CN1263848C - 人工重组的h9n2亚型流感病毒及其应用 - Google Patents
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Abstract
人工重组的H9N2亚型流感病毒及其应用。本发明涉及一种人工重组的H9亚型流感病毒A/哈尔滨/Re-2/2003(H9N2)，人工重组的H9亚型流感病毒A/哈尔滨/Re-2/2003(H9N2)，其特征是：具有与H9N2亚型禽流感病毒A/鸡/广西/10/99(H9N2)的HA和NA基因以及流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS，保藏号CCTCC-V200311。该病毒用作防治动物和人类H9N2亚型流感的疫苗。
Description
技术领域：
本发明涉及一种人工重组的H9亚型流感病毒A/哈尔滨/Re-2/2003(H9N2)，及其该病毒在防治动物和人类H9N2亚型流感的疫苗方面的应用。
背景技术：
禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)是禽类及一些哺乳动物的呼吸系统疾病的重要病原。AIV在分类学上属于：病毒界(Vira)----正粘病毒科(Orthomyxoviridae)----流感病毒属(Influenza Virus A and B)----禽流感病毒(avian influenza virus)。
根据表面蛋白抗原性不同，禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)被分为15个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA)亚型，H9N2亚型AIV 1966年首次在美国的火鸡中首次出现，近10年在世界范围内的野禽和家禽中广泛分布和流行。1998年在香港近首次从猪中分离该亚型病毒，1999年从香港2个患儿的体内分离到2株H9N2亚型流感病毒，标志该亚型禽流感病毒具有巨大公共卫生意义。自1996年以来，我国养禽业一直受到H9亚型禽流感的困扰。鸡胚生产的全病毒灭活疫苗在养禽业的应用使该病的控制取得了较好的效果。但由于现地分离的野毒株鸡胚适应性较差，致使现行使用的疫苗存在成本高、疫苗免疫期短等缺点。
发明内容：
本发明的目的是提供一种人工重组的H9N2亚型流感病毒，按照病毒命名规则命名为人工重组的H9亚型流感病毒A/哈尔滨/Re-2/2003(H9N2)，及其该病毒在防治动物和人类H9N2亚型流感的疫苗方面应用。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
人工重组的H9N2亚型流感病毒，具有与H9N2亚型禽流感病毒A/鸡/广西/10/99(H9N2)的HA和NA基因以及流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS，保藏号CCTCC-V200311。
上述的人工重组的H9N2亚型流感病毒，对我国流行的H9N2禽流感病毒具有广泛的交叉免疫性，具有高滴度鸡胚适应性，对鸡及鸡胚无致病力。
上述的人工重组的H9N2亚型流感病毒在防治动物和人类H9N2亚型流感的疫苗方面的应用。
这个技术方案有以下有益效果：
1.流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(PR8)是实验室鸡胚适应株，即该病毒可在鸡胚内生长至很高滴度，这种鸡胚适应性由病毒的6个内部基因决定。另外，当两个流感病毒共同感染一个细胞或鸡胚时，可发生基因互换，从而产生新的基因重组病毒。因此，通过遗传重组方法，可将PR8病毒6个内部基因和流行株的HA、NA基因的进行重组而获得一个新的重组病毒，该重组病毒具有与HA和NA基因供体毒株一致的抗原性，同时还具有PR8病毒的鸡胚高滴度生长特性。
2.本发明人工重组的H9N2亚型流感病毒以我国禽流感病毒GX/99为HA和NA基因供体，因此，该病毒与我国目前流行的大多数H9N2亚型禽流感病毒抗原性一致。以此为疫苗株生产的疫苗，将对绝大多数H9N2亚型禽流感病毒流行株产生良好的交叉保护性。
3.本发明人工重组的H9N2亚型流感病毒含有鸡胚高滴度适应株PR8的6个内部基因，病毒生长滴度与野毒相比，可提高10倍左右，以此为疫苗株生产疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量。
本发明的具体实施方式：
实施例1：
人工重组的H9N2亚型流感病毒即人工重组的H9亚型流感病毒A/哈尔滨/Re-2/2003(H9N2)，具有与H9N2亚型禽流感病毒A/鸡/广西/10/99(H9N2)的HA和NA基因以及流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS，保藏号CCTCC-V200311。
上述的人工重组的H9N2亚型流感病毒，对我国流行的H9N2禽流感病毒具有广泛的交叉免疫性，具有高滴度鸡胚适应性，对鸡及鸡胚无致病力。
一种上述的人工重组的H9N2亚型流感病毒在防治动物和人类H9N2亚型流感的疫苗方面的应用。
本发明为一株人工制造的H9N2亚型重组流感病毒A/哈尔滨/Re-2/2003(株号Re-2)，该病毒HA和NA基因来自H9N2亚型禽流感病毒A/鸡/广西/10/99(GX/99)，6个内部基因来自PR8病毒；该病毒与我国H9N2亚型禽流感病毒流行株抗原性一致，并且具有良好的鸡胚适应性；作为防制H9亚型动物流感的疫苗株。
本发明由以下具体步骤实现：
1.共感染-使两个病毒基因组发生重组：流感病毒A/PR/8/34(PR8)(H1N1)与经紫外线处理过的H9N2亚型AIV国内分离株A/鸡/广西/10/99(GX/99)共同接种10日龄鸡胚尿囊腔，35℃孵育24h。
2.抗体筛选-除去表面基因来源于PR8病毒的病毒：在上述特定的人工条件下收获的尿囊液50ul，与4倍比稀释的600ul抗PR8的血清混合，室温下孵育30分钟之后接种鸡胚尿囊腔，35℃孵育48h后，鸡胚尿囊液进行血凝活性检测，收获血清稀释度最低并且具有血凝活性的样品用于第二轮筛选。
3.稀释纯化-除去内部基因来源于GX/99病毒：同上方法筛选得到的病毒在鸡胚上进行3代有限克隆纯化，利用片段特异性引物RT-PCR鉴定并经过序列分析筛选HA和NA来自于GX/99、6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS来自PR8的重组病毒。
Claims (2)
1.一种人工重组的H9N2亚型流感病毒，其特征是：具有H9N2亚型禽流感病毒A/鸡/广西/10/99(H9N2)的HA和NA基因以及流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS，保藏号CCTCC-V200311。
2根据权利要求1所述的人工重组的H9N2亚型流感病毒，其特征是：对我国流行的H9N2禽流感病毒具有广泛的交叉免疫性，具有高滴度鸡胚适应性，对鸡及鸡胚无致病力。
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