KR20110092280A

KR20110092280A - ｐＨ에 안정한 외피보유 바이러스의 생산 방법

Info

Publication number: KR20110092280A
Application number: KR1020117011829A
Authority: KR
Inventors: 줄리아 로마노바; 안드레 에고로프; 브리짓 크렌; 마커스 울스첵; 사빈 나코위치
Original assignee: 에빌 그린 힐즈 바이오테크널러지 리서치 디벨롭먼트 트레이드 아게
Priority date: 2008-11-25
Filing date: 2009-11-25
Publication date: 2011-08-17
Also published as: JP5762969B2; JP2012509684A; CA2744354C; US20110223199A1; WO2010060921A1; EA024262B1; US8883479B2; CA2744354A1; KR101741848B1; CN102223895B; CN102223895A; US20140377308A1; US20100172934A1; EP2364167B1; US8815252B2; EA201100845A1; EP2364167A1

Abstract

본 발명은 바이러스를 낮은 pH 조건에서 숙주 세포를 감염시키고 낮은 pH의 조건하에 세포 배양 세포와 함께 항온처리하기 위해 사용하는 pH-안정성 외피보유 바이러스를 생산하는 방법, 및 또한 세포 배양물 속에서 높은 성장률, 증가된 pH 및 온도 안정성을 나타내고 사람 수용체 특이성을 갖는, 상기 방법으로 수득가능한 인플루엔자 바이러스를 제공한다.

Description

ｐＨ에 안정한 외피보유 바이러스의 생산 방법{Method for production of pH stable enveloped virus}

본 발명은 외피보유 바이러스(enveloped virus)를 세포 배양 세포와 함께 낮은 pH의 조건하에서 항온처리함을 포함하는, pH에 안정한 외피보유 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 바이러스는 세포 배양물에서 높은 성장률, 증가된 pH 및 온도 안정성을 나타내며 사람 수용체 특이성을 갖는 신규한 인플루엔자 바이러스를 포함한다.

바이러스 감염의 매년 유행성으로 유발된 질병을 예방하기 위해, 예방접종은 가장 중요한 공중 건강 척도이다. 백신의 효과적인 공급은 다량의 백신 물질(예를 들면, 바이러스)을 신속하게 생산할 수 있느냐에 의존한다. 백신 및 이들의 풍부한 이용가능성의 신속한 개발은 많은 사람 및 동물 질병을 방지하는데 있어서 중요하다. 백신 생산의 지연 및 이의 양에 있어서의 부족은 질병의 발생을 다루는데 있어서 문제점들을 유발할 수 있다.

병아리 발육란에서 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스의 성장은 불활성화되거나 또는 약독화된 인플루엔자 바이러스 백신의 생산에 사용될 수 있는 인플루엔자 바이러스 입자를 효과적으로 생산시키는 것으로 입증되어 왔다. 그럼에도 불구하도 지난 수년 동안 달걀에 기초하는 방법(egg-based method)은 범유행성인 경우에 문제를 유발할 수 있는 특수 병원체가 없는 달걀(pathogen-free egg)의 꾸준한 공급을 필요로 하기 때문에 세포 배양을 사용한 바이러스 생산 시스템을 확립하는데 있어 집중적인 노력이 이루어져 왔다. 세포를 기초로 하는 기술(cell-based technology)은 달걀 공급업자와는 독립적이며 종균 바이러스가 이용가능하자마자 시작할 수 있는 대체 생산 방법이다. 이 외에도, 포유동물 세포에서 성장돤 바이러스로부터 제조한 불활성화된 인플루엔자 백신은 보다 더 교차-반응성인 혈청 항체를 유도하며 달걀에서 성장시킨 백신보다 더 우수한 보호를 나타내는 것으로 밝혀졌다(참조: Alymova 등, 1998, J Virol 72, 4472-7). 더우기, 앞서의 결과에 따르면 사람 분리체의 수용체 특이성 및 항원 특성은 발육된 달걀에서 바이러스의 성장에 따라 변경되어진다(참조: Mochalova 등, 2003, Virology 313, 473-80, Romanova 등, 2003, Virology 307, 90-7).

한편, 조직 배양에서 바이러스의 다량 증식은 종종 융합체의 상승된 pH를 갖는 HA 돌연변이체를 생성하며(참조: Lin 등, 1997, Virology 233, 402-10), 이러한 돌연변이체는 바이러스의 열 변성에 대한 감소된 안정성과 상관관계가 있다(참조: Ruigrok 등, 1986). 특정 단백질의 구조 및 이의 안정성은 소수성 힘(hydrophobic force), 반 데르 바알스 상호작용(van der Waal interaction), 수소 결합, 및 이온 상호작용과 같은 비공유결합성 상호작용에 기초한다. 바이러스를 세포 배양물에 적응시킬 때 나타나는 돌연변이는 HA 분자내 변화된 이온 상호작용 및 염 다리(salt bridge)로 인하여 감소된 단백질 안정성에 의해 유발된 융합체의 pH의 한계(threshold)를 상승시키는 것으로 알려져 있다(참조: Rachakonda 등, 2007, Faseb J 21, 995-1002). 계면 HA1-HA2 또는 HA2-HA2 영역, 또는 HA2의 N 말단에서 일반적으로 발견된 돌연변이체의 탈안정화는 결국 세포-표면 수용체에 대한 감소된 결합을 초래할 수 있으며(참조: Korte 등, 2007, Rachakonda 등, 2007, Faseb J 21, 995-1002, Shental-Bechor 등, 2002, Biochim Biophys Acta 1565, 81-9), 이러한 결합은 감소된 바이러스 감염성 및 후속적으로 생 바이러스 제제의 감소된 면역원성을 초래한다.

Massaab(참조: Massaab H.F., Journal of Immunology. 1969, 102, pp. 728-732)는 원시 닭 신장 조직 배양물 및 수정란에서 성장에 대한 적응 전 및 후에 상이한 유전적 마커(genetic marker)를 사용하여 냉-적응된 인플루엔자 바이러스의 생물학적 및 면역학적 특성을 시험하였다. 이들 균주는 원래의 "야생형" 균주와 비교하여 낮은 pH에 대해 더 민감성이며 감염성 및 헤마글루틴화 수율에 있어 현저한 감소를 나타낸다.

Fiszman 등은 문헌(참조: Journal of Virology, 1974, 13, pp. 801-808)에서 수포성 구내염 바이러스(VSV)에서 낮은 pH(pH 6.6)의 효과를 시험하였으며 바이러스 입자 또는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)가 검출되지 않았음을 밝혔다. Ackermann W 및 Massaab H.F.(참조: Journal of Experimental Medicine FEB 1954, 99, pp 105-117)는 인플루엔자 바이러스의 성장 주기에서 바이러스 억제제, 알파-아미노-p-메톡시-페닐메탄설폰산이 효과를 기재하였다.

어떠한 안전성 또는 공급 문제를 피하기 위하여 고 안정성 및 면역원성인 세포 배양물로부터 다량의 백신 바이러스 제제를 수득하는데 있어서의 어려움으로 인하여, 본 발명의 목적은 효과적이고 안정한 바이러스를 생성하는 이용가능한 방법들을 제공하는 것이다. 당해 목적은 본원의 양태들의 제공으로 달성된다.

본 발명은 바이러스 현탁액의 희석 및 숙주 세포 감염 동안 감소된 pH의 조건을 사용함으로써 조직 배양물 속에서 pH에 안정한 외피보유 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 또한 현재 사용된 방법으로부터 기원한 바이러스 입자와 비교하여 안정성 및 면역원성이 증가된 바이러스를 제공하는 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은

a) 바이러스를 pH가 5.2 내지 5.9, 바람직하게는 5.5 내지 5.8, 가장 바람직하게는 약 5.6인 용액 속에 희석시키는 단계;

b) 숙주 세포를 적어도 하나의 감염성 바이러스 입자로 감염시키며, 여기서

i) 상기 바이러스 입자를 상기 숙주 세포에 가하고 또한 ii) 상기 세포 및 상기 바이러스 입자를 pH 5.2 내지 5.9, 바람직하게는 5.4 내지 5.8, 가장 바람직하게는 약 5.6에서 항온처리하여 바이러스/세포 복합체를 제공하는 단계;

c) 감염된 숙주 세포를 배양하여 바이러스를 증식시키는 단계;

d) 바이러스를 수거하는 단계; 및 임의로

e) 바이러스를 정제하고/하거나 특성화하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 외피보유 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법에 의해 수득된 바이러스는 실험실 규모의 양의 바이러스의 생산 및 백신 바이러스의 대규모 생산에 사용될 수 있다.

"대규모 생산"은, 최소 배양 용적이 적어도 200 ℓ, 바람직하게는 적어도 500 ℓ, 바람직하게는 약 1000 ℓ인 생산을 의미한다.

외피보유 바이러스를 함유하는 백신 제제는 충분한 예방접종을 제공하기 위해 면역원성이어야 한다. 특히, 조류 인플루엔자에 대한 것과 같은 불활성화된 보편적인 인플루엔자 백신은, 면역원성이 불량할 수 있고 사람에서 보호성 항체 반응을 유발시키기 위해서는 고 투여량이 요구된다. 효과적인 항체 반응은 바이러스 감염에 대한 중대한 면역원성을 제공한다. 헤마글루티닌(HA) 단백질은 인플루엔자 바이러스를 사용한 바이러스 감염 및, 불활성화되고 약독화된 플루 백신 둘다를 사용한 예방접종에 의해 유도된 보호성 항체 반응의 주요 표적이다. HA 항원의 구조 통합성은 보호성 항체 반응을 유발하는데 있어 중요하다.

본 발명자들은, 본 발명의 방법이 pH 안정성 및 증가된 면역원성을 포함하는 바이러스를 제공함을 입증하고 있다. 이렇게 생산된 바이러스 입자의 HA 단백질은 바람직하게는 낮은 pH에서 증가된 안정성을 나타낸다. 유리하게는, 이러한 바이러스는 또한 고온, 특히 60℃ 이하의 온도에서 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. 이들 바이러스는, 예를 들면, 60℃에서와 같은 승온에서 수분 내지 수시간 동안 저장하는 경우에도 HA의 헤마글루틴화 활성을 상당하게 상실하지 않는다. "상당하지 않은"은, 헤마글루티닌화 활성이 공급원 바이러스와 비교하여 4배 미만으로 감소됨을 의미한다. 승온에 노출된 후에도, 상기 바이러스는 수주 내지 수개월 동안 0℃ 내지 12℃, 바람직하게는 4℃의 온도에서 저장된 경우에 안정성을 유지한다. 따라서, 본 발명에 따라 생산된 바이러스는 안정한 HA 분자를 포함하므로 백신 제제에 매우 유리하다.

당해 방법은 인플루엔자, 홍역, 볼거리, 광견병, 호흡기합포체, 에볼라(Ebola) 및 한타 바이러스(hanta virus)를 포함하는 몇가지 중요한 사람 병원체를 포함하는 동물 바이러스의 그룹인 네가티브(-)-가닥 RNA 바이러스에 대해 특이적으로 사용될 수 있다.

상기 RNA 바이러스의 게놈은 단일분자형이거나 분절된, (-) 극성의 단일가닥일 수 있다. 2개의 필수적인 요건이 이들 바이러스들 사이에 공유된다: 게놈성 RNA는 후대 바이러스 입자내로의 혼입에 사용될 수 있고 바이러스 단백질로 해독되는 mRNA로 전사될 수 있는 형태인 바이러스성 RNA로 효율적으로 카피되어야 한다. 진핵 숙주 세포는 전형적으로 RNA 주형을 복제하거나 (-) 가닥 RNA 주형으로부터 폴리펩타이드를 해독시키기 위한 기구를 함유하지 않는다. 따라서, (-) 가닥 RNA 바이러스는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 암호화하고 운반함으로써 후대로 조립하기 위한 새로운 게놈성 RNA 및 바이러스 단백질로 해독하기 위한 mRNA의 합성을 촉진시킨다.

게놈성 바이러스 RNA는 바이러스 입자로 패키지되어 바이러스에 전달되도록 하여야 한다. 후대 바이러스 입자가 조립되고 단백질/단백질 상호작용이 조립 동안에 일어나는 공정은 RNA 바이러스내에서 유사하다. 바이러스 입자의 형성은 단일 숙주내에서 또는 상이한 숙주 유기체 사이에서 하나의 숙주 세포로부터 또 다른 것으로 RNA 게놈의 효율적인 전달을 보증한다.

네가티브(-)-센스 게놈의 외피보유-단일가닥 RNA를 함유하는 바이러스 계열은 분절되지 않은 게놈을 가진 그룹[파라믹소비리다에((Paramyxoviridae), 라브도비리다에(Rhabdoviridae), 필로비리다에(Filoviridae) 및 보르나 질병 바이러스(Borna Disease virus), 토가비리다에(Togaviridae)] 또는 분절된 게놈을 가진 그룹[오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 부니아비리다에(Bunyaviridae) 및 아레나비리다에(Arenaviridae)]으로 분류된다. 오르토믹소비리다에 계열은 인플루엔자 A, B 및 C형 바이러스, 및 또한 토고토(Thogoto) 및 도리(Dhori) 바이러스 및 감염성 연어 빈혈증 바이러스(salmon anemia virus)를 포함한다.

바람직한 양태는 인플루엔자 바이러스, 호흡기합포체 바이러스(RSV), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus: NDV), 수포성구내염 바이러스(VSV), 및 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus: PIV)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

인플루엔자 바이러스는 단일가닥 RNA 게놈을 함유하는 내부 리보뉴클레오단백질 코어(나선형 뉴클레오캡시드), 및 매트릭스 단백질(M1)에 의해 내부를 덮는 외부 지질단백질 외피로 이루어져 있다. 인플루엔자 A 바이러스의 분절된 게놈은 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 단백질(PB2, PB1 및 PA) 및 뉴클레오캡시드를 형성하는 뉴클레오단백질(NP); 매트릭스 막 단백질(M1, M2); 지질 함유 외피로부터 돌출된 2개의 표면 당단백질: 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA); 비구조적 단백질(NS1) 및 핵 배출 단백질(NEP)을 포함하는, 7개(일부 인플루엔자 A형 균주는 10개이다)를 암호화하는 선형의, (-) 극성의 단일가닥 RNA의 8개 분자로 이루어진다. 대부분의 인플루엔자 A 균주는 또한 프로세포사멸 특성을 갖는 것으로 여겨지는 11개 단백질(PB1 내지 F2)를 암호화한다.

게놈의 전사 및 복제는 핵내에서 일어나며 조립은 혈장막상에서의 발아(budding)를 통해 일어난다. 바이러스는 혼합된 감염 동안 유전자를 재 교배할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 HA를 통해 세포 막 당단백질 및 당지질에서 시알릴올리고-사카라이드에 대해 흡착된다. 비리온의 세포내이입(endocytosis)에 이어, HA 분자내 구조적 변화는 막 융합을 촉진시킴으로써 탈피복을 개시하는 세포 엔도솜(endosome)내에서 일어난다. 뉴클레오캡시드는, 바이러스 mRNA가 전사된 핵내로 이주한다. 바이러스 mRNA는, 바이러스 엔도뉴클레아제가, 이후에 바이러스 트랜스크립타제에 의해 바이러스 RNA 주형의 전사를 위한 프라이머로서 작용하는 세포 이종 mRNA로부터 캡핑된(capped) 5'-말단을 분해하는 유일한 메카니즘에 의해 전사된다. 전사체는 이들의 주형의 말단으로부터 15 내지 22번 염기 부위에서 종결하며, 여기서, 올리고(U) 서열은 폴리(A) 트랙의 첨가를 위한 신호로서 작용한다. 이렇게 생산된 8개의 바이러스 RNA 분자 중에서, 6개는 HA, NA, NP 및 바이러스 폴리머라제 단백질, PB2, PB1 및 PA를 나타내는 단백질로 직접 해독되는 모노시스트로닉 메세지(monocistronic message)이다. 다른 2개의 전사체는 스플라이싱(splicing)을 겪으며, 각각은 상이한 판독 프레임내에서 해독되어 M1, M2, NS1 및 NEP를 생산한다. 다시 말해서, 8개의 바이러스 RNA 분절은 11개 단백질: 9개의 구조 단백질 및 2개의 비구조(NS1 및 최근 확인된 PB1-F2) 단백질을 암호화한다.

바이러스는 천연적으로 존재하는 균주, 변이체 또는 돌연변이체; 돌연변이유발된 바이러스(예를 들면, 돌연변이유발원에 대한 노출, 반복된 계대(passage) 및/또는 비-증식허용 숙주에서의 계대에 의해 생성됨); 리어소어턴트(reassortant)(분절된 바이러스 게놈의 경우에); 및/또는 바람직한 표현형을 갖는 유전적으로 가공된 바이러스(예를 들면, "역 유전학" 기술 사용) 중에서 선택될 수 있다. 용어 "계대"는 숙주 세포를 정의된 바이러스 입자 수로 접종하고 정의된 일 수, 전형적으로 2 내지 3일 후에 상기 바이러스를 수거하는 것으로 정의된다. 바이러스는 1일당 대략 2 내지 4회 복제 라운드를 가질 것이다.

유행성 인플루엔자에 대한 매년 예방접종을 위한 백신 균주의 제조에 사용된 야생형 바이러스는 세계 건강 보건기구(WHO)에 의해 매년 추천된다는 것이 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 이후에, 이들 균주는, 야생형 바이러스의 NA 및/또는 HA 유전자와 특정의 바람직한 특성을 갖게 될 공여체 바이러스(종종 마스타 공여체 바이러스 또는 MDV로 언급됨)로부터 기원한 나머지 유전자 분절(gene segment)을 일반적으로 결합시킨 리어소어턴트 백신 균주의 생산을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, MDV 균주는 냉-적응된 온도 민감성이고, 약독화되어 있을 수 있고/있거나 높은 성장율을 가질 수 있다.

구체적 양태에 따라서, 인플루엔자 바이러스는 약독화된 인플루엔자 바이러스이다. 상세하게는 인플루엔자 바이러스는 숙주 세포의 초기 면역 반응을 억제하는 병원성 인자내에 결실 또는 변형을 포함한다. 약독화는 모범적으로 냉-적응된 바이러스 균주로부터 기원할 수 있거나 본원에 이의 전문이 참조로 인용된 국제특허WO99/64571호 및 국제특허 WO99/64068호에 기술된 바와 같은 NS1 유전자(△NS1 바이러스)내 결실 또는 변형에 기인할 수 있다. 이들 바이러스는 동물의 호흡기 관내에서 불완전한 복제를 겪기 때문에 복제 결핍성이다. 이와는 달리, 상기 바이러스는 PB1-F2 유전자의 결실 또는 변형을 포함할 수 있다.

본 발명에 따라서, 바이러스는 또한 HA 분자의 안정성을 증가시킬 수 있는 HA 유전자내 변형을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, Steinhauer(참조: 1991, PNAS. 88: 11525 - 1152)은, 인플루엔자 로스톡 바이러스(Rostock virus: H7N1)의 HA₂내 K581 돌연변이가 돌연변이되지 않은 바이러스와 비교하여 막 융합체의 감소된 pH 값에 관여함을 확인하였다. 이는, 산성 pH에 의해 유도된 HA의 구조적 변화가 야생형 바이러스와 비교하여 0.7보다 낮은 pH에서 HA의 돌연변이된 형태내에서 발생함을 내포한다. 당해 돌연변이를 X-31인플루엔자 바이러스(H3 아형)에 도입시킴으로써 동일한 효과가 나타났다.

바이러스에 대해 언급하는 경우 용어 "리어소어턴트(reassortant)"는, 바이러스가 하나 이상의 모체 바이러스 균주 또는 공급원으로부터 기원한 유전 및/또는 폴리펩타이드 성분을 포함함을 나타낸다. 예를 들어, 7:1 리어소어턴트는 첫번째 모체 바이러스로부터 기원한 7개의 바이러스 게놈 분절(또는 유전자 분절), 및 두번째 모체 바이러스로부터 예를 들면, 헤마글루티닌 또는 뉴라미니다제를 암호화하는 단일의 상보성 바이러스 게놈 분절을 포함한다. 6:2 리어소어턴트는 첫번째 모체 바이러스로부터의 6개의 게놈성 분절, 가장 일반적으로는 6개의 내부 유전자, 및 상이한 모체 바이러스로부터의 2개의 상보성 분절, 예를 들면, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제를 포함한다.

상세하게는, 인플루엔자 바이러스 백신은 대유행기사이(interpandemic)의 또는 유행성의 인플루엔자 바이러스 균주, 예를 들면, H1, H3 또는 B 균주로부터 기원한다. 이들 균주는 본 발명의 방법에 따라 생산되는 경우 고도로 증가된 면역원성을 나타낸다.

바이러스를 배양하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 세포는, 배양되어 외피보유 바이러스, 구체적으로 인플루엔자 바이러스에 의해 감염될 수 있는 특정의 바람직한 유형의 세포일 수 있다. 상세하게는, 이는 BSC-1 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, CHO 세포, COS 세포, 쥐 세포, 사람 세포, HeLa 세포, 293 세포, VERO 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, CEK(닭 배아 신장) CEF(닭 배아 섬유모세포), MDOK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, TCMK 세포, LLC-PK 세포, PK15 세포, WI-38 세포, MRC-5 세포, T-FLY 세포, BHK 세포, SP2/0 세포, NS0, PerC6(사람 망막 세포)일 수 있다.

바이러스를 희석시키기 위해, 세포에 대해 생리학적인 pH 값의 범위, 구체적으로 pH 5.2 내지 5.9, 구체적으로 5.4 내지 5.8의 범위를 제공할 수 있다. 예를 들면, 이는 구체적으로 PBS에 기초한 완충액을 사용하는, MES(2-(N-모르폴리노-에탄설폰산) 완충액, 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액일 수 있다. 추가로 성분들, 예를 들면, 염화나트륨, 이-나트륨 하이드록시-포스페이트 또는 칼륨 디-하이드록시-포스페이트 등과 같은 염을 희석 용액에 가할 수 있다.

용어 '희석'은, 바이러스 현탁액이 세포의 생산성 감염에 충분한 바이러스 입자의 내용물로 희석됨을 의미한다.

본 발명의 방법에 따라서, 적절한 세포는 적어도 하나의 바이러스 입자로 감염된다. 충분한 감염에 필수적인 바이러스 입자의 수는 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 바이러스에 의한 세포의 감염은 구체적으로는 약 0.0001 내지 10, 바람직하게는 0.001 내지 0.5의 m.o.i.(감염 다중성)에서 수행될 수 있다.

임의로, 마크롤라이드 폴리엔 항생제 또는 유도체는 희석 단계 동안 희석 용액 속에 및/또는 감염 동안 및/또는 배양 동안 존재할 수 있다. 구체적으로, 항생제는 암포테리신 B 또는 이의 유도체이다. 구체적으로, 마크롤라이드 폴리엔 항생제를 감염 전, 예를 들면, 감염 약 60 내지 30분 전, 보다 바람직하게는 감염 30분 전에 가할 수 있다. 바이러스 항온처리 또는 배양에 사용된 항생제의 최적 농도는 0.20 내지 0.50㎍/ml, 구체적으로는 0.25㎍/ml이다.

바이러스를 세포, 특히 세포 수용체에 결합하기 위해 배양하는 온도는 20℃ 내지 38℃일 수 있다. 배양을 위한 pH는 바람직하게는 5.4 내지 5.8이다. 바이러스를 세포내로 내부화하기에 충분한 시간을 결정하기 위해, 바이러스를 염료 또는 전자 현미경을 사용한 표지화와 같은 표준 과정으로 모니터링할 수 있다. 구체적으로, 시간 간격은 실온에서 적어도 5분 내지 60분, 바람직하게는 20 내지 60분이다.

헤마글루티닌의 전구체 단백질을 분해하는 프로테아제를 가하고 바이러스의 세포로의 내부화를 인플루엔자 바이러스에 의한 세포의 감염 직전, 감염과 동시에 또는 감염 직후에 본 발명에 따라 수행할 수 있다. 첨가를 감염과 동시에 수행하는 경우, 프로테아제를 감염시킬 세포 배양물에 직접 가하거나, 예를 들면, 바이러스 접종물과의 농축물로서 가할 수 있다. 프로테아제는 바람직하게는 세린 프로테아제이고, 특히 바람직하게는 트립신이다. 트립신이 사용되는 경우, 배양 배지에 가해진 최종 농도는 유리하게는 1 내지 200㎍/ml, 바람직하게는 5 내지 50㎍/ml, 보다 바람직하게는 5 내지 30㎍/ml이다.

감염 후, 감염된 세포 배양물을 추가로 배양하여, 특히 바이러스 항원의 최대 세포변성 효과 또는 최대량이 검출될 때까지 바이러스를 복제한다. 이와는 달리 수거는 배양 동안 어느 시기에서도 수행할 수 있다.

숙주 세포의 배양을 위한 pH는, 예를 들면, 6.5 내지 7.5일 수 있다. 배양을 위한 pH는 배양에 사용된 숙주 세포의 pH 안정성에 의존한다. 이는 상이한 pH 조건하에 숙주 세포의 생존성의 시험으로 측정할 수 있다.

용어 배양 및 증식은 본 발명에 따라 동일한 의미를 갖는다.

배양을 위해서는 세포의 배양에 이용가능한 어떠한 배지도 적합할 수 있다. 구체적으로 배지는 SFM opti-pro^TM 배지, 신장 내피 및, 바이러스를 발현하는 관련 세포용의 저 단백질 배지일 수 있다. 세포는 20 내지 40℃, 구체적으로 30 내지 40℃의 온도에서 배양될 수 있다.

바이러스는 적어도 1회의 계대로 숙주 세포내에서 계대배양될 수 있으며, 여전히 일반적으로는 수회의 계대배양, 예를 들면, 적어도 3회의 계대배양이 필요하다.

상기 방법의 특정한 양태에 따라서, 복제된 인플루엔자 바이러스의 수거 및 분리는 감염 후 2 내지 10일, 바람직하게는 3 내지 7일째에 수행한다. 세포 또는 세포 잔사를 분리하고 배양 배지로부터 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법, 예를 들면, 분리기 또는 여과기를 사용하여 수거한다. 농축에 이어, 배양 배지 속에 존재하는 인플루엔자 바이러스를 예를 들면, 구배 원심분리, 여과, 침전 등과 같은, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 수행한다.

외피보유 바이러스를 희석하고 세포를 낮은 pH 조건하에서 감염시키는 것이 낮은 pH에서의 안정성 및 증가된 면역원성을 나타내는 외피보유 바이러스를 초래한다는 것이 본 발명의 발명자들에 의해 성공적으로 입증되었다. 이들 바이러스는 또한 승온에서의 안정성 및/또는 세포 배양물 속에서 높은 성장률 및/또는 사람 수용체 특이성을 나타낼 수 있다. 이는, Scholtissek(1985, Archives Virol., 85, 1-11)이 낮은 pH 값에서 인플루엔자 바이러스의 감염성이 비가역적으로 손실되었음을 나타냈음은 놀라운 것이다. 또한 pH와 열 안정성 사이에 관련성이 없다는 것이 기술되어 있다.

본 발명의 추가의 양태로서, 예를 들면, 예방접종 목적에 유용한 바이러스 또는 종균 바이러스로서 유용한 인플루엔자 바이러스가 또한 제공된다. 당해 인플루엔자 바이러스는 승온에서 검출가능한 헤마글루티닌화 활성을 보유하고, 5.4 내지 5.8의 pH 범위에서 안정한 감염성을 보유하며, 세포 배양물 속에서 높은 성장율을 지니고 사람 수용체 특이성을 갖는다.

"종균 바이러스"는 세포 배양물을 접종하는데 사용된 바이러스로서 정의된다.

본 발명의 양태에 따른 검출가능한 헤마글루티닌화 활성은 사용된 공급원 바이러스와 비교하여 헤마글루틴화 활성의 4배 이하의 감소로 정의된다. 공급원 바이러스는 예를 들면, 비강 면봉으로부터 직접 분리된 바이러스일 수 있다.

추가의 양태에 따라서, 백신 바이러스로서 유용한 바이러스가 제공될 수 있다. 상기 바이러스 입자는 낮은 pH에서 안정하며 공지된 세포 배양 과정에 의해, 예를 들면, Vero 세포, MDCK 또는 MDBK 세포로부터 수득된 바이러스와 비교하여 유사하거나 증가된 면역원성을 나타낸다. 구체적으로, 바이러스는 본 발명에 따른 방법에 노출되지 않은 바이러스와 비교하여 세포 배양물 속에서 증가된 성장율을 나타낸다. 또한, 이 바이러스는 온도 안정성이며 사람 수용체 특이성을 갖는다.

본 발명에 따른 온도 안정성은, 헤마글루티닌화 활성이 60℃ 이하의 온도에서 15분 이하의 기간 동안 상당하게 감소되지 않음을 의미한다. pH 안정성은 5.6의 pH, 바람직하게는 5.4 내지 5.8, 바람직하게는 5.2 내지 5.9의 pH에서 바이러스의 안정성으로 정의된다. 고 성장률은 6 로그 TCID 50/ml 이하, 바람직하게는 7 로그 TCID 50/ml 초과의 성장율을 의미한다.

상기 바이러스는 본원에 기술된 방법으로 수득될 수 있다. 이 바이러스는 백신 제형 또는 치료학적 제형에 특히 유용하다. 이들 제형속에 함유된 인플루엔자 바이러스는 약독화된 바이러스이거나 불활성화된 바이러스일 수 있다. 불활성화는 포르말린 또는, 사독백신의 제조에 사용된 다른 제제를 사용한 처리 또는 비-이온성 세제를 사용한 처리 또는 UV 광에 대한 노출과 같이, 당해 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 수행될 수 있다. 인플루엔자 바이러스를 포함하는 제제는 예를 들면, 피하, 비강내 또는 근육내와 같은 특정의 경로로 투여될 수 있다.

또한, 인플루엔자 바이러스를 함유하는 제제는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 투여된 제제의 면역원을 향상시키는 것으로 공지된 보조 약물을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이들 바이러스는 상기 나열된 특성, 즉, pH 안정성, 온도 안정성, 고 성장율 및 사람 수용체 특이성의 결과인 고 면역원성이므로 제제는 점막을 통해, 특히 비강내 적용으로 투여한다.

이들 특성을 포함하는 인플루엔자 바이러스는 선행기술에서 기술되거나 나타내어지지 않았다.

도 1은 6.0 로그 TCID50/동물의 투여량을 사용한 단일의 비강내 면역화 후에 흰담비(ferret)에서 비교된 Wisc.DNS1 및 Wisc.DNS1_HA2_G75R의 면역원성을 나타낸다.
도 2는 A) 마우스 모델에서 혈청 항체의 유도 및 B) 면역화된 마우스의 폐 및 코 선반내 접종 바이러스(challenge virus)의 재생산을 나타낸다.
도 3에서
A는 원래의 바이러스 및 돌연변이체 바이러스의 HA 분자의 서열 비교를 나타낸다. 부위 지시된 돌연변이유발에 의한 2개의 뉴클레오티드 (aa)의 (tt)로의 치환은 HA2 소단위의 58번 위치에서 K에서 I로의 아미노산 치환을 초래한다.
B는 사람 적혈구를 사용한 VN1203 및 VN1203 K58I 바이러스의 융합 활성화를 나타낸다.
C는 VN1203 및 VN1203 K58I 바이러스를 사용한 면역화 후의 마우스 비강 세척액 속의 IgA 항체 역가를 나타낸다.
D는 VN1203 및 VN1203 K58I 바이러스를 사용한 면역화 후의 마우스 혈청 속의 HAI 항체 역가를 나타낸다.
E는 마우스에 대한 VN 1203 및 VN1203K58I 바이러스의 감염성을 나타낸다.
도 4는 낮은 pH에 대한 Vienna/28 및 Vienna/28_HA2_G75R 바이러스의 민감성을 나타낸다.

위에서 기술한 설명은 후속되는 실시예를 참조하여 더욱 충분히 이해될 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 본 발명의 하나 이상의 양태를 실시하는 방법들을 단순히 나타내는 것이며 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 판독되어서는 안된다.

실시예:

실시예 1

유행성 균주 A/Wisconsin/67/05(H3N2)로부터의 표면 당단백질 및 WHO 백신 균주 IVR-116(A/New Caledonia/20/99 및 A/Puerto Rico/8/34의 리아솔턴트)으로부터의 모든 다른 유전자와 NS1 개방 판독 프레임(△NS1)을 결여하고 있는 NS 유전자를 지닌 2개의 인플루엔자 균주를 역 유전학으로 제작하였다. Vero 세포상에서 상이한 계대배양 조건으로 인하여, HA 분자의 서열내에서 하나의 아미노산 치환에 의해 상이해진 바이러스를 수득하였다. Wisc.△NS1로 명명된 첫번째 바이러스를 저 pH 완충액과 함께 바이러스 접종물의 예비 처리로 Vero 세포 위에서 항상 계대배양였으며, 즉:

바이러스를 MES 0.25㎍/ml의 암포테리신 B가 보충된 감염 완충액(0.1M MES, 150 mM NaCl, 0.9 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂; pH=5.6) 속에 적절한 moi로 희석시켰다. Vero 세포를 감염 완충액으로 희석하였다. Vero 세포를 감염 완충액으로 세척하고 바이러스 접종물을 세포에 적용하고 30분 동안 항온처리하였다. 이후에, 접종물을 제거하고 세포를 0.25 ㎍/ml 암포테리신 B 및 5 ㎍/ml 트립신이 보충된 혈청 유리된 Opti-pro 배지 속에서 항온처리하였다.

당해 방법으로 임상 면봉에서 발견된 원래의 바이러스 HA 서열의 보존이 수득되었다. 두번째 바이러스를 표준 방식으로 중성 조건에서 증식시키고 HA2 아단위, 즉, G75R에서 하나의 치환을 획득하였다(표 1). 표 1은, 면봉에 존재하는 바이러스와 비교되는 HA 분자의 서열 비교를 나타낸다.

상이한 조건에서 배양된 2개의 바이러스의 HA 뉴클레오타이드 서열을 비교하였다. 바이러스 Wisc.△NS는 HA 분자에서 어떠한 돌연변이도 획득하지 않은 반면, HA2 소단위에 위치한 하나의 돌연변이 G75R가 바이러스 Wisc.△NS_HA2_G75R에서 확인되었다.

바이러스	HA 소단위에서 치환
바이러스	HA1	HA2
Wisc.△NS	없음	없음
Wisc.△NS_HA2_G75R	없음	G75R

다음 바이러스 둘다를 다음 방법에 의해 낮은 pH에 대한 이들의 안정성을 비교하였다. 바이러스를 pH 범위가 5.6 내지 7.5인 감염 MES 완충액 속에 희석시켜 정의된 moi를 갖도록 하고 Vero 세포에 후속적인 항온처리에 30분 동안 적용시켜 바이러스가 세포를 감염시키도록 하였다. 이후에 접종물을 제거하고, 세포를 37℃에서 4 내지 9시간(균주에 좌우됨) 동안 배양한 후 고정하고 인플루엔자 NP 단백질을 면역형광성으로 검출하였다.

당해 시험은, 바이러스 Wisc.△NS1이 세포를 감염시키는 pH 5.6에서 중성 조건에서와 동일한 효능으로 안정한 것으로 여겨졌지만, 돌연변이체 바이러스 Wisc.△NS1_HA2_G75R은 pH 5.6에서 세포를 감염시키는 능력을 완전히 상실하였으며 중성 조건에서와 동일한 효능으로 pH 5.8에서만 세포를 감염시켰음을 나타내었다(결과는 나타내지 않음).

Wisc.△NS1 및 Wisc.△NS1_HA2_G75R 바이러스의 면역원성을 6.0 logTCID50/동물의 투여량을 사용한 단일 비강내 면역화 후 흰담비에서 비교하였다. 수득된 결과는, HA Wisc.△NS1의 완전한 서열을 가진 바이러스가 HAI 시험(GMT 202.9)에 의해 측정된 것으로서, 바이러스 Wisc.△NS1_HA2_G75R(GMT 27.9)보다 상당히 더 높은 혈청 항체 역가를 유도하였음을 입증하였다(도 1).

실시예 2.

유행성 균주 A/Brisbane/59/07(H1N1)로부터의 표면 당단백질 및 WHO 균주 IVR-116으로부터의 다른 유전자 모두를 NS1 개방 판독 프레임(△NS1)을 결여한 NS 유전자와 함께 지닌 2개의 H1N1 인플루엔자 균주를 역 유전학으로 작제하였다. HA 분자의 서열내 하나의 아미노산 치환으로 상이해진 수득된 바이러스는 Vero 세포 상에서 상이한 계대배양 조건에 기인하는 것으로 여겨졌다. Brisbane△NS1로 명명된 첫번째 바이러스를 저 pH 조건에서 암포테리신 B의 존재하에 계대배양하였다. 당해 과정으로 임상 시료(계대배양물 1)로부터의 MDCK 세포내에서 분리한 바이러스의 HA 서열과 유사한 것으로 여겨지는 HA 서열의 보존이 수득되었다.

Brisbane△NS1_HA2_N16I로 명명된 두번째 바이러스는 표준 방법에 의해 계대배양하였으며 N16I로 명명된 HA2 소단위내 하나의 치환을 획득하였다(표 2). 표 2는 초기 분리체와 비교하는 HA 분자의 서열 비교를 나타낸다.

바이러스	HA 소단위내 치환
바이러스	HA1	HA2
Brisbane△NS	없음	없음
Brisbane△NS_HA2_N16I	없음	N16I

상이한 조건에서 배양한 2개의 바이러스의 HA 뉴클레오타이드 서열을 비교하였다. 바이러스 Brisbane△NS는 HA 분자내 어떠한 돌연변이도 획득하지 않은 반면, HA2 소단위에 위치한 하나의 돌연변이 N16I가 바이러스 Brisbane△NS_HA2_N16I에서 확인되었다.

낮은 pH에 대한 바이러스 안정성의 비교는, 바이러스 Brisbane△NS1이 안정한 것으로 여겨짐을 나타내었다. 면역 형광성 검정에서, pH 5.6 내지 pH 7.5 정도로 낮은 pH에서 동일한 양의 염색된 Vero 세포가 관측되었다. 돌연변이체 바이러스 Brisbane△NS1_HA2_N16I는 pH 5.8에서만 세포를 감염시키는데 거의 안정하지 않았고 pH 5.6에서는 전혀 감염시키지 않았다. 어떠한 면역 형광성 시그날도 pH 5.6의 완충액과 혼합된 바이러스를 사용하여 감염시킨 세포에서 가시적이지 않았다(결과는 나타내지 않음).

바이러스 둘다의 면역원성을 바이러스 투여량 5.6 로그 TCID50/동물을 사용하여 마우스의 단일의 비강내 면역화 후 비교하였다. 수득된 결과는, 바이러스 Brisbane△NS1이 보다 높은 수준의 혈청 항체(HAI 시험으로 측정할) 및 마우스의 폐 및 코선반내 접종 바이러스의 감소된 복제에 의해 나타난 동물의 보다 우수한 보호를 유도하는 Brisbane△NS1_HA2_N16I보다 더 면역원성이었음을 나타내었다.(도 2A, B). 도 2B는 면역화된 마우스의 폐 및 코선반 속에서 접종 바이러스의 재생산을 구체적으로 기재한다.

실시예 3

표준 조건에서 Vero 세포 위에서의 인플루엔자 B 균주의 배양은 또한 동물 모델에서 돌연변이된 바이러스의 감소된 안정성 및 결과적으로 감소된 면역원성과 관련된 HA 분자내 계면 HA1-HA2 또는 HA2-HA2 영역에서 탈안정화 돌연변이의 발생을 가져온다.

실시예 4

앞서, 지난 10여년 동안 순환한 H5N1 조류 고 병원성 바이러스는 pH 5.6인 사람 비강 세척액을 사용한 치료를 견디지 못하는 것으로 밝혀졌다. 이들은 또한 Vero 세포의 접종 동안 동일한 pH 5.6을 지닌 산성 완충액을 사용한 치료에 견디지 못했다. 이러한 불안정성의 이유는, HA 분자가 세포 막과의 융합을 수행하기 위해서 구조를 변화시키는 높은 pH에 있는데, H5N1 바이러스의 경우에는 pH 5.6이지만 사람 바이러스의 경우에는 이것이 pH 5.2 내지 5.4의 범위이기 때문인 것으로 밝혀졌다.

Steinhauer등은, HA2에서 하나의 치환, 즉, H7N7 바이러스의 K58I는 융합체의 pH를 0.7 단위까지 상당히 감소시킬 수 있음을 입증하였다. H3N2 바이러스에서 이러한 돌연변이의 도입은 유사한 효과를 가졌다.

이러한 변화는 A/VN1203/04 △NS1(H5N1) 바이러스(A/VN/1203/04로부터의 HA, NA, 및 M 유전자 및, △NS1 유전자와 조합된 IVR-116 백신 균주로부터의 나머지 유전자를 유전시키는 리어소어턴트)의 HA 단백질에 대한 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 유도되었으며 구조된(rescued) 바이러스 VN1203 HA K58I로 명명되었다(도 3A). 도 3A는 원래의 바이러스 및 돌연변이체 바이러스의 HA 분자의 서열 비교를 나타낸다.

바이러스 둘다의 HA를 트립신 의존성 방식으로 변형시켰다. 돌연변이된 바이러스 VN1203 HA K58I에 대한 융합체의 pH는 사람 적혈구를 사용한 용혈 시험에서 0.3 단위로 감소하였다(데이타는 나타내지 않음).

더우기, 바이러스 VN1203 HA K58I는 pH 5.6에서 감염성의 감소된 상실을 나타내었다. 면역 형광성 검정에서, pH 5.6 내지 7.5에서 바이러스 VN1203 HA K58I를 사용하여 수행한 감염 후 거의 유사한 양의 염색된 세포가 관측된 반면, 감염을 VN1203 바이러스를 사용하여 pH 5.6에서 수행한 경우 염색된 세포는 가시적이지 않았다(데이타는 나타내지 않음).

바이러스 둘다의 능력을 마우스의 비강내 면역화 후 면역 반응을 유도하기 위해 비교하였다. 면역화한지 4주 후에, 마우스 혈청 및 비강 세척액을 수득하고 HAI 및 IgA 항체를 측정하였다. 도 3B에 나타낸 바와 같이, VN1203 HA K58I 바이러스는 원래의 HA 서열을 지닌 바이러스 VN1203보다 4배 더 높은 역가의 IgA 항체를 유도하였다.

도 3B는 VN1203 및 VN1203 K58I 바이러스를 사용한 면역화 후 마우스 비강 세척액내 IgA 항체 역가를 나타낸다.

도 3C는 VN1203 및 VN1203 K58I 바이러스를 사용한 면역화 후 마우스 혈청내 HAI 항체 역가를 나타낸다.

낮은 pH에 대한 증가된 HA 안정성이 포유동물에 대한 보다 우수한 바이러스 감염성을 초래함을 입증하기 위하여, 적격(competent) NS 유전자를 포함하는 2개의 유사 리어소어턴트 VN1203R 및 VN1203R HA K58I를 제작하였다. 적격 NS 유전자의 존재는 면역 적격 유기체의 호흡관내에서 효율적인 바이러스 성장에 필수적이었다. 상이한 투여량에서 취한 이들 바이러스 각각과의 비강내 접종 후 상부 호흡관내 바이러스 둘다의 바이러스 성장을 비교하였다. 4.5 로그 MID₅₀의 변형되지 않은 VN1203R 바이러스와 비교시 돌연변이된 HA VN1203R HA K58I를 갖는 바이러스는 MID₅₀(마우스 감염 투여량 - 마우스의 50%를 감염시키는 투여량) 값 2.5 로그에서 상부 기도관에서 성장하는 마우스에서 100배 더 감염성이었다(도 3E).

도 3E는 상이한 투여량을 사용한 비강 감염 후 마우스의 상부 호흡관에서 바이러스의 재생산을 나타낸다.

실시예 5: 열안정성

산성 접종한 바이러스의 증식은 또한 열 불활성화에 대한 바이러스 안정성을 보존하였다. 열 안정성은 승온에서 15분 동안 바이러스를 접종한 후 바이러스 헤마글루틴화의 역가로 점검하였다. 낮은 pH 접종(Brisbane△NS1 H1N1, Wisconsin△NS1 H3N2, Brisbane△NS1 H3N2)으로 배양된 바이러스는 심지어 60℃로 노출한 후에도 헤마글루틴화 활성을 보유하였다. 표준 조건에서 배양하고 HA에서 탈안정화 돌연변이를 획득한 바이러스(New Caledonia △NS1_HA2_113, Wisconsin△NS1_HA_218_225_75_81 H3N2)는 60℃에서 처리에 견딜 수 없었고 15분 후 헤마글루틴화 활성을 완전히 상실하였다(표 1).

조류 인플루엔자 바이러스와 관련하여, 다염기성 분해 부위의 변형(트립신 의존성 방식으로)만을 지닌 HA를 함유하는 균주는 심지어 55℃에서의 처리도 견디지 못하였으며(HongKong156△NS1 H5N1, VN1203(6:2) (H5N1), VN1203 H5N1) 처리 15분 내에 적혈구에 교착하는 능력을 완전히 상실하였다. 이들 바이러스에 대한 역치는 50℃이었다. HA 엑토도메인의 HA2 소단위내 돌연변이 K58I의 도입은 바이러스 안정성을 55℃까지 증가시켰다.

바이러스	pH 5.6에서의 안정성	바이러스 처리 온도
바이러스	pH 5.6에서의 안정성	35℃	40℃	45℃	50℃	55℃	60℃	65℃
Brisbane△NS1 H1N1	안정	64	64	64	64	64	64	0
Wisconsin△NS1 H3N2	안정	16	16	16	16	8	4	0
Brisbane△NS1 H3N2	안정	16	16	16	16	8	4	0

New Caledonia △NS1_HA2_113	불안정	64	64	64	64	32	0	0
Wisconsin△NS1_HA1_218_ 225_75_81 H3N2	불안정	64	64	64	64	8	0	0
HongKong156△NS1 H5N1	불안정	32	32	32	16	0	0	0
VN1203(6:2) (H5N1)	불안정	64	64	64	64	0	0	0
VN1203 H5N1	불안정	64	64	64	32	0	0	0
VN1203/04 HA K58I (H5N1)	안정	64	32	32	32	16	0	0

사람 인플루엔자 바이러스 Brisbane△NS1 H1N1, Wisconsin△NS1 H3N2, Brisbane△NS1 H3N2, New Caledonia △NS1_HA2_113, Wisconsin△NS1_HA1_218_225_75_81 H3N2를 상응하는 유행성 바이러스로부터의 표면 항원 HA 및 NA 및, IVR-116 균주로부터의 모든 다른 유전자를 지닌 6:2 리어소어턴트로서 수득하였다. IVR-116-균주는 A/New Caledonia/20/99 (H1N1) 바이러스로부터 표면 당단백질을 포함하는 불활성화된 백신 생산용으로 WHO에 의해 추천되었다. 모든 바이러스의 NS 유전자는 NS1 개방 판독 프레임을 결여하였다.

조류 바이러스를 조류 바이러스 A/Vietnam/1203/04 또는 A/Hong Kong/156/97 HA, NA 및 M(5:3의 경우) 유전자 및 IVR-116 균주로부터의 모든 다른 유전자를 유전하는 5:3(VN1203 H5N1 및 VN1203/04 HA K58I H5N1) 또는 6:2(VN1203(6:2) H5N1) 리어소어턴트로서 수득하였다. 고 병원성 조류 균주의 HA 분해 부위를 저 병원성 조류 바이러스의 것으로 치환하였다. 당해 연구에서 모든 조류 바이러스는 NS1 개방 판독 프레임을 결여하고 있는 NS 유전자를 함유하였다.

실시예 6

NS1 개방 판독 프레임(△NS1)을 결여하는 NS 유전자와 함께 유행성 바이러스 A/Vienna/28/06 (H3N2)로부터의 HA 및 NA 유전자 및, WHO 균주 IVR-116으로부터의 모든 다른 유전자를 함유하는 2개의 인플루엔자 6:2 리어소어턴트를 역 유전학으로 작제하였다. HA 분자의 HA2 소단위의 서열내 하나의 아미노산 치환으로 상이해진 수득된 바이러스는 Vero 세포에서 상이한 계대배양 조건에 기인하는 것으로 여겨졌다. Vienna/28로 명명된 첫번째 바이러스를 pH가 6.5인 배지의 존재하에서 배양한 반면, 두번째 바이러스(Vienna/28_HA2_G75R)는 표준 조건하에서 배양하였다. 바이러스 Vienna/28_HA2_G75R은 원래의 야생형 바이러스에 존재하지 않는 HA2 소단위내 G75R 위치에서의 Vienna/28과 비교하여 HA의 서열에 있어 상이하였다. 이러한 치환은 산성 완충액 속에서 바이러스의 예비항온처리(30분 동안)에 이은 감염성 역가의 적정에 의해 측정된 Vienna/28 바이러스와 비교하여 낮은 pH에서 Vienna/28_HA2_G75R 바이러스의 감소된 감염성을 초래하였다(도 4).

실시예 7

바이러스 A/Brisbane/10/2007[영국 NIBSC로부터 기원하며 수득된 란(egg)]를 MDCK 및 Vero 세포 위에서 동시에 5회 계대배양하였다. 5회 계대배양 후 수득되는 변이체 둘다를 면역 형광성 검정에서 상이한 pH 값에서 이들의 감염성에 대해 원래의 바이러스와 비교하였다. 수득된 데이타는, 원래의 바이러스 A/Brisbane/10/2007이 세포를 pH 5.6 및 중성 pH 7.5 에서 동일한 효능으로 감염시켰음을 명백히 입증한다. 그러나, 상응하는 세포주 위에서 5회 계대배양한 후, 바이러스 둘다는 pH 5.6에서 세포를 감염시키는 능력을 상실하였다. 세포의 양성 염색은 pH 5.8에서만 관측되었으나 염색되지 않은 세포는, pH 5.6인 완충제를 사용한 경우 가시적이었다(결과는 나타내지 않음). HA 유전자의 서열분석은, 변이체 둘다가 HA 분자내 160번 위치에서 D→E로의 동일한 돌연변이를 획득하였다.

실시예 8

바이러스 A/Solomon Island/3/06(영국 NIBSC로부터 기원하고 입수한 란)을 Vero 세포에 2개의 상이한 방식: 표준(중성) 상태 또는 산성(pH 5.6에서 감염)에 의해 연속적인 계대배양으로 Vero 세포에 적응시켰다. 중성 pH에서 계대배양된 수득된 바이러스는 Vero 세포 위에서 4.7 로그 TCID50/ml로부터 6.7 로그 TCID50/ml로 성장능을 개선시켰지만, 면역 형광성 검정에서 pH 5.6에서 세포를 감염시키는 능력을 상실하였다. 세포를 완충액 pH 5.6과 합해진 바이러스로 감염시킨 후 염색된 세포가 관측되지 않았지만, 중성 감염에서 전체 단층이 염색되었다. 산성 조건에서의 감염을 사용하여 Vero 세포 위에서 성장에 대해 적응시킨 바이러스 A/Solomon Island/3/06은 7.6 로그 TCID50/ml의 역가에 이르렀으며 동시에 낮은 pH 조건에서 감염성을 보존하였다. 면역 형광성 검정에서는 pH 5.6 및 7.5에서의 감염 후 염색된 세포의 유사한 분포가 관측되었다.

실시예 9

새로운 H1N1 아형(CDC로부터 기원하고 수득된 란)의 바이러스 A/California/7/09를 산성 조건(pH 5.6에서 세포의 감염)에서 수행된 몇개의 연속적인 계대배양에 의해 Vero 세포에 적응시켰다. 수득된 바이러스는 A/California/7/09-산으로 명명되었다. 원래의 바이러스 및 적응된 바이러스를 생반응기 속에서 동일한 규모(10 L)의 생산을 위해 사용하고 후속적으로 정제하였다. 헤마글루티닌화 역가(HA)에 의해 측정된 A/California/7/09-산 바이러스의 수율은 각각 2 내지 8회 생산 단계 후 A/California/7/09 바이러스보다 더 높았다. 결과는 표 4에 나타낸다.

A/California/7/09 및 A/California/7/09-산 바이러스의 수율

생산 단계	HA 역가
생산 단계	A/California/7/09	A/California/7/09-산
1. 롤러 병(Roller bottle), 계대배양 1 2. 롤러 병, 계대배양 2 3. 생반응기 10L (수거 전) 4. 생반응기 10L (수거 후)	8 16 64 8	64 64 128 64

바이러스 둘다를 수거하고, 불활성화된 백신의 정제를 위해 사용된 표준 과정에 따라 정제하고 비교하였다. 수득된 결과는, 바이러스 A/California/7/09-산이 모든 측정된 매개변수에서 A/California/7/09 보다 더 우수하였음을 나타내었다(표 5).

A/California/7/09 및 A/California/7/09-산 바이러스의 정제된 제제의 비교

매개변수	A/California/7/09	A/California/7/09-산
1. 정화 전/후 HA_50μl 2. 정화 전/후 역가 TCID_50/ml 3. 수율 (mg HA/L) 4. HA/단백질 비 5. 숙주 세포 단백질 불순물 (Vero 단백질/HA)	64/8 6.82/6.13 1.8 0.58 0.09	128/64 8.08/7.71 5.4 0.66 0.04

<110> AVIR Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG <120> Method for Production of pH Stable Enveloped Viruses <130> IPA110321 <150> US61/117,900 <151> 2008-11-25 <150> EP09153664.9 <151> 2009-02-25 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 1 attgacaaaa tgaac 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 2 attgacatta tgaac 15

Claims

a) 바이러스를 pH가 5.2 내지 5.9, 바람직하게는 5.5 내지 5.8, 가장 바람직하게는 약 5.6인 용액 속에 희석시키는 단계;
b) 숙주 세포를 적어도 하나의 감염성 바이러스 입자로 감염시키며, 여기서
i) 바이러스 입자를 상기숙주 세포에 가하고; 또한
ii) 상기 세포 및 상기 바이러스 입자를 pH 5.2 내지 5.9, 바람직하게는 5.5 내지 5.8, 가장 바람직하게는 약 5.6에서 항온처리하여 바이러스/세포 복합체를 제공하는 단계;
c) 상기 감염된 숙주 세포를 배양하여 바이러스를 증식시키는 단계;
d) 상기 바이러스를 수거하는 단계; 및
e) 임의로, 상기 바이러스를 정제하고/하거나 특성화하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 인플루엔자 바이러스의 생산 방법.
제1항에 있어서, 마크롤라이드 폴리엔 항생제 또는 유도체, 바람직하게는 암포테리신 B를 가함을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포가 바람직하게는 BSC-1 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, CHO 세포, COS 세포, 쥐 세포, 사람 세포, HeLa 세포, 293 세포, VERO 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, MDOK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, TCMK 세포, LLC-PK 세포, PK15 세포, Wl-38 세포, MRC-5 세포, T-FLY 세포, BHK 세포, SP2/0 세포, NS0 및 PerC6으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 조직 배양 세포임을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 인플루엔자 A, B 또는 C임을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 약독화된 인플루엔자 바이러스임을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 NS1 유전자 내에 결실 또는 변형을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 냉 적응된 바이러스임을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 바이러스를 다양한 pH 값을 제공할 수 있고 또한 세포용의 생리학적 상태이며, 바람직하게는 MES 완충액, 시트르산 완충액 및 아세테이트 완충액으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 완충액 속에 희석시킴을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양 배지를 사용하여 세포를 배양하고, 상기 배양 배지가 바람직하게는 SFM opti-pro^TM 배지임을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 숙주 세포 속에서 적어도 1회의 계대로 계대배양됨을 특징으로 하는 방법.
바이러스가 증가된 온도에서 헤마글루티닌화 활성을 보유하며, 5,5 내지 5,8의 pH 범위에서 감염성을 보유하고, 세포 배양물 속에서 높은 성장률을 보유하며 바람직하게는 사람 수용체 특이성을 가짐을 특징으로 하는, 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따른 방법으로 수득가능한 인플루엔자 바이러스.
종균 바이러스로서, 제11항에 따른 인플루엔자 바이러스를 포함하는 외피보유 바이러스 입자(enveloped virus particle)의 용도.
백신 바이러스를 대규모 생산하기 위한, 제11항 또는 제12항에 따른 인플루엔자 바이러스를 포함하는 외피보유 바이러스 입자의 용도.
제11항에 따른 인플루엔자 바이러스 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조약물을 포함하는, 바이러스 질환의 예방접종 또는 치료에 유용한 조성물.