CN101628932B - 禽流感合成肽疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种禽流感合成肽疫苗及其制备方法，具体涉及用于禽流感合成肽疫苗的多肽或其聚合物，以及含有该多肽或其聚合物的疫苗及它们的制备方法，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。由该多肽或其聚合物制成的疫苗可以有效应对禽流感病毒的抗原变异，也不存在生物安全性问题，易于大规模合成，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于禽流感合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有该多肽或其多肽聚合物的疫苗及它们的制备方法。
背景技术
禽流感(Avian influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的多种禽类感染的传染病，被国际兽医局(OIE)列为A类传染病，也被我国列为一类动物疾病。AIV是属于正粘病毒科流感病毒属的A型流感病毒，其基因组是由8个分节段的单股负链RNA组成，分别编码8种不同功能的蛋白：多聚酶蛋白PB1、PB2、PA；血凝素蛋白HA；核衣壳蛋白NP；神经氨酸酶蛋白NA；基质蛋白M1和M2，以及非结构蛋白NS1和NS2，其中，血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和M2蛋白为禽流感病毒的三种表面抗原分子，针对这三种抗原的抗体都有抑制流感病毒感染的作用。
禽流感灭活疫苗的保护效力具有亚型特异性，而禽对已知的15种HA亚型都易感，且人们无法预测什么时候家禽会感染哪种亚型，一次使用预防性疫苗来阻止所有可能的亚型禽流感的发生是不现实的。此外，HA和NA抗原性变异频率很高，不同变异株不产生交叉保护，研制此类抗原疫苗的速度往往跟不上病毒变异，这就是目前我国虽不断使用疫苗，但禽流感却不断爆发的原因所在。
为此，禽病科学家一直致力于研究其他类型的疫苗，如DNA疫苗，现已诞生了由杆状病毒表达的禽流感病毒H5N1的HA基因制成的亚单位疫苗；表达HA或NA基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗。这些疫苗的一个突出优点就是只使用了禽流感病毒的某一种或某二种抗原成分，这样有利于开发针对性地检测方法对疫情进行监测。但是，这些疫苗同样无法提供抵抗各种亚型的禽流感的交叉保护作用。因此，开发新型的广泛性防治禽流感病毒感染的技术成为科学工作者的研究热点。
利用A型禽流感病毒M2蛋白是研究具有交叉保护性疫苗的一个重要方向，相关研究如下：Watanabe T等利用缺失M2跨膜区的流感病毒制成了活疫苗；Slepushkin VA等和Frace，M.等的研究表明基因工程表达的M2免疫之后，能够保护小鼠抵御不同亚型流感病毒的攻击；Neirynck(1999)等将A型流感病毒的保守的M2蛋白胞外区与乙肝病毒核心蛋白融合，试图产生一个针对流感病毒的通用疫苗，他们发现对小鼠进行腹腔注射或鼻内施用，可使99-100％的小鼠产生对致病性流感病毒X47攻击免疫力；Mozdzanowska K等(2003)将M2的胞外区和辅助性T细胞的决定簇经肽链连接后，构建带有佐剂作用的M2e-MAPS复合物，免疫小鼠后获得了很强的保护力和明显的抑制病毒在呼吸道中复制的能力。这些研究结果说明，M2蛋白在机体内不仅能刺激产生抗体，而且能引起细胞毒性T细胞(CTL)反应。因此，以M2作为抗原，可对不同亚型的禽流感病毒产生保护性免疫，是研究交叉保护性流感疫苗的理想候选抗原。
跨膜蛋白M2是除HA、NA外的第3种跨膜蛋白，含有97个氨基酸，分子质量约为15ku。它的编码基因位于AIV基因组的第7个节段上，并由它的第2个小mRNA翻译。M2蛋白不含糖基，具有高度保守性。感染细胞的细胞膜上的A型禽流感病毒的M2蛋白与I类糖蛋白相似，即氨基端在细胞外，羧基端在细胞内。细胞外部分有24个氨基酸(M2e)，跨膜区是由19个氨基酸组成的疏水区，羧基端的54个氨基酸位于细胞膜内。M2蛋白是A型禽流感病毒的一个高度保守性的跨膜蛋白(同源性达90％)，特别是氨基端的10个氨基酸是非常保守的，在所测得的禽流感和人流感病毒中，其序列几乎完全相同。
由于氨基末端的24个氨基酸残基的保守性极高，用这24个氨基酸残基作为表位所表达的融合蛋白可表现出很好的免疫保护性。Neirynck S等人将M2蛋白保守性位点基因与乙肝病毒核心蛋白进行融合，制得表达质粒，对小鼠进行腹腔注射或鼻内施用接种。试验显示这几种质粒都可诱导机体产生对不同毒株攻击的保护作用，既抑制了病毒的生长繁殖，又降低了动物的死亡率。
Mozdzanowska K等人将M2的胞外区和辅助性T细胞的决定簇经肽链连接后，构建带有佐剂作用的M2e2MAPs复合物，免疫小鼠后获得了很强的保护力并且明显抑制病毒在呼吸道中的复制。Fan等对M2e合成肽与KLH(Keyhole limpet hemocyanin)或脑膜炎双球菌外膜蛋白的复合物(OMPC)进行处理，制备结合疫苗并免疫小鼠、雪貂和恒河猴，结合疫苗在这三种实验检测物种中均显示出高免疫原性。研究表明以M2e为基础的不同蛋白疫苗在免疫小鼠后可诱导产生有效的免疫保护性反应。
传统疫苗是将病原体灭活或减毒制成的，存在生物危害性和遗传变异致使原疫苗效力丧失等问题。表位疫苗是用抗原表位制备的疫苗，是目前研制感染性疾病疫苗的方向。相对于传统的弱毒苗和灭活苗以及其他几种新型的疫苗，肽类疫苗安全、无毒、稳定，由于其分子结构小而简单，很少会出现严重的并发症及医源性感染问题。肽类疫苗可精确定位，合成T、B细胞抗原表位且可进行不同的复合，制成针对多种病原体的疫苗。特别是可选用微生物中无突变的小片段制备合成肽疫苗。有些病原(如流感病毒)可通过快速而高频的突变逃避宿主免疫系统，若选择无突变的小肽片段作为疫苗就可克服其自身蛋白的局限性。抗原表位(Epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇，它是T细胞抗原受体(TCR)和B细胞抗原受体(BCR)及抗体特异结合的基本单位。在免疫应答中，TCR和BCR所识别的抗原表位不同，分别称为T细胞表位和B细胞表位。研制合成多肽疫苗最重要的一步是寻找抗原表位。
发明内容
本发明通过对禽流感毒株的序列测定，研究禽流感主要抗原位点的变异情况，同时结合计算机辅助方法进行禽流感抗原位点的分析预测，研制出一种效力好、安全性高、生产工艺稳定且成本低的合成肽疫苗，其对不同亚型禽流感病毒产生交叉保护性免疫。
因此，本发明的目的在于提供一种用于禽流感合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有该多肽的疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种禽流感合成肽疫苗的制备方法。
此外，本发明还涉及上述多肽或疫苗在制备预防和/或治疗禽流感，例如高致病性禽流感的药物中的用途。为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一、禽流感合成肽的设计
本发明提供一种用于禽流感合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明通过对禽流感流行毒株的序列测定，研究禽流感主要抗原位点的变异情况，同时结合计算机辅助方法进行禽流感抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，进而经过大量的动物试验对候选多肽抗原进行筛选，得到免疫反应水平高，可以很好地保护动物免受禽流感流行毒株攻击的多肽抗原。
二、禽流感合成肽的制备
本发明还提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的多肽的制备方法，该制备方法如下：
(1)去保护反应：在体积百分比为15％-30％的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，脱除树脂氨基上的9-芴甲氧羰基保护基团，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤；
(2)氨基酸的活化：将合成用的带有9-芴甲氧羰基保护基团的各个氨基酸与1-羟基苯丙三唑反应合成氨基酸-1-羟基苯丙三唑酯；
(3)缩合反应：使用多肽合成仪将上述各种氨基酸和树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂；
(4)乙酰化反应：使用重量体积百分比1.5％-4％(g/ml)的乙酰咪唑N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-28℃条件下反应20-40分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；
(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复步骤(1)-(4)，反应完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽树脂；
(6)多肽与树脂的分离：向干燥的多肽树脂中加入裂解试剂，匀速搅拌1-4小时后置于0℃下反应10分钟，恢复至室温，挥去三氟乙酸，将叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，搅拌洗涤，过滤得多肽溶液；
(7)超滤纯化多肽及无菌处理：使用膜包在20-28℃条件下超滤多肽，使用0.22微米在线滤器除菌保存。
在上述制备方法中，所述裂解试剂的组分体积比具体为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶乙二硫醇∶苯酚∶水＝85∶8∶3∶3∶1。
三、禽流感合成肽疫苗的配制
本发明还提供了一种禽流感合成肽疫苗，其中包括氨基酸序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示的多肽或多肽聚合物。此外，所述疫苗还可以包含佐剂。
该疫苗具体的制备方法如下：
(1)用注射用水将多肽或其多肽聚合物稀释至50μg/ml制成多肽或其多肽聚合物溶液；
(2)在20-28℃条件下，按照多肽或其多肽聚合物溶液∶佐剂＝1∶1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，90-150转/分钟慢速搅拌1.5-3分钟；
(3)缓慢加入含有多肽或其多肽聚合物溶液，搅拌20-30分钟；
(4)高速搅拌15-30分钟后静置5分钟，分装后即得。
在上述制备方法中，所述高速搅拌为8000-10000转/分钟。
此外，本发明还提供了上述的多肽或其多肽聚合物，包含上述多肽或其多肽聚合物的疫苗在制备治疗和/或预防禽流感的药物中的用途。特别地，本发明还提供了上述多肽或其多肽聚合物以及疫苗在制备预防和/或治疗禽流感，例如高致病性禽流感的药物中的用途。
综上所述，本发明人在研究禽流感病毒序列变异规律的基础上，通过计算机分析设计并合成了本发明的多肽，将其用于疫苗的制备，并对这些多肽进行了疫苗安全性和效力试验。结果表明，该疫苗可以有效应对禽流感病毒的抗原变异，也不存在生物安全性问题，易于大规模合成，具有良好的应用前景。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：合成肽疫苗多肽抗原的固相合成
本实施例为本发明所提供的合成肽疫苗的多肽抗原的固相合成。本发明的多肽抗原可以通过ABI 433A全自动多肽合成仪，利用Merrifield固相合成法制备，其中采用了9-芴甲氧羰基(Fmoc)修饰的氨基酸，固相载体为Rink Amide MBHA树脂。生产过程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原纯化与除菌保存。
1、合成原料的准备
合成肽疫苗多肽抗原序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列、SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列以及(SEQ ID NO.1)2-K-εK-CONH2所示氨基酸序列的聚合肽，其中K表示赖氨酸，ε代表在ε氨基有Fmoc保护的赖氨酸。
依据上述多肽抗原序列以及1mmol的合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸，加入相应的Cartridge(装氨基酸的小瓶)中。同样按要求称量RinkAmide MBHA树脂，放入反应腔中，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成的肽的名称，批号，反应腔的皮重以及所称取树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制合成试剂包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、己酰咪唑(AIM)、哌啶(PIP)、甲醇等并放置到对应的试剂瓶中。
2、合成仪状态的检测
检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查N2是否充足，系统表压是否正常。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪：发送Flow Rate1-18到合成仪，选择Main Menu-ModuleTest-按Prer或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A)-按Start-按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求。
3、合成肽疫苗多肽抗原的制备
(1)去保护反应：在15％-30％(体积/体积)的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，脱除树脂氨基上的9-芴甲氧羰基保护基团，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤；
(2)氨基酸的活化：将合成用的带有9-芴甲氧羰基保护基团的各个氨基酸与1-羟基苯丙三唑反应合成氨基酸-1-羟基苯丙三唑酯；
(3)缩合反应：使用多肽合成仪将上述各种氨基酸和树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂；
(4)乙酰化反应：使用1.5％-4％(重量/体积)的乙酰咪唑N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-28℃条件下反应20-40分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；
(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复步骤(1)-(4)，反应完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽树脂；
(6)多肽与树脂的分离：向干燥的多肽树脂中加入裂解试剂(各组分的体积比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶乙二硫醇∶苯酚∶水＝85∶8∶3∶3∶1)，匀速搅拌1-4小时后置于0℃下反应10分钟，恢复至室温，挥去三氟乙酸，将叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，搅拌洗涤，过滤得多肽溶液；
(7)超滤纯化多肽及无菌处理：使用膜包在20-28℃条件下超滤多肽，使用0.22微米在线滤器除菌保存。
实施例2：合成肽疫苗的配制
本实施例为本发明所提供的合成肽疫苗的配制。
用注射用水将多肽溶液分别稀释到50μg/ml，制成抗原水相；将SEPPICMONTANIDE ISA 50V油佐剂经121℃，30分钟灭菌，备用作为油相。在22℃条件下，按照抗原水相与灭菌的油相50V为1∶1的体积比，先将油相加入乳化罐内，100转/分钟慢速搅拌2分钟，缓慢加入水相，加完后搅拌30分钟，再高速9000转/分钟搅拌20分钟，然后静置5分钟，分装后即得抗禽流感病毒的合成肽疫苗，即氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的合成肽疫苗、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的合成肽疫苗，以及氨基酸序列如(SEQ IDNO.1)2-K-εK-CONH2所示氨基酸序列的合成肽疫苗。
实施例3：合成肽疫苗的效力试验
本实施例为对本发明所提供的合成肽疫苗进行效力试验，使用无特定病原体(SPF)鸡血凝抑制试验来测定合成肽疫苗的免疫效果。
将4-5周龄SPF鸡随机分为四组，前三组每组10只SPF鸡，对照组5只SPF鸡，具体分组情况如表1所示。
表1疫苗分组情况及所需动物数
| 分组 | 注射疫苗 | SPF鸡(只) |
| A组 | SEQ ID NO.1疫苗 | 10 |
| B组 | SEQ ID NO.2疫苗 | 10 |
| C组 | SEQ ID NO.1聚合疫苗 | 10 |
| D组 | 生理盐水对照组 | 5 |
对前三组各SPF鸡颈部皮下注射疫苗0.3ml，对照组SPF鸡颈部皮下注射生理盐水0.3ml。接种后21日，连同对照鸡5只，分别采血，分离血清，用禽流感病毒H9亚型抗原测定HI抗体效价。微量法测定HI抗体效价步骤如下：
1)取微量反应板，用微量移液器给第1孔到第10孔每孔各加入生理盐水25μl，第11孔加生理盐水50μl。
2)以微量移液器取被检血清25μl，放入第1孔，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次，使被检血清与稀释液混合均匀，再吸取25μl液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第10孔，最后第10孔吸取25μl液体弃掉，被检血清稀释倍数依次为1∶2至1∶1024。第11孔为红细胞对照，第12孔为抗原对照。
3)第1孔至第10孔每孔在加入含4个单位的病毒液25μl。第11孔为红细胞对照孔，不加病毒液；第12孔为抗原对照，加病毒液。
4)置振荡器上振荡1-2分钟后，放37℃静置20分钟。
5)每孔再加入1.0％红细胞悬浮液25μl，放微量振荡器上振荡1-2分钟混匀，置37℃，15分钟后进行结果判定。
结果判定方法如下：将反应板倾斜45度，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀铺层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能将4单位病毒凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，为该血清的红细胞凝集抑制效价，结果如表2所示。
表2四组SPF鸡血凝抑制试验结果
| 分组 | 试验结果 |
| A组 | 9只SPF鸡HI抗体效价≥6log2 |
| B组 | 10只SPF鸡HI抗体效价≥6log2 |
| C组 | 10只SPF鸡HI抗体效价≥6log2 |
| D组 | 5只SPF鸡HI抗体效价≤1∶4 |
由表2所示的试验结果可以看出，A、B、C组(合成肽苗组)每组免疫鸡至少有9只HI抗体效价≥6log2，而D组(对照组)5只免疫鸡HI抗体效价为阴性。由此说明，合成肽疫苗对SPF鸡具有很好的保护效力。
实施例4：合成肽疫苗的安全试验
本实施例为对本发明所提供的合成肽疫苗进行的安全试验。
1、疫苗与试验动物
三批禽流感合成肽疫苗和空白对照设为四组，具体分组情况见表3。试验动物为4-5周龄SPF鸡40只。
表3疫苗分组情况及所需动物数
| 分组 | 注射疫苗 | 试验动物数(只) |
| A组 | 生理盐水空白对照组 | 10 |
| B组 | SEQ ID NO.1疫苗 | 10 |
| C组 | SEQ ID NO.2疫苗 | 10 |
| D组 | SEQ ID NO.1聚合疫苗 | 10 |
2、合成肽疫苗对4-5周龄SPF鸡的致病性观察
对上述四组SPF鸡分别进行颈部皮下注射，剂量为2ml，观察14日。
3、试验结果如表4所示。
表4安全性试验结果
| 试验组 | 注射疫苗 | 判定结果 |
| A组 | 空白对照 | 无局部或全身不良反应，健活 |
| B组 | SEQ ID NO.1疫苗 | 无局部或全身不良反应，健活 |
| C组 | SEQ ID NO.2疫苗 | 无局部或全身不良反应，健活 |
| D组 | SEQ ID NO.1聚合疫苗 | 无局部或全身不良反应，健活 |
在14日的观察期内，试验鸡全部健活，无局部或全身不良反应，表明三批合成肽疫苗与空白对照组一样，对SPF鸡是安全的。
序列表
<110>中牧实业股份有限公司
<120>禽流感合成肽疫苗及其制备方法
<130>DIC09110112
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>34
<212>PRT
<213>AIV抗原
<400>1
Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Ser Thr Val Lys Met Ser Leu Leu Thr Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Cys Arg Cys Ser Asp Ser
20 25 30
Ser Asp
<210>2
<211>34
<212>PRT
<213>AIV抗原
<400>2
Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Met Ser Leu Leu Thr Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Cys Arg Cys Ser Asp Ser
20 25 30
Ser Asp
Claims (8)
1.一种用于禽流感合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.一种用于禽流感合成肽疫苗的多肽聚合物，其含有权利要求1所述SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，所述多肽聚合物的氨基酸序列如(SEQ IDNO.1)2-K-εK-CONH2所示，其中K代表赖氨酸，ε代表在ε氨基有Fmoc保护的赖氨酸。
3.一种禽流感合成肽疫苗，其中包含权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的多肽聚合物。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含佐剂。
5.一种根据权利要求1中所述的多肽的制备方法，其中包括以下步骤：
(1)去保护反应：在体积百分比为15％-30％的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，脱除树脂氨基上的9-芴甲氧羰基保护基团，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤；
(2)氨基酸的活化：将合成用的带有9-芴甲氧羰基保护基团的各个氨基酸与1-羟基苯丙三唑反应合成氨基酸-1-羟基苯丙三唑酯；
(3)缩合反应：使用多肽合成仪将步骤(2)中获得的活化的氨基酸和步骤(1)中获得的去保护反应后的树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂；
(4)乙酰化反应：使用重量体积百分比为1.5％-4％的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-28℃条件下反应20-40分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；
(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复步骤(1)-(4)，反应完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽树脂；
(6)多肽与树脂的分离：向干燥的多肽树脂中加入裂解试剂，所述裂解试剂的组分体积比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶乙二硫醇∶苯酚∶水＝85∶8∶3∶3∶1；匀速搅拌1-4小时后置于0℃下反应10分钟，恢复至室温，挥去三氟乙酸，将叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，搅拌洗涤，过滤得多肽溶液；
(7)超滤纯化多肽及无菌处理：使用膜包在20-28℃条件下超滤多肽，使用0.22微米在线滤器除菌保存。
6.一种根据权利要求3或4所述的疫苗的制备方法，其中包括以下步骤：
(1)用注射用水将多肽或其多肽聚合物稀释至50μg/ml制得多肽或其多肽聚合物溶液；
(2)在20-28℃条件下，按照多肽或其多肽聚合物溶液∶佐剂＝1∶1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，90-150转/分钟慢速搅拌1.5-3分钟；
(3)缓慢加入多肽或其多肽聚合物溶液，搅拌20-30分钟；
(4)高速搅拌15-30分钟后静置5分钟，分装后即得，所述高速搅拌为8000-10000转/分钟。
7.根据权利要求1中所述的多肽或权利要求2所述的多肽聚合物在制备预防和/或治疗H9亚型禽流感的药物中的用途。
8.根据权利要求3或4所述的疫苗在制备预防和/或治疗H9亚型禽流感的药物中的用途。
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|---|---|---|---|---|
| CN109206492B (zh) * | 2018-09-10 | 2021-02-09 | 中牧实业股份有限公司 | 一种禽流感合成肽疫苗及其制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1261564C (zh) * | 2003-12-02 | 2006-06-28 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 人工重组的流感病毒及其应用 |
| CN1263848C (zh) * | 2003-12-02 | 2006-07-12 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 人工重组的h9n2亚型流感病毒及其应用 |
-
2009
- 2009-08-21 CN CN2009100914632A patent/CN101628932B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1261564C (zh) * | 2003-12-02 | 2006-06-28 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 人工重组的流感病毒及其应用 |
| CN1263848C (zh) * | 2003-12-02 | 2006-07-12 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 人工重组的h9n2亚型流感病毒及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Nikolai V.K., et al..Structural Differences among Hemagglutinins of Influenza A Virus Subtypes Are Reflected in Their Antigenic Architecture: Analysis of H9 Escape Mutants.《Journal of Virology》.2004,第78卷(第1期),240-249. * |
| 杨雪梅 等.禽流感新型疫苗的研究进展.《畜牧与兽医》.2008,第40卷(第4期),91-94. * |
| 莫娟 等.抗禽流感病毒药物和疫苗的研究进展.《中国畜牧兽医》.2008,第35卷(第9期),91－93. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107827958A (zh) * | 2017-11-11 | 2018-03-23 | 中牧实业股份有限公司 | 犬细小病毒合成肽疫苗及其制备方法和应用 |
| CN107827958B (zh) * | 2017-11-11 | 2020-08-25 | 中牧实业股份有限公司 | 犬细小病毒合成肽疫苗及其制备方法和应用 |
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