CN102526718B - 一种重组h5n1禽流感病毒细胞苗及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物传染病技术领域。具体涉及一种重组H5N1禽流感病毒细胞苗及应用。重组H5N1禽流感病毒细胞苗包含重组H5N1禽流感病毒rC4/W1株，该rC4/W1株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：V201029，该重组H5N1禽流感病毒rC4/W1株的基因组中含有如SEQ ID NO：1-8所示的禽流感病毒的8个相关基因的片段。利用反向遗传学方法拯救出重组H5N1禽流感病毒，将该重组病毒在MDCK细胞上传代至稳定并将其灭活后作为油乳灭活苗。本发明以H9N2禽流感病毒为背景，换入H5N1亚型的禽流感病毒HA和NA基因，重组病毒所有基因片段均来自禽流感病毒，具有更好的安全性。重组H5N1禽流感病毒能在MDCK细胞上传代培养，获得高增殖滴度的毒株，克服了禽流感爆发时大量鸡胚的短缺问题。

Description

一种重组H5N1禽流感病毒细胞苗及应用

技术领域

本发明涉及动物传染病技术领域。具体涉及一种重组H5N1禽流感病毒细胞苗及应用。 

背景技术

禽流感(Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。自1878年意大利首先发现至今，世界各地都有特定毒株引起的禽流感爆发和流行。高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI)呈世界性分布，危害极大，其爆发常是毁灭性的，国际兽疫局将其划定为A类传染病，并被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。尤其是香港1997年和东南亚2003-2004年出现的H5N1亚型禽流感病毒直接感染并致死人的事件，引起了世人的震惊和关注。我国自1996年首次报道分离到H5N1亚型高致病性禽流感病毒之后，其流行一直呈一种上升趋势；2005年至2006年5月间，我国已经出现了H5N1亚型禽流感病毒感染人的病例18例，其中12人死亡。目前，世界上已经有50多个国家和地区出现了HPAI，HPAI已经成为制约全球经济发展和威胁人类和动物健康的重大传染病。 

全群扑杀和生物安全防护是及时扑灭和控制高致病性禽流感的主要措施。但是，对于养殖管理水平参差不齐的东南亚各国，疫苗免疫接种可能是防止禽流感疫情大范围流行的最经济的方法。但是采用传统方法构建H5亚型禽流感疫苗株的操作比较困难，流感病毒反向遗传学操作技术为禽流感疫苗的研制提供了新的技术手段。目前我国禽流感H5N1亚型商品疫苗主要是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的Re-4，Re-5株，这种疫苗是利用人流感病毒A/PR/8/34H1N1为背景制备的人流感病毒和H5N1禽流感病毒的重组体，利用鸡胚增殖。因此，其对人存在着安全问题；同时，如果禽流感爆发流行，鸡胚短缺，这种疫苗的生产将面临资源短缺问题。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，获得一种安全性更好的重组H5N1禽流感病毒细胞苗。 

实现本发明的技术方案如下所示： 

一种具有免疫原性的重组H5N1禽流感病毒细胞苗，它包含有来自禽流感病毒的8个相关基因片段，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1-8所示，将所述的8个基因片段分别克隆至转录/表达载体PHW2000上，构建出8个质粒，将所述的8个质粒共转染293T细胞，得到重组H5N1禽流感病毒株rC4/W1，所述的重组H5N1禽流感病毒株rC4/W1保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2010年11月9日；其保藏编号为：CCTCC NO：V201029。 

具体地本发明的技术方案是：通过合成H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004的ΔHA基因(切割位点改为低致病性禽流感病毒HA基因的切割位点)和NA基因到转录/表达载体PHW2000上，构建禽流感病毒H9N2亚型A/duck/Hubei/W1/2004(Xu，X.等，2008)的6个内部基因的载体PHW-PB2，PHW-PB1，PHW-PA，PHW-NP，PHW-M，PHW-NS，利用反向遗传学 技术拯救出重组H5N1禽流感病毒，将重组病毒在MDCK细胞上传代至稳定并将其灭活后作为油乳灭活苗检测其免疫原性。 

与现有技术相比，本发明的有益效果是： 

1、本发明利用禽流感病毒H9N2作为背景，换入禽流感病毒H5N1亚型的HA和NA基因，这样的重组病毒得到所有基因片段都来自禽流感病毒，因而具有更好的安全性。 

2、重组H5N1禽流感病毒在MDCK细胞上传代适应，获得了在MDCK细胞上高增殖滴度的毒株，这样更有利于克服禽流感爆发时大量鸡胚的短缺问题。 

更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1-8是本发明克隆的8个禽流感病毒的基因片段的核苷酸序列，其中SEQ ID NO：1-6是禽流感病毒H9N2的基因序列，SEQ ID NO：7-8是禽流感病毒H5N1的基因序列。 

序列表SEQ ID NO：9是本发明中质粒PHW2000的序列。 

图1：是H9N2病毒6个基因PCR扩增片段琼脂糖凝胶电泳图。 

图2：是本发明使用的PHW2000载体质粒图谱。 

图3：是禽流感H9N2病毒PB2基因克隆到PHW2000的示意图。 

图4：是本发明所采用的拯救策略。 

图5：是拯救病毒的血凝结果。 

图6：是细胞苗免疫鸡的抗体变化规律曲线图。 

具体实施方式

实施例1：禽流感病毒相关基因的克隆 

1、禽流感病毒RNA的提取 

参照OMEGA 

Bioteck RNA-SOLV 

Reagent RNA Isolation Solvent的试剂盒的说明书提取禽流感病毒RNA。具体方法如下：取H9N2亚型禽流感病毒株A/duck/Hubei/W1/2004(Xu，X.等，2008)的新鲜尿囊液300μL，加入到装有1000μL RNA-Solv的焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的1.5mL EP管中，上下颠倒混匀，室温放置8min，加入200μL氯仿，冰浴10min，4℃12000r/min离心15min，取上清500-600μL移入另一EP管，加等体积异丙醇，混匀，室温下放置10min，在室温12000r/min离心10min，弃上清，加1mL 80％浓度的乙醇，涡旋混匀，室温7000r/min离心5min，吸弃乙醇，将EP管置于超净工作台上风干，最后将RNA沉淀溶于10-20μL用DEPC处理的无RNA酶的双蒸水中，置-80℃保存备用。 

2、引物设计合成 

参考E.Hoffman(E.Hoffman，2000)等设计的用来扩增所有A型流感病毒全长基因的通用引物序列，扩增8个全长基因片段的特异性引物，引物合成由上海生物工程有限公司完成，所用的引物对的核苷酸序列如下所示： 

反转录引物Uni12 primer：5’AGCAAAAGCAGG3’ 

扩增PB2基因的引物对： 

P1 5’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTC 3’ 

P2 5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT 3’ 

扩增PB1基因的引物对： 

P3 5’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGCA 3’ 

P4 5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT 3’ 

扩增PA基因的引物对： 

P5 5’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAC 3’ 

P6 5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT 3’ 

扩增NP基因的引物对： 

P7 5’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTA 3’ 

P8 5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT 3’ 

扩增M基因的引物对： 

P9 5’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG 3’ 

P10 5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 3’ 

扩增NS基因的引物对： 

P11 5’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG 3’ 

P12 5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’ 

3、病毒RNA的反转录 

在20μl反转录体系中进行，依次加入以下组分：AMV Reverse Transcriptase XL(购自宝生物工程(大连)有限公司)1.0μl，RNase free H2O 1.0μl，RNase inhibitor(宝生物工程(大连)有限公司)0.5μl，5×AMV Buffer 4.0μl，dNTP 2.0μl(10mmol)，Uni12 primer2μl(10pmol)，溶于焦碳酸二乙酯水中的禽流感病毒RNA模板10.5μl，混匀后置PCR仪上42℃60min进行反转录反应，反应产物直接用于PCR或4℃保存备用。 

4、禽流感病毒cDNA的PCR扩增 

在PCR反应管中加入反转录产物2μl，primerstar Taq DNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)1μl，primerstar PCR Buffer 5μl，dNTPS Mixture(各10mM)2μl，各基因的上下游引物各2.5μl，最后用RNase freed H2O将终体积调至50μl，混匀后于PCR仪上进行扩增。PCR扩增程序为预变性94℃5min，变性94℃20sec，退火58℃30sec，延伸72℃5min，运行30个循环，最后于72℃后延伸10min。同时设无模板的阴性对照。反应结束后，PCR产物各取5μl，在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳分析，剩余的回收。 

5、PCR产物的回收 

电泳结束后在紫外光下从凝胶上切下目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用DNA快速回收试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)回收DNA。具体方法如下：切下目的DNA回收片段，放入一无菌的1.5mL的EP管中，加入500-750μL Binding Buffer，于50-60℃水浴5min，其间轻弹EP管，使凝胶完全溶化。然后将溶化的液体转至一回收柱，于室温静置2min，8000r/min，离心1min，倒掉收集管中的废液，用500μL Washing solution 8000r/min，离心 1min，洗两次；最后12000r/min离心15s，将回收柱转至一干净的1.5mL EP管中，加10-20μL ddH2O洗脱，于室温放置5min，12000r/min离心1min，收集管中即为回收的DNA片段。 

6、连接反应 

回收的PCR产物直接连接到pMD18-T(购自宝生物工程(大连)有限公司)，连接体系和反应如表1： 

表1PCR产物连接体系 

7、连接产物的转化 

取新鲜的感受态细胞DH5α(购自北京全式金生物技术有限公司)100μl加入到1.5mlEP管中，将步骤6的连接产物10μl加入EP管中并混匀。置冰上30min后，42℃热激90sec，冰浴3min-5min。加入400μl LB，于37℃200rpm振荡培养45min使其复苏。复苏后的细菌悬液于4℃5000rpm离心10min，弃去400μl上清，用剩余的100μl重悬沉淀涂布于含有100μg/ml Amp的LB琼脂平板。37℃正置1h，再将平板翻过来，倒置37℃培养14h-16h至菌落出现。 

8、PCR鉴定阳性克隆 

PCR筛选阳性克隆的程序如下：取灭菌的0.5ml的EP管8～12个，依次在每管中加入30μl的灭菌双蒸水。用接种环刮取平皿上的单个的菌落，轻轻晃动接种环使菌体悬浮在双蒸水中。每个样品无菌取10μl菌体悬液储存4℃以备进一步扩大培养用，剩余的20μl沸水浴10min，12000rpm离心5min取上清5μl作为PCR模板。PCR扩增出预期目的片段的样品，取其相应的菌体悬液扩大培养，大量制备质粒用做下一步的转染。用于鉴定的PCR的程序与扩增该基因的程序相同，其PCR体系如表2： 

表2PCR筛选阳性克隆的体系 

9、序列测定和分析 

将步骤8筛选的阳性克隆按每个基因选择4个送到上海生工生物工程有限公司进行序列 测定。用常用的互联网上的软件DNAStar4.0对测序的序列进行分析。 

10、质粒的小提 

采用质粒提取试剂盒EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(购自北京全式金生物技术有限公司，按照该试剂盒的说明书操作)，具体步骤如下： 

(1)将步骤8鉴定正确的阳性克隆分别接种于含有氨苄青霉素的3ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。 

(2)将菌液转入1.5ml离心管内，于4℃10000xg离心1min，弃上清，再将剩余的1.5ml菌液重复离心，倒立离心管于吸水纸上，使液体流尽。 

(3)加入250μl无色溶液RB(上述北京全式金生物技术有限公司的试剂盒自带，含RnaseA)，涡旋使菌体充分悬浮，再加入250μl蓝色溶液LB，反复颠倒离心管4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的液体。 

(4)加入350μl黄色溶液NB，轻轻混合5-6次，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置两分钟。 

(5)15000xg离心5min，吸取上清到吸附柱中。 

(6)15000xg离心1min，弃流出液。 

(7)加入650μl溶液WB，15000xg离心1min，弃流出液。 

(8)15000xg离心1-2min，彻底去除残留的WB。 

(9)将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μl EB或去离子水，室温静置1min。 

(10)10000xg离心1min，洗脱DNA，洗脱出的DNA于-20℃冰箱保存备用。 

11、PHW系列重组质粒的构建 

用BsmB I(Esp3 I)消化连接到pMD18-T中6个片段的重组质粒，回收目的片段与经Esp3I消化的载体PHW2000(美国威斯康星大学兽医学院Webster R G教授馈赠，质粒图谱如图2所示)进行连接并转化DH5α(具体步骤和5-7相同)。其中，PB2和PB1基因内部包含BsmBI的酶切位点，所以用BsmB I消化之后产生了两个片段，将两个片段回收后同时与载体PHW2000进行连接(图3，以PB2基因为例)，虽然连接效率与单一的外源片段相比有所下降，但是仍然获得了全长的正确的克隆。用PCR的方法对每个片段的转化子进行筛选获取PHW系列的重组质粒。 

质粒PHW-ΔHA和PHW-NA由上海捷瑞生物工程有限公司按照我们提供的毒株A/chicken/Hubei/327/2004(H5N1)的ΔHA基因(切割位点改为低致病性禽流感病毒HA基因的切割位点)和NA基因的序列合成并克隆到转录/表达载体PHW2000上(见图2所示)。 

12、结果 

(1)H9N2病毒6个基因的RT-PCR扩增 

用步骤2中列出6对引物(P1-P12)扩增PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因，该6个基因的预期大小为依次2.3kb、2.3kb、2.3kb、1.5kb、1.0kb和0.9kb，结果获得了相应大小的PCR产物(图1所示) 

(2)H9N2病毒6个基因的序列分析 

PB2基因的4个阳性克隆的测序结果完全一致，不同的克隆间没有出现碱基的突变或缺失。PB2基因全长2341个核苷酸，编码759个氨基酸(见SEQ ID NO：1所示)。 

PB1基因的4个阳性克隆有3个测序结果完全一致，在1738位的碱基是G，有1个克隆在此处的碱基是A，再与GeneBank中20个同源性较最高的序列比对发现，1738位均为G，因而认为1738位的T为PCR引入的突变。PB1全长2341个核苷酸，编码757个氨基酸(见SEQ ID NO：2所示)。 

PA基因的4个阳性克隆的测序结果完全一致，全长2233个核苷酸，编码716个氨基酸(见SEQ ID NO：3所示)。 

NP基因的4个阳性克隆的测序结果完全一致，全长为1565个核苷酸，编码498个氨基酸(见SEQ ID NO：4所示)。 

M基因的4个cDNA克隆的测序结果完全一致，全长为1027个核苷酸，分别编码M1和M2两个蛋白。M1全长759个核苷酸，编码252个氨基酸；M2全长291个核苷酸，编码96个氨基酸(见SEQ ID NO：5所示)。 

NS基因的4个cDNA克隆的测序结果完全一致，全长为1027个核苷酸，分别编码NS1和NS2两个蛋白。NS1全长654个核苷酸，编码217个氨基酸；NS2全长327个核苷酸，编码108个氨基酸(见SEQ ID NO：6所示)。 

上述6个基因片段从PB2到NS的GeneBank的登陆号依次为：DQ465397，DQ465398，DQ4653999，DQ465401，DQ465403和DQ465404。 

实施例2：重组H5N1禽流感病毒的拯救及生物学特性 

1、去内毒素质粒的提取 

按照OMEGA公司提供的试剂盒Endo-free Plasmid Mini Kit II的步骤提取(按该试剂盒的说明书操作)，具体步骤如下： 

(1)将带有目的质粒(PHW-PB2，PHW-PB1，PHW-PA，PHW-NP，PHW-M，PHW-NS，PHW-ΔHA和PHW-NA)的大肠杆菌接种于装有5ml LB/氨苄青霉素的10-20ml的培养管，37℃搖床培养12-16h，以扩增质粒。用一个10-20ml培养管或培养瓶，其体积至少有培养基的4倍。 

(2)取5.0ml的菌液，于室温下10,000xg离心1min以沉淀菌种。 

(3)倒出或吸出上述LB培养基，弃去。往沉淀中加入250μl Solution I/RNaseA混和液(上述试剂盒Endo-free Plasmid Mini Kit II自带)，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮(细胞沉淀的完全重悬对于获得高的产量是十分重要的)。 

(4)往步骤3的重悬混和液中加入250μl Solution II，轻轻颠倒混匀7-10次。如有必要，可把裂解液置于室温静置2min，避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA断裂而使得到的质粒纯度降低。裂解反应不要超过5min。 

(5)向步骤4的混和液中加入125ul冰浴Buffer N3，并温和地上下颠倒离心管数次混匀，直至形成白色絮狀沉淀。 

(6)室温下，12000xg离心10min。 

(7)小心将上清倒入干净的1.5ml离心管中，加入0.1倍体积的ETR溶液(蓝色)至上清液中，颠倒试管7-10次，然后于冰浴中静置10min。 

注意：在加入ETR溶液后，裂解液可能出现浑浊，但冰浴后将逐渐转为澄清。 

(8)将上述裂解液于42℃下静置5min。裂解液又将再次出现浑浊。此时，立即于25℃12,000xg离心3min，ETR溶液将在试管底部形成蓝色分层。 

(9)将上清液移至另一新的1.5ml离心管中，加入1/2倍体积室温的无水乙醇，轻轻颠倒试管6-7次，室温放置1-2min。 

(10)取一干净的HiBind Mini Columns(I)装在一个2ml收集试管上(已备)。小心吸出上清，取700ul样品溶液将其转至于柱子內，于室温下10,000xg离心1min，使裂解液完全流过柱子(HiBind DNA柱子一次最多能装700ul溶液)。 

(11)加500ul Hbbuffer，10,000xg离心1min，弃掉废液。 

(12)加700ul Wash solution buffer，10,000xg离心1min，弃掉废液。 

(13)重复步骤12一次。 

(14)12,000xg离心2min. 

(15)加50ul Elution buffer，37℃温箱放置5min，10,000xg离心1min。 

2、脂质体介导的转染 

于转染前24h准备好转染用细胞。按设计组合的8个质粒(PHW-PB2，PHW-PB1，PHW-PA，PHW-NP，PHW-M，PHW-NS，PHW-ΔHA，PHW-NA)，各取1μg均匀混合，稀释至150μl无血清培养基OPTI-MEM(购自GIBCO公司公司)中。将16μl lipofectin转染试剂(购自Invitrogen公司)按说明书稀释到150μl无血清培养基OPTI-MEM中，室温放置5min，然后将稀释的lipofectin缓慢滴加至混合质粒中，轻轻吹吸10余次，充分混匀，室温结合30min，同时设缺失一个质粒PB1的对照。将6孔组织培养板中已培养约18-24h，80％-90％丰度、分布均匀、生长状况好的293T细胞(购自湖北省武汉市武汉大学内的中国典型物保藏中心)。用无血清、无抗生素的OPTI-MEM洗2次后，最后加入500μl OPTI-MEM覆盖于细胞上；加入质粒与lipofectin的结合物，使其均匀覆盖于细胞上，在37℃，5％CO2培养箱中吸附6-8h，换入含10％血清的OPTI-MEM 1ml，30h后加入含终浓度为2.5μg/mlTPCK-胰酶的无血清OPTI-MEM 1ml，60-72h后小心吹落细胞，与上清一起收集。 

3、拯救病毒的增殖及检测 

将转染后收集的细胞及上清以0.3ml/胚的量接种9-11日龄SPF鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，每个样品接种2个胚。置33-35℃培养，每日观察鸡胚死亡情况，适时收集鸡胚尿囊液进行病毒血凝鉴定。 

4、小鼠的毒力实验 

将本发明的重组H5N1禽流感病毒rC4/W1株做10倍连续稀释，然后用乙醚将小鼠麻醉，以50μl剂量通过滴鼻途径攻毒小鼠，每个稀释度感染4只小鼠，攻毒后每天观察并记录小鼠死亡情况至两周。 

5、鸡的静脉接种指数实验 

将重组H5N1禽流感病毒rC4/W1株尿囊液用灭菌生理盐水稀释10倍，将此稀释病毒液以0.1ml/羽静脉接种10只6周龄SPF鸡，接种24小时后观察鸡只的临床症状10天。每次观察后作如下记录：鸡只正常，标记为0；如发病，则标记为1；严重发病，则标记为2；死亡则记为3。 

6、试验结果 

(1)拯救病毒的血凝结果见图5。图3A是8质粒拯救病毒的血凝价，为2⁹，B为7质粒拯救(缺PB1)作为阴性对照。 

(2)重配毒的小鼠的半数致死量为10^7.0EID₅₀，是低致病性流感病毒。 

(3)重配毒的静脉接种指数为0，是低致病性流感病毒。 

实施例3：重组H5N1禽流感病毒细胞苗的制备及应用 

1、重组H5N1禽流感病毒rC4/W1株在MDCK细胞上的增殖 

将重组H5N1禽流感病毒rC4/W1株以10²TCID₅₀的剂量感染长成单层的MDCK细胞(购自湖北省武汉市武汉大学内的中国典型物保藏中心)上，孵育1小时后用DMEM培养基(购自GIBCO公司)洗两遍，加入2ml含传代将含2.5μg/mlTPCK-胰酶(购自上海生工生物工程有限公司)的DMEM培养，在37℃，5％CO₂培养箱培养72小时。一直传代至血凝价达到1∶1028为止。 

2、重组H5N1禽流感病毒rC4/W1株的灭活及乳化 

在步骤1得到的重组H5N1禽流感病毒rC4/W1加入0.8％的甲醛溶液，在37℃灭活48小时，用鸡胚盲传两代确定灭活的病毒灭活彻底。将灭活的病毒与白油按1∶1的体积比进行乳化。 

3、免疫原性实验 

将20只SPF鸡(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)分为两组，一组只免疫一次，另一组在免疫一次后第2周加强免疫一次。每次免疫的剂量为0.5ml本发明的禽流感H5N1细胞苗胸部肌肉注射。免疫后每周采血测抗体变化规律，共检测4个月。 

4、试验结果 

(1)重组H5N1禽流感病毒rC4/W1在MDCK细胞上传代13次，使血凝价达到1∶1028。 

(2)抗体变化规律见图6所示。由图6，免疫一次的试验组，免疫后的抗体水平在第4周达到峰值并维持在较高水平上，在第16周时抗体仍维持在2⁶以上。免疫两次的试验组，免疫后抗体水平比一免试验组的抗体水平要高，在第16周时抗体仍维持在2⁷以上，说明本发明的重组禽流感H5N1细胞苗免疫效果良好，抗体水平高，持续时间长。 

主要参考文献 

1、Hoffmann E，Stech J，Guan Y，Webster RG，Perez DR.(2001)Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses.Arch Virol.146：2275-2289。 

2、Xu，X.J.Xu，G.Y.Zhou，H.B.Yu，Z.J.Zhang，A.D.Song，Y.F.Jin，M.L.Chen，H.C.2008.Evolutionary characterization of influenza virus A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2)isolated from central China.Virus Genes.36：79-83.)。 

Claims (2)

1.一种具有免疫原性的重组H5N1禽流感病毒细胞苗，其特征在于，它包含重组H5N1禽流感病毒rC4/W1株，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：V201029，在所述的重组H5N1禽流感病毒rC4/W1株的基因组中含有如序列表SEQ ID NO：1-8所示的禽流感病毒的8个基因片段。

2.一种具有免疫原性的重组H5N1禽流感病毒rC4/W1株，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：V201029。

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