TWI494430B - 製備與真實流感病毒粒子高度相似的流感類病毒顆粒之轉殖基因哺乳動物細胞表現系統 - Google Patents

Description

製備與真實流感病毒粒子高度相似的流感類病毒顆粒之轉殖 基因哺乳動物細胞表現系統

本申請案係美國專利申請案第11/515,843號，申請日2006年9月5日，之部分繼續申請案，該案之全文以引用的方式併入本文中。

本發明係關於產生類病毒顆粒(VLPs)用之哺乳動物表現系統，及該哺乳動物表現系統所產生之VLPs之用途。

新近演化出之冠狀病毒(CoV)的傳播，使得2003年急性嚴重呼吸道症候群(SARS)之疫情暴發成為全球性的威脅(Kuiken,T.等人，2003，Lancet 362：263-270)。鑑於其基因組織及複製策略，冠狀病毒在分類學上係歸類於尼多病毒目(Nidovirales)。如同其他冠狀病毒，SARS-CoV之外形為被膜顆粒，病毒核心表面遍佈著典型的表面突出物，稱為「冠」或「刺」(Ksiazek,T.G.等人，2003，N Engl J Med 348：1953-1966；Lin,Y.等人，2004，Antivir Ther 9：287-289)。冠狀病毒顆粒核心外是一層脂質被膜，主要包含三種蛋白質：數量最多之M(膜)蛋白，小的E(被膜)蛋白及S(刺)蛋白。S蛋白之同類三聚體共同形成了前述之冠，其涉及病毒與宿主受體之結合、供病毒進入之膜融合、細胞對細胞之傳播、及冠狀病毒之組織向性。被膜內之病毒核心稱為殼包核酸，內含一約30kb之正鏈病毒基因組RNA，以N(殼包核酸)蛋白包裝。

不像HCoV-229E及HCoV-OC43等其他人類冠狀病毒僅能造成類似一般感冒之症狀，SARS-CoV造成的是高度傳染性、嚴重且劇烈的疾病，在成人-尤其是老人間常常具有致命性。由於其高傳染性及致命性，對於SARS-CoV的研究及臨床興趣快速成長。特別是緊急需要對SARS-CoV有效且安全之疫苗，以應付未來可能捲土重來之SARS疫情。

大多數目前使用之抗病毒疫苗包含去活化或活減毒之完 整病毒。去活化(或去毒)病毒係經化學性或放射線照射處理而使其失去複製能力，一般而言係安全且易於製造者。雖然能夠誘發中和性抗體，該等病毒無法將病毒抗原遞送至細胞質以活化CD8+ T淋巴球(毒殺T細胞、或CTL)(其在動物對感染的防禦上扮演關鍵角色)。活減毒疫苗相較於去毒疫苗顯著較有效。然而，活減毒病毒的危險性在於逆轉或與循環之野生型重組成為劇毒品系。此外，使用完整病毒製造疫苗亦有病毒逃漏之風險。

為避免使用完整病毒(例如去毒或減毒病毒)作為疫苗之危險性，重組病毒蛋白質不僅被視為研究工具，更被視為具潛力之先進次單元疫苗。然而，已知次單元疫苗通常免疫增強性不佳，這是由於摺疊不正確、抗原展示不佳、或碳水化合物及脂質組成不同所致。類病毒顆粒(VLPs)係自我組裝之顯微抗原結構，其大小及形狀與原本的病毒相似但缺少遺傳物質。VLPs可以相似且逼真的構造同時展示多個病毒蛋白質、碳水化合物及脂質，因而被視為理想的抗病毒疫苗(McGuigan,L.C.等人，1993，Vaccine 11：675-678)。VLP在表面以重複排列方式展示完整的病毒抗原，因而能重建病毒般的巨大分子實體來促進與抗原呈現細胞(APCs)之表面受體結合，尤其是樹狀細胞(DCs)。因此，以DC為標靶之VLPs可有效刺激抗VLP相關抗原之CD4+ T細胞。除了誘發體液免疫外，VLPs在DC中能經由抗原交叉呈現，因而使VLPs相關抗原起動CTL反應(Moron,G.等人，2002，J Exp Med 195：1233-45)。

利用昆蟲及哺乳類細胞的表現系統，已經能產生出超過三十種病毒之VLPs供作疫苗研發用途(Noad,R.及Roy,P.，2003，Trends Microbiol 11：438-44)。已知組裝冠狀病毒VLPs之至少需要M蛋白及E蛋白同時表現於同一細胞(Vennema,H.等人，1996，EMBO J 15：2020-2028)。雖然S蛋白在VLPs的形成上可有可無，若與M及E蛋白同時表現於同一細胞也 會嵌入VLPs中(Godeke,G.J.等人，2000，J Virol 74：1566-1571)。

研究者曾使用巴氏病毒表現系統產生SARS-VLPs(Ho,Y.等人，2004，Biochem Biophys Res Commun 318：833-838；Mortola,E.及Roy,P.，2004，FEBS Lett 576：174-178)。然而，由於昆蟲細胞與哺乳動物細胞間，至少蛋白質醣化修飾上不同，在昆蟲細胞(SF9)中產生之SARS-VLPs直徑110nm，大於SARS-CoV真病毒顆粒之78nm直徑(Lin,Y.等人，2004，同上，及Ho,Y.等人，2004，同上)。此外，昆蟲細胞產生之SARS-VLP之免疫增強性尚未經研究調查。其他研究者亦曾試圖使用哺乳類細胞的表現系統產生SARS-VLPs(Huang,Y.等人，2004，J Virol 78：12557-65)。然而，其VLPs之胞外釋出產率不佳，有待改進。

因此，仍然需要研發可大規模產生SARS-VLPs之有效方法，俾提供有效且安全之抗SARS疫苗。

流感之感染對於人類健康係一種主要威脅，並且帶來全球性顯著之罹病率及死亡率。根據世界衛生組織估計，季節性流感每年流行影響全球約5至15%之人口，並造成每年超過3至5百萬住院以及約25至50萬死亡數目(www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/index.html)。近來，除了每年因抗原漂移造成之流通季節性流感變種，其他具潛在流行性之流感病毒株例如高度致病性禽流感H5N1或是出現新的A/H1N1，因為他們藉由重組在人體適應的更好，而比過去更具威脅性(www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/en/及www.who.int/csr/don/2009.sub.--08.sub.--19/en/index.html)。減少因季節性或流行性流感爆發造成之傳染以及隨後帶來之重大經濟損失，最有效率之方法為預防接種。目前核可流感疫苗之製造，不論是分裂之次病毒形式(被打碎、高度純化病毒)或是次單元疫苗(純化之紅血球凝集素HA、神經氨酸苷酶 NA)，係絕對依賴受精雞蛋為製造之生物反應器。該方法實質上受到限制，因為製造量會受限於雞蛋可獲性，可能不足以面對流感流行期間疫苗之迫切需求量[1,2,3]。此外，這些疫苗誘導主要針對病毒性HA之抗體，對於健康成人有效，但對於高危險群(例如年長者)展現較低保護率，且對於年幼孩童可能免疫性差。一旦野生種群病毒之HA成分經顯著抗原漂移，這些問題會更加劇[1,2,4,5,6]。必然地，由未活化疫苗引出之保護性免疫之持續時間太短，無法防禦新發展流感變體。因此，發展具有對流感演化有快速反應及/或延長接種效率之交叉保護效果之疫苗是需要解決的。

另外，歐洲核可了改善的季節性流感疫苗之製備，其運用了以哺乳類動物細胞為基礎之培養系統之反向基因學，而非以雞蛋[2]。運用哺乳類動物細胞培養系統例如Vero或MDCK細胞做為疫苗病毒之可適性宿主有一些優點，不只增加了製造過程的靈活性與一致性，也恢復了病毒抗原，其在雞蛋或是桿狀病毒依賴系統無法正確被醣化，之宿主依賴性特定醣化作用。在真核細胞中，蛋白質醣化作用牽涉到正確摺疊或導引新轉譯蛋白質細胞局部化，在蛋白質功能扮演重要角色。不同醣化模式構成不同株流感病毒差別之基礎。

近來，經自發性相互作用自我組裝病毒結構蛋白質之非感染性類病毒顆粒(VLP)之使用被認為係提供了大範圍造成人類疾病的病毒之進階疫苗的良好潛能[7]。以VLP為基礎之疫苗方法為一種具吸引力之選擇，其取代或補充傳統未活化病毒疫苗或是次單元疫苗而增進安全性與效率，特別對孩童及長者。值得注意的是由酵母系統產生、以VLP為基礎之人類乳突狀瘤病毒(HPV)疫苗，其有能力誘導針對造成子宮頸癌之HPV保護性免疫反應，在2006年獲批准上市[8,27,28]。已被描述的是，由重組桿狀病毒系統表現之流感VLPs呈現多種組成抗原，包含HA及基質1(M1)、有或無NA，其有能力針對同種或異種流感病毒株誘導同源或內生之 免疫反應[3,9,10,11,12,13,14,29]。桿狀病毒表現流感VLPs之臨床研究目前正在展開。

鑒於季節性及流行性流感感染造成之重大威脅，有進一步加強針對流感感染發展靈活性、有效率、安全疫苗方法之必要。

本發明提供一種產生VLPs之有效方法，其中所產生之VLPs免疫增強性高，可作為有效之疫苗；特別是用作抗SARS疫苗之SARS-VLPs，以及用作抗流感感染疫苗或激發免疫反應之流感VLPs。

一個以重組維羅細胞產生流感VLPs為基礎之靈活性平台，提供了一個製造安全且有效疫苗之實用新方法，該方法不會有以雞蛋為基礎或以桿狀病毒細胞培養為基礎方法之缺點，並能替代用於製造流感疫苗之傳統反向遺傳學。

在本發明某些具體實施例中，提供一種產生哺乳動物病毒之類病毒顆粒(VLPs)之方法，該方法包含：建構一質體，該質體包含一核苷酸序列，該序列編碼至少兩種的病毒結構性蛋白質之組合；以該質體轉染維羅(Vero)細胞；及於經轉染之細胞中表現該等病毒結構蛋白質以產生該病毒之VLPs。

在本發明其他具體實施例中，提供一種產生抗SARS-CoV抗體之方法，包含以依據本發明所產生之SARS-VLPs免疫哺乳類或鳥類動物，及由該哺乳類或鳥類之血液中收取抗SARS-VLPs抗體。

在本發明更進一步之具體實施例中，提供一種偵測一個體是否受SARS-CoV感染之方法，包含以依據本發明所產生之SARS-VLP接觸該個體之血清樣本，及測定該樣本中是否有能結合SARS-VLPs抗原之專一性抗體，其中該抗體之存在表示陽性結果。

在本發明更進一步之具體實施例中，提供一種偵測一個體中是否受SARS-CoV感染之方法，包含以利用本發明之SARS-VLPs所產生之專一性抗體接觸該個體之組織樣本，及測定該樣本中SARS-CoV抗原之存在，其中該抗原之存在表示陽性結果。

在本發明更其他之具體實施例中，提供一種預防個體受SARS-CoV感染之方法，包含以依據本發明所產生之SARS-VLP免疫該個體。

在本發明更其他之具體實施例中，提供一種高免疫增強性的組合物，包含依據本發明所產生之SARS-VLPs。

再一方面，本發明涉及一種製備流感類病毒顆粒(VLP)之方法，該方法包含：取得基礎維羅(Vero)細胞，其係經編碼流感M1之序列及編碼流感M2之序列穩定轉染；建構至少一種重組DNA分子，其包含編碼流感紅血球凝集素(HA)之序列及編碼流感神經氨酸苷酶(NA)之序列；將該至少一種重組DNA分子導入至該基礎維羅細胞，以取得共表現維羅細胞，其係經編碼流感M1、流感M2之序列穩定轉染，以及經進一步編碼流感HA及流感NA之序列轉染，其中該等流感M1、M2、HA及NA蛋白質於該共表現維羅細胞之表現係由一或多種可誘發性表現系統所調控；於條件下培養該共表現維羅細胞，該條件容許該流感M1、該流感M2、該流感HA及該流感NA之表現，以及包含該流感M1、該流感M2、該流感HA及該流感NA之VLP之組合；及將該VLP由該共表現維羅細胞培養之上清液分離出來。

另一方面，本發明涉及一種製備流感類病毒顆粒(VLP)之方法，該方法包含： 取得共表現維羅細胞，其係經編碼流感M1之序列、編碼流感M2之序列穩定轉染，以及經進一步編碼流感紅血球凝集素HA之序列及編碼流感神經氨酸苷酶NA之序列轉染，其中該等流感M1、M2、HA及NA蛋白質於該共表現維羅細胞之表現係由一或多種可誘發性表現系統所調控；及於條件下培養該共表現維羅細胞，該條件容許該流感M1、該流感M2、該流感HA及該流感NA之表現，以及包含該流感M1、該流感M2、該流感HA及該流感NA之VLP之組合；及將該VLP由該共表現維羅細胞培養之上清液分離出來。

另一方面，本發明涉及一種流感類病毒顆粒(VLP)，包含：流感M1、流感M2、流感紅血球凝集素(HA)及流感神經氨酸苷酶(NA)，其中該等流感蛋白係由維羅細胞重組表現；及至少一種維羅細胞之細胞蛋白。

另一方面，本發明涉及一基礎維羅細胞，其係經編碼流感M1之序列及編碼流感M2之序列穩定轉染之一維羅細胞，其中該流感M1及M2蛋白質於基礎維羅細胞中之表現係由一可誘發性表現系統所調控。在一具體實施例中，該基礎維羅細胞係由維羅E6細胞重組製成。

另一方面，本發明涉及一種取得基礎維羅細胞之方法，該方法包含：將編碼流感M1之序列及編碼流感M2之序列導入維羅細胞；及取得基礎維羅細胞，其係經編碼流感M1之序列及編碼流感M2之序列穩定轉染，其中該流感M1及M2蛋白質於基礎維羅細胞中之表現係由一可誘發性表現系統所調控。

本發明之一具體實施例涉及一共表現維羅細胞，其係一經編碼流感M1、流感M2之序列穩定轉染，以及經進一步編碼流感HA、流感NA之序列轉染之維羅細胞，其中該等流感M1、M2、HA及NA蛋白質於該共表現維羅細胞之表現係由一或多種可誘發性表現系統所調控。在一具體實施例中，該共表現維羅細胞係由維羅E6細胞重組製成。

本發明之另一具體實施例涉及一種取得共表現維羅細胞之方法，該方法包含：取得基礎維羅細胞，其係經編碼流感M1之序列及編碼流感M2之序列穩定轉染，將編碼流感HA之序列及編碼流感NA之序列導入基礎維羅細胞；及取得共表現維羅細胞，其係經編碼流感M1、流感M2之序列穩定轉染，以及經進一步編碼流感HA及流感NA之序列轉染，其中該等流感M1、M2、HA及NA蛋白質於該共表現維羅細胞之表現係由一或多種可誘發性表現系統所調控。

本發明之具體實施例進一步涉及根據本發明具體實施例之包含流感VLPs之免疫性組成份，以及根據本發明具體實施例之抗流感VLPs之抗體。

本發明亦包含涉及流感VLPs之方法、免疫性組成份以及抗體。

本發明之其他態樣、特徵及優點將會經由以下揭露內容，包括本發明之詳細說明及其較佳具體實施例及申請專利範圍，而清楚呈現。具體實施例

除非另有指明，所有在此處使用的技術性和科學性術語具有如同本發明所屬技藝中之通常技術者一般所瞭解的意義。否則，此處使用之某些詞語之涵義係如說明書中所指定者。本說明書中所有引用之專利、公開之申請專利及出版物以引用的方 式全文併入本文中。須注意於此處及所附申請專利範圍中所使用的冠詞「一」係指該冠詞的一或一個以上(即，至少一個)的文法受詞。

欲產生作為SARS疫苗之VLPs的關鍵技術在於病毒蛋白質的轉譯後修飾、正確摺疊，及精細地嵌入脂質被膜中，以及提供實際應用上所需之持續、大量生產。SARS-S蛋白據推測為一巨大的醣蛋白，包含1255個胺基酸殘基、23個推定的N-連結醣化位點、其中至少12個N-聚糖已經鑑定存在(Krokhin,O.等人，2003，Mol Cell Proteomics 2：346-56)。在受SARS-CoV感染之細胞中及純化後之病毒顆粒中，M蛋白帶一個高甘露糖類型之N-聚糖(Voss,D.等人，2006，FEBS Lett 580：968-73)。因此，本案發明人採取哺乳類表現系統及細胞培養方式達到SARS-VLPs之量產。

一方面，本發明提供一種產生哺乳動物病毒(如SARS-CoV)之類病毒顆粒(VLPs)之方法，該方法包含：建構一質體，該質體包含一核苷酸序列，該序列編碼至少兩種的病毒結構性蛋白質之組合；以該質體轉染維羅(Vero)細胞；及於經轉染之細胞中表現該等病毒結構蛋白質以產生該病毒之VLPs。

本發明之方法適用於產生各種哺乳動物病毒，包括但不限於沙狀病毒、冠狀病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、正黏病毒、負黏病毒、巴波瓦病毒、小病毒及反轉錄病毒。在本發明之一較佳具體實施例中，該哺乳動物病毒為冠狀病毒。更佳者，該哺乳動物病毒為SARS-CoV。

本文所用之「病毒結構蛋白質」或「病毒之結構蛋白質」乙詞及同義詞係指形成病毒結構之蛋白質由病毒基因序列所編碼。例如，冠狀病毒之結構性蛋白質包括M(膜)，E(被膜)、S(刺)及N(殼包核酸)蛋白。病毒之基因序列亦攜帶病毒進行複製所需之功能性、非結構性之蛋白質。

依據本發明產生SARS-VLPs之方法之一具體實施例中，在經轉染細胞中表現之結構性蛋白質可為源自SARS-CoV之E、M、N及S蛋白之任何組合，例如M+E、M+E+S、M+S、N+M+E、N+M+E+S及N+M+S。在一較佳具體實施例中，該結構性蛋白質之組合為M+E。最佳者，該結構性蛋白質之組合為M+E+S。

本發明中所用之質體可為任何適於在哺乳動物細胞中表現異源蛋白質之質體或載體。本發明可採用許多已經商業化之哺乳動物表現載體，例如Invitrogen公司(Carlsbad,CA,USA)之pcDNA^TM 系列。

欲構築本發明中所用之重組質體，可將編碼病毒結構性蛋白質組合之核苷酸序列分組為一或個「表現匣(expression cassettes)」，以利控制表現。本文所用之「表現匣」乙詞係指藉由DNA重組或合成產生之核酸序列，得以在宿主細胞中進行基因表現。表現匣可嵌入質體或染色體中。典型上而言，一表現載體之表現匣部分除其他序列外尚包含一欲轉錄之核苷酸序列、一啟動子及一聚腺苷化指令。在本發明中，「表現匣」乙詞與「轉殖基因」乙詞可互換使用。

為調控本發明病毒蛋白質之表現，以達最佳化，表現匣包含一操縱子，以俾經誘發後達到高度表現。在本發明一較佳具體實施例中係利用四環素誘發性表現系統調控病毒蛋白質之高度表現，其中係於培養基中添加強力黴素(doxycycline)以達到誘發。商業化的誘發性表現系統之實例包括但不限於Invitrogen公司之T-REx^TM 系統及GeneSwitch^TM 系統，以及Clontech Laboratories公司(Mountain View,CA,USA)之BD Tet-On^TM 及BD Tet-Off^TM 基因表現系統。

依據本發明之一具體實施例，用於產生VLPs之細胞為維羅細胞。維羅細胞株，亦即ATCC編號CCL-81^TM 之細胞株，係由位於日本千葉之千葉大學之Y.Yasumura及Y.Kawakita，於1962年3月27日當初，自一正常成年非洲綠猴之腎臟取得。 B.Simizu於1964年6月15日將該細胞株之第93代，自千葉大學帶至美國國家衛生院之國家過敏及感染性疾病研究院之熱帶病毒學實驗室。除了用作疫苗細胞基質外，此細胞株曾被廣泛用於病毒複製研究及溶菌斑分析。在本發明中，「維羅細胞」乙詞不僅包含來自原始維羅細胞株之細胞，亦包含衍生自維羅-衍生細胞株，如維羅76(ATCC編號CRL-1587^TM )及維羅E6(ATCC編號CRL-1586^TM )者。

轉染可藉由任何已知方法進行，且可造成短暫性或穩定性之轉染。穩定性轉染對於建立產製目標VLPs之細胞株而言較佳。獲得穩定性轉染之方法係熟知者，例如篩選自發性之穩定性轉染細胞株、以永生性基因轉染、及選擇提供抗生素(如新黴素、嘌呤黴素、zeocin、潮黴素B及保米黴素S)抗性之基因。

如下列實例中所示，藉由本發明方法所產生之SARS-VLPs可在小鼠中誘發高力價之SARS-CoV-專一性抗體。因此，本發明亦提供一種產生抗SARS-CoV抗體之方法，包含以依據本發明所產生之SARS-VLPs免疫哺乳動物或鳥類，及由該哺乳動物或鳥類之血液中收取抗VLPs抗體。

依據下列實例，除了誘發體液免疫反應外，藉由本發明方法所產生之SARS-VLPs亦可刺激輔助T(T_H )細胞的全身性活化。因此，本發明亦提供一種預防一個體中SARS-CoV感染之方法，包含以依據本發明所產生之SARS-VLPs免疫該個體。較佳者，該個體為哺乳動物，如狗、貓、兔、大鼠、小鼠、豬、綿羊、山羊及牛，更佳為人類。

免疫可依傳統方式進行。可包含初次投藥及隨後之數次加強投藥，但劑量可依各種不同療程而調整。SARS-VLPs之投藥量取決於欲免疫之個體，包括例如該個體之免疫系統產生抗體、甚至產生細胞媒介免疫反應之能力。需投藥之VLPs正確量取決於從業者。然而，熟習本技術者鑑於本案揭示即可無須過度實驗而輕易決定適當劑量範圍。劑量亦可能取決於投藥途 徑，且依宿主之大小而異。非限制性之例示劑量包括例如：約0.01mg/kg至約10mg/kg體重之較佳劑量，及約0.1mg/kg至約1mg/kg體重之更佳劑量。

另一方面，本發明提供一種偵測一個體是否受SARS-CoV感染之方法，包含以依據本發明所產生之SARS-VLP接觸該個體之血清樣本，及測定該樣本中是否有能結合SARS-VLPs抗原之專一性抗體，其中該抗體之存在表示陽性結果。

較佳者，該方法包含免疫分析。在本發明一特佳具體實施例中，該方法包含酵素連結免疫吸附分析(ELISA)。在ELISA分析中，VLPs係吸附於一選取之材質表面，例如：聚苯乙烯微滴定盤之凹槽。沖洗去除不完全吸附之物質後，可令一已知對受試樣本為抗原中性之非專一性蛋白質，如牛血清白蛋白(BSA)，補吸附該選取之表面。如此可阻斷該表面上的非專一性吸附區，藉以降低因抗血清中之蛋白質與該表面之非專一性結合所造成的背景訊號。

然後在有利於抗原/抗體結合之條件下，令吸附有SARS-VLPs之材質表面與體液樣本進行培養(例如：取自疑似受SARS-CoV感染之個體之血清樣本)。樣本可加入稀釋劑(如BSA溶液、牛γ-球蛋白(BGG)及/或磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)/Tween-20)稀釋。然後在適當反應溫度(例如介於約25℃至約37℃)下使樣本反應約2至約4小時。反應後，以一溶液(例如PBS/Tween^TM -20或硼酸鹽緩衝液)沖洗去除未結合之物質。再與對一級抗體具專一性之二級抗體進行培養，再沖洗後，呈色測定陽性反應程度。若受試樣本係源自人類，則二級抗體為對人類免疫球蛋白(一般而言為IgG、IgA、IgM)具專一性之抗體。為便於偵測，該二級抗體可具有相關之活性，例如與適當呈色性受質反應後可產生呈色效果之酵素活性。然後即可使用例如分光光度計測量顏色深淺以達到定量之目的。

本發明亦提供另一種偵測一個體是否受SARS-CoV感染 之方法，包含以利用本發明之SARS-VLPs所產生之專一性抗體接觸該個體之組織樣本，及測定該樣本中SARS-CoV抗原之存在，其中該抗原之存在表示陽性結果。

較佳者，該方法包含免疫分析。在本發明一特佳具體實施例中，該方法包含間接性免疫螢光染色。間接性免疫螢光染色包括以抗體染色細胞內之特定蛋白質，及分別經由螢光標記之二級抗體追蹤訊號。例如，首先將目標細胞固定化、滲透及清洗，然後以1%明膠/PBST將細胞阻斷一小時，以1%明膠/PBST適當稀釋後令其與一級抗體(如抗-S、M、E及GFP)在4oC下反應隔夜。以PBST清洗三次後，使細胞與螢光標記之二級抗體反應，清洗，並於共軛焦顯微鏡下掃描之。

再一方面，本發明提供一種由SARS-VLPs構成，具免疫增強性的組合物，個體在投藥後會產生免疫學反應，例如抗體或T-細胞反應。

依據本發明所產生之SARS-VLPs在由培養基或細胞懸浮液收取後及用於免疫增強性組合物前可加以純化。可使用任何已知可由周圍蛋白質、脂質、核酸、膜、完整細胞等分離出VLPs或病毒之方法。特佳者為親和層析法，例如可使用對SARS-VLPs具專一性之固定化單株抗體。額外的適合方法為凝膠過濾層析法、離子交換層析法及密度梯度沉澱法。

當與佐劑共同投予時，依據本發明所產生之SARS-VLPs之免疫增強性可提高。佐劑可促進抗原之免疫增強性，但本身未必具有抗原性。佐劑之作用可為將抗原維持於投藥處附近以產生補給站效應，以便將抗原緩慢且持續地釋放給免疫系統之細胞。佐劑亦可將免疫系統之細胞吸引至抗原補給站附近，並刺激該等細胞而引起免疫反應。

例如，可促進免疫增強性組合物之有效性之較佳佐劑包括但不限於：(1)鋁鹽(明礬)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油乳液配方(含或不含其他特定免疫刺激劑如胞壁醯肽(見下文)或細菌細胞壁組分)，如(a)MF59^TM ，包含5% 角鯊烯^TM 、0.5% Tween^TM 80及0.5% Span^TM 85(視需要包含不同量之MTP-PE(見下文)，雖然非必須)，使用微流化器，如型號1 10Y之微流化器(Microfluidics,Newton,Mass.,U.S.A.)調配成次微米顆粒，(b)SAF^TM ，包含10%角鯊烷^TM 、0.4% Tween^TM 80、5% pluronic嵌段聚合物L121及thr-MDP(見下文)，可微流化為次微米乳液或渦流震盪以產生顆粒較大之乳液，及(c)Ribi^TM 佐劑系統(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,Mont.,U.S.A.)，包含2%角鯊烯^TM 、0.2% Tween^TM 80及選自由下列所組成之群之一或多種細菌細胞壁組分：單磷酸酯A(MPL)、海藻糖二黴菌酸鹽(TDM)及細胞壁骨架(CWS)，較佳為MPL+CWS(Detox^TM )；(3)皂苷佐劑，可使用如Stimulon^TM (Cambridge Bioscience,Worcester,Mass.,U.S.A.)或由其產生之顆粒如ISCOM(免疫刺激複合物)；(4)完全弗氏(Freund's)佐劑(CFA)及不完全弗氏佐劑(IFA)；(5)細胞激素，如介白素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(如γ-干擾素)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)細菌ADP-核糖化毒素，如霍亂毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大腸桿菌熱易變毒素(LT)，特別是LT-K63、LT-R72、CT-Si09、PT-K9/G129；及(7)其他作用如免疫刺激劑而促進組合物有效性之物質。

如前所述，胞壁醯肽包括但不限於N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩胺酸醯胺(thr-MDP)、N-乙醯基-正胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩胺酸醯胺(nor-MDP)、N-乙醯基-胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩胺酸醯胺基-L-丙胺酸-2-(1’-2’-二棕櫚醯基-s-n-甘油醯基-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(MTP-PE)等。

亦可於本發明之免疫增強性組合物中使用醫藥上可接受之鹽類。例如礦物鹽如氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽，以及有機酸鹽如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或苯甲酸鹽。

本發明之免疫增強性組合物一般包含醫藥上可接受之賦形劑，例如水、生理鹽水、甘油及乙醇，且可包含如濕潤劑、 乳化劑或pH緩衝劑等物質。

本發明之免疫增強性組合物可製備為注射物、液態溶液、懸浮液或乳液，並以非經腸方式作皮下、皮內或肌肉內注射投藥。或者，本發明之免疫增強性組合物可以某種方式調配及遞送以於黏膜表面誘發免疫反應。因此，該免疫增強性組合物可藉由例如鼻腔或口腔(胃內)途徑投予至黏膜表面。或者可能需要其他投藥方式，包括栓劑及口服配方。口服配方之形式可為溶液、懸浮液、錠劑、片劑、膠囊、持續釋放配方或粉劑。

本發明之免疫增強性組合物可進一步包含來自其他病原體之抗原而成為多價之免疫增強性組合物。

另一方面，本發明中寄宿於哺乳類動物之病毒為正黏液病毒，即，一RNA病毒家族，其包括五種類：流感病毒A(例如H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7)、流感病毒B、流感病毒C、傳染性鮭魚貧血病毒(isa virus)及托高土病毒(thogoto virus)。更佳者，該寄宿於哺乳類動物之病毒為流感病毒。

流感病毒之結構性蛋白質包含但不限於紅血球凝集素(HA)、神經氨酸苷酶(NA)、基質(M1)及氫離子離子通道蛋白質(M2)。

M1為流感顆粒中最充足之蛋白質。其於病毒包膜內形成一內膜，其係由部分宿主細胞模(磷脂質及蛋白質)衍生而來，但包含某些病毒醣蛋白。M1能夠直接進行病毒組裝及出芽。報告指出M1單獨表現會誘導昆蟲細胞釋放VLPs(見US20050186621A1及其中文獻)。

M2為一鑲嵌於病毒包膜之氫離子選擇性離子通道蛋白質。其在流感病毒之生命週期扮演重要角色，能使氫離子由內體進入病毒顆粒(病毒粒子)，因此降低病毒內PH值並造成病毒基質蛋白質M1由核醣核酸蛋白質RNP分離。此為病毒去膜及暴露內容物至宿主細胞之細胞質之一關鍵步驟。

HA為一發現於流感病毒表面之抗原醣蛋白。其係紅血球 凝集素之一種，即，一種能夠造成紅血球(血紅細胞)體外凝聚(凝集)之蛋白質。HA調節流感病毒與標的細胞之鍵結以及病毒基因體進入標的細胞，例如，與其標的細胞表面含唾液酸之受體結合以及造成宿主內細胞膜與病毒膜之融合。目前至少有十六種不同流感HA亞型已被發現，H1至H16。

NA為另一發現於流感病毒表面之抗原醣蛋白。其參與子代病毒由感染細胞釋出，例如，催化水解病毒粒子及宿主細胞受體之終端唾液酸殘基。其活性亦包括促進呼吸道黏液中病毒顆粒之移動以及子代病毒由感染細胞之溶離。目前至少有九種不同流感NA亞型已被發現，N1至N9。

HA及NA為主要免疫反應抗原決定基之來源，使病毒進行中和及保護性免疫。其被認為係預防流感疫苗最重要之組成份。基於對HA及NA之抗體反應，流感A病毒被歸成數亞型。HA及/或NA之改變明顯改變流感病毒之宿主特異性，例如，使病毒感染新品種宿主或對舊宿主有更強感染性。當一新流感病毒株出現新的HA及/或NA亞型，在對抗舊有流感病毒株接種之後所研製之抗體，可能無法對新病毒株提供有效保護作用。考慮到流感病毒之抗原漂移，新的流感疫苗研製是必須的。

目前有兩種類型之季節性流感疫苗：注射式流感疫苗及鼻噴式流感疫苗。注射式流感疫苗含有已死流感病毒，通常以針注入手臂。注射式流感疫苗被批准用於六個月大以上，包括健康以及慢性醫療條件之人士。鼻噴式流感疫苗含有減弱之活流感病毒，其不會造成流感(有時稱為LAIV“活減毒流感疫苗”或FluMist®)。LAIV(FluMist®)被批准用於二至四十九歲非懷孕健康人士。

每種季節性流感疫苗係由三種流感病毒株混合製成，例如，兩株流感A與一株流感B。季節性疫苗之病毒每年改變，其係基於國際監測系統及科學家對於該年何種類型或病毒株將會流通之預測。大約接種兩週後，提供抗流感病毒感染保護 之抗體於體內形成。然而，季節性流感疫苗可能無法提供抗所有該年循環於人類族群流感之保護。舉例而言，包含一流感A(H3N2)病毒、一一般季節性A(HINI)病毒及一流感B病毒之季節性疫苗無法提供抗2009HINI流感之保護，該流感具有不尋常之豬、禽及人之流感基因序列混合。可能需要有與季節性流感疫苗不同之流感疫苗，例如抗2009HINI，來有效預防流感感染之爆發或大流行。

每年九月或是在疫苗可用後即開始接種，並且於整個流感季節持續進行，至十二月、一月及之後。這是因為流感季節之時間及期間有所變化。流感可能早在十月就爆發，而大部分流感高峰期發生於一月或更晚。

根據本發明之具體實施例，由維羅細胞，例如維羅E6細胞生成流感VLPs之一操作平台，提供一安全且有效疫苗製造之新方法。此平台不會有以雞蛋為基礎或以桿狀病毒細胞培養為基礎方法之缺點，並能替代用於製造流感疫苗之傳統反向遺傳學。根據本發明具體實施例之維羅細胞系統，其製造不止包括HA及NA還包括基質蛋白質M1及M2之流感VLPs，因為M1及M2皆具流感病毒組裝及出芽過程之同等關鍵地位，這表明他們在哺乳類動物VLP出芽效率同樣重要[31,32,33,34,35,36]。M1及M2於流感VLPs之組合不只增加由維羅細胞之VLP產量，亦補充內部病毒抗原，其能提供高度保存T細胞及B細胞決定基以打擊同源及異源性病毒[37,38]。

該方法之靈活性已被交換HA及NA表面抗原以產生模擬兩種流感亞型之VLPs所證實(圖6及8)。如此可縮短用於調整抗循環流感病毒株之特異性疫苗匹配之前置時間。已達成由重組維羅細胞生產之流感VLPs臨床前產量規模。該維羅細胞VLP系統緩解了依賴活病毒之安全限制與瓶頸。其亦容許快速及可擴展之產量，不須依賴於雞蛋的可得性來生產疫苗。

來自哺乳類動物細胞之流感VLPs之產生曾被報告係藉由 人類293T細胞中HA及NA蛋白質短暫共表達[30]。然而，本發明為第一個揭露由哺乳類動物細胞製得包含充足HA及NA蛋白質量之VLPs蛋白質體，其係經SDS-PAGE分析證實，包括其由進一步經去醣基化及血凝測定證實之特定。現在第一次發現，由維羅細胞表現之VLPs包含多種維羅細胞蛋白質，例如，β 肌動蛋白、微管蛋白等，於其他表現系統製成的VLPs無此等蛋白質。

亦第一次發現，維羅細胞表現之VLPs主要誘發IgG1抗體，其係與分裂或次單元疫苗誘發者相同，且為Th2型免疫反應之指標。於動物接種維羅細胞表現之VLPs引起HA特異性IgG1抗體以及導致抗同源性病毒致命感染之全面保護。而桿狀病毒表現之VLPs誘發IgG2a主要抗體，其係與未活化全病毒疫苗誘發者相同，且為Th1主要免疫反應之指標。Th1型免疫反應容易產生有害之副作用。

本發明第一次進一步發現，維羅細胞表現VLPs之HA同時包含複合型及高甘露糖型聚醣。此種醣化之HA不可能由桿狀病毒系統生成。透過修改宿主昆蟲細胞，桿狀病毒系統僅能選擇一種醣化作用。

根據本發明一具體實施例，流感類病毒顆粒(VLP)係由一方法製備，該方法包含：取得基礎維羅(Vero)細胞，其係經編碼流感M1之序列及編碼流感M2之序列穩定轉染；建構至少一種重組DNA分子，其包含編碼流感紅血球凝集素(HA)之序列及編碼流感神經氨酸苷酶(NA)之序列；將該至少一種重組DNA分子導入至該基礎維羅細胞，以取得共表現維羅細胞，其係經編碼流感M1、流感M2之序列穩定轉染，以及經進一步編碼流感HA及流感NA之序列轉染，其中該等流感M1、M2、HA及NA蛋白質於該共表現維羅細胞之表現係由一或多種可誘發性表現系統所調控； 於條件下培養該共表現維羅細胞，該條件容許該流感M1、該流感M2、該流感HA及該流感NA之表現，以及包含該流感M1、該流感M2、該流感HA及該流感NA之VLP之組合；及將該VLP由該共表現維羅細胞培養之上清液分離出來。

該基礎維羅細胞可經DNA編碼流感M1之序列及DNA編碼流感M2之序列穩定轉染之維羅細胞取得。流感M1及流感M2之編碼序列可衍生自任何流感病毒，例如H1N1、H5N1、H3N2等。流感M1及M2之編碼序列可衍生自相同流感病毒或不同流感病毒。序列可與病毒中自然發生者相同。序列亦可包含一或多種修飾，較佳情況為不改變編碼流感M1及M2之功能。舉例而言，序列可基於簡併遺傳密碼做修改以最佳化維羅細胞中基因表現，而不使編碼流感M1及M2之任何胺基酸序列改變。

流感M1及M2之編碼序列被選殖至一或多項表現質體，於是其可操作性地連結至使維羅細胞中流感M1及M2表現之表現控制元素。該表現控制元素包含一啟動子使維羅細胞表現、轉譯起始密碼、轉錄及轉譯終止密碼。表現控制元素亦可包含能達成一般表現之一般序列，例如，用於誘導流感蛋白質表達者。

鑒於本發明揭露內容，表現質體經本技術領域中已知方法導入維羅細胞。編碼流感M1及M2之序列，其包括流感M1及M2之編碼序列及可操作性地連結的表現控制元素，嵌入維羅細胞之基因體。結果之維羅細胞，即，基礎維羅細胞，係經編碼流感M1及M2之序列穩定轉染。鑒於本發明揭露內容，此穩定轉染細胞係使用本技術領域中已知方法被選擇及驗證。編碼流感M1及M2之序列可用一單獨表現質體或兩個別表現質體穩定轉染至維羅細胞。

在本發明一特定具體實施例中，基礎維羅細胞係經一包含 SEQ ID NO：12序列穩定轉染，其編碼流感A/Taiwan/083/2006之流感M1及M2。於SEQ ID NO：12，一CMV/TO啟動子控制M1及M2編碼序列之轉錄，其與核糖體內起始位(IRES )連結。一結構性表現tet 抑制子一之序列(SEQ ID NO：13)亦穩定轉染至維羅細胞以調控所有由CMV/TO啟動子控制之基因的表現。於SEQ ID NO：13，一CMV啟動子控制tet 抑制子編碼序列之轉錄。

表現質體、細胞系及類似於上述SARS-CoV VLPs建構重組維羅細胞之方法，可用於建構經編碼流感M1之序列及編碼流感M2之序列穩定轉染之基礎維羅細胞。

基礎維羅細胞之活細胞培養可被儲存，例如，於極低溫度下低溫冷凍儲存，例如在液態氮內。細胞可方便地恢復並隨後使用於根據本發明具體實施例之方法之操作。

一或多種流感病毒之HA及NA編碼序列可經標準分子生物技術取得，例如例如RT-PCR，接著DNA選殖及序列分析。關注之流感病毒可為潛在流行性或季節性流感病毒株，即，基於國際監測系統及科學家預測之該年可能於人類族群間傳撥之流感病毒類型及病毒株。流感HA及NA之編碼序列可衍生自相同流感病毒或不同流感病毒。序列可與病毒中自然發生者相同。序列亦可包含一或多種修飾，較佳情況為不改變編碼流感HA及NA之抗原專一性。舉例而言，序列可基於簡併遺傳密碼做修飾以最佳化維羅細胞中基因表現，不改變流感HA及NA之任何胺基酸序列。或，胺基酸序列之選擇性殘基可為專一性目的做突變，例如啟用一蛋白酶裂解點，止用醣化點或啟用設計抗原表位之融合。

將流感HA及NA之編碼序列選殖至一或多項表現質體，於是其可操作性地連結至使維羅細胞中流感HA及NA表現之表現控制元素。該表現控制元素包含一啟動子使維羅細胞表現、轉譯起始密碼、轉錄及轉譯終止密碼。表現控制元素亦可包含能達成一般表現之一般序列，例如，為了誘導流感蛋白質 表達者。

鑒於本發明揭露內容，表現質體經本技術領域中已知方法導入基礎維羅細胞。編碼流感HA及NA之序列，其包括流感HA及NA之編碼序列即可操作性地連結的表現控制元素，可被嵌入基礎維羅細胞之基因體，形成一共表現維羅細胞，其係經編碼流感蛋白質M1、M2、HA及NA之序列穩定轉染。編碼流感HA及NA之序列可亦留在細胞內非基因體之表現質體上，形成一經編碼流感M1及M2之序列穩定轉染、但經編碼流感HA及NA之序列短暫轉染之共表現維羅細胞。本發明具體實施例包括經編碼流感HA及NA之序列穩定或短暫轉染之共表現維羅細胞。編碼流感HA及NA之序列可用一單獨表現質體或兩個別表現質體穩定轉染至基礎維羅細胞。

在本發明一特定具體實施例中，共表現維羅細胞係經一包含SEQ ID NO：12序列穩定轉染，其編碼流感A/Taiwan/083/2006之流感M1及M2，。於SEQ ID NO：12，一CMV/TO啟動子控制M1及M2編碼序列之轉錄，其與核糖體內起始位(IRES )連結。一結構性表現tet 抑制子一之序列(SEQ ID NO：13)亦穩定轉染至維羅細胞以調控所有由CMV/TO啟動子控制之基因的表現。於SEQ ID NO：13，一CMV啟動子控制tet 抑制子編碼序列之轉錄。及進一步以包含SEQ ID NO：14之序列(其編碼流感A/Taiwan/083/2006之流感H3及N2)轉染，更佳者穩定轉染。SEQ ID NO：14亦包括用於H3及N2表現之5’-及3’-表現控制元素。

在本發明另一特定具體實施例中，共表現維羅細胞係經一包含SEQ ID NO：12之序列穩定轉染，其編碼流感A/Taiwan/083/2006之流感M1及M2，及進一步以包含SEQ ID NO：15之序列(其編碼流感A/Hanoi/30408/2005(H5N1)之流感H5及N1)轉染，更佳者穩定轉染。SEQ ID NO：15亦包括H5及N1表現之5’-及3’-表現控制元素。

可進一步將一或多種編碼外加蛋白質之DNA序列導入基 礎維羅細胞，以重組製造進一步包含外加蛋白質之流感VLPs。

在本發明一具體實施例中，可進一步將編碼佐劑(例如致病細菌之鞭毛蛋白)之一或多種DNA序列導入基礎細胞以重組製造進一步包含佐劑之VLPs。

在本發明另一具體實施例中，來自二或多種不同流感病毒株之編碼HAs及NAs之序列，例如，二或多種潛在流行性或季節性流感病毒株，可被轉染至基礎維羅細胞。結果之共表現維羅細胞係經編碼流感M1及M2之序列穩定轉染，及來自二或多種不同流感病毒株之編碼HAs及NAs之序列短暫或穩定轉染。該共表現維羅細胞製造包含HAs及NAs交融之VLPs，其對該二或多種不同流感病毒株之預防感染有助益。

表現質體及類似於上述SARS-CoV VLPs建構重組維羅細胞之方法，可用於建構共表現維羅細胞以產生流感VLPs。

在本發明一具體實施例中，編碼病毒蛋白質序列之表現，例如，流感M1、M2、HA及NA，係由一或多種可誘發性基因表現系統所控制，於是病毒蛋白質係於可誘發性條件下製造及組裝至流感VLPs。任何可誘發性基因表現系統，例如如上述之SARS-CoV VLPs可誘發性製造，可依本發明揭露內容用來可誘發性的製造流感VLPs。病毒蛋白質可由相同可誘發性基因表現系統控制。各病毒蛋白質亦可獨立由不同可誘發性基因表現系統控制。

共表現維羅細胞之活細胞培養可被儲存，例如，於極低溫度下低溫冷凍儲存，例如在液態氮內。細胞可方便地恢復並隨後使用於流感VLP之製造。

據此，本發明一具體實施例係有關於製備流感類病毒顆粒(VLP)之方法，該方法包含：取得共表現維羅細胞，其係經編碼流感M1之序列、編碼流感M2之序列穩定轉染，以及經進一步編碼流感紅血球凝集素(HA)之序列及編碼流感神經氨酸苷酶(NA)序列轉染，其中該等流感M1、M2、HA、NA蛋白質於該共表現維 羅細胞之表現係由一或多種可誘發性表現系統所調控；及於一條件下培養該共表現維羅細胞，該條件使該等流感M1、流感M2、流感HA、流感NA表現，並組合為該等流感M1、流感M2、流感HA、流感NA之VLP；及將該VLP由該培養之共表現維羅細胞上清液分離出。

本發明之一具體實施例係有關於一基礎維羅細胞，其係經編碼流感M1之序列及編碼流感M2之序列穩定轉染之一維羅細胞，其中該流感M1及M2蛋白質於基礎維羅細胞中之表現係由一可誘發性表現系統所調控。

本發明具體實施例亦涵蓋取得基礎維羅細胞之方法。該方法包含：將編碼流感M1之序列及編碼流感M2之序列導入維羅細胞；及取得基礎維羅細胞，其係經編碼流感M1之序列及編碼流感M2之序列穩定轉染，其中該流感M1及M2蛋白質於基礎維羅細胞中之表現係由一可誘發性表現系統所調控。

編碼流感M1之序列及編碼流感M2之序列可於單一核酸分子或於兩個別核酸分子被導入維羅細胞。

在本發明一具體實施例中，該基礎維羅細胞係經編碼流感M1之序列及編碼流感M2之序列穩定轉染之一維羅E6細胞，其中該流感M1及M2蛋白質於維羅E6細胞中之表現係由一可誘發性表現系統所調控。

該基礎維羅細胞可做為一建構重組維羅細胞用之宿主細胞，包含一或多種編碼一或多種流感蛋白質之轉染序列，該等蛋白質係與流感M1及M2不同。

本發明之一具體實施例係關於一共表現維羅細胞，其係一維羅細胞經編碼流感M1之序列、編碼流感M2之序列穩定轉染，以及經進一步編碼流感HA之序列、編碼流感NA之序列轉染，其中該等流感M1、M2、HA、NA蛋白質於該共表現 維羅細胞之表現係由一或多種可誘發性表現系統所調控。在一具體實施例中，該共表現維羅細胞為維羅E6細胞重組製得。

本發明具體實施例亦涵蓋取得共表現維羅細胞之方法。該方法包含：取得基礎維羅細胞，其係經編碼流感M1之序列及編碼流感M2之序列穩定轉染；將編碼流感HA之序列及編碼流感NA之序列導入基礎維羅細胞；及取得共表現維羅細胞，其係經編碼流感M1之序列、編碼流感M2之序列穩定轉染，以及經進一步編碼流感HA之序列及編碼流感NA之序列轉染，其中該等流感M1、M2、HA及NA蛋白質於該共表現維羅細胞之表現係由一或多種可誘發性表現系統所調控。

編碼流感HA之序列及編碼流感NA之序列可於單一核酸分子或於兩個別核酸分子被導入維羅細胞。該共表現細胞可經編碼流感HA之序列及編碼流感NA之序列穩定或短暫轉染。

各流感M1、M2、HA及NA蛋白質之表現可經相同或不同可誘發性表現系統獨立調控。在一具體實施例中，該等流感M1、M2、HA及NA蛋白質之表現係由相同可誘發性表現系統調控。

流感蛋白，例如，M1、M2、HA及NA在適當條件下表現於共表現維羅細胞，例如，當細胞生長於包含可誘發性表現系統之誘導物之培養基。該等病毒蛋白連同一些維羅細胞之細胞蛋白，自我組裝為帶有HA及NA表面抗原的VLPs之非感染性VLPs。該VLPs被分泌至共表現維羅細胞之細胞培養基。其進而由細胞分離出以及利用保存該VLPs完整性之方法被分離出，例如用密度梯度離心等。

根據本發明具體實施例，與前述製造及分離SARS-CoVVLPs類似之方法可用於流感VLPs之製備。

現在第一次發現，特異性存在於真實流感病毒顆粒中之細 胞成份亦被納入由維羅細胞製造之流感VLP。這表示宿主蛋白與病毒蛋白之特定交互作用牽涉VLPs之生物合成，其反應真實流感病毒顆粒之病毒組裝及出芽期間之類似過程(表1及圖9)。此外，根據本發明具體實施例，數個細胞蛋白被發現與流感VLPs有關聯，但與病毒顆粒無關，這表明該等蛋白質而非流感病毒顆粒於維羅細胞中流感VLPs之製造扮演重要角色。

因此，本發明另一具體實施例係關於流感類病毒顆粒(VLP)，其包含：一流感M1、一流感M2、一流感紅血球凝集素(HA)及一流感神經氨酸苷酶(NA)，及維羅細胞之至少一細胞蛋白，其中該流感蛋白係由該維羅細胞重組表現。

在本發明一特定具體實施例中，該維羅細胞為維羅E6細胞。

流感VLP中該等流感M1、M2、HA及NA可衍生自相同或不同流感病毒株。在本發明一具體實施例中，該流感M1及M2係衍生自相同流感病毒，及該流感HA及NA係衍生自一或多種不同流感病毒株，例如一或多種潛在流行性或季節性流感病毒株。在本發明一具體實施例中，該流感HA及該流感NA係衍生自相同潛在流行性或季節性流感病毒株。

在本發明另一具體實施例中，該流感VLP包含二或多種HAs及二或多種NAs，其等衍生自二或多種不同流感病毒株，例如，二或多種潛在流行性或季節性流感病毒株。

在本發明特定具體實施例中，該流感VLP包含流感A/台灣/083/2006之M1(SEQ ID NO：6)及M2(SEQ ID NO：7)，及流感A/台灣/083/2006之H3(SEQ ID NO：8)及N2(SEQ ID NO：9)。

在本發明另一特定具體實施例中，該流感VLP包含流感A/台灣/083/2006之M1(SEQ ID NO：6)及M2(SEQ ID NO：7)，及流感A/河內/30408/2005(H5N1)之H5(SEQ ID NO：10)及N1(SEQ ID NO：11)。

在本發明一具體實施例中，該流感VLP之細胞蛋白，根據本發明一具體實施例，包括亦呈現於真實流感病毒之蛋白 質，如表1所列，例如，細胞骨架蛋白、細胞外基質(ECM)蛋白、熱休克蛋白、膜聯蛋白、四次穿膜蛋白及解糖酶。

在本發明另一具體實施例中，該流感VLP包含非存在於流感病毒顆粒內之細胞蛋白，如表2所列者，例如，一或多種選自由下列所構成之群組：籠形蛋白重鏈1、紅細胞膜內蛋白β、叢狀蛋白B2、CD109同源物、前列腺素F2受體負調節物、Na+/Ka+腺核苷三磷酸水解酶α1、腫瘤排斥抗原(gp96)1及浮艦蛋白I。

根據本發明具體實施例之流感VLPs之HA及NA刺狀醣化概況係經N-去醣化作用來檢驗(圖10)。於H3N2-VLPs，HA之醣化概況與維羅細胞中流感病毒複製高度相似[25]。以穿透式電子顯微鏡(TEM)時，根據本發明具體實施例之流感VLPs被發現與流感病毒之大小、顆粒型態及表面刺狀精緻結構極相似(圖6及7)。結果發現，根據本發明具體實施例之流感VLPs激發投予VLPs小鼠之抗體免疫反應。結果亦表明，根據本發明具體實施例之流感VLPs疫苗提供小鼠對抗禽流感感染之全面性保護。所有結果表明流感VLPs提供對抗流感感染安全且有效之方法。

本發明一具體實施例係關於免疫性組合物，其包含免疫上有效量之本發明具體實施例流感VLP及藥學上可接受之賦形劑。該免疫性組合物可進一步包含賦形劑。任何藥學可接受賦形劑或佐劑，例如上述包含SARS-CoV VLPs之免疫性組合物，可用於包含流感VLP之免疫性組合物。

在本發明一具體實施例中，根據本發明一具體實施例之免疫性組合物被投藥至一個體，以誘發個體對抗流感病毒之免疫力。該免疫性組合物包含一流感VLP，其包含衍生自標的流感病毒之HA及NA。個體中免疫力之誘發結果為預防、改良或減少該個體流感病毒感染相關之至少一症狀。「流感VLP之免疫上有效量」一般係指足以誘發預防、改良或減少流感病毒感染相關之至少一症狀之免疫力之流感VLP量。

在本發明另一具體實施例中，對個體免疫接種提供個體中對抗流感病毒之保護，接種之疫苗包含根據本發明具體實施例之流感VLP，其包含衍生自流感病毒之HA及NA。

在本發明一具體實施例中，一包含源自超過一種流感病毒株之HAs及NAs之流感VLPs混合物，將其投藥至個體以誘發個體中對抗超過一種流感病毒株之免疫力。

在本發明另一具體實施例中，根據本發明具體實施例之流感VLP用於診斷個體受流感病毒感染之方法。該方法包含：由該個體取得生物樣本；使該生物樣本與流感VLP接觸，其中該流感VLP包含由流感病毒衍生之HA及NA；及測量該生物樣本中與該流感VLP組成抗體抗原複合體之抗體之含量，其中高於抗體之閾值含量者表示該個體曾被該流感病毒感染或是接受過類似病毒株之免疫接種。

該生物樣本可為，例如，一血清樣本或組織液。與該流感VLP組成抗體抗原複合體之抗體之含量可經任何方法測得，例如ELISA，如本發明所揭露。抗體之閾值含量可經一陽性對照決定，例如，由一已知經閾值含量之流感病毒感染之個體取得生物樣本。

本發明另一具體實施例係關於與對抗根據本發明具體實施例之流感VLP之一抗體。

鑒於本發明揭露內容，該抗體可經此技術領域中已知方法製備。舉例而言，可經將VLP投藥至脊椎動物，及由該脊椎動物之血液收集抗該VLP之抗體，而製備該抗體。該抗體可為多株或單株。

該抗體可用於多種目的，例如治療或診斷流感病毒之感染。

在本發明一具體實施例中，一治療流感病毒感染之方法包含對個體投予抗流感VLP之一抗體。該流感VLP包含衍生自 標的流感病毒之HA及NA。

該抗體可伴隨上述之藥學可接受賦形劑投藥至個體。該抗體辨識並鍵結至流感病毒表面之HA及NA抗原位置，因此調節個體中抗流感病毒之免疫反應。該HA特異性抗體於流感病毒中和扮演一重要角色，及該NA特異性抗體減少受感染細胞之病毒釋出。該等抗體亦可於個體中阻斷流感病毒進入細胞或阻斷流感病毒之複製。早期以抗體治療或以涉及抗流感VLP之抗體之免疫血漿被動免疫介入，能協助控制急性流感病毒感染之爆發，特別是在虛弱、受抑制或免疫系統受損之個體。

在另一具體實施例中，該抗體可用於偵測個體受流感病毒感染之方法，該方法包含：由該個體取得生物樣本；使該生物樣本與申請專利範圍第17項之抗體接觸；及偵測該生物樣本中與該抗體形成抗體抗原複合體之抗原，其中該抗原存在於該生物樣本中表示該個體被該流感病毒感染。

該生物樣本可為，例如，該個體之血清、咽部採集樣本、眼淚或組織標本等。

本發明一具體實施例包括關於維羅細胞製造之流感VLPs之組合物及方法，其與前述之SARS-CoV VLPs類似。

本發明進一步以下列實例闡述，其目的係供說明而非限制。

實例1 SARS-VLP之表現及組裝

細胞株及質體

維羅E6細胞係得自美國菌種保存中心(ATCC編號CRL-1586^TM )，依常規培養於添加有10%胎牛血清之MEM培養基中。衍生自維羅E6之四環素-可誘發性基礎細胞維羅/TR，係以pcDNA6/TR質體(Invitrogen)作穩定轉染而得。 可誘發性之M-GFP及E表現匣之建構，係將β -球蛋白/IgG之合成內子(來自pCI載體，Promega)、M-GFP序列、來自腦心肌炎病毒(ECMV)之內部核糖體進入位點(IRES)之序列、及E序列依序以PCR連接，然後將該構築體嵌入pcDNA4/TO質體(Invitrogen)之骨架中。可誘發性之S表現匣之建構，係將TW1品系之S蛋白cDNA插入pcDNA5/TO質體(Invitrogen)中。隨後，將整個S表現匣嵌入M-GFP及E之表現質體中而產生pcDNA4/TO-S-MG-E之多遺傳單位載體。整個質體的序列已經DNA定序確認。

質體的構築

如圖1A中所示，帶三種SARS-CoV被膜蛋白質，S、M-GFP(亦即與用以追蹤VLP之綠色螢光蛋白(GFP)融合之M蛋白)及E之轉殖基因係建構於同一質體(pcDNA4/TO-S-MG-E)中。在一質體中，該載體含有兩個表現匣。CMV/TO-MG-E表現匣(序列識別編號：1)轉錄為一RNA轉錄體，包含兩個編碼M-GFP及E蛋白之開放譯讀架，由一內部核糖體進入位點(IRES)連接，而CMV/TO-S表現匣(序列識別編號：2)僅表現S蛋白。兩個轉錄單位均由四環素-可誘發性啟動子調節。

VLP的表現

將pcDNA4/TO-S-MG-E載體穩定轉染入先前由維羅E6衍生之基礎細胞，以獲得SARS-VLP表現。該基礎細胞係以穩定轉染表現一四環素抑制因子(pcDNA6/TR)，因此重組SARS-CoV基因在誘發前不會表現。依據GFP之螢光強度選出兩個細胞株用於量產SARS-VLP，亦即維羅/S-MG-E-55及維羅/S-MG-E-68。病毒基因之表現係藉由添加強力黴素(1μ g/ml)至細胞培養物，並以RT-PCR確認帶S、M及E序列之RNA之可誘發性表現(不出示數據)。VLP在維羅/S-MG-E-55株中之表現量最高，維羅/S-MG-E68株次之，因此VLP之製備主要使用維羅/S-MG-E-55株。

為供共軛焦顯微鏡分析，將受試細胞培養於12mm蓋玻 片上並以強力黴素(1μ g/ml)處理1天。將細胞以4%多聚甲醛於冰上固定20分鐘，以0.2%(v/v)Triton X^TM -100/PBS穿透，然後以PBS清洗三次。以1%(v/v)魚凝膠/PBST(含0.1% Tween^TM -20之PBS)阻斷一小時後，將樣本於4℃下以特定抗體處理18小時，隨後以PBST清洗三次，然後以相關的螢光共軛二級抗體於室溫下偵測一小時。最後，將樣本以PBST清洗三次，並以封片膠(Vector)封片。掃描樣本中之GFP及抗體螢光標記訊號，隨後以製造商之軟體(Zeiss LSM 510 META)分析共同之局部化現象。

如顯微鏡影像圖示(圖1B)，一經誘發，在一天內GFP點即明顯地出現在生產細胞中，且GFP螢光之表現延續超過五天。在細胞質中由細胞核周圍區域延伸向細胞膜之各種大小之GFP點，狀似哺乳動物細胞中由內質網(ER)至細胞膜之分泌途徑。此胞內分布符合SARS及其他冠狀病毒之組裝，係位於ER-高基之間的區域。

以下藉免疫螢光染色檢視各VLP組成蛋白(S、M、E及GFP)於細胞內之表現，並與GFP之螢光軌跡進行重疊來分析VLP之組裝，如圖1B中所示誘發一天後之VLPs生產細胞。以抗M蛋白或GFP抗體染色造成與GFP軌跡完全重合之訊號，因此表示GFP融合忠實地標記了M蛋白(圖1B)。除了細胞核周圍(高基氏體位置)之染色外，S蛋白有強烈之ER網狀形態染色(此外尚有高基氏體及分泌液泡之輪廓，圖1B)。然而，S蛋白與M-GFP之重合點主要限於高基氏體及分泌液泡。較多S蛋白累積於ER中，表示其在ER中滯留期較長，其新合成及醣化可能需要較長的時間。雖然多數分泌性M-GFP點與E蛋白之染色呈重合分布，細胞核附近之M-GFP有的與E蛋白重合，有的不與E蛋白重合。以上數據共同顯示E蛋白一旦轉譯出來，旋即加入高基氏體附近之M-GFP及S蛋白進行組合，因此形成M-GFP、E及S蛋白間精確地重合於分泌液泡處(圖1B)。在作為負對照組之維羅E6母細胞中， 相同的S、M或E抗體免疫染色並未偵測到任何訊號，亦未見到GFP之螢光軌跡(不出示數據)。與先前對SARS-CoV及其他冠狀病毒之芽生及VLP組裝之研究一致者，本案之數據指出SARS-M、E及S係於細胞核附近組裝，並於分泌液泡中重合分布。三種蛋白質組裝為類SARS-CoV顆粒，在以下的蔗糖梯度實驗中共同沉降及電顯影象中呈多刺球狀顆粒得到進一步證明(圖2D)。

實例2 SARS-VLP之純化與定性

進行VLP之純化，首先於45%蔗糖緩衝物上以200,000×g之超高速離心，將釋放有VLP的細胞培養液於4℃下濃縮2小時。收集介面，再以25%、35%蔗糖之階梯式梯度超高速離心，以200,000×g於4℃下進一步分離48小時。由試管底部往上每0.5mL分割取樣。以考馬西(Coomassie)(Bradford)蛋白質分析套組(Pierce)分析各分割之蛋白質濃度，並以VICTOR2^TM 螢光光度計(PerkinElmer)測量GFP螢光。

利用西方墨點分析作蛋白質鑑定，抗體是以大腸桿菌表現之M蛋白(序列識別編號：3之第53至221個胺基酸)及E蛋白(序列識別編號：4之第1至76個胺基酸)為抗原，於由兔子脾臟注射產生。抗S蛋白多株抗體係使用大腸桿菌表現之S蛋白(序列識別編號：5之第679至888個胺基酸)為抗原於注射鴨子產生，並由卵黃純化IgY抗體(Wu,H.S.等人，2004，J Biomed Sci 11：117-126)。

如圖2A所示，蛋白質與GFP的分布，一致地集中於25%蔗糖層(第9至15分割樣本)。令人意外地，本研究亦發現一集中於35%蔗糖層(第2至6分割樣本)之次要蛋白質峰，此一次要蛋白質峰並未見於維羅/S-MG-E-68株。以SDS-PAGE及考馬西藍染色作蛋白質分析，顯示該兩個明顯區分之蛋白質峰顯然具有不同的蛋白質組成(圖2B)。圖2B中標示之各種預期大小之VLP組成蛋白質，係使用抗S、M、E及GFP蛋白之特定抗體作西方墨點分析確認(圖2C)。SARS-VLP包含 多型之S蛋白，主要是有分子量180k(○)之成熟形式，較少的是170k(★)及140k(+)(圖2B)。依據先前針對S及M蛋白於哺乳動物細胞中個別表現之研究，180k(○)型代表一複合醣化型(EndoH-抗性但PNGaseF-敏感性)；170kDa(★)型代表一高-甘露糖醣化型(EndoH-敏感性)；而140kDa(+)型代表一未醣化型。經純化之SARS-CoV包含兩型之M。數量較多是分子量22k的未醣化型，而數量較少之27k的帶一EndoH-可切、高-甘露糖型之N-聚醣，連接於Asn-4殘基(Voss,D.等人，2006，同上)。SARS-VLP中GFP融合提高分子量27k，SARS-VLP中M-GFP之分子量主要為65k(#)與70k(＊)兩型，於SDS電泳中不知為何均額外的增加16k。65k型(#)多於70k型(＊)，這點與前人研究一致(圖2B)。E蛋白在蔗糖梯度沉澱中與M蛋白一起，且其分子量9k可能表示缺乏醣化。

SARS-VLP除了有預期之主要型式。不預期的次要型式則主要含170k型之S蛋白及較少65k型之M-GFP，但沒有E蛋白，因此未於此進一步定性。主要的SARS-VLP(亦即圖2A至2C中之級分9至15)包含最多M-GFP較少，S蛋白，最少E蛋白，此比例類似SARS及其他之冠狀病毒，用於以下的研究。分泌型SARS-VLP之S蛋白為主要的180k型，包含複合型之N-聚糖，一般認為其熟成係發生於S蛋白三聚體化之前。就其於SDS電泳中之移動率估計，分泌型SARS-VLP中所含之所有S蛋白均未受蛋白酶切割。

進一步以穿透式電子顯微鏡(EM)觀察SARS-VLP之外形。為供EM，將一滴10μl經純化之SARS-VLP點至碳膜上，3分鐘靜置後，以2%乙酸鈾醯染色2分鐘，在電子顯微鏡下直接觀察。由圖2D可見，負染之VLP外形為具有多刺表面之球狀顆粒，類似於SARS-CoV顆粒，且直徑範圍介於50nm及70nm間。維羅E6細胞所釋放之空心VLP，其直徑比釋放細於胞外之SARS-CoV真病毒(介於60nm及100nm間)小。

值得注意者，上述SARS-VLP之蛋白質產量很高，對所有相關應用而言，本案的VLP表現系統極具吸引力。以圖2所示為例，誘發後3天及5天時收集之共750ml培養液，其經常性的純化VLP產能，第9至15分割(每一分割樣本有3ml)加總共產出250mg之純化VLP蛋白質(圖2A)。發明人使用哺乳動物細胞為本之維羅/S-MG-E-55株生產SARS-VLP，經常性產量為449.7±69.3mg/L培養基(N=12)(使用1.2×108個生產細胞)，較文獻中以昆蟲細胞為本之SARS-VLP產量高了超過1,000倍(200μ g/L×109個宿主細胞，估計為0.5至1L細胞培養液)(Mortola E.及Roy,P.，2004，同上)。發明人相信本研究中SARS-VLP空前的高表現量可能肇因於以下之最佳搭配：維羅E6作為宿主細胞表現SARS病毒蛋白質，及轉殖基因在染色質中嵌入一基因表現上高度活躍的區域；因為發明人亦分離出許多其他基因轉殖維羅E6細胞株，其GFP點之細胞內表現程度顯然較低。然而，這也可能涉及用於本研究細胞株中之可誘發性CMV啟動子帶來的強力表現。就發明人所知，在維羅E6細胞中以穩定轉染生產SARS-VLP提供最高的產量，且生產過程不難修改作大規模生產，本系統具潛力發展經濟有效之疫苗。

實例3 SARS-VLPs之疫苗接種實驗

有了可由上述哺乳動物表現獲得之大量SARS-VLP，下一個重要課題係其免疫增強性及SARS-CoV-中和抗體反應。針對此課題，本案發明人設計了一系列小鼠疫苗接種試驗並檢查全身性免疫反應(圖3A)。以四隻6至8週齡之C57BL/6雌鼠為一組，於皮下注射20μ g SARS-VLP(溶於100μ L生理食鹽水中，不含額外之佐劑)，並於兩週後以不同劑量(0、5μ g、20μ g)加強。對照組小鼠則注射100μ L生理食鹽水。

接種SARS-VLP可在小鼠中誘發抗原專一性之IgG1反應。

加強免疫後兩週時，用原本的SARS-VLP為吸附抗原作 ELISA，定量血清IgG之抗原專一性。自尾靜脈採血後，於4℃下凝血隔夜、離心澄清、取得樣本血清。以1μ g SARS-VLP於4℃下吸附ELISA盤(Nunc)隔夜，並以生理食鹽水含5%脫脂乳進行阻斷。然後加入圖中指示之稀釋血清樣本於37℃下培養一小時，PBST沖洗五次、再以HRP-二級抗體培養，再PBST沖洗、加入TMB受質(PIERCE)呈色。最後，以微量盤吸光侧定儀(Power Wave XS,Bio-Teck)讀取450nm波長(A450)之吸光值。扣除空樣本之背景讀值作VLP-專一性IgG定量(A450)。

如圖3B所示，單劑20μ g VLP確實誘發50倍高之抗體反應。加強免疫一次，專一性抗體力價隨劑量增加而提高，可超過6250倍(圖3B)。偵測各IgG亞型之ELISA，發現抗體反應主要限於IgG1亞型，其一般功能在中和抗原(圖3B)。反之，在該等實驗中IgG2a亞型之VLP-專一性抗體力價則非常低(圖3B)。總之，抗體亞型之反應顯示SARS-VLP針對其表面之抗原決定點之誘發TH2-型免疫細胞之功能與效應。最重要的是，使用世界衛生組織網站建議之商業化ELISA檢驗套組化驗，SARS-VLP所誘發的IgG抗體能有效辨識經γ-射線及加熱去活化之SARS-CoV真病毒顆粒(圖3C)。在加強免疫後，在小鼠血中之高力價專一性抗體至少可維持4週，指出施打SARS-VLP可造成長期持續之抗體免疫反應(圖3D)。圖3B至3C中之ELISA結果，SARS-VLP疫苗所誘發的抗體能辨識、結合VLP及完整病毒之表面，顯示可能中和SARS病毒。以上結果亦證明VLP與完整SARS病毒的表面十分相似。

SARS-VLP誘發S及M蛋白專一性抗體之血清IgG抗體。

小鼠施打SARS-VLP後之抗體反應，我們利用西方墨點分析轉漬有三個不等量之SARS-VLP來了解抗體是針對哪些VLP蛋白質。如圖3E所示，VLP-專一性抗體對M-GFP結合最強，其次為S蛋白，最後才是E蛋白。VLP-專一性抗體有 效率地結合各型S及M蛋白。以上數據指出在SARS-VLP中S及M蛋白較E蛋白的免疫增強性高很多，這亦符合在SARS病患中發現之抗體專一性。

施打SARS-VLP可在小鼠中誘發抗原專一性輔助T(TH)細胞反應。

接種SARS-VLP疫苗產生之TH反應類型，我們以IFN-γ及IL-4 ELISPOT(酵素連結免疫墨點分析)檢查脾臟細胞之TH1及TH2是否活化而分泌細胞激素。為供ELISPOT分析，先以0.1ml IFN-γ及IL-4抗體(1：60；R&D systems)於4℃下吸附於PVDF底之微量盤(Millipore)、隔夜。以PBS沖洗兩次後，加入含1% BSA之生理食鹽水於室溫下阻斷4小時。在加強投藥後14天時自受試小鼠中取出脾臟、分離細胞並溶破紅血球。脾臟細胞體外培養於INF-γ或IL-4 ELISPOT盤中，呈單一細胞懸浮，每孔加入3×105細胞與1μ g VLP，於含10%加熱去活化FBS及50μ Mβ -巰基乙醇之RPMI中，培養40小時。ELISPOT之各步驟間以PBST沖洗五次。將盤以0.1mL 1/60稀釋之生物素接合之INF-γ或IL-4偵測抗體(R&D systems)於4℃下培養隔夜，沖洗後，加入1/60稀釋之streptavidin-alkaline phosphatase(R&D systems)於室溫下處理1.5小時，沖洗，並以水沖洗兩次。於黑暗中以BCIP/NBT溶液(R&D systems)使ELISPOT呈色30分鐘。以水沖洗俾停止呈色並風乾。以ImmunoSpot分析器計數訊號並以ImmunoSpot軟體(CTL)分析之。

當小鼠施打SARS-VLP後，脾細胞之初代培養於活體外再次接觸SARS-VLP時，會釋放INF-γ與IL-4之族群均隨著SARS-VLP之注射劑量而上升，顯示SARS-VLP疫苗接種在活體內，隨劑量增加而誘導出更多脾臟中具VLP-專一性的TH1細胞及TH2細胞(圖4A及4B)。然而，血清中以IgG1為主之抗體反應偏向TH2之免疫反應，又當DC對TH1及CTL呈現VLP抗原時，二者均可分泌INF-γ，故推測TH1細胞在 經疫苗接種之小鼠中之功能應為活化CTL。(圖3B及3C)。總體而言，以上數據指出SARS-VLP本身即為強力的疫苗，其可誘發體液及細胞免疫反應。

實例4 維羅細胞流感VLPs之表現與純化

製造流感VLPs之維羅細胞系統之建立

維羅細胞由生物資源保存及研究中心(台灣新竹)取得，且培養於基本成分培養基(HyClone,South Logan,UT)，其添加10%胎牛血清(Gibco,San Diego,CA)，並置於含5%二氧化碳之37℃加濕恆溫培養箱。

由流感A/Taiwan/083/2006序列衍生而來之M1及M2之cDNAs分別被殖入一以IRES連結之pcDNA6/TR(Invitrogen,Carlsbad,CA)修飾主幹，至一單一真核表現載體以提供質體pCI6/TO-M1-M2(圖5)。編碼M1及M2之胺基酸序列分別為SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7。HA及NA之cDNAs係分別基於A/台灣/083/2006及A/河內/30408/2005(H5N1)病毒株(感謝中央研究院生物化學研究所梁博煌博士提供)之合成序列，最佳化哺乳動物密碼子使用及進一步殖入表現載體pCI4/TO-HA-NA如圖所示(圖5A)。編碼HA及NA之胺基酸序列基於A/台灣/083/2006分別為SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9。編碼HA及NA之胺基酸序列基於A/河內/30408/2005(H5N1)分別為SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11。

就製造H3N2-及H5N1-VLPs之維羅細胞方面，質體pCI6/TO-M1-M2被穩定轉染至維羅細胞以衍生一基礎維羅細胞株，其進一步以HA及NA之表現載體轉染以取得具M1、M2、HA及NA蛋白質之四共表達維羅細胞株。

為確認H3N2-VLP生產細胞系之N2基因表現，由細胞分別萃取出經及不經四環黴素(Dox)誘導之全部RNAs，並使用配對相應N2基因內部序列之引子進行RT-PCR檢測。此引子為N2-F，5’-ATTAGGCTTTCCGCTGGTGGGGACAT-3’(SEQ IDNO：16)及N2-R， 5’-GCATTCTGACTCCTGGGTCCTGAGGATT-3’(SEQ ID NO：17)。

蛋白質表現係由西方墨點分析及免疫螢光染色確認，如下。四VLP表達細胞經Dox誘導48小時，或未經處理做為對照組。細胞隨後以4%多聚甲醛固定10分鐘並以0.05% Triton-X 100浸泡1分鐘。以1%明膠阻斷後，細胞分別以初級特異抗體處理，接著以山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG併合Cy3染劑處理。螢光圖像以共軛焦顯微鏡取得(LSM 510 META NLO DuoScan,Carl Zeiss,GmbH)。本研究用之抗體為，多株：Abcam(Cambridge,MA)之H3(ab20084)、N1(ab21305)、M1(ab20734)、膜聯蛋白A2(ab41803)及籠形蛋白(ab21679)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)之肌動蛋白β (sc-1616-R)，及單株：Abcam之M2(ab5416)及微管(ab6160)及AbD Serotec(Raleigh,NC)之H5(MCA2660，用於IFA)。用於西方墨點法之抗H5兔多株抗體係由馬徹博士(中央研究院基因體研究中心)提供。

於本研究，以哺乳動物細胞培養為基礎之方法係用以生成流感VLPs。為了將VLP製造關鍵之M1、M2、HA及NA病毒基因穩定轉染至培養之維羅細胞，例如維羅E6細胞，將四基因表現匣設計並置於二載體如圖所示(圖5A)。一四環素抑制子基因及tet 操縱子調節基因表現匣亦被插入表現M1及M2之質體，以促成質體pCI6/TO-M1-M2。藉由M1-M2載體穩定轉染至維羅細胞，基礎細胞在四環黴素(Dox)誘導構築前不會表現M1-M2轉殖基因。另二tet 操縱子調節、CMV啟動子驅動表現匣被分別殖入另帶有HA及NA基因之質體，以促成表現載體pCI4/TO-HA-NA。pCI4/TO-HA-NA載體穩定轉染至M1-M2基礎細胞株之後，一維羅細胞中哺乳動物表現VLP系統建立完成。

欲驗證全部四病毒基因之共表現確實係由可誘發性啟動子(CMV-TO)驅動，四-轉染H3N2維羅細胞株之總細胞裂解 液利用抗H3、M1及M2之特異病毒抗體以西方墨點分析(圖5B)。由於無可用之N2抗體，N2基因表現以RT-PCR確認。H3之細胞定位亦由共軛焦雷射掃瞄顯微鏡觀察(圖5D)。該系統作為反向遺傳學疫苗發展一種替代平台之效用，由以一獨立帶有H3N2之HA及NA基因之質體簡單替換H5N1者而呈現(圖5C及5E)。結果之四H5N1-VLP細胞株再度共表現HA及NA，這次為H5及N1品種。四維羅細胞株中分別生成推定H3N2-及H5N1-VLPs之兩種亞型，已經構築及驗證。製造其他流感VLPs之維羅細胞表現系統亦可利用先前揭露之類似方法構築及驗證。

維羅細胞製得流感VLPs之微載體及純化

為擴大VLP生產細胞之培養，加入60g微載體(HyClone)及細胞(約2×10⁸ )至3L旋轉式培養瓶(BellcoGlass com.,Vineland,NJ)，以約35rpm伴隨一懸垂玻璃珠攪拌，及培養於基本成分添加10%胎牛血清之培養基，置於含5%二氧化碳之37℃加濕恆溫培養箱。培養七日後，細胞已貼附於膠原塗佈之微載體表面且生長至細胞整面覆蓋。為使VLP由細胞表現及分泌，移除細胞培養基並置換為包含1μg/mL之Dox之無血清培養基(SFM4MegaVir,HyClone)，以開始誘導。

經Dox誘導72小時後，收成VLP生產細胞之條件培養基，以0.45μm Stericap過濾，以Vivaflow 50(Sartorius Stedim Biotech,Göttingen,Germany)濃縮，分層至30%蔗糖-TNE(10mM Tris-HCl,pH 7.4,100mM NaCl,1mM EDTA)填料。隨後以Beckman SW28轉子(Beckman Coulter,Fullerton,CA)112,600×g於4℃離心兩小時，結果之沉澱物於TNE緩衝液重新懸浮，並進一步依20-30-60%蔗糖梯度(112,600×g於4℃離心兩小時)純化。最後，收集帶狀VLPs，以TNE緩衝液透析過夜，並儲存於-80℃。為分析純化VLPs之蛋白質成分，將以Quant-iT Protein Assay Kit(Invitrogen)定量之樣本與Lämmle SDS-PAGE sample buffer混合，煮沸5分鐘，以 7.5-17.5%梯度膠體分出。

哺乳動物維羅細胞系統以穩定共表現四病毒蛋白：M1、M2、HA及NA，成功製造臨床規模之流感VLPs。通常情況下，於純化後，3L-規模微載體系統之試驗性產量為平均1.2mg/L培養基之流感VLPs。每次接種3L-培養可達10⁹ 細胞且可被誘導以持續表達VLPs三次。

實例5 維羅細胞製得流感VLPs之特性

純化H3N2 VLPs及H5N1VLPs之型態與抗原呈現

純化之維羅細胞製得流感VLPs以免疫金電子顯微鏡進行實驗。將1μg以之蔗糖梯度純化之流感VLPs吸附於弗姆瓦/碳塗佈鎳網(Electron Microscopy Sciences,Fort Washington,PA)。以TBS緩衝液(50mM Tris-HCl,pH 7.5,150mM NaCl)清洗兩分鐘後，樣本以含1% BSA之TBS阻斷一小時。初級抗體(10μg/mL)以1% BSA/TBS稀釋且於室溫吸附至網一小時。隨後以TBS清洗三次，以次級接合金抗體於室溫處理一小時。以TBS清洗網兩次，以1%戊二醛固定，以水清洗且以2%醋酸鈾醯負染30秒。哺乳動物VLPs染色圖像利用Hitachi H-7000穿透式電子顯微鏡擷取。

經2%醋酸鈾醯負染，以TEM觀察自轉染細胞培養基純化出之哺乳動物VLPs的形態，相較於繁衍於維羅細胞中之相應病毒(圖6A及6B)。

流感VLPs一般而言呈現球形及密集核染色。VLPs表面之刺狀隆起與真實流感病毒所呈現者同。VLPs表面之HA及NA醣蛋白以單獨專一性抗體及接合至二級抗體之金球做免疫金標記(圖6C及6D)。

動態光散射(DLS)測量流感VLPs平均顆粒大小

為完成TEM形態分析，藉由DLS分析來估量原生溶液中分泌出之VLPs之平均大小。為做有效的疫苗，已有人提出，顆粒大小範圍在20至200nm者可有助於引流自由抗原至淋巴結並誘發樹狀細胞(DC)強烈反應，達成長期保護目的。以 雷射為基礎的DLS可監測溶液中奈米粒子之布朗運動改變，提供顆粒之平均大小及頻率分布相關的資訊。

將流感VLPs之儲備原液稀釋至0.1μg/mL於pH 7.4之20mM磷酸鹽緩衝液中，通過0.45μm濾器，並在Nano ZS顆粒大小分析器上分析(Malvern Zetasizer,Malvern Instruments Ltd,UK)。根據操作指令，對於每個由DLS分析之樣本，一個樣本做連續兩次測量，並以光散射數據採集時間60秒來測量。使用附帶的軟體(Nanov510)來轉換以強度為基礎的測量為大小分布，其基於每個大小群組中顆粒的數量，並以一個顯示樣本頻率分佈之曲線圖表來呈現，其中在曲線下之區域與相關尺寸範圍內偵測到的VLPs數目成比例。隨後計算VLPs的平均直徑，做為三個獨立的實驗的VLP族群大小平均數±標準差(SD)。

如圖7所示，DLS顯示，於25℃，H3N2 VLPs及H5N1 VLPs之平均直徑分別為108.2±17.9nm及125.6±10.5nm。VLPs的大小相若於其相應的病毒大小，例如，H3N2病毒及H5N1病毒之平均直徑分別為133.5±15.4nm及104.1±12.4nm。兩個VLPs亞型的大小分佈的範圍從70-200nm(95%CI)，這表明由維羅細胞生產的流感VLPs對DC吸收而言是在較佳尺寸範圍內，而有希望能激發強大免疫反應(圖7)。DLS將會是一個有益的方法來監測VLPs批次間的一致性，其藉由快速提供整個顆粒族群之資訊。綜上，DLS和TEM測量流感VLPs是一致的，顯示由維羅細胞製造之VLPs之大小和形態係與真實流感病毒相若。

鑑定流感VLP組成及VLP相關的細胞蛋白質

為了驗證哺乳動物表達VLPs之蛋白質成分，將10μg H3N2和H5N1-VLPs以7.5%-17.5%梯度凝膠分離，並在不同的實驗以考馬斯藍染色(圖8A和8C)或以專一性抗病毒蛋白質之抗體做探測(圖8B和8D)。除了HA、NA、M1和M2之病毒蛋白質，在流感VLPs內亦觀察廣譜的次要帶，相似於 在真實病毒中者(圖8A和8C)。

為了確定這些VLPs之基本蛋白質概況，將比較明顯的蛋白質帶(圖中箭頭指示，圖8A和8C)從凝膠中切除，進行凝膠內胰蛋白酶消化，並以液相色譜串聯質譜(LC/MS/MS)分析。簡言之，1-D凝膠之蛋白質條帶從凝膠手動切除並切成小塊(約0.5mm³ )。以含50%甲醇溶液和5%醋酸之溶液在微離心管中洗滌凝膠2-3小時，以25mM NH₄ HCO₃ 之50%乙腈溶液洗滌兩次，一次10分鐘，然後在真空離心機中乾燥。在DTT減少和碘乙酰胺烷化後，加入含於25μ L 25mM之NH₄ HCO₃ 中75ng經測序級修飾胰蛋白酶之溶液(Promega Corporation,Madison,Wis.)並乾凝膠片段於37℃培養12-16小時。經過消化，在渦流中以含5%甲酸之50%乙腈萃取胰蛋白酶肽兩次，每次15分鐘。匯集所萃取的溶液並在真空狀態下蒸發至乾。重新溶解乾燥後的沉澱物於10~20μ L 0.1%甲酸中以進行如下所述的LC/MS/MS分析。在連接至配備了PicoView奈米噴霧介面(New Objective,Woburn,Mass.)之LTQ-Orbitrap XL混合質譜儀(Thermo Electron,Bremen,Germany)的nanoAcquity系統(Waters,Milford,Mass.)上進行NanoLC-nanoESi-MS/MS分析。肽混合物被裝到一個75μm ID,25cm長之C18 BEH柱(Waters)，其以1.7μm孔徑130Å之顆粒填滿，並採用分段梯度由5%至50%溶劑B(乙腈與具0.1%甲酸)在流速為300mL/min分離該肽混合物90分鐘，且一柱溫度為35℃溶劑A為0.1%甲酸水。以數據依賴模式操作質譜儀。簡言之，在具解析度設在60,000m/z 400及自動獲得控制(AGC)目標為160之軌道阱中(M/Z350-1600)獲得調查全掃描質譜。10個最強的離子相繼被分離，在線性離子阱(AGC目標為7000)做CID MS/MS分段和偵測，動態排除先前選定的離子90秒。具單一和/或無法識別荷電狀態之離子也被排除。

以Bioworks3.3.1處理MS和MS/MS原始數據，並對內 部生成的蛋白質NCBI數據庫進行搜索，使用Mascot Daemon 2.2服務器。搜索條件中使用了胰蛋白酶消化、可變修飾如脲甲基(C)和氧化(M)、可允許多達2個遺漏之差異(missed cleavage)、質量精度為母離子10ppm及碎片離子0.60Da。

透過對NCBI數據庫檢索，VLP的主要成分如表1和2所示。結果發現，除了如表1所示之預期位置外，哺乳動物VLPs之HA和NA蛋白質分佈在多個凝膠片中。這可能反映了，他們是VLPs中最豐富的蛋白質並形成HA和NA蛋白質低聚物(圖8B和8D)。

此外，另有22 VLP相關的細胞蛋白質被鑑定出，其係與那些常見於流感病毒粒子內部或外部之細胞蛋白質具相同或類似功能[16]。其中大部分可分為功能群體，包括細胞骨架蛋白質、細胞外基質(ECM)蛋白質、熱休克蛋白質、膜聯蛋白、四次穿膜蛋白和糖酵解酶。

除了這些在病毒粒子和VLPs中已鑑定出的常見蛋白質，有幾個獨特的細胞蛋白質(如表2)也在流感VLPs中鑑定出，其在LC/MS/MS分析中具有非常高的Mascot評分。這些蛋白質可能參與了VLPs的生物合成。

就真正的病毒而言，一些細胞蛋白質對病毒粒子之添補作用或衣殼化可能是一個支持其完成生命週期的關鍵行為，即藉由與病毒蛋白質或RNA之專一性相互作用。然而，在這種情況下，哺乳動物流感VLP具有病毒成分(藉由轉染)及細胞蛋白質(由添補作用)，而無包含的任何病毒遺傳物質。在流感VLPs中被鑑定出之細胞蛋白質可能積極參與正常病毒的生命週期，特別是在病毒組裝和從宿主細胞出芽期間。

為了表現哺乳動物VLPs上HA突刺的功能，進行血球凝集檢測(圖8E)。VLP之製備與0.75%豚鼠紅細胞反應有有明顯的血球凝集活動，在含3.5μg之VLPs樣本中，滴定度就H3N2-VLPs為2⁷ 、就H5N1-VLPs為2⁶ 。相同量之H3N2和H5N1病毒VLPs具有HA活性相似的滴定度(2⁷ )。這個結果表明，涵蓋哺乳動物VLPs整個表面的HA突刺與真正活性病毒的方向和功能相同。

通常，本研究中，H5N1和H3N2-VLPs的兩個獨立的LC/MS/MS分析及西方墨點法結果類似於經報導之流感病毒蛋白組[16]，這表明流感VLPs的之組裝與真正病毒組裝和離開有許多相似性。綜言之，這些數據證實，哺乳動物表達之VLPs的流感非常相似於真正病毒，其具有用於進一步疫苗發 展相當的優勢。

確認與流感VLPs有關且併入的細胞蛋白質

在鑑定被併入之細胞蛋白質之蛋白質組後，數個病毒和相關的細胞蛋白質被進一步用西方墨點及免疫金標記來表現。為排除下列可能性，即鑑定出之蛋白質可能是由於非專一性的污染，如隨VLPs一起被純化出的微泡或外吐小體，將哺乳動物流感VLP之製備物進行一蛋白酶保護法分析，其已被證明能夠有效地從HIV-1病毒粒子製備物去除微泡[17,18]。

將相當於50μg蛋白質之純化H5N1-VLPs與或不與20μg MSG-胰蛋白酶(G-Biosciences,St.Louis,Mo.)培養在37℃、20mM Tris-HCl,pH 8.0及1mM CaCl₂ 中18小時。在經胰蛋白酶培養後，經處理和未經處理的VLPs製備物被以含有30μ M PMSF(Sigma,St.Louis,Mo.)分別稀釋至7mL，並由超速離心(200,000 XG，2小時4℃，Beckman SW41Ti轉子)通過20%蔗糖緩衝液為墊層(sucrose cushion)濃縮，再以抗HA、NA、M1、M2、β -肌動蛋白、微管蛋白、膜聯蛋白A2和網格蛋白之抗體做西方墨點分析(圖9A)。

在胰蛋白酶消化後，VLPs喪失HA和NA兩種蛋白質，證明這些蛋白質位於膜殼之外，整合並附著在VLP表面。大部分一起被純化出之污染物被蛋白酶消化掉。然而，一些預期在病毒粒子內部的代表性細胞蛋白質，如肌動蛋白、微管蛋白和膜聯蛋白A2仍然被發現存在於經蛋白酶消化的VLPs，這表明這些細胞蛋白質明確地納入VLPs的結構中(圖9A)。

相較之下，一個在這項研究中發現之獨特細胞蛋白質，網格蛋白重鏈，在經蛋白酶處理後喪失，該蛋白質是網格蛋白包覆膜孔之重要組成部分，其中介了許多受體、離子通道、運輸子和其他跨膜蛋白質以及各種水溶性大分子和病毒的內吞作用(圖9A)[19,20]。這一發現提出了兩種可能：第一，網格蛋白是與污染物，而不是VLPs相連，或第二，網格蛋白確實是併入VLPs的，但如HA和NA暴露在表面上。為解決這個 問題，使用免疫金標記來尋找完好、未消化的VLPs之表面上網格蛋白的存在(圖9B)。此實驗的確顯示了在表面完好的VLPs上有染出網格蛋白，如同HA和NA(圖6C和6D)。這個新穎發現，即網格蛋白，一個內吞作用調節蛋白質，是專門與分泌流感VLPs相連的，可牽涉到VLP生物合成路徑和後期的病毒組裝和出芽。

分泌出之VLPs之蛋白質組分析及蛋白酶保護檢測顯示，22個與真實H1N1病毒有關的細胞蛋白質亦特定地併入哺乳動物H3N2和H5N1 VLPs(表1和圖8)。這些蛋白質中，微管蛋白、肌動蛋白、膜聯蛋白、烯醇酶、GAPDH，γ-麩胺醯轉化酶，和HSP27透過先前研究中蛋白質組分析已被證明是來自脂筏[39,40,41,42,43]。流感病毒正確的組裝和出芽需要多個病毒蛋白與雙層脂質和基因組RNA以及宿主蛋白質之質的合作活動[44,45]。在VLP系統，除了牽涉到病毒RNA和衣殼蛋白質之相互作用，與病毒粒子釋放之相關活動被認為是重合於真實病毒組裝和釋放。大量在哺乳動物流感VLPs中被鑑定出的蛋白質闡明了其等在流感病毒粒子感染過程的組裝/出芽階段之重要角色。VLP蛋白質組和病毒細胞蛋白質內含物之間的相似性也表明了，哺乳動物VLPs之出芽行為及成分與真實病毒非常相似，因此，從哺乳動物細胞為基礎的系統表達之VLPs，其並構成一個具除了基因組內容外非常相似的性質之非致病性假病毒粒子，這最有可能成為一種很有前途的候選疫苗。

流感VLPs的醣基化分析

病毒表面抗原的醣基化作用在免疫識別、受體結合、炎症和致病性是至關重要的，因此對疫苗抗原療效具有重大影響[21,22]。例如，由於雞蛋適應造成的病毒HA之胺基酸取代和隨之而來的改變醣基化作用，此常見的現象嚴重影響了流感病毒抗原性[23]。如HA之N-聚醣足跡分析法所證明者，使用不同的細胞系用來複製相同的病毒，導致在HA上有不同的N -糖基化模式，其可以歸結為宿主介導的HA胺基酸序列和潛在的醣基化位點的改變，進一步影響了所製造之的病毒抗原特性[24,25,26]。因此，對VLPs中HA和NA抗原的醣基化狀態進行評估，以尋找任何會影響以VLP為基礎的疫苗之抗原性和免疫反應的改變。

進行流感VLPs中蛋白質之去醣基化檢測。藉由在0.5%SDS和40mM DTT存在下在100℃加熱10分鐘，將相當於10μg蛋白質之經純化流感VLPs變性。接下來，添加PNGase F或Endo-H(New England Biolabs,Ipswich,Mass.)及不同的反應緩衝液至混合物中並在37℃作用1小時，接著進行蛋白質凝膠電泳和隨後的西方墨點分析。

將來自維羅細胞之N-醣基化模式的H3N2和H5N1-VLPs與真實病毒之多醣狀態相較，透過以N-內切糖苷酶PNGase F和Endo-H進行去醣基化作用檢測。PNGase F可以自如複合、雜合、高高甘露糖型之醣蛋白質清除所有類型的N-連接寡醣，而Endo-H從N-連接醣蛋白質切割高甘露醣和雜合寡醣之殼糖雙糖核心。如圖10A所示，純化H5N1-VLP中大部分修飾後的HA和NA(標記為HA 1**+NA**及HA2**)在去醣基化前，在SDS-PAGE凝膠顯示兩個主要帶(道1)；其顯然的分子質量分別約為56和30kDa(圖10B和10C，道1)。在以PNGase F對H5N1-VLPs處理後，HAL HA2，和NA帶增加了他們的流動性至分子質量分別為40、27和52kDa(圖10A，10B，和10C，道2)，這表明了，兩種主要病毒表面抗原主要是被N-連接寡糖糖基化的。值得注意的是，在圖10C NA中某個標記為(Π)者，其流動性在與兩種酶反應後並沒有改變，表明NA可能有其他類型的翻譯後修飾。當以Endo-H處理H5N1-VLP之醣基化HA，去醣基化作用的反應只是局部的，因此可同時在圖10B第6道看到HA1和HA2原本的蛋白質帶和經Endo-H消化之殘帶，標記為(#)。不過，在維羅細胞中繁衍的H5N1病毒 之HA是抗Endo-H消化的，此表明多醣鏈接到病毒HA是複合型(圖10B，第8道)。H5N1-VLPs之HA對Endo-H的局部靈敏度可能是混合聚醣鏈的結果，其起因於壓倒性的大量蛋白質的表現因此醣基化不完全。然而，由於絕大多數的NA可被Endo-H去醣基化，H5N1-VLP之NA蛋白質擁有的高甘露糖可能比擁有的複合多醣更多(圖10C，第4道)。與此同時，對H3N2-VLPs進行去糖基化作用分析(圖10D)。在H3醣蛋白質，Endo-H處理減少分子質量16kDa和PNGase F處理減少25kDa，這表明H3聚醣池中擁有的高甘露糖或雜合型比擁有的複合型更多(圖10D)。

結果指出，對相同的宿主感染，從維羅細胞產生VLPs有類似於真實病毒的醣基化狀態。綜言之，從維羅細胞製成的VLPs在粒子的大小、形態、蛋白質組成，及醣基化狀態皆像真正的病毒，因此提供了極大的潛力做為安全有效的流感疫苗的抗原。

實例6 病毒之傳播、血凝及血清學試驗

流感病毒，A/Taiwan/083/2006和H5N1(NIBRG-14)株(National Institute for Biological Standards and Control,Potters Bar,U.K.)在Vero(為做VLP比較)或MDCK細胞(為做病毒刺激)中繁衍。為了評估血球凝集，將3.5μg的VLPs或病毒及其連續2倍稀釋液與0.75%豚鼠紅細胞懸浮液在96孔板中混合。將該板培養1小時並以肉眼評估血球凝集。具血球凝集之最高稀釋VLPs或病毒被定義為1HA單位。

為了評估血球凝集抑制(HI)滴定度，以受體破壞酶處理血清並進行熱滅活(30分鐘，56℃)，以2倍稀釋測試，其開始於1：10稀釋，接著與8HA單位H5N1-VLP混合並培養在室溫。經過1小時，添加0.75%豚鼠紅細胞懸浮液並在2小時後以肉眼評估血球凝集。最高稀釋之HI滴定度表現顯示50%的血球凝集抑制。所有樣本都進行了三次測試，。

在4℃將ELISA盤(Nunc)塗覆以指定的H5醣蛋白質、 VLPs或病毒整夜，並用含1%酪蛋白之PBS阻斷(Blocker Casein,Pierce,Rockford,Ill.)。接著將ELISA盤與指定稀釋度的血清樣本培養37℃ 1小時，以HRP-共軛二級抗體追踪，並以TMB基質顯色(Pierce)。在ELISA每一步驟間用PBST洗五次。最後，以一微盤讀取儀(Power Wave XS,Bio-Teck)在吸收波長為450nm讀取ELISA(A₄₅₀ )並繪製結果。

實例7 疫苗接種與病毒刺激

雌性BALB/c小鼠(6週齡)購自國家實驗動物中心，隨機分配接受兩劑間隔21天之疫苗。0.3μg、1.5μg、2.5μg或10μg之H5N1-VLPs之疫苗依序包含0.054μg、0.27μg、0.45μg或1.8μg之醣蛋白質，且使全病毒疫苗在雞胚胎生長，以福馬林滅活並在2.5μg或10μg的劑量應用。以肌肉注射疫苗或PBS(做為模擬控制)到四頭肌。經後眼窩竇採集小鼠血液，轉移到含有血清分離劑和凝血活化劑之管中，並使其在室溫下凝固。在離心後血清被除去，並存放-80℃。以具有致命劑量之重組H5N1病毒，NIBRG-14，刺激經免疫小鼠(100倍致50%小鼠死的劑量)，如先前所進行者[48]。在刺激後，每天監測小鼠共14天之存活和發病率(即體重減輕、不活動和體溫)。所有的動物實驗皆受中央研究院動物護理和使用委員會的評估和批准。

VLPs之體液免疫反應

為了研究這種疫苗對哺乳動物表達VLPs的影響，在無佐劑下對小鼠接種VLPs。對接種疫苗的老鼠進行抗體反應和抗病毒感染之保護的分析。以純化的H5N1-VLP或H5N1-假型疫苗株滅活全病毒(以反向遺傳學做H5N1重組工程)對小鼠(BALB/C，N=12)分別肌肉注射接種兩次(第0天和第21天)，兩個抗原劑量(2.5μg和10μg)。在實驗前(第-1天)和免疫接種後(第14天及35天)採集血樣以分析體液免疫反應(圖11A)。以ELISA檢測血清之流感病毒專一性抗體對抗 桿狀病毒產生之H5醣蛋白質，或哺乳動物表現H5N1-VLP和H3N2-VLP(圖11B)。接種H5N1-VLP之小鼠表現出強勁的IgG抗體反應對抗H5蛋白質和H5N1-VLP。兩個抗原劑量對H5蛋白質和H5N1-VLP的ELISA滴定度均均高於1：200,000，相比之下其對H3N2-VLP滴定度是微不足道的(<1：25 000)。這表明，H5N1-VLP具高度免疫原性可刺激高度專一性抗體對抗H5抗原表位。全病毒疫苗刺激ELISA滴定度近似1：100,000，而而高度免疫原性之H5-專一性滴定度遠低於VLP疫苗(圖11B)。然而，當全病毒被用作ELISA抗原時，VLP疫苗組ELISA滴定度降低到全病毒疫苗組的水平(圖11C)。這表明H5N1-VLP之免疫性是更有效的且對H5醣蛋白質更具專一性，它可能在VLPs中比在病毒中引起較高的HA含量。VLP誘導抗體對抗VLP和病毒之所有蛋白質的特異性被進一步以西方墨點法偵測。確實，IgG抗體僅偵測VLP和病毒中HA1和HA2片段的H5醣蛋白質對應信號(圖11D)。在這個實驗中，缺乏信號偵測其他宿主和病毒蛋白質表明了VLP如同滅活分裂病毒及亞單位疫苗同樣「乾淨」，僅對HA醣蛋白質有免疫原性。

接種疫苗引起的IgG抗體同型分布表示其為T細胞免疫反應類型，因為抗原專一性輔助性T細胞之亞群透過分泌不同的細胞素調節生產不同的IgG同型。小鼠之IgG1同型被認為是Th2反應信號，而IgG2a同型表明更多是Th1反應。進一步使用ELISA來測量抗原專一性抗體對VLP和全病毒疫苗之反應的類別及IgG同型。如圖所示，VLP誘導之抗體主要是IgG1同型，IgG2a則少很多，IgG2b和IgA極低或測不到(圖11E，左)。然而，由全病毒疫苗誘導的抗體主要是IgG2a，IgG1較少，和不明顯的IgG2b和IgA。這些結果表明，哺乳動物VLP疫苗在兩個抗原劑量誘發主要是Th2反應，而全病毒疫苗刺激了Th1/Th2混合反應，在較高的抗原劑量Th1較明顯。

疫苗誘導之血球凝集抑制(HI)活性和抗病毒感染保護

HI分析是就流感免疫力最被廣泛接受的血清學檢測且是疫苗接種後HA-專一性抗體功能之黃金標準衡量。在美國目前使用來核准大流行疫苗的血清學標準是基於在年齡小於65歲之成人中具血清轉化(即在HI滴定度最少4倍高)率>40%及血清保護(即HI滴定度>1：40)率70%之季節性流感疫苗。評估各候選疫苗誘發之抗體之抑制VLP誘導之豚鼠紅細胞凝集作用的能力(圖11E)。在第二劑後(第35天)，血清保護HI滴定度在83.3%小鼠被誘發，其接受2.5μg和10μg VLP疫苗，HI滴定度均值達到約1：60。當VLP疫苗抗原劑量下降至0.3μg和1.5μg，互反血清保護率下降到12.5%和25%。在平行實驗中，血清保護率相應整個病毒疫苗為75%和87.5%。

所有接種VLP疫苗、全病毒疫苗或模擬控制之小鼠，被以預定的致死劑量H5N1-假型重組病毒滴鼻刺激，以評估每個候選疫苗的防護效果。所有接受2.5μg和10μgVLP疫苗的小鼠在病毒刺激後存活下來，相較下，模擬控制組老鼠在感染後7天之內全部死亡(圖12A)。較低劑量(0.3μg和1.5μg)的VLP疫苗確實影響生存率(分別為50%和25%)，這與較低的血清保護率一致。此外，全病毒疫苗(2.5μg和10μg)對病毒刺激具保護性，除了一隻2.5μg劑量組之小鼠減輕了>30%體重(圖12B)。試驗小鼠的體重和溫度變化表示有疾病，而以高劑量VLP和全病毒疫苗接種之小鼠在刺激13天後恢復了原來的體重，其結果與生存結果一致。然而，以低劑量VLP接種之小鼠具有更明顯的體重減輕及溫度的降低，儘管一些倖存者在稍後時間恢復。

作為使用於人類和動物的新的流感疫苗之由哺乳動物表達系統產生之VLP的功效，第一次在本研究中被證實。例如，已證實，在BALB/c小鼠使用兩劑療法以劑量低至2.5μg VLP(0.45μg HA)接種哺乳動物表達的VLPs提供充分保護對抗致命的同源菌株刺激感染。

完整的哺乳動物VLP疫苗保護與功能性抗體反應具良好的相關性(HI檢測)，其為可被接受的大流行疫苗的許可標準。整合在哺乳動物表達VLP的眾多細胞蛋白質的存在可能有自身免疫之疑慮。結果表明，宿主VLP蛋白質內含物與真實病毒的品種和數量類似。

維羅和維羅E6細胞系是目前被監管當局認為是最廣泛接受的細胞基質，其產生大範圍的病毒用以製造人類使用的疫苗，包括流感、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、天花、水泡性口炎病毒、單純皰疹病毒和羅塔病毒等。此外，在文件「WHO以反向遺傳學發展之流感疫苗參考病毒之指導手冊」中，維羅細胞是唯一被推薦來透過反向遺傳學製備疫苗生產用病毒。出於這個原因，我們選擇了維羅和維羅E6細胞系，而不是任何其他人類或非人類哺乳動物細胞系產生的VLPs。事實上，我們的研究證明，在無佐劑配方下以VLP疫苗接種小鼠引起高滴定度抗體，其只抗HA而不抗其他蛋白質(圖11)。通過肌肉注射免疫以兩劑2.5μg和10μg的VLP疫苗接種的老鼠完美地存活下來，而且全部在致命病毒刺激後存活。在整個56天的實驗、病毒刺激前後，皆無發現不良影響。值得的注意，由哺乳動物表達VLPs引起的體液免疫反應不同於從桿狀病毒衍生的VLPs，此暗示了兩種形式VLPs之間有不同。可能歸因於醣基化狀態、宿主蛋白質內含物、呈現抗原的整體顆粒結構，或別的東西。

熟習本技藝者當瞭解針對上述具體實施例可於不偏離本發明寬廣之發明概念下進行改變化。應瞭解本發明並不限於所揭示之特定具體實施例，旨在涵蓋如所附申請專利範圍所定義本發明之精神及範圍內。

上述發明內容及實施方式與所附圖式一併閱讀將更增瞭解本發明。為闡明本發明之目的，圖式中所示具體實施例為目 前較佳者。然而，應瞭解本發明並不限於所示之確切配置及方法。

在圖式中：圖1包含圖1A及1B。圖1A包含建構螢光SARS-VLP表現質體之圖解。圖1B包含螢光影像，顯示所表現之VLP之位置。圖1A係將兩個受四環素操縱子調節且由CMV啟動子驅動之表現匣建構於同一質體中，俾供一個表現匣中之M-GFP融合蛋白(亦即與綠色螢光蛋白(GFP)融合之M蛋白)及E蛋白，及另一表現匣中之S蛋白之可誘發性表現。圖1B顯示螢光SARS-VLPs在維羅E6/S-MG-E-55生產細胞株中之表現及組裝，其中細胞的誘發係添加1μg/ml強力黴素(Dox)至培養基經一天，固定，然後以特別針對M、GFP、S及E蛋白之抗體(如標示)作間接染色。掃描經染色細胞中來自GFP之綠色螢光並重疊之，以觀察生產細胞中VLP所含各種蛋白質之共同局部化現象。

圖2包含圖2A至2D，顯示維羅E6分泌之SARS-VLPs之純化及定性結果。圖2A係以蔗糖梯度超離心純化分泌之VLPs。如標示般繪出各級分中蛋白質濃度(以Bradford分析測量)及GFP螢光之圖表。圖2B係以SDS-PAGE及考馬西藍染色分析各級分中所含蛋白質。圖2C係使用抗S、M、E或GFP蛋白之抗體，以西方墨點分析確認圖2B中標示之蛋白質條帶之身分。圖2D係經負染色之SARS-VLPs(圖2B之級分9至15)之電子顯微鏡影像，該等SARS-VLPs係以蔗糖梯度由細胞培養基中純化而得(條狀物表示50nm之尺度)。

圖3包含圖3A至3E，顯示SARS-VLPs免疫於小鼠中誘發體液免疫反應之結果。圖3A係免疫程序之示意圖，如標示般於兩個時間點對每組四隻小鼠皮下注射不同劑量之SARS-VLPs。以ELISA檢查系列稀釋後之血清樣本，俾瞭解受試小鼠中之VLP-專一性抗體反應。圖3B顯示之圖表係關於VLP-專一性IgG、IgG1及IgG2a之ELISA滴定量，使用 SARS-VLP作為捕捉抗原。於初次免疫後第28天收集血清樣本。X-軸標示受試樣本之稀釋度。扣除背景之吸收度(450nm)係以平均值±標準差(誤差條)作圖。所示數據為三次不同實驗結果之總和。圖3C之圖表係關於VLP-專一性IgG抗體與真實SARS-CoV之交叉反應。於PBS中稀釋圖3B中所示之抗血清(1：250)。以商業SARS ELISA測試套組(Euroimmun)，依據製造商之程序說明偵測SARS-VLP疫苗接種所誘發之SARS-專一性抗體滴定量，唯一修飾在於以抗-小鼠IgG取代抗-人類IgG二級抗體。總結各組免疫小鼠中之平均滴定量及標準差並以平均值±標準差作圖。圖3D之圖表係關於VLP所誘發之抗體反應之時程。於所指示之時間點收集經免疫小鼠之血清樣本。於PBS中稀釋抗血清(1：250)，並如圖3B般以ELISA分析測量VLP-專一性IgG。圖3E係關於VLP所誘發之抗體之抗原決定位。裝載三種劑量(100、10、1ng)之經純化VLP作為西方墨點抗原。於PBS中稀釋圖3B中所示之抗血清(1：1000)並從事西方墨點分析。

圖4包含圖4A及4B，係關於SARS-VLPs免疫於小鼠中所誘發之細胞免疫反應。脾細胞係得自如圖3B所示初次免疫後28天之受試小鼠，將其初代培養物以SARS-VLP重新刺激40小時。以ELISPOT分析測定分泌干擾素-γ(圖4A)及介白素-4(圖4B)之有反應細胞。所示數據為三次不同實驗結果之總和以平均值±標準差(誤差條)表示。

圖5圖解了維羅細胞中流感類病毒顆粒(VLPs)之建構及細胞表現：圖5A係流感類病毒顆粒之哺乳類動物表現載體之簡圖，其表明了各種基因組成的排列，包括CMV組成啟動子、四環黴素抑制基因(TetR)、多聚腺苷酸化信號(PA)、CMV多西環素(Dox)可誘導啟動子(CMV-TO)、嵌合內含子(In)、腦心肌炎病毒核醣體內起始位(IRES)，以及流感蛋白質之編碼序列(M1及M2、基質1及2；HA，紅血球凝集 素；NA，神經氨酸苷酶)；圖5B及5C顯示被選擇之四個VLP生產細胞中之病毒基因表現，其中M1、M2、H3、H5及N1之表現由西方墨點分析法偵測出：從不具(-)或具(+)Dox誘導之VLP生產維羅細胞萃取全部細胞裂解液，以SDS-PAGE分離細胞裂解液中之蛋白質，接著在西方墨點分析法中分別以抗HA、NA、M1及M2之專一性抗體探測，HA、NA、M1及M2之分子質量被表明在右方；以RT-PCR偵測不具(-)或具(+)Dox誘導之N2表現(顯示於圖5B中)；及圖5D及5E顯示活體內VLP生產維羅細胞中之表現病毒蛋白質之免疫螢光染色，如標註，以抗HA及NA(紅色)之抗體染色並以DAPI(藍色)對比染色。

圖6顯示由維羅細胞產生之經純化流感VLPs之形態及抗原存在決定：圖6A及6B係TEM下之經純化之分泌出之流感VLPs：以蔗糖濃度差超速離心純化分泌出之VLPs，並以2%醋酸鈾醯負染，接著用100,000倍放大之TEM觀察；各別病毒株亦顯示於VLPs下方；及圖6C及6D係自免疫金電子顯微鏡分析所得之下之經純化之分泌出之流感VLPs：所使用之一級抗體標示於各圖下；二級抗體係共軛接至12nm金珠上之山羊抗兔抗體，線條表示100nm。

圖7A-D分別圖解了以動態光散射(DLS)測量溶液中H3N2 VLPs、H3N2病毒、H5N1 VLPs及H5N1病毒之平均顆粒大小及分布：於25℃，H3N2 VLPs及H5N1 VLPs在磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中之平均顆粒直徑分別為108.2±17.9nm(A)及125.6±10.5nm(C)；於25℃，H3N2病毒及H5N1病毒在磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中之平均顆粒直徑分別為133.5±15.4nm(B)及104.1±12.4nm(D)；二不同批之VLPs或病毒之代表性決定以紅線與綠線表示；VLP族群之大小分布範圍從 70至200nm，具95%信賴區間(CI)。

圖8顯示經純化之由維羅細胞產生之流感VLPs之特徵：圖8A及8C顯示以SDS-PAGE分析之H3N2 VLPs及H5N1 VLPs分別相較於H3N2病毒及H5N1病毒之圖：VLPs或病毒之總蛋白質被溶解於7.5-17.5%梯度凝膠之SDS-PAGE並以考馬斯藍染色；將膠上之每個相關染色帶，以箭號與數字標出，進行LC/MS/MS分析以鑑定其組成；將經鑑定之VLPs病毒蛋白染色帶以括號標記；蛋白質標記之分子質量註記在右側；圖8B及8D顯示以西方墨點分析之H3N2 VLPs中及H5N1 VLPs中之病毒蛋白質，分別相較於H3N2病毒及H5N1病毒之圖：在如圖8A及8C圖中描述之SDS-PAGE之後，以專一性抗體做為標記進行西方墨點法：以Chemigenius 2(SYNGENE,Frederick,Md.)及GeneTools(3.07版)軟體定量之HA與NA之相對豐度，就H3N2 VLPs為4：1、就H5N1-VLPs為3：2；HA蛋白質分別佔H3N2 VLPs或H5N1 VLPs中總蛋白質之12.8%或18%；及圖8E以血球凝集分析演示了HA功能之評估：圖中標出以兩倍連續稀釋之所使用之VLPs或病毒量；血球凝集分析中亦包括THE(VLPs之緩衝液)及PBS做為負控制組。

圖9A顯示H5N1 VLPs中病毒蛋白質(左)及維羅細胞蛋白質(右)之西方墨點分析圖：經純化之VLPs經模擬處理(mock-treated)(Untr.，第1道)或經胰蛋白酶分解整夜(Prot.，第2道)，接著以20%蔗糖緩衝液為墊層(sucrose cushion)進行純化；2.5μg之每個經純化之VLPs進一步以SDS-PAGE分析，接著進行西方墨點分析，使用抗所指出之蛋白質之抗體，包括HA、NA、M1、M2、β -肌動蛋白、微管蛋白、膜聯蛋白A2及網格蛋白；分子量標記於左側；及圖9B顯示經純化之H5N1 VLPs表面上網格蛋白之免疫金標記：將從條件培養液中純化之分泌出之VLPs以抗網格蛋白 之抗體做免疫金標記，以2%醋酸鈾醯負染，並以電子顯微鏡觀察(放大100,000X)；線條代表100nm。

圖10顯示由維羅細胞產生之流感VLPs中HA及NA之醣基化分析：將經模擬處理(mock-treated)及去醣基化酶處理之H5N1-VLPs之蛋白質以SDS-PAGE分離，以考馬斯藍染色(A)，並進一步使用抗H5(B)及N1(C)抗體以西方墨點法分析；H5N1病毒之蛋白質亦以使用抗H5(B)抗體以西方墨點法分析；經模擬處理及去醣基化酶處理之H3N2-VLPs或H3N2病毒之蛋白質亦以使用抗H3(D)抗體以西方墨點法分析；分子標記註記於左側；PNGase F及Endo-H之位置被指出；被醣基化之HA1、HA2、NA及H3分別以HA1**、HA2**、NA**及H3**標記；#代表經醣基化之蛋白質，其含有對PNGase F敏感、但不對Endo-H敏感之複合型多醣體之殘基團；Π代表H5N1-VLPs之NA上的未知轉譯後修飾。

圖11圖解了製自維羅細胞之流感VLPs的體液免疫反應：圖11A顯示了初免(prime)及加強免疫(boost)接種策略及隨後的病毒刺激：IM0、IM1及IM2分別代表蒐集自免疫前、初免14天後及加強免疫的小鼠血清；圖11B顯示在接種H5N1-VLP或未活化之整個病毒(IWV)後，以ELISA分析在IM2時，取自各小鼠組之抗原專一性IgG抗體對抗H3N2-VLP、H5蛋白質(表現之重組桿狀病毒)及H5N1-VLP(與免疫抗原同)之不同抗原：對各小鼠組(n=8-12)進行劑量2.5μg及10μg之VLPs或IWV之肌內免疫，如標示；在ELISA分析中所使用血清樣本之稀釋溶液註記在上側；H3N2-VLPs含有所有與VLP抗原一體之宿主細胞蛋白質，除了做為負控制組的HA及NA不同子型外，同時由桿狀病毒產生之H5蛋白質做為正控制組；所使用之包被抗原係等量的，如註明者；圖11C顯示了由H5N1-VLPs或IWV疫苗誘發之抗H5N1 病毒之血清IgG抗體的ELISA結果；圖11D顯示由H5N1-VLP(左圖)或IWV(右圖)疫苗誘發之小鼠血清IgG抗體的西方墨點分析結果：所使用之抗原及各別量標記在圖上方；圖11E顯示使用H5N1-VLP做為ELISA抗原分析而由VLPs及IWV疫苗誘發之專一性IgG同型及IgA；及圖11F顯示各接種之小鼠的HI滴定度及同組平均值之描圖：HI滴定度40為血清保護之閾值。

圖12A-D顯示抗H5N1病毒之致死劑量刺激之疫苗保護：於第42天，以肌內注射致死劑量(100 LD₅₀ )之重組H5N1(NIBRG-14)病毒至已接種小鼠，並每日監測重量之減輕及死亡數；紀錄存活率百分比及體重之改變及溫度：(A)H5N1-VLP組之存活率；(B)IWV組之存活率，體重喪失超過30%之小鼠被安樂死；(C)H5N1-VLP組之體重及溫度；就接受0.3μg及1.5μg劑量抗原之組，僅顯示存活小鼠之數據；及(D)IWV組之體重及溫度。

<110>　中央研究院

<120>　產生類病毒微粒之高產率轉殖基因哺乳動物表現系統

<130>　682781-11U1

<150>　US 11/515,843

<151>　2006-09-05

<160>　17

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　3484

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　表現卡匣

<400>　1

<210>　2

<211>　4837

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　表現卡匣

<400>　2

<210>　3

<211>　221

<212>　PRT

<213>　急性嚴重呼吸道症候群冠狀病毒(SARS coronavirus Urbani)

<400>　3

<210>　4

<211>　76

<212>　PRT

<213>　急性嚴重呼吸道症候群冠狀病毒(SARS coronavirus Urbani)

<400>　4

<210>　5

<211>　1255

<212>　PRT

<213>　急性嚴重呼吸道症候群冠狀病毒TW1(SARS coronavirus TW1)

<400>　5

<210>　6

<211>　252

<212>　PRT

<213>　A型流感/台灣/083/2006

<400>　6

<210>　7

<211>　97

<212>　PRT

<213>　A型流感/台灣/083/2006

<400>　7

<210>　8

<211>　566

<212>　PRT

<213>　A型流感/台灣/083/2006

<400>　8

<210>　9

<211>　469

<212>　PRT

<213>　A型流感/台灣/083/2006

<400>　9

<210>　10

<211>　567

<212>　PRT

<213>　A型流感/河內/30408/2005(H5N1)

<400>　10

<210>　11

<211>　449

<212>　PRT

<213>　A型流感/河內/30408/2005(H5N1)

<400>　11

<210>　12

<211>　2920

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　CMV-TO-內插子-M1編碼序列-IRES-M2編碼序列-polyA

<400>　12

<210>　13

<211>　2246

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　CMV啟動子-兔beta-球蛋白　內插子II-Tet R編碼序列-SV40 polyA

<400>　13

<210>　14

<211>　5646

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　編碼流感H3及N2的DNA序列，包括5'及3'表現控制區域

<400>　14

<210>　15

<211>　5598

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　編碼流感H5及N1的DNA序列，包括5'及3'表現控制區域

<400>　15

<210>　16

<211>　26

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　RT-PCR引子

<400>　16

<210>　17

<211>　28

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　RT-PCR引子

<400>　17

Claims (18)

1. 一種用以製備與真實流感病毒粒子高度相似的流感類病毒顆粒(VLP)之方法，該方法包含：取得基礎維羅(Vero)細胞，其係經編碼流感M1之序列及編碼流感M2之序列穩定轉染；建構至少一種重組DNA分子，其包含編碼流感紅血球凝集素(HA)之序列及編碼流感神經氨酸苷酶(NA)之序列；將該至少一種重組DNA分子導入至該基礎維羅細胞，以取得共表現維羅細胞，其係經編碼流感M1、流感M2之序列穩定轉染，以及經進一步編碼流感HA及流感NA之序列轉染，其中該等流感M1、M2、HA及NA蛋白質於該共表現維羅細胞之表現係由一或多種可誘發性表現系統所調控；於條件下培養該共表現維羅細胞，該條件容許該流感M1、該流感M2、該流感HA及該流感NA之表現，以及包含該流感M1、該流感M2、該流感HA及該流感NA之VLP之組合；及將該VLP由該共表現維羅細胞培養之上清液分離出來。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該基礎維羅細胞係衍生自維羅E6細胞。
3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該流感HA及該流感NA係衍生自一或多種潛在流行性或季節性流感病毒株。
4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一種重組DNA分子進一步包含編碼第二流感HA之序列及編碼第二流感NA之序列，其中該流感HA與該第二流感HA係衍生自不同的流感病毒株，及該流感NA與該第二流感NA係衍生自不同的流感病毒株；該共表現維羅細胞進一步經該編碼第二流感HA及第二流感NA之序列轉染；及該培養步驟容許該流感M1、該流感M2、該流感HA、該流感NA、該第二流感HA、及該第二流感NA之表現，以及包含該 流感M1、該流感M2、該流感HA及該第二流感HA之至少一種、該流感NA與該第二流感NA之至少一種之VLP之組合。
5. 一種用以製備與真實流感病毒粒子高度相似的流感類病毒顆粒(VLP)之方法，該方法包含：取得共表現維羅細胞，其係經編碼流感M1之序列、編碼流感M2之序列穩定轉染，以及經進一步編碼流感紅血球凝集素HA之序列及編碼流感神經氨酸苷酶NA之序列轉染，其中該等流感M1、M2、HA及NA蛋白質於該共表現維羅細胞之表現係由一或多種可誘發性表現系統所調控；及於條件下培養該共表現維羅細胞，該條件容許該流感M1、該流感M2、該流感HA及該流感NA之表現，以及包含該流感M1、該流感M2、該流感HA及該流感NA之VLP之組合；及將該VLP由該共表現維羅細胞培養之上清液分離出來。
6. 一種用以製備與真實流感病毒粒子高度相似的流感類病毒顆粒(VLP)之方法，該方法包含：(1)建構第一質體及第二質體，該第一質體包含CMV啟動子序列、四環素抑制子基因及編碼M1及M2流感病毒結構性蛋白質之核苷酸序列，該第二質體包含CMV啟動子序列及編碼HA及NA流感病毒表面之抗原醣蛋白之核苷酸序列；(2)將該第一質體轉染至維羅(Vero)細胞以產生基礎細胞，其表現四環素抑制因子，接著將第二質體轉染至基礎細胞，以產生具第一質體及第二質體且可共表達M1、M2、HA及NA之維羅細胞；(3)培養該可共表達M1、M2、HA及NA之維羅細胞，添加四環黴素(doxycycline)，誘導M1、M2、HA及NA之共表達以產生該流感VLP。
7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中M1係具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列、M2係具有SEQ ID NO：7之核苷酸序列、HA係具有SEQ ID NO：8之核苷酸序列及NA係具有SEQ ID NO：9之核苷酸序列。
8. 如申請專利範圍第6項之方法，其中M1係具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列、M2係具有SEQ ID NO：7之核苷酸序列、HA係具有SEQ ID NO：10之核苷酸序列及NA係具有SEQ ID NO：11之核苷酸序列。
9. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該流感VLP為H3N2 VLP或H5N1 VLP。
10. 一種與真實流感病毒粒子高度相似的流感類病毒顆粒(VLP)，包含：流感M1、流感M2、流感紅血球凝集素(HA)及流感神經氨酸苷酶(NA)，其中該等流感蛋白係由維羅細胞重組表現；及至少一種維羅細胞之細胞蛋白，其中該流感VLP係由申請專利範圍第1-9項中任一項之方法所製備而得。
11. 如申請專利範圍第10項之流感VLP，其中該維羅細胞為維羅E6細胞。
12. 如申請專利範圍第10項之流感VLP，其中該流感HA及流感NA係衍生自一或多種潛在流行性或季節型流感病毒株。
13. 如申請專利範圍第10項之流感VLP，進一步包含第二流感HA及第二流感NA，其中該流感HA與該第二流感HA係衍生自不同的流感病毒株，以及該流感NA與該第二流感NA係衍生自不同的流感病毒株。
14. 如申請專利範圍第10項之流感VLP，其分別包含流感A/台灣/083/2006之M1及M2，及流感A/台灣/083/2006之H3及N2，或流感A/河內/30408/2005(H5N1)之H5及N1。
15. 如申請專利範圍第10項之流感VLP，其中該至少一種細胞蛋白係選自由籠形蛋白重鏈1、紅細胞膜內蛋白β、叢狀蛋白B2、CD109同源物、前列腺素F2受體負調節物、Na+/Ka+腺核苷三磷酸水解酶α1、腫瘤排斥抗原(gp96)1及浮艦蛋白I所組 成之群組。
16. 一種免疫組合物，其包含免疫上有效量之申請專利範圍第10至15項中任一項之流感VLP以及藥學上可接受之賦形劑。
17. 如申請專利範圍第16項之免疫組合物，其進一步包含佐劑。
18. 一種在體外診斷個體受流感病毒感染之方法，該方法包含：使取得自該個體之生物樣本在體外與申請專利範圍第10項之流感VLP接觸，其中該流感VLP包含由流感病毒衍生之HA及NA；及測量該生物樣本中與該流感VLP組成抗體抗原複合體之抗體之含量，其中高於抗體之閾值含量者表示該個體曾被該流感病毒感染或是接受過類似病毒株之免疫接種。