CN104302317B - 新型和改进的流感疫苗 - Google Patents

Abstract

提供了包括包含流感血凝素的抗原的流感疫苗，所述抗原在合适的低pH或其它合适的条件下经受处理，以获得合适程度的效力丧失，和其制造方法。该疫苗不仅诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，也能诱导如目前灭活的疫苗的毒株特异性免疫应答和保护。还提供了施用流感疫苗的方法，以诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，其特别适合在诸如大流行的紧急情况下使用。

Description

新型和改进的流感疫苗

发明领域

本发明一般地涉及医学领域，且具体涉及微生物学、免疫学、和疫苗，且更具体地，流感疫苗。

发明背景

存在三种类型的流感病毒，A、B和C型。A和B型流感病毒负责人和动物中大部分感染和相关疾病。A型流感病毒已与所有流感大流行，与2009年中最新的一种有关。流感病毒具有锚定在其包膜上的两种主要的糖蛋白，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA通过结合至细胞受体和介导病毒与细胞膜之间的融合，负责介导病毒进入靶细胞。HA也是宿主免疫应答的主要靶点和当前许可的疫苗的保护抗原。

由于其易于出错的复制和重配基因组区段的能力，流感病毒经历不断的基因改变，导致在HA中不断的抗原改变，及变体或新型病毒株的出现。过去的大流行均与变体或新性病毒株的出现相关，对此人群具有很少或没有预先存在的免疫力。基于HA和NA的抗原表征，A型流感病毒被分为16种HA(H1-H16)和9种NA(N1-N9)亚型，而B型流感病毒分为两大谱系。作为不断的抗原改变的结果，同一亚型内的病毒仍然可以是抗原性不同的或异源的。16种HA亚型基于HA蛋白的序列同源性分为两大系统发生组(I和II)，其每个还可以分为3个(H1、H2、H5和H6；H8、H9和H12；H11、H13、和H16)和两个进化枝(H3、H4、和H14；H7、H10、和H15)(Russell等人，NatlAcadSciUSA.105:17736-17741,2008)。

流感疫苗

当前许可的流感疫苗主要是含有来自两种HA亚型(H1和H3)和一种B型病毒的抗原的三价灭活疫苗(TIV)(Fukuda等人，InVaccines.Plotkin等人(著)，第4版，第339-370页，2003，Saunders.Philadelphia；Fiore等人，CurrTopMicrobiolImmunol.333:43-82,2009)。最近，四价灭活疫苗(QIV)已被许可，其与TIV相同，但掺入了额外的B病毒。其没有被广泛使用。这些疫苗是毒株特异性的。为了匹配传播中的病毒，疫苗毒株每年更新。为针对大流行保护，也产生了靶向大流行病毒的单价灭活疫苗，诸如为2009年H1N1大流行的一种。当前TIV的功效仅是中度的，在年龄为18-65岁的成年人中具有59％的平均功效(Osterholm等人，LancetInfectDis12：36-44，2012)，其针对不良地匹配的变体病毒可能甚至更低。因此，存在改善目前的TIV的巨大需求。

使用鸡卵或包括MDCK和Vero的培养的鸟类或哺乳类细胞制造灭活疫苗。制造过程包括病毒的生长、收集、和纯化。病毒在制造过程中灭活，例如，在收集的步骤或在病毒纯化后。可以使用各种化学试剂和物理手段实现灭活。试剂包括甲醛、戊二醛、β-丙内酯、和TritonX-100，其中甲醛是最广泛使用的。物理手段包括加热、γ辐照、和UV灯。纯化的灭活的病毒可被直接作为全病毒(WV)抗原用于疫苗，或可以裂解为亚病毒粒子组分，以产生裂解疫苗(splitvaccine)。裂解的亚组分可被进一步纯化，以产生亚单位疫苗。目前，裂解或亚单位抗原制成的TIV是最广泛使用的。也使用灭活的WV疫苗，其可优选的针对大流行，因为相比裂解或亚单位疫苗，它有更多的免疫原性，且可以更快地制作。

HA是保护抗原。灭活疫苗基于HA蛋白的量被标准化，HA蛋白的量作为疫苗的效力指标。它是由使用特异于待测试并在疫苗中使用的病毒株的HA的多克隆抗体的单一径向扩散(SRD)测试确定的。SRD在含有抗HA抗体的琼脂板上进行，其中测试抗原被与参考抗原一起置于由琼脂形成的小圆孔中(Wood等人，JBiolStand.5:237-247,1977；DevBiolStand.64:169-177,1986)。抗原扩散进入琼脂允许抗原和抗体结合，且从而形成沉淀环。环的尺寸反映了存在于抗原或疫苗中HA的量。对于目前的TIV，效力标准是对于成人或老人群体每剂疫苗三种毒株每种15或60μgHA。TIV的免疫原性已被广泛评价。效力标准与如通过血细胞凝集抑制(HAI)和中和测试(NT)测量的一定水平的保护免疫应答的诱导相关。HAI滴度≥1：40通常被认为是人中的保护阈值。

除了灭活疫苗，正在开发其它形式的流感疫苗(Lambert和Fauci,NEnglJMed.363:2036-2044,2010)。它们包括单独或与其它病毒蛋白组合的重组HA蛋白和HA蛋白构成的病毒样颗粒(VLP)。最近，基于重组HA的三价疫苗已被许可。重组HA蛋白和VLP可以使用各种不同的表达系统生产，所述表达系统包括细菌、鸟类或哺乳类细胞、杆状病毒、和植物。它们是无生命的或不是从感染性材料制成的，且因此不经过灭活步骤。然而，这些疫苗的效力也是基于如通过SRD确定的HA的量，虽然对这些疫苗的效力标准可以基于抗原的免疫原性和功效而不同。

HA蛋白的结构与功能

HA是由三个相同亚单位构成的三聚体蛋白质(Skehel和Wiley,Annu.Rev.Biochem.69:531-569,2000；Luo,AdvExpMedBiol.726:201-221,2012)。每个亚单位由两个部分构成，HA1和HA2，作为蛋白酶裂解前体HA0的结果。HA1和HA2通过二硫键和氢键保持联合在一起。三个HA亚单位一起形成具有由HA1形成的球状头部及主要由HA2形成的茎区的伞状HA分子。HA1具有受体结合位点并负责结合到宿主细胞，而HA2由融合肽和长螺旋结构域构成，负责介导细胞融合(Bullough等人，Nature.371:37-43,1994)。相比在HA1下方被覆盖且免疫原性较低的HA2，HA1是免疫应答的主要靶点。随着结合到宿主细胞，病毒进入内体，在那里它们被暴露于低pH(～5.0)的环境。在这样低的pH，HA经历不可逆的且剧烈的构象改变，包括HA1球状头部的解离和再折叠的HA2茎的上升(Skehel和Wiley,Annu.Rev.Biochem.69:531-569,2000)。这些构象的改变引起病毒和细胞膜的融合，导致递送病毒基因组进入细胞质。

保守的抗原结构域和具有广谱保护的流感疫苗的开发

流感病毒的不断抗原改变构成了开发用于控制流感的流行和大流行的疫苗的巨大挑战。目前的TIV(H1、H3、和B)是毒株特异性的，且不适用于控制大流行。因此，迫切需要提供针对不同亚型的流感病毒的广谱保护的流感疫苗，以提供对流感流行的更好的控制，及针对大流行的有效对策。

开发广泛地保护的疫苗的一个关键战略是靶向高度保守的抗原结构域，以便产生的特定抗体是交叉反应的，即，能够与来自相同或不同亚型的异源病毒反应以提供交叉保护(Heiny等人，PLoSOne.2:e1190,2007；Du等人,MicrobesInfect.12:280-286,2010；Gilbert,Influenzaandotherrespiratoryviruses.10.1111/irv.12013,2012)。虽然HA不断地发生抗原改变，可以在HA1和HA2两者中找到高度保守的结构域。然而，HA2比HA1更为保守得多(Fouchier等人,JVirol.79:2814-22,2005；Gerhard等人,EmergInfectDis.12:569-574,2006)。对于HA2，每个单独的亚型中的平均一致性百分比为至少92％，或在来自分析的四个进化枝的两个密切相关的亚型之间为87％(Fouchier等人，79:2814-22,2005)。识别HA1的受体结合位点的单克隆抗体已被证明能够中和测试的36种H1N1病毒株中的30种(Whittle等人,ProcNatlAcadSciUSA.108:14216-14221,2011)。另一方面，使用单克隆抗体在HA2的茎区中已鉴定了若干高度保守的结构域(Kashyap等人,ProcNatlAcadSciUSA.105:5986-91,2008；Ekiert等人,Science.324:246-51,2009；Sui等人,NatStructMolBiol.16:265-73,2009；Corti等人,Science.333:850-856,2011)。在HA2、M2和其它病毒蛋白质中找到的高度保守的结构域已成为用于广泛地保护或通用流感疫苗的开发的主要靶点(Stanekova和Vareckova,VirolJ.7:351,2010；Gilbert,Influenzaandotherrespiratoryviruses.10.1111/irv.12013,2012)。

针对高度保守的结构域的交叉反应抗体可通过用目前的疫苗接种疫苗或感染后产生，但仅在较低水平，不足以提供保护。因此，广泛地保护的疫苗的主要目的是增加针对这些结构域的交叉反应的抗体应答。交叉反应抗体可以是中和的或非中和的。中和的抗体可通过阻止病毒进入细胞，预防感染。非中和抗体可不预防感染，但能降低疾病的发病率和严重程度。研究M2蛋白的高度保守的M2e结构域表明，非中和交叉反应抗体可以是高度保护的并降低病毒散播(Stanekova和Vareckova,VirolJ.7:351,2010；ElBakkouri等人,JImmunol.186:1022-1031,2011)。

应当认识到，可以提供针对所有流感病毒(A和B)的保护，并代替所有目前的疫苗的全谱或真正的通用的流感疫苗将是理想的。然而，这是一项艰巨的任务，且在被许可在人中使用之前可能需要漫长的开发过程(Nabel和Fauci,NatMed.16:1389-91,2010；Rappuoli,F1000MedRep.3:16,2011)。因此，可首先开发至少可以提供针对对季节性流行很重要的，且有较大可能造成未来的流感大流行的包括H1、H3、和H5的主要亚型的保护的广谱疫苗，以满足目前和紧急需求。鉴于流感流行是不断的年度事件且下一次大流行可能发生在任何时间的这一事实，为了世界人口的福祉，针对可能的未来的大流行保护，并更好地控制疫情的广谱和通用的疫苗加速的开发的需求是严峻且急切的。

发明概要

因此，本发明提供了一种流感疫苗，它不仅能提供针对变体或异源的病毒的增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，且还能提供针对包含在疫苗中的病毒的如同目前的灭活疫苗的毒株特异性免疫应答和保护。该疫苗包括包含流感HA的抗原，该抗原在合适的低pH或其它合适的条件下经受处理，以获得合适程度的效力丧失。本发明发现，包含流感HA的抗原的效力可通过低pH处理逐渐地降低高达100％，与处理条件直接相关，且仅在合适的低pH处理条件下获得的具有合适程度的效力丧失的抗原诱导增加的交叉反应抗体应答和交叉保护，其特殊地与HA2的增加的交叉反应相关联，HA2是HA的高度保守的部分。效力丧失可与抗原的或结构的改变相关且由对抗原的或结构的改变的功能等价的替代测量指示。通过以适当量的额外的抗原或佐剂补偿部分效力丧失，可以容易地配制这些抗原以满足作为疫苗的效力标准。因此，得到的疫苗可提供针对包含在疫苗中的病毒的如与未处理的抗原或像目前的灭活疫苗相同水平的毒株特异性免疫应答和保护，并在同时还提供针对没有包含在疫苗中的病毒的增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，没有包含在疫苗中的病毒包括可能的大流行以及季节性变体病毒。

该新型流感疫苗可以以单一或多个抗原制成。它非常适合用于基于相同的三种抗原(H1、H3、和B)的新型TIV的生产。通过掺入来自所有三个或至少H1和H3毒株的处理的抗原，该新型TIV可诱导甚至更宽广的交叉反应免疫应答，特别是考虑到H1和H3亚型分别属于两个不同的系统发生组。其同样可以以最近许可的四价灭活疫苗(QIV)来实现，其与TIV相同，但掺入了额外的B病毒抗原。当配制以满足效力标准时，新型TIV或QIV不仅会履行其原来的适应症(indication)—针对包含在疫苗中的病毒的毒株特异性保护，还能提供针对不包含在疫苗中的病毒的广泛交叉反应免疫应答和交叉保护，从而提供对季节性流行的更好控制及针对可能的大流行的保护。可以掺入来自额外的亚型或两个系统发生组的进化枝的抗原，以进一步扩大并加强交叉反应和保护。

本发明还提供了一种用于在人或动物中诱导针对流感病毒的增加的交叉反应免疫应答和交叉保护的方法，该方法是通过施用有效剂量的包括包含流感HA的抗原的流感疫苗，所述抗原通过在合适的低pH或其它合适的条件下处理获得了合适程度的效力丧失。本发明还提出了一种用于在人或动物中诱导针对流感病毒的毒株特异性免疫应答和保护及增加的交叉反应免疫应答和交叉保护两者的方法，所述方法通过施用有效剂量的进一步配制以满足效力标准的该流感疫苗。

本发明还提供了用于制造诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护的流感疫苗的方法。该方法包括将包括HA的流感抗原在合适的低pH和温度下处理。处理的抗原获得合适程度的效力丧失。然后处理的抗原与药学上可接受的载体配制为疫苗。通过以额外的抗原或佐剂补偿处理的抗原的部分效力丧失，可以进一步配制这些疫苗以满足效力标准。然后得到的疫苗还将诱导如同目前的灭活疫苗的毒株特异性免疫应答和保护。

本发明还提供了施用流感疫苗用于增加的交叉反应免疫应答和交叉保护的诱导的方法。该方法包括在合适的低pH处理包括包含流感HA的抗原的疫苗，以产生合适程度的效力丧失，然后将处理的疫苗施用至动物或人。低pH处理可以使用含有所需的酸性和碱性溶液的试剂盒进行。此方法可用于转化在传播或库存中的现有疫苗，以在诸如大流行的紧急情况下提供增加的交叉保护。在可能的大流行的情况中这可能是极为重要的对策，在该情况中库存的疫苗不直接匹配大流行病毒，且对大流行病毒特异性的疫苗不可用或供应短缺。

附图简述

图1显示了在不同pH和温度处理后，用灭活WV抗原(A/NewCaledonia/20/99,H1N1NC)(A)和TIV(2006-2007,Fluzone)(B)的单一径向扩散(SRD)测试。

图2显示了用在pH5.1和不同的温度下处理后的灭活WV抗原(A/NewCaledonia/20/99,H1N1NC)、以及具有已知的HA浓度(μg/ml)的参考抗原标准(std)的单一径向扩散(SRD)测试。

图3显示了低pH处理的抗原诱导增加的交叉反应抗体应答。针对未处理的或在低pH(5.1)和不同温度下(0、25、或37℃)处理的灭活WV抗原(A/NewCaledonia/20/99,H1N1NC)或由等量的未处理的抗原和在37℃下处理的抗原组成的抗原的混合物在小鼠中产生的混合的血清样品用不同的抗原在ELISA中测试，所述不同的抗原包括同源灭活H1N1NCWV抗原未处理的(A)或在pH5.1和0℃(B)、25℃(C)或37℃(D)处理的，及异源灭活H5N3WV抗原(A/鸭/Singapore-Q/F119-2/97,H5N3鸭)(E)、单价2009H1N1大流行疫苗(A/California/7/2009,H1N1CA)(F)、灭活H3N2WV抗原(A/Wisconsin/67/2005)(G)、和灭活BWV抗原(B/Malaysia/2506/2004)(H)。测试的血清样品在第2次免疫后的第4周获得。

图4显示了未处理的和低pH处理的抗原在交叉反应抗体应答的诱导中的比较。图3中血清样品的ELISA单位通过将针对未处理的抗原血清样品任意地指定为100个单位，作为计算与在相同ELISA板上测试的相同抗原反应的其它血清样品的滴度(单位)的参考来确定。

图5显示了低pH处理的抗原诱导增加的交叉反应抗体应答。通过如图3的ELISA测试了相同的混合血清样品，但用异源A/PuertoRico/8/34(H1N1PR8)(A)或A/California/7/2009(H1N1CA)(B)病毒、或同源A/NewCaledonia/20/99(H1N1NC)病毒(C)的重组HA蛋白。以如图4(D)中相同的方式比较了未处理的和处理的抗原的交叉反应抗体应答的诱导。

图6显示了由低pH处理的抗原诱导的与HA1和HA2增加的抗体反应。与在图3中相同的针对未处理的或低pH处理的(pH5.1，在0、25、或37℃)灭活WV抗原(A/NewCaledonia/20/99,H1N1NC)的混合血清样品通过免疫印迹，用同源(H1N1NC)和不同的异源抗原(H1N1CA、H5N1VN、和H5N3鸭)进行了测试。图A显示了免疫印迹。图B显示了图A的免疫印迹中HA1和HA2蛋白质条带的密度图(未校准的OD)。箭头指示HA1且括号指示HA2。

图7显示了由低pH处理的抗原诱导的与HA1和HA2增加的抗体反应和交叉保护。图A显示了免疫印迹中HA1和HA2蛋白质条带的密度图(未校准的OD)。针对未处理的或低pH处理的(pH5.2，在0、25、或37℃)灭活WV抗原(A/NewCaledonia/20/99,H1N1NC)的混合血清样品通过免疫印迹用同源(H1N1NC)和异源(H1N1PR8)抗原测试。测试的血清样品在第2次免疫后的第2周获得。图B显示了针对用异源H1N1PR8病毒的致死性攻击的交叉保护。在第二次免疫后第3周进行攻击。

图8显示了未处理的和低pH处理的(pH5.2，在0、25、或37℃)灭活WV抗原(A/NewCaledonia/20/99,H1N1NC)的蛋白酶敏感性。图A显示了以考马斯亮蓝染色的凝胶；图B显示了蛋白质条带的密度图。封闭的箭头指示HA1，开放的箭头指示HA1消化产物(DP1)，括号指示HA2/M1，且封闭的箭头指示胰蛋白酶。

发明详述

定义

词语“抗原”和“免疫原”可互换使用，且是指能够诱导特异性体液(抗体)和细胞免疫应答的分子、物质、蛋白质、糖蛋白、或活病毒。

本文所用的词语“抗原性”是指抗体与特异性抗原反应或结合的能力。

本文所用的词语“免疫原性”是指抗原或疫苗诱导特异性免疫应答的能力。

术语“免疫应答”是指针对抗原、疫苗或感染因子的体液或抗体介导的和细胞介导的免疫应答。

词语“疫苗”是指用于针对感染性或非感染性疾病的治疗性处理或预防性免疫的包括抗原的组合物。

词语“免疫”是指通过接种疫苗或感染产生的免疫应答，其提供针对感染性或外来试剂的保护。

术语“重组蛋白质或抗原”是指以重组DNA技术产生的蛋白质或抗原，其可用于在包括细菌、哺乳类细胞、昆虫细胞、和植物的各种宿主中克隆和表达基因以产生蛋白质。重组DNA技术在众多出版的书籍和手册中描述了，包括"Currentprotocolsinmolecularbiology"(Ausubel著2008.JohnWiley&Son)。重组蛋白质或抗原可以作为单独的蛋白质或复合物诸如病毒样颗粒存在。

术语“疾病”或术语“疾病状况”是指可由感染因子或其它潜在的机制引起的在动物或人中的任何异常改变。它与“病症”可互换使用。

术语“感染因子”和“病原体”可互换使用，且是指感染性微生物，诸如病毒或细菌，以及致病剂，诸如各种来源的毒素。

词语“一个(a)”或“一个(an)”是指“一个或更多个”。

词语“灭活的”和“灭活”是指在从活病毒产生灭活疫苗的过程中杀灭或致使活病毒无感染性或无生命。灭活可在疫苗生产过程的不同阶段进行，例如，病毒的纯化之前或之后。“灭活的”与“无生命的”也可互换地使用。无生命的疫苗还可以包括通过重组DNA技术产生的抗原，诸如重组HA和病毒样颗粒。

术语“低pH”与酸性pH可互换地使用。它是指pH小于7.0。

词语“效力”是指如通过指定的效力测定测量的在抗原制剂或疫苗中抗原的量。对于疫苗，效力的需求水平或标准必须被满足，这与疫苗的功效或有效性直接相关。对于目前的灭活的或无生命的流感疫苗，效力是通过指定的SRD测试测量的HA蛋白的量。它是毒株特异性的，因为用特异地针对待测试的并在疫苗中使用的病毒株的HA产生的多克隆抗体进行SRD。因为多种因素，用于疫苗的效力标准可能有所不同，所述因素包括抗原类型、预期使用的人群、及佐剂的使用。

术语“效力丧失(lossofpotency)”、“效力丧失(potencyloss)”和“效力降低”可互换地使用，且是指如通过效力测试测量的抗原或疫苗的效力的减少。效力丧失反映抗原或疫苗的抗原或结构的改变。除了效力测试，这些改变可以通过功能等价的替代方法测量。

术语“同源的病毒或抗原”是指与如通过基于完善确立的标准(一般认为是在HAI滴度中<4倍的差异)由HAI测试通常定义的亚型内的组中的其它病毒或抗原血清学相似的流感病毒或抗原。

术语“异源的病毒或抗原”是指与如通过基于完善确立的标准(一般认为是在HAI滴度中≥8倍的差异)由HAI测试通常定义的来自相同或不同亚型的其它病毒或抗原血清学不同的流感病毒或抗原。它可以与“变体病毒或抗原”互换地使用。

术语“交叉反应”是指由抗原、疫苗或病毒产生的免疫应答与异源病毒或抗原反应。

术语“交叉保护”是指在宿主中由抗原、疫苗、或感染针对一种病毒产生的保护，预防由异源病毒引起的感染或疾病。

详细说明

本发明的第一方面是，通过以直接相关的处理条件在低pH处理，包括HA的流感抗原的效力可逐渐降低高达100％。因此，pH越低，效力丧失越高。升高温度显著地增强了低pH对降低效力的作用。如实施例1、2及4所示，在pH5.1或5.2及37℃下的处理导致≥90％的效力丧失，而在相同的pH及0或4℃下的处理降低效力的<50％。当在pH5.2和0℃下进行低pH处理时，获得效力丧失低达～10％。以灭活WV抗原、TIV以及重组HA证明了低pH对效力的这种作用。效力丧失是不可逆的，因为在低pH处理后，将pH调节回到原始水平(7.0-7.4)后，进行SRD测试。在相同条件下效力丧失的程度可以随不同的抗原而改变。但可以通过调节处理条件容易地获得不同的抗原或疫苗的相同水平的效力丧失。

本发明的第二个方面是，当以与效力丧失的相关施用至动物时，低pH处理的抗原可以诱导针对异源抗原的增加的交叉反应抗体应答。如实施例3和4中所示，如通过ELISA对总特异性抗体测量的，所有处理的抗原诱导异源抗原的增加的交叉反应。在更严格的条件下(pH5.1或5.2，及37℃)处理的那些具有≥90％的效力丧失，诱导最高的交叉反应。但是，在温和的条件下(pH5.1或5.2，及0-25℃)处理的抗原具有<50％且低至12.5％的效力丧失，也诱导强烈的交叉反应。这种增加的交叉反应抗体应答不仅以灭活的抗原证明，且还以重组HA蛋白证明，表明增加的交叉反应抗体应答指向HA。增加的交叉反应的水平表现为在来自相同系统发生组的异源抗原中更高。这与两个系统发生组是基于HA蛋白的序列同源性建立的事实相一致。

本发明的第三方面是，在适当的低pH条件下处理的具有部分效力丧失的抗原可诱导与HA2更大的交叉反应，HA2是HA的高度保守部分。如通过免疫印迹的实施例3和4所示，不同的低pH条件(pH5.1或5.2及0、25、或37℃)下处理的抗原诱导与HA1和HA2两者增加的反应，但显然，具有明显不同的模式。以温和的条件(0-25℃)处理的抗原诱导与HA2更大的反应，而以更严格的条件(37℃)处理的那一个诱导与HA1更大的反应。这表明，不同处理条件下诱导的抗原或结构的改变不仅是定量的，而且是定性的。在实施例3和4中，以温和条件处理的具有在20-50％的范围内的效力丧失的抗原获得了与HA2反应的最大的增加。重要地，其在所有测试的异种抗原中一致地发生了。因此，在合适的处理条件下获得的一定范围的效力丧失在诱导与HA2的增加的交叉反应方面是特别有效的。另一方面，在不同条件下，与异源抗原的HA1的增加的交叉反应的水平在单个抗原之间变化。这些结果与HA2比HA1保守得多的事实相一致。与上文描述的通过ELISA的发现相似，与HA2的交叉反应也表现为在来自相同系统发生组的异源抗原中更高。

HAI和NT测量中和抗体。未处理的抗原(A/NewCaledonia/20/99)诱导针对同源病毒的高HAI和NT滴度，但如预期的，没有检测到针对异源病毒(A/PuertoRico/8/34,H1N1PR8)的HAI或NT滴度。处理的抗原诱导与效力丧失相关的针对同源病毒的较低的HAI和NT滴度。但是，在温和的条件下(0-25℃)处理的具有<50％的效力丧失的抗原仍然能够诱导实质的HAI和NT滴度，相比未处理的抗原它们在相同的水平或仅低～2倍。重要的是，如实施例4所示在温和的条件下(pH5.2和25℃)获得的某些处理的抗原也能够诱导针对异源病毒的较低、但增加的HAI和NT滴度水平。

本发明的第四方面是，在合适的低pH条件下获得的具有部分效力丧失的相同的处理的抗原可以诱导增加的交叉保护。实施例4显示，在温和的条件(0或25℃)下处理的具有<50％的部分效力丧失的抗原诱导增加的交叉保护。与之相反且出乎意料的是，在37℃下处理的具有≥90％的效力丧失的抗原在使用的实验条件下未提供任何可检测的交叉保护，虽然通过这种抗原诱导了与HA1高水平的总交叉反应抗体应答及交叉反应。因此，很显然，增加的交叉保护与部分的效力丧失(<50％)和与HA2的增加的交叉反应相关。Quan等人(Virology.417:196-202,2011)评估了基于低pH对HA的构象改变的公知作用的认识，在低pH(5.0)和37℃下处理的灭活WV抗原试图产生交叉反应免疫应答和交叉保护。然而，处理的抗原丧失了≥4倍的血细胞凝集活性，且不诱导任何增加的交叉反应抗体应答，也不诱导针对异源病毒的任何增加的交叉保护。它实际上比未处理的抗原在诱导交叉反应的抗体应答和交叉保护方面更低效(Quan等人，Virology417:196-202,2011)。这与在本发明中在37℃处理的抗原涉及增加的交叉保护的缺乏的结果相一致，并且还显示了本发明的意想不到的性质，即在温和的低pH条件下处理的具有部分效力丧失的抗原诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护。虽然不希望受到理论的束缚，但可能的是在温和的条件下处理的抗原可能仅获得有限的抗原或结构改变，这适合于更好的暴露在其天然形式中的HA2和可能地其它保守结构域，且从而增加交叉反应和保护，而在37℃下处理的那些可能获得过度的抗原或结构改变，如通过几乎完全的效力丧失证明的，且因此可能与天然HA较不相关，且因此较少的保护，即使当针对它们诱导了增加的免疫应答。

低pH对流感病毒的HA的作用已被广泛研究(Skehel和Wiley,Annu.Rev.Biochem.69:531-569,2000；Luo,AdvExpMedBiol.726:201-221,2012)。但是，先前没有研究集中于低pH对流感抗原和疫苗的效力的作用，及以在不同的低pH条件下处理的抗原诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护。因此，本发明首次表明，与低pH处理的条件相关，流感抗原的效力可降低达100％。本发明还证明，仅在合适的低pH处理的条件下获得的具有合适程度的效力丧失的抗原诱导与HA2更大的交叉反应，及增加的交叉保护，HA2是HA的高度保守部分。总之，这些发现形成了基于合适的低pH条件下处理的抗原的新型和改进的流感疫苗的基础。

本发明的一个实施方案是包括在合适的低pH条件下处理的具有部分效力丧失的流感抗原的流感疫苗，其诱导增加的交叉反应应答和交叉保护。优选地，低pH处理后，处理的抗原保留了其原始血细胞凝集活性。疫苗可与佐剂配制以进一步增强交叉反应免疫应答和交叉保护。

本发明的另一个实施方案是包括在合适的低pH条件下处理的具有部分效力丧失的流感抗原的流感疫苗，其不仅提供了增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，且还满足了效力标准，从而提供了如与未处理的抗原或像目前的灭活疫苗相同水平的针对包含在疫苗中的流感病毒的毒株特异性保护。这种双效疫苗可通过如实施例6中描述的制备，通过掺入合适量的额外的抗原或佐剂，补偿处理的抗原的部分效力丧失。

已知的是，毒株特异性免疫应答和保护主要通过HA1介导，HA1是目前的灭活疫苗中HA的免疫显性的部分。毒株特异性保护主要通过中和抗体赋予，如由HAI和NT测量的。根据本发明，由在合适的低pH条件下处理的抗原诱导的增加的交叉反应抗体应答和交叉保护与以HA2的增加的反应相关联。因此，这种双效疫苗均衡地使用HA1和HA2，前者用于主要诱导毒株特异性免疫应答和保护，后者用于主要诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护。中和及非中和抗体两者可以牵涉在由在合适的低pH条件下处理的抗原诱导的交叉保护中。如上文所述，非中和抗体也可以是高度保护的。

根据本发明的流感疫苗可以以一种或更多种抗原制备。在多种抗原的情况下，部分或全部的抗原可在适合于各自抗原的低pH条件下处理。目前的TIV包含来自三个病毒株的抗原，三个病毒株是H1N1、H3N2、和B。最近，四价灭活疫苗(QIV)已被许可，其与TIV相同，但掺入了额外的B病毒。H1亚型属于系统发生组I，而H3亚型属于系统发生组II。因此，如果来自H1和H3亚型两者的处理的抗原合并，可生成甚至更广泛的交叉反应抗体应答和交叉保护。考虑到两个系统发生组基于HA蛋白的序列同源性确立，这是特别有利的，且因此预计以相同系统发生组内的病毒交叉反应的水平将较高。因此，根据本发明，这些抗原高度适用于制造新一代TIV或QIV。这样的新疫苗将不仅发挥其原来的适应症—针对包含在疫苗的病毒的毒株特异性保护，而且还可以提供针对不包含在疫苗中的其它病毒，包括可能的大流行以及季节变体病毒的增加的交叉保护。这种新型广谱TIV或QIV的非常显著的优点是，它可以容易地掺入到针对流感的目前的免疫项目中。该新型TIV或QIV还可掺入来自额外的进化枝的处理的抗原，以成为多价或多进化枝疫苗，所述疫苗包括来自一个系统发生组的两个或更多个进化枝的抗原、及来自另一系统发生组的至少一个进化枝的抗原。来自两个系统发生组的所有五个目前的进化枝的抗原可掺入该多进化枝疫苗中。作为使用在合适的低pH条件下处理的抗原的结果，由通过更保守的HA2进一步加强进化枝和系统发生组内和之间的交叉反应性，所得疫苗将进一步增强和扩大交叉反应免疫应答和交叉保护。这样的疫苗具有提供足以达到实现真正的通用保护的最终目标的抗原宽度的能力。

本发明的又另一实施方案是生产诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护的流感疫苗的方法。因此，包括HA的流感抗原在合适的低pH条件下处理，以获得期望水平的效力丧失，用于诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护。对于低pH处理，酸性pH溶液可被添加到抗原以调节pH至合适的低pH水平，然后将抗原保持在合适的温度持续合适的一段时间，且在处理结束后，抗原的pH被调节回到原始的或生理学的水平(7.0-7.4)。具体处理条件可以基于抗原形式、病毒株、来源和生产方法对不同的抗原而改变。对于给定的抗原，可以通过在宽的pH和温度范围下的测试确定合适的条件。低pH处理可以在制造过程中的任何阶段进行，例如散装抗原在其配制成最终的疫苗产物前。对于由鸡卵或培养的鸟类或哺乳类细胞中生长的活病毒制成的灭活的抗原，低pH处理可以在灭活之前或之后进行。低pH处理后，灭活的抗原可进一步用甲醛或其它合适的试剂固定，以确保抗原的长期稳定性。低pH处理可以优选在2-8℃或低于室温进行，以保持抗原的稳定性并最小化微生物污染的机会。对于多价疫苗，在被合并以制备最终的疫苗前，单个抗原可以分别在不同的合适的条件下处理。最终的疫苗可通过如实施例6中描述的，由通过掺入合适量的额外的未处理的或处理的抗原或合适的佐剂，补偿处理的抗原的部分效力丧失，制备以满足效力标准。对于具有非常低的效力丧失的处理的抗原，抗原补偿可能不是必要的，因为这样的抗原可能仍然能够诱导相同水平的毒株特异性免疫应答。

本发明另一实施方案是施用流感疫苗至动物或人的方法，以诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护。因此，将酸性溶液或低pH缓冲溶液(处理溶液)加入疫苗，以降低疫苗的pH至合适的水平，例如5.0-6.0。然后疫苗保持在合适的温度下(4、25、或37℃)持续合适的一段时间以诱导合适水平的效力丧失。加入碱性溶液或高pH缓冲液(终止溶液)通过使pH回到其原始或生理学水平(7.0-7.4)以停止处理。然后将疫苗施用至动物或人。加入碱性溶液的步骤是任选的，因为与酸性溶液混合的疫苗的pH一经接触体液可以很快改变至生理学水平。可以提供包括酸性溶液和碱性溶液的试剂盒，以便于在多剂量小瓶或单剂量注射器中的疫苗的处理。在可能的大流行的情况中这种方法是非常重要的，其中传播或库存中的现有的疫苗不直接匹配大流行病毒，且对大流行病毒特异性的疫苗不可用或供应短缺。因此，这些现有的疫苗可通过就在施用前在合适的条件下低pH处理被转化，以提供增加的交叉保护，否则功效将较低或没有。考虑到目前有限的全球疫苗生产能力，大流行疫苗的短缺是不可避免的，特别是在大流行的早期阶段。因此，在合适的低的条件下低pH处理现有疫苗能够在这样紧急的情况下提供有效的对策。

包括HA的任何抗原或疫苗可适合于通过本发明使用。它们可以通过各种制造系统生产，诸如细菌细胞、鸟类细胞(aviancell)、哺乳类细胞、鸡卵、昆虫细胞、植物细胞、昆虫、和植物。它们也可以以不同的形式，如WV、裂解病毒、亚单位、病毒体、重组HA和病毒样颗粒。它们可以是由活病毒产生的灭活的抗原或通过重组DNA技术产生的重组蛋白质。抗原中的HA可以是部分或全部的HA分子，且还可以通过重组DNA技术插入、缺失、和/或取代一个或更多个氨基酸被修饰。低pH处理前，重组HA可以任选地用蛋白酶处理，以去除HA1和HA2之间的共价连接(Wang等人，Vaccine.24:2176-2185,2006)。

对于本发明的实践，抗原可以在从3.0至6.8的合适的低pH范围，及0℃或更高的温度下处理。合适的低pH处理条件可以基于毒株、形式、来源和生产方法对不同的抗原而改变。因此，对于给定的抗原，合适的处理条件可以通过基于用于诱导交叉反应免疫应答和交叉保护的效力丧失的期望水平或范围，在不同的温度(0-37℃)筛选广泛的低pH(3-6.9)确定。该抗原可能有在非常低的pH(<4.5)变性的风险，这使得其对流感病毒抗原性相关性较低。因此，低pH处理可以优选地在pH4.5-6.5及合适的温度进行，以达到效力丧失的期望水平，同时最小化抗原的任何可能的变性。因为低pH对效力的作用通过增加温度而增加，基于使用的特定的低pH和温度的组合，在不同的条件下可达到相同水平的效力丧失是可能的。

适于增加的交叉反应免疫应答和交叉保护的诱导的效力丧失的程度可根据不同的抗原而改变，其范围可从1％-100％。如在实施例3和4中证明的，在一定范围内的效力丧失(20％-50％)以H1N1的NCWV抗原诱导与HA2的最高交叉反应。然而，效力丧失的合适范围可随着不同抗原而变化。约50％或更少的效力丧失是优选的，因为具有这种部分效力丧失的抗原可以特别有效地诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，且在同一时间也能诱导显著的或相同水平的毒株特异性免疫应答。它们可以额外的抗原配制，以满足效力标准。如实施例4中所示，具有仅为12.5％的效力丧失的抗原可以是有效的。在0-25℃范围内的温度优选用于产生具有相对较低的效力丧失(约50％或更少)的处理的抗原。因为疫苗在低温下(2-8℃)生产并储存，出于疫苗稳定性和预防微生物污染的目的，在2-8℃范围内的温度可以是特别合适的。

优选的是，抗原的血细胞凝集活性在低pH处理后被保持。因此，低pH处理后血细胞凝集滴度优选地保持相同或具有<2倍的降低。血细胞凝集活性反映了HA对细胞受体的结合，且是稳定性的重要指标。可以使用用于测量HA与受体结合的可替代方法。应当理解，取决于使用的生产方法，一些抗原或疫苗可以不具有血细胞凝集活性。因此，可能不能用血细胞凝集活性评估一些处理的抗原或疫苗。

用于在低pH处理期间调节pH的试剂可以是简单的酸和碱。用于降低pH的酸可选自包括以下的组，盐酸(HCl)、乙酸、柠檬酸、硼酸、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、和磷酸。低pH处理后用于提高pH到生理学水平的碱可以选自包括以下的组，氢氧化钠(NaOH)、乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠、磷酸钠、和Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)。它们可制成无菌溶液用于与抗原或疫苗混合。可替代地，以这些酸和碱制成的低pH缓冲液，如在合适的低pH的柠檬酸盐或乙酸盐缓冲液，可用于降低pH，且碱性pH缓冲液，如在～pH8.0的柠檬酸盐、Tris、或磷酸盐缓冲液，可以用于提高pH回到原始的或生理学的pH水平(7.0-7.4)。缓冲剂的用途具有最小化暴露抗原至极端pH的机会的优点。

可以通过在其它合适的条件下处理，获得用于增加交叉反应免疫应答和交叉保护的合适范围的效力丧失的抗原。已知的是，在高温或用变性剂诸如尿素的处理可如低pH诱导HA蛋白的相似的构象改变(Carr等人，1997)。因此，也可以使用基于变性剂如尿素、高温或其它化学和物理手段的替代的处理条件，以产生根据本发明的具有合适范围的效力丧失的处理的抗原，用于诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护。作为一个实例，可以通过在不同的高温(50-68℃；实施例8)下处理，获得效力的逐渐降低。用于抗原处理的合适范围的高温可以从40至80℃的范围，考虑到合适的温度可以随不同抗原而改变。为了避免抗原的可能变性，可优选37-70℃的较低的温度范围。温度的作用是依赖于时间的。合适程度的效力丧失可以通过在可以包括37℃或更低的较低的温度下处理较长的时间获得。在高温或其它替代处理后，抗原的血细胞凝集活性也优选被保持。

效力丧失反映了HA分子的抗原或结构的改变。以对HA特异性的多克隆抗体进行SRD。多克隆抗体由识别HA分子上的各种不同的表位的单个抗体构成，所述表位作为由一级氨基酸序列的不连续的部分或线性拉伸制成的结构可以是构象的或线性的。因此，效力的降低反映了在分子的某些区域中抗原的或结构的改变，消除了一些原始的表位并暴露了先前较少暴露或隐藏的那些。效力丧失是低pH处理后抗原或结构改变的优选的指标，因为它直接关系到抗原或疫苗诱导增加的交叉反应免疫应答和蛋白质以及毒株特异性免疫应答和保护的能力。然而，效力丧失可与对部分或全部HA的抗原或结构的改变的功能等价的替代测量相关，其可以包括生物学、免疫学、化学、生物化学、或形态学的方法，诸如与单克隆抗体反应、蛋白酶敏感性、溶血、细胞融合、电子显微镜术、差示扫描量热法(DSC)和圆二色性(CD)。因此，在低pH处理期间，通过功能等价的替代测量，可以指示并监测抗原或结构的改变，且稍后确定处理的抗原的效力用于配制最终疫苗以满足效力标准。作为一个实例，蛋白酶敏感性可以与效力丧失相关(实施例5)。在将来，可开发新型效力测定用于流感疫苗以关联并替代目前的SRD测试。

根据本发明的疫苗可以以各种不同的药物赋形剂或载体配制。它们可以包括盐和缓冲剂以提供生理学的离子强度和pH，表面活性剂诸如聚山梨醇酯20和80以防止抗原聚集，用于抗原稳定的稳定剂，诸如PEG、海藻糖、和明胶，及用于缓释的聚合物诸如CMC、HEC、和葡聚糖。疫苗还可以受控释放或增强的展示系统配制，诸如水凝胶、病毒体、纳米颗粒、和乳液。疫苗还可以佐剂配制，以进一步增加交叉反应免疫应答和交叉保护，所述佐剂可包括实施例6中描述的那些。疫苗可通过各种途径使用，如肌内、皮下、鼻内、局部、舌下、或口服。

总之，本发明提供了新型和改进的流感疫苗，及制造和施用其的方法。这种疫苗不仅可以提供针对异源病毒的增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，还可以像目前的灭活疫苗提供针对季节性流感病毒的毒株特异性保护。因此，在满足提供针对可能的未来的大流行的保护以及更好地控制季节性流感的流行的迫切需要方面，它具有明显的优势。提供以下实施例以说明本发明的原理而非限制其范围。

实施例1

低pH处理后的灭活流感全病毒(WV)抗原的效力

使用了来自三种病毒株(A/NewCaledonia/20/99，H1H1(H1N1NC)；A/Wisconsin/67/2005，H3N2(H3N2Wis)；B/Malaysia/2506/2004(BMal)的灭活WV抗原。它们是通过从感染的MDCK细胞纯化，并在4℃以甲醛(1/4000稀释或0.01％)灭活至少三天产生的。灭活通过在鸡卵中的滴度和在MDCK细胞中的空斑测定确认。

对于低pH处理，在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.2；～2.0mg/ml)中的抗原以含有150mMNaCl(pH4.6-5.4，以0.2增量)的20mM柠檬酸钠缓冲液1:10稀释使抗原的pH达到4.9-5.5，最终抗原浓度为～0.2mg/ml。然后，将抗原在0℃(冰上)、4℃、25℃(室温)、或37℃保持15min，随后用适当体积的1MTrisHCl缓冲液(pH8.0)将pH调节回到原始的水平(7.0-7.4)。可替代地，使用以抗原稀释(例如，1：10)的低pH缓冲液(0.2M柠檬酸盐/0.1M磷酸盐，pH3.6-6.6，以0.2增量)。这允许抗原在更高的蛋白质浓度被处理。灭活抗原的HA的效力或量通过SRD测试根据Wood等人描述的方法测量(JBiolStand.5:237-247,1977；DevBiolStand.64:169-177,1986)。以在说明书中提供的推荐浓度使用SRD参考血清和抗原(H1N1、H3N2和B；FDA)。

对于不同条件的筛选，基于在SRD测试板中形成的沉淀环的尺寸分析了结果。它们表明，如较小的沉淀环所反映的，低pH处理的抗原表现出降低的效力(图1A和表1)。沉淀环尺寸或效力的降低与处理条件直接相关。pH越低，效力丧失越大(图1A和表1)。升高温度显著地增强了低pH对降低效力的作用(图1A和表1)。从最温和的(pH5.5和0℃)到最严格的(pH4.9和37℃)处理条件获得了全范围的效力丧失(17.6％-98.6％)。图2显示了在pH5.1和不同温度下处理的H1N1WV抗原以及参考标准的效力。在0和4℃之间没有观察到效力丧失的明显差异。

用灭活的H3N2和BWV抗原获得了类似的结果，即效力丧失随着pH降低和温度升高而升高。然而，效力丧失的程度在不同抗原中变化。在各种条件下H3N2抗原显示了与H1N1抗原相似程度的效力丧失，而B抗原对低pH处理更为敏感得多-在4℃和pH5.6获得了>50％的效力丧失。

在低pH处理后，还使用1％鸡红细胞(RBC)在96孔V底板中测量了血细胞凝集活性。在50μlPBS中将抗原一式两份连续稀释2倍，然后与等体积的1％新鲜鸡RBC混合。将板在室温下保持1hr，随后确定血细胞凝集滴度，其为具有完全凝集的最高稀释度。结果显示，对于H1N1NC抗原，当效力已丧失93.1％时血细胞凝集活性保持相同，且在最低的pH(4.9)和37℃的处理后，具有98.6％效力丧失，血细胞凝集活性仅下降2倍(表2)。

实施例2

低pH处理后的三价灭活疫苗(TIV)的效力

TIV(Fluzone，2006-2007年)，其含有实施例1中描述的相同的三种病毒株的抗原，也评价了其在不同条件下低pH处理后的效力。疫苗进行相似的处理，但在以等体积的0.1MNaOH中和之前，将适当体积的0.1MHCl加入疫苗，pH调节至相似的范围。测量了H1N1NC毒株的效力。结果类似于如上所述以灭活WV抗原获得的那些(图1B和表3)。然而，TIV比WV抗原对低pH处理更敏感，因为在任何给定的条件下TIV的效力丧失更大。这可能与TIV由裂解抗原制成的事实有关。在37℃下对于测试的所有pH水平，获得了完全的效力丧失(100％)(图1B和表3)。类似地，在37℃或最低的pH(4.5)处理后，血细胞凝集活性仅降低2倍或更多(表4)。

在单独的测试中，在pH5.2和4个不同的温度(0、4、25、或37℃)处理疫苗，测试了所有三种毒株的效力。在不同条件下H1和H3抗原表现出相似水平的效力丧失，而B抗原表现出大得多的丧失，与使用灭活WV抗原(实施例1)的结果相一致。在0和4℃之间没有观察到效力丧失的差异。

实施例3

由低pH处理的抗原对增加的交叉反应抗体应答的诱导

具有不同水平的效力丧失的低pH处理的H1N1NCWV抗原与未处理的对照一起用于免疫6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(n＝7)。抗原在pH5.1和不同温度(0、25、和37℃)下处理，且如实施例1中所述的确定效力(HA，μg/ml)。处理的抗原展示了与处理条件相关的效力的降低，但保留了原始的血细胞凝集活性(表5)。

基于总蛋白质以相同的抗原剂量免疫小鼠，其等价于未处理的抗原1μgHA/小鼠通过肌内注射两次，间隔4周。还包括接受包含等份的未处理的抗原和在37℃处理的抗原的抗原混合物的组(表5)。如预期的，混合的抗原表现与未处理的抗原相似水平的效力(表5)。第2次免疫后，每隔两周收集血清样品至第4周。特异性抗体通过血细胞凝集抑制(HAI)、中和测试(NT)、ELISA，和免疫印迹测量。

HAI和NT

HAI和NT测量中和抗体。使用鸡RBC如对动物流感诊断和监测的WHO手册(WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5)中的描述的进行HAI测试。简要地，单独或混合的血清样品在37℃下以受体破坏酶(RDE)处理过夜，且然后在HAI测试使用之前，在56℃下灭活30min。HAI滴度是具有凝集的完全抑制的最高稀释度(当板倾斜时，RBC点流下来)。

NT在96孔板中在MDCK细胞中进行。来自每个组的混合的血清样品在56℃灭活30min，并在混合之前以100TCID50病毒(H1N1NC，或H1N1PR8)一式两份连续稀释2倍。在37℃温育1hr后，将混合物转移至96孔板中的MDCK细胞，并在37℃温育1hr。除去混合物后，将板用培养基洗涤一次，且然后加入含有1μg/ml胰蛋白酶的新鲜培养基。将板在37℃温育48hr，然后在福尔马林中固定并用结晶紫染色。中和滴度是具有完整细胞单层的最高稀释度。

结果表明，针对与效力丧失相关的同源病毒(H1N1NC)相比未处理的对照抗原，低pH处理的抗原诱导较低的HAI或NT滴度(表6)。但是，处理的抗原仍能够诱导相当水平的HAI和NT滴度。特别地，具有21.1％效力丧失(0℃)的抗原的HAI或NT滴度相比未处理的抗原仅低约2倍。如预期的，没有血清样品诱导针对异源H1N1病毒(A/PuertoRico/8/34,H1N1PR8)的可检测的HAI或NT滴度(表6)。

包含相同量的未处理的和低pH处理(37℃)的抗原的混合的抗原诱导与未处理的抗原相似的HAI和NT滴度(表6)。这与处理的抗原的效力丧失通过加入未处理的抗原补偿是一致的(表5)。

ELISA

ELISA测量总抗原结合抗体。以用于免疫小鼠的未处理的或低pH处理的灭活H1N1NCWV抗原，以及包括H5N3鸭的WV抗原(A/鸭/Singapore-Q/F119-2/97)、H3N2Wis和BMal，及单价2009年H1N1大流行疫苗(A/California/7/2009,H1N1CA)(Sanofi-Aventis)的异源抗原进行。以5μg/ml的WV抗原和在0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)中的1μgHA/ml的单价疫苗包埋96孔板(100μl/孔)，在4℃过夜。混合的血清样品连续稀释2倍，并在室温温育2hrs。洗涤后，将板与抗小鼠IgG碱性磷酸酶轭合物温育1hr，随后洗涤并与pNPP底物温育30min。在405nm处测量OD。在相同的板上同时针对每种抗原测试了所有5种混合的血清样品。针对不同抗原的血清样品的滴度曲线示于图3。还使用CDCELISA程序分析了数据，通过针对未处理的抗原100任意单位分配血清，并用它作为参考来计算针对处理的抗原的血清样品的单位用于比较(表7和图4)。

结果显示，相比处理的抗原，未处理的抗原诱导更好地与它自身反应的抗体(图3A和4，表7)，且类似地，相比未处理的抗原，处理的抗原诱导更好地与它们自身反应的抗体(图3B-D和4，表7)。这表明，处理的抗原是高度免疫原性的，并至少部分地与未处理的抗原的抗原性不同。由在37℃处理的抗原诱导了处理的抗原的最高反应，且具有最大的效力丧失(90％)(图3B-D和4，表7)。

如预期的，相比与同源抗原的反应，与异源抗原的反应的总体水平较低(图3)。然而，相比未处理的抗原，三种处理的抗原(pH5.1和0、25、或37℃)的每个诱导了与异源抗原(H1N1CA和H5N3鸭)的更高的交叉反应(图3E-F和4；表7)。在37℃处理的具有90％的效力丧失的抗原诱导了最高的交叉反应，其比未处理的抗原高>2倍(图3E-F和4；表7)。然而，在0℃处理的或仅具有21.1％的效力丧失的抗原也获得了显著增加的交叉反应(>70％)(图3E-F和4；表7)。以H3N2Wis抗原观察到交叉反应中较小的增加(<50％)(图3G和4；表7)。以BMal抗原未观察到交叉反应(图3H)。H1和H5亚型属于系统发生组I，而H3亚型属于系统发生组II。因此，由低pH处理的抗原诱导的交叉反应表现为在来自相同系统发生组的异源抗原中更高。

为了进一步证实这些结果，测试了同源H1N1NC的和异源H1N1CA和H1N1PR8病毒(Sino-Biologicals)的重组HA。这些重组HA在哺乳类细胞中产生，且包括HA的完整的胞外域。如以灭活的抗原，相比同源的HA(H1N1NC)，与异源重组HA的整体反应水平较低(图5和表8)。然而，针对处理的抗原的血清样品显示出与异源重组HA的增加的交叉反应(图5和表8)，从而进一步指示处理的抗原诱导增加的交叉反应的能力，且表明增加的交叉反应指向HA。针对在37℃处理的抗原的血清表现出与异源抗原的最高的交叉反应，滴度与未处理的抗原比高近4倍，随后是针对在0℃(2.1-2.6倍)和25℃(1.5-2.0倍)处理的抗原的那些(图5和表8)。

包含相同量的未处理的抗原和在37℃处理的抗原的混合抗原一致地诱导针对测试的同源和异源抗原两者的高水平的应答(图3-5和表7-8)，表明混合的抗原可有效地诱导针对同源和异源抗原两者的应答。

免疫印迹

还针对同源和异源抗原通过免疫印迹测试了混合的血清样品。抗原通过SDS-PAGE分离，且然后印迹至尼龙膜(Immobilon-P，Millipore)上。将膜用包含PBS中3％BSA和0.025％吐温20的封闭缓冲液封闭。来自每个组的混合的血清样品在封闭缓冲液中稀释，并在室温下与膜温育2hrs。然后将膜与抗小鼠IgG碱性磷酸酶轭合物温育1小时，随后洗涤并与NBT/BCIP底物反应。为了比较抗体结合单个蛋白质条带的相对水平，使用ImageJ程序(NIH)测量阳性条带的密度。

结果表明，相比未处理的抗原，处理的抗原诱导与HA1和HA2更强的抗体反应(图6)。值得注意的是，不同条件下处理的抗原诱导明显不同的抗体反应模式。在温和的条件下(0℃)处理的具有21.1％效力丧失的抗原诱导与HA2反应的最大的增加，而在37℃处理的具有90％的效力丧失的抗原诱导与HA1反应的最大的增加，如与同源H1N1NC抗原所示的(图6)。以在25℃处理的具有66.3％的效力丧失的抗原获得中间反应模式。这些不同的反应模式也在以类似地处理的抗原的单独的实验中观察到(见实施例4)。

如同以ELISA，用异源抗原的反应的总程度比用同源抗原的低。然而，在温和条件(0℃)处理的抗原诱导的与HA2最高的反应以所有测试的异源抗原一致地发生，所述异源抗原包括H1N1CA和H5N1VN(AVietnam/1203/2004)单价疫苗和H5N3鸭WV抗原(图6)，且是未处理的抗原>2倍高。与HA2的增加的交叉反应也以杆状病毒表达的重组HA(H5N1VN)显示，在使用前将其用胰蛋白酶处理以分离HA1和HA2(Wang等人,Vaccine.24:2176-2185,2006)。另一方面，在不同的处理条件下，不同的异源抗原与HA1的增加的反应在单个抗原之间变化(图6)。这些结果与HA2比HA1更保守的多的事实相一致。还观察到H3N2Wis与HA2交叉反应的小幅增加，但以BMal抗原没有观察到交叉反应。

总之，这些结果显示，以温和的条件(0℃)处理的抗原诱导与HA2更大的反应，而以更严格的条件(37℃)处理的抗原诱导与HA1更高的反应。这表明，在不同的低pH处理的条件下，抗原或结构的改变不仅是定量的，也是定性的。这也与以下一致：如通过免疫印迹测量的与HA1或HA2的增加的交叉反应，不一定与通过ELISA测量的总交叉反应抗体水平相关。

实施例4

由在合适的低pH条件下处理的抗原对增加的交叉反应抗体应答和交叉保护的诱导

进行如实施例3中的相似的实验，但是在实验结束时以异源病毒攻击小鼠。在pH5.2和不同温度(0、25、或37℃)处理H1N1NCWV抗原。这些抗原的效力和血细胞凝集活性示于表9。这些抗原的效力降低类似于实施例3中描述的，但在4℃和25℃处理的抗原中较低(表9)。这与用于处理的pH(5.2)略高相一致。如实施例3，6-8周龄的雌性Balb/c小鼠组(n＝7)以处理的和未处理的抗原免疫。通过ELISA、HAI、NT和免疫印迹，使用同源(H1N1NC)和异源(H1N1PR8)抗原或病毒类似地分析了混合的血清样品。在第2次免疫后第3周，以H1N1PR8病毒每只小鼠1×10⁶TCID₅₀的高度致死剂量进行攻击。攻击后，每日监测小鼠的体重和存活。

交叉反应免疫应答

如实施例3所示，所有处理的抗原诱导增加的交叉反应总抗体应答，如通过ELISA测量的(表10)。通过定义终点为比背景高至少2倍的OD值确定ELISA滴度。相比在0℃处理的抗原，在25℃和37℃处理的抗原诱导与异源H1N1PR8抗原较高的交叉反应(表10)。

在0℃处理的具有12.5％的效力丧失的抗原诱导与未处理的抗原相同的HAI和NT滴度，而在37℃处理的抗原诱导针对同源病毒最低的HAI和NT滴度(表10)。在25℃处理的抗原显示了2倍低的HAI滴度和相同的NT滴度(表10)。这与获得的效力降低的水平相一致。如实施例3，未处理的抗原不能诱导针对异源H1N1PR8的任何可检测的HAI或NT滴度，进一步证实了这两种病毒之间的异源性质(由HAI，≥32倍的差异，表10)。然而，在25℃处理的抗原确实诱导了针对H1N1PR8的低但是增加的HAI和NT滴度水平。

免疫印迹结果显示，如实施例3，所有处理的抗原诱导与HA1和HA2增加的反应。在37℃处理的具有90％效力丧失的抗原诱导与同源的H1N1NC或异源的H1N1PR8的HA1最高的反应或交叉反应，而与HA2的这样的反应或交叉反应的最高水平以在25℃处理或具有45.5％的效力丧失的抗原获得(图7A)。与实施例3中的显示以HA2的最高交叉反应是由在pH5.1和0℃下具有21.1％的效力丧失的处理的抗原诱导的结果一起，这些结果表明，具有20-50％的效力丧失的处理的抗原在诱导与HA2更高的交叉反应方面特别有效。

交叉保护

攻击结果显示，在0和25℃处理的抗原提供了相比未处理的抗原(14％或1/7)大大增加的交叉保护(43％或3/7)(图7B)。与之相反且和出乎意料的是，在37℃处理的抗原没有得到可检测的交叉保护(图7B)。在25℃处理的抗原提供整体最佳的交叉保护，因为具有该抗原的小鼠存活较长(图7B)且恢复的那些得到体重更早和更快，在两周的观察结束时，达到原始体重的>90％。如上所示，在0和25℃处理的抗原分别表现出12.5％和45.5％的效力丧失，且在25℃处理的抗原诱导了与HA2的增加的交叉反应的最高水平。因此，增加的交叉保护与部分效力丧失(<50％)和以HA2的增加的交叉反应相关联。

在强攻击条件且不使用任何佐剂下通过在温和条件(0℃和25℃)处理的抗原获得了尽管部分的、增加的交叉保护的水平(图7B)。这样的增加的交叉保护在大流行或高度感染的季节性变体病毒的出现的事件中可以非常重要。在37℃处理的抗原不提供任何可检测的交叉保护是非常出乎意料的。它可能具有较弱的交叉保护，其在使用的强的攻击条件下不能被检测(图7B)。在温和的条件下处理的抗原可能只获得有限的抗原或结构的改变是可能的，其适合于在其天然形式中HA2和可能的其它保守结构域的更好的暴露，且从而增加交叉反应和保护，而在37℃处理的那些可能获得过度的抗原或结构的改变，如几乎完全的效力丧失所证明的，且从而可能与天然HA较不相关，且因此保护较少。

实施例5

低pH处理的抗原的蛋白酶敏感性

已知低pH处理诱导HA的结构改变，这使其对蛋白酶消化敏感(Carr等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:14306-14313,1997)。因此，将实施例4中制备的未处理的和低pH处理的抗原与胰蛋白酶(10μg/ml)混合，并在室温下温育30min。然后，通过SDS-PAGE分离抗原，并以考马斯亮蓝染色。结果显示，在未处理的抗原中的HA耐受胰蛋白酶消化，而在处理的抗原中的HA1与处理条件相关逐渐被消化(图8)。在37℃处理的抗原中的HA1几乎完全消失，而在0℃处理的抗原中的HA1大多数保持完整。在25℃处理的抗原中约50％的HA1被消化。HA1的逐渐消失与其降解产物的逐渐出现相关(DP1，图8)。不能清晰地检测HA2中的改变，因为它与M1蛋白质共迁移(图8)。因此，这些结果显示，如同效力丧失，蛋白酶敏感性与低pH处理条件直接相关地增加。

实施例6

将低pH处理的抗原配制为疫苗

包括HA的流感抗原首先在合适的低pH或其它合适的条件下处理，以得到合适水平的效力丧失或抗原或结构的改变。然后将它与药学上可接受的赋形剂或载体配制为疫苗，用于诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护。通过掺入来自一种或更多种毒株的抗原，疫苗可以是单价或多价的。可以掺入合适的佐剂以进一步增强交叉反应免疫应答和交叉保护。合适的佐剂可以选自多糖诸如脂多糖和皂苷、核酸诸如CpG和聚I:C、脂质诸如MPL(单磷酰脂质A)、蛋白质诸如细菌鞭毛蛋白、无机盐诸如铝盐和磷酸钙、乳剂诸如弗氏不完全佐剂、MF59和AS03、和各种Toll样受体配体。可以用处理的抗原测试不同的佐剂，以鉴定在合适的佐剂剂量产生较高水平的交叉反应免疫应答和交叉保护，包括完全的或100％的保护的合适的佐剂。同时，使用合适的佐剂也将增加毒株特异性免疫应答，允许疫苗诱导与未处理的抗原或像目前的灭活疫苗相同或甚至更高的水平的这样的应答(见下文)。

疫苗也可以配制以满足效力标准，使得所得的疫苗将不仅提供增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，还提供像目前的灭活疫苗相同水平的毒株特异性保护。这种双效疫苗可以通过以不同的方法补偿处理的抗原的部分效力丧失来制造。一种方法是混合处理的抗原与适量的未处理的抗原以满足效力标准。如实施例3所示，以在37℃处理且具有≥90％的效力丧失的抗原，可以制备处理的和未处理的抗原的混合物，具有预期的效力和免疫原性的水平。作为一个实例，对于具有20％的效力丧失的处理的抗原，可以向疫苗加入具有完整的效力的20％更多的未处理的抗原，以满足效力标准。

另一种方法是基于效力丧失的程度，使用按比例增加量的处理的抗原。例如，对于具有20％的效力丧失的处理的抗原，需要仅25％更多的该相同抗原以满足效力标准。在温和的条件(0-25℃)处理的和具有小于50％的效力丧失的抗原，对保存抗原的使用可以是优选的。这种方法具有一个明显的优势，在于仅使用一种抗原组分。此外，随着更多的处理的抗原的存在，疫苗可诱导较高的水平的交叉反应免疫应答和交叉保护。

一种另外的方法是将处理的抗原与可包括上述那些的适当的佐剂配制。佐剂增强免疫应答，且从而降低实现相同水平的免疫应答和保护所需要的抗原的量或效力的水平。对于灭活流感疫苗，通过使用合适的佐剂，达到在人中的保护所需的抗原的量可以从标准的15μgHA降低数倍，低至1.5μgHA(Cox等人，Vaccine29:8049-8059,2011；Garcon等人，ExpertRevVaccines.11:349-366,2012)。因此，合适佐剂的掺入可允许处理的抗原进一步增加交叉反应免疫应答和交叉保护，且同时还诱导像未处理的抗原相同水平的毒株特异性免疫应答和保护，而不需要任何额外的抗原。

实施例7

重组HA的低pH处理

如在实施例1和2中描述的，杆状病毒(BEIResources)产生的H3N2Wis(AWisconsin/67/2005)的重组HA在pH5.2和不同的温度(0、25、或37℃)处理。通过如实施例1中描述的SRD确定处理的抗原的效力。如对于灭活WV抗原和TIV，低pH处理与处理条件相关地降低重组HA效力。因此，效力在37℃完全丧失(100％)，在25℃为93.1％，及在0℃为36.6％(表11)。这些结果表明，与低pH处理的条件相关，重组HA的效力也可以逐渐降低。

实施例8

在高温下流感抗原的处理

将在PBS(pH7.2)中的H1N1NC的灭活WV抗原置于250μl管(100μl/管)中，且在PCR(聚合酶链式反应)机器中在不同温度下加热10min。如实施例1所述，评价了处理的和未处理的抗原的效力和血细胞凝集活性。

结果显示，随着温度增加效力降低(表12)。在50℃效力降低了14.8％，且在68℃降低了75.7％。当抗原在62℃或更低温度处理时，获得相对低水平的效力丧失(<21％)。温度达到≥64℃后，随着每两度的温度上升，效力显著地降低(表12)。在66℃(63.4％的效力降低)血细胞凝集滴度开始降低，且在68℃(75.7％效力降低)降低4倍。相比低pH处理(实施例1和2)，在与效力丧失的程度相关的高温处理，血细胞凝集滴度表现出快得多的降低，这表明抗原变性可能发生在较高温度下。

Claims (36)

1.一种流感疫苗，所述流感疫苗包括至少一种包含流感血凝素的抗原，其中所述抗原在合适的低pH条件下经受处理以得到合适程度的效力丧失；其中所述疫苗诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，

其中所述处理包括：

a.调节所述抗原的pH至合适的低pH，所述合适的低pH范围为从3.0到6.8；

b.将所述抗原在合适的温度下保持合适的一段时间，其中所述合适的温度范围为从0至37℃；以及

c.调节所述抗原的pH回到原始的或生理学的水平以产生处理的抗原，其中所述处理的抗原获得范围从1％至100％的合适程度的效力丧失。

2.根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗包括至少两种选自包括A型流感病毒H1和H3亚型的组的所述抗原。

3.根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗包括至少三种所述抗原，所述抗原选自包括来自第一系统发生组的至少两个进化枝、及来自第二系统发生组中的至少一个进化枝的组，其中每个所述抗原选自独立的进化枝。

4.根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述抗原是灭活的或重组的。

5.根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述抗原是活病毒，所述活病毒在所述处理后被灭活。

6.根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述合适的低pH范围为从4.5至6.5。

7.根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述合适的温度范围为从0至25℃。

8.根据权利要求1所述的流感疫苗，其中在所述处理后，所述抗原表现出血细胞凝集活性中无或小于2倍的降低。

9.根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述合适程度的效力丧失的范围为从10％至50％。

10.根据权利要求9所述的流感疫苗，其中所述合适的温度范围为从0至25℃。

11.根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述效力丧失由对抗原的或结构的改变的功能等价的替代测量指示。

12.根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗诱导针对HA2的增加的免疫应答。

13.根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗被配制为满足诱导毒株特异性免疫应答和保护的效力标准。

14.根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗还包括佐剂。

15.有效剂量的权利要求1所述的流感疫苗在制备用于在人或动物中诱导针对流感病毒的增加的交叉反应免疫应答和交叉保护的药物中的用途。

16.有效剂量的权利要求13所述的流感疫苗在制备用于在人或动物中诱导针对流感病毒的毒株特异性免疫应答和保护及增加的交叉反应免疫应答和交叉保护两者的药物中的用途。

17.一种用于产生包括至少一种包含流感血凝素的抗原的流感疫苗的方法，其中所述疫苗诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护；其中所述方法包括：

a.调节所述抗原的pH至合适的低pH，所述合适的低pH范围为从3.0到6.8，

b.将所述抗原在合适的温度下保持合适的一段时间，其中所述合适的温度范围为从0至37℃，

c.调节所述抗原的pH回到原始的或生理学的水平以产生处理的抗原，其中所述处理的抗原获得范围从1％至100％的合适程度的效力丧失，和

d.在药学上可接受的载体中将所述处理的抗原配制为疫苗。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述合适的低pH范围为从4.5至6.5。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述合适的温度范围为从0至25℃。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述疫苗通过合适的配制途径配制以满足效力标准，所述配制途径包括：

a.将合适量的所述处理的抗原掺入所述疫苗，

b.将合适量的未处理的和所述处理的抗原的混合物掺入所述疫苗,和/或

c.将佐剂掺入所述疫苗，

其中所述疫苗还诱导毒株特异性免疫应答和保护。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗原是灭活的或重组的。

22.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗原是活病毒，所述活病毒在步骤c后被灭活。

23.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗原是由哺乳类细胞、鸟类细胞、昆虫细胞、细菌细胞、植物细胞、鸡卵、昆虫或植物产生的。

24.根据权利要求17所述的方法，其中所述处理的抗原表现出血细胞凝集活性中无或小于2倍的降低。

25.根据权利要求17所述的方法，其中所述合适的温度为2-8℃。

26.根据权利要求17所述的方法，其中所述合适程度的效力丧失的范围为从10％至50％。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述合适的温度为0-25℃。

28.根据权利要求17所述的方法，其中所述效力丧失由对抗原的或结构的改变的功能等价的替代测量指示。

29.包括至少一种包含流感血凝素的抗原的流感疫苗在制备用于诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护的试剂盒中的用途，当所述试剂盒被使用时，包括以下步骤：

a.向所述疫苗加入酸性溶液，以调节所述疫苗的pH至合适的低pH，其中所述合适的低pH选自3.0-6.8的范围，

b.将所述疫苗在合适的温度下保持合适的一段时间，其中所述合适的温度选自0至37℃的范围，及

d.将所述疫苗施用至人或动物，

其中所述抗原获得范围从1％到100％的合适程度的效力丧失。

30.根据权利要求29所述的用途，其中所述合适的低pH选自4.5至6.5的范围。

31.根据权利要求29所述的用途，其中所述合适的温度选自0至25℃的范围。

32.根据权利要求29所述的用途，其中所述抗原获得范围从10％至50％的合适程度的效力丧失。

33.根据权利要求29所述的用途，当所述试剂盒被使用时，还包括向所述疫苗加入碱性溶液，以调节所述疫苗的pH回到原始的或生理学的水平。

34.根据权利要求33所述的用途，所述试剂盒包括

a.在容器中的酸性溶液，及

b.在容器中的碱性溶液。

35.根据权利要求34所述的用途，其中所述酸性溶液为低pH缓冲液。

36.根据权利要求34所述的用途，其中所述碱性溶液为在碱性pH的缓冲液。