KR20110101137A - Ｒｎａ 바이러스의 생성을 위한 신규한 방법 - Google Patents

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안드레 에고로프
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에빌 그린 힐즈 바이오테크널러지 리서치 디벨롭먼트 트레이드 아게
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Abstract

본 발명은 헬퍼 바이러스의 존재 하에서 선형 발현 구조물을 사용하여 음성-가닥 세그멘트화된 RNA 바이러스를 생성시키는 방법을 제공한다.

Description

ＲＮＡ 바이러스의 생성을 위한 신규한 방법{NOVEL METHOD FOR GENERATION OF RNA VIRUS}
본 발명은 헬퍼 세포의 존재 하에서 선형 발현 구조물을 사용하여 음성-가닥 (negative-stranded) 세그멘트화된(segmented) RNA 바이러스를 생성시키는 방법을 제공한다.
음성-가닥 RNA 바이러스는 인플루엔자, 홍역, 볼거리, 광견병, 호흡기 합포체, 에볼라 및 한타바이러스를 포함하는 몇 가지 중요한 인간 병원체를 포함하는 동물 바이러스의 그룹이다.
이들 RNA 바이러스의 게놈은 단일분자성이거나 세그멘트화될 수 있으며, (-) 극성의 단일 가닥화된다. 2 가지 필수적인 필요조건이 이들 바이러스 사이에 공유된다: 이들 게놈 RNAs는 자손 바이러스 입자 내로 통합시키기 위해서 사용될 수 있는 형태인 바이러스 RNA로 효율적으로 카피되어야 하고, 바이러스 단백질로 해독되는 mRNA로 전사되어야 한다. 진핵성 숙주 세포는 전형적으로 RNA 주형을 복제하거나, 음성-가닥 RNA 주형으로부터 폴리펩타이드를 해독하는 기구를 포함하지 않는다. 따라서, 음성-가닥 RNA 바이러스는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 코드화하고, 보유하여 바이러스 단백질로의 해독을 위한 mRNAs 및 자손 바이러스 내로 조립하기 위한 새로운 게놈 RNA의 합성을 촉진시킨다.
게놈 바이러스 RNA는 바이러스가 전파되도록 하기 위해서는 바이러스 입자 내에 포장되어야 한다. 자손 바이러스 입자가 조립되는 과정 및 조립 중에 나타나는 단백질/단백질 상호작용은 RNA 바이러스 내에서 유사하다. 바이러스 입자의 형성은 하나의 숙주 내에서, 또는 상이한 숙주 유기체 사이에서 RNA 게놈이 하나의 숙주 세포로부터 다른 것으로 효율적으로 전파되는 것을 보장한다.
음성-센스 게놈을 갖는 외피, 단일-가닥 RNA를 함유하는 바이러스 집단은 비-세그멘트화된 게놈을 갖는 그룹 (파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae), 라브도비리다에 (Rhabdoviridae), 필로비리다에 (Filoviridae) 및 보르나병 (Borna Disease) 바이러스, 토가비리다에 (Togaviridae)) 및 세그멘트화된 게놈을 갖는 것 (오르토믹소비리다에 (Orthomyxoviridae), 분야비리다에 (Bunya-viridae) 및 아레나비리다에 (Arenaviridae))로 분류된다. 오르토믹소비리다에 집단은 A, B 및 C 타입 바이러스인 인플루엔자 바이러스뿐만 아니라 토고토 (Thogoto) 및 도리 (Dhori) 바이러스 및 전염성 연어 빈혈 바이러스를 포함한다.
인플루엔자 비리온은 단일-가닥 RNA 게놈을 함유하는 내부 리보핵단백질 코어 (나선형 뉴클레오캡시드), 및 매트릭스 단백질 (M1)에 의해서 내부에 라이닝된 외측 지단백질 외피로 구성된다. 인플루엔자 A 바이러스의 세그멘트화된 게놈은 다음을 포함하는 11 개의 폴리펩타이드 (일부의 인플루엔자 A 주에서는 10 개)를 코드화한 선형이고, 음 극성인 단일-가닥 RNAs의 8 개의 분자로 구성된다: 뉴클레오캡시드를 형성하는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 단백질 (PB2, PB1 및 PA) 및 핵단백질 (NP); 매트릭스 막 단백질 (M1, M2); 지질-함유 외피로부터 돌출하는 2 개의 표면 당단백질: 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA); 비구조적 단백질 (NS1) 및 핵 수송 단백질 (NEP). 대부분의 인플루엔자 A 주는 또한, 전세포소멸성 특성을 갖는 것으로 믿어지는 11번째의 단백질 (PB1-F2)을 코드화한다.
바이러스 게놈의 전사 및 복제는 핵에서 일어나며, 조립은 원형질막 상에서의 출아 (budding)을 통해서 일어난다. 바이러스는 혼합 감염 중에 유전자를 재편성할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 HA를 통해서 세포막 당단백질 및 당지질 내의 시알릴올리고-사카라이드에 흡착한다. 비리온의 엔도사이토시스 (endocytosis) 이 후에, HA 분자에서의 구조 변화는 세포 엔도좀 내에서 일어나서 막 융합을 촉진시킴으로써 탈피각 (uncoating)을 유발한다. 뉴클레오-캡시드는 핵으로 이동하고, 여기에서 바이러스 mRNA가 전사된다. 바이러스 mRNA는, 바이러스 엔도뉴클레아제가 세포성 이종 mRNAs로부터 캡형성된 (capped) 5'-말단을 절단한 다음에 바이러스 전사효소에 의한 바이러스 RNA 주형의 전사를 위한 프라이머로서 작용하는 독특한 기전에 의해서 전사된다. 전사물은 그들의 주형의 말단으로부터 15 내지 22 염기 부위에서 종결하며, 여기에서 올리고(U) 서열은 폴리(A) 트랙트 (tract)의 첨가를 위한 시그날로서 작용한다. 이렇게 생산된 8 개의 바이러스 RNA 분자 중에서, 6 개는 HA, NA, NP를 나타내는 단백질 및 바이러스 폴리머라제 단백질 PB2, PB1 및 PA로 직접 해독되는 모노시스트론성 메시지 (monocistronic message)이다. 다른 2 개의 전사물은 스플리싱 (splicing)을 겪어서 각각, 상이한 판독 프레임 내에서 해독되어 M1, M2, NS1 및 NEP를 생산하는 2 개의 mRNAs를 수득한다. 즉, 8 개의 바이러스 RNA 세그멘트는 11 개의 단백질에 대해 코드화된다: 9 개의 구조적 및 2 개의 비-구조적 (NS1 및 최근에 확인된 PB1-F2) 단백질.
인플루엔자 바이러스에 대한, 특히 고도로 병원성인 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 최신 백신의 생성은 DNA로부터 인플루엔자 바이러스의 생산을 허용하는 역유전적 방법 (reverse genetics)의 사용에 의존한다. 음성-가닥 RNA 인플루엔자 바이러스의 제작을 위한 첫 번째 역유전적 시스템은 시험관내 재구성된 리보핵단백질 (RNP) 복합체와 혼합된 단일 바이러스 유전자의 형질감염, 및 이어서 인플루엔자 헬퍼 바이러스에 의한 감염을 포함한다. RNP 복합체는 합성 RNA 전사물을 인플루엔자 바이러스로부터의 정제된 NP 및 폴리머라제 단백질 (PB1, PB2 및 PA)과 함께 배양함으로써 제조되었으며, 헬퍼 바이러스는 바이러스 단백질 및 다른 vRNAs의 세포내 공급원으로서 사용되었다 [Luytjes et al., 1989, Cell, 59, 1107-1113].
뉴만 (Neumann) 등 [1994, Virology, 202, 477-479]은 쥐 RNA 폴리머라제 I 프로모터-반응성 플라스미드로부터 RNA의 발현 후에 인플루엔자-감염된 세포에서 바이러스 모델 RNAs의 RNP 형성을 달성하였다. 플레쉬카 (Pleschka) 등 [1996, J. Virol., 4188-4192]은 RNP 복합체가 플라스미드-기본 발현 벡터로부터 재구성되는 방법을 기술하였다. 바이러스 RNA-양 전사물의 발현은 절단된 인간 폴리머라제 I (polI) 프로모터, 및 자가촉매적 절단에 의해서 3' 말단을 생성한 리보자임 서열을 함유하는 플라스미드로부터 달성되었다. polI-유도된 플라스미드는 바이러스 PB1, PB2, PA 및 NP 단백질을 발현하는 polII-반응성 플라스미드와 함께 인간 293 세포 내로 공동형질감염되었다. 형질감염 효율은 형질감염당 약 10 개의 형질감염체 바이러스 입자로 매우 낮았다. 추가로, 이 플라스미드-기본 전략은 헬퍼 바이러스의 도움에 의존적이었다.
국제출원 WO 01/04333에서, 단편화된 음성-가닥 RNA 바이러스는 게놈 vRNA 세그멘트 및 RNP 단백질을 발현하는 12 개의 발현 플라스미드의 세트를 사용하여 구성되었다. 국제출원 WO 01/04333에 기술된 벡터는 잘 알려진 pUC19 또는 pUC18 플라스미드를 기초로 하였다. 설명에 따르면, 이 시스템은 인플루엔자 바이러스의 8 개의 세그멘트 모두를 발현하는 8 개의 플라스미드의 세트와 함께 핵단백질 및 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 (PB1, PB2, PA 및 NP)의 서브유니트를 발현하는 4 개의 플라스미드의 추가의 세트를 필요로 한다.
국제출원 WO 00/60050은 작동적으로 인플루엔자 바이러스 바이러스 세그멘트 cDNA (PA, PB1, PB2, HA, NP, NA, M)에 연결되고, 전사 종결 서열에 연결된 프로모터를 포함하는 적어도 2 개의 벡터, 및 작동적으로 인플루엔자 바이러스 세그멘트 DNA (PA, PB1, PB2, NP)에 연결된 프로모터를 포함하는 적어도 2 개의 벡터의 세트를 포함한다. 이 시스템은 하나의 플라스미드 상에 조합된 바이러스 RNA 합성을 위한 8 개의 RNA 폴리머라제 I 전사 카세트를 갖는 플라스미드를 사용함으로써 다수의 상이한 벡터를 사용하는데 있어서의 어려움을 극복하도록 시도하였다.
국제출원 WO 01/83794는 RNA 폴리머라제 II (polII) 프로모터와 폴리아데닐화 시그날 사이에 삽입된 RNA 폴리머라제 I (polI) 프로모터, 및 polI 종결 시그날을 포함하는 원형 발현 플라스미드를 기술하였다. 이 출원에 따른 용어 "벡터"는 일반적으로, 추가의 외래 DNA를 수용할 수 있고, 적합한 숙주 세포 내로 쉽게 도입될 수 있는 이중-가닥 DNA의 자체-함유 분자인 플라스미드로 기술되어 있다.
국제출원 WO 2009/00891은 선형 발현 구조물 및 인플루엔자 바이러스 유전자 세그멘트의 발현을 위한 그의 용도를 기술하였다.
오자와 엠. (Ozawa M.) 등 [J. Virol, 2007, vol. 81, pp. 9556-9559]은 아데노바이러스 벡터를 사용한 인플루엔자 A 바이러스의 생성을 위한 역유전적 시스템을 기술하였다. 호프만 이. (Hoffmann E.) 등 [Virology, 2000, 267, pp. 310-317]은 양방향성 전사 구조물을 사용하여 하나의 주형으로부터 바이러스 RNA 및 mRNA를 생성시킴으로써 인플루엔자 바이러스를 생성시키는 시스템을 기술하였다. 8 개의 플라스미드로부터 인플루엔자 B 바이러스의 구제 (rescue)가 또한 호프만 (Hoffmann) 등 [Proc. Natl. Acad. Sci., 2002, 99, pp. 11411-11416]에 의해서 기술되었다.
바이러스 질환에 의해서 야기된 유행병 및 세계적 유행병은 여전히 인간의 삶을 빼앗고 있으며, 세계 경제에 영향을 미치고 있다. 인플루엔자는 수백만의 근무를 못한 날 수 및 의사에 대한 방문, 세계적으로 수십만의 입원 [Couch 1993, Ann. NY. Acad. Sci 685;803,], 수만의 과도한 사망 [Collins & Lehmann 1953 Public Health Monographs 213:1; Glezen 1982 Am. J. Public Health 77:712] 및 건강-관리 비용의 관점에서 수십억 유로 [Williams et al . 1988, Ann. Intern. Med. 108:616]에 대해서 책임이 있다. 건강한 성인이 면역화되면, 현재 이용할 수 있는 백신은 증례의 70-90%에서 임상적 질환을 예방한다. 이 레벨은 65세 이상의 경우에는 30-70%로 감소하며, 요양원에 거주하는 65세 이상인 경우에는 훨씬 더 떨어진다 [Strategic Perspective 2001: The Antiviral Market. Datamonitor. p. 59]. 바이러스의 빈번한 항원적 변화는 큰 사망자수에 더 기여하는데, 이는 연례적 백신접종조차도 방어를 보장할 수 없기 때문이다. 따라서, 미국의 사망자수는 1976/77 년에 16,363 명으로부터 1998/99 년에는 4 배만큼의 사망으로 증가하였다 [Wall Street Journal, Flu-related deaths in US despite vaccine researches. January 7, 2003].
특히, 세계적인 유행성 바이러스 질환의 발발의 경우에는 질환이 발발한 직후에 백신접종 또는 치료를 제공하는 것이 가장 중요할 수 있다. 바이러스 질환의 효율적인 방어 및 치료를 제공하기 위한 긴박한 필요성에 비추어서, 현재의 발현 기술의 단점 및 곤란성을 극복하고, 바이러스 발현을 위한 대체 방법을 제공할 수 있는, 바이러스 생산을 위한 경제적이며 빠르고 효율적인 발현 시스템의 개발에 대한 한층 더 큰 필요성이 있다. 상기의 목적은 본 출원의 구체예의 공급에 의해서 달성된다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 선형 발현 구조물이 헬퍼 바이러스(helper virus)의 존재 하에서 RNA 바이러스의 발현을 위해서 사용되는 대체 기술을 제공한다.
놀랍게도, 헬퍼 바이러스의 존재 하에서, polI 프로모터와 polI 종결 시그날 사이에 삽입된 HA 또는 HA 유전자 세그멘트를 포함하는 폴리아데닐화 시그날과 RNA 폴리머라제 II (polII)프로모터 사이에 삽입된 RNA 폴리머라제 I (polI) 프로모터 및 polI 종결 시그날을 포함하며 어떤 증폭 및/또는 선택 서열도 갖지 않는 적어도 하나의 선형 발현 구조물의 사용이 바이러스 입자의 빠른 구제를 위한 효율적인 도구를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 공지된 기술에 의해서 사용된 방법과는 대조적으로, 박테리아 세포 내에서의 클로닝 단계가 필요하지 않고, 숙주 세포는 바이러스 게놈의 모든 세그멘트으로 형질감염시킬 필요가 없다. 특히, 단지 하나 또는 두 개의 세그멘트, 즉 HA 및/또는 NA 단백질을 코드화한 유전자에 의한 형질감염이 전체 바이러스의 발현에 충분할 수 있다. 따라서, 형질감염 및 충분한 양의 바이러스 입자의 발현에 필요한 시간이 크게 감소될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 참고로 포함된 국제출원 PCT/EP2008/058182에 기술된 바와 같은 선형 발현 구조물이 헬퍼 바이러스의 존재 하에서, RNA 바이러스, 특히 야생형, 돌연변이체 또는 재편성 주의 인플루엔자 바이러스를 포함하는 백신을 개발하는데 사용될 수 있다. 이것은 인플루엔자 유행병 또는 세계적 유행병이 발생한 경우에 필요한 모든 바이러스 백신의 빠른 생성을 위한 도구를 제공한다.
또한, 본 발명은 헬퍼 바이러스의 제거를 위한 개선된 방법, 및 개선된 선택 및 정제 목적으로 변형된 절단 부위를 갖는 HA 세그멘트를 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은
a) 임의의 증폭 및/또는 선택 서열도 갖지 않으며, RNA 폴리머라제 II (polII) 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날 사이에 삽입된 RNA 폴리머라제 I (polI) 프로모터 및 polI 종결 시그날을 포함하고, polI 프로모터와 polI 종결 시그날 사이에 삽입된 HA 및/또는 NA 유전자 세그멘트를 더 포함하는 선형 발현 구조물을 제공하고,
b) 숙주 세포를 상기 선형 발현 구조물로 형질감염시키고,
c) 상기 숙주 세포를 헬퍼 바이러스 HA 및/또는 NA 단백질을 갖는 헬퍼 바이러스로 감염시키고,
d) 상기 숙주 세포를 배양하여 바이러스 입자를 증식시키고,
e) HA 및/또는 NA 단백질의 표현형, 유전자형 또는 항원적 특성을 기초로 하여 (i) 선형 발현 구조물로부터 유도된 HA 및/또는 NA 단백질을 함유하지만, (ii) 헬퍼 바이러스 HA 및 NA 단백질 또는 그의 세그멘트를 함유하지 않는 바이러스 입자를 선택하고,
임의로 헬퍼 바이러스 HA 및 NA 단백질의 부재를 핵산 또는 아미노산 서열의 분석에 의해서 결정하는 단계를 포함하여, 음성-가닥 세그멘트화된 RNA 바이러스를 생산하는 방법을 포함한다.
더욱 특히, 음성-가닥 세그멘트화된 RNA 바이러스 입자를 생산하는 방법은 증폭 서열, 선택 서열, 또는 증폭 서열 및 선택 서열 둘 다를 갖지 않으며, RNA 폴리머라제 I (polI) 프로모터 및 polI 종결 시그날 (여기에서, polI 프로모터 및 polI 종결 시그날은 RNA 폴리머라제 II (polII) 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날 사이에 삽입된다)을 포함하고, polI 프로모터와 polI 종결 시그날 사이에 삽입된 HA 유전자 세그멘트, NA 유전자 세그멘트, 또는 HA 유전자 세그멘트 및 NA 유전자 세그멘트 둘 다를 더 포함하는 선형 발현 구조물을 제공하고; 숙주 세포를 상기 선형 발현 구조물로 형질감염시키고; 상기 숙주 세포를 HA 단백질, NA 단백질 또는 HA 단백질 및 NA 단백질 둘 다를 코드화한 게놈 RNA를 포함하는 헬퍼 바이러스로 감염시키고; 상기 숙주 세포를 배양함으로써 자손 바이러스 입자 (여기에서, 자손 바이러스 입자의 적어도 일부분은 선형 발현 구조물로부터 유도된 HA 단백질 또는 NA 단백질을 포함한다)를 생산하고; 상기 자손 바이러스 입자로부터 i) 선형 발현 구조물이 HA 유전자 세그멘트를 포함하는 경우에는 헬퍼 바이러스로부터 유도된 HA 단백질이 아닌 선형 발현 구조물로부터 유도된 HA 단백질; 및 ii) 선형 발현 구조물이 NA 유전자 절편을 포함하는 경우에는 헬퍼 바이러스로부터 유도된 NA 단백질이 아닌 선형 발현 구조물로부터 유도된 NA 단백질을 포함하는 후보 바이러스 입자를 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 숙주 세포는 HA 또는 NA 유전자 세그멘트를 포함하는 적어도 하나의 선형 발현 구조물로 형질감염된다. 바람직하게는, 숙주 세포는 적어도 두 개의 선형 발현 구조물로 형질감염되며, 여기에서 하나의 선형 구조물은 HA 유전자 세그멘트를 포함하고, 두 번째 선형 구조물은 NA 유전자 세그멘트를 포함한다.
후보 바이러스 입자를 선택하는 단계는 후보 바이러스 입자가 헬퍼 바이러스의 HA 아미노산 서열 또는 NA 아미노산 서열을 포함하지 않는다는 것을 결정하기 위해서 후보 바이러스 입자의 아미노산 서열을 분석하거나, 후보 바이러스 입자가 헬퍼 바이러스의 HA 뉴클레오타이드 서열 또는 NA 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다는 것을 결정하기 위해서 후보 바이러스 입자의 핵산 분자를 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
"선형 발현 구조물"은 본 발명에 따라, 임의의 증폭 및/또는 선택 서열도 함유하지 않으며, RNA 폴리머라제 II (polII) 프로모터와 폴리아데닐화 시그날 사이에 삽입된 RNA 폴리머라제 I (polI) 프로모터 및 polI 종결 시그날을 포함하고, polI 프로모터와 polI 종결 시그날 사이에 삽입된 유전자 세그멘트를 포함하는 것으로 정의된다.
바람직하게는, 선형 발현 구조물은 박테리아 세포 내에서 플라스미드의 증폭을 위해서 필요한 어떤 선택 또는 증폭 서열도 함유하지 않는다. ori (복제의 기원)-서열도 항생제 내성 서열이나 어떤 다른 선택 서열도 함유될 필요가 없다. 필요에 따라, 선형 발현 구조물은 짧은 링커 서열을 사용하여 원형화될 수 있다.
본 발명의 특정한 구체예에 따르면, 선형 발현 구조물은 구조물의 N- 및/또는 C-말단에서의 추가의 보호 서열과 같은 DNA 분자 이외의 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들 보호 서열은 국제출원 WO 00/56914에 기술된 바와 같은 펩타이드 핵산 서열 (PNAs)일 수 있다. 이들 PNAs는 전체 데옥시리보즈-포스페이트 골격 (backbone)이 2-아미노에틸 글리신 단위를 함유하는 화학적으로 완전히 상이하지만 구조적으로 상동성인 폴리아미드 (펩타이드) 골격으로 교환된 핵산 아날로그 (analogs)이다. PNA "클램프 (clamps)"는 또한, 안정성을 증가시키는 것으로 나타났으며, 여기에서 2 개의 동일한 PNA 서열은 3 개의 8-아미노-3,6-디옥사옥타노산 단위를 함유하는 유연성 헤어핀 링커에 의해서 접합된다. PNA가 상보적 호모퓨린 또는 호모피리미딘 DNA 표적 서열과 혼합되는 경우에는, 극도로 안정한 PNA-DNA-PNA 트리플렉스 (triplex) 하이브리드를 형성할 수 있다 [Bentin et al., 1996, Biochemistry, 35, 8863-8869, Egholm et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 217-222, Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500, Demidov et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1995, 92, 2637-2641]. 이들은 뉴클레아제 및 프로테아제 분해에 대해서 저항성이 있는 것으로 나타났다 [Demidov et al., Biochem. Pharm., 1994, 48, 1010-1013]. 바이러스 유전자 절편은 상기 세그멘트의 cDNA 카피 또는 RT-PCR 증폭 생성물일 수 있다.
특히, 본 발명은
a) 숙주 세포를 HA 유전자 세그멘트를 포함하는 선형 발현 구조물 및/또는 NA 유전자 절편을 포함하는 선형 발현 구조물, 및 임의로 PB1, PB2, PA, NS, M, NP로부터 선택된 유전자 세그멘트 또는 적어도 그의 일부분을 더 포함하는 선형 발현 구조물로 형질감염시키고,
b) 상기 숙주 세포를 헬퍼 바이러스로 감염시키고,
c) 상기 감염된 숙주 세포를 배양하여 바이러스를 증식시키고,
d) 상기 선형 발현 구조물로부터 유도된 적어도 HA 및/또는 NA 단백질을 함유하는 바이러스 입자를 선택하는 단계를 포함하여, RNA 바이러스를 발현 및 생산하는 방법을 제공한다.
상기의 선택은 비-헬퍼 바이러스 기원의 HA 또는 NA 단백질의 유전자형, 표현형 또는 항원적 특성들을 기초로 하여 수행될 수 있다. 상이한 서열, 상이한 표현형적 특성 또는 상이한 항원적 특성을 포함하는 단백질을 구분하는 것으로 알려진 어떤 선택 방법이라도 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 기술된 바와 같은 선택 기준이 사용될 수 있다. 헬퍼 바이러스 기원 및 비-헬퍼 바이러스 기원으로부터의 HA 및 NA 단백질은 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 다양하며, 따라서 본 기술분야에서 잘 알려진 바와 같은 서열 비교방법이 선형 발현 구조물로부터 유도된 HA 또는 NA 서열을 포함하는 바이러스를 확인하기 위해서 사용될 수 있다. 발현 구조물 또는 바이러스"로부터 유도된" 핵산 분자는 발현 구조물 또는 바이러스의 뉴클레오타이드 서열 또는 상보적 서열을 포함하는 것이며, 일반적으로 분자의 생산을 위한 세포 배양 또는 다른 배지 내에서 발현 구조물 또는 바이러스의 존재의 결과로 생산된다. 발현 구조물 또는 바이러스"로부터 유도된" 단백질은 발현 구조물 또는 바이러스의 뉴클레오타이드 서열 또는 상보적 서열로부터 해독된 것이며, 일반적으로 단백질의 생산을 위한 세포 배양 또는 다른 매질 내에서 발현 구조물 또는 바이러스의 존재의 결과로 생산된다.
적어도 하나의 선형 발현 구조물에 더하여, 역유전적 기술을 수행하기 위한 기술분야에서 공지된 플라스미드가 바이러스 단백질 및/또는 바이러스 게놈의 추가의 세그멘트의 발현을 위해서 사용될 수 있다. 이들 플라스미드는 예를 들어, 문헌 [Hoffmann et al., Vaccine 2002, 20(25-26), 3165-3170; 이것은 참고로 포함된다]에 기술되어 있다. 특히, 이들 발현 플라스미드는 PB1, PB2, PA, NS, NA, HA, M 또는 NP 또는 이들의 일부분을 코드화한 세그멘트를 포함한다.
용어 "HA 단백질 및 NA 단백질"은 본 발명에 따라, HA 또는 NA 단백질 각각의 완전한 아미노산 서열 또는 상기 서열의 일부분으로서 정의되며, 여기에서 상기의 일부분은 야생형 HA 또는 NA 단백질에 의해서 생산된 반응과 유사하거나 동등한 상기 HA 또는 NA 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는데 충분하다. 바람직하게는, HA 또는 NA 단백질은 완전한 단백질의 HA 또는 NA 아미노산 서열의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%를 포함한다. 면역원성의 관점에서 기능적 동등성은 예를 들어, 문헌 [Lu et al., J. Virol., 1999, 5903-5911; 또는 Boyd M.R. and Beeson M.F., J. Antimicrobial Chemotherapy, 1975, 43-47]에 기술된 바와 같은 동물 모델에서 시험할 수 있다.
헬퍼 바이러스는 그 자신으로는 복제하는 능력을 갖지 않는 헬퍼 의존성 바이러스 벡터의 카피를 생산하는 경우에 사용된 바이러스이다. 헬퍼 바이러스는 바이러스 벡터와 함께 세포를 공동감염시키기 위해서 사용되며, 바이러스 벡터의 게놈의 복제를 위해서 필요한 효소를 제공한다.
용어 "헬퍼 바이러스"는 생산될 바이러스와 동일한 적어도 하나의 유전자 절편을 포함하며, 완전한 바이러스 입자를 생산하는데 필요한 적어도 하나의 바이러스 절편 및/또는 적어도 하나의 바이러스 단백질을 제공함으로써 바이러스 생성을 유지할 수 있는 모든 바이러스로 정의된다.
헬퍼 바이러스는 일반적으로 선형 발현 구조물로 형질감염시킨 후에 본 방법에서 숙주 세포에 첨가되지만, 대체 방법에 따르면 헬퍼 바이러스는 숙주 세포를 HA 및/또는 NA 유전자 세그멘트를 포함하는 발현 구조물에 의해서 형질감염시키기 전에 감염을 위해서 숙주 세포에 첨가될 수 있다.
상기의 방법에 의해서 발현될 수 있는 RNA 바이러스는 HA 및/또는 NA 유전자 세그멘트 또는 이들 구조체과 기능적으로 동등한 구조를 포함하는 모든 RNA 바이러스일 수 있다. 용어 "기능적으로 동등한 구조체"는 수용체-결합 및 융합 활성을 갖는 바이러스 단백질을 의미한다.
RNA 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 특히 인플루엔자 A, B 또는 C 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 뉴캐슬병 (Newcastle disease) 바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
바이러스를 배양하기 위해서 본 발명에 따르는 방법에서 사용될 수 있는 세포는 배양될 수 있고, 외피 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스에 의해서 감염될 수 있는 세포의 모든 바람직한 타입일 수 있다. 특히, 이것은 BSC-1 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, CHO 세포, COS 세포, 쥐 세포, 인간 세포, HeLa 세포, 293 세포, VERO 세포, CEK (닭 배아 신장 (chicken embryo kidney)), CEF (닭 배아 섬유아세포 (chicken embryo fibroblasts)), MDBK 세포, MDCK 세포, MDOK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, TCMK 세포, LLC-PK 세포, PK15 세포, WI-38 세포, MRC-5 세포, T-FLY 세포, BHK 세포, SP2/0 세포, NS0, PerC6 (인간 망막 세포)일 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 숙주 세포는 공지의 방법에 의해서, 예를 들어, 전기천공에 의해서 형질감염될 수 있다.
숙주 세포 배양물은 바이러스를 복제하기 위해서 본 기술분야에서 공지된 표준 조건 하에서, 특히 최대 세포변성 효과 또는 바이러스 항원의 최대량이 검출될 수 있을 때까지 배양할 수 있다. 수확은 대안적으로, 배양 중의 어떤 시점에서라도 이루어질 수 있다.
숙주 세포의 배양을 위한 pH는 예를 들어, 6.5와 7.5 사이일 수 있다. 배양을 위한 pH는 배양을 위해서 사용된 숙주 세포의 pH 안정성에 따라 좌우된다. 이것은 상이한 pH 조건 하에서 숙주 세포의 생존 능력을 시험함으로써 결정될 수 있다.
유행성 인플루엔자에 대한 연례적 백신접종을 위한 백신 주의 제조에 사용된 야생형 바이러스가 세계보건기구 (WHO)에 의해서 연례적으로 추천되고 있다는 것은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 그 후, 이들 주(Strains)는 일반적으로 야생형 바이러스의 NA 및/또는 HA 유전자를 특정의 바람직한 특징을 가질 수 있는 공여체 바이러스 (종종 매스터 (master) 공여체 바이러스 또는 MDV로 칭함)로부터 유도된 나머지 유전자 절편을 조합시킨 재편성 백신 스트레인의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, MDV 스트레인은 한랭-적응성이고/이거나, 온도 민감성이고/이거나, 약독화되고/되거나, 높은 성장률을 가질 수 있다. 본 발명에 따르면, 바이러스 입자는 바람직하게는 계절적 백신접종 목적으로 추천된 바이러스 스트레인의, 또는 특히 세계적 유행병 바이러스의 경우에 고도로 면역원성인 것으로 나타난 바이러스 스트레인의 HA 및/또는 NA 단백질을 포함한다.
상기의 표면 단백질을 포함하는 바이러스의 선택은 상기 단백질을 헬퍼 바이러스 기원의 HA 및 NA 단백질로부터 구분하는 표현형적, 유전자형적 또는 항원적 특성을 기초로 할 수 있다.
선택된 바이러스와 같은 비-헬퍼 바이러스 기원의 HA 및 NA 단백질로부터 헬퍼 바이러스 기원의 HA 및 NA 단백질을 구분하는 헬퍼 바이러스 기원의 HA 및 NA 단백질의 표현형적 특성은 예를 들어, HA의 활성화를 위한 절단 부위의 차이 및 낮은 pH에 대한 안정성에서의 차이를 포함한다. 헬퍼 바이러스 HA는 백신 바이러스의 HA를 활성화하는 프로테아제와는 상이한 프로테아제에 의한 단백분해적 활성화에 따라 좌우되는 절단 부위를 함유할 수 있다. 헬퍼 바이러스는 또한, 낮은 pH 조건에 대해서 백신 바이러스보다 더 낮은 안정성을 나타낼 수 있다. 백신 바이러스의 HA 및 NA를 함유하는 바이러스의 선택은 또한, 항원적 특성을 기초로 할 수 있다. 백신 바이러스 (예를 들어, H1N1)와는 상이한 서브타입 (예를 들어, H3N2)의 헬퍼 바이러스를 사용함으로써, 헬퍼 바이러스의 성장은 헬퍼 바이러스 서브타입, 예를 들어, H3N2에 대해서 특이적인 항혈청에 의해서 억제될 수 있다. 선택을 위해서 이용될 수 있는 유전자형적 특징은 헬퍼 바이러스 기원의 HA 및/또는 NA 절편과 비-헬퍼 바이러스 기원의 HA 및 NA 단백질 사이의 핵산 또는 아미노산 서열 차이를 포함한다. 방법은 서열 분석을 수행하기 위해서 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 뉴클레오타이드 서열 차이를 기초로 하여, 예를 들어, siRNAs 또는 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는 헬퍼 바이러스의 HA 및/또는 NA에 대해서 특이적으로 디자인될 수 있다. 이들 siRNAs 또는 안티-센스 올리고뉴클레오타이드의 형질감염에 의해서 헬퍼 바이러스 성장은 억제될 수 있다.
한가지 옵션은 헬퍼 바이러스 기원의 HA 단백질을 포함하는 바이러스 입자를 헬퍼 바이러스 기원의 HA 단백질은 절단하지 않지만 재편성 바이러스의 HA 단백질은 절단함으로써 활성화시키는 프로테아제로 처리하여 후보 바이러스 입자로부터 분리시키는 것일 수 있다. 예를 들어, 프로테아제는 트립신, 엘라스타제, 키모트립신, 파파인 또는 서몰리신으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 헬퍼 바이러스의 HA 단백질은 활성화되도록, 예를 들어, 프로테아제 (여기에서, 상기 프로테아제는 트립신이 아니다)에 의해 절단되도록 변형될 수 있으며, 반면에 최종 백신 바이러스의 HA 단백질은 트립신에 의해서 절단된다. 이에 의해서, 단순하고 적용가능한 선택 시스템이 제공된다. 이것은 절단 부위를 변형시킴으로써 수행될 수 있다. 헬퍼 바이러스로서 유용한 바이러스 주의 HA 세그멘트는 트립신 대신에 엘라스타제에 의해서 단백분해적으로 활성화된 절단 부위를 함유하도록 PCR-돌연변이유발과 같은 돌연변이유발에 의해서 개조될 수 있다. 예를 들어, 이 절단 부위 주변의 아미노산 서열은 PSIQPI/GLFGA일 수 있다 (절단 부위는 /로 나타낸다). 원치 않는 복귀 현상 (reversion events)을 최소화하기 위해서, 바람직하게는 코돈당 적어도 2 개의 뉴클레오타이드 변화가 원래의 아미노산으로의 역 복귀를 야기하는데 필요하도록 하는 방식으로 코돈이 선택된다.
대안적으로, 헬퍼 바이러스 기원의 HA 및 NA 단백질을 포함하는 바이러스 입자는 낮은 pH 조건을 제공함으로써, 선형 구조물로부터 발현된 NA 또는 HA 단백질을 포함하는 후보 바이러스 입자로부터 분리될 수 있다. 몇 개의 계대 동안 세포 배양물 내에서, 특히 Vero 세포 배양물 내에서 배양된 바이러스 입자는 야생형 HA 및/또는 NA 단백질을 포함하는 임상적 분리물로부터의 주에 비해서 HA 단백질 내의 변형으로 인해 낮은 pH에 대한 감소된 안정성을 나타낸다. 따라서, 낮은 pH 조건 하에서, 즉 5.2 내지 6.2 사이의 pH에서 헬퍼 바이러스의 처리는 헬퍼 바이러스의 감소된 증식율을 초래하며, 따라서 비변형된 HA 및/또는 NA 단백질을 포함하는 후보 바이러스 입자의 선택을 초래한다.
본 발명의 추가의 대체 구체예로서, 헬퍼 바이러스 기원의 HA 및/또는 NA 단백질을 포함하는 바이러스 입자는 헬퍼 바이러스 기원의 상기 HA 및/또는 NA 단백질을 중화시키거나 그에 결합하는 항체를 함유하는 항혈청으로 처리함으로써 후보 바이러스 입자로부터 분리된다.
원치 않는 HA 및 NA 단백질을 제거하기 위한 다양한 방법의 조합이 또한 본 발명에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 특정의 구체예에 따르면, 헬퍼 바이러스 입자는 야생형 바이러스의 NA 단백질에 비해서 감소된 활성을 갖는 NA 단백질을 포함할 수 있다. 헬퍼 바이러스는 이 구체예에서 기능적 NA 단백질, 즉 바이러스가 숙주 세포로부터 유리되도록 할 수 있는 NA 단백질을 결여할 수 있거나, NA 단백질을 완전히 결여할 수 있다.
추가의 대체 구체예에 따르면, 헬퍼 바이러스는 인플루엔자 C 바이러스의 HEF 단백질을 포함한다. 인플루엔자 C 바이러스는 단지 하나의 주된 표면 당단백질인, HA 단백질에 대해서 기능적으로 동등한 HEF (헤마글루티닌 에스테라제 융합물)를 갖는다. HEF 단백질은 예를 들어, 본 발명에 참고로 포함된 문헌 [Gao et al., J. Virol., 2008, 6419-6426]에 기술된 바와 같이 트립신 또는 TPCK 트립신에 의해서 활성화될 수 있다.
대안적으로, 외래 프로테아제 절단 부위, 예를 들어, 엘라스타제 절단 부위를 도입시킴으로써 변형될 수 있는 바이러스 당단백질 HEF를 포함하는 변형된 인플루엔자 바이러스가 본 발명에 의해서 구체적으로 청구된다.
본 발명의 추가의 대체 구체예로서, 헬퍼 바이러스 기원의 HEF 단백질을 포함하는 바이러스 입자는 상기 HEF 단백질을 중화시키거나 그에 결합하는 항체로 처리함으로써 제거된다.
추가의 구체 예로서, 헬퍼 바이러스는 코로나바이러스의 HA 단백질을 포함할 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스의 생산의 경우에는, 대안적으로 인플루엔자 B 기원의 HA 및/또는 NA 단백질이 사용될 수 있다.
백신 생산을 위한 바이러스뿐만 아니라 헬퍼 바이러스는 특히 인플루엔자 바이러스 기원의 바이러스일 수 있으며, 더욱 특히 이것은 약독화된 인플루엔자 바이러스일 수 있다.
특정한 구체예에 따르면, 인플루엔자 바이러스는 약독화된 인플루엔자 바이러스이다. 특히, 인플루엔자 바이러스는 숙주 세포의 선천적인 면역반응을 억제하는 병원성 인자 내에 결실 또는 변형을 포함한다. 약독화는 전형적으로, 한랭-적응된 바이러스 스트레인으로부터, 또는 본 발명에 전체로서 참고로 포함된 국제출원 WO99/64571 및 WO99/64068에 기술된 바와 같이 NS1 유전자 (ΔNS1 바이러스) 내에서의 결실 또는 변형으로 인하여 유도될 수 있다. "변형"은 야생형 NS1 서열과 비교한 것으로서 하나 또는 그 이상의 핵산의 치환 또는 결실을 나타낸다. NS 유전자 내에서의 변형은 인터페론 수용 세포 (competent cells)에서 성장 결핍성인 바이러스 입자를 초래한다. 성장 결핍성은 이들 바이러스가, 이들이 동물의 기도에서 부전형 복제 (abortive replication)를 겪음에 따라서 복제 결핍성이 된다는 것을 의미한다. 대안적으로, 바이러스는 PB1-F2 유전자의 결실 또는 변형을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르는 방법은 특히, 기능적 NS1 단백질의 결실을 포함하는 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위해서 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 헬퍼 바이러스는 생산될 바이러스와 동일한 적어도 4 개, 바람직하게는 적어도 5 개, 바람직하게는 6 개의 세그멘트를 함유할 수 있다. 특히, 이들 세그멘트는 PB1, PB2, PA, NP, M, NS이다.
헬퍼 바이러스는 공지의 역유전적 기술에 의해서, 또는 바이러스 재편성과 같은 대체 기술에 의해서 생산될 수 있다.
바이러스에 관한 경우에 용어 "재편성(reassortment)"은 바이러스가 하나보다 많은 모 바이러스 주 또는 공급원으로부터 유도된 유전자 및/또는 폴리펩타이드 성분을 포함하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 7:1 재편성은 제1 모 바이러스로부터 유도된 7 개의 바이러스 게놈 세그멘트 (또는 유전자 세그멘트), 및 제2 모 바이러스로부터 유래하는, 예를 들어, 헤마글루티닌 또는 뉴라미니다제를 코드화한, 단일 상보적 바이러스 게놈 세그멘트를 포함한다. 6:2 재편성은 제1 모 바이러스로부터의 6 개의 게놈 절편, 가장 통상적으로는 6 개의 내부 유전자, 및 상이한 모 바이러스로부터 유래하는 2 개의 상보적 세그멘트, 예를 들어, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제을 포함한다.
NS1 결실을 포함하는 헬퍼 바이러스를 생산하는 방법은 문헌 [Egorov et al., 1998 J. Virol. 1998 Aug; 72(8):6437-41; Egorov et al., Vopr. Virusol., 39:201-205]에 기술되었다. 이에 의해서, H1 인플루엔자 A 바이러스는 NS 유전자 내에 온도 민감성 돌연변이를 포함하는 기본 바이러스로 사용되었으며, 이것은 단지 인터페론 결핍 세포 내에서만 성장할 수 있는 완전히 결실된 NS 유전자를 제공하도록 더 변형된다.
본 발명은 또한, PSIQPIGLFGA (SEQ ID. No. 7)의 서열을 포함하는 HA 폴리펩타이드를 포함한다.
다음의 서열 또는 그의 일부분을 포함하는 HA 뉴클레오타이드 서열이 또한 본 발명에 포함된다:
AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCAAAATGAAAGCAAAACTACTGGTCCTGTTATGTACATTTACAGCTACATATGCAGACACAATATGTATAGGCTACCATGCCAACAACTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTTGAGAAGAATGTGACAGTGACACACTCTGTCAACCTACTTGAGGACAGTCACAATGGAAAACTATGTCTACTAAAAGGAATAGCCCCACTACAATTGGGTAATTGCAGCGTTGCCGGATGGATCTTAGGAAACCCAGAATGCGAATTACTGATTTCCAAGGAATCATGGTCCTACATTGTAGAAACACCAAATCCTGAGAATGGAACATGTTACCCAGGGTATTTCGCCGACTATGAGGAACTGAGGGAGCAATTGAGTTCAGTATCTTCATTTGAGAGATTCGAAATATTCCCCAAAGAAAGCTCATGGCCCAACCACACCGTAACCGGAGTATCAGCATCATGCTCCCATAATGGGAAAAGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGGGGAAGAATGGTTTGTACCCAAACCTGAGCAAGTCCTATGTAAACAACAAAGAGAAAGAAGTCCTTGTACTATGGGGTGTTCATCACCCGCCTAACATAGGGAACCAAAGGGCCCTCTATCATACAGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGTCTTCACATTATAGCAGAAGATTCACCCCAGAAATAGCCAAAAGACCCAAAGTAAGAGATCAGGAAGGAAGAATCAACTACTACTGGACTCTGCTGGAACCTGGGGATACAATAATATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCGCCATGGTATGCTTTTGCACTGAGTAGAGGCTTTGGATCAGGAATCATCACCTCAAATGCACCAATGGATGAATGTGATGCGAAGTGTCAAACACCTCAGGGAGCTATAAACAGCAGTCTTCCTTTCCAGAATGTACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGTCCAAAGTATGTCAGGAGTGCAAAATTAAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACATCCCATCCATTCAACCCATTGGTTTGTTTGGAGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACTGGAATGGTAGATGGGTGGTATGGTTATCATCATCAGAATGAGCAAGGATCTGGCTATGCTGCAGATCAAAAAAGTACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAAACAAGGTGAATTCTGTAATTGAGAAAATGAACACTCAATTCACAGCTGTGGGCAAAGAATTCAACAAATTGGAAAGAAGGATGGAAAACTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGGTTTCTAGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTGGTTCTACTGGAAAATGAAAGGACTTTGGATTTCCATGACTTCAATGTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAAAGAATAATGCCAAAGAAATAGGAAACGGGTGTTTTGAATTCTATCACAAGTGTAACAATGAATGCATGGAGAGTGTGAAAAATGGAACTTATGACTATCCAAAATATTCCGAAGAATCAAAGTTAAACAGGGAGAAAATTGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGAGTCTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCCCTGGTTCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGCTTCTGGATGTGTTCCAATGGGTCTTTGCAGTGTAGAATATGCATCTGAGACCAGAATTTCAGAAATATAAGAAAAAACACCCTTGTTTCTACT (SEQ ID No. 8)
특히, 다음의 서열을 포함하는 HA 뉴클레오타이드가 본 발명에 포함된다: 5'-CCATCCATTCAACCCATTGGTTTGTTTGGAGCC-3' (SEQ ID. 9)
도 1은 선형 양방향 발현 구조물의 생성을 설명하는 개략도이다. 도 1a는 PCR 증폭에 의해서 생성된 단편 F1, F2 및 F3를 나타낸다. 도 1b는 올리고뉴클레오타이드 P4 및 P6을 사용한 중복 (overlapping) PCR에 의해서 생성된 단편 F4를 나타낸다.
실시예 :
실시예 1: 선형 H3N2 HA 발현 구조물의 생성
Vero 세포 배양물-유래 인플루엔자 A H3N2 바이러스의 HA 세그멘트를 올리고뉴클레오타이드 P1 및 P2를 사용하여 PCR 증폭시켰다 (도 1a에서의 F1). 이어서, pHW2000 [Hoffmann et al. 2000, Proc Natl Acad Sci U S A. 97:6108-13]으로부터 유도된 2 개의 DNA 단편 (도 1에서의 F2 및 F3)을 중복 PCR을 사용하여 HA PCR 생성물에 융합시켰다 (참조: 도 1b). 제1 DNA 단편 (F2)은 CMV 프로모터 및 PolI 종결부위 (terminator)를 포함하고, 제2의 단편 (F3)은 인간 PolI 프로모터 및 BGH 폴리A 시그날을 포함한다. 중복 PCR 생성물의 생성을 촉진시키기 위해서, HA 증폭을 위해서 사용된 올리고뉴클레오타이드를, P1이 PolI 종결부위에 대해서 상보적인 서열을 함유하고, P2가 PolI 프로모터에 대해서 상보적인 서열을 함유하도록 그들의 5' 말단 상에서 연장시켰다 (참조: 도 1a). 마찬가지로, 단편 F1 및 F2의 생성을 위해서 사용된 프라이머 P3 및 P5를, HA의 5' 및 3' 말단에 대해서 상보적인 서열을 함유하도록 그들의 5' 말단 상에서 연장시켰다 (참조: 도 1a). 단편 F2 및 F3은 pHW2000 골격으로 기술된 서열로부터 유도된 보호 서열을 함유한다. 이들 서열은 mRNA 및 vRNA의 전사에 직접적으로 포함되지는 않지만, 엑소뉴클레아제에 의한 양방향 발현 카세트의 분해를 감소시킨다.
바이러스 RNA는 퀴아겐 바이랄앰프 키트 (Qiagen ViralAmp kit)를 사용하여 Vero 세포 배양물-유래 인플루엔자 A H3N2 바이러스로부터 추출하고, 이전에 기술된 바와 같이 Uni12 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 역전사시켰다 [Hoffmann et al., 2001, Arch Virol. 146:2275-89]. HA 절편은 Pfu Turbo DNA 폴리머라제 및 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 표 1에 나타낸 올리고뉴클레오타이드에 의해서 증폭시켰다:
P1 5'-CGAAGTTGGGGGGG AGCAAAAGCAGGGGATAATTCTATTAAC -3' (SEQ ID No. 1)
P2 5'-GCCGCCGGGTTATT AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAATTAATGC -3' (SEQ ID No. 2)
H3 서열에 상응하는 뉴클레오타이드는 이탤릭 볼드체 문자로 나타내며, PolI 종결부위 (P1) 및 PolI 프로모터 (P2)에 대해서 동종성인 뉴클레오타이드는 표준 대문자로 나타낸다.
HA F4 PCR 생성물은 퀴아퀵 (Qiaquick) PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. PCR 단편 F2 및 F3은 각각 Pfu Turbo DNA 폴리머라제 및 Taq DNA 폴리머라제의 혼합물을 사용하여 pHW2000 플라스미드 DNA로부터 프라이머 쌍 P3+P4 및 P5+P6 (참조: 표 2 및 도 1a)에 의해서 증폭되었다. PCR 생성물 F2 및 F3은 퀴아퀵 (QIAquick) PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
P3 5'- CCTGCTTTTGCT CCCCCCCAACTTCGGAGGTC-3' (SEQ ID No. 3)
P4 5'-GGGGTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATAC-3' (SEQ ID No. 4)
P5 5'- CCTTGTTTCTACT AATAACCCGGCGGCCCAAAATGC-3' (SEQ ID No. 5)
P6 5'-CCCCTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGTTC3' (SEQ ID No. 6)
H3에 상응하는 P3 및 P5 뉴클레오타이드의 경우에, 서열은 이탤릭 볼드체 문자로 나타내며, pHW2000에 대해서 상보적인 뉴클레오타이드는 표준 대문자로 나타낸다. P4 및 P6의 경우에, 5' 말단에서의 4 개의 뉴클레오타이드를 제외한 모든 뉴클레오타이드는 pHW2000에 상응한다.
HA를 함유하는 전체 길이 PCR 생성물 (F4)을 생성시키기 위해서, CMV 프로모터, PolI 종결부위, PolI 프로모터 및 BGH 폴리A 시그날, 단편 F1, F2 및 F3를 조합하고, Pfu Turbo DNA 폴리머라제 및 Taq DNA 폴리머라제의 혼합물을 사용하여 프라이머 P4 및 P6에 의한 중복 PCR로 증폭시켰다.
도 1은 선형 양방향 발현 구조물의 생성의 개략도를 나타낸다. 도 1a)는 PCR 증폭에 의해서 별도로 생성된 단편 F1, F2 및 F3를 개략적으로 기술한다.
단편 F1은 각각의 바이러스 세그멘트를 함유하며, PolI 프로모터 및 PolI 종결부위에 대해서 상보적인 연장부를 함유한다. 단편 F2는 CMV 프로모터 및 PolI 종결부위뿐만 아니라 각각의 바이러스 세그멘트에 대해서 상보적인 연장부를 함유한다. 단편 F3은 PolI 프로모터 및 BGH 폴리아데닐화 시그날뿐만 아니라 각각의 바이러스 세그멘트에 대해서 상보적인 연장부를 함유한다. F1 단편의 PCR 증폭을 위해서 사용된 올리고뉴클레오타이드 P1 및 P2는 각각의 바이러스 세그멘트에 대해서 상보적이다. P1은 PolI 종결부위에 대해서 상보적인 5' 연장부를 함유하며, P2는 PolI 프로모터에 대해서 상보적인 5' 연장부를 함유한다.
올리고뉴클레오타이드 P3 및 P4는 각각의 바이러스 세그멘트에 대해서 상보적인 5' 연장부를 함유하는 P3에 의한 F2 단편의 PCR 증폭을 위해서 사용된다.
올리고뉴클레오타이드 P5 및 P6은 각각의 바이러스 세그멘트에 대해서 상보적인 5' 연장부를 함유하는 P5에 의한 F3 단편의 PCR 증폭을 위해서 사용된다.
보호 서열은 pHW2000 골격으로부터 유도되며, mRNA 또는 vRNA 전사에 직접적으로 포함된 서열을 함유하지 않는다.
실시예 2: 엘라스타제 -의존성 헬퍼 바이러스의 생성
인플루엔자 A/뉴칼레도니아/20/99-양 (H1N1) 스트레인의 HA 세그멘트는ㄴㄴ 트립신 대신에 엘라스타제에 의해서 단백분해적으로 활성화된 절단 부위를 함유하도록 PCR-돌연변이유발에 의해서 개조된다. 절단 부위 주위의 아미노산 서열은 PSIQSR/GLFGA로부터 PSIQPI/GLFGA로 변화된다 (절단 부위는 /로 나타낸다). 실시예 1과 유사하게, 10-20 ㎍의 선형 양방향 발현 구조물 F4는 PCR에 의해서 생성되고, 퀴아퀵 키트 (Qiagen)를 사용하고, 이어서 퀴아겐 엔도프리 플라스미드 (Qiagen Endofree Plasmid) 키트에 의해서 정제한다.
Vero 세포는 37℃ 및 5% CO2 하에서 10% 태자 송아지 혈청 및 1% 글루타맥스 (Glutamax)-I 보충물을 함유하는 DMEM/F12 배지 중에 유지시킨다.
바이러스 생성을 위해서, 변형된 F4 HA DNA 단편은 Vero 세포의 형질감염을 위해서 단독으로, 또는 PB1, PB2, PA 및 NP에 대해서 코드화한 4 개의 단백질 발현 플라스미드와 함께 사용된다. 형질감염 24 시간 후에, 세포를 기능적 NS1를 발현하지 않는 인플루엔자 A IVR-116 주(IVR-116-delNS1)에 의해서 0.001 내지 1의 MOI로 감염시킨다.
감염시킨 후에, 바이러스 복제를 지지하기 위해서 Vero 세포를 5 ㎍/㎖ 엘라스타제의 존재 하에 무-혈청 배지 (Opti-Pro; Invitrogen) 내에서 배양한다. 50-100% CPE가 관찰되자마자, 구제된 엘라스타제-의존성 IVR-116-delNS1 바이러스 (IVR-116-delNS1-EL)를 동결시키거나, Vero 세포 상에서 플라크-정제한다.
실시예 3: 엘라스타제 -의존성 H1N1 헬퍼 바이러스의 사용에 의한 인플루엔자 A H3N2 재편성 바이러스의 생성
A/브리스베인 (Brisbane)/10/2007 (H3N2)-양 바이러스의 HA 및 NA 세그멘트에 대한 선형 양방향 발현 구조물 (F4)는 실시예 1에 기술된 바와 같이 PCR에 의해서 생성된다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 정제한 후에, HA 및 NA F4 PCR 생성물은 Vero 세포의 형질감염을 위해서 단독으로, 또는 PB1, PB2, PA 및 NP에 대해서 코드화한 4 개의 단백질 발현 플라스미드와 함께 사용된다. 형질감염 24 시간 후에, 세포를 인플루엔자 A IVR-116-delNS1-EL 바이러스 (헬퍼 바이러스)에 의해서 0.001 내지 1의 MOI로 감염시킨다. 감염시킨 후에, 세포를 5 ㎍/㎖ 트립신의 존재 하에, 무-혈청 배지 (Opti-Pro; Invitrogen) 내에서 배양한다. 10-100% CPE가 관찰되자마자, 바이러스를 수확한다. 선택적 계대는 바이러스 수확물을 24 시간 동안 4℃에서, 적절한 농도 (예를 들어, 10% v/v)의 항혈청 (비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae)로부터의 뉴라미니다제로 전처리됨)으로, 또는 A/뉴칼레도니아/20/99 HA 및 NA에 대해서 특이적인 정제된 IgG 제제로 처리하여 헬퍼 바이러스를 중화시킴으로써 수행된다. 그 후, Vero 세포를 전처리된 바이러스와 함께 RT에서 30 분 동안 배양하고, PBS로 세척하고, 이어서 5 ㎍/㎖ 트립신을 함유하는 무-혈청 배지 내에서 37℃로 배양한다. 임의로, A/뉴칼레도니아/20/99 HA 및 NA에 대해서 특이적인 정제된 IgG를 배양 배지에 첨가할 수 있다. 10-100% CPE가 관찰되자마자 바이러스를 수확하고, 2차 선택적 계대를 수행한다. CPE가 발생하면, 바이러스를 동결시키거나 플라크-정제한다.
실시예 4: 낮은 pH 처리와 함께 엘라스타제 -의존성 H1N1 헬퍼 바이러스의 사용에 의한 인플루엔자 A H3N2 재편성 바이러스의 생성
A/브리스베인/10/2007 (H3N2)-양 바이러스의 HA 및 NA 세그멘트에 대한 선형 양방향 발현 구조물 (F4)은 실시예 1에 기술된 바와 같이 PCR에 의해서 생성된다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 정제한 후에, HA 및 NA F4 PCR 생성물은 Vero 세포의 형질감염을 위해서 단독으로, 또는 PB1, PB2, PA 및 NP에 대해서 코드화한 4 개의 단백질 발현 플라스미드와 함께 사용된다. 형질감염 24 시간 후에, 세포를 인플루엔자 A IVR-116-delNS1-EL 바이러스 (헬퍼 바이러스)에 의해서 0.001 내지 1의 MOI로 감염시킨다. 감염시킨 후에, 세포를 5 ㎍/㎖ 트립신의 존재 하에 무-혈청 배지 (Opti-Pro; Invitrogen) 내에서 배양한다. 10-100% CPE가 관찰되자마자 바이러스를 수확한다. 그 후, 바이러스 수확물을 150 mM NaCl, 및 50 mM MES pH 5.4-6.2를 함유하는 완충액으로 1:1 희석하고, 37℃에서 30 분 동안 배양하여 헬퍼 바이러스 HA를 선택적으로 불활성화시킨다. pH 중화시킨 후에, 선택적 계대는 바이러스 수확물을 24 시간 동안 4℃에서, 적절한 농도 (예를 들어, 10% v/v)의 항혈청 (비브리오 콜레라에로부터의 뉴라미니다제로 전처리됨)으로, 또는 A/뉴칼레도니아/20/99 HA 및 NA에 대해서 특이적인 정제된 IgG 제제로 처리하여 헬퍼 바이러스를 중화시킴으로써 수행된다. 그 후, Vero 세포를 전처리된 바이러스와 함께 RT에서 30 분 동안 배양하고, PBS로 세척하고, 이어서 5 ㎍/㎖ 트립신을 함유하는 무-혈청 배지 내에서 37℃로 배양한다. 경우에 따라, A/뉴칼레도니아/20/99 HA 및 NA에 대해서 특이적인 정제된 IgG를 배양 배지에 첨가할 수 있다. 10-100% CPE가 관찰되자마자 바이러스를 수확하고, 2차 선택적 계대를 수행한다. CPE가 발생하면, 바이러스를 동결시키거나 플라크-정제한다.
실시예 5: 엘라스타제 -의존성 H3N2 헬퍼 바이러스의 사용에 의한 인플루엔자 A H1N1 재편성 바이러스의 생성
A/뉴칼레도니아/20/99 (H1N1)-양 바이러스의 HA 및 NA 세그멘튼에 대한 선형 양방향 발현 구조물 (F4)은 실시예 1에 기술된 바와 같이 PCR에 의해서 생성된다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 정제한 후에, HA 및 NA F4 PCR 생성물은 Vero 세포의 형질감염을 위해서 단독으로, 또는 PB1, PB2, PA 및 NP에 대해서 코드화한 4 개의 단백질 발현 플라스미드와 함께 사용된다. 형질감염 24 시간 후에, 세포를 엘라스타제-의존성 인플루엔자 A/위스콘신/67/05 (H3N2)-양 바이러스 (헬퍼 바이러스)에 의해서 0.001 내지 1의 MOI로 감염시킨다. 감염시킨 후에, 세포를 5 ㎍/㎖ 트립신의 존재 하에 무-혈청 배지 (Opti-Pro; Invitrogen) 내에서 배양한다. 10-100% CPE가 관찰되자마자 바이러스를 수확한다. 선택적 계대는 바이러스 수확물을 24 시간 동안 4℃에서, 적절한 농도 (예를 들어, 10% v/v)의 항혈청 (비브리오 콜레라에로부터의 뉴라미니다제로 전처리됨)으로, 또는 A/위스콘신/67/05 HA 및 NA에 대해서 특이적인 정제된 IgG 제제로 처리하여 헬퍼 바이러스를 중화시킴으로써 수행된다. 그 후, Vero 세포를 전처리된 바이러스와 함께 RT에서 30 분 동안 배양하고, PBS로 세척하고, 이어서 5 ㎍/㎖ 트립신을 함유하는 무-혈청 배지 내에서 37℃로 배양한다. 임의로, A/위스콘신/67/05 HA 및 NA에 대해서 특이적인 정제된 IgG를 배양 배지에 첨가할 수 있다. 10-100% CPE가 관찰되자마자 바이러스를 수확하고, 2차 선택적 계대를 수행한다. CPE가 발생하면, 바이러스를 동결시키거나 플라크-정제한다.
<110> AVIR Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG <120> Novel Method for Generation of RNA Virus <130> IPA110318 <150> US61/119,618 <151> 2008-12-03 <150> EP09155594.6 <151> 2009-03-19 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 1 cgaagttggg ggggagcaaa agcaggggat aattctatta ac 42 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 2 gccgccgggt tattagtaga aacaagggtg tttttaatta atgc 44 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 3 cctgcttttg ctccccccca acttcggagg tc 32 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 4 ggggtatcag ggttattgtc tcatgagcgg atac 34 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 5 ccttgtttct actaataacc cggcggccca aaatgc 36 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid sequence <400> 6 ccccttggcc gattcattaa tgcagctggt tc 32 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified HA cleavage site of influenza A virus <400> 7 Pro Ser Ile Gln Pro Ile Gly Leu Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 1775 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 8 agcaaaagca ggggaaaata aaaacaacca aaatgaaagc aaaactactg gtcctgttat 60 gtacatttac agctacatat gcagacacaa tatgtatagg ctaccatgcc aacaactcaa 120 ccgacactgt tgacacagta cttgagaaga atgtgacagt gacacactct gtcaacctac 180 ttgaggacag tcacaatgga aaactatgtc tactaaaagg aatagcccca ctacaattgg 240 gtaattgcag cgttgccgga tggatcttag gaaacccaga atgcgaatta ctgatttcca 300 aggaatcatg gtcctacatt gtagaaacac caaatcctga gaatggaaca tgttacccag 360 ggtatttcgc cgactatgag gaactgaggg agcaattgag ttcagtatct tcatttgaga 420 gattcgaaat attccccaaa gaaagctcat ggcccaacca caccgtaacc ggagtatcag 480 catcatgctc ccataatggg aaaagcagtt tttacagaaa tttgctatgg ctgacgggga 540 agaatggttt gtacccaaac ctgagcaagt cctatgtaaa caacaaagag aaagaagtcc 600 ttgtactatg gggtgttcat cacccgccta acatagggaa ccaaagggcc ctctatcata 660 cagaaaatgc ttatgtctct gtagtgtctt cacattatag cagaagattc accccagaaa 720 tagccaaaag acccaaagta agagatcagg aaggaagaat caactactac tggactctgc 780 tggaacctgg ggatacaata atatttgagg caaatggaaa tctaatagcg ccatggtatg 840 cttttgcact gagtagaggc tttggatcag gaatcatcac ctcaaatgca ccaatggatg 900 aatgtgatgc gaagtgtcaa acacctcagg gagctataaa cagcagtctt cctttccaga 960 atgtacaccc agtcacaata ggagagtgtc caaagtatgt caggagtgca aaattaagga 1020 tggttacagg actaaggaac atcccatcca ttcaacccat tggtttgttt ggagccattg 1080 ccggtttcat tgaagggggg tggactggaa tggtagatgg gtggtatggt tatcatcatc 1140 agaatgagca aggatctggc tatgctgcag atcaaaaaag tacacaaaat gccattaacg 1200 ggattacaaa caaggtgaat tctgtaattg agaaaatgaa cactcaattc acagctgtgg 1260 gcaaagaatt caacaaattg gaaagaagga tggaaaactt aaataaaaaa gttgatgatg 1320 ggtttctaga catttggaca tataatgcag aattgttggt tctactggaa aatgaaagga 1380 ctttggattt ccatgacttc aatgtgaaga atctgtatga gaaagtaaaa agccaattaa 1440 agaataatgc caaagaaata ggaaacgggt gttttgaatt ctatcacaag tgtaacaatg 1500 aatgcatgga gagtgtgaaa aatggaactt atgactatcc aaaatattcc gaagaatcaa 1560 agttaaacag ggagaaaatt gatggagtga aattggaatc aatgggagtc tatcagattc 1620 tggcgatcta ctcaactgtc gccagttccc tggttctttt ggtctccctg ggggcaatca 1680 gcttctggat gtgttccaat gggtctttgc agtgtagaat atgcatctga gaccagaatt 1740 tcagaaatat aagaaaaaac acccttgttt ctact 1775 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 9 ccatccattc aacccattgg tttgtttgga gcc 33

Claims (18)

  1. a) 임의의 증폭 및/또는 선택 서열도 갖지 않으며, RNA 폴리머라제 II (polII) 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날 사이에 삽입된 RNA 폴리머라제 I (polI) 프로모터 및 polI 종결 시그날을 포함하고, 상기 poll 프로모터와 상기 poll 종결 시그날 사이에 삽입된 HA 및/또는 NA 유전자 절편을 더 포함하는 선형 발현 구조물을 제공하고,
    b) 숙주 세포를 상기 선형 발현 구조물로 형질감염시키고,
    c) 상기 숙주 세포를 헬퍼 바이러스 HA 및/또는 NA 단백질을 갖는 헬퍼 바이러스로 감염시키고,
    d) 상기 숙주 세포를 배양하여 바이러스 입자를 증식시키고,
    e) HA 및/또는 NA 단백질의 표현형, 유전자형 또는 항원적 특성을 기초로 하여 (i) 선형 발현 구조물로부터 유도된 HA 및/또는 NA 단백질을 함유하지만, (ii) 헬퍼 바이러스 HA 및 NA 단백질 또는 그의 세그멘트를 함유하지 않는 바이러스 입자를 선택하고, 임의로
    f) 헬퍼 바이러스 HA 및 NA 단백질의 부재를 핵산 또는 아미노산 서열의 분석에 의해서 결정하는 단계를 포함하여, 음성-가닥 세그멘트화된 RNA 바이러스를 생산하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 숙주 세포를 PB1, PB2, PA, NS, M, 및 NP로 구성된 그룹으로부터 선택된 단백질을 코드화한 선형 구조물로 형질감염시키는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 헬퍼 바이러스로부터 유도된 HA 단백질을 포함하는 자손 바이러스 입자는 자손 바이러스 입자를 프로테아제로 처리함으로써 후보 바이러스 입자로부터 분리되고, 또한 상기 프로테아제는 헬퍼 바이러스로부터 유도된 HA 단백질을 절단하지 않지만 후보 바이러스 입자의 HA 단백질은 절단하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 하나에 있어서, 프로테아제가 트립신, 엘라스타제, 키모트립신, 파파인으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 헬퍼 바이러스의 HA 단백질이 프로테아제에 의해서 절단되도록 변형되고, 여기에서 상기 프로테아제는 트립신이 아닌 방법.
  6. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 헬퍼 바이러스 기원의 HA 및 NA 단백질을 포함하는 자손 바이러스 입자는 낮은 pH 조건을 제공함으로써 후보 바이러스 입자로부터 분리되는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중의 어느 하나에 있어서, 헬퍼 바이러스 기원의 HA 및/또는 NA 단백질을 포함하는 자손 바이러스 입자는 자손 바이러스를 상기 HA 및/또는 NA 단백질을 결합시키는 항체와 접촉시킴으로써 후보 바이러스 입자로부터 분리되는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스 입자가 감소된 활성을 갖는 NA 단백질을 포함하거나, 기능적 NA 단백질을 결여하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스가 인플루엔자 C 바이러스의 HEF 단백질을 포함하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 헬퍼 바이러스의 HEF 단백질이 프로테아제에 의해서 절단되도록 변형되며, 여기에서 상기 프로테아제는 트립신이 아닌 방법.
  11. 제 1항 내지 제 8항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스가 코로나바이러스의 HA 단백질을 포함하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 입자가 인플루엔자 바이러스 입자인 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 입자가 약독화된 인플루엔자 바이러스 입자인 방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스가 NS1 유전자 내의 결실 또는 변형을 포함하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스가 변형되거나 결실된 NS 유전자를 포함하고, 인터페론 수용 세포에서 성장 결핍성인 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스가 생산되는 바이러스와 동일한 적어도 4 개, 바람직하게는 적어도 5 개, 바람직하게는 6 개의 세그멘트를 함유하는 방법.
  17. 서열 PSIQPIGLFGA (SEQ ID. NO. 7)를 포함하는 HA 폴리펩타이드 단편.
  18. 서열 CCATCCATTCAACCCATTGGTTTGTTTGGAGCC (SEQ ID. NO. 9)를 포함하는 HA 뉴클레오타이드 서열 단편.
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