CN102220293B

CN102220293B - 犬流感重组病毒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102220293B
Application number: CN2011101395283A
Authority: CN
Inventors: 李泽君; 滕巧泱; 张旭; 周洁文
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2011-05-26
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2031-05-26
Also published as: KR20140031912A; CA2837126A1; WO2012159522A1; CN102220293A; EP2716752A1; US20140286979A1; EP2716752A4; JP2014516530A

Abstract

本发明公开一种犬流感重组病毒，该重组病毒包含：ZJCIV犬流感病毒的HA和NA基因、以及PR8病毒的PA、PB1、PB2、M、NP和NS六个内部基因。本发明还公开了犬流感重组病毒的制备方法及应用。本发明的犬流感重组病毒，在鸡胚和MDCK细胞上均能产生很高的病毒滴度和血凝滴度，可作为研制犬流感疫苗的优良种毒。

Description

犬流感重组病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种犬流感重组病毒及其制备方法和应用。

背景技术

A型流感病毒是一类威胁人类健康的重要传染病。流感病毒具有严格的宿主特异性，即便是相同病毒在不同的宿主上的传播也受到宿主界限制。早在2004年，美国首次报道H3N8亚型犬流感病毒引起犬流感的大爆发，通过序列分析，发现该亚型的犬流感病毒是从马流感病毒衍变而来的。随后，澳大利亚发生马流感后也爆发犬流感病毒。2008年，韩国爆发了由H3N2亚型犬流感病毒引起的犬流感，通过序列分析，发现H3N2亚型的犬流感病毒是禽源的，不同于欧美国家的马源犬流感病毒。

2006-2007年间，中国华南地区发病犬体内分离获得数株H3N2亚型犬流感病毒，通过序列分析，发现这些病毒与韩国分离到病毒高度同源。对华南地区宠物狗的血清进行调查发现，6.7％的狗血清呈流感阳性。2010年，本实验室从华东地区也分离获得一株犬流感病毒，命名为A/canine/Zhejiang/01/2010(H3N2亚型，简称ZJCIV)。对ZJH3病毒的全基因组序列分析发现，该病毒与华南及韩国H3N2犬流感病毒高度同源。动物感染实验发现ZJH3病毒可以感染狗，并可以引起犬发病，表现为食欲下降、高热、咳嗽和鼻腔中排出脓性分泌物等症状，解剖后发现肺淤血、出血，肺泡中充满炎性渗出物。

2009年6月，Intervet公司研究成功犬流感病毒灭活苗，在美国已经上市，但是我国流行的犬流感病毒与美国流行的犬流感病毒抗原性差别很大，二者起源于不同的H3流感病毒分支。因而，研制针对我国犬流感病毒流行株的灭活疫苗，对于犬流感的预防控制具有重要的实际意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种犬流感重组病毒，其包含犬流感病毒ZJCIV的HA和NA基因、以及PR8病毒的6个内部基因，该重组病毒能制成更适用于亚洲地区的犬流感病毒灭活苗。

此外，还需要提供一种上述犬流感重组病毒的制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种犬流感重组病毒，该重组病毒包含：ZJCIV犬流感病毒的HA和NA基因、以及PR8病毒的PA、PB1、PB2、M、NP和NS六个内部基因，

所述犬流感病毒HA基因的核苷酸序列选自：

(1)编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)编码与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；

所述犬流感病毒NA基因的核苷酸序列选自：

(1)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)编码与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。

优选的，所述犬流感病毒HA基因具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，或者所述犬流感病毒HA基因具有与SEQ ID NO.3所示核苷酸序列具有98％以上同源性的序列。

优选的，所述犬流感病毒NA基因具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，或者所述犬流感病毒NA基因具有与SEQ ID NO.4所示核苷酸序列具有98％以上同源性的序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述犬流感重组病毒的制备方法，包括以下步骤：

构建分别包含ZJCIV犬流感病毒HA基因和NA基因的重组质粒；

将所述HA基因的重组质粒和NA基因的重组质粒，与分别包含PR8病毒PA、PB1、PB2、M、NP、NS内部基因的六个质粒一起转染293T细胞，培养转染后的细胞；

将培养的细胞上清接种于鸡胚，在孵化器内培养合适时间后，收获鸡胚尿囊液，检测该尿囊液的血凝性，如果有血凝活性，并且经过序列分析确定没有非预期突变后，即获得犬流感重组病毒。

优选的，将培养的细胞上清接种于9-11日龄鸡胚，在37℃孵化器内培养48-72小时后，收获鸡胚尿囊液。

所述重组质粒采用PBD载体作为空载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述犬流感重组病毒在制备预防或治疗犬流感的病毒灭活疫苗中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种流感疫苗，该疫苗以上述犬流感重组病毒为种毒而制成。

本发明犬流感重组病毒，在鸡胚和MDCK细胞上均能产生很高的病毒滴度和血凝滴度，可作为研制犬流感疫苗的优良种毒。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1犬流感病毒ZJCIV的HA和NA的RT-PCR电泳图；

图2是本发明实施例3救获的重组病毒和ZJCIV接种鸡胚后不同时间的血凝效价图；

图3是本发明实施例3救获的重组病毒和ZJCIV在鸡胚上生长曲线比较图；

图4是本发明实施例3救获的重组病毒和ZJCIV接种MDCK细胞后不同时间的血凝效价图；

图5是本发明实施例3救获的重组病毒和ZJCIV在MDCK细胞上生长曲线比较图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

犬流感病毒灭活疫苗研制的重要前提之一是有优良的种毒，本实验室之前分离到的A/canine/Zhejiang/01/2010病毒(H3N2亚型，简称ZJCIV)无论在鸡胚上还是在细胞上扩增后，血凝滴度均非常低。为此，本发明将ZJCIV犬流感病毒主要的抗原蛋白HA、NA基因与PR8病毒其余六个内部基因重组在一起，通过流感病毒的反向遗传操作系统救获一株在鸡胚和细胞均能产生很高的病毒滴度和血凝滴度的犬流感重组病毒，该重组病毒可作为研制犬流感疫苗的优良种毒。

实施例1重组质粒的构建与鉴定

1、PCR扩增

用Trizol(Invitrogen)抽提犬流感病毒ZJCIV的总RNA。采用Reverse TranscriptionSystem kit反转录试剂盒(TakaRa)，根据其说明书，用12bp引物5’-AGCAAAAGCAGG-3’为特异性引物，合成cDNA第一链。以获得的cDNA的第一链为模板，用sapI-HA-up、sapI-HA-down和sapI-NA-up、sapI-NA-down为上下游引物(含有BspQI酶切位点，如表1)，分别扩增出片段ZJCIV的HA和NA。PCR扩增程序为94℃预变性5min，进入以下循环，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min45s，运行30个循环，最后再72℃延伸10min。同时设无模板的阴性对照。反应结束后，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳实验。结果所图1所示，有两条PCR的条带出现，大小分别约为1700bp的HA和1400bp的NA，目的片段大小相符。

在图1中，M：DNA分子量标准；1：ZJCIV HA PCR产物；2：ZJCIV NA PCR产物。

表1A型流感病毒HA和NA基因的通用引物

引物名称	引物序列
		sapI-HA-up	CACACAgctcttctattAGCAAAAGCAGGGG(SEQ ID NO.5)
sapI-HA-down	CACACAgctcttcggccAGTAGAAACAAGGGTGTTTT(SEQ ID NO.6)
		sapI-NA-up	CACACAgctcttctattAGCAAAAGCAGGAGT(SEQ ID NO.7)
sapI-NA-down	CACACAgctcttcggccAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT(SEQ ID NO.8)

2、PCR产物的割胶回收

电泳结束后在紫外光下从凝胶上切下目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用DNA快速回收试剂盒回收DNA。具体方法如下：在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，放入一无菌的1.5ml的EP管中，加入3倍凝胶体积(100mg＝100ul体积)的Buffer DE-A(凝胶液)，混合均匀后于75℃加热，间断混合(2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)。加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B(结合液)，混合均匀；当回收的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。将混合液转移到DNA制备管中，12000×g离心1min，倒掉收集管中的废液。将制备管置回收集管中，加入500ul Buffer W1(洗涤液)，12000×g离心30s，倒掉收集管中的废液。将制备管置回收集管中，加入700ulBuffer W2(去盐液)，12000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，以同样的方法再洗一次。将制备管置回收集管中，12000×g空离1min。最后将制备管置于洁净的1.5ml EP管中，在制备膜中央加入30ul的去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA，置于-20℃保存备用。

3、酶切、连接及转化

纯化的PCR产物和PBD载体(本实验室保存)在BspQI限制性内切酶(NEB)的作用下，按照说明书，在50℃温育1个小时。用胶回收试剂盒回收目的片段与PBD质粒的酶切产物，加入1ul的T4连接酶的缓冲液和1ul T4连接酶(TakaRa)，连接的反应体系为10ul，混匀。16℃过夜连接。连接产化转化于感受态细胞JM109(本实验室制备)，并在无菌条件下超净台中涂布于含Amp的LB固体培养基上，37℃培养8-20h。

4、重组质粒的鉴定

挑取LB固体培养基上的单个菌落，放入加有约3ml含Amp的LB液体培养基的试管中，然后固定在摇床上37℃振荡培养10h，也可过夜。将菌液用碱性抽提法抽提的质粒，用PCR方法进行验证。鉴定为阳性的质粒进行序列测定，用DNAstar序列分析软件比对。结果发现，重组质粒PBD-ZJCIVHA和PBD-ZJCIVNA构建成功，HA基因序列如SEQ ID NO.3所示，NA基因序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例2重组PR8病毒的拯救

1、转染质粒准备

用超纯质粒抽提试剂盒(OMEGA)抽提质粒，操作步骤如下：1)用接种环蘸取保存甘油菌(含质粒PBD-ZJCIVHA、PBD-ZJCIVNA、PBD-PR8M、PBD-PR8PB1、PBD-PR8PB2、PBD-PR8PA、PBD-PR8NS、PBD-PR8NP，后六个质粒为实验室保存)，在含Amp LB平板表面划线，37℃静置过夜；2)挑取单菌落，接种到5ml Amp LB培养基中，37℃振荡培养至OD600值为1.0-1.5；3)收集3ml过夜培养物，离心彻底去除培养基；4)悬浮菌体：用0.25ml含RNase A的溶液SolutionI悬浮菌体，直至成匀浆状；5)裂解细菌：再加入0.25ml溶液SolutionII，颠倒5次以轻轻混匀；6)中和：加入0.125ml溶液Buffer N3，立刻颠倒5次以轻轻混匀，直至形成白色絮状沉淀，室温12,000×g，离心10min；7)小心将上清倒入干净的1.5ml离心管中，加入0.1倍体积的ETR Solution(蓝色)至上清液中，颠倒7-10次，然后冰浴10min；8)加入42℃水浴5min，再次混浊，室温12,000×g，离心3min，ETR溶液将在离心管底部形成一个蓝色分层；9)上清移入到新的1.5ml离心管中，加0.5倍体积的无水乙醇，颠倒6-7次，室温放置1-2min；10)上述混合液倒入一个事先用2ml溶液E4平衡好的HiBand DNAMini柱，放在一个2ml的收集管上，室温10,000×g，离心1min，使裂解液流过柱子；11)弃去收集管中的液体，将剩余的混合液加入到柱子中，室温10,000×g，离心1min，使裂解液完全通过柱子；加入500ul Buffer HB到柱子上，室温下10,000离心1min，洗涤柱子，确保除去残余的蛋白质，以得到高质量的DNA；12)弃液体，用700ulDNA Wash buffer洗涤柱子，室温下10,000×g，离心1min，弃去液体；13)重复，再加DNA Wash buffer；14)弃液体，空转，室温12,000×g离心2min，去液体；15)把柱子置于一个干净的1.5ml离心管中，加入30-50ul的无内毒素洗脱液到柱子上，室温静置2min，室温12,000×g离心1min以洗脱DNA，可洗两次；16)电泳检测，并用Nanodrop 2000c紫外可见光分光光度计测量OD₂₆₀、OD₂₈₀，估算DNA含量与纯度。结果：获得了足量的转染所需质粒。

2、转染293T细胞

将上述超纯度抽提的质粒，包括PBD-ZJCIVHA、PBD-ZJCIVNA、PBD-PR8M、PBD-PR8PB1、PBD-PR8PB2、PBD-PR8PA、PBD-PR8NS和PBD-PR8NP，通过适量的脂质体2000共转染于3.5cm直径的293T细胞中。转染后6h，弃去细胞上清，加入2ml OPTI-MEM(Invitrogen)培养液，并放于37℃的CO₂培养箱中培养72h。

3、拯救获得重组的PR8病毒

转染48h后的细胞上清，接种于9-11日龄SPF鸡胚(北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，用石蜡封口后置于37℃孵化器内培养。48-72h放入4℃过夜，取出，收获鸡胚尿囊液。尿囊液用血凝试验测定有无凝集活性。结果：尿囊液能使红细胞凝集，表明已成功拯救出一株含ZJCIV HA和NA基因的PR8重组病毒。

4、重组病毒的鉴定

用Trizol抽提重组病毒的尿囊液总RNA，并用12bp引物反转录，获得cDNA第一链。以cDNA第一链为模板，用sapI-HA-up、sapI-HA-down和sapI-NA-up、sapI-NA-down为上下游引物，PCR扩增ZJCIV HA和NA片段，并用1％琼脂糖电泳鉴定。此外，将ZJCIV HA和ZJCIVNA PCR产物送公司测序。结果：在琼脂糖电泳胶上出现两条条段，大小分别约为1700bp和1400bp，与目的大小完全一致。测序结果也进一步证实PCR产物确实为ZJCIV HA和NA片段。

实施例3救获的重组病毒生长特性鉴定

1、救获的重组病毒和ZJCIV的EID₅₀测定

含病毒的鸡胚尿囊液按照10倍倍比稀释，将10^-6～10^-10各稀释度分别接种到5枚9-11日龄的SPF鸡胚中，37℃继续孵化48h。通过测定感染胚尿囊液的血凝活性来判断其是否感染，利用Reed-Muench法计算EID₅₀(鸡胚半数感染量)。结果：救获的重组病毒和ZJCIV的EID₅₀分别为10^7.5/100ul和10^6.5/100ul。

2、救获的重组病毒和ZJCIV的TCID₅₀测定

从1∶10^-3开始10倍稀释，把不同稀释度的重组病毒和ZJCIV接毒于长满单层MDCK细胞的48孔板中，接毒的过程：先用PBS清洗MDCK细胞两遍，然后在每一孔加入100ul病毒，每个稀释度做3个重复，把48孔板放入37℃CO₂培养箱让病毒吸附到细胞上，其中每过20min左右摇晃一次细胞，1.5h-2h后把细胞培养板中的病毒弃掉，用PBS清洗细胞两次，然后加入无血清培养基300ul。吸附了病毒的细胞在CO₂培养箱继续培养72h，然后测定每一个孔的血凝活性，利用Reed-Muench法计算TCID₅₀(组织细胞半数感染量)。结果：救获的重组病毒和ZJCIV的TCID₅₀分别为10^6.5/100ul和10^5.5/100ul。

3、救获的重组病毒和ZJCIV在鸡胚上生长特性比较

救获的重组病毒和ZJCIV稀释为100EID₅₀，按照这个稀释度分别接种18枚9-11日龄的SPF鸡胚。在接毒后6h，12h，24h，36h，48h，72h时，分别取出3枚接种过的SPF鸡胚，收集其尿囊液并测定它们的血凝效价(图2)。把收集的各个时间段的尿囊液，按10倍稀释，每个稀释度的病毒液接种3枚9-11日龄的SPF鸡胚，接毒量为100ul/枚。接毒后48h测定鸡胚尿囊液的血凝活性，计算不同时间收集尿囊液的病毒含量，并绘制病毒的生长曲线(图3)，比较救获的重组病毒和ZJCIV在鸡胚上的生长情况。结果如图2所示，接毒后12h内，ZJCIV和重组病毒的尿囊液均无血凝性。接毒后48h，重组病毒的血凝效价达到2¹¹，明显高于ZJCIV的血凝效价。如图3所示结果，ZJCIV和救获的重组病毒在接毒6h时，均未能检测到病毒。接毒12h后，救获的重组病毒病毒滴度明显高于ZJCIV，并于接毒48h后达到最高峰。

4、救获的重组病毒和ZJCIV在MDCK细胞上生长特性的比较

救获的重组病毒和ZJCIV稀释为100TCID₅₀，按照这个稀释度各接种3瓶MDCK细胞长至80％的T25细胞瓶。在接毒后6h，12h，24h，36h，48h，72h时，分别收集其细胞上清并测定它们的血凝效价(图4)。滴定各个时间收集的细胞上清中的病毒含量，具体如下：把收集的细胞上清按10倍稀释，每个稀释度的病毒液接种3孔在24孔细胞板上长至80％的MDCK细胞，接毒后48h测定血凝活性，计算各个时间收集的细胞上清中的病毒含量(TCID₅₀)，根据此TCID₅₀绘出病毒的生长曲线(图5)，比较救获的重组病毒和ZJCIV在MDCK细胞上的生长情况。结果如图4所示，接毒后12h内，ZJCIV的细胞上清无血凝活性，而重组病毒的细胞上清有血凝活性，并在接毒后36h达到高峰，随后趋于相对稳定。在整个感染过程中，重组病毒血凝活性明显高于ZJCIV的血凝活性。如图5所示，ZJCIV和救获的重组病毒在接毒6h时，未能检测到病毒，接毒后12h，救获的重组病毒就可以检测到，而ZJCIV直到接毒后24h才能检测到。接毒后36h，重组病毒和ZJCIV的病毒滴度达到高峰，随后便开始下降。在整个细胞感染过程中，重组病毒的病毒滴度明显高于ZJCIV的病毒滴度。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>犬流感重组病毒及其制备方法和应用

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>471

<212>PRT

<213>Canine influenza virus

<400>1

Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Ala Ile Gly Ser Val Ser Leu Thr

1 5 10 15

Ile Ala Thr Val Cys Phe Leu Leu Gln Ile Ala Ile Leu Ala Thr Thr

20 25 30

Val Thr Leu Tyr Phe Lys Gln Asn Glu Cys Asn Ile Pro Ser Asn Ser

35 40 45

Gln Val Val Pro Cys Lys Pro Ile Ile Ile Glu Arg Asn Ile Thr Glu

50 55 60

Val Val Tyr Leu Asn Asn Thr Thr Ile Glu Lys Glu Lys Glu Ile Cys

65 70 75 80

Ser Val Val Leu Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gln Ile

85 90 95

Thr Gly Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala

100 105 110

Gly Gly Asp Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro

115 120 125

Ser Lys Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn

130 135 140

Lys His Ser Asn Gly Thr Ile His Asp Arg Ile Ser His Arg Thr Leu

145 150 155 160

Leu Met Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val

165 170 175

Cys Ile Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu

180 185 190

His Val Cys Val Thr Gly Asp Asp Arg Asn Ala Thr Ala Ser Phe Val

195 200 205

Tyr Asn Gly Met Leu Val Asp Ser Ile Gly Ser Trp Ser Gln Asn Ile

210 215 220

Leu Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr

225 230 235 240

Val Val Met Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Arg Ala Asp Thr Arg Ile

245 250 255

Leu Leu Ile Arg Glu Gly Lys Ile Val His Ile Ser Pro Leu Ser Gly

260 265 270

Ser Ala Gln His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Asn

275 280 285

Val Arg Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Val

290 295 300

Ile Asp Ile Asn Met Ala Asp Tyr Ser Ile Asp Ser Ser Tyr Val Cys

305 310 315 320

Ser Gly Leu Val Gly Asp Thr Pro Arg Asn Asp Asp Ser Ser Ser Ser

325 330 335

Ser Asn Cys Arg Asp Pro Asn Asn Glu Arg Gly Asn Pro Gly Val Lys

340 345 350

Gly Trp Ala Phe Asp Asn Glu Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile

355 360 365

Ser Arg Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val Ile Gly Gly

370 375 380

Trp Thr Thr Ala Asn Ser Lys Ser Gln Val Asn Arg Gln Val Ile Val

385 390 395 400

Asp Asn Asn Asn Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly

405 410 415

Lys Ser Cys Val Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Gly

420 425 430

Pro Gln Glu Thr Arg Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe

435 440 445

Cys Gly Thr Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala

450 455 460

Asn Ile Asn Phe Met Pro Ile

465 470

<210>2

<211>566

<212>PRT

<213>Canine influenza virus

<400>2

Met Lys Thr Val Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Ala Phe Gly

1 5 10 15

Gln Asn Leu Pro Gly Asn Glu Asn Asn Ala Ala Thr Leu Cys Leu Gly

20 25 30

His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asp Asp

35 40 45

Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Pro Thr

50 55 60

Gly Lys Ile Cys Asn Asn Pro His Lys Ile Leu Asp Gly Arg Asp Cys

65 70 75 80

Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Val Phe Gln

85 90 95

Asn Glu Thr Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Asn Ala Phe Ser Asn

100 105 110

Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Ile Val

115 120 125

Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Thr Glu Gly Phe Thr Trp Ala

130 135 140

Gly Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Gly Ala Cys Lys Arg Gly Pro Ala

145 150 155 160

Asn Gly Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Gly Asn Thr

165 170 175

Tyr Pro Val Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Asn Asn Phe Asp Lys

180 185 190

Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asn Gln Glu Gln Thr

195 200 205

Ser Leu Tyr Ile Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Arg Arg

210 215 220

Ser Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Leu Val Arg

225 230 235 240

Gly Gln Ser Gly Arg Ile Ser Val Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly

245 250 255

Asp Val Leu Val Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly

260 265 270

Tyr Phe Lys Met His Ile Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala

275 280 285

Pro Ile Asp Thr Cys Ile Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile

290 295 300

Pro Asn Glu Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Ile Thr Tyr Gly Ala

305 310 315 320

Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met

325 330 335

Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

340 345 350

Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly

355 360 365

Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys

370 375 380

Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Met

385 390 395 400

Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser

405 410 415

Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Arg Tyr Val Glu Asp Thr

420 425 430

Lys Val Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu

435 440 445

Asn Gln Asn Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe

450 455 460

Glu Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn

465 470 475 480

Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Glu Ser

485 490 495

Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asn Ile Tyr Arg Asp Glu Ala Val

500 505 510

Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys

515 520 525

Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys

530 535 540

Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Arg Gly Asn Ile

545 550 555 560

Arg Cys Asn Ile Cys Ile

565

<210>3

<211>1701

<212>DNA

<213>Canine influenza virus

<400>3

atgaaaactg ttattgcttt aagctacatt ttctgcctgg cttttggtca gaatcttcca 60

ggaaatgaaa ataatgctgc aacactatgc ctgggacatc atgcagtgcc gaacgggaca 120

atagtgaaaa ctatcacaga cgatcaaatt gaggtgacca acgccaccga gctagtccaa 180

aactccccaa cagggaaaat atgcaacaat ccccacaaga ttcttgatgg gagggactgc 240

acactaatag atgccctact aggggacccg cactgtgacg tcttccaaaa tgagacatgg 300

gacctttttg tggaacgaag caatgctttt agcaattgtt acccttatga tgtaccagac 360

tatgcatccc ttcgatccat agttgcatca tcaggcacat tggagttcat cactgaaggt 420

ttcacttggg caggagtaac tcaaaatgga ggaagcggtg cttgtaaaag gggacctgct 480

aatggtttct tcagtagatt gaattggtta actaagtcag gaaatacata tccagtgttg 540

aatgtgacta tgccaaacaa taacaatttc gacaaattat acatttgggg agttcatcac 600

ccaagcacta atcaagaaca aaccagcctg tatattcagg cctcaggaag agtcacagtc 660

tctaccagga gaagccaaca gaccataatc ccaaacattg gatctagacc cttggtaagg 720

ggccaatctg gcagaataag cgtatattgg acaatagtca aacctggaga cgtactggta 780

ataaacagta atggaaacct aatcgctcct cgaggctact tcaaaatgca cattgggaaa 840

agctcaataa tgagatcaga tgcgcctatt gacacctgca tttccgaatg tatcactccg 900

aacgggagca tccccaatga aaagcccttc caaaatgtga acaagatcac atacggagca 960

tgtcccaaat atgttaagca aaacaccttg aaactggcaa caggaatgcg gaatgtccct 1020

gagaggcaaa ccagaggcct gttcggcgca atagcaggct tcatagaaaa tggatgggaa 1080

gggatggtag acggttggta tggcttcagg caccaaaatt ccgaaggtac aggacaagca 1140

gcagacctta aaagcactca ggcagccatt gaccagatta atgggaaatt gaacagaatg 1200

attgaaaaaa cgaatgagaa gttccatcaa atcgaaaagg agttttccga agtagaaggg 1260

aggattcaag accttgagag atacgttgaa gacacaaaag tagatctttg gtcttacaat 1320

gccgagcttc ttgttgcttt agaaaaccag aacacaattg atttaactga ttcagaaatg 1380

aacaaattgt ttgaaaagac taggaggcaa ttgagggaaa atgctgaaga catgggcaat 1440

ggctgcttca agatatacca caagtgtgac aatgcttgca tagaatcgat tagaaacgga 1500

acttatgacc ataacatata tagagatgag gcagtgaaca atcggttcca gatcaaaggt 1560

gttgagctaa agtctggata caaagactgg atcttgtgga tttcctttgc catatcatgc 1620

tttttgcttt gtgttgtctt gctgggtttc attatgtggg cctgccagag aggcaacatt 1680

aggtgcaaca tttgcatttg a 1701

<210>4

<211>1416

<212>DNA

<213>Canine influenza virus

<400>4

atgaacccaa atcaaaagat aatagcaata ggttctgtct ctctaaccat tgcaacagta 60

tgtttcctct tgcagattgc catcctagca acaactgtga cactgtactt caagcaaaat 120

gaatgcaaca tcccctcgaa cagtcaagta gtgccatgta aaccaatcat aatagaaagg 180

aacataacag aggtagtata tttgaataat actaccatag aaaaagaaaa agaaatttgt 240

tccgtagtgc tagaatacag gaactggtcg aaaccgcagt gtcaaattac aggatttgct 300

cctttctcca aggacaactc aatccgactc tccgctggtg gggacatttg ggtaacaagg 360

gaaccttatg tgtcatgcga ccccagcaaa tgttatcagt ttgcacttgg gcaggggacc 420

acgctgaaca ataaacactc aaacggcaca atacatgata ggatctctca tcgaactctt 480

ttaatgaatg agttgggtgt tccgtttcat ttgggaacca aacaagtgtg catagcatgg 540

tccagttcaa gttgtcacga tgggaaagca tggttacatg tttgtgtcac tggggatgat 600

agaaatgcga ctgctagttt cgtttataat ggaatgcttg ttgacagtat tggttcatgg 660

tctcaaaata tcctcagaac tcaagagtca gaatgcgttt gcatcaatgg aacttgtaca 720

gtagtaatga ctgatggaag tgcatcagga agggctgata ctagaatact actcatcaga 780

gaggggaaaa ttgtccatat tagcccattg tcagggagtg ctcaacatat agaggaatgt 840

tcctgttatc ctcgatatcc aaatgttaga tgtgtttgca gagacaattg gaagggctct 900

aataggcccg ttatagatat aaatatggca gattatagca tcgattccag ttatgtgtgt 960

tcaggacttg ttggcgatac accaaggaat gatgatagct ctagcagcag taactgcagg 1020

gatcctaata atgagagagg gaatccagga gtgaaagggt gggcctttga taatgagaat 1080

gacgtttgga tggggaggac aatcagcaga aatttgcgct caggttatga gactttcaag 1140

gtcattggtg gctggaccac tgctaattcc aagtcacagg tcaatagaca agtcatagtt 1200

gacaataata actggtctgg ttattctggt attttctccg ttgaaggcaa aagctgtgtt 1260

aataggtgtt tttatgtaga gttgataaga ggagggccac aagagactag agtatggtgg 1320

acttcaaata gcattgtcgt attttgtggt acttctggta cctatggaac aggctcatgg 1380

cctgatgggg cgaatatcaa cttcatgcct atataa 1416

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(31)

<223>引物

<400>5

cacacagctc ttctattagc aaaagcaggg g 31

<210>6

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(37)

<223>引物

<400>6

cacacagctc ttcggccagt agaaacaagg gtgtttt 37

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(32)

<223>引物

<400>7

cacacagctc ttctattagc aaaagcagga gt 32

<210>8

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(38)

<223>引物

<400>8

cacacagctc ttcggccagt agaaacaagg agtttttt 38

Claims

1.一种犬流感重组病毒，其特征在于，该重组病毒包含：ZJCIV犬流感病毒的HA和NA基因、以及PR8病毒的PA、PB1、PB2、M、NP和NS六个内部基因，所述犬流感病毒HA基因为编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；所述犬流感病毒NA基因为编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的犬流感重组病毒，其特征在于，所述犬流感病毒HA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的犬流感重组病毒，其特征在于，所述犬流感病毒NA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

4.一种权利要求1所述犬流感重组病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建分别包含ZJCIV犬流感病毒HA基因和NA基因的重组质粒；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒采用PBD载体作为空载体。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将培养的细胞上清接种于9-11日龄鸡胚，在37℃孵化器内培养48-72小时后，收获鸡胚尿囊液。

7.权利要求1所述犬流感重组病毒在制备预防或治疗犬流感的病毒灭活疫苗中的应用。

8.一种流感疫苗，其特征在于，以权利要求1所述犬流感重组病毒为种毒而制成。