CN1261564C - 人工重组的流感病毒及其应用 - Google Patents
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Abstract
人工重组的流感病毒及其应用。本发明涉及一株人工制造的分子修饰致弱的H5亚型重组流感病毒。H5和H7亚型的高致病力禽流感病毒的暴发和蔓延往往给一个国家或地区的养禽业造成毁灭性打击，被国际兽疫局列为I类烈性传染病，然而，很难从自然界分离具备上述条件的毒株作为疫苗株。本产品保藏号为CCTCC-V200312，具有H5亚型高致病力禽流感病毒A/鹅/广东/1/96(H5N1)的血凝素(HA)基因，但HA裂解位点氨基酸序列为-RETR-；具有流感病毒A/Hongkong/486/97(H5N1)的神经氨酸酶(NA)基因和A/PR/8/34(H1N1)的PB2，PB1，PA，NP，M和NS共6个内部基因。本品用作防止禽流感疫苗。
Description
技术领域：本发明涉及一种人工制造的分子修饰致弱的H5亚型重组流感病毒，及其该病毒的应用。
背景技术：禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)是禽类及一些哺乳动物的呼吸系统疾病的重要病原。AIV在分类学上属于：病毒界(Vira)----正粘病毒科(Orthomyxoviridae)----流感病毒属(influenza virus A and B)----禽流感病毒(avian influenza virus)。
根据表面蛋白抗原性不同，禽流感病毒被分为15个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA)亚型，H5和H7亚型的高致病力禽流感病毒的暴发和蔓延往往给一个国家或地区的养禽业造成毁灭性打击，被国际兽疫局列为I类烈性传染病。使用鸡胚生长的全病毒灭活疫苗是防制高致病力禽流感的主要可行措施。理想的疫苗株应具备与流行株良好的抗原匹配性，对鸡及鸡胚无致病力及鸡胚高滴度生长性等条件。然而，很难从自然界分离具备上述条件的毒株作为疫苗株。反向基因操作技术的发展使人工构建满足上述条件禽流感病毒疫苗株成为可能。
发明内容：
本发明的目的是提供一种人工重组的流感病毒，按照病毒命名原则命名为：人工制造的H5亚型重组流感病毒A/哈尔滨/Re-1/2003(H5N1)，它是一种防制高致病力禽流感的疫苗，对鸡及鸡胚无致病力、具有鸡胚高滴度适应性、适合H5亚型禽流感防制，本发明包括该病毒的应用。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
人工重组的H5N1亚型流感病毒，株号简称为Re-1，保藏号为CCTCC-V200312，具有H5亚型高致病力禽流感病毒A/鹅/广东/1/96(H5N1)的血凝素(HA)基因，但HA裂解位点氨基酸序列为-RETR-；具有流感病毒A/Hongkong/486/97(H5N1)的神经氨酸酶(NA)基因和A/PR/8/34(H1N1)的PB2，PB1，PA，NP，M和NS共6个内部基因。
所述的人工重组的H5N1亚型流感病毒，具典型的低致病力H5亚型禽流感病毒分子特征；对鸡及鸡胚无致病力，具有高度鸡胚适应性。
一种上述的人工重组的H5N1亚型流感病毒，在防治动物H5亚型流感的疫苗上的应用。
这个技术方案有以下有益效果：
1.禽流感病毒表面结构蛋白HA是其最主要的免疫原蛋白。H5亚型禽流感病毒HA1-HA2裂解位点的多个碱性氨基酸是决定其高致病力的必要条件，这些碱性氨基酸的缺失或突变将致使其致病力丧失。流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株是鸡胚高滴度生长适应株，其鸡胚生长特性与其6个内部基因密切相关。
大多数人用流感病毒疫苗株为人流感病毒流行株与PR8病毒的2∶6重组病毒。流感病毒的基因组由8个分段的负链RNA片段组成，当2个病毒共同感染鸡胚或细胞时，其基因组片段会发生互换，从而产生一些新的重组病毒(reassortant)。利用全病毒灭活疫苗防制人的流感已有30多年的历史。由于流感病毒的HA基因极易发生变化，导致流行株的抗原性与疫苗株的抗原性匹配不良，同时现地新分离的抗原性变异株往往缺乏鸡胚生长适应性。为制备与流行株抗原性一致又具有良好的鸡胚生长特性的流感病毒疫苗株，需要通过遗传重组方法制备一个含有PR8病毒6个内部基因和流行株的HA、NA基因的重组病毒，该重组病毒具有与HA和NA基因供体毒株一致的抗原性，同时还具有PR8病毒的鸡胚高滴度生长特性。
流感病毒反向基因操作系统(reverse genetics system，RGS)是构建2∶6重组病毒疫苗株的直接、简单方法。流感病毒的RGS是指人工制造流感病毒的技术系统，其基本原理是将病毒基因组cDNA 8个片段的mRNA和vRNA转录质粒共同转染导入适当细胞系，分别在细胞内DNA依赖的聚合酶□聚合酶□的作用下，合成PB1、PB2、PA和NP的mRNA和病毒基因组所有RNA片段，前者指导合成病毒聚合酶系统和NP蛋白并与病毒基因组RNA结合形成核蛋白复合体(RNP)后启动病毒的复制，制造出完整的病毒粒子。
利用这一技术，在细胞转染过程中，用流行株的HA和NA基因cDNA的mRNA-vRNA双向转录质粒替换PR8病毒的HA、NA基因cDNA的mRNA-vRNA双向转录质粒，与PR8的6个内部基因cDNA的mRNA-vRNA双向转录质粒共同转染合适的细胞系，可在48小时之内救获(rescue)含有PR8病毒6个内部基因和流行株的HA、NA基因的重组病毒。
利用RGS可构建分子修饰致弱的禽流感病毒疫苗株。9-11日龄鸡胚尿囊腔繁殖的禽流感病毒尿囊液是生产禽流感灭活苗的原材料。高致病力H5亚型禽流感病毒(AIV)可在24小时之内致死鸡胚，尿囊液病毒含量极低，不利于疫苗生产。禽流感病毒的致病力与其表面结构蛋白HA基因裂解位点的氨基酸序列密切相关，低致病力AIV的HA裂解位点只有一个碱性氨基酸—精氨酸(R)，高致病力AIV的HA裂解位点含有连续多个碱性氨基酸。利用PCR突变法缺失AIV的HA裂解位点与致病力相关的连续多个碱性氨基酸编码序列，并用其替换野生HA基因的cDNA mRNA-vRNA双向转录质粒进行病毒救获，可获得对鸡胚无致死能力的低致病力疫苗株。美国学者构建了97香港H5亚型人流感病毒HA基因分子修饰致弱的冷适应重组病毒和鸡胚高滴度适应重组病毒。
本发明是一株对鸡及鸡胚无致病力、具有鸡胚高滴度适应性、适合H5亚型禽流感防制的H5亚型禽流感病毒疫苗株。我们以RT-PCR扩增技术及PCR突变技术、流感病毒RGS技术获得一株人工制造的分子修饰致弱的H5N1亚型重组禽流感病毒。该病毒具有我国H5亚型禽流感病毒流行株特有的抗原性；与我国流行的H5亚型禽流感流行株均为高致病力不同，本发明的病毒株被彻底致弱，对鸡及鸡胚无致死能力；同时，本病毒具有良好的鸡胚生长特性，是良好的疫苗生产用毒株。
2.本发明的人工重组的H5N1亚型流感病毒以我国第一株H5N1亚型禽流感病毒GD/96为HA基因供体制造的重组病毒，保持了我国H5亚型禽流感病毒特有的抗原性。H5N1亚型禽流感病毒自1996年在我国广东省出现后，近年来在我国大范围流行，给我国养禽业发展带来很大危害。我们已分离鉴定了近200株流行株，对鸡均呈高致病力；虽然遗传演化分析发现不同时期和不同地区分离株基因组有较大变异，但HA基因却相对保守，均源自GD/96。因此，本发明Re-1作为疫苗株，对我国H5亚型禽流感具有良好的抗原针对性。
3.本发明的人工重组的H5N1亚型流感病毒为一株分子修饰致弱的H5亚型重组流感病毒，对鸡及鸡胚无致病能力。现行使用的禽流感疫苗均为鸡胚繁殖的全病毒灭活疫苗，疫苗质量与病毒抗原含量直接相关。自然分离的H5亚型禽流感病毒接种鸡胚后在24小时内致死鸡胚，使病毒繁殖受限，尿囊液中病毒滴度很低，只有浓缩才可制备出合格的疫苗产品；另外，由于其为高致病力毒株，疫苗生产及废物处理不当导致的散毒有可能导致周边禽类暴发禽流感。由于缺失了野毒HA裂解位点与致病力相关的碱性氨基酸序列，并含有鸡胚高滴度适应株PR8的6个内部基因，本发明的人工重组的H5N1亚型流感病毒在48小时之内不致死鸡胚，病毒生长滴度与野毒相比，可提高10倍左右，以此为疫苗株生产疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量，同时对环境安全。
本发明的具体实施方式：
实施例1：
人工重组的H5N1亚型流感病毒即人工制造的H5亚型重组流感病毒A/哈尔滨/Re-1/2003(H5N1)，株号简称为Re-1，保藏号为CCTCC-V200312，具有H5亚型高致病力禽流感病毒A/鹅/广东/1/96(H5N1)的血凝素(HA)基因，但HA裂解位点氨基酸序列为-RETR-；具有流感病毒A/Hongkong/486/97(H5N1)的神经氨酸酶(NA)基因和A/PR/8/34(H1N1)的PB2，PB1，PA，NP，M和NS共6个内部基因。
上述的人工制造的H5亚型重组流感病毒A/哈尔滨/Re-1/2003(H5N1，具典型的低致病力H5亚型禽流感病毒分子特征；对鸡及鸡胚无致病力，具有高度鸡胚适应性。
一种上述的人工制造的H5亚型重组流感病毒A/哈尔滨/Re-1/2003(H5N1，在防治动物H5亚型流感的疫苗上的应用。
具体制作过程为：
1.以我国H5亚型高致病力禽流感病毒早期分离株A/鹅/广东/1/96(GD/96)株RNA为模板，以两对引物分别扩增HA的HA1和HA2两个片段，两对引物序列分别为：
5′-GCGCGCGGATCCTCTTCGAGCAAAAGCAGGGG/5′-TAGTCCTCGAGTCTCTCTTTGAGG和
5′-GCGAGACTCGAGGACTATTTGGAG/5′-GCGCGCAAGCTTATTAACCCTCACTAAAAGTAGAAACAAGGGTGTT.
HA1片段用BamHI和XhoI，HA2分别用XhoI和Hind III酶切后，共同插入BamH I和Hind III酶切的pUC18质粒中。该质粒中插入的HA基因与野生基因不同，其HA裂解位点的氨基酸序列已由-RERRRKKR-突变为-RETR-，后者为典型的H5亚型低致病力禽流感病毒HA分子特征1。2.以上述重组质粒为模板，利用一对引物5′-AGCAAAAGCAGGGG/5′AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAATT PCR扩增的HA全长cDNA，并插入含有RNA聚合酶I，聚合酶II启动子的RNA双向转录载体pBD的SapI位点，插入基因与调控元件相对顺序为：聚合酶II启动子序列→聚合酶I终止序列→病毒cDNA全序列(起始密码→终止密码)→聚合酶II多聚A信号序列→聚合酶I启动子序列。
3.RT-PCR扩增H5N1亚型流感病毒A/Hongkong/486/97的NA基因全基因cDNA，按上述方法插入pBD中。
4.RT-PCR扩增流感病毒高滴度鸡胚适应株A/PR/8/34株的6个内部基因PB2，PB1，PA，NP，M及NS基因全基因cDNA，分别按上述方法插入pBD中。
5.利用脂质体转染法将上述8个基因的双向表达质粒同时导入单层的293T细胞，48-72小时后收获细胞及上清，接种9-11日龄鸡胚尿囊腔，48-72小时后收获尿囊液并检测血凝(HA)活性。HA阳性样品即为救获的H5亚型低致病力重组病毒，命名为A/Harbin/Re-1/2003，株号为Re-1。
6.RT-PCR扩增救获病毒基因组8个片段，全基因组序列分析确证其6个内部基因源自PR8株，HA基因为HA1-HA2裂解位点4个碱性氨基酸缺失、1个碱性氨基酸突变后的GD/96HA基因，NA基因源自A/Hongkong/486/97株。
7.对鸡胚及鸡致病力检验：以0.1ml 104倍稀释的病毒鸡胚尿囊腔培养液接种9-11日龄鸡胚尿囊腔，48小时之内不致死接种鸡胚。以10倍稀释的病毒尿囊腔培养液0.2ml/只的剂量静脉注射10只4周龄SPF鸡，10日内没有鸡只发病和死亡。
本产品是一株人工制造的分子修饰致弱的H5N1亚型重组流感病毒A/Harbin/Re-1/2003，(Orthomyxoviridae---influenza virus A and B---H5N1subtype influenza virus)，株号为Re-1，保藏号为CCTCC-V200312。它是利用反向基因操作技术人工制造的含有特殊性状的重组流感病毒，即以克隆并经过分子修饰的禽流感病毒和人流感病毒基因组cDNA为病毒基因组负链RNA和信息mRNA的复制模板，通过体外细胞转染技术人工制造的重组禽流感病毒。该病毒是致弱的、基因组杂交重组的H5N1亚型禽流感病毒，其对鸡及鸡胚无致死能力，鸡胚生长滴度较高，具有与我国流行的H5亚型禽流感病毒相同的抗原性，是理想的H5亚型禽流感疫苗株。
Claims (2)
1.一种人工重组的流感病毒，其特征是：株号简称为Re-1，保藏号为CCTCC-V200312，具有H5亚型高致病力禽流感病毒A/鹅/广东/1/96H5N1的血凝素HA基因，但HA裂解位点氨基酸序列为-RETR-；具有流感病毒A/Hongkong/486/97(H5N1)的神经氨酸酶NA基因和A/PR/8/34 H1N1的PB2，PB1，PA，NP，M和NS共6个内部基因。
2.根据权利要求1所述的人工重组的流感病毒，其特征是：具典型的低致病力H5亚型禽流感病毒分子特征；对鸡及鸡胚无致病力，具有高度鸡胚适应性。
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