에서 작동적으로 사용된다. 바람직하게, 오염물이 실질적으로 없는 정제된 물질은 50% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 및 보다 더 바람직하게는 99% 이상 순수하다. 순도는 크로마토그래피, 겔 전기영동, 면역분석, 조성 분석, 생물학적 분석 및 당업계에 공지된 기타 방법에 의해 평가될 수 있다.
정제 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 바이러스 입자는 한외여과 또는 한외원심분리, 바람직하게는 연속 원심분리(Furminger, 상기 참조)에 의해 정제될 수 있다. 기타 정제 방법이 가능하고 본원에서 고려된다. 정제된 물질은 이것이 본래에 연합되어 있었던, 세포 성분, 배지, 단백질 또는 기타 바람직하지 못한 성분 또는 불순물(기재된 바와 같은) 약 50% 미만, 바람직하게는 약 75% 미만 및 가장 바람직하게는 약 90% 미만을 함유할 수 있다. 용어 "실질적으로 순수한"은 당업계에 공지된 통상적인 정제 기술을 사용하여 성취될 수 있는 최고의 순도를 지적한다.
특정 양태에서, 용어 "약" 또는 "대략적으로"는 통계학적으로 의미있는 범위내의 값을 의미한다. 당해 범위는 특정 규모 정도내에서, 주어진 값 또는 범위에 대해 바람직하게는 50%, 보다 바람직하게는 20%, 보다 더 바람직하게는 10% 및 보다 더 바람직하게는 5%이내일 수 있다. 용어 "약" 또는 "대략적으로"에 의해 포함되는 허용가능한 변화는 연구중의 특정 시스템에 의존하고 당업자가 용이하게 판단할 수 있다.
헤마글루티닌
헤마글루티닌 (HA)은 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 주요 외피 당단백질이다. 인플루엔자 C 바이러스의 헤마글루티닌-에스테라제(HE)는 이들 바이러스중의 HA 상동체이다. 전형적으로 인플루엔자 바이러스의 천연의 보유고인 것으로 공지된 물새로부터 도입된 HA 분자의 신규 서브타입은 인플루엔자 유행병을 유발한다(문헌참조: Suzuki and Nei, MoI. Biol. Evol. 2002; 19(4): 501-509).
HA는 단일 유전자에 의해 암호화되고 시그날 펩타이드의 제거를 포함하는 단일 전구체 분자의 단백질가수분해로부터 유래된 2개의 폴리펩타이드 쇄, HA1 및 HA2를 포함한다(문헌참조: Suzuki and Nei, 상기 참조; Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981; 78(12): 7639-7643). HAl은 약 320개의 아미노산을 갖고 수용체 결합 단백질이며 면역 반응의 주요 표적이다. HA2는 약 220개의 아미노산을 갖고 바이러스 외피에 대한 앵커를 제공한다(문헌참조: Suzuki and Nei, 상기 참조).
인플루엔자 A 기원의 HA 유전자는 이의 항원 성질에 따라 16개의 서브타입으로 분류된다. 인플루엔자 B 및 C 바이러스 HA(HE) 유전자는 서브타입으로 분류되지 않는다. 인플루엔자 서브타입 H1 내지 H15, 및 인플루엔자 B 및 C HA(HE)의 서열은 본원에 참조로서 인용되는 문헌(Suzuki and Nei, 상기 참조, Figure 1)에 보여진다. 모든 12개의 서브타입 기원의 보존된 아미노산 잔기를 포함하는, 인플루엔자 A HA 서브타입 Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, HlO, HI l, 및 H12의 비교는 본원에 참조로서 인용되는 문헌[Figure 1 of Air, 상기 참조]에서 보여진다. 2개 문헌은 이들 서열이 수득된 종을 기재한다.
본 발명의 신규 HA 분자는 HA 분자의 아미노산 서열에, 항원성을 증가시키는 변화를 도입함에 의해 제조된다. 당해 HA 분자를 암호화하는 핵산의 분리는 통상적이고(문헌참조: Air, 상기 참조), 아미노산 서열중에 변화를 도입하기 위한, 예를 들어, 부위 지시된 돌연변이 유발에 의한 핵산의 변형도 마찬가지이다.
또 다른 양태에 있어서, 특정 HA 서브타입의 하나의 종 기원의 HA 분자는 이미, A/베트남/1203/04에 상대적으로 A/HK/213/03에 대해 본원에 예시된 바와 같은 상이한 종 기원의 동일 서브타입의 HA 분자에 비해 이의 항원성을 증가시키는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 경우, 항원성이 보다 큰 HA 분자를 갖는 인플루엔자 종은 진단학적 표준 종으로서 작용할 수 있다. 또 다른 양태에서, 보다 큰 항원성의 HA 기원의 아미노산 잔기가 덜 항원성인 HA 분자의 서열에 도입되거나 치환되어 HA 분자의 항원성이 증가되도록 할 수 있다.
HA 분자의 서열중에 다양한 변화가 항원성을 증가시킬 수 있다. 상기된 바와 같이, HA1 쇄는 수용체 결합 도메인 및 면역 반응의 주요 표적이고 당해 변화가 만들어질 수 있는 쇄이다. 당해 변화는 예를 들어, 에피토프를 만드는 당화 부위를 제거하거나 증진된 항체 결합 친화성을 갖는 형태를 선호함에 의해 HA 분자의 항체 친화성을 증가시킬 수 있다. 또한, 당해 변화는 HA 수용체, 예를 들어, 적혈구상의 시알산 수용체로의 결합을 감소시켜 HA 분자에 특이적인 항체가 헤마글루티닌 반응에 대해 보다 효과적인 경쟁인자가 되도록 한다. 헤마글루티닌 억제(HI) 분석을 포함하는, 당해 변화를 입증할 수 있는 다양한 면역 분석은 당업계에 널리 공지되어 있다.
HI 분석은 현재 백신 처럼, 전체 인플루엔자 바이러스 입자를 포함한다. 따라서, 본 발명은 항원성이 증가된 HA 분자를 갖는 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 당해 바이러스는 "역 유전학" 방법을 통해 간편하게 제조되지만 이것은 또한 통상적인 재구성을 사용할 수 있다.
역 유전학 방법
최근에 개발된 역-유전자 시스템은 인플루엔자 바이러스 게놈의 조작을 가능하게 하였다(문헌참조: Palese et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11354; Neumann and Kawaoka, Adv. Virus Res. 1999, 53:265; Neumann et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345; Fodor et al, J. Virol. 1999, 73:9679; 미국특허출원 20040029251). 예를 들어, 이것은 pol I 프로모터로부터의 8개의 인플루엔자 vRNA의 플라스미드 구동 발현 및 pol11 프로모터로부터의 모든 mRNA는 감염성 인플루엔자 A 바이러스의 형성을 유도한다[문헌참조: Hoffmann et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97:6108; 미국특허공보 No. 20020164770 (이 문헌에 기술된 최소 플라스미드 역 유전학 시스템 및 유전공학기법에 관한 내용은 본원에 참조로 포함됨)]. 이들 재조합 방법은 폴리펩타이드 아미노산 서열에 특이적인 변화와 함께 인플루엔자 바이러스 유형의 특이적 생산을 가능하게 한다. 목적하는 치환을 포함하는 HA 분자는 재조합 인플루엔자 바이러스의 일부일 수 있다. 재조합 인플루엔자 바이러스는 "플라스미드 단독" 시스템과 같은 유전자 조작 방법을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 제조될 수 있다(Hoffmann et al, Vaccine 2002, 20:3165). 재조합 인플루엔자 바이러스는 H5N1 바이러스로부터 유래할 수 있다. 재조합 바이러스는 A/레닌그라드 /134/17/57, A/레닌그라드 /134/47/57 및 A/Ann Arbor/6/60의 냉각 처리된 종을 포함하는, A/PR/8/34 바이러스 또는 임의의 인플루엔자 A 바이러스와 같은 백신 개발에 사용되는 H1N1 바이러스의 유전적 배경을 가질 수 있다. HA 분자 서열에 상응하는 핵산은 바이러스로부터 분리되고 서열분석될 수 있다.
특이적 핵산 및 단백질을 분리하고 변형시키는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명에 따라, 당업계의 기술 범위내에서 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 당해 기술은 문헌[참조: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (herein "Sambrook et al, 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & SJ. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & SJ. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [Ri. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Ausubel, F.M. et al. (eds.). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., 1994]에서 완전하게 설명된다. 이들 기술은 돌연변이와 함께 PCR 생성물을 합성하기 위해 변형된 뉴클레오타이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 부위 지시된 돌연변이 유발을 포함한다(예를 들어, 기관(Stratagene)에 의해 제조된 "퀵체인지" 키트).
면역분석
항원에 대한 항체의 면역특이적 결합을 검출하기 위한 당업계에 공지된 다양한 수단을 사용하여 본 발명에 따른 결합 및 증가된 항원성을 검출할 수 있다. 항원과 항체간의 상호작용을 검출하는 초기 방법은 겔중 침전에 의한 복합체의 검출 및 분석을 포함했다. 분석물-검출기 항체 결합 쌍을 검출하는 추가의 방법은 방사선 요오드화된 검출기 항체 또는 IgG와 반응하는 방사선 요오드화된 단백질(예를 들어, 단백질 A)의 사용을 포함한다. 이들 초기 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고 문헌[Methods in Enzymology 1980, 70:166-198]에서 검토되었다.
단지 1개의 항체를 사용하는 샘플중의 분석물의 존재를 측정하는 후기 방법은 경쟁 결합 분석을 포함한다. 본 기술에서, 가장 흔히 고형 지지체상에 고정화된 항체는 공지된 양의 표지된 분석물과 함께 분석물을 함유할 것으로 의심되는 샘플에 노출될 것이다. 이어서, 2개의 분석물, 표지된 분석물 및 샘플중의 분석물은 항체에 대한 결합 부위에 대해 경쟁할 것이다. 유리 표지된 분석물 또는 결합 표지된 분석물을 측정하고 이러한 측정으로부터 샘플중의 경쟁하는 분석물의 양이 공지된다. 당해 방법의 보다 완전한 기재는 문헌[참조: "Basic Principles of Antigen-Antibody Reaction" (Labat, Methods in Enzymology, 70, 3-70, 1980)]에 기재되어 있다. 본 실시예에서, 표지된 분석물은 방사선동위원소 또는 효소 표지로 표지될 수 있다.
보다 최근의 면역분석은 분석물의 존재를 검출하기 위한 이중 항체 방법을 사용한다. 이들 기술은 또한 효소학에 대한 상기 문헌의 방법에서 검토되었다. 따라서, 본 발명의 한 양태에 따라, 개개의 마커의 존재는 검출될 각각의 마커에 대해 한쌍의 항체를 사용하여 측정한다. 상기 항체 쌍중 하나는 본원에서 "검출기 항체"로서 언급되고 다른 항체 쌍은 "포획 항체"로서 언급된다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 생물학적 유체 샘플중 분석물을 검출하는 이중 항체 샌드위치 방법을 사용한다. 상기 방법에서, 분석물은 검출기 항체와 포획 항체 사이에 샌드위치시키고, 포획 항체는 고형 지지체상으로 비가역적으로 고정화시킨다. 검출기 항체는 검출가능한 표지를 함유하여 항체-분석물 샌드위치의 존재를 동정할 수 있고 따라서 분석물의 존재를 검출할 수 있다.
고형 지지체의 일반적인 초기 형태는 플레이트, 튜브 또는 폴리스티렌 비드를 포함하고 이 모두는 방사선면역분석 및 효소 면역분석 분야에서 널리 공지되어 있다. 보다 최근에, 나일론, 니트로셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 유리 섬유와 같은 다수의 다공성 물질 및 기타 다공성 물질이 고형 지지체로서 사용되었다.
다양한 기술 및 상응하는 센서 장치가 사용될 수 있다. 자동화 분석 장치는 연속/무작위 접근 분석 장치를 포함한다. 당해 시스템의 예는 제조원[ PB Diagnostic System, Inc]의 OPUSTM 및 제조원[Abbott Laboratories of North Chicago, 111]에 의해 도입된 IMXTM 분석기를 포함한다. 제조원[PB Diagnostic Systems, Inc.]의 자동화 분석 장치는 문헌[참조: 미국 특허 제5,051,237호; 제5,138,868호; 제5,141,871호 및 제5,147,609호]에 기재되어 있다.
본 발명을 수행하는데 사용될 수 있는 추가 부류의 면역화학적 분석기 시스템은 광학 면역센서 시스템이다. 일반적으로, 광학 면역센서는 목적하는 화학적 또는 생화학적 농도 또는 활성을 전기 신호로 전환시키는 정량적 광학 원리를 사용하는 장치이다. 이들 시스템은 4개의 주요 카테고리로 분류될 수 있다: 반사 기술; 표면 플라스몬 공명; 섬유 광학 기술 및 통합 광학 장치. 반사 기술은 타원 편광 분석, 다중 통합 반사 분광기 및 형광성 모세관 충전장치를 포함한다. 섬유 광학 기술은 무한소 필드 형광, 광학 섬유 모세관 튜브, 및 섬유 광학 형광 센서를 포함한다. 통합 광학 장치는 플래너 무한소 필드 형광, 입력 등급 커플러 면역센서, 매치-제흔더 간섭계, 하트만 간섭계 및 차등 간섭계 센서를 포함한다. 결합 반응의 홀로그래픽 검출은 결합쌍의 하나의 반응물이 결합쌍의 고정화된 제2 반응물과 결합하는 경우, 미리 결정된 이미지 위치에서 합성되는 홀로그래픽 이미지의 존재를 검출하여 성취된다(문헌참조: U.S. Pat. No. 5,352,582, issued Oct. 4, 1994 to Lichtenwalter et al). 광학 면역센서의 예는 일반적으로 문헌[참조: G. A. Robins, Advances in Biosensors 1991, 1:229-256]에 기재되어 있다. 이들 장치의 보다 특이적 기재는 예를 들어, 문헌[ U.S. Pat. Nos. 4,810,658; 4,978,503; and 5,186,897; R. A. Brady et al. (Phil. Trans. R. Soc. Land. B. 1987, 316:143-160) and G. A. Robinson et al. (in Sensors and Actuators, Elsevier 1992)]에서 발견된다.
혈청학적 분석은 바이러스 종의 유행병학 및 항원성에 관한 연구 뿐만 아니라 인플루엔자 진단의 결정에 광범위하게 사용된다. 특히, 헤마글루티닌 억제(HI) 분석은 이의 실험실 최소 요건 및 사용의 용이함때문에 광범위하게 사용되고 있다. 본 발명은 이의 민감성을 증가시킴에 의해 HI 분석의 응용성을 개선시키는 것으로 고려된다. HI 분석을 또한 사용하여 변형된 HA 분자의 항원성을 보여줄 수 있고 비변형된 분자 보다 다소 항원성인 변형된 HA 분자의 특성 분석을 도와준다.
HI 분석은 표준화된 참조물과 결합하는, 혈청 샘플의 항체 능력을 측정한다. HI 분석에서, 연속 희석(역가)된 혈청 샘플을 표준양의 적혈구와 혼합하고 이들의 당해 복합체로의 연합을 가시적으로 검출한다. 결과로서 가시적 복합체를 나타내는 최저 수준의 적정된 혈청이 분석된다.
상기된 바와 같이, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하거나 예방하기 위한 백신의 개선된 제조 방법 및 정당한 근거를 제공한다. 특히, 본 발명은 역 유전학 기술을 사용하여 생성된 백신에 적용될 수 있다. 이것은 본 발명이 백신접종 후 면역 반응의 타당성 및 입증에 사용되는 것으로 고려된다. 특히, 전적으로는 아니지만, 본 발명은 개체가 인플루엔자 바이러스에 노출된 후, 변형된 HA 분자의 항원성의 증진으로 인해 항체의 증진된 검출을 제공한다. 이러한 증진된 항원성은 HI 분석과 같은 면역 반응을 검출하는데 사용되는 분석의 증가된 민감성에서 반영된다.
백신 개발
하기 예시된 바와 같이, 항원성이 증가된 HA 분자 자체를 포함하는 변형된 바이러스는 보다 면역원성이어서 보다 강한 면역 반응 및 보다 우수한 백신 잠재력을 제공한다.
인플루엔자 백신 효과를 증진시키기 위한 전략은 애쥬반트의 사용(Wood and Williams, 상기 참조), 면역자극 분자의 동시 투여 (Salgaller and Lodge, J. Surg. Oncol. 1998, 68:122) 및 점막 백신 접종 전략을 포함한다. 점막 면역화 전략은 미세캅셀내 바이러스를 캅셀화하는 방법(미국 특허 제5,075,109호, 제5,820,883호, 및 제5,853,763호) 및 면역강화 막 담체를 사용하는 방법 (WO 98/0558)을 포함한다. 추가로, 경구 투여된 면역원의 면역원성은 적혈구(rbc) 또는 rbc 고스트(ghost)를 사용하거나 (미국 특허 제5,643,577호) 청설 항원을 사용함(미국 특허 제5,690,938호)에 의해 증진될 수 있다. 이들 방법이 개선된 미래 백신 접종 전략을 위해 전망이 있지만, 특정 상황하에서 이의 사용은 백신 효과를 확신하기 위한 타당성 및 조사를 요구한다. 본원에 기재된 발명은 면역원성 효과를 검출하기 위한 능력을 증가시킴에 의해 당해 전략을 증진시키는 것으로 고려된다.
하기 실시예는 본 발명의 다양한 측면을 설명하기 위한 것이지만 이를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 접종된 흰담비의 혈청 항체 역가
고도로 병원성인 H5N1 바이러스를 아시아에서의 연구에 협력하는 세계 보건 기구(WHO)로부터 수득하였다. 이들 바이러스를 사용한 모든 연구는 연구소[St. Jude Children's Research Hospital]의 BL3+ 시설에서 수행하였다. Z 유전자형의 2004년에 지배적이었던 2003년 인플루엔자 바이러스의 면역원성을 2004년 바이러스의 면역원성을 비교하기 위해, 본 발명자는 흰담비에, 치명적 사람의 사례(A/HK/213/03)로부터 분리된 H5N1 바이러스 (Guan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101:8156) 및 2004년에 사람, 닭 및 매로부터 분리된 4개의 H5N1 바이러스로 접종하였다(도 IA). 수컷 및 암컷 이종교배된 흰담비는 기관[Animal Resources Center at St. Jude Children's Research Hospital]의 특별한 육종 프로그램을 통해 수득하였다. 당해 동물은 3 내지 5개월된 것이었고 현재 유행성 인플루엔자 A H1N1, H3N2 및 H5N1 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스 노출에 대한 HI 시험에 대해 혈청 음성이었다. 바이러스는 35℃에서 48시간동안 10일된 닭 유정란의 요막공간에서 증식시켰다. 닭 유정란중에서 단일 계대 후 수거된 요막 유체를 80℃에서 동결시키고 실험에 사용하였다. 혈청 항체는 접종 후 28일째에 챌린지 바이러스를 사용한 HI 분석에 의해 적정하였다. A/HK/213/03 바이러스는 높은 항체 역가(1:640-1:1280)를 유도한 반면, 4개의 2004년 균주는 매우 낮은 HI 역가(1:20-1:40)를 유도하였다.
2004년 H5N1 바이러스에 대한 비교적 낮은 HI 역가는 바이러스 유도된 일반적 면역 억제의 결과일 수 있었다. 그러나, A/HK/213/03 및 A/베트남 /1203/04의 HA 및 뉴라미다제를 포함하는 ΔH5N1- A/PR/8/34 (6+2) 백신을 사용한 백신 접종 결과는 H5에서의 차이가 당해 효과에 주로 기여할 수 있음을 지적했다(도 1B). 2개의 별도의 7㎍ 용량의 ΔH5N1/03 백신을 사용한 백신 접종은 HI 및 바이러스 중화 시험에서 검출가능한 높은 수준의 혈청 항체를 유도하였다 (도 1B). ΔH5N1/04로 동일하게 백신 접종한 후, 매우 낮은 (대략 1:20) 역가가 HI 시험에서 검출된 반면, 중화 역가는 훨씬 컸다 (ΔH5N1/03에 의해 유도된 것의 약 절반). 이전의 연구는 A/오리 /싱가포르 /3/97 (H5N3)로부터 유래하는 불활성화된 백신이 거의 검출할 수 없는 혈청 항체를 유도한 것임을 밝혔다(문헌참조: Nicholson et al, Lancet 2001, 357:1937; Stephenson et al, Vaccine 2003, 21:1687). 이를 종합해 볼 때, 이들 결과는 몇몇 H5 분리물이 독특한 면역원성 및/또는 항원성 성질을 가질 수 있음을 지적한다. H5 아미노산 서열의 정렬은 A/HK/213/03 및 A/베트남/1203/04 바이러스의 HA가 HAl 영역에서 10개 아미노산이 차이가 있음을 밝혔다 (표 1b). A/베트남 /1203/04 바이러스는 아스파라긴 N154 (N*154-S155-T156, N-X-S/T, X≠ P)에서 잠재적인 당화 부위를 갖고 있다. 서열 비교는 2004년 바이러스 모두에 존재하지만 A/HK/213/03. K212에는 존재하지 않는 3개의 아미노산(S120, K189 및 S223)이 A/베트남/1203/04 바이러스의 특징임을 밝혔다.
실시예 2: 재조합 ΔH5- A/PR/8/34 바이러스의 생성 및 항원 특성 분석
동정된 아미노산의 면역원성 및 바이러스 챌린지에 대한 보호에 대한 영향을 시험하기 위해, 본 발명자는 8개의 플라스미드 역 유전학 시스템을 사용하여 A/PR/8/34의 7개의 유전자 분절 및 단일 점 돌연변이를 포함하는 A/베트남/ 1203/04의 HA 유전자 분절을 갖는 재조합 바이러스를 제조하였다(Hoffmann et al, Vaccine 2002, 20:3165). 절단 부위에서 H5HA의 변형에 의해 비병원체성이 부여된 재조합 바이러스는 DNA 형질감염에 의해 제조하였다 (Hoffmann et al, Vaccine 2002, 20:3165). 점 돌연변이를 퀵체인지R 부위 지시된 돌연변이유발 키트 (Stratagene, Cedar Creek, TX, USA) 및 한 세트의 H5 HA 특이적 프라이머를 사용함에 의해 PCR 동안에 HA로 삽입하였다. 재구성 바이러스는 A/PR/8/34 (HlNl) 바이러스의 유전적 배경에서 H5N1 바이러스 기원의 HA 유전자 또는 HA 및 뉴라미니다제(NA) 유전자를 포함했다(본 연구를 위해 제조된 바이러스 및 이의 약어에 대해 표 1a 참조). 닭 유정란에서 단일 계대 후 수거된 요낭 유체는 80℃에서 동결시키고 실험에 사용하였다. 재조합 바이러스의 HA 유전자는 RT-PCR를 사용하여 증폭시키고 지정된 돌연변이만이 존재하는지를 입증하기 위해 서열 분석했다. 재조합 바이러스의 HA 분절을 서열분석함에 의해 아미노산 변화를 입증하였다(표 1a).
재조합 HA의 항원성 성질 및 다양성을 평가하기 위해, 본 발명자는 6개 항-HA 모노클로날 항체의 패널을 사용하여 HI 분석을 수행했다(표 2). A/닭 /펜실베니아 /1370/83 (H5N3) 바이러스의 HA에 대한 모노클로날 항체(mAb) CP24, CP46, CP58 및 406/7은 기관[Infectious Diseases Department of St. Jude Children's Research Hospital. MAb VN04-6]에서 제조하였다. A/베트남 /1203/04 바이러스의 HA에 대한 Mab VN04-6 및 A/HK/213/03 바이러스의 HA에 대한 mAb HK03-3은 문헌[참조: Kohler and Milstein (Kaverin et al, Journal of Virology 2004, 78:240; Koher et al, European Journal of Immunology 1976, 6:511)에 기재된 방법의 변형에 의해 제조하였다. 5개의 mAb는 ΔH5N1/03 바이러스와 비교적 높은 역가로 반응하였지만, 3개만이 ΔH5/04 HA와 반응하였다. ΔH5SI55→N, T156→A/04, ΔH5s120-N/04 및 ΔH5R212-→K/04 바이러스의 반응성 패턴은 일반적으로 ΔH5/04 바이러스의 패턴과 유사하다. ΔH5S12O→N, S155→N, T156→A/04 바이러스의 반응은 ΔH5N1/03 바이러스의 반응과 유사하였다. 4개의 mAb는 돌연변이 S223→N (ΔH5S223→N/04)를 갖는 ΔH5/04 HA를 인지하였다. 2003년 바이러스의 HA에서 역 돌연변이 N223→S (ΔH5N223→s/03)는 HI 역가를 상당히 감소시키거나 mAb에 의한 인지를 상실하였다.
실시예 3: 닭 및 말 적혈구를 사용한 HI 시험
또 다른 흥미있는 관찰은 닭 및 말 적혈구(RBC)를 사용한 HI 시험에서 수득하였다. 흥미롭게도, 재조합 ΔH5S223→N/04 바이러스는 1% 말 RBC를 적게 응집시킬 수 있지만 이것은 닭 RBC를 고역가(1:1024)로 응집시켰다. 나머지 재조합 바이러스의 어떠한 것도 닭 및 말 RBC에 대한 반응에서 차이가 없었고 동일한 정도로 반응하였다.
실시예 4: H5-돌연변이 재조합 바이러스를 사용한 흰담비의 백신 접종
본 발명자는 HA 내용물에 대해 표준화된 ΔH5N1/04, ΔH5/04, ΔH5S155→N, T156→A/04, ΔH5S120→N/04, 및 ΔH5S223→N/04 바이러스의 제제로 근육내 주사하여 3마리의 흰담비 그룹을 백신접종함에 의해 불활성화된 백신의 면역원성 및 보호 효과를 평가하였다. 단일 방사 면역확산 기술을 사용하여 ΔH5N1/03 (Webby et al, Lancet 2004, 363:1099)을 표준화하였다. 나머지 재조합 바이러스는 12% SDS-폴리사카라이드 겔 전기영동으로 분리하였고, 염색 겔은 FUJIFILM 발광 이미지 분석기LAS-1000plus상에서 밀도측정기로 분석하였고, HA는 참조 단백질 제제와 비교하여 정량하였다. 7㎍의 HA를 2회 주사한 후, 각각의 동물을 A/베트남 /1203/04 (H5N1)으로 백신접종하였다. 3마리의 흰담비 그룹은 불활성화된 정제된 바이러스 기원의 7㎍의 HA를 함유하는 250㎕의 멸균 PBS를 근육내 주사하여 백신접종하였다. 백신 바이러스를 문헌[참조: (Liu et al, Virology 2003, 314:580; Webby et al, Lancet 2004, 363:1099)]에 기재된 바와 같이 불활성화시키고 농축시키고 정제하였다. 3 마리의 대조군 동물에 250 μl의 멸균 PBS만을 주사하였다. 백신 접종 후 21일째에, 혈청을 수거하고 7㎍의 HA를 2번째 근육내 주사하였다. 2주 후, 혈청을 다시 수거하고 동물에 챌린지 바이러스를 접종하였다.
백신 접종된 동물 및 대조군 동물은 이전에 기재된 바와 같이 106개의 50% 난 감염성 용량(EID50)의 A/베트남/1203/04 바이러스로 비강내 접종하였다 (Govorkova et al, Journal of Virology 2005, 79:2191). 감염의 임상적 징후, 체중 및 온도는 2주동안 매일 모니터하였다. 중증 질환의 징후를 보여주는 흰담비를 희생시켰다. 감염 후 면역 반응을 평가하기 위해, 추가 그룹의 흰담비에 106개의 EID50의 사람 및 조류 H5N1 분리물 A/HK/213/03, A/베트남 /3046/04, A/베트남 /3062/04, A/닭/ 베트남 /39/04 및 A/매 /HK/D0028/04를 사용하여 접종하였다. 접종 후 28일째에 동물로부터 혈청을 수거하였다. 상부 호흡 기관에서 바이러스 역가를 측정하기 위해, 3일, 5일 및 7일째에 비강 세척으로 표본을 수득하였다 (Govorkova et al, Journal of Virology 2005, 79:2191). 샘플중의 바이러스는 10일된 닭 유정란에서 적정하였고 0.1 ml당 log10 EID50으로서 표현하였다. 모든 백신 접종된 동물의 비강 세척물은 3일째에 2.5-4.5 log10 EID50, 5일째에 0.5- 2.5 log10 EID50, 및 7일째에 0.25 log10 EID50 이하의 바이러스 역가를 보여주었다(도 2). 백신 접종되지 않은 흰담비는 감염 후 1주째에 4.0 log10 EID50의 평균 역가를 갖는다. 3개의 대조군 흰담비중 2개는 중증 질환(막대한 체중 손실 및 마비)의 징후를 나타냈고 안락사시켰고 하나는 감염으로 죽었다. 백신 접종된 흰담비 하나만이 중증의 병에 걸렸다. ΔH5S120→N/04 바이러스로 백신 접종된 당해 흰담비는 중증의 신경학적 징후를 나타냈고 접종 후 7일째에 안락사시켰다. 당해 흰담비는 접종 후 4일째에 중증의 바이러스 결막염을 나타냈고 이후 바이러스가 뇌로 전파되었다. 3일째에 비강 세척동안에 바이러스를 안구에 전달하고 뇌로의 급속한 신경 전파는 뇌막염을 유발하였다. 나머지 백신 접종된 흰담비는 바이러스 챌린지 후 첫번째 3일동안에 활성 감소, 체중 손실 및 체온 증가를 입증하였다. 이들 징후는 5일째에 소멸하고 모든 동물은 신속하게 회복되었다. 따라서, 시험된 모든 백신 바이러스는 A/베트남 /I 203/04을 사용한 치명적 챌린지로부터 흰담비를 보호하였다. 백신 접종은 상부 호흡 기관에서 바이러스 역가를 감소시켰고 바이러스 발산의 지속시간을 감소시켰다.
실시예 5: 재조합 ΔH5-A/PR/8/34 바이러스의 면역원성의 HI 및 중화 시험
백신 접종된 흰담비로부터의 혈청은 HI 및 바이러스 중화 분석에서 재조합 바이러스에 대해 시험하였다(각각 표 3 및 4). 흰담비로부터 수거된 혈청을 비브리오 콜레라 수용체-파괴 효소를 사용하여 밤새 처리하고 (Denka-Seiken, Tokyo, Japan), 30분동안 56℃에서 열 불활성화시키고 0.5%의 닭 적혈구(CRBC) 현탁액으로 흡수하였다. MDCK 세포에서 표준 HI 및 바이러스 중화 시험을 이전에 기재한 바와 같이 수행하였다(Palmer et al., US Department of Health, Education and Welfare, Immunology series no. 6. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention. 1975; Kida et al, Virology 1982 122:38).
바이러스의 4개의 헤마글루티닌화 유니트(HAU)는 각각의 HI 분석에 사용하였고 100개의 50% 조직 배양 감염성 용량 (TCID50)을 각각의 중화 분석에 사용하였다. 야생형 단일 유전자 재구성 바이러스(ΔH5/04, 참조 바이러스)로 백신 접종된 흰담비의 혈청은 1:20의 HI 역가를 유도하였다. 당화 부위가 제거된 작제물 (ΔH5S155→N; T156→A/04)은 1:10-1:20의 HI 역가를 유도하였다. 돌연변이 ΔH5 HA SI20→N/04 는 1:20 내지 1:80의 HI 역가를 유도하였다. 대조적으로, ΔH5S223-→N/04을 사용한 백신 접종은 1 :640의 HI 역가를 유도하였고 기타 시험된 면역 혈청은 높은 HI 역가(1:160 내지 1:320)에서 ΔH5S223→N/04 바이러스와 반응하였다. 따라서, 백신 접종은 보호 면역을 유도하였지만 검출가능한 항체의 수준은 상이하였다.
모든 ΔH5/04 바이러스는 백신 접종 후 바이러스 중화 항체에 대해 높은 역가(1:320 내지 1:1280)를 유도하였다 (표 4). 동종성 및 이종성 중화 역가간에 어떠한 실질적인 차이가 관찰되지 않았다. 따라서, HA의 인지에서 항혈청간에 관찰되는 차이는 바이러스를 중화시키는 항체의 능력을 반영하지 않았다.
실시예 6: 재조합 바이러스의 반응성
추가로 재조합 바이러스의 반응성을 평가하기 위해, 본 발명자는 HI 분석을 사용하여 변형된 HA를 갖는 재조합 바이러스에 대한 ΔH5N1/03 및 A/HK/213/03 바이러스로 백신 접종 후 수득된 과면역 마우스 및 닭 혈청을 시험하였다(표 5). 상 동성 ΔH5N1/03 바이러스에 대한 평균 HI 역가는 1:2560이었다. ΔH5/04에 대한 HI 역가는 1:160이었다. 재조합 ΔH5S223→N/04 바이러스에 대한 HI 역가는 기타 돌연변이체에 대한 역가의 2배 이상이었다.
혈청학적 반응성에 대한 223번 위치에서 아미노산의 기여에 대한 추가의 정보를 수득하기 위해, 본 발명자는 H5가 N223→S 점 돌연변이만을 갖는 A/HK/213/03로부터 유래하는 재조합 바이러스를 제조하였다(표 1a). 당해 재조합 ΔH5N223→s/03 바이러스는 ΔH5N1/03 바이러스를 사용했던 것 보다는 닭 및 말 RBC에서 보다 낮은 HI 역가를 가졌다. 항원-항체 인지에 대한 아미노산 223의 영향을 특성 분석하기 위해, 본 발명자는 야생형 HA 및 A/오리 /싱가포르/3/97로부터 돌연변이된 S223→N HA를 함유하는 재조합 바이러스를 제조하였다(표 1a 참조). 이들 바이러스는 항-H5 항혈청 및 mAb의 패널에 대한 HI 분석에 의해 시험하였다(표 6). HA에서 S223→N 치환은 HI 역가(4이상의 인자만큼)를 급격하게 증가시켰다. 그러나, 당해 돌연변이는 특히, mAb와의 반응에서 A/오리/싱가포르/3/97 HA의 반응성 패턴을 상당히 변화시키지 않았다: 본래의 HA 또는 돌연변이 HA도 mAb HK03-3 및 CP46과 반응하지 않았고, 둘다는 CP46와 낮은 역가로 반응하였다 (표 6). 이들 결과는 HA에서 S223→N 치환이 HI 분석의 민감성을 증가시킴을 입증한다.
실시예 7: HI 분석의 민감성을 증가시키는 것으로 예상되는 제2 세대 진단학적 참 조 바이러스
본 발명자는 이전에 상기 실시예 3에서 H5 HA의 223번 위치에서 아미노산을 아스파라긴으로 전환시킴에 의해 닭 적혈구를 사용하는 HI 시험의 민감성을 증가시킴을 입증하였다. 본 발명자는 이러한 효과의 분자적 근거는 변형된 수용체 특이성에 의해 유발된다는 증거를 제공했다. 민감성이 증가된 돌연변이 바이러스는 단지 알파 2,3 연결을 갖는 말 적혈구 세포를 응집시키지 않았다. 따라서, 말 적혈구를 응집시키지 못하는 아미노산 변화는 닭적혈구를 사용하는 HI 분석에서 민감성 잠재력이 증가된 후보물이다. 이러한 개념은 모든 16개의 HA 서브타입, 특히, 2,3 특이성을 갖는 조류 인플루엔자 A 바이러스에 적용될 수 있다.
역 유전학 기술은 이의 항원 구조에서 소수의 변화를 갖지만 상이한 세포 기질의 인지에서 최적화된 재조합 바이러스의 제조를 가능하게 한다. 바람직하게, 아미노산 (H5에 대한 91, 130-134, 149, 151, 179, 186, 190-191, 220-225)은 수용체 결합 부위에 인접하거나 이의 일부에서 돌연변이된다. 유전자 조작된 HA를 갖는 플라스미드가 작제될 수 있고 바이러스는 동시 형질감염에 의해 생성될 수 있다. 재조합 바이러스는 닭 적혈구 및 말 적혈구를 병행하여 사용하는 HA 분석에 의해 시험할 수 있다. 닭 적혈구를 응집시키지만 말 적혈구를 응집시키지 않는 후보 바이러스가 HI 시험에서 시험을 위한 후보물이다. 상응하는 실험에서, 말 적혈구를 응집시키지만 닭 적혈구를 응집시키지 않는 바이러스를 생성시킨다. 단일 아미노 변화를 갖는 후보물의 조합은 민감성을 추가로 증가시킬 수 있다. 후보물의 평가는 2,3 특이성으로 수용체에 대한 특이적 반응성을 갖는 진단학적 참조 바이러스를 유도할 것으로 예상된다.
Figure 112008016044119-pct00001
*: ΔH5에서 다염기성 아미노산은 유전자 조작에 의해 제거되었다
†: 야생형 A/오리/싱가포르/3/97은 다염기성 아미노산을 갖지 않는다.
Figure 112008016044119-pct00002
Figure 112008016044119-pct00003
HI 시험은 0.5% 닭 RBC를 사용한 미세역가 플레이트에서 수행하였다. 역가는 바이러스의 4개의 헤마글루티닌 유니트(HAU)에 의해 유발된 헤마글루티닌을 억제하는 mAb의 최저 희석비의 역수이다.
* A/베트남/1203/04 바이러스에 대한 항-HA mAb;
† A/HK/213/03 바이러스에 대한 항-HA mAb;
‡A/닭/펜실베니아/1370/83 바이러스에 대한 항-HA mAb
Figure 112008016044119-pct00004
11주된 인플루엔자 혈청네가티브 흰담비를, 250㎕의 PBS에서 7㎍의 HA를 함유하는 불활성화되고, 정제되고 농축된 바이러스 제제의 근육내 주사에 의해 3주 간격으로 2회 백신 접종하였다. 데이터는 각각 제공된 3마리의 흰담비로부터의 HI 역가이다. HI 시험은 0.5% 닭 RBC를 사용하였다.
Figure 112008016044119-pct00005
중화 분석은 MDCK 세포에서 수행하였다. 역가는 바이러스의 100 TCID50을 완전히 억제하는 혈청의 최저 희석비의 역수이다. 상동성 역가는 밑줄쳐져 있다. 값은 각각 제공된 3마리의 흰담비로부터의 중화 역가이다.
Figure 112008016044119-pct00006
HI 시험은 0.5% 닭 RBC를 사용한 미세역가 플레이트에서 수행하였다(문헌참조: Palmer et ah, 5 in US Department of Health, Education and Welfare, Immunology series no. 6. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention, 1975). 역가는 바이러스의 4개의 HAU에 의해 유발되는 헤마글루티닌을 억제하는 혈청의 최저 희석값의 역수이다.
Figure 112008016044119-pct00007
* A/베트남/1203/04 바이러스에 대한 항-HA mAb;
† A/HK/213/03 바이러스에 대한 항-HA mAb;
‡A/닭/펜실베니아/1370/83 바이러스에 대한 항-HA mAb
HI 시험은 0.5% 닭 RBC를 사용한 미세역가 플레이트에서 수행하였다(14). 역가는 바이러스의 4개의 HAU에 의해 유발된 헤마글루티닌을 억제하는 mAb의 최저 희석비의 역수이다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 양태에 의한 범위내에서 제한되지 말아야 한다. 실질적으로, 본원에 기재된 것들 뿐만 아니라 본 발명의 다양한 변형이 이전의 기재 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 당해 변형은 첨부된 청구항의 범위내에 속하는 것으로 의도된다.
추가로, 모든 값은 대략적인 것이고 설명을 위해 제공된 것으로 이해되어야만 한다.
본원에 인용된 모든 특허 및 특허원은 이의 전반적인 내용이 참조로 본원에 인용된다.

Claims (37)

  1. 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 헤마글루티닌(HA) 분자로서, 상기 재조합 H5 HA 분자가 (i) H5 HA의 223번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 아스파라긴을 포함하고; (ii) A/HK/213/03 HA 분자가 아닌, 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 헤마글루티닌(HA) 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 H5 HA 분자가, H5 HA의 223번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 아스파라긴 이외의 아미노산을 포함하는 자연 발생적인 H5 HA 분자와 비교하여, H5 인플루엔자 바이러스 또는 H5 인플루엔자 백신에 노출된 동물로부터 유래된 항혈청과의 반응성이 증가된, 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 H5 HA 분자가 사람 인플루엔자 A 바이러스로부터 유래하는, 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 H5 HA 분자가 조류 인플루엔자 바이러스로부터 유래하는, 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자.
  6. 제1항의 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스.
  7. 제1항의 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자를 포함하는 인플루엔자 백신 바이러스.
  8. 제1항에 있어서, 상기 223번 아미노산 위치의 아스파라긴이 시알산 수용체에 대한 특이성을 변화시키는, 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자.
  9. 제6항에 있어서, 상기 H5 HA 분자가 사람 인플루엔자 A 바이러스로부터 유래하는, 재조합 인플루엔자 바이러스.
  10. 삭제
  11. 제6항에 있어서, 상기 H5 HA 분자가 조류 인플루엔자 바이러스로부터 유래하는, 재조합 인플루엔자 바이러스.
  12. 제6항에 있어서, 상기 223번 아미노산 위치의 아스파라긴이 시알산 수용체에 대한 특이성을 변화시키는, 재조합 인플루엔자 바이러스.
  13. 제7항에 있어서, 상기 H5 HA 분자가 사람 인플루엔자 A 바이러스로부터 유래하는, 인플루엔자 백신 바이러스.
  14. 삭제
  15. 제7항에 있어서, 상기 H5 HA 분자가 조류 인플루엔자 바이러스로부터 유래하는, 인플루엔자 백신 바이러스.
  16. 제7항에 있어서, 상기 223번 아미노산 위치의 아스파라긴이 시알산 수용체에 대한 특이성을 변화시키는, 인플루엔자 백신 바이러스.
  17. 제2항에 있어서, 상기 자연 발생적 H5 HA 분자가 H5 HA의 223번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 세린을 포함하는, 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자.
  18. 백신 접종된 사람을 제외한 동물로부터 유래하는 항혈청과 인플루엔자 바이러스 H5 헤마글루티닌(HA) 분자를 반응시키는 단계를 포함하여, 사람을 제외한 동물 내에서 인플루엔자 바이러스 백신의 효능을 결정하기 위한 방법으로서,
    상기 H5 HA 분자가 (i) H5 HA의 223번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 아스파라긴을 포함하고; (ii) A/HK/213/03 HA 분자가 아닌, 사람을 제외한 동물 내에서 인플루엔자 바이러스 백신의 효능을 결정하기 위한 방법.
  19. 백신 접종되거나 감염된 사람을 제외한 동물로부터 유래하는 항혈청과 인플루엔자 바이러스 H5 헤마글루티닌(HA) 분자를 반응시키는 단계를 포함하여, 헤마글루티닌 억제(HI) 분석의 민감성을 증가시키기 위한 방법으로서,
    상기 H5 HA 분자가 (i) H5 HA의 223번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 아스파라긴을 포함하고; (ii) A/HK/213/03 HA 분자가 아닌, 헤마글루티닌 억제(HI) 분석의 민감성을 증가시키기 위한 방법.
  20. 제19항에 있어서, 헤마글루티닌 억제(HI) 분석의 민감성을 2배 이상 증가시키는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 헤마글루티닌 억제(HI) 분석의 민감성을 4배 이상 증가시키는 방법.
  22. 동물로부터 유래하는 항혈청을 진단학적 참조 바이러스와 반응시키고, 일정 시간 항온 처리 후, 여기에 적혈구를 첨가하는 단계를 포함하여, 상기 동물이 인플루엔자 바이러스에 노출되었는지의 여부를 결정하기 위해, 상기 진단학적 참조 바이러스와 적혈구가 결합된 복합체를 검출하는 방법으로서,
    상기 참조 바이러스가 문제의 인플루엔자 바이러스로부터 유래하지만, 인플루엔자 바이러스 H5 헤마글루티닌(HA) 분자를 포함하며, 상기 H5 HA 분자가 (i) H5 HA의 223번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 아스파라긴을 포함하고; (ii) A/HK/213/03 HA 분자가 아닌, 상기 동물이 인플루엔자 바이러스에 노출되었는지의 여부를 결정하기 위해, 상기 진단학적 참조 바이러스와 적혈구가 결합된 복합체를 검출하는 방법.
  23. 동물로부터 유래하는 항혈청을 진단학적 참조 바이러스와 반응시키고, 일정 시간 항온 처리 후, 여기에 적혈구를 첨가하는 단계를 포함하여, 상기 동물이 인플루엔자 바이러스에 노출되었는지의 여부를 결정하기 위해, 상기 진단학적 참조 바이러스와 적혈구가 결합된 복합체를 검출하는 방법으로서,
    상기 참조 바이러스가 문제의 인플루엔자 바이러스로부터 유래하지만, H5 HA의 223번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 아미노산 아스파라긴을 포함하는 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자를 포함하며, 상기 아스파라긴의 포함으로 인해 상기 참조 바이러스와 야생형 H5 HA 분자를 갖는 인플루엔자 바이러스에 노출된 동물로부터 유래하는 항혈청과의 반응성이 증가되는, 상기 동물이 인플루엔자 바이러스에 노출되었는지의 여부를 결정하기 위해, 상기 진단학적 참조 바이러스와 적혈구가 결합된 복합체를 검출하는 방법.
  24. 동물로부터 유래하는 항혈청을 진단학적 참조 바이러스와 반응시키고, 일정 시간 항온 처리 후, 여기에 적혈구를 첨가하는 단계를 포함하여, 상기 동물이 인플루엔자 바이러스에 노출되었는지의 여부를 결정하기 위해, 상기 진단학적 참조 바이러스와 적혈구가 결합된 복합체를 검출하는 방법으로서,
    상기 참조 바이러스가 문제의 인플루엔자 바이러스로부터 유래하지만, 제1항의 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자를 포함하는, 상기 동물이 인플루엔자 바이러스에 노출되었는지의 여부를 결정하기 위해, 상기 진단학적 참조 바이러스와 적혈구가 결합된 복합체를 검출하는 방법.
  25. 제18항, 제19항, 제22항, 제23항 및 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물이 흰담비인, 방법.
  26. 제22항, 제23항 및 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물이 사람인, 방법.
  27. 제1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방용 약제로서 사용하기 위한, 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자.
  28. 제1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방용 약제로서 사용하기 위한, 사람 인플루엔자 A 바이러스로부터 유래하는 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자.
  29. 제1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방용 약제로서 사용하기 위한, 조류 인플루엔자 바이러스로부터 유래하는 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자.
  30. 사람 인플루엔자 A 바이러스로부터 유래하는 제1항의 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방용 약제로서 사용하기 위한 재조합 인플루엔자 바이러스.
  31. 조류 인플루엔자 A 바이러스로부터 유래하는 제1항의 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방용 약제로서 사용하기 위한 재조합 인플루엔자 바이러스.
  32. 제1항에 따른 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 H5 HA 분자가 사람 인플루엔자 A 바이러스로부터 유래하는, 약제학적 조성물.
  34. 제32항에 있어서, 상기 H5 HA 분자가 조류 인플루엔자 바이러스로부터 유래하는, 약제학적 조성물.
  35. 제1항의 재조합 인플루엔자 바이러스 H5 HA 분자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 H5 HA 분자가 사람 인플루엔자 A 바이러스로부터 유래하는, 약제학적 조성물.
  37. 제35항에 있어서, 상기 H5 HA 분자가 조류 인플루엔자 A 바이러스로부터 유래하는, 약제학적 조성물.
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7871626B2 (en) 2005-08-04 2011-01-18 St. Jude Children's Research Hospital Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency
BRPI0617952A2 (pt) 2005-10-28 2011-08-09 Boehringer Ingelheim Vetmed composição antigênica compreendendo um antìgeno de um patógeno de um animal de uma primeira espécie, bem como uso de vacinas para o tratamento/prevenção da transmissão de patógenos da gripe entre espécies
CA2660038A1 (en) * 2006-08-14 2008-06-19 Massachusetts Institute Of Technology Hemagglutinin polypeptides, and reagents and methods relating thereto
US8202967B2 (en) 2006-10-27 2012-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use
CN101687921A (zh) * 2007-05-11 2010-03-31 淡马锡生命科学研究院有限公司 可用于h5禽流感诊断和监视的h5亚型特异性结合蛋白
HUE029921T2 (en) * 2007-06-25 2017-04-28 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Flu-inhibiting preparations and methods
CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
PT2610345E (pt) 2007-11-27 2016-01-11 Medicago Inc Partículas semelhantes ao vírus (vlps) da gripe recombinantes produzidas em plantas transgénicas que expressam hemaglutinina
CN103990120B (zh) * 2008-04-01 2018-06-05 伊耐特免疫治疗有限公司 抗感染剂及其用途
WO2010006452A1 (en) * 2008-07-18 2010-01-21 Medicago Inc. New influenza virus immunizing epitope
PL2358386T3 (pl) * 2008-11-28 2017-04-28 Statens Serum Institut Zoptymalizowane szczepionki na grypę
KR101145720B1 (ko) * 2009-06-23 2012-05-14 한밭대학교 산학협력단 안전성이 뛰어난 인플루엔자 바이러스 백신용 재조합 헤마글루티닌 단백질을 함유하는 생분해성 ｐｌｇａ 미립자의 제조 방법
ES2669303T3 (es) 2009-06-24 2018-05-24 Medicago Inc. Partículas pseudovíricas quiméricas de influenza que comprenden hemaglutinina
SG10201403557QA (en) * 2009-06-25 2014-10-30 Medimmune Llc Swine influenza hemagglutinin variants
PT3354657T (pt) 2009-09-22 2022-05-06 Medicago Inc Método de preparação de proteínas derivadas de plantas
CN102095852A (zh) * 2010-11-24 2011-06-15 中国检验检疫科学研究院 一种用于快速检测新型h1n1流感病毒的双抗体夹心法
TWI620816B (zh) 2011-03-23 2018-04-11 苜蓿股份有限公司 植物衍生蛋白回收方法
AR088028A1 (es) 2011-08-15 2014-05-07 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal
DK2760882T3 (da) * 2011-09-30 2023-07-03 Medicago Inc Forøgelse af udbyttet af viruslignende partikler i planter
CA2871160C (en) 2012-05-10 2023-03-14 Massachusetts Institute Of Technology Agents for influenza neutralization
EA033027B1 (ru) * 2012-07-17 2019-08-30 Мериал, Инк. Ослабленные вакцины от свиного гриппа и способы их получения и применения
KR101315273B1 (ko) * 2012-10-29 2013-10-08 대한민국 강독화된 인플루엔자 바이러스 변이주
CN104491463A (zh) * 2014-11-18 2015-04-08 四川金堂海纳生物医药技术研究所 一种治疗舌溢血(舌衄)的汤剂药物及制备方法
WO2016090297A1 (en) * 2014-12-04 2016-06-09 The New York Stem Cell Foundation Perfusion bioreactor
JOP20190088A1 (ar) * 2016-10-21 2019-04-21 Us Agriculture نواقل مؤتلفة للتعبير عن مولدات مضاد فيروس انفلونزا الطيور و استخداماتها
US20180128545A1 (en) 2016-11-08 2018-05-10 Berry Metal Company Modular furnace cooling wall
WO2021226533A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 Academia Sinica Chimeric influenza vaccines
TW202334429A (zh) 2021-10-01 2023-09-01 中央研究院 Sars-cov-2棘蛋白特異性抗體及其用途
CN117229370A (zh) * 2022-06-08 2023-12-15 中科南京生命健康高等研究院 H5n6禽流感广谱性疫苗的开发及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6719979B2 (en) 1998-06-19 2004-04-13 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. Newcastle disease virus infectious clones, vaccines and diagnostic assays

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5762939A (en) 1993-09-13 1998-06-09 Mg-Pmc, Llc Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
IL127331A0 (en) 1998-11-30 1999-09-22 Yeda Res & Dev Peptide-based vaccine for influenza
WO2004112831A2 (en) * 2003-05-28 2004-12-29 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy
CN1261564C (zh) * 2003-12-02 2006-06-28 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 人工重组的流感病毒及其应用
US7871626B2 (en) 2005-08-04 2011-01-18 St. Jude Children's Research Hospital Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6719979B2 (en) 1998-06-19 2004-04-13 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. Newcastle disease virus infectious clones, vaccines and diagnostic assays

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Infect. Dis., Vol. 191(8), pp. 1216-1220 (2005. 4. 15.) *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20080042864A (ko) 2008-05-15
US20130017216A1 (en) 2013-01-17
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US7871626B2 (en) 2011-01-18
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