CN102223895A - 生产pH稳定的包膜病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于生产pH稳定的包膜病毒的方法，其中所述病毒用于在低pH条件下感染宿主细胞及用于在低pH条件下与细胞培养细胞一起温育，以及通过这种方法可获得的流感病毒，其展现细胞培养中的高生长速率、升高的pH和温度稳定性且具有人类受体特异性。

Description

生产pH稳定的包膜病毒的方法

发明领域

本发明提供了一种用于生产pH稳定的包膜病毒的方法，其中所述病毒在低pH条件下与细胞培养细胞一起温育。此类病毒包括显示细胞培养中的高生长速率、升高的pH和温度稳定性且具有人类受体特异性的新型流感病毒。

发明背景

为了预防由一年一度的病毒感染流行引起的疾病，疫苗接种是最重要的公众健康措施。疫苗的有效供应依赖于快速生产大量疫苗原料(例如病毒)的能力。疫苗的快速开发及它们的丰富可得性在抗击许多人类和动物疾病中是至关重要的。疫苗生产的延迟和数量不足在解决疾病的爆发时会引起问题。

病毒(尤其是流感病毒)在含胚鸡蛋中的生长显示出导致流感病毒颗粒的有效生产，这可用于生产灭活的或活的减毒流感病毒疫苗株。虽然如此，最近几年，进行了深入的工作来建立使用细胞培养的病毒生产系统，因为基于蛋的方法需要特定的、无病原体的蛋的稳定供应，这在大流行的情况中会成问题。基于细胞的技术是一种不依赖蛋供应商且一获得种子病毒就能开始的替代生产工艺。除此之外，自在哺乳动物细胞中培养的病毒制备的灭活型流感疫苗显示出诱导比蛋培养的疫苗更多的交叉反应性血清抗体且揭示出更好的保护(Alymova et al.，1998，J Virol 72，4472-7)。此外，依照先前的结果，在含胚鸡蛋中生长之后，人类隔离群的受体特异性和抗原性特性发生改变(Mochalova et al.，2003，Virology 313，473-80；Romanova et al.，2003，Virology307，90-7)。

另一方面，病毒在组织培养中的多次扩增常常导致融合的pH升高的HA突变体(Lin et al.，1997，Virology 233，402-10)，这与病毒对热变性的稳定性降低有关(Ruigrok et al.，1986)。任何蛋白质的结构及它的稳定性基于非共价相互作用，像疏水力、范德华相互作用、氢键、和离子相互作用。已知在病毒适应细胞培养时出现的突变提高因HA分子中改变的离子相互作用和盐桥而降低的蛋白质稳定性诱导的融合的pH阈(Rachakonda et al.，2007，Faseb J 21，995-1002)。通常见于界面HA1-HA2或HA2-HA2区或HA2的N端中的失稳性突变继而可导致降低的对细胞表面受体的结合(Korte et al.，2007，Rachakonda et al.，2007，Faseb J 21，995-1002，Shental-Bechor et al.，2002，Biochim Biophys Acta 1565.81-9)，这导致活病毒制备物降低的病毒感染性和随后降低的免疫原性。

Massaab H.F.，Journal of Immunology.1969，102，pp.728-732使用不同遗传标志测试了在适应原代鸡肾组织培养和含胚蛋中的生长之前和之后冷适应流感病毒的生物学和免疫学特征。指出了与初始的“野生型”株相比这些株对低pH更加敏感，并显示了感染性和血细胞凝集产量的显著降低。

Fiszman et al，Journal of Virology，1974，13，pp.801-808检验了低pH(pH6.6)对水泡性口炎病毒(VSV)的影响，并显示了没有检测到病毒颗粒或核壳。Ackermann W and Massaab H.F.，Journal of Experimental Medicine FEB 1954，99，pp 105-117披露了病毒抑制剂α-氨基-p-甲氧基-苯基甲磺酸对流感病毒生长周期的影响。

由于难以自细胞培养大量获得具有高稳定性和免疫原性以避免任何安全性或供应问题的疫苗病毒制备物，本发明的一个目的是获取产生有效且稳定的病毒的工艺。通过提供本申请的实施方案，实现了该目的。

发明概述

本发明涉及在组织培养中生产pH稳定的包膜病毒的方法，其在稀释病毒悬液和感染宿主细胞期间采用了降低pH的条件。本发明的方法还提供了一种病毒，其与经当前使用的方法得到的病毒颗粒相比，稳定性和免疫原性升高。

附图简述

图1：Wisc.ΔNS1和Wisc.ΔNS1_HA2_G75R在雪貂中以6.0log TCID50/动物进行单次鼻内免疫接种后，比较免疫原性。

图2：

A)在小鼠模型中诱导血清抗体；

B)攻击病毒在免疫过的小鼠的肺和鼻甲中繁殖。

图3：

A.初始病毒和突变病毒的HA分子的序列比较。通过定点诱变，将两个核苷酸(aa)替换成(tt)，导致HA2亚基第58位的氨基酸K变成I。

B.VN1203和VN1203K58I病毒与人类红细胞的融合活性。

C.用VN1203和VN1203K58I病毒免疫接种后，小鼠鼻洗液中的IgA抗体滴度。

D.用VN1203和VN1203K58I病毒免疫接种后，小鼠血清中的HAI抗体滴度。

E.VN 1203和VN1203K58I病毒对小鼠的感染性。

图4：维也纳/28和维也纳/28_HA2_G75R病毒对低pH的敏感性。

发明详述

本发明涉及一种用于生产包膜病毒的方法，特征在于它包括下述步骤：

a)在具有介于5.2和5.9之间的，优选介于5.5和5.8之间的，最优选约5.6的pH的溶液中稀释病毒；

b)用至少一种感染性病毒颗粒感染宿主细胞，其中：其中i)将所述病毒颗粒添加至所述细胞；并ii)将所述细胞和所述病毒颗粒在介于5.2和5.9之间的，优选介于5.4和5.8之间的，最优选约5.6的pH温育以提供病毒/细胞复合物；

c)培养所述经过感染的宿主细胞以扩增病毒；

d)收获所述病毒；并任选

e)纯化和/或表征所述病毒。

通过实施方法获得的病毒可用于病毒的实验室规模量的生产以及疫苗病毒的大规模生产。

“大规模生产”意指最小培养体积至少200升，优选至少500升，优选约1000升的生产。

含有包膜病毒的疫苗制备物必须是有免疫原性的，以提供足够的疫苗接种。尤其，灭活型大流行流感疫苗(像针对禽流感的)可具有较低的免疫原性，而且在人类中引发保护性抗体应答需要较高剂量。有效的抗体应答提供至关重要的针对病毒感染的免疫力。血凝素(HA)蛋白是由流感病毒的病毒感染及由灭活型和活-减毒型流感疫苗的疫苗接种诱导的保护性抗体应答的主要靶物。HA抗原的结构完整性对于引发保护性抗体应答是至关重要的。

发明人显示了本发明的方法提供了具有pH稳定性和升高的免疫原性的病毒。如此生成的病毒颗粒的HA蛋白优选在低pH显示升高的稳定性。有利地，病毒还可在较高的温度显示升高的稳定性，具体是高至60℃的温度。这些病毒没有显著损失HA的血细胞凝集活性，甚至在升高的温度，像例如60℃保存数分钟至数小时时。“不显著”意味着血细胞凝集活性与源病毒相比的降低不到4倍。甚至在暴露于升高的温度之后，所述病毒在介于0℃和12℃之间的、优选4℃的温度保存数周至数月后保持稳定性。因此，依照本发明生成的病毒对于疫苗制备是高度有利的，因为所述病毒包含稳定的HA分子。

这种方法具体可用于负链RNA病毒，它们是一组动物病毒，包含数种重要人类病原体，包括流感、麻疹、腮腺炎、狂犬病、呼吸道合胞、埃博拉(Ebola)和汉坦病毒(hantavirus)。

这些RNA病毒的基因组可以是单分子的或区段化的，单链(-)极性的。这些病毒共享两项关键要求：基因组RNA必须有效拷贝成病毒RNA，即可用于掺入后代病毒颗粒的形式及转录成mRNA，其翻译成病毒蛋白质。真核宿主细胞通常不含用于复制RNA模板或用于自负链RNA模板翻译多肽的机制。因此，负链RNA病毒编码并携带RNA依赖性RNA聚合酶来催化新基因组RNA(供装配成后代)和mRNA(供翻译成病毒蛋白质)的合成。

为了传播病毒，基因组病毒RNA必须包装成病毒颗粒。装配期间发生的后代病毒颗粒装配和蛋白质/蛋白质相互作用的过程在RNA病毒内是相似的。病毒颗粒的形成确保了RNA基因组自一个宿主细胞高效传播至同一宿主或不同宿主生物体的另一个宿主细胞。

含有负链基因组的包膜单链RNA的病毒科被分成具有非区段化基因组的组(副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、纤丝病毒科(Filoviridae)和波尔那病病毒(Borna Disease Virus)、披盖病毒科(Togaviridae))或具有区段化基因组的组(正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、本扬病毒科(Bunyaviridae)和沙粒病毒科(Arenaviridae))。正粘病毒科包括甲型、乙型和丙型流感病毒，以及索哥托(Thogoto)和多理(Dhori)病毒和传染性鲑鱼贫血病毒。

优选的实施方案包括但不限于流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、新城病病毒(NDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、和副流感病毒(PIV)。

由含有单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心(螺旋状核壳)和内部以基质蛋白(M1)衬里的外部脂蛋白包膜组成。甲型流感病毒的区段化基因组由8个分子的线性、负极性、单链RNA组成，它们编码11种(有些甲型流感株是10种)多肽，包括：RNA依赖性RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核壳的核蛋白(NP)；基质膜蛋白(M1、M2)；两种自含脂包膜凸出的表面糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白(NS1)和核输出蛋白(NEP)。大多数甲型流感株还编码第11种认为具有促凋亡特性的蛋白(PB1-F2)。

基因组的转录和复制在核中进行，而装配经质膜上的出芽来进行。病毒在混合感染期间能重配基因。流感病毒经HA吸附至细胞膜糖蛋白和糖脂中的唾液酰寡糖。在对病毒体的内吞之后，细胞内体内发生HA分子的构象变化，这促进膜融合，如此触发脱壳。核壳迁移至核，在那里病毒mRNA转录。病毒mRNA被独特机制转录，其中病毒内切核酸酶自细胞异源mRNA切割带帽的5′-末端，然后充当病毒转录酶转录病毒RNA模板的引物。转录物在距它们模板末端15至22个碱基的位点处终止，其中oligo(U)序列起添加poly(A)串的信号的作用。在如此生成的八种病毒RNA分子中，六种是单顺反子信息，它们直接翻译成代表HA、NA、NP和病毒聚合酶蛋白PB2、PB1和PA的蛋白质。另两种转录物进行剪接，各自产生两种mRNA，它们翻译成不同读码框以生成M1、M2、NS1和NEP。换言之，八种病毒RNA区段编码十一种蛋白质：九种结构和两种非结构(NS1和最近鉴定的PB1-F2)蛋白。

病毒可选自天然存在株、变体或突变体；经过诱变的病毒(例如通过暴露于诱变剂、反复传代.基因和/或在非许可宿主中传代而生成的)；重配株(在区段化病毒基因组的情况中)；和/或遗传工程病毒(例如使用“反求遗传学”技术)，它们具有期望的表型。

术语“传代”定义为用指定病毒颗粒数接种宿主细胞并在指定天数(通常是2-3天)后收获所述病毒。病毒会具有大约2至4轮复制每天。

本领域公知，世界卫生组织(WHO)每年推荐为针对流感流行进行的一年一度的疫苗接种制备疫苗株中使用的野生型病毒。然后可以将这些株用于生产重配疫苗株，它们一般组合野生型病毒的NA和/或HA基因与自具有某些期望特征的供体病毒(常常称作主供体病毒或MDV)衍生的其余基因区段。例如，MDV株可以是冷适应的温度敏感的、减毒的、和/或具有高生长速率。

依照一个具体的实施方案，流感病毒是减毒型流感病毒。具体地，流感病毒在抑制宿主细胞的先天性免疫应答的病原性因子内包含删除或修饰。例如，减毒可衍生自冷适应病毒株或由于NS1基因内的删除或修饰(ΔNS1病毒)，如WO99/64571和WO99/64068中记载的，通过述及而完整收入本文。这些病毒是复制缺陷的，因为它们在动物的呼吸道中进行中断的复制。或者，病毒可包含PB1-F2基因的删除或修饰。

依照本发明，病毒可进一步在HA基因内包含提高HA分子的稳定性的修饰。例如，Steinhauer et al.，1991，PNAS.88：11525-1152鉴定了流感罗斯托克病毒(H7N1)HA2中的K58I突变负责与非突变型病毒相比降低的膜融化pH值。这暗示由酸性pH诱导的HA的构象变化在HA的突变形式中在与野生型病毒相比低0.7的pH发生。通过将这种突变引入X-31流感病毒(H3亚型)，显示了相同的效果。

术语“重配株(reassortant)”在提及病毒时指示病毒包括自超过一种亲本病毒株或来源衍生的遗传和/或多肽成分。例如，7∶1重配株包括7种自第一亲本病毒衍生的病毒基因组区段(或基因区段)和1种来自第二亲本病毒的补充性病毒基因组区段，例如编码血凝素或神经氨酸酶。6∶2重配株包括6种来自第一亲本病毒的基因组区段(最常见的是6种内部基因)和2种来自不同亲本病毒的补充性区段(例如血凝素和神经氨酸酶)。

具体地，流感病毒疫苗衍生自大流行间的或大流行的流感病毒株，例如H1、H3或B株。已经显示了这些株在依照本发明的方法生产时显示出大大升高的免疫原性。

在依照本发明的方法中可用于培养病毒的细胞可以是任何期望类型的，可以培养且可以被包膜病毒(具体是流感病毒)感染的细胞。具体地，它可以是BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、CHO细胞、COS细胞、鼠类细胞、人类细胞、HeLa细胞、293细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CEK(鸡胚肾)CEF(鸡胚成纤维细胞)、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC-PK细胞、PK15细胞、Wl-38细胞、MRC-5细胞、T-FLY细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0、PerC6(人类视网膜细胞)。

对于稀释病毒，可使用能提供所述pH值范围(具体是介于pH 5.2和5.9之间的，具体是介于5.4和5.8之间的)且对于细胞是生理性的任何缓冲液。例如，它可以是MES(2-(N-吗啉代-乙磺酸))缓冲液、柠檬酸缓冲液或乙酸缓冲液，具体是使用基于PBS的缓冲液。另外，可将成分添加至稀释溶液，例如盐，像氯化钠、磷酸氢二钠或磷酸二氢钾等。

术语稀释意指将病毒悬浮液稀释至足以对细胞进行生产性感染的病毒颗粒含量。

依照本发明的方法，用至少一种病毒颗粒感染适宜细胞。熟练技术人员能容易地确定充分感染所需要的病毒颗粒数。用病毒感染细胞可具体以约0.0001至10、优选0.001至0.5的m.o.i.(感染复数)进行。

任选地，稀释步骤期间在稀释溶液中和/或感染和/或培养期间可存在大环内酯多烯抗生素或衍生物。具体地，抗生素为两性霉素B或其衍生物。

具体地，可在感染之前，例如感染之前约60-30分钟，更优选感染之前30分钟添加大环内酯多烯抗生素。

用于病毒温育或培养的最佳抗生素浓度介于0.20和0.50μg/ml之间，具体是0.25μg/ml。

温育病毒使其结合细胞(尤其是细胞受体)的温度可介于20℃和38℃之间。温育的pH优选介于5.4和5.8之间。为了确定足以让病毒内化入细胞中的时间，可通过标准规程来监测病毒，像用染料标记或电子显微术。具体地，在室温，时间段介于至少5分钟和60分钟之间，优选介于20和60分钟之间。

可添加切割血凝素前体蛋白的蛋白酶，而且病毒内化入细胞中可依照本发明在用流感病毒感染细胞之前不久、同时或之后不久进行。如果添加是与感染同时进行的话，可将蛋白酶直接添加至待感染的细胞培养物，或例如作为与病毒接种体一起的浓缩物。蛋白酶优选为丝氨酸蛋白酶，特别优选胰蛋白酶。如果使用胰蛋白酶的话，培养培养基中添加的终浓度有利地为1至200μg/ml，优选5至50μg/ml，更优选5至30μg/ml。

感染后，进一步培养经过感染的细胞培养物以复制病毒，特别是直至能检测到最大细胞致病效应或最大量的病毒抗原。或者，可在培养期间的任何时间点收获。

用于培养宿主细胞的pH可以例如介于6.5和7.5之间。用于培养的pH取决于用于培养的宿主细胞的pH稳定性。这可通过在不同pH条件下测试宿主细胞的存活力来确定。

术语培养和扩增依照本发明具有相同含义。

对于培养，可用于培养细胞的任何培养基都是适宜的。具体地，培养基可以是SFM opti-pro^TM培养基，一种用于培养表达病毒的肾上皮及相关细胞的低蛋白质培养基。可在介于20和40℃之间、具体地介于30和40℃之间的温度培养细胞。

病毒可在宿主细胞中传代至少一代，但通常需要数代，例如至少三代。

依照该方法的一个具体实施方案，复制产生的流感病毒的收获和分离在感染后2至10天、优选3至7天进行。可通过本领域技术人员知道的方法自培养液分离及收获细胞或细胞残余物，例如通过分离器或滤器。此后，通过本领域技术人员知道的方法(诸如例如梯度离心、过滤、沉淀等等)来进行培养液中存在的流感病毒的浓缩。

发明人成功地显示了，在低pH条件下稀释包膜病毒和感染细胞产生显示在低pH的稳定性和升高的免疫原性的包膜病毒。这些病毒还可显示在升高的温度的稳定性和/或在细胞培养中的高生长速率和/或人类受体特异性。这是令人惊讶的，因为Scholtissek，1985.Archives Virol.，85：1-11显示了在低pH值，流感病毒的感染性不可逆地丧失。还指出在pH和热稳定性之间没有关联。

作为本发明的又一个实施方案，还提供了作为例如种子病毒有用的流感病毒或对于疫苗接种目的有用的病毒。所述流感病毒在升高的温度保留可检测的血细胞凝集活性，保留在5.4和5.8的pH范围稳定的感染性，在细胞培养中具有高生长速率及具有人类受体特异性。

“种子病毒”定义为用于接种细胞培养的病毒。

依照本发明的实施方案，可检测的血细胞凝集活性定义为与所使用的源病毒相比不超过4倍的血细胞凝集活性降低。源病毒可以是例如直接自鼻拭子分离的病毒。

依照又一个实施方案，可提供作为疫苗病毒有用的病毒。所述病毒颗粒在低pH是稳定的且显示出与通过已知细胞培养规程获得的病毒(例如来自Vero细胞、MDCK或MDBK细胞)相比相似或升高的免疫原性。具体地，病毒在细胞培养中显示与未曾暴露于依照本发明的方法的病毒相比升高的生长速率。

另外，病毒具有温度稳定性、且具有人类受体特异性。

温度稳定性依照本发明意指血细胞凝集活性在高至60°的温度长至15分钟的时间段没有显著降低。pH稳定性定义为病毒在5.6、优选介于5.4和5.8之间、优选介于5.2至5.9之间的pH的稳定性。高生长速率意指高至6 log TCID50/ml、优选7log TCID 50/ml以上的生长速率。

所述病毒可通过本申请所述方法来获得。所述病毒对于疫苗配制剂或治疗性配制剂特别有用。这些配制剂中所含的流感病毒可以是减毒型病毒或灭活型病毒。灭活可通过本领域已知的任何方法来实施，像用福尔马林或制造杀死型病毒疫苗中使用的其它试剂处理或用非离子型去污剂处理或暴露于UV光。包含流感病毒的制备物可通过任何路径来施用，像例如皮下、鼻内或肌肉内。

或者，含有流感病毒的制备物可进一步包含已知的药学可接受载体或佐剂来增强所施用制备物的免疫原性。

优选地，经粘膜(特别是经过鼻内应用)施用制备物，因为这些病毒因上文所列特征(即pH稳定性、温度稳定性、高生长速率和人类受体特异性)而具有高免疫原性。

包含这些特征的流感病毒之前未曾有记载或指明。

参照下面的实施例会更加全面地理解上述描述。然而，此类实施例仅仅代表实施本发明一个或多个实施方案的方法，不应解读为限制本发明的范围。

实施例

实施例1

通过反求遗传学构建了两种流感株，其携带来自流行株甲型/威斯康星/67/05(H3N2)的表面糖蛋白和来自WHO疫苗株IVR-116(甲型/新喀里多尼亚/20/99和甲型/波多黎各/8/34的重配株)的所有其它基因，以及缺少NS1可读框的NS基因(ΔNS1)。由于Vero细胞的不同传代条件，获得的病毒在HA分子的序列中相差一处氨基酸替代。第一种病毒，命名为Wisc.ΔNS1，它始终在Vero细胞上传代，且病毒接种物先用低pH缓冲液处理，即：

在补充有0.25μg/ml两性霉素B的MES感染缓冲液(0.1M MES，150mMNaCl，0.9mM CaCl₂，0.5mM MgCl₂；pH＝5.6)中稀释病毒至适宜moi。用感染缓冲液清洗Vero细胞，并将病毒接种物应用于细胞并温育30分钟。然后除去接种物，并在补充有0.25μg/ml两性霉素B和5μg/ml胰蛋白酶的无血清Opti-pro培养基中温育细胞。

这种方法导致临床拭子中找到的初始病毒HA序列被保持。第二种病毒通过标准方式在中性条件来扩增，并获得了HA2亚基中的一处替代，即G75R(表1)。表1显示了HA分子与拭子中存在的病毒的序列比较。

比较了在不同条件培养的两种病毒的HA核苷酸序列。病毒Wisc.ΔNS没有获得HA分子中的任何突变，而在病毒Wisc.ΔNS_HA2_G75R中鉴定出位于HA2亚基中的一处突变G75R。

表1：

接着，通过下面的方法比较了两种病毒针对低pH的稳定性。在pH范围5.6-7.5的感染MES缓冲液中稀释病毒以获得指定moi，并应用于Vero细胞，随后温育30分钟以容许病毒感染细胞。此后，除去接种物，将细胞于37℃温育4-9小时(取决于株)，然后固定，并通过免疫荧光来检测流感NP蛋白。

这项测试揭示了病毒Wisc.ΔNS1表现出在pH 5.6是稳定的，以与中性条件相同的效率感染细胞，而突变型病毒Wisc.ΔNS1_HA2_G75R在pH 5.6完全丧失感染细胞的能力，只在pH 5.8以与中性条件相同的效率感染细胞(结果未显示)。

剂量为6.0 log TCID50/动物的单次鼻内免疫接种后，在雪貂中比较了Wisc.ΔNS1和Wisc.ΔNS1_HA2_G75R病毒的免疫原性。获得的结果证明，根据HAI测试(GMT 202.9)的测量，具有完整HA序列的病毒Wisc.ΔNS1诱导比病毒Wisc.ΔNS1_HA2_G75R(GMT 27.9)显著更高的血清抗体滴度，(图1)。

实施例2

通过反求遗传学构建了两种H1N1流感株，其携带来自流行株甲型/布里斯班/59/07(H1N1)的表面糖蛋白和来自WHO株IVR-116的所有其它基因，与缺少NS1可读框的NS基因(ΔNS1)组合。获得的病毒在HA分子的序列中相差一处氨基酸替代，看来是由于Vero细胞的不同传代条件所致。第一种病毒，命名为布里斯班ΔNS1，在两性霉素B存在下在低pH条件传代。这种规程导致HA序列的保持，这表现为与来自临床样品的MDCK细胞中分离的病毒(第1代)的相似。

第二种病毒，命名为布里斯班ΔNS1_HA2_N16I，通过标准方法来传代，并获得了HA2亚基中的一处替代，即N16I(表2)。表2显示了HA分子的序列比较，与初始隔离群比较。

表2

比较了在不同条件培养的两种病毒的HA核苷酸序列。病毒布里斯班ΔNS没有获得HA分子中的任何突变，而在病毒布里斯班ΔNS_HA2_N16I中鉴定出位于HA2亚基中的一处突变N16I。

病毒对低pH的稳定性的比较揭示了病毒布里斯班ΔNS1表现为稳定的。在免疫荧光测定法中，在低至5.6的pH和pH 7.5观察到相同量的染色的Vero细胞。突变型病毒布里斯班ΔNS1_HA2_N16I不太稳定，只在pH 5.8感染细胞且在pH 5.6没有感染任何细胞。用与pH 5.6的缓冲液组合的病毒感染的细胞看不到任何免疫荧光信号(结果未显示)。

给小鼠单次鼻内免疫接种剂量为5.6 log TCID50/动物的病毒后，比较了两种病毒的免疫原性。获得的结果揭示了病毒布里斯班ΔNS1比布里斯班ΔNS1_HA2_N16I免疫原性更高，诱导更高水平的血清抗体(根据HAI测试的测量)，而且小鼠的肺和鼻甲中攻击病毒的复制降低指示更好的对动物的保护(图2A，B)。图2B具体公开了经过免疫的小鼠的肺和鼻甲中攻击病毒的繁殖。

实施例3

在标准条件下在Vero细胞上培养乙型流感株也导致HA分子中HA1-HA2或HA2-HA2区的界面处失稳性突变的出现，其涉及稳定性降低并继而降低突变型病毒在动物模型中的免疫原性(数据未显示)。

实施例4

先前发现最近十年期间流传的H5N1禽高致病性病毒不耐受用pH 5.6的人类鼻洗液处理。它们在接种Vero细胞期间也不耐受用同样pH 5.6的酸性缓冲液处理。发现这种不稳定性的原因是HA分子改变构象以实现与细胞膜融合时的高pH，对于H5N1病毒为pH值5.6，而对于人类病毒在5.2-5.4的范围中。

Steinhauer等人证明了H7N7病毒HA2中的一处替代，即K58I，能将融合的pH显著降低0.7个单位。将这种突变引入H3N2病毒具有相似的效果。

通过定点诱变将这种变化引入甲型/VN1203/04 ΔNS1(H5N1)病毒(重配株，继承来自甲型/VN/1203/04的HA、NA、和M基因及来自IVR-116疫苗的其余基因，与ΔNS1基因组合)的HA蛋白，并将所得病毒命名为VN1203 HAK58I(图3A)。图3A显示了初始和突变病毒的HA分子的序列比较。

以胰蛋白酶依赖性方式修饰两种病毒的HA。突变型病毒VN1203 HAK58I的融合pH在使用人类红细胞进行的溶血实验中降低了0.3个单位(数据未显示)。

此外，病毒VN1203 HA K58I在pH 5.6显示出降低的感染性损失。在小鼠免疫荧光测定法中，用病毒VN1203 HA K58I在pH 5.6和7.5进行感染后观察到几乎相似量的染色的细胞，而用VN1203病毒在pH 5.6进行感染时看不到染色细胞(数据未显示)。

对小鼠鼻内免疫接种后，比较了两种病毒诱导免疫应答的能力。免疫接种后4周，获得小鼠血清和鼻洗液，并测量HAI和IgA抗体。如图3B所示，VN1203 HA K58I病毒诱导的IgA抗体滴度比具有初始HA序列的病毒VN1203要高4倍。

图3B显示了免疫接种VN1203和VN1203 K58I病毒后，小鼠鼻洗液中的IgA抗体滴度。

图3C显示了免疫接种VN1203和VN1203 K58I病毒后，小鼠血清中的HAI抗体滴度。

为了证明对低pH升高的HA稳定性导致病毒更好的对哺乳动物的感染性，构建了两种类似的重配株，VN1203R和VN1203R HA K58I，其包含胜任(competent)NS基因。胜任NS基因的存在是免疫胜任生物体的呼吸道中有效病毒生长所需要的。以不同剂量鼻内接种每一种这些病毒后，比较了两种病毒在上呼吸道中的病毒生长。发现，与4.5log MID50的未修饰型VN1203R病毒相比，具有突变型HA的病毒VN1203R HA K58I对小鼠的感染性大100倍，以2.5 log的MID50(小鼠感染剂量-50％的小鼠受到感染时的剂量)值在上呼吸道中生长(图3E)。

图3E显示了不同剂量的鼻内感染后，小鼠上呼吸道中病毒的繁殖。

实施例5：热稳定性

以酸性接种来扩增病毒也保持病毒对热灭活的稳定性。通过将病毒在升高的温度温育15分钟后滴定病毒血细胞凝集滴度来检查热稳定性。发现用低pH接种培养的病毒(布里斯班ΔNS1 H1N1、威斯康星ΔNS1 H3N2、布里斯班ΔNS1 H3N2)保留血细胞凝集活性，甚至在暴露于60℃之后仍如此。以标准条件培养并获得HA中的失稳性突变的病毒(新喀里多尼亚ΔNS1_HA2_113、威斯康星ΔNS1_HA_218_225_75_81H3N2)无法耐受60℃的标准处理且在15分钟后完全丧失血细胞凝集活性(表1)。

对于禽流感病毒，发现含有HA、且只有多元(polybasic)切割位点修饰(以胰蛋白酶依赖性方式)的株不耐受甚至55℃的处理(香港156ΔNS1 H5N1、VN1203(6∶2)(H5N1)、VN1203 H5N1)，在15分钟处理中完全丧失凝集红细胞的能力。这些病毒的阈是50℃。引入HA胞外域HA2亚基中的突变K58I提高病毒稳定性直至55℃。

表3

人类流感病毒布里斯班ΔNS1 H1N1、威斯康星ΔNS1 H3N2、布里斯班ΔNS1 H3N2、新喀里多尼亚ΔNS1_HA2_113、威斯康星ΔNS1_HA1_218_225_75_81H3N2是作为6∶2重配株获得的，其携带来自相应流行病毒的表面抗原HA和NA及来自IVR-116株的所有其它基因。IVR-116(即WHO推荐用于生产灭活型疫苗的株)包含来自甲型/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)病毒的表面糖蛋白。所有病毒的NS基因都缺少NS1可读框。

禽病毒是作为5∶3(VN1203 H5N1和VN1203/04 HA K58I H5N1)或6∶2(VN1203(6∶2)H5N1)重配株获得的，其继承禽病毒甲型/越南/1203/04或甲型/香港/156/97的HA、NA和M(在5∶3的情况中)基因及来自IVR-116株的所有其它基因。高致病性禽株的HA切割位点被替代成低致病性禽病毒的。这项研究中的所有禽病毒都含有缺少NS1可读框的NS基因。

实施例6

通过反求遗传学构建了两种流感6∶2重配株，其含有来自流行病毒甲型/维也纳/28/06(H3N2)的HA和NA基因及来自WHO株IVR-116的所有其它基因，以及缺少NS1可读框的NS基因(ΔNS1)。获得的病毒在HA分子的HA2亚基的序列中相差一处氨基酸替代，看来是由于Vero细胞上的不同传代条件所致。第一种病毒，命名为维也纳/28，在pH 6.5的培养基存在下培养，而第二种病毒(维也纳/28_HA2_G75R)以标准条件培养。病毒维也纳/28_HA2_G75R与维也纳/28相比在HA的序列中不同，即初始野生型病毒中的HA2亚基位置不存在G75R。这处替代导致维也纳/28_HA2_G75R病毒在低pH与维也纳/28病毒相比降低的感染性，是通过在酸性缓冲液中预温育病毒(30分钟)，随后滴定感染性滴度来测量的(图4)。

实施例7

病毒甲型/布里斯班/10/2007(卵衍生的，得自NIBSC，UK)平行地在MDCK和Vero细胞上传代5次。传5代后，在免疫荧光测定法中将二者所得变体与初始病毒比较它们在不同pH值的感染性。获得的数据清楚地证明了初始病毒甲型/布里斯班/10/2007在pH 5.6和在中性pH 7.5以相同的效率感染细胞。但是，在相应细胞系上传5代后，两种病毒都丧失在pH 5.6感染细胞的能力。只在pH 5.8观察到阳性细胞染色，但是在使用pH 5.6的缓冲液时看不到染色的细胞(结果未显示)。对HA基因的测序揭示了两种变体都获得了相同的突变，即HA分子中第160位D→E。

实施例8

通过以两种不同方式进行连续传代，即标准(中性)条件或酸性(在pH 5.6感染)，使病毒甲型/所罗门岛/3/06(卵衍生的，得自NIBSC，UK)适应Vero细胞。在免疫荧光测定法中，在中性pH传代的所得病毒将在Vero细胞上生长的能力自4.7log TCID50/ml提高至6.7log TCID50/ml，但是丧失了在pH 5.6感染细胞的能力。用与pH 5.6的缓冲液组合的病毒感染细胞后没有观察到染色的细胞，而在中性感染中，整个单层被染色。适应了Vero细胞上的生长的病毒甲型/所罗门岛/3/06在使用酸性条件感染时达到滴度7.6 log TCID50/ml，同时在低pH条件保持感染性。在免疫荧光测定法中，在pH 5.6和7.5感染后观察到相似的染色细胞分布。

实施例9

通过在酸性条件(在pH 5.6感染细胞)进行的数次连续传代，使新H1N1亚型的病毒甲型/加利福尼亚/7/09(卵衍生的，得自CDC)适应Vero细胞。所得病毒命名为甲型/加利福尼亚/7/09-酸性。用初始病毒和经适应的病毒在生物反应器中进行小规模(10升)生产，随后纯化。在每个生产步骤后，通过血细胞凝集滴度(HA)测量的甲型/加利福尼亚/7/09-酸性病毒产量比甲型/加利福尼亚/7/09病毒要高2-8倍。结果显示于表4。

表4：甲型/加利福尼亚/7/09和甲型/加利福尼亚/7/09-酸性病毒的产量

将两者病毒收获，依照用于纯化灭活型疫苗的标准规程纯化并比较。获得的结果揭示了病毒甲型/加利福尼亚/7/09-酸性在所有测量的参数中好于甲型/加利福尼亚/7/09(表5)。

表5：甲型/加利福尼亚/7/09和甲型/加利福尼亚/7/09-酸性病毒的纯化制备物的比较

Claims (14)

1.一种用于生产流感病毒的方法，特征在于它包括下述步骤：

a)在具有介于5.2和5.9之间的，优选介于5.5和5.8之间的，最优选约5.6的pH的溶液中稀释病毒；

b)用至少一种感染性病毒颗粒感染宿主细胞，其中：

i)将所述病毒颗粒添加至所述细胞；并

ii)将所述细胞和所述病毒颗粒在介于5.2和5.9之间的，优选介于5.5和5.8之间的，最优选约5.6的pH温育以提供病毒/细胞复合物；

c)培养所述经过感染的宿主细胞以扩增病毒；

d)收获所述病毒；并

e)任选纯化和/或表征所述病毒。

2.依照权利要求1的方法，特征在于添加大环内酯多烯抗生素或衍生物，优选两性霉素B。

3.依照权利要求1或2的方法，特征在于所述细胞是组织培养细胞，优选选自下组：BSC-1细胞，LLC-MK细胞，CV-1细胞，CHO细胞，COS细胞，鼠类细胞，人类细胞，HeLa细胞，293细胞，VERO细胞，MDBK细胞，MDCK细胞，MDOK细胞，CRFK细胞，RAF细胞，TCMK细胞，LLC-PK细胞，PK15细胞，Wl-38细胞，MRC-5细胞，T-FLY细胞，BHK细胞，SP2/0细胞，NS0，PerC6。

4.依照权利要求1至3任一项的方法，特征在于所述病毒是甲型、乙型或丙型流感。

5.依照权利要求1至4任一项的方法，特征在于所述流感病毒是减毒流感病毒。

6.依照权利要求1至5任一项的方法，特征在于所述流感病毒在NS1基因内包含删除或修饰。

7.依照权利要求1至6任一项的方法，特征在于所述流感病毒是冷适应病毒。

8.依照权利要求1至7任一项的方法，特征在于在能提供一定范围的pH值且对于细胞是生理性的缓冲液中稀释病毒，其中所述缓冲液优选选自下组：MES缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，和乙酸盐缓冲液。

9.依照权利要求1至8任一项的方法，特征在于使用培养培养基来培养所述细胞，且所述培养培养基优选是SFM opti-pro ^TM培养基。

10.依照权利要求1至9任一项的方法，特征在于所述病毒在所述宿主细胞中传代至少一代。

11.通过权利要求1至10任一项的方法可获得的流感病毒，特征在于该病毒在升高的温度保留血细胞凝集活性，在5.5至5.8的pH范围保留感染性，在细胞培养中有高生长速率且优选具有人类受体特异性。

12.包含依照权利要求11的流感病毒的包膜病毒颗粒作为种子病毒的用途。

13.包含依照权利要求11或12的流感病毒的包膜病毒颗粒用于大规模生产疫苗病毒的用途。

14.一种可用于疫苗接种或治疗病毒病的组合物，包含依照权利要求11的流感病毒和药学可接受载体或佐剂。

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