RU2420535C2 - Модифицированный вирус гриппа, предназначенный для мониторинга и повышения эффективности вакцины - Google Patents
Модифицированный вирус гриппа, предназначенный для мониторинга и повышения эффективности вакцины Download PDFInfo
- Publication number
- RU2420535C2 RU2420535C2 RU2008107875/10A RU2008107875A RU2420535C2 RU 2420535 C2 RU2420535 C2 RU 2420535C2 RU 2008107875/10 A RU2008107875/10 A RU 2008107875/10A RU 2008107875 A RU2008107875 A RU 2008107875A RU 2420535 C2 RU2420535 C2 RU 2420535C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- influenza
- molecule
- amino acid
- recombinant
- Prior art date
Links
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims abstract description 110
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title abstract description 52
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 title description 5
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims abstract description 270
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims abstract description 270
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims abstract description 270
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims abstract description 270
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims abstract description 267
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 186
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 88
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 55
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims abstract description 46
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 34
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims abstract description 33
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims abstract description 33
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 61
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims description 29
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 26
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 19
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 18
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 claims description 13
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 10
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 10
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 7
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 claims description 6
- 229940033324 influenza A vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 241000856131 recombinant Influenza A viruses Species 0.000 claims 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 abstract description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 21
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 18
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 78
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 60
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 52
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 51
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 49
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 49
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 45
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 35
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 29
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 29
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 29
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 29
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 28
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 27
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 23
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 18
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 16
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 15
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 14
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 12
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 11
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 9
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 8
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 7
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 101000984442 Sorghum bicolor Phosphoenolpyruvate carboxylase 3 Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108010061514 sialic acid receptor Proteins 0.000 description 5
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 4
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 4
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 4
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 4
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 4
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 102100027518 1,25-dihydroxyvitamin D(3) 24-hydroxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- 101000849787 Brucella melitensis biotype 1 (strain 16M / ATCC 23456 / NCTC 10094) Ribosome-recycling factor Proteins 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000861278 Homo sapiens 1,25-dihydroxyvitamin D(3) 24-hydroxylase, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 3
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 2
- 241000713297 Influenza C virus Species 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- -1 asparagine amino acid Chemical class 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009365 direct transmission Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 108010028403 hemagglutinin esterase Proteins 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 208000037799 influenza C Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N (4R)-4-[[(2S,3R)-2-[acetyl-[(3R,4R,5S,6R)-3-amino-4-[(1R)-1-carboxyethoxy]-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-amino-5-oxopentanoic acid Chemical compound C(C)(=O)N([C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](CCC(=O)O)C(N)=O)C1[C@H](N)[C@@H](O[C@@H](C(=O)O)C)[C@H](O)[C@H](O1)CO YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N 0.000 description 1
- 101150002210 34 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000539677 Berant virus Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101000909256 Caldicellulosiruptor bescii (strain ATCC BAA-1888 / DSM 6725 / Z-1320) DNA polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010010755 Conjunctivitis viral Diseases 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108700015872 N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108700020354 N-acetylmuramyl-threonyl-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 101150076840 PolI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 101000902592 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101710146873 Receptor-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108091034135 Vault RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 208000005914 Viral Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000059 abdominal discomfort Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N almurtide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CO[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 208000003836 bluetongue Diseases 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000009400 out breeding Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000001055 reflectance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 229960000172 trivalent influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описано, что иммуногенность молекулы гемагглютинина (НА) вируса гриппа можно повышать путем замен аминокислот в последовательности НА. Замена конкретных остатков в НА, такая как интродукция аспарагина в положение 223 в НА Н5, позволяет повышать чувствительность реакции торможения гемагглютинации (HI) в результате изменения рецепторной специфичности и/или способности к связыванию антитело-антиген. Молекулы НА, имеющие такие замены, могут найти применение при разработке диагностических эталонных вирусов и улучшенных противогриппозных вакцин. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 7 табл.
Description
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США No.60/705808, зарегистрированной 4 августа 2005 г, которая во всей полноте включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Заявление, касающееся исследования или разработки, субсидировавшихся за счет федеральных средств
Исследование, в результате которого было создано настоящее изобретение, проводилось в рамках гранта AI95357 Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (National Institute of Allergy and Infectious Disease) и при поддержке Центра раковых исследований (Cancer Center Support (CORE)) в рамках гранта СА21765 Национальных институтов здравоохранения (National Institutes of Health). В соответствии с этим правительство США обладает определенными правами на изобретение.
Ссылка на приложение, записанное на компактном диске
Не применимо.
Область техники, к которой относится изобретение
В целом настоящее изобретение относится к повышению антигенности и/или иммуногенности определенных подтипов группы вирусов гриппа.
Предпосылки создания изобретения
Вирусы гриппа
Вирусы гриппа, среди которых, прежде всего, следует отметить конкретные штаммы вирусов А и В, являются серьезной причиной заболеваемости и смертности во всем мире в результате ежегодных вспышек заболевания. Периодически, но с нерегулярными интервалами возникают пандемии, приводящие к особенно высоким уровням заболеваемости и смертности. Исторически пандемии явились результатом возникновения новых подтипов вируса гриппа А, которые образовались путем перегруппировки сегментированного генома (антигенная изменчивость), в то время как ежегодные эпидемии, как правило, являются результатом эволюции поверхностных антигенов вируса гриппа А и В (антигенный дрейф). Вирусы гриппа человека часто происходят от птичьих штаммов вируса гриппа, так что в основе заражения гриппом лежит зооноз. Очевидно также, что свиньи могут служить в качестве промежуточного хозяина («смешивающиеся сосуды») при образовании новых происходящих от птиц штаммов, которые являются патогенными для человека (Scholtissek и др. Virology, 147, 1985, с.287). Вспышка заболевания в Гонконге в 1997 г., вызванного штаммом H5N1 вируса гриппа А, показала, что обладающие высокой патогенностью вирусы гриппа А могут передаваться также непосредственно от различных видов птиц человеку (Claas и др., Lancet, 351, 1998, с.472; Suarez и др., J.Virol., 72, 1998, с.6678; Subbarao и др. Science, 279, 1998, с.393; Shortridge, Vaccine, 17 (прил. 1), 1999, сс. 26-29). В 2003 г. штаммы вирусов H5N1 в Юго-Восточной Азии представляли собой различные сосуществующие генотипы, но в 2004 г. доминантным стал один генотип, известный как «Z-генотип» (Li и др. Nature, 430, 2004, с.209). Современные данные свидетельствуют о том, что случаи смерти людей были обусловлены непосредственной передачей этого генотипа от птиц человеку и что этот генотип заражает также кошек путем непосредственной передачи от кошки к кошке (Kuiken и др., Science 2004, 306:241). Это и другие доказательства изменения диапазона хозяев и широкое распространение этого вируса привело к пониманию того, что H5N1-вирусы могут приобретать свойства, позволяющие осуществлять перенос от человека к человеку. Люди не могут приобретать иммунитет к таким H5N1-вирусам, что может вызвать катастрофическую пандемию гриппа (Fouchier и др., Nature, 435, 2005, с.419). Способность вирусов гриппа А образовывать новые патогенные штаммы из огромного количества штаммов, циркулирующих в животных-носителях возбудителей вирусной инфекции, означает, что борьба с этим заболеванием требует осуществления мониторинга этих вирусов и разработки улучшенных противовирусных терапий и вакцин. Скорость, с которой развиваются новые штаммы вируса, требует особого внимания при осуществлении такого мониторинга, включая применение усовершенствованных методов оценки эффективности вакцин против новых штаммов.
Вирусы гриппа А, В и С семейства Orthomyxoviridae, все имеют сегментированный геном с негативной цепочкой РНК, который реплицируется в ядре инфицированной клетки, имеет суммарную кодирующую емкость, составляющую примерно 13 т.п.н., и содержит генетическую информацию для десяти вирусных белков. Конкретно вирусы гриппа имеют восемь генных сегментов антисмысловой РНК (nsPHK), которые кодируют по меньшей мере 10 полипептидов, включая белки РНК-полимеразы (РВ2, РВ1 и РА), мишенью которых является РНК, нуклеопротеин (NP), нейраминидазу (NA), гемагглутинин (НА, который после ферментативного расщепления образует ассоциацию субъединиц НА1 и НА2), матриксные белки (M1 и М2) и неструктурные белки (NS1 и NS2) (Krug и др., в: The Influenza Viruses, под ред. R.M. Krug, изд-во Plenum Press, New York, 1989, сс. 89-152).
Разработанные в последнее время обратные генетические системы должны дать возможность осуществлять манипуляции с геномом вируса гриппа (Palese и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1996, с.11354; Neumann и Kawaoka, Adv. Influenza Res., 53, 1999, с.265; Neumann и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1999, с.9345; Fodor и др., J. Virol., 73, 1999, с.9679). Было продемонстрировано, например, что экспрессия восьми nsPHK, осуществляемая плазмидой под контролем промотора pol I, и коэкспрессия белков полимеразного комплекса приводит к образованию инфекционного вируса гриппа A (Hoffmann и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 2000, с.6108).
Вирусная частица вируса гриппа имеет размер примерно 125 нм и состоит из ядра, включающего антисмысловую вирусную РНК, ассоциированную с ядерным белком, которое окружено вирусной оболочкой, имеющей двухслойную липидную структуру. Внутренний слой вирусной оболочки состоит преимущественно из матриксных белков, а наружный слой состоит в основном из липидного материала, происходящего из хозяина. Так называемые «поверхностные белки», нейраминидаза (NA) и гемагглютинин (НА) выступают в виде пиков на поверхности тела вируса. Инфективность новых вирусов гриппа зависит от расщепления НА специфическими протеазами хозяина, в то время как NA участвует в отделении вирионов-потомков от клеточной поверхности и предупреждает агглютинацию нового образовавшегося вируса.
Белки НА и NA, погруженные в вирусную оболочку, представляют собой основные антигенные детерминанты вируса гриппа (Air и др., Structure, Function, and Genetics, 6, 1989, сс.341-356; Wharton и др. в: The Influenza Viruses, под ред. R.M.Krug, изд-во Plenum Press, New York, 1989, сс.153-174). Благодаря перегруппировке сегментированного генома вируса гриппа постоянно образуются новые варианты НА и NA, в отношении которых у только что зараженного организма не вырабатывается анамнестическая реакция (вторичный иммунный ответ). Гликопротеин НА представляет собой основной антиген для нейтрализующих антител и он участвует в связывании вирусных частиц с рецепторами на клетках-хозяевах.
Последовательности молекул НА из различных штаммов вируса обладают значительным сходством, как на уровне нуклеиновых кислот, так и на уровне аминокислот. Степень сходства варьируется, когда сравнивают штаммы разных подтипов, при этом для некоторых штаммов характерны более высокие степени сходства, чем для других (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, с.7643). Степени сходства аминокислот варьируются между вирусными штаммами одного подтипа и вирусными штаммами других подтипов (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, с.7643). Эта вариация достаточна для установления отдельных подтипов и направления эволюционной дифференцировки различных штаммов, однако можно довольно легко осуществлять сравнительный анализ первичной структуры ДНК и аминокислотных последовательностей различных штаммов с помощью обычных биоинформационных методов (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, сс.7643; Suzuki и Nei, Mol. Biol. Evol., 19, 2002, с.501).
Противогриппозные вакцины
Противогриппозные вакцины, разрешенные в настоящее время органами здравоохранения для применения в Соединенных Штатах и Европе, представляют собой инактивированные противогриппозные вакцины, а также живую ослабленную вакцину FLUMIST, применяемую в Соединенных Штатах. Вирусы, являющиеся представителями важных в эпидемиологическом отношении штаммов вируса гриппа А и вируса гриппа В, выращивают в оплодотворенных куриных яйцеклетках, и затем вирусные частицы очищают и инактивируют с помощью химических средств для получения биомассы вакцины. Каждый год ВОЗ отбирает подтипы, которые по прогнозу должны встречаться с наибольшей вероятностью, для создания вакцин.
Хотя противогриппозные вакцины применяют для вакцинации человека с начала 1940-х годов и для вакцинации свиней с конца 1960-х годов, существование многочисленных животных-носителей возбудителей вирусной инфекции в сочетании с угрозой возникновения нового вируса гриппа, способного вызвать пандемию, заставляет проводить исследования с целью разработки новых терапевтических методов борьбы с вирусом. За последние несколько лет в области борьбы с гриппом был достигнут ряд важных успехов (см. обзор Сох и Subbarao, Lancet, 354, 1999, сс.1277-1282). Например, было экспериментально установлено, что интраназальное введение живой ослабленной трехвалентной противогриппозной вакцины может обладать высокой эффективностью в отношении защиты детей младшего возраста от штамма вируса гриппа A H3N2 и вируса гриппа В. Другие подходы к повышению эффективности существующих (убитых) вакцин на основе вируса гриппа включают создание адаптированных для защиты от простуды и сконструированных генетическим путем вирусов гриппа, которые содержат ослабляющие мутации (см. обзор у Palese и др., J. Infect. Dis., 176 прил. 1, 1997. сс.45-49). Существует надежда, что такие измененные генетическим путем вирусы, в которые путем перегруппировки были интродуцированы гены НА и NA из циркулирующих штаммов, можно применять в качестве безопасных живых вакцин на основе вируса гриппа для индукции пролонгированного защитного иммунного ответа у человека. Хотя, по-видимому, адаптированные для защиты от простуды вакцины являются эффективными для детей и подростков, их можно ослаблять в достаточной степени для стимулирования идеального иммунного ответа у пожилых людей, которые представляют собой основную группу из числа 20000-40000 индивидуумов, умирающих каждый год в США в результате заражения гриппом.
Легко доступные вакцины должны стать наиболее эффективным инструментом для борьбы с неожиданно возникающей пандемией гриппа. После вспышки H5N1 в Гонконге в 1997 г. на людях были испытаны вакцины, получаемые с помощью двух различных подходов. Обычная вакцина на основе субъединицы (подтипа) Н5, полученной из A/duck/Singapore/3/97, обладала слабой иммуногенностью для человека даже против близкородственных по антигенным свойствам штаммов и даже после нескольких вакцинаций (Nicholson и др., Lancet, 357, 2001, с.1937; Stephenson и др., Journal of Infectious Disease, 191, 2005, с.1210). Применение адъюванта MF59 повышало титр антител к указанной вакцине на основе Н5 (Stephenson и др., Vaccine, 21, 2003, с.1687). Вакцинация с использованием инактивированной «расщепленной» вакцины, полученной на основе непатогенного вируса A/duck/HK/836/80 (H3N1) и модифицированного гемагглютинина Н5 из вируса А/НК/156/97 (H5N1), индуцировала слабо обнаруживаемые титры нейтрализующих антител (Takada и др. Journal of Virology, 73, 1999, с.8303). Таким образом, хотя указанные вакцины на основе H5N1 хорошо переносились, оказалось, что они обладали слабой иммуногенностью. Существующий в настоящее время недостаток эффективных вакцин против штаммов вируса H5N1 повышает угрозу того, что эти вирусы могут вызвать пандемическое заболевание.
Иммуногенность противогриппозной вакцины
Методы определения титров антител в сыворотке являются суррогатными методами оценки иммунной защиты после вакцинации или вирусной инфекции. В качестве методов определения титров антител в сыворотке преимущественно применяют анализы титров вирус-нейтрализующих антител и анализы титров с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI). Эти анализы основаны на способности антител к вирусу гриппа из человеческой сыворотки вступать в перекрестную реакцию с антигенами в условиях in vitro. Методы анализа для конкретной ситуации выбирают не только на основе их способности давать непротиворечивые и применимые результаты, но также и на основе простоты их применения и требований к оборудованию, необходимому для осуществления каждого типа анализа.
В целом анализ на основе нейтрализации вирусов заключается в том, что оценивают способность антител из образца сыворотки блокировать заражение культивируемых клеток вирусом гриппа. Это анализ осуществляют путем приготовления серийных разведений (титров) образца сыворотки и объединения каждого из этих разведений со стандартным количеством инфекционного вируса. Затем каждую смесь, полученную с использованием этих разведений, вносят в определенную культуру клеток и анализируют полученные коэффициенты заражения. Считается, что анализ титров вируснейтрализующих антител является чрезвычайно ценным и надежным тестом для оценки уровня иммунозащитных антител, присутствующих в организме конкретного индивидуума. Однако он зависит от характеристик специализированной культуры клеток и поэтому не является полностью универсальным. Кроме того, методология является очень трудоемкой и требует большого количества времени, вследствие чего она плохо приспособлена для скрининга большого количества образцов.
При анализе с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI) также оценивают способность антител из образца сыворотки связываться со стандартизованным эталонным вирусом. Этот анализ основан на том факте, что вирусы гриппа должны связываться с эритроцитами и вызывать их агглютинацию. В HI-анализе серийные разведения образца сыворотки смешивают со стандартными количествами эталонного вируса и после ряда инкубации добавляют к эритроцитам. После этого визуально выявляют приводящую к образованию комплексов ассоциацию между эталонными вирусами и эритроцитами. Наибольшее разведение сыворотки, которое ингибирует гемагглютинацию, принимают за титр ингибирования гемагглютинации. Хотя HI-анализ не обладает такой же чувствительностью в отношении иммуногенности вакцины, как другие анализы, он находит широкое применение благодаря относительно простой технологии и невысоким требованиям к лабораторному оборудованию.
Принимая во внимание указанные выше ограничения существующих в настоящее время методов, пригодных для разработки и оценки противогриппозных вакцин, существует необходимость в усовершенствовании методов оценки иммуногенности для определения иммунного ответа после заражения, а также эффективности вакцины.
Краткое изложение сущности изобретения
В настоящем изобретении предложены аминокислотные замены в молекуле гемагглютинина (НА) вируса гриппа А, которые могут изменять антигенность и иммуногенность НА. Эти замены могут приводить к изменению областей детерминанты путем изменения специфичности рецептора и/или связывания антитело-антиген. В различных вариантах осуществления изобретения повышенную антигенность, обусловленную заменой, можно использовать для повышения чувствительности анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI) в образцах сыворотки, взятых у зараженных животных. Такая информация важна для создания предназначенных для диагностики эталонных вирусов и новых противогриппозных вакцин. Предпочтительно аминокислотная замена приводит к образованию молекул, которые обладают иммуногенными характеристиками, свойственными аминокислотной замене на аспарагин в положении 223 в НА Н5-подтипа.
Таким образом, определенные объекты настоящего изобретения относятся к молекуле гемагглютинина (НА) вируса гриппа, имеющей одну или несколько аминокислотных замен в рецепторном сайте связывания, что усиливает антигенность молекулы НА в отношении антител, обладающих специфичностью к молекуле НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в ее рецепторном сайте связывания. Молекула НА с повышенной антигенностью вируса гриппа может содержать аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, при этом включение аспарагина приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, которое инфицировано вирусом гриппа, несущим молекулу НА дикого типа. Повышенная антигенность молекулы НА вируса гриппа может быть обусловлена присутствием аминокислоты аспарагина в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, где молекула НА не выведена из изолята человеческого Н5 А/НК/213/03, и включение аспарагина в положение 223 приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная замена приводит к изменению сайта гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения вирус гриппа представляет собой вирус гриппа А человека. Вирус гриппа А человека может являться, например, представителем подтипа Н5. Вирус гриппа А человека может представлять собой вирус гриппа A/Vietnam/1203/04 (H5N1). В некоторых вариантах осуществления изобретения вирус гриппа представляет собой вирус гриппа В. Под объем изобретения подпадают молекулы НА вируса гриппа с повышенной антигенностью, полученные из вируса гриппа птиц.
Другие объекты изобретения относятся к рекомбинантному вирусу гриппа, имеющему молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая содержит одну или несколько аминокислотных замен в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецепторном сайте связывания. Рекомбинантный вирус гриппа может включать модифицированную молекулу НА, полученную из вируса гриппа H5N1, в генетическом окружении вируса гриппа А. Вирус гриппа А может представлять собой исходный вакцинный штамм гриппа. Рекомбинантный вирус гриппа можно использовать в качестве диагностического эталонного вируса в анализе с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI). Рекомбинантный вирус гриппа можно включать в набор для анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI).
Другие объекты изобретения относятся к обратным генетическим системам, предназначенным для получения вируса, содержащего молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецепторном сайте связывания.
Следующие объекты представленного в настоящем описании изобретения относятся к способам создания вируса, содержащего молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецептором сайте связывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что интродуцируют рекомбинантный вектор, который экспрессирует молекулу НА с повышенной антигенностью, в обратную генетическую систему.
Кроме того, родственными объектами изобретения являются способы определения эффективности вакцины на основе вируса гриппа для животных. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что антисыворотку, полученную из организма вакцинированного животного, подвергают взаимодействию с молекулой гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет одну или несколько аминокислотных замен в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в рецепторном сайте связывания, присутствующей в вакцине на основе вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулу НА с повышенной антигенностью получают из изолята А/НК/213/03 человеческого H5N1, и включение аспарагина в положение, которое соответствует положению 223 в НА из вируса H5N1, приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма вакцинированного животного. В некоторых вариантах осуществления изобретения животное представляет собой человека. В других вариантах осуществления изобретения животное представляет собой хорька.
Другими родственными объектами настоящего изобретения являются способы создания вируса гриппа, который содержит молекулу гемагглютинина (НА), заключающиеся в том, что культивируют с помощью обратного генетического процесса обратную генетическую систему, в которой кодирующая НА ДНК кодирует одну или несколько аминокислотных замен в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в рецептором сайте связывания.
Кроме того, изобретение относится к способам повышения чувствительности анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI), которые заключаются в том, что антисыворотку, полученную из организма вакцинированного или инфицированного животного, подвергают взаимодействию с молекулой гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет одну или несколько аминокислотных замен в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в рецепторном сайте связывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ повышения чувствительности HI-анализа приводит по меньшей мере к 2-кратному повышению чувствительности анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI), В некоторых вариантах осуществления изобретения способ повышения чувствительности HI-анализа приводит по меньшей мере к 4-кратному повышению чувствительности анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI).
Другим объектом изобретения являются способы определения того, инфицировано ли животное вирусом гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что антисыворотку, полученную из организма животного, подвергают взаимодействию с предназначенным для диагностики эталонным вирусом, который выведен из рассматриваемого вируса гриппа, но содержит молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецепторном сайте связывания, приводящую к повышению реактивности в отношении антисыворотки. В некоторых вариантах осуществления изобретения животное представляет собой человека. В других вариантах осуществления изобретения животное представляет собой хорька.
Следующими объектами изобретения являются другие способы определения того, инфицировано ли животное вирусом гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что антисыворотку, полученную из организма животного, подвергают взаимодействию с диагностическим эталонным вирусом, который выведен из рассматриваемого вируса гриппа, но содержит модифицированную молекулу НА вируса гриппа, которая имеет аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, при этом включение аспарагина приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа с молекулой НА дикого типа, что приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ определения того, инфицировано ли животное вирусом гриппа, заключается в том, что антисыворотку, полученную из организма животного, подвергают взаимодействию с диагностическим эталонным вирусом, который выведен из рассматриваемого вируса гриппа, но содержит модифицированную молекулу НА вируса гриппа, которая имеет аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, где молекула НА не происходит из изолята человеческого Н5 А/НК/213/03 и включение аспарагина в положение 223 приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения животное представляет собой человека. В других вариантах осуществления изобретения животное представляет собой хорька.
Под объем изобретения подпадают также предназначенные для получения вакцины вирусы гриппа, содержащие молекулу гемагглютинина (НА), имеющую аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецепторном сайте связывания, и где модификация приводит к повышению иммуногенности вакцинного вируса.
Одним из объектов настоящего изобретения являются выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, содержащую аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в ее рецепторном сайте связывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула НА вируса гриппа, кодируемая выделенной нуклеиновой кислотой, содержит аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, где молекула НА не выведена из изолята человеческого Н5 А/НК/213/03 и включение аспарагина в положение 223 приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, зараженного вирусом гриппа.
Кроме того, изобретение относится к способам получения нуклеиновых кислот, кодирующих молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая содержит аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в ее рецепторном сайте связывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что интродуцируют нуклеотидную последовательность в нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в рецепторном сайте связывания, что приводит к аминокислотной замене в последовательности молекулу НА, придающей молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствует аминокислотная замена.
Под объем настоящего изобретения подпадают эти и другие объекты изобретения, как это более подробно указано в разделах «Подробное описание изобретения» и «Примеры».
Описание чертежей
На чертежах показано:
На фиг.1 - график, иллюстрирующий HI-титры антител у хорьков, которым инокулировали вирусы гриппа H5N1, выделенные в 2003 г. и 2004 г. (A); HI-титры и титры вируснейтрализующих антител у хорьков, иммунизированных вирусами ΔН5М1/03 и ΔН5М1/04 (Б). Представленные на фиг.1А данные получены с использованием образцов сыворотки, взятых в день 28 после инокуляции 106 EID50 (средняя инфицирующая доза для куриного эмбриона) вирусов H5N1, которые титровали против 4 гемагглютинирующих единиц (HAU) гомологичного вируса. Данные представляют собой репрезентативные значения, полученные для 2 или 4 образцов сыворотки. Представленные на фиг.1Б данные получены с использованием образцов сыворотки, взятых из организма хорьков, вакцинированных дважды с использованием каждый раз по 7 мкг НА вирусов ΔH5N1/03 и ΔH5N1/04, которые титровали против 4 HAU и 100 TCID50 (средняя цитопатогенная доза) гомологичного вируса соответственно.
На фиг.2 - график, иллюстрирующий вирусные титры в назальных смывах, полученных у вакцинированных и контрольных хорьков после контрольного заражения вирусом A/Vietnam/I 203/04 (H5N1). Хорькам, вакцинированным рекомбинантными вирусами ΔH5N1/04 или ΔН5/04, интраназально инокулировали 106 EID50 вируса A/Vietnam/1203/04. Титры представляют собой средние значения (log10 EID50/0,1 мл) ± С.К.О., определенные для назальных смывов у 3 хорьков.
Следует отметить, что различия в величинах титров для вакцинированной и контрольной групп являются статистически достоверными и характеризуются значениями р, составляющими 0,0028 - 0,0173 согласно неспаренному t-критерию.
На фиг.3 - модель молекулы полипептида НА Н5, на которой показано положение аминокислоты (положения 154 и 223) в трехмерной (3D-) структуре НА вируса A/duck/Singapore/3/97 (H5N3). На фиг.3А указаны рецепторный сайт связывания аминокислот в 3D-структуре. На фиг.3Б кружок обозначает поверхность раздела между представленным мономером и двумя другими мономерами (не показаны) в трехмерной молекуле НА. Аминокислота в положении 223 находится в 220-петле рецепторного связывающего домена между остатком глутамина, который, как правило, присутствует в положении 222, и остатком глицина, который, как правило, присутствует в положении 224.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении предложены изменения в аминокислотной последовательности молекулы гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которые придают молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекул НА, в которых отсутствуют изменения. Такие изменения последовательности включают замены и делеции. Образовавшийся НА обозначают как «НА с повышенной антигенностью».
Молекулу НА с повышенной антигенностью можно применять для тестирования эффективности вакцины, поскольку изменение повышает чувствительность методов диагностики антител к вирусу гриппа в сыворотке. В конкретном варианте осуществления изобретения вирус представляет собой вирус гриппа А. В другом варианте осуществления изобретения вирус может представлять собой также вирус гриппа В, а еще в одном вариант осуществления изобретения он может представлять собой вирус гриппа С. В варианте осуществления изобретения, в котором вирус представляет собой вирус гриппа А, он может являться Н5-подтипом вируса гриппа А. В более конкретном варианте осуществления изобретения молекулу НА Н5-подтипа модифицируют с целью включения аминокислоты аспарагина в положение 223 (N223), что приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной от животного, инфицированного Н5-подтипом вируса гриппа. В конкретном варианте осуществления изобретения молекула НА, предлагаемая в изобретении, не представляет собой молекулу НА А/НК/213/03, которая относится к встречающемуся в естественных условиях Н5-подтипу, содержащему аспарагин в положении 223. Вирус гриппа может представлять собой вирус гриппа А человека Н5-подтипа, включая вирус A/Vietnam/1203/04 (H5N1).
Аминокислотные изменения, которые придают молекуле НА большую антигенность, можно осуществлять в рецепторном связывающем домене НА, например, как показано на фиг.3А, прежде всего в области 220-петли рецепторного связывающего домена. Такое изменение может уменьшать связывание НА с рецепторами сиаловой кислоты на эритроцитах, повышая тем самым способность антител к НА ингибировать гемагглютинацию, что приводит к усилению способности связываться с антителом в анализе с использованием реакции торможения гемагглютинации. В альтернативном варианте аминокислотное изменение, которое придает молекуле НА большую антигенность, можно осуществлять для того, чтобы изменить или удалить путем делеции сайт гликозилирования на белке НА, прежде всего сайт гликозилирования, который маскирует эпитопы на НА, распознаваемые специфическими в отношении НА антителами. Еще в одном варианте осуществления изобретения аминокислотное изменение можно осуществлять на аминокислотном остатке, соответствующем остатку 223 НА Н5-подтипа. Во всех вариантах осуществления изобретения аминокислотные модификации, которые придают молекуле НА большую антигенность, можно легко идентифицировать с помощью иммуноанализов с использованием антител, специфических в отношении конкретного подтипа НА. Модификация, которая придает молекуле НА большую антигенность, должна приводить к заметно более высокой связывающей активности в отношении титруемого антитела по сравнению со связывающей активностью в отношении молекулы НА, к которой вырабатываются антитела. К таким анализам относятся анализы с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI).
В конкретном варианте осуществления изобретения замена в молекуле НА Н5-подтипа остатка серина (который может представлять собой гликозилированный остаток) на аспарагин (который может быть либо негликозилированным, либо иметь другую схему гликозилирования) приводит к повышению антигенности. Однако другие замены также могут приводить к заметному повышению антигенности. Такие замены могут представлять собой консервативные замены, такие как замена треонина на серин или глутамина на аспарагин, но не обязательно консервативные замены. Они могут сохранять относительную полярность, например, замена аспарагина на серин или лизина на аспарагиновую кислоту, что сохраняет полярность, существовавшую до указанных изменений. Можно рассматривать также замену на такие остатки, как глицин и аланин, что приводит к устранению реактивной боковой цепи, не оказывая существенного влияния на структуру полипептида. И, наконец, можно осуществлять полностью неконсервативные изменения. И в этом случае с помощью простых иммуноанализов можно устанавливать, приводит ли конкретное изменение к повышению антигенности.
Некоторые H5N1-вирусы гриппа птиц, выделенные в Центральной и Южной Америке, несут основную аминокислоту аргинин в положении 223. Нейтральная аминокислота аспарагин обнаружена в положении 223 НА человеческого изолята А/НК/213/03. Этот аминокислотный остаток расположен в 220-петле рецепторного связывающего домена между остатком глутамина, как правило, присутствующим в положении 222, и остатком глицина, как правило, присутствующим в положении 224 (фиг.3). Экспериментальные данные позволяют предположить, что более высокие HI-титры отражают изменение специфичности рецептора. Фактически глутамин, как правило, присутствующий в положении 222, и глицин, как правило, присутствующий в положении 224, связываются непосредственно с рецептором сиаловой кислоты. Аминокислоты, присутствующие в 220-петле или смежные с ней, играют важную роль в конформации рецепторного связывающего кармана (На и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 2001, с.11181). Хотя в настоящем изобретении не утверждается какое-либо конкретное объяснение наблюдаемого эффекта, может оказаться возможным, что замена аспарагина на серин в положении 223 Н5 приводит к конформационным изменениям и изменяет специфичность рецептора.
Согласно следующему объекту изобретения молекулы НА, модифицированные в соответствии с изобретением с целью достижения большей антигенности, обладают также большей иммуногенностью. Такие молекулы в качестве компонента противогриппозной вакцины могут вызывать более сильный или эффективный иммунный ответ, что, в свою очередь, приводит к более эффективной защите от заражения гриппом.
Вирусы гриппа, источником которых являются птицы-носители возбудителей инфекции, имеют особое значения для общественного здравоохранения. Считается, что эти вирусы с наибольшей вероятностью способны вызывать вспышки пандемии гриппа в человеческой популяции. Поэтому молекула НА из птичьего подтипа с повышенной антигенностью и/или иммуногенностью может оказаться наиболее пригодной для применения в иммуноанализах, проводимых при разработке вакцины. Стратегию, проиллюстрированную в настоящем описании на примере Н5, можно применять для повышения титров в HI-анализе (ингибирование гемагглютинации) против других подтипов НА, что особенно важно для оценки иммунитета в отношении гриппа птиц. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулу НА, имеющую аминокислотные замены в рецепторном сайте связывания, можно получать из вируса гриппа птиц, включая подтипы от H1 до H16 включительно.
Одним из объектов настоящего изобретения является применение рекомбинантного вируса гриппа, содержащего молекулу НА с повышенной антигенностью, в качестве эталонного вируса в иммуноанализе, прежде всего HI-анализе, а также набор для осуществления такого анализа. Например, замена аминокислоты аспарагина в положении 223 в молекуле НА Н5 повышает связывание с рецепторами сиаловой кислоты эритроцитов (RBC), имеющими альфа-2,6-связь, такими, которые присутствуют в организме кур, но понижает связывание с рецепторами, имеющими N-гликозилсиаловую кислоту с альфа-2,3-связью, такими, которые присутствуют в организме лошади. Таким образом, один из объектов изобретения заключается в том, что в результате достигнутой пониженной способности к связыванию с рецепторами на лошадиных RBC должно требоваться меньшее количество антитела для ингибирования гемагглютинации. Этот принцип, заключающийся в интродукции аминокислотных замен, повышающих антигенность, что оценивают по связыванию с антителом, можно применять ко всем 16 подтипам НА, включая подтипы вирусов гриппа А птиц.
Под объем изобретения подпадают способы оценки эффективности вакцины на основе вируса гриппа для животного. Этот способ заключается в том, что антисыворотку, полученную из организма вакцинированного животного, подвергают взаимодействию с вирусом гриппа, содержащим молекулу гемагглютинина (НА) с повышенной антигенностью. В некоторых вариантах способа оценки эффективности вакцины на основе вируса гриппа для животных, как это продемонстрировано с помощью примеров, антисыворотку, полученную из организма вакцинированного животного, подвергают взаимодействию с молекулой НА Н5-подтипа вируса гриппа, содержащей аминокислоту аспарагин в положении 223 (N223), например, молекулой НА из изолята человеческого H5N1 А/НК/213/03. Присутствие аспарагина в положении 223 приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного другим Н5-подтипом вируса гриппа. Вакцинированное животное может относиться к любому из многочисленных видов животных, включая хорьков и человека.
Под объем настоящего изобретения подпадают также способы повышения чувствительности HI-анализа путем использования эталонного вируса, который содержит молекулу НА с повышенной антигенностью. В некоторых вариантах осуществления изобретения, таких, в которых молекула НА выведена из изолята штамма человеческого H5N1 А/НК/213/03, аминокислотная замена заключается в интродукции аспарагина в положение 223, что приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа Н5, имеющим другой аминокислотный остаток в этом положении, таким как A/Vietnam/1203/04. Такое повышение реактивности может достигать любого уровня, в том числе по меньшей мере 2-кратного или по меньшей мере 4-кратного повышения реактивности. 2-кратное или 4-кратное повышение чувствительности может оказаться особенно важным в ситуациях, когда конечные концентрации при использовании общепринятых методов титрования находятся ниже предела обнаружения.
Конкретным вариантом осуществления изобретения является также применение в качестве диагностического эталонного вируса рекомбинантного вируса гриппа, который содержит модифицированную молекулу НА Н5-подтипа, имеющую аминокислоту аспарагин в положении 223, что приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа Н5. В конкретном варианте осуществления изобретения молекула НА Н5 в диагностическом эталонном вирусе выведена из изолята штамма человеческого H5N1 А/НК/213/03. В другом варианте осуществления изобретения остаток аспарагина (или глутамата) заменен в положение 223 молекулы Н5 из другого штамма вируса гриппа. Очевидно, что такой же подход можно применять для любой молекулы НА из любого штамма вируса гриппа. В различных вариантах осуществления изобретения животное может представлять собой любое из многочисленных видов животных, включая хорьков и человека.
Помимо применения в качестве обладающих повышенной чувствительностью эталонных вирусов в клинических опытах по изучению вакцины для человека, эти вирусы можно применять в сероэпидемиологических исследованиях. Получение данных, показывающих как много людей заражены вирусами H5N1, с помощью быстрых и простых методов обнаружения, таких как HI-анализы, позволяет получать важную информацию о распространенности вирусов H5N1 среди людей. Эти данные можно использовать для оценки вероятности передачи вирусов H5N1 от человека к человеку или от различных видов птиц к человеку.
К другим объектам изобретения относятся способы определения того, инфицировано ли животное вирусом гриппа, заключающиеся в том, что антисыворотку, полученную из организма животного, подвергают взаимодействию с диагностическим эталонным вирусом. Диагностический эталонный вирус получают из того же штамма вируса гриппа, что и инфицирующий вирус, но эталонный вирус содержит молекулу НА с повышенной антигенностью. В одном из вариантов осуществления изобретения эталонный вирус содержит молекулу НА, имеющую остаток аспарагина в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, где включение остатка аспарагина приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа, содержащим молекулу НА дикого типа, что приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки. В другом варианте осуществления изобретения эталонный вирус содержит молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, имеющую аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, и где молекула Н5 не происходит из изолята человеческого Н5 А/НК/213/03 и включение остатка аспарагина в положение 223 приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа. В конкретном варианте осуществления изобретения инфицирующий вирус представляет собой вирус H5N1 и эталонный вирус представляет собой изолят человеческого H5N1 А/НК/213/03, который содержит остаток аспарагина в положении 223 аминокислотной последовательности, что приводит к повышению реактивности в отношении H5N1-специфической антисыворотки. В других вариантах осуществления изобретения животное может представлять собой любое из многочисленных видов животных, включая хорьков и человека.
Под объем изобретения подпадают также противогриппозные вакцины, содержащие молекулу НА с повышенной антигенностью. В конкретном варианте осуществления изобретения вирус представляет собой изолят человеческого H5N1. В более конкретном варианте осуществления изобретения НА получают из изолята А/НК/213/03. Еще в одном варианте осуществления изобретения НА представляет собой Н5, модифицированный путем включения аминокислоты аспарагина в положение 223.
Введение модификаций в молекулу НА требует осуществления манипуляций на генетическом уровне, как это хорошо известно в данной области и описано более подробно ниже. После создания модифицированного гена НА можно использовать ряд подходов, таких как обратные генетические методы, для интродукции модифицированной молекулы НА в вирус гриппа, в результате чего его можно применять в качестве эталонного вируса для тестирования эффективности вакцины или диагностического эталонного вируса для наблюдения за эпидемиями гриппа, включая передачу вируса от животного к человеку и передачу вируса от человека к человеку.
Некоторые объекты изобретения относятся к рекомбинантным вирусам гриппа, содержащим молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, имеющую по меньшей мере одно изменение в аминокислотной последовательности, которое придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствуют изменения. Изменения в аминокислотной последовательности могут включать замену или делецию одной или большего количества аминокислот. Модифицированную молекулу НА можно получать из вируса гриппа H5N1 в генетическом окружении вируса гриппа А. В некоторых вариантах осуществления изобретения вирус гриппа А представляет собой исходный вакцинный штамм вируса. Рекомбинантные вирусы, содержащие модифицированную молекулу НА, обладающую повышенной антигенностью в отношении антител, специфических в отношении молекул НА, в которых отсутствует изменение в аминокислотной последовательности, можно применять в качестве диагностического эталонного вируса в анализе с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI). Рекомбинантный вирус можно также включать в состав набора для анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI).
Другие объекты изобретения относятся к способам создания вируса, содержащего молекулу гемагглютинина (НА). Например, одним из объектов изобретения является способ создания вируса, содержащего молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет по меньшей мере одно изменение в аминокислотной последовательности, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекул НА, в которых отсутствуют изменения. Способ может заключаться в интродукции рекомбинантного вектора, экспрессирующего модифицированный НА в обратной генетической системе. Способ создания вируса гриппа, содержащего молекулу гемагглютинина (НА), может заключаться в культивировании с помощью обратного генетического метода обратной генетической системы, в которой ДНК, кодирующая НА, кодирует аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в рецепторном сайте связывания.
Под объем изобретения подпадают также способы получения нуклеиновых кислот, кодирующих молекулу гемагглютинина (НА). Молекула НА может иметь по меньшей мере одно изменение в аминокислотной последовательности, которое придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекул НА, в которых отсутствуют изменения. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что нуклеотидную последовательность интродуцируют в нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в рецепторном сайте связывания, что приводит к аминокислотной замене в последовательности молекулы НА, придающей молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствует аминокислотная замена.
Определения
В контексте настоящего описания понятие «вирус гриппа» относится к типам вируса, патогенные штаммы которых вызывают заболевание, известное под названием инфлюэнца или грипп.
Понятие «исходный вакцинный штамм вируса» обозначает штамм вируса, который применяют для создания используемых в вакцине штаммов, обладающих способностью к быстрому росту, или ослабленных штаммов. Такие исходные вакцинные штаммы, как правило, содержат шесть сегментов гена, используемых в вакцинном вирусе (РВ1, РВ2, PA, NP, NA, М и NS). Исходный вакцинный штамм вируса может представлять собой штамм, который применяют также в качестве компонента вакцины, в частности штамм вируса A/PR/8/34.
Понятие «полипептид» относится к полимеру аминокислот и не связано с конкретной длиной продукта; таким образом, под определение «полипептид» подпадают пептиды, олигопептиды и белки. Это понятие не относится или не включает посттрансляционные модификации полипептида, например, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п.
В контексте настоящего описания понятие «инфекционный» обозначает способность вируса размножаться в клетке и продуцировать вирусные частицы. Инфективность можно оценивать либо путем обнаружения вируса, т.е. вирусной нагрузки, либо путем выявления развития заболевания у животного.
Понятия «индивидуум» или «субъект» или «животное» в контексте настоящего описания относятся к позвоночным, которые подвержены инфекции, вызываемой вирусом с антисмысловой цепью РНК, конкретно инфекции, вызываемой вирусом гриппа, включая (но не ограничиваясь ими) птиц (таких как водоплавающие и куры) и представителей различных видов млекопитающих, таких как псовые, кошачьи, волки, хорьки, грызуны (крысы, мыши и т.д.), лошади, коровы, овцы, козы, свиньи и приматы, последние включают человека. В конкретном варианте осуществления изобретения субъект представляет собой хорька, который является пригодным модельным животным для изучения гриппа. В другом варианте осуществления изобретения субъект представляет собой человека.
В контексте настоящего описания понятие «иммуногенный» означает, что вирус или полипептид обладает способностью вызывать гуморальный или клеточно-опосредованный иммунный ответ и предпочтительно оба ответа. Иммуногенная субстанция является также антигенной. Иммуногенная композиция представляет собой композицию, которая вызывает гуморальный или клеточно-опосредованный иммунный ответ и предпочтительно оба ответа при введении животному.
Молекула является «антигенной», если она обладает способностью специфически взаимодействовать с распознающей антиген молекулой иммунной системы, такой как иммуноглобулин (антитело) или Т-клеточный антигенный рецептор. Антигенный полипептид содержит «эпитоп», состоящий по меньшей мере из примерно пяти и предпочтительно по меньшей мере из примерно 10 аминокислот. Антигенный фрагмент полипептида, который в настоящем описании обозначают также как «эпитоп», может представлять собой фрагмент, который является иммунодетерминантой для распознавания антителом или Т-клеточным рецептором, или он может представлять собой фрагмент, используемый для создания антитела к молекуле путем конъюгации антигенного фрагмента с полипептидом-носителем с целью иммунизации. Не является необходимым, чтобы антигенная молекула была сама по себе иммуногенной, т.е. обладала способностью вызывать иммунный ответ в отсутствие носителя.
В контексте настоящего описания понятие «аминокислотная замена» относится к встраиванию аминокислоты в конкретное положение в аминокислотной последовательности, рассматриваемой молекулы. Аминокислотная замена представляет собой замену конкретной аминокислоты на любую другую аминокислоту, которая может занимать рассматриваемое положение. Полипептид, образующийся в результате изменения аминокислотной последовательности, может содержать также изменения, представляющие собой посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, или любые другие аминокислотные модификации, а также аминокислотную замену.
В контексте настоящего описания понятие «обратная генетическая система» относится к методам создания частиц вируса гриппа, полипептидов, вирионов или нуклеиновых кислот с использованием методов генной инженерии. Такие методы включают (но, не ограничиваясь ими) «плазмидную систему», описанную у Hoffmann (Hoffmann и др., Vaccine, 20, 2002, с.3165; публикация патента США 2002/0164770А1, 7 ноября 2002 г., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте). В целом, обратные генетические системы позволяют создавать вирусные частицы, полипептиды и/или нуклеиновые кислоты, содержащие специфические последовательности, с использованием методов генной инженерии, известных специалистам в данной области. Такие системы описаны также более подробно ниже.
В контексте настоящего описания понятие «рецепторный сайт связывания» относится к фрагменту молекулы НА, с которым связывается представляющий интерес рецептор, такой как рецептор сиаловой кислоты на эритроцитах. Структура молекулы Н5 A/duck/Singapore и положение рецепторного сайта связывания гемагглютинина вируса Н5-подтипа известны и описаны в литературе (На и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 2001, с.11181). Модель молекулы указанного НА Н5, включая рецепторный сайт связывания, представлены на фиг.3.
Понятие «диагностический эталонный вирус» относится к вирусу, содержащему НА с повышенной антигенностью. Такой диагностический эталонный вирус можно применять в иммуноанализе, например, в анализе ингибирования гемагглютинина.
Понятие «инфицирующий вирус» относится к вирусу, который инфицирует конкретное животное. Такая инфекция может осуществляться в процессе повседневной деятельности, такой как контакт с инфицированным субъектом, например, приводящий к инфицированию человека инфекционным вирусом гриппа. Такая инфекция может являться результатом специального клинического контрольного заражения, например, при проведении лабораторных опытов, например, когда лабораторное животное, такое как хорек, специально инфицируют вирусом. Такая инфекция может быть осуществлена при иммунизации с использованием противогриппозной вакцины.
Понятие «фармацевтически приемлемый» относится к молекулам и композициям, которые являются физиологически переносимыми и, как правило, при введении человеку не вызывают аллергическую или аналогичную неблагоприятную реакцию, такую как желудочное расстройство, головокружение и т.п. В контексте настоящего описания понятие «фармацевтически приемлемый» предпочтительно означает «утвержденный» регулирующим органом Федерального правительства или правительства штата или «разрешенный» Фармакопеей США или другими общепризнанными фармакопеями для применения на животных и более конкретно для человека.
Понятие «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или наполнителю, вместе с которым вводят соединение. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода или масла, включая масла, полученные из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. В качестве носителей, прежде всего для инъекционных растворов, предпочтительно используют воду или водные физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина. Пригодные фармацевтические носители описаны в «Remington's Pharmaceutical Sciences» под ред. E.W. Martin, 18-е изд.
В контексте настоящего описания понятие «адъювант» относится к соединению или смеси, которая усиливает иммунный ответ на антиген. Адъювант может служить в качестве депо в ткани, которое медленно высвобождает антиген, а также в качестве активатора лимфатической системы, который неспецифически усиливает иммунный ответ (Hood и др., Immunology, 2- изд., изд-во Benjamin/Cummings, Memo Park, CA, 1984, с.384). Часто первичное контрольное заражение с использованием только антигена в отсутствии адъюванта не может вызывать гуморальный или клеточно-опосредованный иммунный ответ. Адъюванты включают (но не ограничиваясь ими) полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, сапонин, минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масло или углеводородные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки и потенциально пригодные для человека адъюванты, такие как N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин, N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин, БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum. Предпочтительно адъювант является фармацевтически приемлемым.
В контексте настоящего описания понятие «выделенный» означает, что рассматриваемый материал удален из его нативного окружения, например, из клетки или вируса. Так, выделенный биологический материал может быть свободен от некоторых или всех клеточных компонентов, т.е. компонентов клеток, в которых нативный материал встречается в естественных условиях (например, цитоплазматического или мембранного компонента). Следует считать, что материал выделен, если он присутствует в клеточном экстракте или супернатанте. В случае молекул нуклеиновой кислоты к выделенным нуклеиновым кислотам относится ПЦР-продукт, выделенная мРНК, кДНК или полученный путем рестрикции фрагмент. В другом варианте осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота предпочтительно «вырезана» из хромосомы, в которой она может присутствовать, и более предпочтительно не связана с некодирующими областями и не находится в непосредственной близости от них (однако она может быть связана с ее нативными регуляторными областями или их фрагментами), или с другими генами, расположенными против хода или по ходу транскрипции относительно гена, содержащегося в выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, когда она присутствует в хромосоме. Еще в одном варианте осуществления изобретения в выделенной нуклеиновой кислоте отсутствует один или несколько интронов. К выделенным молекулам нуклеиновой кислоты относятся последовательности, встроенные в плазмиды, космиды, искусственные хромосомы и т.п., т.е. когда они представляют собой часть химерной рекомбинантной конструкции нуклеиновой кислоты. Так, в конкретном варианте осуществления изобретения рекомбинантная нуклеиновая кислота представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту. Выделенный белок может быть ассоциирован с другими белками или нуклеиновыми кислотами, с которыми он связан в клетке, или ими обоими, или с клеточными мембранами, если он представляет собой ассоциированный с мембраной белок. Выделенную органеллу, клетку или ткань удаляют из анатомической области, в которой она присутствует в организме. Выделенный материал может быть очищен, но это не является обязательным.
В контексте настоящего описания понятие «очищенный» относится к материалу, который был выделен в условиях, которые позволяют уменьшить или исключить присутствие не имеющих отношения к нему материалов, т.е. загрязнителей, включая нативные материалы, из которых получен рассматриваемый материал. Например, очищенный вирион предпочтительно практически свободен от компонентов клетки-хозяина или культуры, включая тканевую культуру или белки яйцеклетки, неспецифические патогены и т.п. В контексте настоящего описания понятие «практически свободен от» используют в конкретном контексте аналитического определения чистоты материала. Предпочтительно очищенный материал, практически свободный от загрязнителей, имеет по меньшей мере 50%-ную степень чистоты, более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную степень чистоты, и еще более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную степень чистоты. Степень чистоты можно оценивать с помощью хроматографии, гель-электрофореза, иммуноанализа, анализа состава, биологического анализа и других методов, известных в данной области.
Методы очистки хорошо известны в данной области. Вирусные частицы можно очищать с помощью ультрафильтрации или ультрацентрифугирования, предпочтительно непрерывного центрифугирования (см. Furminger, выше). Можно применять другие методы очистки, которые рассмотрены в настоящем описании. Очищенный материал может содержать менее, чем примерно 50%, предпочтительно менее, чем примерно 75%, и наиболее предпочтительно менее, чем примерно 90% клеточных компонентов, сред, белков или других нежелательных компонентов или примесей (смотря по контексту), с которым он был ассоциирован в исходном состоянии. Понятие «практически чистый» означает наибольшую степень чистоты, которую можно достичь с помощью общепринятых методов очистки, известных в данной области.
В конкретном варианте осуществления изобретения понятие «примерно» или «приблизительно» означает, что величина находится в статистически определенном диапазоне значений. Такой диапазон может составлять по порядку величин предпочтительно 50%, более предпочтительно 20%, еще более предпочтительно 10%, и еще более предпочтительно 5% от указанного значения или диапазона. Допустимые вариации, подпадающие под понятие «примерно» или «приблизительно», зависят от конкретной рассматриваемой системы и обычный специалист в данной области легко может оценить их.
Гемагглютинин
Гемагглютинин (НА) представляет собой основной оболочечный гликопротеин вирусов гриппа А и В. Гемагглютинин-эстераза (НЕ) вирусов гриппа С представляет собой гомолог НА этих вирусов. Новые подтипы молекул НА, источником которых, как правило, являются водоплавающие птицы, которые, как известно, представляют собой естественные носители вирусов гриппа, приводят к возникновению пандемий гриппа (см. Suzuki и Nei, Mol. Biol. Evol., 19(4), 2002, сс.501-509).
НА имеет две полипептидные цепи, НА1 и НА2, кодируемые одним геном и образующиеся в результате протеолиза из одной молекулы-предшественника, включающего потерю сигнального пептида (Suzuki и Nei, выше; Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(12), 1981, сс.7639-7643). НА1 содержит примерно 320-аминокислот - и представляет собой белок, связывающий рецептор, который является основной мишенью иммунных ответов. НА2 содержит примерно 220 аминокислот и обеспечивает «заякоривание» на вирусной оболочке (Suzuki и Nei, выше).
Гены НА из вируса гриппа А подразделяют на 16 подтипов в соответствии с их антигенными свойствами. Гены НА (НЕ) вирусов гриппа В и С не подразделяют на подтипы. Последовательности подтипов H1-H15 вируса гриппа и НА (НЕ) вирусов гриппа В и С представлены в статье Suzuki и Nei, выше, на фиг.1, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки. Сравнение последовательностей НА подтипов H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11 и Н12 вируса гриппа А, включая консервативные аминокислотные остатки из всех двенадцати подтипов, представлено на фиг.1 в статье Air, выше, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки. В обеих ссылках описаны штаммы, из которых были получены эти последовательности.
Новые молекулы НА, предлагаемые в изобретении, создают путем интродукции таких изменений в аминокислотную последовательность молекулы НА, которые приводят к повышению антигенности. Выделение нуклеиновых кислот, кодирующих такие молекулы НА, является стандартной процедурой (см. Air, выше), так же как и модификация нуклеиновой кислоты с целью интродукции изменений в аминокислотную последовательность, которую осуществляют, например, с помощью сайтнаправленного мутагенеза.
В альтернативном варианте осуществления изобретения молекулы НА одного из штаммов конкретного подтипа НА уже содержат аминокислотную последовательность, которая усиливает антигенность по сравнению с молекулами НА того же подтипа из других штаммов, что проиллюстрировано в настоящем описании на примере штамма А/НК/213/03, родственного, например, штамму A/Vietnam/1203/04. В этом случае штамм вируса гриппа, содержащий молекулу НА с большей антигенностью, может служить в качестве диагностического эталонного штамма. В другом варианте осуществления изобретения аминокислотные остатки из НА с большей антигенностью можно интродуцировать или осуществлять с их использованием замену в последовательности молекулы НА с меньшей антигенностью, придавая тем самым молекуле НА большую антигенность.
К повышению антигенности могут приводить различные изменения последовательности молекулы НА. Как указано выше, цепью, в которой можно осуществлять такие изменения, является цепь НА1, которая представляет собой рецепторный связывающий домен и служит основной мишенью иммунного ответа. Изменения могут повышать аффинность антитела к молекуле НА, например, в результате удаления сайта гликозилирования, который образует эпитоп, или в результате образования более благоприятной конформации, обладающей повышенной аффинностью к связыванию с антителом. В альтернативном варианте изменение может приводить к уменьшению связывания с рецептором НА, например, рецептором сиаловой кислоты на эритроцитах, в результате чего антитела, специфические в отношении молекулы НА, становятся более эффективными конкурентами в реакции гемагглютинации. Различные иммуноанализы, позволяющие выявлять такие изменения, включая анализ с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI), хорошо известны в данной области.
В HI-анализе используют целые частицы вируса гриппа, которые применяют в настоящее время в вакцинах. Таким образом, в изобретении предложены вирусы гриппа, содержащие молекулы НА с повышенной антигенностью. Такие вирусы наиболее удобно создавать с помощью «обратного генетического метода», хотя можно применять также классический метод перегруппировки.
Обратные генетические методы
Разработанные в настоящее время обратные генетические методы позволяют осуществлять манипуляции с геномом вируса гриппа (Palese и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1996, с.11354; Neumann и Kawaoka, Adv. Гриппа Res., 53, 1999, с.265; Neumann и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1999, с.9345; Fodor и др., J. Virol., 73, 1999, с.9679; заявка на патент США 20040029251). Например, было продемонстрировано, что обеспечиваемая плазмидой экспрессия восьми вРНК под контролем промотора polI и всех мРНК под контролем промотора polII приводит к образованию инфекционного вируса гриппа A (Hoffmann и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 2000, с.6108; публикация патента США No.20020164770, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в части, касающейся описания минимальной плазмидной обратной генетической системы и описания методов генной инженерии). Такие методы рекомбинации позволяют осуществлять специфическое создание типов вируса гриппа со специфическими изменениями аминокислотной последовательности полипептида. Молекула НА, содержащая требуемую замену, может представлять собой часть рекомбинантного вируса гриппа. Рекомбинантный вирус гриппа можно создавать также любыми методами, известными специалистам в данной области, включая такой метод генной инженерии, как метод, основанный на использовании «только плазмидной» системы (Hoffmann и др. Vaccine, 20, 2002, с.3165). Рекомбинантный вирус гриппа можно получать из вируса H5N1. Рекомбинантный вирус может находиться в генетическом окружении вируса H1N1, применяемого для создания вакцины, такого как вирус A/PR/8/34 или любой вирус гриппа А, включая адаптированные для защиты от простуды штаммы A/Leningrad/134/17/57, A/Leningrad/134/47/57 и A/Ann Arbor/6/60. Нуклеиновую кислоту, соответствующую последовательности молекулы НА, можно выделять из вируса и секвенировать.
Методы выделения и модификации конкретных нуклеиновых кислот и белков хорошо известны специалистам в данной области. Согласно настоящему изобретению можно применять общепринятые методы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК, известные специалистам в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе, см., например, Sambrook, Fritsch и Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (в настоящем описании цитируется как «Sambrook и др., 1989»); DNA Cloning: A Practical Approach, тома I и II, под ред. D.N. Glover, 1985; Oligonucleotide Synthesis, под ред. M.J. Gait, 1984; Nucleic Acid Hybridization, под ред. B.D. Hames и S.J. Higgins, 1985; Transcription And Translation, под ред. B.D. Hames и S.J. Higgins, 1984; Animal Cell Culture, под ред. R.I. Freshney, 1986; Immobilized Cells And Enzymes, изд-во IRL Press, 1986; В. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984; Current Protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel, F.M., изд-во John Wiley & Sons, Inc., 1994. Эти методы включают сайтнаправленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов с измененными нуклеотидами для получения ПЦР-продуктов, содержащих мутации (например, с помощью набора «Quikchange», производимого фирмой Stratagene).
Иммуноанализы
Для обнаружения связывания и повышенной антигенности, создаваемой согласно настоящему изобретению, можно применять разнообразные методы обнаружения иммуноспецифического связывания антитела с антигеном, известные в данной области. Один из первых методов обнаружения взаимодействия между антигеном и антителом был основан на обнаружении и анализе комплекса с помощью преципитации в гелях. Другой метод обнаружения связанной пары анализируемая субстанция-идентифицирующее антитело основан на использовании меченного радиоактивным йодом идентифицирующего антитела или меченного радиоактивным йодом белка, обладающего реактивностью в отношении IgG, такого как протеин А. Эти первые методы хорошо известны специалистам в данной области, и обзор этих методов дан в Methods in Enzymology, 70, 1980, сс.166-198.
Более поздние методы определения присутствия анализируемой субстанции в образце с использованием только одного антитела основаны на применении анализов конкурентного связывания. В этом методе антитело, которое чаще всего должно быть иммобилизовано на твердой подложке, приводят в контакт с образцом, который, как предполагают, содержит анализируемую субстанцию, в сочетании с известным количеством меченой анализируемой субстанции. После этого две анализируемые субстанции, а именно, меченая анализируемая субстанция и анализируемая субстанция, содержащаяся в образце, должны конкурировать за сайты связывания антитела. Определяют количественно либо свободную меченую анализируемую субстанцию, либо связанную меченую анализируемую субстанцию и по результатам этого измерения определяют количество конкурирующей анализируемой субстанции в образце. Более подробно этот метод описан в «Basic Principles of Antigen-Antibody Reaction» (у Labat, Methods in Enzymology, 70, 1980, сс.3-70). В этом случае меченая анализируемая субстанция может нести либо радиоактивную, либо ферментную метку.
В более современных иммуноанализах применяют метод двойных антител для обнаружения присутствия анализируемой субстанции. Эти методы также описаны в процитированном томе Methods in Enzymology. Так, согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения присутствие индивидуальных маркеров определяют с использованием пары антител для каждого из предназначенных для обнаружения маркеров. В контексте настоящего описания одно из указанной пары антител обозначают как «идентифицирующее антитело», а второе из указанной пары антител обозначают как «иммобилизованное антитело». Так, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения применяют сэндвич-метод с использованием двух антител для обнаружения анализируемой субстанции в образце биологической жидкости. В этом методе анализируемую субстанцию помещают между идентифицирующим антителом и иммобилизованным антителом, причем иммобилизованное антитело необратимо иммобилизовано на твердой подложке. Идентифицирующее антитело должно нести обнаруживаемую метку для того, чтобы идентифицировать присутствие сэндвича антитело-анализируемая субстанция и тем самым присутствие анализируемой субстанции.
Первые обычные твердые подложки находились в форме полистироловых пластин, трубок или гранул, которые все хорошо известны в области радиоиммунного анализа и иммуноферментного анализа. В последние годы в качестве твердых подложек применяют многочисленные пористые материалы, такие как нейлон, нитроцеллюлоза, ацетат целлюлозы, стекловолокно и другие пористые полимеры.
Можно применять различные методы и соответствующие сенсорные устройства. Автоматизированные устройства для анализа включают устройства для анализа с непрерывной/произвольной выборкой. Примерами таких систем являются OPUS™ фирмы РВ Diagnostic System, Inc. и анализатор IMX™, созданный фирмой Abbott Laboratories of North Chicago, Ill. Приборы для автоматизированного анализа фирмы РВ Diagnostic Systems, Inc. описаны в U.S. 5051237; 5138868; 5141871 и 5147609.
Другими классами систем для иммунохимического анализа, которые можно использовать при осуществлении на практике настоящего изобретения, являются оптические иммуносенсорные системы. В целом, оптический иммуносенсор представляет собой устройство, в котором используются принципы оптики для количественного превращения представляющих интерес химических или биохимических концентраций или активностей в электрические сигналы. Эти системы можно сгруппировать в четыре основные категории: устройства для измерения отражения; устройства для измерения резонанса поверхностного плазмона; волоконные оптические (световодные) устройства и интегрально-оптические устройства. Устройства для измерения отражения включают эллипсометрические устройства, устройства для множественной интегральной отражательной спектроскопии и капиллярные устройства с флуоресцентным заполнением. Волоконные оптические устройства включают устройства для измерения флуоресценции в быстро изменяющемся поле, оптические волоконные капиллярные трубки и волоконные оптические флуоресцентные сенсоры. Интегрально-оптические устройства включают устройства для измерения флуоресценции в плоском быстро изменяющемся поле, иммуносенсор с градирующим устройством ввода, интерферометр Маха-Цендера, интерферометр Хартмана и разностные (дифференциальные) интерферометрические сенсоры. Голографическое обнаружение реакций связывания осуществляют путем обнаружения присутствия голографического изображения, которое создают в заранее назначенном положении изображения, когда один реагент связывающейся пары связывается с иммобилизованным вторым реагентом связывающейся пары (см. U.S. No.5352582, выданный 4 октября 1994 г.на имя Lichtenwalter и др.). Примеры оптических иммуносенсоров описаны в целом в обзорной статье G. A. Robins, Advances in Biosensors, 1, 1991, сс.229-256. Более конкретное описание этих устройств можно найти, например, в U.S. 4810658; 4978503 и 5186897; у R. A. Brady и др. в Phil. Trans. R. Soc. Land. В., 316, 1987, сс.143-160 и у G. A. Robinson и др. в Sensors and Actuators, изд-во Elsevier, 1992).
Для установления диагноза гриппа, а также в поисковых исследованиях, касающихся эпидемиологии и антигенности вирусных штаммов, широко применяют серологические анализы. В частности, широко применяют анализ с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI) благодаря минимальным требованиям к лабораторному оборудованию и простоте применения. Предполагается, что настоящее изобретение должно повысить применимость HI-анализа благодаря повышению его чувствительности. HI-анализ можно применять также для выявления антигенности модифицированной молекулы НА и для облегчения характеризации модифицированной молекулы НА в качестве молекулы, обладающей большей или меньшей антигенностью, чем немодифицированные молекулы.
HI-анализ позволяет определять способность антител из образца сыворотки связываться со стандартизованным эталоном. В HI-анализе серийные разведения (титры) образца сыворотки смешивают со стандартными количествами эритроцитов и визуально выявляют их ассоциацию в комплексы. Результатом анализа является установление нижнего предела титра сыворотки, при котором можно визуально обнаружить комплекс.
Как указано выше, в настоящем изобретении предложен улучшенный способ получения и валидации вакцин для лечения или предупреждения инфекций, вызываемых вирусом гриппа. В частности, настоящее изобретение применимо к вакцинам, которые получают с помощью обратных генетических методов. Предполагается, что изобретение должно найти применение для валидации и проверки иммунного ответа после вакцинации. В частности, благодаря повышенной антигенности модифицированной молекулы НА изобретение позволяет проводить (но, не ограничиваясь этим) более эффективное обнаружение антител после того, как индивидуум был инфицирован вирусом гриппа. Эта повышенная антигенность обеспечивает повышенную чувствительность анализа, применяемого для обнаружения иммунного ответа, такого как HI-анализ.
Создание вакцины
Как показано ниже на примерах, модифицированный вирус, содержащий молекулу НА с повышенной антигенностью, сам по себе обладает большей иммуногенностью, что, в свою очередь, приводит к более сильному иммунному ответу и более высокому потенциалу вакцины.
Стратегии повышения эффективности вакцины включают применение адъювантов (Wood и Williams, выше), совместное введение иммуностимулирующих молекул (Salgaller и Lodge, J. Surg. Oncol., 68, 1998, с.122) и стратегий вакцинации через слизистую оболочку. Стратегии иммунизации через слизистую оболочку включают инкапсуляцию вируса в микрокапсулы (U.S. 5075109, 5820883 и 5853763) и использование иммунопотенциирующего мембранного носителя (WO 98/0558). Кроме того, иммуногенность вводимых оральным путем иммуногенов можно повышать путем использования эритроцитов (RBC) или гемолизированных RBC (U.S. 5643577), или путем использования антигена «синего языка» (blue tongue antigen) (U.S. 5690938). Хотя эти подходы являются многообещающими для разработки будущих стратегий вакцинации, их применение в конкретных ситуациях требует валидации и наблюдения для гарантии эффективности вакцины. Предполагается, что представленное в настоящем описании изобретение должно улучшить эти стратегии, в том числе путем повышения способности обнаруживать их терапевтические действия.
Примеры
Ниже различные объекты изобретения проиллюстрированы на примерах, не ограничивающих его объем.
Пример 1: Титры антитела в сыворотке инокулированных хорьков
Обладающие высокой патогенностью вирусы H5N1 получали от находящихся в Азии лабораторий, сотрудничающих с Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ). Всю работу с этими вирусами проводили на оборудовании BL3+ в Детском исследовательском госпитале Св. Иуды (St. Jude Children's Research Hospital). При создании изобретения для сравнения иммуногенности вирусов гриппа Z-генотипа, выделенных в 2003 г., который стал преобладающим в 2004 г., с вирусами, выделенными в 2004 г., осуществляли инокуляцию хорьков вирусом H5N1, выделенным из организма погибшего человека (А/НК/213/03) (Guan и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 2004, с.8156), и четырьмя вирусами H5N1, выделенными из организма человека, куриц и соколов в 2004 (фиг.1А). Самцов и самок выведенных путем аутбридинга хорьков получали в рамках специальной программы селекции Центра ресурсов животных при St. Jude Children's Research Hospital. Животные имели возраст 3-5 месяцев и при проведении HI-анализов они давали отрицательную серологическую реакцию (были серонегативными) в отношении заражения циркулирующими в настоящее время вирусами гриппа A H1N1, H3N2 и H5N1 и вирусов гриппа В. Вирусы размножали в аллантоидных полостях 10-дневных оплодотворенных куриных яйцеклеток при 35°С в течение 48 ч. Аллантоидную жидкость, собранную после одного пассажа оплодотворенных куриных яйцеклеток, замораживали при -80°С и использовали в экспериментах.
Сывороточные антитела при проведении HI-анализа титровали и осуществляли контрольное заражение вирусами через 28 дней после инокуляции. Вирус А/НК/213/03 индуцировал высокие титры антитела (от 1:640 до 1:1280), в то время как четыре штамма 2004 г. индуцировали очень низкие HI-титры (от 1:20 до 1:40).
Сравнительно низкие Hi-титры вирусов H5N1 2004 г. могли являться результатом общей иммуносупрессии, индуцированной вирусом. Однако результаты вакцинации с использованием вакцин ΔH5N1-A/PR/8/34 (6+2), которые содержали НА и нейраминидазу из А/НК/213/03 и A/Vietnam/1203/04, показали, что основной вклад в этот эффект может быть обусловлен различиями в Н5 (фиг.1Б). Вакцинация с использованием двух доз вакцины ΔH5N1/03 по 7 мкг индуцировала высокие уровни антител в сыворотке, которые можно было обнаруживать как с помощью HI-анализа, так и теста по нейтрализации вируса (фиг.1Б). После такой же вакцинации с использованием ΔH5N1/04 при HI-анализе были обнаружены очень низкие (примерно 1:20) титры, в то время как нейтрализующие титры были намного выше (они составляли примерно половину от титров, индуцированных ΔН5К1/03). В проведенных ранее исследованиях было установлено, что инактивированная вакцина, полученная на основе A/duck/Singapore/3/97 (H5N3), индуцировала низкие или необнаруживаемые уровни антитела в сыворотке (Nicholson и др., Lancet, 357, 2001, с.193 7; Stephenson и др., Vaccine, 21, 2003, с.1687). Взятые в совокупности, эти результаты свидетельствуют о том, что некоторые изоляты Н5 могут обладать необычными иммуногенными и/или антигенными свойствами. Сравнительный анализ первичной структуры аминокислотных последовательностей Н5 позволил установить, что НА из вирусов А/НК/213/03 и A/Vietnam/1203/04 гриппа различаются 10 аминокислотами в НА 1-области (таблица 1б). Вирус A/Vietnam/1203/04 имеет потенциальный сайт гликозилирования на остатке аспарагина N154 (N*154-S155-T156, N-X-S/T, Х≠Р). Сравнение последовательностей позволило выявить три аминокислоты (S120, K189 и S223), которые присутствовали во всех вирусах 2004 г, но не присутствовали в А/НК/213/03. Для вируса A/Vietnam/1203/04 отличительной особенностью было присутствие К212.
Пример 2: Создание рекомбинантных вирусов ΔН5-A/PR/8/34 и определение их антигенных характеристик
Для оценки влияния идентифицированных аминокислот на иммуногенность и защиту от контрольного заражения вирусом (введения провокационной пробы) при создании изобретения использовали 8-плазмидную обратную генетическую систему для создания рекомбинантных вирусов, несущих семь сегментов гена A/PR/8/34 и сегмент гена НА A/Vietnam/1203/04, содержащий одиночные точковые мутации (Hoffmann и др., Vaccine, 20, 2002, с.3165). Рекомбинантные вирусы, лишенные патогенности в результате модификации НА Н5 в сайте расщепления, создавали с помощью ДНК-трансфекции (Hoffmann и др., Vaccine, 20, 2002, с.3165). Точковые мутации встраивали в НА с помощью ПЦР с использованием набора для сайтнаправленного мутагенеза QuikChange® (фирма Stratagene, Цедар Крик, шт.Техас, США) и набора специфических для НА Н5 праймеров. Перегруппированные вирусы содержали ген НА или гены НА и нейраминидазы (NA) из вирусов H5N1 в генетическом окружении вируса A/PR/8/34 (H1N1) (см. таблицу 1а, в которой представлены вирусы, сконструированные при создании настоящего изобретения, и указаны их сокращенные обозначения). Аллантоидную жидкость, собранную после одного пассажа оплодотворенных куриных яйцеклеток, замораживали при -80°С и использовали в экспериментах. Гены НА рекомбинантных вирусов амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР и секвенировали с целью проверки того, что присутствуют только указанные мутации. Изменение аминокислотной последовательности проверяли путем секвенирования сегмента НА рекомбинантных вирусов (таблица 1а).
Для оценки антигенных свойств и разнообразия рекомбинантных НА при создании изобретения проводили HI-анализы с использованием панели из шести моноклональных антител к НА (таблица 2). Моноклональные антитела (МАт) СР24, СР46, СР58 и 406/7 к НА вируса A/chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N3) создавали в Отделении инфекционных заболеваний St. Jude Children's Research Hospital. МАт VN04-6 к НА вируса A/Vietnam/I 203/04 и МАт НК03-3 к НА вируса А/НК/213/03 создавали с помощью модифицированного метода, описанного у Kohler и Milstein (Kaverin и др., Journal of Virology, 78, 2004, с.240; Koher и др., European Journal of Immunology, 6, 1976, с.511). Пять МАт вступали в реакцию при относительно высоких титрах с вирусом ΔН5Ж/03, но только 3 вступали в реакцию с НА ΔН5/04. Схемы реактивности вирусов ΔH5S155→N, T156→A/04, ΔH5S120→N/04 и ΔH5R212→K/04 в целом были сходными со схемой реактивности вируса ΔН5/04. Реакции вируса ΔH5S120→N, S155→N, Т156→А/04 были сходными с реакциями вируса ΔH5N1/03. Четыре МАт распознавали ΔН5/04 НА, несущий мутацию S223→N (ΔH5S223→N/04). Обратная мутация N223→S в НА вируса 2003 г. (ΔH5N223→S/03) приводила к существенному уменьшению HI-титров или к утрате способности распознаваться МАт.
Пример 3: HI-анализы с использованием куриных и лошадиных эритроцитов
Другой интересный результат был получен в HI-анализе с использованием куриных и лошадиных эритроцитов (RBC). Интересно отметить, что рекомбинантный вирус ΔH5S223→N/04 обладал слабой способностью вызывать агглютинацию 1%-ных лошадиных RBC, но приводил к агглютинации куриных RBC при высоких титрах (1:1024). Ни для одного из остальных рекомбинантных вирусов реакции с куриными и лошадиными RBC не различались между собой в такой степени.
Пример 4: Вакцинация хорьков мутантными рекомбинантными вирусами Н5-подтипа
При создании изобретения оценивали иммуногенность и защитную эффективность инактивированных вакцин путем вакцинации групп, включающих по 3 хорька, которую осуществляли путем внутримышечной инъекции препаратов вирусов ΔH5N1/04, ΔН5/04, ΔH5S155→N, Т156→А/04, ΔH5S120→N/04 и ΔH5S223→N/04, стандартизованных в отношении содержания их НА. Для стандартизации ΔH5N1/03 применяли метод простой радиальной имунодиффузии (Webby и др., Lancet, 363, 2004, с.1099). Остальные рекомбинантные вирусы разделяли путем электрофореза в 12%-ном ДСН-полиакриламидном геле, окрашенные гели анализировали с помощью денситометрии на анализаторе люминесцентных изображений типа LAS-1000plus фирмы FUJIFILM и количественно оценивали НА путем сравнения с препаратом эталонного белка. После осуществления двух инъекций по 7 мкг НА каждому животному инокулировали A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Группы по 3 хорька вакцинировали путем внутримышечной инъекции 250 мкл стерильного ЗФР, содержащего 7 мкг НА из инактивированных очищенных вирусов. Вакцинные вирусы инактивировали, концентрировали, очищали согласно описанному в литературе методу (Liu и др., Virology, 314, 2003, с.580; Webby и др., Lancet, 363, 2004, с.1099). Трем контрольным животным вводили путем инъекции 250 мкл только одного стерильного ЗФР. В день 21 после вакцинации брали образцы сыворотки и осуществляли вторую внутримышечную инъекцию 7 мкг НА. Через две недели снова брали образцы сыворотки и осуществляли контрольное заражение путем инокуляции вируса.
Вакцинированных и контрольных животных инокулировали, как описано выше, интраназально 106 средних инфицирующих доз для куриного эмбриона (EID50) вируса A/Vietnam/1203/04 (Govorkova и др., Journal of Virology, 79, 2005, с.2191). В течение двух недель ежедневно осуществляли мониторинг клинических признаков инфекции, измерение веса тела и температуры. Хорьков, у которых были выявлены признаки серьезного заболевания, умерщвляли. Для оценки постинфективного иммунного ответа дополнительные группы хорьков инокулировали 106 EID50 изолятов А/НК/213/03, A/Vietnam/3046/04, A/Vietnam/3062/04, A/chicken/Vietnam/39/04 и A/falcon/HK/D0028/04 человеческого и птичьего H5N1. В день 28 после инокуляции у животных брали образцы сыворотки. Для определения титров вируса в верхних дыхательных путях в дни 3, 5 и 7 брали образцы с помощью назального лаважа (Govorkova и др., Journal of Virology, 79, 2005, с.2191). Содержащийся в образцах вирус титровали в 10-дневных оплодотворенных куриных яйцеклетках и выражали в виде log10 EID50 на 0,1 мл. Титры вируса в назальных смывах у всех вакцинированных животных составляли от 2,5 до 4,5 log10 EID50 в день 3, от 0,5 до 2,5 log10 EID50 в день 5 и 0,25 log10 EID50 или менее в день 7 (фиг.2). У невакцинированных хорьков средний титр составлял 4,0 log10 EID50 спустя одну неделю после заражения. У двух из трех контрольных хорьков были выявлены признаки серьезного заболевания (большая потеря веса и паралич) и они были умерщвлены, а один умер от инфекции. Среди вакцинированных хорьков только у одного развилось серьезное заболевание. У этого хорька, вакцинированного вирусом ΔH5S120→N/04, были выявлены серьезные неврологические признаки и он был умерщвлен в день 7 после инокуляции. У этого хорька в день 4 был выявлен серьезный вирусный конъюнктивит с последующим распространением вируса в головной мозг. По-видимому, вирус был занесен в глаза в процессе осуществления назального лаважа в день 3 и быстрое распространение по нейронам в головной мозг вызвало энцефалит. У остальных вакцинированных хорьков в течение первых трех дней после контрольного заражения вирусом была выявлена пониженная активность, потеря веса тела и повышенная температура тела. Эти признаки исчезли к пятому дню, и все животные быстро вернулись к норме. Таким образом, все протестированные вакцинные вирусы защищали хорьков от смертельного заражения A/Vietnam/1203/04. Вакцинация приводила к понижению титров вируса в верхних дыхательных путях и уменьшала продолжительность выделения вируса в среду.
Пример 5: Оценка с помощью HI-анализов и тестов по нейтрализации иммуногенности рекомбинантных вирусов ΔH5-A/PR/8/34
Полученную от вакцинированных хорьков сыворотку тестировали в отношении присутствия рекомбинантных вирусов с помощью HI-анализа и анализа нейтрализации вируса (таблицы 3 и 4 соответственно). Образцы сыворотки, взятые у хорьков, обрабатывали в течение ночи ферментом, разрушающим рецептор холерного вибриона (Vibrio cholerae) (фирма Denka-Seiken, Токио, Япония), инактивировали тепловой обработкой при 56°С в течение 30 мин и абсорбировали 0,5%-ной суспензией куриных эритроцитов (CRBC). Стандартный HI-анализ и анализ нейтрализации вируса в клетках MDCK осуществляли согласно описанному в литературе методу (Palmer и др., Immunology series no. 6. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention, изд-во US Department of Health, Education and Welfare, 1975; Kida и др., Virology, 122, 1982,с.38).
В каждом HI-анализе использовали по четыре гемагглютинирующие единицы (HAU) вируса и в каждом анализе нейтрализации вируса использовали по 100 средних цитопатогенных доз (TCID50). Для сыворотки, полученной из организма хорьков, вакцинированных псевдовирионом дикого типа с одним геном (ДН5/04, эталонный вирус) HI-титры составляли 1:20. Конструкция, в которой был удален сайт гликозилирования (ΔH5S155→N; Tl56→A/04), индуцировала HI-титры, составляющие от 1:10 до 1:20. Для мутантного ΔН5 HAS120→N/04 HI-титры составляли от 1:20 до 1:80. В отличие от этого вакцинация с использованием ΔH5S223→N/04 приводила к HI-титру, составляющему 1:640, а другие протестированные иммунные сыворотки вступали в реакцию с вирусом ΔH5S223→N/04 при высоких HI-титрах (от 1:160 до 1:320). Таким образом, хотя вакцинация индуцировала защитный иммунитет, уровни обнаруживаемого антитела были различными.
Все вирусы ΔН5/04 после вакцинации индуцировали высокие титры нейтрализующих вирус антител (от 1:320 до 1:1280) (таблица 4). Не было выявлено существенных различий между гомологичными и гетерологичными нейтрализующими титрами. Следовательно, выявленные различия между сыворотками в отношении распознавания НА не отражают способности антител нейтрализовать вирус.
Пример 6: Реактивность рекомбинантных вирусов
При создании изобретения с целью дополнительной оценки реактивности рекомбинантных вирусов использовали HI-анализ для тестирования гипериммунной сыворотки мыши и куриц, полученной после вакцинации с использованием вирусов ΔH5N1/03 и А/НК/213/03, против рекомбинантных вирусов с измененными НА (таблица 5). Средние HI-титры против гомологичного вируса ΔH5N1/03 составляли 1:2560. HI-титры против ΔН5/04 составляли 1:160. HI-титры против рекомбинантного вируса ΔH5S223→N/04 превышали по меньшей мере в два раза титры против других мутантов.
Для получения дополнительной информации о вкладе аминокислоты, присутствующей в положении 223, в серологическую реактивность при создании изобретения был сконструирован рекомбинантный вирус, в котором Н5 был получен из А/НК/213/03, имеющий только точковую мутацию N223→S (таблица 1а). Этот рекомбинантный вирус ΔH5N223→S/03 характеризовался более низкими HI-титрами в куриных и лошадиных RBC, чем вирус ΔH5N1/03. Для дополнительной оценки влияния аминокислоты в положении 223 на распознавание антигена антителом при создании изобретения был сконструирован рекомбинантный вирус, который содержал НА дикого типа и имел НА из A/duck/Singapore/3/97 с мутацией S223→N (см. таблицу 1а). Эти вирусы тестировали с помощью HI-анализа с использованием панели антисыворотки к Н5 и МАт (таблица 6). Замена S223→N в НА приводила к резкому повышению HI-титров (в 4 раза и более). Однако эта мутация не приводила к значительному изменению схемы реактивности НА A/duck/Singapore/3/97, прежде всего в реакциях с МАт: ни исходный, ни мутантный НА не вступал в реакцию с МАт, представляющими собой НК03-3 и СР46, и оба вступали в реакцию с СР46 с низкими титрами (таблица 6). Эти результаты свидетельствуют о том, что замена S223→N в НА повышает чувствительность HI-анализа.
Пример 7: Второе поколение диагностических эталонных вирусов, которые должны повышать чувствительность HI-анализа
Выше в примере 3 уже было продемонстрировано, что в результате замены аминокислоты в положении 223 НА Н5 на аспарагин повышалась чувствительность HI-анализа с использованием куриных эритроцитов. При создании изобретения было доказано, что основой этого эффекта на молекулярном уровне является измененная рецепторная специфичность. Мутантный вирус с повышенной чувствительностью не вызывает агглютинацию лошадиных эритроцитов, в которых присутствует только альфа-2,3-связь. Следовательно, аминокислотные замены, которые приводят к потере способности вызывать агглютинацию лошадиных эритроцитов, являются кандидатами для повышения потенциала чувствительности HI-анализа с использованием куриных эритроцитов. Этот принцип можно применять ко всем 16 подтипам НА, прежде всего вирусов гриппа А птиц, которые обладают специфичностью в отношении 2,3-связи.
Обратные генетические методы позволяют создавать рекомбинантные вирусы, которые имеют минимальные изменения своих антигенных структур, но являются «оптимизированными» с точки зрения распознавания различных клеточных субстратов. Предпочтительно подвергают мутации аминокислоты (91, 130-134, 149, 151, 179, 186, 190-191, 220-225 в Н5-подтипе), которые расположены вблизи от сайта связывания рецептора или представляют собой его часть. Можно создавать плазмиды содержащие сконструированные генетическим путем НА, и путем котрансфекции создавать вирусы. Рекомбинантные вирусы можно тестировать путем анализа НА с использованием параллельно куриных эритроцитов и лошадиных эритроцитов. Вирусы, которые вызывают агглютинацию куриных эритроцитов и не вызывают агглютинацию лошадиных эритроцитов, являются кандидатами для тестирования с помощью HI-анализов. С помощью дополнительных экспериментов создают вирусы, которые вызывают агглютинацию лошадиных эритроцитов и не вызывают агглютинацию куриных эритроцитов. Использование комбинации кандидатов, имеющих одиночные аминокислотные замены, может еще более повысить чувствительность. Следует ожидать, что выявление кандидатов может привести к выявлению диагностических эталонных вирусов со специфической реактивностью к рецепторам, обладающим специфичностью в отношении 2,3-связи.
| Таблица 2 | ||||||
| HI-анализ рекомбинантных вирусов ΔН5 с использованием моноклональных антител к Н5 | ||||||
| Вирус | Моноклональные антитела к Н5 (HI-титры) | |||||
| VN04-6* | НК03-3+ | СР24++ | СР46++ | СР58++ | 406/7++ | |
| ΔH5N1/03 | 51200 | 6400 | 1600 | 100 | 1600 | 800 |
| ΔН5/04 | 12800 | <100 | 800 | <100 | 1600 | <100 |
| ΔH5S155→N, Т156→А/04 | 3200 | <100 | 800 | <100 | 800 | 100 |
| ΔH5S120→N/04 | 12800 | 200 | 800 | <100 | 1600 | <100 |
| ΔH5R212→K/04 | 12800 | 100 | 1600 | <100 | 6400 | <100 |
| ΔH5S223→N/04 | 51200 | 3200 | 12800 | <100 | 25600 | <100 |
| ΔH5S120→N, S155→N, T156→A/04 | 12800 | 1600 | 3200 | <100 | 1600 | 200 |
| ΔH5N223→S/03 | 12800 | 800 | ≤100 | <100 | 200 | ≤100 |
HI-анализы проводили в титрационных микропланшетах, содержащих 0,5%-ные куриные RBC. Титры представляют собой обратные величины наименьших разведений МАт, которые ингибируют гемагглютинин 4 гемагглютинирующих единиц (HAU) вируса.
* МАт к НА вируса A/Vietnam/1203/04;
+ МАт к НА вируса А/НК/213/03;
++ МАт к НА вируса A/chicken/Pennsylvania/1370/83.
11-недельных серонегативных в отношении вируса гриппа хорьков вакцинировали дважды с 3-недельными интервалами путем внутримышечной инъекции инактивированного очищенного и концентрированного препарата, содержащего 7 мкг НА в 250 мкл ЗФР. Данные представляют собой HI-титры, представленные индивидуально для 3 хорьков. В HI-анализах применяли 0,5%-ные куриные RBC.
Анализ нейтрализации осуществляли в клетках MDCK. Титры представляют собой обратные величины наименьших разведений, которые полностью ингибируют 100 TCID50 вируса. Гомологичные титры подчеркнуты. Величины представляют собой нейтрализующие титры, указанные индивидуально для каждого из 3 хорьков.
| Таблица 5 | ||
| HI-анализы антисыворотки к H5N1 2003 г. в отношении мутантных вирусов | ||
| Поликлональная антисыворотка к: | ||
| Вирус | вакцина ΔH5N 1/03 | A/HK/213/03 (H5N1) |
| ΔH5N1/03 | 2560 | 2560 |
| ΔН5/04 | 160 | 160 |
| ΔH5S155→N; T156→A | 80 | 320 |
| ΔH5S120→N/04 | 320 | 320 |
| ΔH5S223→N/04 | 1280 | 640 |
HI-анализ проводили в титрационных микропланшетах, содержащих 0,5%-ные куриные RBC (см. Palmer и др. в: Immunology series no. 6. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention, изд-во US Department of Health, Education and Welfare, 1975). Титры представляют собой обратные величины наименьших разведений сыворотки, которые ингибируют гемагглютинин 4 HAU вируса.
| Таблица 6 | |||||||||||||
| Анализ антигенности вирусов Н5/97 и H5S223→N/97 с использованием поликлональных и моноклональных антител | |||||||||||||
| Вирус | HI-титр поликлональной антисыворотки: | HI-титр МАт: | |||||||||||
| A/ck/Hi dalgo/94 | A/HK/1 56/97 | a/gs/h K/497-4/97 | A/ck/HK /YU22/02 | А/НК/2 13/03 |
ΔН5/03 | VN04-6* | HK03-3+ | СР58++ | СР24++ | СР46++ | СР406/7++ | ||
| ΔН5/03 | 20 | 320 | 5120 | 12800 | 160 | 5120 | 25600 | 6400 | 1600 | 12800 | <100 | 1600 | |
| Н5/97 | 40 | 640 | 640 | 320 | <10 | 10 | 3200 | <100 | 3200 | 1600 | <100 | 3200 | |
| H5S223→N/97 | 320 | 10240 | 10240 | 2560 | 80 | 1280 | 25600 | <100 | 25600 | 51200 | 200 | 25600 | |
| * МАт к НА вируса A/Vietnam/1203/04; | |||||||||||||
| + МАт к НА вируса А/НК/213/03; | |||||||||||||
| ++ МАт к НА вируса A/chicken/Pennsylvania/13 70/83. | |||||||||||||
| HI-анализ проводили в титрационных микропланшетах, содержащих 0,5%-ные куриные RBC (14). Титры представляют собой обратные величины наименьших разведений сыворотки, которые ингибируют гемагглютинин 4 HAU вируса. | |||||||||||||
Объем настоящего изобретения не ограничен представленными в настоящем описании конкретными вариантами осуществления изобретения. Фактически специалистам в данной области после ознакомления с приведенным выше описанием и прилагаемыми чертежами должны быть очевидны различные модификации изобретения помимо тех, которые представлены в настоящем описании. Следует считать, что такие модификации подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения.
Кроме того, следует иметь в виду, что все величины являются приблизительными и приведены с целью иллюстрации.
Все патенты и заявки на патент, процитированные в настоящем описании, включены в описание в качестве ссылки во всей полноте.
Claims (9)
1. Рекомбинантная молекула гемагглютинина (НА) вируса гриппа А субтипа Н5 (НА Н5), обладающая реактивностью в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, которое инфицировано вирусом гриппа или противогриппозной вакциной и включающая аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, где молекула НА не происходит из изолята человеческого Н5 А/НК/213/03.
2. Рекомбинантная молекула НА по п.1, отличающаяся тем, что она содержит одну или несколько замен по сравнению с соответствующей молекулой НА дикого типа, где указанная рекомбинантная молекула НА включает аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5; где указанная молекула дикого типа включает аминокислоту отличную от аспарагина в положении, соответствующем положению 223.
3. Рекомбинантная молекула НА вируса гриппа по п.1, отличающаяся тем, что аминокислотная замена приводит к изменению сайта гликозилирования.
4. Рекомбинантная молекула НА вируса гриппа по п.1, отличающаяся тем, что вирус гриппа представляет собой вирус гриппа А человека.
5. Рекомбинантная молекула НА вируса гриппа по п.4, отличающаяся тем, что вирус гриппа А человека является представителем Н5-подтипа.
6. Рекомбинантная молекула НА вируса гриппа по п.4, отличающаяся тем, что вирус гриппа А человека представляет собой вирус A/Vietnam/1203/04 (H5N1).
7. Рекомбинантный вирус гриппа А субтипа Н5, предназначенный для обнаружения антител к гриппу у животных, подвергающихся воздействию вируса гриппа или вакцины против гриппа, и содержащий рекомбинантную молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа А типа Н5 по п.1.
8. Вакцинный вирус гриппа А субтипа Н5, обладающий иммуногенной активностью и содержащий рекомбинантную молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа А типа Н5, где указанная рекомбинантная молекула НА содержит одну или несколько замен по сравнению с соответствующей молекулой НА дикого типа, где указанная рекомбинантная молекула НА включает аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5; где указанная молекула дикого типа включает аминокислоту, отличную от аспарагина в положении, соответствующем положению 223.
9. Противогриппозная вакцина, содержащая рекомбинантную молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа А типа Н5 по п.1.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US70580805P | 2005-08-04 | 2005-08-04 | |
| US60/705,808 | 2005-08-04 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011103648/10A Division RU2480480C2 (ru) | 2005-08-04 | 2006-07-28 | Способы применения модифицированного вируса гриппа |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008107875A RU2008107875A (ru) | 2009-09-10 |
| RU2420535C2 true RU2420535C2 (ru) | 2011-06-10 |
Family
ID=37727844
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011103648/10A RU2480480C2 (ru) | 2005-08-04 | 2006-07-28 | Способы применения модифицированного вируса гриппа |
| RU2008107875/10A RU2420535C2 (ru) | 2005-08-04 | 2006-07-28 | Модифицированный вирус гриппа, предназначенный для мониторинга и повышения эффективности вакцины |
| RU2013101020/10A RU2552213C2 (ru) | 2005-08-04 | 2013-01-11 | Вакцины на основе модифицированного вируса гриппа |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011103648/10A RU2480480C2 (ru) | 2005-08-04 | 2006-07-28 | Способы применения модифицированного вируса гриппа |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013101020/10A RU2552213C2 (ru) | 2005-08-04 | 2013-01-11 | Вакцины на основе модифицированного вируса гриппа |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7871626B2 (ru) |
| EP (1) | EP1924281B1 (ru) |
| JP (2) | JP5395430B2 (ru) |
| KR (1) | KR101334047B1 (ru) |
| CN (2) | CN101283099B (ru) |
| AU (1) | AU2006278696B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0614297A2 (ru) |
| CA (1) | CA2617483C (ru) |
| ES (1) | ES2728791T3 (ru) |
| HU (1) | HUE043952T2 (ru) |
| PL (1) | PL1924281T3 (ru) |
| RU (3) | RU2480480C2 (ru) |
| SG (1) | SG2014007934A (ru) |
| UA (1) | UA94717C2 (ru) |
| WO (1) | WO2007019094A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA200800505B (ru) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7871626B2 (en) | 2005-08-04 | 2011-01-18 | St. Jude Children's Research Hospital | Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency |
| EP1942924B1 (en) | 2005-10-28 | 2012-02-01 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Use of vaccines for the treatment/prevention of the transmission of influenza pathogens between species |
| JP2010501074A (ja) * | 2006-08-14 | 2010-01-14 | マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー | グリカンのデータマイニングシステム |
| US8202967B2 (en) * | 2006-10-27 | 2012-06-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use |
| CA2687147C (en) * | 2007-05-11 | 2016-08-23 | Temasek Life Sciences Laboratory Limited | H5 subtype-specific binding proteins useful for h5 avian influenza diagnosis and surveillance |
| MX363240B (es) * | 2007-06-25 | 2019-03-15 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Composiciones que inhiben la influenza y métodos. |
| CA2615372A1 (en) | 2007-07-13 | 2009-01-13 | Marc-Andre D'aoust | Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin |
| EP2610345B1 (en) | 2007-11-27 | 2015-08-19 | Medicago Inc. | Recombinant influenza virus-like particles (VLPS) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin |
| AU2009232503B2 (en) * | 2008-04-01 | 2013-03-28 | Innate Immunotherapeutics Limited | Anti-infective agents and uses thereof |
| CN102165062B (zh) * | 2008-07-18 | 2017-09-08 | 麦迪卡格公司 | 新的流感病毒免疫表位 |
| HUE030520T2 (en) * | 2008-11-28 | 2017-05-29 | Statens Seruminstitut | Optimized influenza vaccines |
| KR101145720B1 (ko) * | 2009-06-23 | 2012-05-14 | 한밭대학교 산학협력단 | 안전성이 뛰어난 인플루엔자 바이러스 백신용 재조합 헤마글루티닌 단백질을 함유하는 생분해성 ｐｌｇａ 미립자의 제조 방법 |
| SI2445928T1 (en) | 2009-06-24 | 2018-05-31 | Medicago Inc. | HYPER PARTICULARS, SIMILAR VIRUSES OF GRIPE, WHICH HAVE EXPOSED HEMAGLUTININE |
| EP2448598B1 (en) * | 2009-06-25 | 2016-03-30 | MedImmune, LLC | Swine influenza hemagglutinin variants |
| KR102115226B1 (ko) | 2009-09-22 | 2020-05-27 | 메디카고 인코포레이티드 | 식물-유래 단백질의 제조방법 |
| CN102095852A (zh) * | 2010-11-24 | 2011-06-15 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种用于快速检测新型h1n1流感病毒的双抗体夹心法 |
| TWI620816B (zh) | 2011-03-23 | 2018-04-11 | 苜蓿股份有限公司 | 植物衍生蛋白回收方法 |
| AR088028A1 (es) | 2011-08-15 | 2014-05-07 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal |
| JP6248040B2 (ja) * | 2011-09-30 | 2017-12-13 | メディカゴ インコーポレイテッド | 植物における増加するウイルス様粒子収量 |
| CN109265541A (zh) | 2012-05-10 | 2019-01-25 | 麻省理工学院 | 流感中和药剂 |
| CA2879228C (en) * | 2012-07-17 | 2021-07-13 | Merial Limited | Attenuated swine influenza vaccines and methods of making and use thereof |
| KR101315273B1 (ko) * | 2012-10-29 | 2013-10-08 | 대한민국 | 강독화된 인플루엔자 바이러스 변이주 |
| CN104491463A (zh) * | 2014-11-18 | 2015-04-08 | 四川金堂海纳生物医药技术研究所 | 一种治疗舌溢血(舌衄)的汤剂药物及制备方法 |
| WO2016090297A1 (en) * | 2014-12-04 | 2016-06-09 | The New York Stem Cell Foundation | Perfusion bioreactor |
| JOP20190088A1 (ar) | 2016-10-21 | 2019-04-21 | Us Agriculture | نواقل مؤتلفة للتعبير عن مولدات مضاد فيروس انفلونزا الطيور و استخداماتها |
| US20180128545A1 (en) * | 2016-11-08 | 2018-05-10 | Berry Metal Company | Modular furnace cooling wall |
| CN116075315A (zh) | 2020-05-08 | 2023-05-05 | 刘扶东 | 嵌合流感疫苗 |
| TW202334429A (zh) | 2021-10-01 | 2023-09-01 | 中央研究院 | Sars-cov-2棘蛋白特異性抗體及其用途 |
| CN117229370A (zh) * | 2022-06-08 | 2023-12-15 | 中科南京生命健康高等研究院 | H5n6禽流感广谱性疫苗的开发及其应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5762939A (en) | 1993-09-13 | 1998-06-09 | Mg-Pmc, Llc | Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus |
| EP0974660A1 (en) | 1998-06-19 | 2000-01-26 | Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) | Newcastle disease virus infectious clones, vaccines and diagnostic assays |
| IL127331A0 (en) | 1998-11-30 | 1999-09-22 | Yeda Res & Dev | Peptide-based vaccine for influenza |
| BRPI0410702B1 (pt) * | 2003-05-28 | 2022-04-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Composição, métodos para preparar um vírus de influenza e um veículo de liberação de genes, e, vírus |
| CN1261564C (zh) * | 2003-12-02 | 2006-06-28 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 人工重组的流感病毒及其应用 |
| US7871626B2 (en) | 2005-08-04 | 2011-01-18 | St. Jude Children's Research Hospital | Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency |
-
2006
- 2006-07-27 US US11/460,584 patent/US7871626B2/en active Active
- 2006-07-28 BR BRPI0614297-4A patent/BRPI0614297A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2006-07-28 CN CN2006800372900A patent/CN101283099B/zh active Active
- 2006-07-28 SG SG2014007934A patent/SG2014007934A/en unknown
- 2006-07-28 RU RU2011103648/10A patent/RU2480480C2/ru active
- 2006-07-28 JP JP2008525063A patent/JP5395430B2/ja active Active
- 2006-07-28 KR KR1020087005408A patent/KR101334047B1/ko active IP Right Grant
- 2006-07-28 CA CA2617483A patent/CA2617483C/en active Active
- 2006-07-28 RU RU2008107875/10A patent/RU2420535C2/ru active
- 2006-07-28 AU AU2006278696A patent/AU2006278696B2/en active Active
- 2006-07-28 EP EP06813248.9A patent/EP1924281B1/en active Active
- 2006-07-28 WO PCT/US2006/029575 patent/WO2007019094A2/en active Application Filing
- 2006-07-28 ES ES06813248T patent/ES2728791T3/es active Active
- 2006-07-28 PL PL06813248T patent/PL1924281T3/pl unknown
- 2006-07-28 CN CN201310049997.5A patent/CN103172710B/zh active Active
- 2006-07-28 HU HUE06813248A patent/HUE043952T2/hu unknown
- 2006-07-28 UA UAA200802674A patent/UA94717C2/ru unknown
-
2008
- 2008-01-17 ZA ZA200800505A patent/ZA200800505B/xx unknown
-
2010
- 2010-12-09 US US12/964,491 patent/US8293247B2/en active Active
-
2012
- 2012-09-13 US US13/614,835 patent/US8574592B2/en active Active
-
2013
- 2013-01-11 RU RU2013101020/10A patent/RU2552213C2/ru active
- 2013-09-04 JP JP2013183196A patent/JP5745584B2/ja active Active
- 2013-10-03 US US14/045,097 patent/US9499850B2/en active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BOTH G.W. et al., "Hemagglutinin of swine influenza virus: a single amino acid change pleiotropically affects viral antigenicity and replication", Proc Nail Acad Sci USA. 1983 Nov; 80(22):6996-7000. GAMBARYAN A. et al., "Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain". Virology. 2005 Apr 10; 334(2):276-83. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2420535C2 (ru) | Модифицированный вирус гриппа, предназначенный для мониторинга и повышения эффективности вакцины | |
| CN104093422B (zh) | 基于副流感病毒5的疫苗 | |
| US9072701B2 (en) | Avian influenza viruses, vaccines, compositions, formulations, and methods | |
| US20140072958A1 (en) | Novel influenza hemagglutinin protein-based vaccines | |
| EP2650362A2 (en) | Novel vaccines against the a/h1n1 pandemic flu virus | |
| Reneer et al. | Broadly reactive H2 hemagglutinin vaccines elicit cross-reactive antibodies in ferrets preimmune to seasonal influenza a viruses | |
| Sreenivasan et al. | Host Range, Biology, and Species Specificity of Seven-Segmented Influenza Viruses—A Comparative Review on Influenza C and D | |
| TWI620819B (zh) | 抗大流行性感冒病毒ａ／ｈ１ｎ１之新穎疫苗 | |
| AU2017203547B2 (en) | H3 equine influenza a virus | |
| Desheva | Preparing Live Influenza Vaccines against Potential Pandemic Influenza Using Nonpathogenic Avian Influenza Viruses and Cold-Adapted Master Donor Strain | |
| Arevalo | Of Mice, Ferrets, And Men: From Original Antigenic Sin To A New Universal Influenza Virus Vaccine Candidate | |
| Li | Development of competitive ELISA for detection of N1 and N2 antibodies against influenza virus | |
| Gupta et al. | Equine influenza in India. |