CN102257135B - 流感疫苗的生产 - Google Patents

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Abstract

总的来说，本发明涉及用于生产改进的抗流感病毒疫苗的材料和方法，其中疫苗包含重排病毒，所述重排病毒具有来自于相同甲型流感病毒亚型或乙型流感病毒株的血凝素基因和神经氨酸酶基因以及来自于不同甲型流感病毒亚型或乙型流感病毒株的内部基因。在一种情况下，HA和NA基因以及内部基因来自于高致病性甲型流感H5N1毒株。

Description

流感疫苗的生产
本申请要求2008年12月16日提交的美国临时专利申请No.61/122,961的优先权益，所述临时专利申请在此引为参考。
发明领域
总的来说，本发明涉及用于生产对抗流感病毒的改进疫苗的材料和方法。本发明提供了表达来自于单一病毒株例如甲型流感病毒H5N1毒株的血凝素和神经氨酸酶、并且还具有来自于流感病毒株的所有内部基因的重排病毒(reassortant virus)。设想了对血凝素基因进行突变，使其与野生型毒株中的血凝素基因相比表现出降低的致病力。
发明背景
高效的疫苗生产需要从宿主系统以高产量产生大量病毒的生长。不同类型的病毒需要不同生长条件以获得可接受的产量。因此，在其中生长病毒的宿主是极为重要的。取决于病毒类型，病毒可以生长在原代组织培养细胞、已建立的细胞系或含胚卵例如来自鸡的含胚卵中。
某些用作病毒宿主系统的哺乳动物细胞系以高产量生产病毒，但是这些细胞的致瘤性质引起法规上限制它们用于疫苗生产。事实上，世界卫生组织(WHO)的适用准则表明，只有几种细胞系被允许用于病毒疫苗生产。
存在三种一般类型的流感病毒——甲型、乙型和丙型，由它们的内部蛋白之间缺乏血清学交叉反应性所定义。甲型流感病毒根据其糖蛋白——血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白的抗原性差异进一步分成亚型。人类对每种甲型、乙型和丙型流感病毒的感染所引起的疾病易感。
当前，人类中流感感染的最重要病因可归因于乙型流感以及甲型流感的H1N1和H3N2亚型。因此，乙型流感以及甲型流感的H1N1和H3N2亚型的抗原通常被掺入到目前的季节性流感疫苗中。当前可用的疫苗具有75-90％的保护率。然而，可能引起大流行的感染的流感毒株是例如H5N1亚型的毒株，其不受典型流感疫苗的防范。H2、H7和H9亚型也具有大流行的潜力。参见例如Koopmans等，Lancet 363：587-93，2004；Joseph等，Md Med.6：30-2，2005；Cameron等，virology 278：36-41，2000；以及Huber等，Pediatri Infect Dis 27(10Suppl)：S113-17，2008。
最近，活的减毒流感病毒疫苗已在美国批准使用。许多当前的疫苗用于季节性流感感染，并含有甲型流感的两种组分H1N1和H3N2以及乙型流感的组分。在过去几年中，由于流感蛋白的抗原性漂移和突变，至少一种组分每年发生变化。从受感染的患者获取人类流感病毒的临床分离株，并使用实验室改造的高生长供体病毒主毒株A/PuertoRico/8/34(H1N1)流感毒株在鸡胚卵中进行重排(美国专利7,037,707)。重排的目的是通过将来自原代临床分离株的至少HA或NA基因与主毒株供体病毒的6个内部基因进行重组，来实现候选疫苗毒株产量的增加。这种策略提供了具有与临床分离株类似的抗原决定簇的高生长重排体(Wood，J.M.和Williams，M.S.，《流感教科书》(Textbook of Influenza)，BlackwellScience Ltd，Oxford，1998；Robertson等，Biologicals，20：213，1992)。通过将这种重排的病毒株在含胚卵中生长，然后通过化学手段将纯化的病毒失活，来制备疫苗。
高致病性禽流感病毒能够在鸟类中引起严重呼吸系统疾病和死亡。该特点已知只属于H5和H7亚型的HA。因为某些禽类病毒传播给人类的能力，它们也变成了人类健康隐患。禽流感病毒的致病性具有多基因性质，但是已经显示HA蛋白在感染中发挥主要作用。病毒感染性的先决条件是将HA蛋白前体(HAO)切割成HA1和HA2亚基。这种切割释放出负责病毒与内体膜的融合的肽。低致病性病毒表达的表面HA分子只被呼吸或胃肠道细胞分泌的胰蛋白酶样蛋白酶所活化(Perdue等，Virus Res 49：173-86，1997)。高致病性病毒的切割位点发生改变的方式是使其能够被不同细胞的蛋白酶切开，特别是被绝大多数细胞中存在的遍在性弗林蛋白酶切开(Steinhauer D.，Virology 258：1-20，1999；Swayne D.，Vet Pathol34，557-67，1997)。所有高致病性毒株总是在切割位点处含有多个碱性残基(例如R和K)(Perdue等，同上)。因此，病毒能够在几乎任何器官中快速扩散和复制，并引起全身性感染。
已经通过反向遗传学生产了减毒的H5N1重排病毒(RG，Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)93：11354-58，1996)，其中使用了来自H5N1毒株的HA和NA基因，并将这些基因插入到包含来自于致病性较低的病毒的其余内部流感病毒基因的“骨架”病毒中。常用的骨架源自于H1N1亚型的原型毒株A/Puerto Rico/8/34(A/PR/8/34)，其高度适应于在卵中生长，并且只有两种表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)源自于H5N1病毒。这些重排病毒被设计用于在卵中生产疫苗，但是本技术领域中已知的现有反向遗传学重排体在卵中和细胞培养物中生长不良。例如，Suguitan等(PLoS Medicine 3：1541-54，2006)描述了使用冷适应Ann Arbor(ca AA)骨架产生了具有来自H5N1毒株A/Hong Kong/213和A/Vietnam/1203/2004的HA和NA基因的病毒。这些病毒被证实在体内减毒，即在鸡中不致死，并且在用野生型H5N1病毒重新激惹的小鼠中还表现出一定的保护效应。Shengqiang等(J Infectious Dis 179：1132-8，1999)也使用大流行的香港(Hong Kong)毒株的HA和NA基因和Ann Arbor毒株的内部基因产生了重组病毒。然而，这些病毒在卵中的生长未达到最好。
同样，Ming等，Chin.J.Biotech.(2006)22：720-726特别描述了包含来自H9N2病毒株的内部基因以及来自H5N1毒株的修饰的HA基因和来自H2N3的NA基因的重排病毒。Shi等，Vaccine(2007)25：7379-7384特别描述了具有来自于H9N2毒株的内部基因和来自于H5N1毒株的修饰的HA和野生型NA基因的重排病毒。Hickman等(J.Gen.Virol.89：2682-2690，2008)特别描述了包含用来自于H1N1、H5N1和H7N2毒株的HA和/或NA基因援救的来自于H9N2毒株的骨架基因的疫苗。
最近的研究尝试了产生在哺乳动物细胞培养物中生长的疫苗，以避免在卵中生长病毒时所通常观察到的问题，例如保持和维护卵设施的成本、从卵蛋白纯化病毒以及对残留卵蛋白的过敏。其中美国专利6,146,873和7,132,271讨论了能够生产疫苗级病毒的培养细胞系的开发。也参见Kistner等(Vaccine 16：960-8，1998)，其公开了适合于提高病毒生长的VERO细胞并描述了疫苗生产，以及Ehrlich等(New Eng J Med 35：2573-84，2008)，其特别描述了用甲醛溶液失活的在Vero细胞中生长的H5N1完整病毒疫苗。
因此，在本技术领域中仍需要生产与现有疫苗相比抗原性增加的大流行或季节性流感疫苗，其能够在宿主中引发良好的免疫应答，不引起感染，并在哺乳动物细胞培养物中表现出强健的生长。
发明概述
本发明提供了针对流感病毒的改进疫苗的生产，其中疫苗包含重排病毒，所述重排病毒具有来自于相同的病毒性甲型流感亚型或乙型流感毒株的血凝素基因和神经氨酸酶基因以及来自于不同甲型流感亚型或乙型流感毒株的内部基因。在一种情况下，HA和NA基因以及内部基因源自于甲型流感的高致病性H5N1毒株。
一方面，本发明提供了重排流感病毒，其包含：来自于第一种甲型流感病毒亚型的内部基因区段(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)以及来自于内部基因所来源的流感病毒亚型的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，内部基因源自于甲型流感亚型的第一种毒株，HA和NA基因源自于甲型流感亚型的第二种毒株。此外，设想了NS基因包含NS1、NS2、或NS1和NS2基因。
在一个实施方案中，本发明设想了纯化的重排流感病毒，其包含甲型流感H5N1毒株的内部基因区段(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)以及来自于甲型流感病毒H5N1的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，HA和NA基因源自于相同病毒株。在相关实施方案中，HA和NA基因来自于第一个H5N1进化枝(clade)，内部基因来自于第二个H5N1进化枝。在另一个实施方案中，HA和NA基因以及内部基因源于同一个进化枝。此外还设想了NS基因包含NS1、NS2、或NS1和NS2基因。
在另一个实施方案中，本发明设想了重排流感病毒，其包含来自于第一种乙型流感病毒株的内部基因区段PB1、PB2、PA、M、NP和NS以及来自于第二种乙型流感毒株的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，其中病毒的特征为在哺乳动物细胞培养物中繁殖的能力。
在又一个实施方案中，重排病毒的HA基因被修饰以产生减毒病毒。在一个实施方案中，HA基因在多碱性氨基酸切割位点(polybasic cleavage site)处被修饰。在另一个实施方案中，HA基因中多碱性氨基酸切割位点处的修饰是RERRRKKR(SEQ ID NO：13)→TETR(SEQ ID NO：14)的突变。
在另一个实施方案中，病毒的特征是在哺乳动物细胞培养物中繁殖的能力。在又一个实施方案中，哺乳动物细胞选自MRC-5、MRC-9、Lederle 130、张氏(Chang)肝细胞和WI-38；U937、Vero、CV-1、IMR-90和IMR-91、MDCK、MDBK、HEK、H9、CEM和CD4表达型HUT78、PerC6、BHK-21细胞、BSC和LLC-MK2。在相关实施方案中，哺乳动物细胞培养物是Vero细胞培养物。
在某些实施方案中，甲型流感亚型包含H1至H16与N1至N9的任何组合，包括H1N1、H2N1、H3N1、H4N1、H5N1、H6N1、H7N1、H8N1、H9N1、H10N1、H11N1、H12N1、H13N1、H14N1、H15N1、H16N1；H1N2、H2N2、H3N2、H4N2、H5N2、H6N2、H7N2、H8N2、H9N2、H10N2、H11N2、H12N2、H13N2、H14N2、H15N2、H16N2；H1N3、H2N3、H3N3、H4N3、H5N3、H6N3、H7N3、H8N3、H9N3、H10N3、H11N3、H12N3、H13N3、H14N3、H15N3、H16N3；H1N4、H2N4、H3N4、H4N4、H5N4、H6N4、H7N4、H8N4、H9N4、H10N4、H11N4、H12N4、H13N4、H14N4、H15N4、H16N4；H1N5、H2N5、H3N5、H4N5、H5N5、H6N5、H7N5、H8N5、H9N5、H10N5、H11N5、H12N5、H13N5、H14N5、H15N5、H16N5；H1N6、H2N6、H3N6、H4N6、H5N6、H6N6、H7N6、H8N6、H9N6、H10N6、H11N6、H12N6、H13N6、H14N6、H15N6、H16N6；H1N7、H2N7、H3N7、H4N7、H5N7、H6N7、H7N7、H8N7、H9N7、H10N7、H11N7、H12N7、H13N7、H14N7、H15N7、H16N7；H1N8、H2N8、H3N8、H4N8、H5N8、H6N8、H7N8、H8N8、H9N8、H10N8、H11N8、H12N8、H13N8、H14N8、H15N8、H16N8；H1N9、H2N9、H3N9、H4N9、H5N9、H6N9、H7N9、H8N9、H9N9、H10N9、H11N9、H12N9、H13N9、H14N9、H15N9和H16N9。在某些实施方案中，甲型流感亚型是H5N1。
在一个实施方案中，重排病毒的内部基因源自于本技术领域已知并在下面的详细说明书中进一步详细描述的H5N1病毒。在相关实施方案中，所述内部基因源自于选自下列的H5N1毒株：A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/HongKong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005、A/Anhui/1/05和A/Cambodia/R0405050/2007、A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04、A/chicken/Vietnam/C58/04、A/quail/Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-样、Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/Salatiga/BBVet-I/05和Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/Vietnam/453/2004、A/duck/Singapore/3/97、A/HK/156/97和A/Hong Kong/156/1996。在具体实施方案中，内部基因来自于A/Vietnam/1203/2004。
在另一个实施方案中，重排病毒的HA和NA基因源自于本技术领域已知并在下面进一步详细描述的H5N1病毒。在又一个实施方案中，所述HA和NA基因源自于选自下列的H5N1毒株：A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005、A/Anhui/1/05和A/Cambodia/R0405050/2007、A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04、A/chicken/Vietnam/C58/04、A/quail/Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-样、Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/Salatiga/BBVet-I/05和Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/Vietnam/453/2004、A/duck/Singapore/3/97、A/HK/156/97和A/Hong Kong/156/1996。
在某些实施方案中，内部基因与HA和NA基因源自于相同病毒株。在其他实施方案中，内部基因与HA和NA基因源自于不同病毒株。
在实施方案中，HA和NA基因来自于H5N1毒株A/Vietnam/1203/2004。在另一个实施方案中，HA和NA基因来自于H5N1毒株A/Indonesia/5/05。
另一方面，本发明提供了抗原性重排流感病毒组合物，其包含：来自于第一种甲型流感病毒亚型的内部基因区段(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)以及来自于内部基因所来源的流感病毒亚型的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，内部基因源自于甲型流感亚型的第一种毒株，HA和NA基因源自于甲型流感亚型的第二种毒株。还设想了NS基因包含NS1、NS2、或NS1和NS2基因。
在一个实施方案中，抗原性重排甲型流感病毒组合物包含源自于甲型流感H5N1毒株的内部基因区段(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)以及源自于甲型流感病毒H5N1的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，HA和NA基因源自于相同病毒株。还设想了NS基因包含NS1、NS2、或NS1和NS2基因。
在又一个实施方案中，本发明提供了抗原性重排流感病毒组合物，其包含来自于第一种乙型流感病毒株的内部基因区段PB1、PB2、PA、NP、M和NS以及来自于第二种乙型流感毒株的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，其中病毒的特征是在哺乳动物细胞培养物中繁殖的能力。
在一个实施方案中，组合物的HA基因被修饰以产生减毒的病毒。在相关实施方案中，HA基因在多碱性氨基酸切割位点处被修饰。
在又一个实施方案中，流感病毒的特征是在哺乳动物细胞培养物中繁殖的能力。
在一个实施方案中，抗原性组合物的内部基因源自于本技术领域已知并在下面进一步详细描述的H5N1病毒。在相关实施方案中，所述内部基因源自于选自下列的H5N1毒株：A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04、A/chicken/Vietnam/C58/04、A/quail/Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96样、Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/Salatiga/BBVet-I/05和Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/Vietnam/453/2004、A/duck/Singapore/3/97、A/HK/156/97和A/Hong Kong/156/1996。在具体实施方案中，内部基因来自于A/Vietnam/1203/2004。
在另一个实施方案中，抗原性组合物的HA和NA基因源自于本技术领域已知并在下面进一步详细描述的H5N1病毒。在又一个实施方案中，所述HA和NA基因源自于选自下列的H5N1毒株：A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005、A/Anhui/1/05和A/Cambodia/R0405050/2007、A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04、A/chicken/Vietnam/C58/04、A/quail/Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96样、Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/Salatiga/BBVet-I/05和Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/Vietnam/453/2004、A/duck/Singapore/3/97、A/HK/156/97和A/Hong Kong/156/1996。
在某些实施方案中，抗原性组合物的内部基因与HA和NA基因源自于相同病毒株。在其他实施方案中，内部基因与HA和NA基因源自于不同病毒株。
在实施方案中，抗原性组合物的HA和NA基因来自于H5N1毒株A/Vietnam/1203/2004。在另一个实施方案中，HA和NA基因来自于H5N1毒株A/Indonesia/5/05。
在又一个实施方案中，HA基因中多碱性氨基酸切割位点处的修饰是RERRRKKR(SEQID NO：13)→TETR(SEQ ID NO：14)的突变。
在另一个实施方案中，抗原性组合物还包含可药用载体。
一方面，本发明设想了包含重排流感病毒的疫苗，所述病毒包含：i)编码表面蛋白HA的多核苷酸和编码表面蛋白NA的多核苷酸，HA和NA每个都源自于甲型流感病毒亚型的第一种毒株；编码PB1的多核苷酸，编码PA的多核苷酸，编码PB2的多核苷酸，编码M的多核苷酸，编码NS(NS1和/或NS2)的多核苷酸，编码NP的多核苷酸，PB1、PB2、PA、NP、M和NS的多核苷酸源自于甲型流感病毒亚型的第二种毒株，其中所述多核苷酸可操作地连接，以允许重排的多核苷酸包装在病毒粒子中。
在相关实施方案中，本发明提供了包含重排甲型流感病毒的疫苗，所述病毒包含：编码表面蛋白HA的多核苷酸和编码表面蛋白NA的多核苷酸，HA和NA每个都源自于流感病毒H5N1；编码PB1的多核苷酸，编码PA的多核苷酸，编码PB2的多核苷酸，编码M的多核苷酸，编码NS1(NS1和/或NS2)的多核苷酸，编码NP的多核苷酸，PB1、PA、PB2、M、NP和NS的多核苷酸源自于流感病毒H5N1，多核苷酸可操作地连接，以允许重排的多核苷酸包装在病毒粒子中。
在相关实施方案中，本发明设想了包含重排流感病毒的疫苗，所述病毒包含：编码表面蛋白HA的多核苷酸和编码表面蛋白NA的多核苷酸，HA和NA每个都源自于乙型流感病毒的第一种毒株；编码PB1的多核苷酸，编码PA的多核苷酸，编码PB2的多核苷酸，编码M的多核苷酸，编码NP的多核苷酸，编码NS的多核苷酸，PB1、PA、PB2、M、NP和NS的多核苷酸源自于乙型流感病毒的第二种毒株，其中多核苷酸可操作地连接，以允许重排的多核苷酸包装在病毒粒子中，并且其中病毒的特征是在哺乳动物细胞培养物中繁殖的能力。
在一个实施方案中，组合物的HA基因被修饰以产生减毒病毒。在相关实施方案中，HA基因在多碱性氨基酸切割位点处被修饰。
在一个实施方案中，疫苗中的内部基因源自于本技术领域中已知并在下面进一步详细描述的H5N1病毒。在相关实施方案中，所述内部基因源自于H5N1毒株A/Vietnam/1203/2004。
在另一个实施方案中，疫苗中的HA和NA基因源自于本技术领域中已知并在下面进一步详细描述的H5N1病毒。在又一个实施方案中，所述HA和NA基因源自于选自下列的H5N1毒株：A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005、A/Anhui/1/05和A/Cambodia/R0405050/2007、A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04、A/chicken/Vietnam/C58/04、A/quail/Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96样、Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/Salatiga/BBVet-I/05和Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/Vietnam/453/2004、A/duck/Singapore/3/97、A/HK/156/97和A/Hong Kong/156/1996。
在某些实施方案中，疫苗中的内部基因与HA和NA基因源自于相同病毒株。在其他实施方案中，内部基因与HA和NA基因源自于不同病毒株。
在一个实施方案中，疫苗中的HA和NA基因来自于H5N1毒株A/Vietnam/1203/2004。在另一个实施方案中，HA和NA基因来自于H5N1毒株A/Indonesia/5/05。
在又一个实施方案中，HA基因中多碱性氨基酸切割位点处的修饰是RERRRKKR(SEQID NO：13)→TETR(SEQ ID NO：14)的突变。
在另一个实施方案中，疫苗还包含佐剂。示例性佐剂包括但不限于皂角苷、非离子型去污剂、植物油、无机凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢诺尼克(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽类、油或烃类乳液、匙孔血蓝蛋白以及潜在有用的人类佐剂例如N-乙酰-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-s-n-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺、BCG(卡介苗)、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、ISCOM、纳米珠、鲨烯和嵌段共聚物，它们被设想单独或组合使用。
在又一个实施方案中，疫苗是失活的疫苗。设想了使用本技术领域已知的方法和试剂进行灭活，包括但不限于甲醛、UV辐射、戊二醛、二元乙烯亚胺(BEI)和β-丙内酯。还设想了疫苗作为活的减毒病毒疫苗给药。
在一个实施方案中，疫苗包含的HA含量为1μg至75μg HA。在另一个实施方案中，疫苗包含的HA含量为每份疫苗1μg至30μg。在相关实施方案中，给药的疫苗剂量为1μg、3μg、5μg、7.5μg、10μg、12.5μg、15μg、20μg、25μg、30μg HA，或者根据需要是直至100μg HA的任何量。因此，单次疫苗剂量包括具有约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约11μg、约12μg、约13μg、约14μg、约15μg、约16μg、约17μg、约18μg、约19μg、约20μg、约21μg、约22μg、约23μg、约24μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约55μg、约60μg、约65μg、约70μg、约75μg、约80μg、约85μg、约90μg、约95μg、约100μg和超过100μg血凝素的剂量，其以相同或不同的血凝素量在单剂或多剂中提供。
另一方面，本发明提供了用于在对象中引发针对至少一种大流行的流感病毒株的免疫应答的方法，所述方法包含给药本文中所述的病毒、抗原性组合物或疫苗，其量能够有效保护对象抵抗至少一种H5N1流感病毒株的感染。在相关方面，本发明设想了用于在对象中引发针对至少一种季节性流感病毒株的免疫应答的方法，所述方法包含给药本文中所述的病毒、抗原性组合物或疫苗，其量能够有效保护对象抵抗至少一种甲型流感病毒和/或乙型流感病毒株的感染。
另一方面，本发明设想了防止对象被H5N1流感病毒感染的方法，所述方法包含向对象给药有效量的本文中所述的病毒、抗原性组合物或疫苗。另一方面，本发明设想了用于防止对象被甲型流感病毒或乙型流感病毒感染的方法，所述方法包含向对象给药有效量的本文中所述的病毒、抗原性组合物或疫苗。
在一个实施方案中，可用于本发明的方法的疫苗包含的HA含量为1μg至75μg HA。在另一个实施方案中，疫苗包含的HA含量为每剂疫苗1μg至30μg。在相关实施方案中，给药的疫苗剂量为1μg、3μg、5μg、7.5μg、10μg、12.5μg、15μg、20μg、25μg、30μg HA，或者根据需要是直至100μg HA的任何量。因此，单次疫苗剂量包括具有约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约11μg、约12μg、约13μg、约14μg、约15μg、约16μg、约17μg、约18μg、约19μg、约20μg、约21μg、约22μg、约23μg、约24μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约55μg、约60μg、约65μg、约70μg、约75μg、约80μg、约85μg、约90μg、约95μg、约100μg和超过100μg血凝素的剂量，其提供在单剂或相同或不同血凝素量的多剂中。
另一方面，本发明提供了制造包含重排流感病毒的疫苗的方法，所述重排流感病毒包含甲型流感H5N1毒株的内部基因区段(PB1、PB2、PA、M、NP和NS)以及来自于甲型流感病毒H5N1的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，HA和NA基因源自于同一病毒株并且HA基因在多碱性氨基酸切割位点处被修饰以产生减毒的HA基因，所述方法包含将病毒在适合于重排病毒生长的条件下转染到哺乳动物细胞中。在相关实施方案中，本文描述的制造疫苗的方法可用于制造包含甲型或乙型流感的季节性流感毒株的疫苗。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞选自MRC-5、MRC-9、Lederle 130、张氏肝细胞和WI-38；U937、Vero、CV-1、IMR-90和IMR-91、MDCK、MDBK、HEK、H9、CEM和CD4表达型HUT78、PerC6、BHK-21细胞、BSC和LLC-MK2。在相关实施方案中，哺乳动物细胞是Vero细胞。
在某些实施方案中还设想了以上描述的病毒和组合物缺乏流感的所有6个内部基因。在一个实施方案中，重排病毒包含2、3、4或5个流感病毒的内部基因。例如，在一个实施方案中，重排病毒和/或其组合物和/或疫苗缺乏所有或部分NS1基因。
在另一个方面，设想了使用任何甲型和乙型流感病毒株来执行本发明。在一个实施方案中，重排病毒可以具有来自甲型流感的8个流感基因的任何组合。在相关实施方案中，重排病毒可以具有来自乙型流感病毒的8个流感基因的任何组合。
本发明排除了以前公开的或例如使用骨架如A/Puerto Rico/8/34(H1N1)、A/AnnArbor/6/60(H2N2)、A/Leningrad/134/17/57(H2N2)和B/Ann Arbor/1/66生产的、具有来自于第一种亚型的一种毒株的内部基因和来自于同一亚型的不同毒株的HA和NA基因的任何病毒(甲型流感和乙型流感)，这些病毒公开在本文引用的任何现有出版物中，包括但不限于：美国专利4,552,758、7,037,707、7,601,356、7,566,458、7,527,800、7,510,719、7,504,109、7,465,456和7,459,162；美国专利公布20090297554、20090246225、20090208527、20090175909、20090175908、20090175907、20090136530、20080069821、20080057081、20060252132、20060153872、20060110406、20050158342、20050042229和20070172929；国际专利公布Nos.WO 2008/157583、WO 2008/021959、WO 2007/048089、WO 2006/098901、WO2006/063053、WO 2006/041819、WO 2005/116260、WO 2005/116258、WO 2005/115448、WO2005/062820、WO 2003/091401、以及在其中鉴定到的可用于FLUMISTTM疫苗的病毒，其可以在重组病毒中包含来自一种甲型流感亚型毒株的内部基因和同一亚型的不同毒株的HA和NA基因。所有这些文献在此以其全文引为参考。
在实施方案中，本发明还排除了包含流感亚型的第一种毒株的骨架以及来自同一流感亚型的第二种毒株的HA和NA基因的天然存在的重排病毒。当在本文中使用时，术语“天然存在的重排病毒”是指在自然环境例如病毒宿主中没有外部源的干预下重组的重排病毒。
在又一个实施方案中，本发明排除了具有来自于作为骨架的第一种甲型或乙型流感亚型例如突变的A/Puerto Rico/8/34(H1N1)、A/Ann Arbor/6/60(H2N2)或B/Ann Arbor/1/66的一个或多个修饰过的内部基因、以及来自于相同流感病毒株的HA和NA基因的重排病毒，例如在美国专利公布No.20070172929中所示例的。然而，本发明设想了将包含流感亚型的骨架毒株的修饰过的内部基因以及来自同一亚型但是不同毒株的HA和NA基因的病毒，包括在本发明的范围内。
在另一个实施方案中，本发明排除了使用冷适应病毒例如A/Ann Arbor/6/60(H2N2)、A/Leningrad/134/17/57(H2N2)、B/Ann Arbor/1/66以及本技术领域中已知的其他冷适应病毒作为骨架/供体毒株所产生的重排病毒，其中内部骨架基因来自于第一种亚型，HA和NA基因来自于同一亚型的不同毒株。
附图简述
图1显示了使用源自于A/Hong Kong/213/03的非编码区修饰的A/Vietnam/1203/04(H5N1)的HA切割位点核苷酸序列和其他内部基因序列。源自于A/Hong Kong的序列用下划线标出。
图2显示了使用源自于A/Hong Kong/213/03的非编码区修饰的A/Indonesia/5/05(H5N1)的HA切割位点核苷酸序列和其他内部基因序列。源自于A/Hong Kong的序列用下划线标出。
图3显示了使用源自于A/Hong Kong/213/03的非编码区修饰的A/Turkey/Turkey/1/05(H5N1)的HA切割位点核苷酸序列和其他内部基因序列。源自于A/Hong Kong的序列用下划线标出。
图4显示了使用源自于A/Hong Kong/213/03的非编码区修饰的A/Anhui/1/05(H5N1)的HA切割位点核苷酸序列和其他内部基因序列。源自于A/Hong Kong的序列用下划线标出
详细说明书
本发明提供了包含重排病毒的改进的疫苗，所述重排病毒具有源自于各种流感毒株的病毒结构蛋白——血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)以及病毒内部基因[PB1、PB2、PA、NS(NS1、NS2)、M1、M2和NP]。本发明的疫苗是其中病毒内部基因源自于特定流感毒株，并且HA和NA基因源自于相同毒株的疫苗，但是内部基因所来源的毒株是甲型流感亚型或乙型流感毒株，其不同于HA和NA基因所来源的甲型流感亚型或乙型流感毒株。一种情况下，HA和NA基因源自于相同甲型流感亚型，而在另一种情况下，HA和NA基因源自于不同甲型流感亚型。尽管本发明通篇具体参考H5N1疫苗和抗原性组合物作为示例，但应该理解，按照描述所构建的任何流感毒株都被本发明所涵盖。本发明的疫苗包括针对甲型和乙型流感毒株的疫苗。甲型流感毒株包括16种HA亚型和9种NA亚型。重排病毒能够在细胞培养物中有效生长，这是超越于含胚卵中生长的传统方法的改进生产方法。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通专业人员所通常理解的相同的含义。下面的参考文献为专业人员提供了本发明中使用的许多术语的通用定义：Singleton等，《微生物和分子生物学词典》(DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)(第二版，1994)；《剑桥科学技术词典》(THECAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY)(Walker主编，1988)；《遗传学词汇》(THE GLOSSARY OF GENETICS)第五版，R.Rieger等主编，Springer Verlag(1991)；以及Hale和Marham，《HARPER COLLINS生物学词典》(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY)(1991)。
在本文中引用的每个出版物、专利申请、专利和其他参考文献，在与本公开内容没有冲突的程度上以其全文引为参考。
这里指出，当在本说明书和所附的权利要求书中使用时，没有具体数量的指称包括其复数形式，除非上下文明确指明不是如此。
当在本文中使用时，下列术语具有属于它们的意义，除非明确表明不是如此。
术语“重排病毒”是其中来自于目标病毒株的编码抗原性蛋白(例如血凝素和神经氨酸酶基因)的基因区段与来自不同病毒株的编码病毒聚合酶复合物(PB2、PB1和PA)的基因或其他类似基因(例如非糖蛋白基因，包括M基因和NS基因，以及核蛋白(NP)基因)的基因区段组合的病毒。当在本文中使用时，“毒株”是指给定物种例如甲型或乙型流感物种和甲型流感病毒的亚型的特定病毒变体。例如，病毒A/Vietnam/1203/2004是甲型流感病毒H5N1亚型，毒株名称为A/Vietnam/1203/2004。
术语“源自于”是指与野生型或天然存在的多核苷酸或多肽序列相比发生改变或突变的多核苷酸或多肽序列的全部或部分，其中源自于野生型序列的多核苷酸或多肽在一个或多个碱基或氨基酸中发生改变，使其不再具有与野生型序列相同的序列。
当在本文中使用时，术语“亚型”是指甲型流感毒株中的不同病毒可以根据病毒株中表达的HA和NA基因分类成亚型。甲型流感亚型的命名是根据HA亚型，例如亚型是本技术领域已知的16种不同HA基因中的任一种，以及NA亚型，例如本技术领域已知的9种不同NA基因的任一种。示例性亚型包括但不限于H5N1、H1N1、H3N2和本技术领域中已知的许多其他亚型。
当在本文中使用时，术语“进化枝”是指现有的甲型流感病毒H5N1的不同分类。H5N1进化枝中的病毒是遗传相关的，但是不共有完全相同的病毒基因组。在本技术领域中指明了至少7种不同的H5N1亚型进化枝，例如进化枝1、进化枝2、进化枝3、进化枝4、进化枝5、进化枝6和进化枝7。进化枝2被进一步分成亚进化枝。
术语“抗原性组合物”是指包含在宿主或对象中刺激免疫系统并引发免疫应答的物质的组合物。术语“引发免疫应答”是指在体内对刺激物例如抗原做出响应刺激免疫细胞。免疫应答由细胞免疫应答例如T细胞和巨噬细胞刺激、和体液免疫应答例如B细胞和补体刺激和抗体产生两者构成。细胞和体液免疫应答不相互排斥，并且设想了其一种或两种被本文描述的抗原性组合物、病毒或疫苗刺激。免疫应答可以使用本技术领域公知的技术来测量，所述技术包括但不限于抗体免疫测定法、增殖测定法和详细说明书中更详细描述的其他技术。
术语“减毒的”用于描述显示出毒力降低(与野生型病毒相比)的病毒或抗原性组合物。修饰的HA是从野生型HA发生改变的HA基因，其编码的蛋白被切开的程度比野生型HA蛋白低，引起病毒生长降低。减毒病毒典型但并不总是通过鼻内给药。设想了通过本文描述的任何途径进行减毒病毒的给药。
术语“失活的”在本文中用于描述在本技术领域中也称为“被杀死”或“死亡”病毒的病毒。失活的病毒是没有毒力性质的完整病毒，并且从“活的”病毒产生，而不论病毒是否以前以任何方式减毒。失活的病毒典型但并不总是通过肌肉内注射给药。设想了通过本文描述的任何途径进行失活病毒的给药。
当在本文中使用时，术语“疫苗”是指包含本文所述的重排病毒的组合物，其可用于在对象中建立针对病毒的免疫力。设想了疫苗包含可药用载体和/或佐剂。设想了疫苗是预防性或治疗性的。“预防性”治疗是对没有表现出疾病征兆或仅表现出早期征兆的对象施用的、目的在于降低发生疾病的风险的治疗。本发明的化合物可以作为预防治疗提供，以降低发生疾病的可能性或者如果疾病发生，将其严重性降到最低。“治疗性”治疗是对表现出疾病征兆或症状的对象施用的、目的在于减轻或消除那些征兆或症状的治疗。征兆或症状可以是生物化学、细胞、组织学、功能性的，可以是主观的或客观的。
多肽的“片段”是指多肽的小于全长多肽或蛋白表达产物的任何部分。在一种情况下，片段是全长多肽的缺失类似物，其中已经从全长多肽的氨基端和/或羧基端移除一个或多个氨基酸残基。因此，“片段”是下面描述的缺失类似物的亚组。
“模拟物”、“类似物”或“衍生物”可以互换使用，是指与天然存在的分子在结构上基本类似并具有相同生物活性、尽管在某些情况下程度有所不同的化合物，例如肽或多肽。类似物与类似物所来源的天然存在的多肽相比，差异在于其氨基酸序列的组成，这种差异是基于一个或多个突变，所述突变包括(i)删除位于多肽一个或多个末端的一个或多个氨基酸残基、和/或天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域，(ii)在多肽的一个或多个末端插入或添加一个或多个氨基酸(典型为“添加”类似物)，和/或插入或添加天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域(典型为“插入”类似物)，或(iii)将天然存在的多肽序列中的一个或多个氨基酸取代成其他氨基酸。设想了本发明的重排病毒包含病毒基因的类似物，所述基因包括HA、NA、PB1、PB2、PA、M(M1和M2)、NS(NS1和NS2)和NP基因中的任一个或一个以上。
一种情况下，类似物与野生型或天然存在的序列例如肽表现出约70％但低于100％的序列相似性。在一种情况下，这样的类似物或衍生物包含非天然存在的氨基酸残基，包括例如但不限于高精氨酸、鸟氨酸、青霉胺和正缬氨酸，以及天然存在的氨基酸残基。在另一种情况下，这样的类似物或衍生物由一个或多个D-氨基酸残基构成，或在两个或多个氨基酸残基之间含有非肽互连。在一个实施方案中，类似物或衍生物可以是多肽的片段，其中所述片段与野生型多肽在至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸的长度上基本同源(即至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源)。
根据被取代的氨基酸和取代它的氨基酸的物理化学或功能相关性，取代是保守或非保守的。这种类型的取代在本技术领域中是公知的。供选地，本发明也包含了非保守取代。示例性的保守取代描述在Lehninger，[《生物化学》(第二版)(Biochemistry，2ndEdition)；Worth Publishers，Inc.，New York(1975)，pp.71-77]中，并在下面列出。
保守取代
不带电荷-极性：
或者，示例性保守取代直接在下面列出。
保守取代II
当在本文中使用时，术语“分离的”是指病毒或抗原性组合物从其天然环境中取出。因此，分离的生物材料不含某些或所有细胞组分，即天然存在天然材料的细胞组分(例如细胞质或膜组分)。在一种情况下，如果病毒或抗原性组合物存在于细胞提取物或上清液中，其被视为分离的。在核酸分子的情况下，分离的核酸包括PCR产物、分离的mRNA、cDNA或限制性片段。
当在本文中使用时，术语“纯化的”是指病毒或抗原性组合物已经在减少或消除存在的无关材料的条件下分离，所述无关材料即污染物、包括从中获得组合物的内源材料。例如而非限制性的，纯化的病毒粒子基本上不含宿主细胞或培养物组分，包括组织培养物或卵蛋白和非特异性病原体。在各种实施方案中，基本上不含污染物的纯化材料是至少50％纯；至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％纯的。纯度可以通过层析、凝胶电泳、免疫测定法、组成分析、生物测定法和本技术领域已知的其他方法来评估。
术语“药物组合物”是指适合于给药到对象动物、包括人类和哺乳动物的组合物。药物组合物包含药理有效量的本发明的病毒或抗原性组合物，并且也包含可药用载体。药物组合物涵盖了包含活性成分和构成可药用载体的惰性成分的组合物，以及由任两种或多种成分的组合、复合或聚合所直接或间接产生的任何产物。因此，本发明的药物组合物涵盖了通过将本发明的化合物或结合物与可药用载体混合而制成的任何组合物。
术语“可药用载体”包括任何和所有临床有用的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂和赋形剂，例如磷酸盐缓冲的盐水溶液、5％葡萄糖或甘露糖醇水溶液和乳液例如油/水乳液或水/油乳液，以及各种类型的润湿剂和/或佐剂。适合的药物载体和制剂描述在《Remington药物学》第19版中(Remington′s PharmaceuticalSciences，19th Ed.)(Mack Publishing Co.，Easton，1995)。可用于组合物的药物载体取决于活性药剂所打算的给药方式。典型的给药方式包括但不限于肠(例如口服)或肠胃外(例如皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内注射；或局部、透皮或经粘膜给药)。“可药用盐”是能够配制在化合物或结合物中用于药物应用的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)以及氨或有机胺的盐。
术语“可药用”或“药理学可接受”是指在生物学等方面没有不利的材料，即材料可以给药于个体而不引起任何不想要的生物效应，或与包含它的组合物中的任何组分或当使用下面描述的本技术领域公知的途径给药时以有害的方式发生相互作用。
流感基因
流感病毒是分节段的负链RNA病毒，其属于正粘病毒(Orthomyxoviridae)科。甲型流感病毒由9个结构蛋白构成，并另外编码一个具有调控功能的非结构性NS1蛋白。流感病毒分节段基因组含有8个负义RNA(nsRNA)基因区段(PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA和NA)，其编码至少10个多肽，包括RNA指导的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB 1和PA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、血凝素(亚基HA1和HA2)、基质蛋白(M1和M2)以及非结构蛋白(NS1和NS2)(Krug等，《在流感病毒中》(In The Influenza Viruses)，R.M.Krug主编，Plenum Press，N.Y.，1989，pp.89152)。
流感病毒引起广泛传播的疾病的能力是由于其通过经历抗原性变化而避开免疫系统的能力，这种抗原性变化被认为在宿主被动物流感病毒和人类流感病毒两者同时感染时发生的。在宿主中突变和重排期间，病毒可以将来自于另一种病毒的HA和/或NA表面蛋白基因掺入到其基因组中，从而产生新的流感亚型并避开免疫系统。
血凝素
HA是病毒表面糖蛋白，其包含约560个氨基酸，占病毒总蛋白的25％。它在感染的早期阶段负责病毒粒子附着及穿透到宿主细胞中。存在16种已知的HA亚型，其被分类为H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16亚型。
对于病毒感染细胞来说，病毒HA0前体切割成HA1和HA2亚片段是必需的步骤。因此，为了将宿主细胞中的新病毒粒子转变成能够感染新细胞的病毒粒子，需要进行切割。已知切割发生在整合的HA0膜蛋白从被感染细胞的内质网向质膜运输期间。在运输过程中，血凝素经历一系列共翻译和翻译后修饰，包括前体HA通过蛋白水解切割成氨基端片段HA1和羧基端片段HA2。在原代组织培养物或已建立的细胞系中生长流感毒株的一个主要困难，在于宿主细胞中的流感血凝素需要蛋白水解切割活化。
尽管已知未切割的HA能够介导病毒与其细胞表面上含神经氨酸的受体的附着，但它不能进入感染周期的下一步，即融合。已经报道，需要通过切割暴露出HA2的疏水氨基端，以便它能够插入到靶细胞中，从而在病毒与靶细胞膜之间形成桥。在该过程之后，两个膜融合并使病毒进入靶细胞。
HA的蛋白水解活化涉及通过类似胰蛋白酶的内切蛋白酶在精氨酸残基处切割，这种酶通常是钙依赖性的细胞内酶，并具有中性最适pH。因为活化性蛋白酶是细胞的酶，因此被感染细胞的类型决定了HA是否被切割。哺乳动物流感病毒和非致病性禽流感病毒的HA只对有限数量细胞类型中的蛋白水解切割敏感。另一方面，H5和H7亚型中致病性禽病毒的HA被广泛的不同宿主细胞中存在的蛋白酶切割。因此，存在着由于与病毒致病性相关的血凝素可切割性差异而导致的宿主范围的差异。
可切割性的差异是由于HA的切割位点的氨基酸序列差异。序列分析显示，非致病性禽流感病毒和所有哺乳动物流感病毒的HA分子的HA1和HA2片段由单个精氨酸相连。相反，致病性禽毒株在切割位点处具有几个碱性氨基酸的序列，常见的共同特性是赖氨酸-精氨酸或精氨酸-精氨酸，例如RRRK(SEQ ID NO：15)。所有流感病毒的血凝素被导致消除碱性氨基酸的同样的通用机制切开。
神经氨酸酶
神经氨酸酶是甲型流感病毒的第二种膜糖蛋白。已经显示，病毒NA的存在对于产生对抗感染病毒的多方面保护性免疫应答来说是重要的。NA是413个氨基酸的蛋白，由1413个核苷酸的基因编码。在流感病毒中已鉴定到9种不同的NA亚型(N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9)，它们都已在野生鸟类中发现。NA通过从被感染细胞表面上的糖部分切下末端神经氨酸(也称为唾液酸)残基，参与破坏病毒HA的细胞受体。NA也从病毒蛋白上切下唾液酸残基，防止病毒聚集。利用这种机制，假设了NA通过阻止新形成的病毒粒子沿着细胞膜聚集并促进病毒运过黏膜表面上存在的黏液，而促成病毒子代的释放。NA是易发生抗原性变异的重要的抗原决定簇。
给药神经氨酸酶的化学抑制剂限制了病毒感染的严重性和传播。神经氨酸酶抑制剂通过阻止病毒从宿主细胞出芽来对抗流感感染。示例性NA抑制剂包括但不限于通过吸入给药的扎那米韦、通过口服给药的奥司他韦和通过肠胃外给药的帕拉米韦。
流感的内部基因
除了表面蛋白HA和NA之外，流感病毒还包含6个其他内部基因，其产生8种不同蛋白，包括聚合酶基因PB1、PB2和PA、基质蛋白M1和M2、核蛋白(NP)以及非结构蛋白NS1和NS2(Horimoto等，Clin Microbiol Rev.14(1)：129-49，2001)。
为了包装在子代病毒粒子中，病毒RNA作为核糖核蛋白复合体从核中运输，所述复合体由三种流感病毒聚合酶蛋白、核蛋白(NP)和病毒RNA构成，并与流感病毒基质1(M1)蛋白和核外运蛋白结合(Marsh等，J Virol，82：2295-2304，2008)。位于包膜中的M1蛋白被认为在装配和出芽中起作用。
病毒粒子中整合了有限数量的M2蛋白(Zebedee，J.Virol.62：2762-2772，1988)。它们形成具有H+离子通道活性的四聚体，并且当在内体中被低pH活化时，使病毒粒子内部酸化，便于其脱壳(Pinto等，Cell 69：517-528，1992)。金刚烷胺是通过干扰M2离子通道活性从而抑制病毒脱壳以阻止病毒感染的抗流感药物。
NS1蛋白是非结构蛋白，其具有多种功能，包括剪接的调控和细胞mRNA的核外运以及刺激翻译。NS1的主要功能似乎是抵消宿主的干扰素活性，因为NS1敲除的病毒在干扰素非缺陷型细胞中可以存活，但是其生长效率低于亲代病毒(Garcia-Sastre，Virology 252：324-330，1998)。
已经在病毒粒子中检测到NS2蛋白。病毒粒子中NS2的平均数量据估计为130-200个分子。体外结合测定显示出M1与NS2之间的直接蛋白质-蛋白质接触。也通过免疫沉淀在病毒感染的细胞裂解物中检测到NS2-M1复合物(Virology.196：249-55，1993)。NS2蛋白已知存在于病毒粒子中(Richardson等，Arch.Virol.116：69-80，1991；Yasuda等，Virology196：249-255，1993)，据认为通过与M1蛋白相互作用在RNP从核的外运中发挥作用(Ward等，Arch.Virol.140：2067-2073，1995)。
反向遗传学和重排病毒
分离和修饰特定核酸和蛋白的技术对于本技术领域的专业人员来说是公知的。对于本发明来说，可以使用本领域技术中的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术已在文献中充分解释。参见例如Sambrook，Fritsch & Maniatis，《分子克隆实验室指南》第二版(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition.)Cold SpringHarbor，N.Y.：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989(在本文中称为“Sambrook等，1989”)；《DNA克隆实用方法》第I和II卷(DNA Cloning.A Practical Approach，Volumes Iand II)(D.N.Glover主编，1985)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait主编，1984)；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)[B.D.Hames &S.J.Higgins主编，(1985)]；《转录和翻译》(Transcription And Translation)[B.D.Hames& S.J.Higgins主编，(1984)]；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture)[R.I.Freshney主编，(1986)]；《固定化细胞与酶》(Immobilized Cells And Enzymes)[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，《分子克隆实用指南》(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984)；Ausubel，F.M.等主编，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in MolecularBiology)，John Wiley & Sons，Inc.，1994。这些技术包括使用具有改变的核苷酸的寡核苷酸用于产生具有突变的PCR产物的位点定向诱变技术。
一方面，本发明是基于通过本文中描述并在本技术领域中已知的反向遗传学方法产生禽流感病毒及其疫苗。
流感病毒RNA转录的机制是独特的(Horimoto等，Clin Microbiol Rev.14(1)：129-49，2001)。来自细胞mRNA的5’帽被病毒核酸内切酶切开，并被病毒的转录酶用作转录引物(Krug等，Cell 18：329-334，1979)。8个RNA区段中的6个以单顺反子方式转录成mRNA，并翻译成HA、NA、NP、PB1、PB2和PA。相反，两个RNA区段通过剪接各自转录成两个mRNA。对于M和NS基因两者来说，编码mRNA以不同的阅读框翻译，分别产生M1和M2蛋白以及NS1和NS2蛋白。据认为，游离NP浓度的增加触发了从mRNA合成向互补RNA(cRNA)和病毒RNA(vRNA)合成的转变(Shapiro等，J.Virol.62：2285-2290，1988)。新合成的vRNA在核中被NP包壳，在那里它们起到模板的作用，用于病毒mRNA的次级转录。
最近开发的反向遗传学系统允许对流感病毒基因组进行操作(Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11354-58，1996；Neumann和Kawaoka，Adv.Virus Res.53：265，1999；Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：9345，1999；Fodor等，J.Virol.73：9679，1999)。流感病毒情况下的反向遗传学的机理是将负义RNA工程化改造成cDNA，用于具有负链RNA基因组的生物体的重组制备。反向遗传学技术涉及制备合成的重组病毒RNA，其含有负链病毒的非编码区，是病毒RNA被病毒聚合酶识别以及产生成熟病毒粒子所需的包装信号所必需。重组RNA从重组DNA模板合成，并在体外与纯化的病毒聚合酶复合物重构，以形成可用于转染细胞的重组核糖核蛋白(RNP)。参见美国专利6,022,726和6,001,634。
这些重组方法允许产生在多肽氨基酸序列上具有特定改变的流感病毒类型。例如，含有所需取代的HA分子可以是重组流感病毒的一部分。在一种方法中，重组流感病毒通过遗传工程方法例如“唯质粒(plasmid only)”系统来制造(Hoffmann等，Vaccine 20：3165，2002)。
在另一种用于产生重组病毒的方法中使用了8质粒系统，其中负义RNA从pol I启动子表达，并且聚合酶复合蛋白的共表达导致形成了感染性甲型流感病毒(Hoffmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6108-13，2000)。这种技术允许从cDNA快速生产嵌合疫苗用于流感大流行事件，并提供了为致病性毒株减毒的能力(Subbarao等，Virology 305：192-200，2003)，同时消除筛选重排病毒6:2配置(即6个内部基因与2个HA和NA基因(每种基因各一个))的需要。也参见美国专利7,037,707。
在一个实施方案中，在高致病性流感病毒例如H5N1的情况下，通过位点定向诱变除去造成病毒高致病性本质的HA的多碱性氨基酸切割位点，以将病毒减毒并将其类别从BSL-3改变为BSL-2。此外，将原型供体毒株的一个或多个内部基因用其他亚型的病毒基因代替，以进一步改进生长特性。
这样组合了高生长特性与H5N1野生型病毒的免疫优势的病毒，节省了生产时间，并且在一种情况下是6:2重排体，具有来自于H5N1病毒例如越南(Vietnam)株或印度尼西亚(Indonesia)株的6个内部基因作为骨架，以及实际的H5N1大流行(样)毒株的HA(带有用于减毒的突变的切割位点)和NA。具有高生长潜力的重排病毒的另一个实例是5:1:2重排体，具有来自于H5N1病毒例如越南株或印度尼西亚株的5个内部基因、H1N1毒株的PB2(用于改进在细胞培养物中的生长)作为骨架，以及实际的H5N1大流行毒株的HA(带有用于减毒的突变的切割位点)和NA。
在某些实施方案中，使用Palese等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：11354-58，1996)制备重排病毒，所述方法描述了使用辅助病毒系统产生遗传工程病毒。在一个实施方案中，病毒使用流感辅助病毒方法产生。例如，为了构建6:2重排体，可以使用减毒的VN1203病毒作为辅助病毒以导入来自第二个H5N1毒株例如鸡埃及毒株的HA和NA(Aly等，Avian Dis.52：269-77，2008)。转染体病毒的选择使用针对辅助病毒HA或NA蛋白的中和抗体来进行(参见例如Palese等，同上，其中的图2)。
本文描述的两种示例性减毒H5N1重排体具有H5N1进化枝1毒株A/Vietnam/1203/2004的骨架，即6个内部基因(PB1、PB2、PA、NP、M、NS)；一个含有H5N1进化枝1Vietnam 1203毒株的突变的HA和NA，另一个含有不同进化枝的H5N1病毒例如进化枝2A/Indonesia/5/05毒株的突变和HA和NA。这两种减毒的RG重排体具有在标准Vero细胞(含有胎牛血清)或无血清蛋白的Vero细胞中的高生长潜力。这些重排病毒与现有的RG H5N1/PR8重排体相比还具有诱导增强的H5N1特异性免疫应答的潜力，因为它们含有主要负责诱导细胞免疫的所有H5N1蛋白，即核蛋白和基质蛋白。这些H5N1特异性免疫应答也可能具有通过特异性诱导辅助性T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和记忆细胞而诱导更广泛的免疫应答的能力，从而引起提高的加强效应。在使用现有的具有源自于卵适应性H1N1亚型季节性毒株的内部蛋白的H5N1/PR8重排体时，不会发生这样的结果，所述重排体不诱导强烈的H5N1特异性细胞免疫应答。
在本技术领域中已经鉴定到大量H5N1毒株，其每个都适合本发明。参见例如Govorkova等，J Virol.2005Feb；79(4)：2191-8；Proc Natl Acad Sci USA 103：2845-50，2006；Horimoto等，Clin Microbiol Rev 14：129-49，2001和Cauthen等，J Virol.74：6592-9，2000，以及其他(参见例如Lee等，J Virol 79：3692-02，2005)。
可用于本发明的H5N1禽流感毒株的实例包括但不限于A/Vietnam/1203/2004(H5N1)(CDC#2004706280)(VN1203)、A/Indonesia/05/2005(H5N1)(CDC#2005740199)(IN5/05)、A/Cambodia/R0405050/2007(H5N1)(CamR04)、A/Anhui/1/05(H5N1)(AH1/05)、A/turkey/Turkey/01/2005(H5N1)(TT01)(参见例如Carter等，BioDrugs.22：279-92，2008)、A/Vietnam/1194/2004、土耳其流感病毒株A/Turkey/England/50-92/91(H5N1)(参见例如Horimoto等，Clin Microbiol Rev 14：129-49，2001)、A/turkey/England/87-92BFC/91(H5N1)(Londt等，Avian Pathology，36：347-350，2007)、鸡流感病毒株A/Chicken/Indonesia/03(H5N 1)、鸡流感病毒株A/Chicken/Hong Kong/220/97(参见例如Tumpey等，JVirol 76：6344-55，2002)、鸡流感病毒株A/Chicken/Scotland/59(H5N1)(参见例如Horimoto等，同上)、鸡流感病毒株A/Chicken/Hong Kong/258/97(H5N1)(参见例如Horimoto等，同上)、鸡流感病毒株A/Chicken/Nakom-Patom/Thailand/CU-K2/2004(H5N1)(参见例如Anwar等，In Silico Biol.6：161-8，2006；Viseshakul等，Virology.328：169-76，2004)、鸡流感病毒株A/Chicken/Hong Kong/31.2/2002(H5N1)(参见例如Anwar等，同上)、鸡流感病毒株A/Chicken/Vietnam/C58/04(H5N1)(参见例如Anwar等，同上)、鸡流感病毒株A/Chicken/Vietnam/38/2004(H5N1)(参见例如Anwar等，同上)、鸡流感病毒株A/Chicken/Hong Kong/1000/97(H5N1)(参见例如Shan等，Biochem Biophys ResCommun.302：377-83，2003)、鸡流感病毒株A/Chicken/Hong Kong/317.5/01和鸭流感病毒株A/Duck/Anyang/A VL-1/01(参见例如Tumpey等，J Virol 76：6344-55，2002)、鸭流感病毒株A/Duck/Vietnam/11/2004(H5N1)、A/Hatay/2004/(H5N1)(参见例如Anwar等，同上)、鸭流感病毒株A/Duck/Korea/ES/03(H5N1)、A/Duck/Korea/ESD1/03(H5N1)和A/Duck/HongKong/821/02(H5N1)(参见例如Lee等，J Virol 79：3692-02，2005)、鸭流感病毒株A/Duck/Vietnam/11/2004(H5N1)、A/Duck/China/E319-2/03(参见Lee等，Vet Microbiol 124：193-201，2007)、白鹭流感病毒A/egret/Hong Kong/757.2/02(H5N1)(参见例如Lee等，J Virol79：3692-02，2005)、鹅流感病毒株A/Goose/Guangdong/1/96(参见例如Cauthen等，JVirol.74：6592-9，2000)、禽流感病毒株A/Env/HK/437-4/99(参见例如Cauthen等，同上)、禽流感病毒株A/Env/HK/437-6/99(参见例如Cauthen等，同上)、禽流感病毒株A/Env/HK/437-8/99(参见例如Cauthen等，同上)、禽流感病毒株A/Env/HK/437-10/99(参见例如Cauthen等，同上)、禽流感病毒株A/Quail/Vietnam/36/04(H5N1)(参见例如Anwar等，同上)、禽流感病毒株A/Swan/Italy/179/06(H5N1)(参见例如Terregino等，Vet Rec.158：491，2006)、禽流感病毒株A/Hong Kong/156/97(H5N1)(HK156)(参见例如Cauthen等，同上)和禽流感病毒株A/Hong Kong/213/03(H5N1)(HK213)(参见例如Shinya等，J.Virol.79：9926-32，2005)，以及在Lee等，Emerging Infect Dis.14：487-90，2008中所公开的那些。
在对来自于H5N1毒株的内部基因与HA和NA基因了解后，将会认识到，在供选实施方案中，可以通过本技术领域公知和常用的技术合成编码这些基因的多核苷酸。
在另一个实施方案中，其他甲型流感病毒亚型和乙型流感病毒的流感病毒可用于本发明的方法和组合物中。例如，设想了具有任何HA亚型、包括H1至H16亚型中的任一种的甲型流感病毒。在另一个实施方案中，设想了可以在本发明中使用具有N1至N9任一NA亚型的流感病毒。
在某些实施方案中，设想了当产生重排体时，HA和NA亚型源自于相同毒株，并且骨架源自于同一亚型的流感病毒。示例性的组合包括但不限于例如H3N2骨架并具有来自于不同H3N2病毒株的H3和N2基因，或H15N8骨架并具有来自于不同H15N8病毒株的H15和N8基因。此外，设想了在本发明中可以使用任一下列甲型流感病毒亚型：H1N1、H2N1、H3N1、H4N1、H5N1、H6N1、H7N1、H8N1、H9N1、H10N1、H11N1、H12N1、H13N1、H14N1、H15N1、H16N1；H1N2、H2N2、H3N2、H4N2、H5N2、H6N2、H7N2、H8N2、H9N2、H10N2、H11N2、H12N2、H13N2、H14N2、H15N2、H16N2；H1N3、H2N3、H3N3、H4N3、H5N3、H6N3、H7N3、H8N3、H9N3、H10N3、H11N3、H12N3、H13N3、H14N3、H15N3、H16N3；H1N4、H2N4、H3N4、H4N4、H5N4、H6N4、H7N4、H8N4、H9N4、H10N4、H11N4、H12N4、H13N4、H14N4、H15N4、H16N4；H1N5、H2N5、H3N5、H4N5、H5N5、H6N5、H7N5、H8N5、H9N5、H10N5、H11N5、H12N5、H13N5、H14N5、H15N5、H16N5；H1N6、H2N6、H3N6、H4N6、H5N6、H6N6、H7N6、H8N6、H9N6、H10N6、H11N6、H12N6、H13N6、H14N6、H15N6、H16N6；H1N7、H2N7、H3N7、H4N7、H5N7、H6N7、H7N7、H8N7、H9N7、H10N7、H11N7、H12N7、H13N7、H14N7、H15N7、H16N7；H1N8、H2N8、H3N8、H4N8、H5N8、H6N8、H7N8、H8N8、H9N8、H10N8、H11N8、H12N8、H13N8、H14N8、H15N8、H16N8；H1N9、H2N9、H3N9、H4N9、H5N9、H6N9、H7N9、H8N9、H9N9、H10N9、H11N9、H12N9、H13N9、H14N9、H15N9和H16N9。以前已经鉴定到下列亚型的甲型流感病毒；H1N1、H2N2、H1N2、H3N2、H3N8、H4N6、H5N1、H5N2、H5N3、H5N9、H6N1、H6N2、H6N5、H7N1、H7N7、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6、H14N5、H15N8、H15N9、H16N3。表1列出了来自于可用于产生重排病毒的甲型流感毒株的示例性HA和NA基因。
设想的其他甲型和乙型流感病毒包括但不限于A/Brisbane/59/2007(H1N1)、A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/Solomon Islands/3/2006(H1N1)、A/Uruguay/716/2007、A/Wisconsin/67/2005(H3N2)、A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/California/7/2004(H3N2)、A/New York/55/2004、A/Wellington/1/2004(H3N2)、A/Fujian/411/2002(H3N2)、A/Moscow/10/99(H3N2)、A/Panama/2007/99、A/Sydney/5/97(H3N2)、A/Beijing/262/95(H1N1)、B/Florida/4/2006、B/Malaysia/2506/2004、B/Shanghai/361/2002、B/Sichuan/379/99、B/Hong Kong/330/2001、B/Guangdong/120/2000、B/Johannesburg/5/99、B/Victoria/504/2000、B/Sichuan/379/99、B/Beijing/184/93、B/Yamanashi/166/98、B/Shangdong/7/97、B/Harbin/7/94、B/Hawaii/10/2001以及与上述病毒任一种具有类似性质的病毒。在此引为参考的美国专利公布No.20090010962描述了可用于本发明的甲型流感病毒H1N1。
鉴定到的甲型流感毒株、包括甲型流感H5N1毒株的名单，可以从世界卫生组织(World Health Organization)(WHO)和美国疾病控制中心(United States Centers forDisease Control)(CDC)甲型流感和H5N1亚型数据库获得。由美国国立医学图书馆(UnitedStates National Library of Medicine)维护的国家生物技术信息中心(The NationalCenter for Biotechnology Information)(NCBI)也维持了更新的数据库，其描述了鉴定到的甲型流感病毒和乙型流感病毒物种的HA和NA基因的长度和序列。由这些组织列出的毒株，以及在其他商业和学术数据库中或在文献出版物中描述并在本技术领域中已知的病毒株，被设想用于本发明。还设想了今后鉴定和分离到的更多的甲型流感和乙型流感毒株也可用于本发明。因此，在本说明书中具体示例的任何H5N1毒株以及本技术领域中已知或发现后的毒株，适用于本发明的重排病毒、抗原性组合物、疫苗和方法。
为了强调本发明的新颖性并且将本发明与本技术领域以前公开的重排病毒相区分，从本发明中特意排除了以前公开或生产的任何病毒(甲型流感病毒和乙型流感病毒)，例如在本文引用的任何现有出版物中，使用骨架例如A/Puerto Rico/8/34(H1N1)、A/AnnArbor/6/60(H2N2)和B/Ann Arbor/1/66、具有来自一个毒株的内部基因和来自相同亚型的不同毒株的HA和NA基因的病毒，所述出版物包括但不限于：美国专利4,552,758、7,037,707、7,601,356、7,566,458、7,527,800、7,510,719、7,504,109、7,465,456、7,459,162；美国专利公布Nos.20090297554、20090246225、20090208527、20090175909、20090175908、20090175907、20090136530、20080069821、20080057081、20060252132、20060153872、20060110406、20050158342、20050042229和20070172929；国际专利公布Nos.WO 2008/157583、WO 2008/021959、WO 2007/048089、WO 2006/098901、WO 2006/063053、WO 2006/041819、WO 2005/116260、WO 2005/116258、WO 2005/115448、WO 2005/062820、WO 2003/091401，以及在其中鉴定到的可用于FLUMISTTM疫苗的任何病毒，其可以在重组病毒中含有来自一种甲型流感病毒亚型的内部基因以及同一亚型的HA和NA基因。所有这些文献在此以其全文引为参考。
在实施方案中，本发明还排除了天然存在的重排病毒，其包含流感病毒亚型的第一个毒株的骨架以及来自同一流感病毒亚型的第二个毒株的HA和NA基因。当在本文中使用时，术语“天然存在的重排病毒”是指没有外部源的干预在自然环境中重组的重排病毒。
在其他实施方案中，本发明排除了具有来自于第一种甲型或乙型流感亚型例如突变的A/Puerto Rico/8/34(H1N1)、A/Ann Arbor/6/60(H2N2)或B/Ann Arbor/1/66的一个或多个修饰过的内部基因作为骨架、以及来自于相同流感病毒株的HA和NA基因的重排病毒，例如在美国专利公布No.20070172929中所示例的。然而，本发明设想了将包含流感病毒亚型的骨架毒株的修饰过的内部基因以及来自同一亚型但是不同毒株的HA和NA基因的病毒，包括在本发明的范围内。
在另一个实施方案中，本发明排除了使用冷适应病毒例如A/Ann Arbor/6/60(H2N2)、A/Leningrad/134/17/57(H2N2)、B/Ann Arbor/1/66以及本技术领域中已知的其他冷适应病毒作为骨架/供体毒株所产生的重排病毒，其中内部骨架基因来自于第一种亚型，HA和NA基因来自于同一亚型的不同毒株。
细胞系
典型的流感病毒适合于在鸡卵中生长，但是维持卵培养物的费用明显高于在细胞培养物中生长病毒。已经使用常规的鸡胚细胞(CEC)培养物来尝试生长用于疫苗的流感病毒，但是它们只提供全部鸡胚的某些蛋白酶活性，因此只允许有限范围的流感病毒株复制。制备CEC培养物的标准程序包括除去头部和内部器官以及多个胰蛋白酶处理步骤。这些程序具体来说导致脑、心、肺、肝和肾细胞的丧失，所述细胞已被显示能够复制许多流感毒株(Scholtissek等，J.Gen.Virol.，69：2155-2164，1988)。因此，标准程序产生主要由成纤维细胞构成的高度选择过的细胞群体，在它们所能支持的病毒株方面受到限制。
已经尝试了在鸡培养物和哺乳动物细胞系两者中改进流感病毒生产。例如，已经报道，通过向组织培养基添加胰蛋白酶，可以改善几种甲型流感毒株在标准细胞培养物中的受限复制。例如，添加胰蛋白酶显著增加了在CEC培养物中生长的各种毒株的感染力(Lazarowitz等，Virology，68：440-454，1975)。此外，Stieneke-Grober等(EMBO J.，11：2407-2414，1992)已经鉴定到MDBK细胞中的HA活化酶是弗林蛋白样蛋白酶。这样的酶已经从人类和小鼠组织中分离，并构成了一个真核生物枯草菌素样内切蛋白酶的新家族。Katz等(J.Infect.Dis.160：191-98，1989)比较了流感H3N2在MDCK细胞和含胚卵羊膜腔中的生长特性，并显示了从MDCK细胞获得的流感滴度与含胚卵相当，并且MDCK生长的病毒在体内产生增加的抗原性。然而，使用MDCK细胞存在问题。例如，MDCK细胞不是批准的用于生产人类疫苗的细胞系，并且程序需要病毒在MDCK细胞系中繁殖和连续传代。
适合用于提高疫苗生长和疫苗生产的Vero细胞描述在美国专利6,146,873和Kistner等(Vaccine.16：960-8，1998)中，所述文献在此引为参考。Vero细胞是世界卫生组织(World Health Organization)接受的用于生产疫苗的细胞系。在一个实施方案中，如下面的实施例所述，本发明的病毒生长在Vero细胞中。
还有哺乳动物细胞系可用于病毒培养和生长。可用于培养病毒以制备疫苗的示例性哺乳动物细胞包括但不限于：MRC-5、MRC-9、Lederle 130、张氏肝细胞和WI-38(人类成纤维细胞)；U937(人类单核细胞)；Vero和CV-1(非洲绿猴)；IMR-90和IMR-91(具有平滑肌特性的人类肺成纤维细胞)、MDCK(马-达(Madin Darby)二氏犬肾)、MDBK(马-达二氏牛肾)、HEK(人类胚胎肾)、H9、CEM和CD4表达型HUT78(人类T细胞)；PerC6(人类成视网膜细胞)；BHK-21细胞(幼仓鼠肾)、BSC(猴肾细胞)和LLC-MK2(猴肾)。
疫苗
设想了将从组织培养制备物获得的所需病毒株用于生产疫苗。已知许多类型的病毒疫苗，包括但不限于减毒、失活、亚基和裂解疫苗。
减毒疫苗是已经以某些方式进行改变从而降低致病性并且不再引起疾病的活的病毒疫苗。减毒病毒通过几种方式生产，包括在组织培养物中生长以重复传代，以及进行遗传操作以突变或移除参与致病性的基因。例如，在一个实施方案中，对被鉴定为参与致病性或参与疾病症候的病毒基因和/或蛋白进行突变或改变，以使病毒仍然能够感染细胞并在细胞中复制，但不能引起疾病。其实例是突变HA1/HA2切割位点。通过在病毒基因区段例如NA基因中插入外来表位(J Virol.66：4647-4653，1992)，由此干扰基因组的正常功能，也已成功地将病毒减毒。还可使用本技术领域公知的冷适应方法将病毒减毒。参见例如Maassab等，Rev Med Virol.9：237-44，1999，其讨论了甲型和乙型流感病毒的减毒方法，以及Ghendon等(Vaccine.23：4678-84，2005)，其描述了在MDCK细胞中生长的冷适应流感病毒。
减毒病毒的其他方法包括构建缺乏NS1基因的重排病毒。参见例如美国专利6,468,544、6,573,079、6,669,943和6,866,853以及美国专利公布Nos.20030157131和20040109877(其每个的公开内容在此引为参考)，它们公开了缺乏功能性NS 1基因的减毒病毒。可以通过突变将NS1基因完全缺失或部分缺失或改变，以使病毒中的NS1基因没有功能性表达。缺乏NS1基因的病毒粒子与野生型病毒相比显示出减毒表型。
在产生减毒病毒后，使用标准方法制备疫苗。使用本技术领域已知的标准方法，例如使用尺寸排阻层析、高速(超速)离心或蔗糖梯度，对病毒进行纯化。
亚基疫苗是杀死的疫苗。亚基疫苗的生产包括分离病毒激活免疫系统的部分。在流感的情况下，已使用纯化的HA和NA制备了亚基疫苗，但病毒蛋白的任何混合物都可用于生产亚基疫苗。一般来说，从重组病毒形式提取病毒蛋白例如HA，并配制含有来自不同毒株的这些病毒蛋白的混合物的亚基疫苗。
裂解疫苗是通过用去污剂处理包膜病毒以使包膜中的蛋白溶解而产生的杀死的疫苗。在流感病毒的情况下，HA和NA变得溶解。在一个实施方案中，使用非离子型去污剂生产裂解疫苗。非离子型去污剂的实例包括但不限于壬酰基-N-甲基葡萄糖胺(Mega 9)、Triton X-100、辛基葡萄糖苷、洋地黄皂苷、C12E8、Lubrol、Nonidet P-40和Tween(例如Tween 20、80或120)。
失活病毒疫苗的制备是通过将收获的病毒失活并使用已知方法对其进行配制，以用作疫苗在哺乳动物中诱导免疫应答。失活使用试剂进行，包括但不限于甲醛、UV辐射、戊二醛、二乙烯亚胺(BEI)和β-丙内酯。失活剂以高得足以基本上失活溶液中的所有病毒粒子的浓度使用。例如而非限制性的，使用γ-辐射进行的病毒失活描述在美国专利6,254,873中，使用甲醛溶液的失活描述在美国专利6,254,873和美国专利6,635,246中；使用甲醛对日本脑炎病毒疫苗JE-VAX的失活描述在Couch等，J Infect Dis 1997；176(Suppl 1)：S38-44中；通过可见光的光动力失活描述在Wallis等，Journal of Immunology，1963，91：677-682中；使用UV光失活描述在WO/2008/039494中；氯失活描述在Rice EW等，EmergInfect Dis[英特网上的丛书].2007Oct中；使用涂布在表面上的水不溶性、疏水聚阳离子例如N，N-十二基甲基-聚乙烯亚胺(PEI)的失活描述在Haider等，Proc.Natl.Acad.Sci USA103：17667-17671，2006中；热失活描述在Thomas等，Journal of Food Protection.70：674-680中；使用β-丙内酯失活(正如用于生产Inflexal V和Fluvirin)描述在《欧洲药典》5.0版(EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0)中；通过二乙烯亚胺失活描述在美国专利6,803,041中。这些文献每个的公开内容针对其关于病毒失活的讲授引为参考。设想了在失活步骤期间，亚基的纯化和/或裂解在从细胞培养物纯化病毒之前或之后进行。例如，失活病毒疫苗的生产可以包括除去细胞物质、失活病毒、纯化和溶解病毒包膜。在一个实施方案中，如Kistner等，Vaccine.25：6028-36，2007中所述，本文描述的重排病毒在Vero细胞中生长并从其中分离。
然后使用本技术领域已知的标准佐剂和疫苗制备物制备疫苗。佐剂包括但不限于皂角苷、非离子型去污剂、植物油、无机凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢诺尼克多元醇、聚阴离子、肽类、油或烃类乳液、匙孔血蓝蛋白以及潜在有用的人类佐剂例如N-乙酰-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-s-n-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺、BCG(卡介苗)、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、ISCOM、纳米珠、鲨烯和嵌段共聚物，它们被设想单独或组合使用。
ISCOM是免疫刺激复合物(Immune Stimulating Complex)的首字母缩写，最初描述在Morein等(Nature 308：457-460，1984)中。ISCOM是新的疫苗递送系统，与常规佐剂不同。ISCOM以两种方式形成。在某些实施方案中，抗原在其配制过程中被物理掺入到结构中。在其他实施方案中，ISCOM-基质(由例如Isconova供应)不含抗原，但是在免疫接种之前与终端用户选择的抗原混合。在混合后，抗原与ISCOM-基质一起存在于溶液中，但是不物理掺入到结构中。
在一个实施方案中，佐剂是水包油乳液。水包油乳液在本技术领域中是公知的，并已被建议可用作佐剂组合物(EP 399843，WO 95/17210，美国专利公布No.20080014217)。在一个实施方案中，可代谢油存在的量为抗原性组合物或分离的病毒的总体积的0.5％至20％(终浓度)、量为总体积的1.0％至10％、或量为总体积的2.0％至6.0％。
在某些实施方案中，可用作佐剂的水包油乳液系统具有小的油微滴尺寸。在某些实施方案中，微滴尺寸在直径为120至750nm、或120至600nm的范围内。
为了使任何水包油组合物适用于人类给药，乳液系统的油相包含可代谢油。油可以是任何对接受体无毒并能通过代谢转化的植物油、鱼油、动物油或合成油。坚果、种子和谷物是常见的植物油来源。合成油也是本发明的一部分，并可以包括可商购的油例如NEOBEE等。特别适合的可代谢油是鲨烯。鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳己烯)是一种不饱和油，大量见于鲨鱼肝油中，以较低量见于橄榄油、小麦胚芽油、米糠油和酵母中，并且是特别适用于本发明的油。由于鲨烯是胆固醇生物合成中的中间体(《Merck索引》(Merck index)，第十版，编目号8619)这一事实，鲨烯是可代谢的油。可用于水包油乳液的示例性油包括但不限于固醇类、母育酚类和α-生育酚。
在其他实施方案中，向疫苗和/或药物组合物添加免疫系统刺激剂。免疫刺激剂包括：细胞因子、生长因子、趋化因子、来自淋巴细胞、单核细胞或淋巴器官的细胞的细胞培养物的上清液、来自植物的细胞制备物和/或提取物、来自细菌(例如BCG、分枝杆菌、棒状杆菌)、寄生虫的细胞制备物和/或提取物、或有丝分裂原以及源自于其他病毒或其他来源(例如双链RNA、CpG)的新核酸、嵌段共聚物、纳米珠或本技术领域已知的其他化合物，可以单独或组合使用。
佐剂和其他免疫刺激剂的具体实例包括但不限于溶血卵磷脂、糖苷(例如皂角苷和皂角苷衍生物例如Quil A(QS7和QS21)或GPI-0100)、阳离子表面活性剂(例如DDA)、卤化四烃基铵、普卢诺尼克多元醇、聚阴离子和多原子离子、聚丙烯酸、非离子型嵌段聚合物(例如普卢诺尼克F-127)和3D-MPL(3-O-脱酰化单磷酰脂A)。参见例如美国专利公布Nos.20080187546和20080014217。
免疫测定法
在本技术领域中，已知有各种用于检测抗体与抗原的免疫特异性结合的技术可用于检测本发明的重排病毒、抗原性组合物或疫苗的抗原性和免疫应答的诱导。检测抗原与抗体之间的相互作用的早期方法涉及通过在凝胶中沉淀来进行复合物的检测和分析。另一种检测抗原-抗体结合对的方法包括使用放射性碘标记的检测抗体或放射性碘标记的与IgG反应的蛋白例如蛋白A。这些早期方法对于本技术领域的专业人员来说是公知的，其综述在《酶学方法》(Methods in Enzymology)70：166-198，1980中。
血清学测定法广泛使用在流感诊断测定以及与病毒株的流行病学和抗原性相关的研究中。具体来说，血凝素抑制(HI或HAI)测定法被广泛使用(Meisner等，J Virol.82：5079-83，2008；Couch等，Vaccine 25：7656-63，2007)。HI测定法也可用于显示修饰的HA分子的抗原性，并协助对与未修饰HA蛋白相比具有或多或少抗原性的修饰HA蛋白进行表征。
HI测定法测定来自血清样品的抗体与标准参比物结合的能力。在HI测定法中，将血清样品的连续稀释物(滴度)与标准量的红细胞混合，并通过视觉检测它们结合形成的复合物。被滴定的血清产生可见复合物的最低浓度作为测定结果。
单向辐射扩散(SRD)测定法由Wood等(J Biol Standardization 5：237-47，1997)开发，其测定样品中HA抗原的水平。SRD测定法比较抗原被HA特异性抗体结合时参比抗原与测试抗原(例如疫苗)的扩散位点区域。
上面所述和本技术领域已知的SRD测定法和其他测定法可用于测定疫苗样品中HA的量，以用于制备包含预定量HA抗原的疫苗。
药物制剂和给药
疫苗组合物的给药一般用于预防目的。组合物的预防性给药用于防止或减弱任何随后的感染。“药理可接受的”组合物是接受体患者耐受的组合物。设想了给药有效量的疫苗。“有效量”是足以获得所需生物效应例如诱导足够的体液或细胞免疫的量。这可以取决于疫苗的类型、接受体的年龄、性别、健康和体重。所需生物效应的实例包括但不限于产生无症状、减轻症状、减少组织或鼻分泌物中的病毒滴度、完全保护免于流感病毒感染以及部分保护免于流感病毒感染。
本发明的疫苗或组合物，如果其存在引起接受体患者的生理发生可检测的变化，增强了针对至少一种传染性流感病毒株的至少一种初级或次级体液或细胞免疫应答，则是生理学显著的。给药疫苗组合物保护免于病毒感染。“保护”不必是绝对的，即如果与对照人群或患者组相比存在统计学显著的改进，则不一定完全预防或消除流感感染。保护可以限于降低流感病毒感染的症状发作的严重性或速度。
在一个实施方案中，本发明的减毒或灭活疫苗组合物在感染发生前(以便阻止或减弱预计的感染)或在实际感染开始后提供，由此保护免于病毒感染。
在一种情况下，本发明的方法包括药物组合物的给药步骤。病毒、抗原性组合物或疫苗以本技术领域任何已知的手段给药，包括通过吸入、鼻内、口服和肠胃外给药。肠胃外给药途径的实例包括真皮内、肌肉内、静脉内、腹膜内和皮下给药。
在一个实施方案中，流感疫苗给药是根据每剂的血凝素单位(HAU)的数量。一个HAU被定义为在使用鸡红细胞的标准血凝素测定法中实现50％凝集所需的抗原量。本文中所述的禽流感病毒疫苗在包含下列HA单位(HAU)的制剂中有效：约10ng至约1μg之间，约20ng至约500ng之间，约50ng至约250ng之间，约75ng至约200ng之间，约100ng，约125ng，约150ng或约175ng。在相关实施方案中，包含失活病毒的疫苗组合物包含相当于约0.1至约200μg血凝素蛋白/ml的病毒量，或其中的任何范围或值。在相关实施方案中，本发明的疫苗组合物包含约102至109个噬斑形成单位(PFU)/ml，或其中的任何范围或值，其中病毒是减毒的。在某些实施方案中，疫苗组合物包含约102、约103、约104、约105、约106、约107、约108或约109个PFU/ml。还设想了疫苗组合物包含102至约104个PFU/ml、约104至约106个PFU/ml或约106至约109个PFU/ml。
另一种情况下，失活流感疫苗通过单向辐射扩散(SRD)测定法定量(参见Kistner等，Vaccine(2007)25：6028-36和Wood等，J.Biol.Stand.(1997)5：237-247)，并表示成微克血凝素(每ml或每剂)。在一个实施方案中，季节性疫苗的剂量是每株15μg，在三剂中共为45μg。对于大流行(前)的疫苗来说，剂量典型地依赖于佐剂。在一种情况下，剂量范围是每份疫苗1μg至15μg，并且在某些制备物中，可以使用高达每份疫苗75μg。在一个实施方案中，疫苗药剂以1μg至100μgHA的剂量给药。在又一个实施方案中，疫苗包含的HA含量为每份疫苗1μg至30μg。在相关实施方案中，疫苗药剂以1μg、3μg、5μg、7.5μg、10μg、12.5μg、15μg、20μg、25μg或30μg HA或者根据需要以直至100μg的任何量给药。在某些实施方案中，设想了根据疫苗制备所使用的佐剂调整疫苗剂量。
因此，单次疫苗剂量包括具有约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约11μg、约12μg、约13μg、约14μg、约15μg、约16μg、约17μg、约18μg、约19μg、约20μg、约21μg、约22μg、约23μg、约24μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约55μg、约60μg、约65μg、约70μg、约75μg、约80μg、约85μg、约90μg、约95μg、约100μg以及超过100μg血凝素的疫苗，其提供在单剂或具有相同或不同血凝素量的多剂中。
在某些实施方案中，还设想了将病毒或抗原性组合物在包含与疫苗给药时所设想的相似的HA单位或pfu的药剂中给药。
当作为溶液给药时，将疫苗制备成水溶液的形式。这样的制剂在本技术领域中是已知的，并通过将抗原和其他适合的添加剂溶解在适合溶剂中来制备。这样的溶剂包括例如水、盐水、乙醇、乙二醇和甘油。适合的添加剂包括经核准的染料和抗微生物防腐剂，例如硫柳汞(乙汞硫水杨酸钠)。这样的溶液可以使用标准方法例如通过添加部分水解的明胶、山梨糖醇或细胞培养基进行稳定化，并可以使用标准方法，使用例如试剂诸如磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钾和/或磷酸二氢钾或TRIS进行缓冲。液体制剂还可以包括悬液和乳液。悬液的制备包括例如使用胶体磨，乳液的制备包括例如使用匀浆器。
在一个实施方案中，设想了疫苗载体是聚合物延迟释放系统。合成的聚合物可用于疫苗制剂，使用本技术领域公知的方法实现抗原的受控释放。
从下面的实施例，本发明的其他方面和细节将变得明显，这些实施例打算用于说明而不是限制。
实施例
实施例1
通过反向遗传学产生具有修饰的切割位点的减毒A/Vietnam/1203/04毒株
病毒株A/Vietnam/1203/04(H5N1)是从致死的人类流感病例分离的高致病性毒株。为了将该毒株减毒，消除了HA切割位点处的多碱性氨基酸段(RRRK(SEQ ID NO：15))。此外，如Horimoto等所述(Vaccine.24：3669-76，2006)，导入了附加的取代(R→T和K→T)，以防止由于聚合酶延宕(polymerase stuttering)重新形成多碱性氨基酸。该修饰消除了高致病性禽流感病毒的主要致病因素，并将其转变成低致病性表型。
Vero细胞从欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of CellCultures)(ECACC，Salisbury，Wiltshire SP4 0JG，UK)获得，处于第134次传代。Vero细胞培养在增补有4mM L-谷氨酰胺的OPTI-PRO(Gibco，Carlsbad，CA)培养基中。
将病毒在含有5μg/ml胰蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO)的OPTI-PRO培养基中的Vero细胞中，在37℃和5％CO2下繁殖。通过标准的TCID50分析确定病毒的感染滴度。血细胞凝集测定使用0.5％鸡红细胞悬液进行。用或不用胰蛋白酶的病毒生长通过标准的噬斑测定试验确定，所述试验在含有4mM L-谷氨酰胺、5μg/ml胰蛋白酶、0.01％DEAE-葡聚糖(Sigma)、0.6％琼脂(Sigma)的OPTI-PRO培养基中的Vero细胞上进行，并表示成噬斑形成单位(pfu)。
构建了在HA蛋白中具有修饰的切割位点的病毒A/Vietnam/1203/04(H5N1)。在Geneart AG(Regensburg，德国)，根据GenBank发表的序列(登记号：HA为AY818135，NA为AY818141，M为AY818144，NP为AY818138，NS为AY818147，PA为AY818132，PB1为AY818129，PB2为AY818126)，合成了对应于A/Vietnam/1203/04PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M和NS区段的cDNA。
因为A/Vietnam/1203/04区段的病毒非编码区(NCR)仅仅部分可得到，因此将源自于相应的A/Hong Kong/213/03区段的NCR添加到Vietnam/1203/2004编码序列中(A/HongKong/213/03HA的登记号：AB212054；NA：AB212056；M：AB212057；NP：AB212055；NS：AB212058；PA：AB212053；PB1：AB212052；PB2：AB212050)。
将高致病性毒株A/Vietnam/1203/04(H5N1)的HA多碱性氨基酸切割位点用在低致病性H5毒株中发现的胰蛋白酶依赖性序列TETR/GLF替换(图1)。HA基因的修饰包括移除HA切割位点处的碱性氨基酸段，并将邻近的碱性氨基酸精氨酸(R)和赖氨酸(K)取代成苏氨酸(T)，NTPQRERRRKKRGLFGAI(SEQ ID NO：16)→NTPQTETRGLFGAI(SEQ ID NO：17)，以便防止可能返回到野生型表型。
图1显示了病毒基因的HA切割位点核苷酸序列的修饰。图1中源自于A/Hong Kong/213/03的NCR被下划线。通过PCR获得基因组片段的cDNA拷贝，并使用PCR产物转染Vero细胞。转染按照Hoffmann等(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)97：6108-113，2000)的方法，使用含有完整病毒基因组的8个cDNA进行。
将转染的Vero细胞接种在6孔板中含血清的转染培养基(DMEM/F12+2mM L-谷氨酰胺+10％FCS)中。将细胞在37℃温育。转染后6小时，将培养基更换为增补有4mM L-谷氨酰胺和1μg/ml胰蛋白酶的无血清OPTI-PRO培养基。24小时后，向上清液加入另外的含10μg胰蛋白酶的无血清培养基。72小时后收获上清液，并用于在新鲜Vero细胞上进行再一次传代(盲传)。这次传代的温育一直持续到观察到发生100％的细胞病变效应(CPE)，然后收获上清液。得到的病毒被命名为A/Vietnam/1203/04(H5N1)-HAatt或attVN1203。
在有限稀释液中的Vero细胞上进行被拯救病毒的两次连续病毒传代。为此目的，将Vero细胞汇合的24孔板用重复4次10倍稀释制成的收获病毒的稀释液感染，在2天内，收获稀释(-5)的两个孔，并用于第二步。第二步以同样的方式进行。在2天后收获稀释(-6)的病毒，用于生产病毒储用物。将具有Vero细胞汇合单层的T150cm2Roux培养瓶，使用0.0005的感染复数(moi)用最后一次传代收获的病毒感染。在室温下温育30分钟后，除去接种物，并加入50ml增补有5μg/ml胰蛋白酶的无血清培养基。在48小时内发生100％CPE，并收获上清液，通过以160g离心10分钟使其澄清，在冷冻管中分成1ml等份试样，并在-80℃下冷冻。
在Vero细胞上产生的A/Vietnam/1203/04-Haatt病毒储用物的感染滴度，通过在Vero细胞上使用TCID50测定法滴定来测定。执行了两次独立的滴定。结果显示在表2中。与在卵中繁殖相比，从Vero细胞生产的病毒滴度高大约10倍。
表2、A/Vietnam/1203/04(H5N1)-HAatt病毒储用物的感染滴度
实验 感染滴度，log10TCID50/ml
1 8.87
2 8.55
A/Vietnam/1203/04(H5N1)-HAatt(H5N1)病毒的HA基因的序列被工程化改造，以消除HA切割位点处的多碱性氨基酸段。这种修饰将其转变成对人类不存在任何威胁的低致病性表型。
为了证实获得的A/Vietnam/1203/04(H5N1)-HAatt毒株的低致病性表型，测定了不存在胰蛋白酶时产生噬斑的能力。在存在胰蛋白酶的情况下在Vero细胞上进行的噬斑测定中，A/Vietnam/1203/04(H5N1)-HAatt病毒产生噬斑(滴度为2x107个PFU/ml)。相反，在不存在胰蛋白酶的情况下病毒不形成噬斑，证实了A/Vietnam/1203/04(H5N1)-HAatt病毒的无致病性表型。为了证实被拯救的病毒与克隆序列的同一性，验证了HA和NA基因的序列。在任何被测序的基因中没有发现变化。
这些结果证实，包含来自于A/Vietnam/1203/2004(H5N1)流感毒株的内部基因(骨架)和来自于同一病毒的减毒HA和野生型NA基因的重排病毒，适应于在细胞培养物中生长，并表现出与野生型病毒相比降低的抗原性。
实施例2
通过反向遗传学产生具有修饰的切割位点的减毒A/Indonesia/5/05毒株(A/Vietnam/1203/042：6转染体)
病毒株A/Indonesia/5/05(H5N1)是从致死的人类流感病例分离的高致病性毒株。为了将该毒株减毒，消除了HA切割位点处的多碱性氨基酸段(RRKK[SEQ ID NO：21])。导入了附加的取代(R→T和S→T)以防止多碱性氨基酸的重新形成(Horimoto等，Vaccine.24：3669-76，2006)。该修饰将消除高致病性禽流感病毒的主要致病因素，并将其转变成低致病性表型。
细胞培养和病毒繁殖按照上述进行。构建了在HA蛋白中带有修饰的切割位点的A/Indonesia/5/05(H5N1)样病毒。在Geneart AG(Regensburg，德国)，根据GenBank发表的序列(登记号：HA为ISDN125873，NA为ISDN125875，M为AY818144，NP为AY818138，NS为AY818147，PAT为AY818132，PB1为AY818129，PB2为AY818126)，合成了对应于A/Indonesia/5/05的HA和NA以及对应于A/Vietnam/1203/04的PB2、PB1、PA、NP、M和NS区段的cDNA。
因为A/Vietnam/1203/04区段的病毒非编码区(NCR)仅仅部分可得到，因此将源自于相应的A/Hong Kong/213/03区段的NCR添加到A/Indonesia/5/05和Vietnam/1203/2004的编码序列中(A/HongKong/213/03HA的登记号：AB212054；NA：AB212056；M：AB212057；NP：AB212055；NS：AB212058；PA：AB212053；PB1：AB212052；PB2：AB212050)。将高致病性毒株A/Indonesia5/05(H5N1)的HA多碱性氨基酸切割位点用在低致病性H5毒株中发现的胰蛋白酶依赖性序列TETR/GLF替换(图2)。HA基因的修饰包括移除HA切割位点处的碱性氨基酸段，并将邻近的碱性氨基酸R和S取代成T以便防止可能返回到野生型表型，取代如下：NTPQRERRRKKRGLFGAI(SEQ ID NO：16)→NTPQTETRGLFGAI(SEQ ID NO：17)。图2显示了A/Indonesia/5/05的HA切割位点的修饰和病毒基因的核苷酸序列。源自于A/Hong Kong/213/03的NCR被下划线。
通过PCR获得基因组片段的cDNA拷贝，并使用PCR产物转染Vero细胞。将转染的Vero细胞接种在6孔板中含血清的转染培养基(DMEM/F12+2mM L-谷氨酰胺+10％FCS)中。将细胞在37℃温育。转染后6小时，将培养基更换为增补有4mM L-谷氨酰胺和1μg/ml胰蛋白酶的无血清OPTI-PRO培养基。24小时后，向上清液加入另外的含10μg胰蛋白酶的无血清培养基。72小时后收获上清液，并用于在新鲜Vero细胞上进行再一次传代(盲传)。这次传代的温育一直持续到发生100％的细胞病变效应(CPE)，然后收获上清液。得到的病毒被命名为A/Indonesia/5/05(H5N1)-HAatt或RG-attVN1203/IN5/05。
在有限稀释液中的Vero细胞上进行被拯救病毒的两次连续病毒传代。为此目的，将Vero细胞汇合的24孔板用重复4次10倍稀释制成的收获病毒稀释液感染，在2天后，收获稀释(-6)的两个孔，并用于第二步，第二步以同样的方式进行。在2天后收获稀释(-6)的病毒，用于生产病毒储用物。将具有Vero细胞汇合单层的T150cm2Roux培养瓶，使用0.0005的moi，用最后一次传代收获的病毒感染。在室温下温育30分钟后，除去接种物，并加入50ml增补有5μg/ml胰蛋白酶的无血清培养基。在48小时后发生100％CPE，并收获上清液，通过以160g离心10分钟使其澄清，在冷冻管中分成1ml等份试样，并在-80℃下冷冻。
在Vero细胞上产生的A/Indonesia/5/05(H5N1)-HAatt病毒储用物的感染滴度，在Vero细胞上使用TCID50测定法通过滴定来估算。执行了两次独立的滴定。结果显示在表3中。
表3、A/Indonesia/5/05(H5N1)-HAatt病毒储用物的感染滴度
实验 感染滴度，log10TCID50/ml
1 9.04
2 8.72
A/Indonesia/5/05(H5N1)-HAatt病毒的HA基因的序列被工程化改造，以消除HA切割位点处的多碱性氨基酸段。这种修饰将其转变成对人类不存在任何威胁的低致病性表型。为了证实获得的A/Indonesia/5/05(H5N1)-HAatt毒株的低致病性表型，测定了不存在胰蛋白酶时产生噬斑的能力。在存在胰蛋白酶的情况下在Vero细胞上进行的噬斑测定中，A/Indonesia/5/05(H5N1)-HAatt病毒产生噬斑(滴度为3x107个PFU/ml)。相反，在不存在胰蛋白酶的情况下病毒不形成噬斑，证实了A/Indonesia/5/05(H5N1)-HAatt病毒的无致病性表型。
为了证实被拯救的病毒与克隆序列的同一性，验证了HA和NA基因的序列。在任何被测序的基因中没有发现变化。
这些结果证实，包含来自于A/Vietnam/1203/2004(H5N1)流感毒株的内部基因(骨架)以及来自于不同H5N1流感毒株(A/Indonesia/5/05)的减毒HA和野生型NA基因的重排病毒，适应于在细胞培养物中生长，并表现出与野生型病毒相比降低的抗原性。
然后将减毒病毒在Vero细胞培养物中的生长与卵适应性反向遗传学病毒在Vero细胞中的生长进行了比较。
流感毒株CDC RG Indo/05/2005是具有PR8骨架(6个源自于PR8的内部基因)以及源自于A/Indonesia/05/2005毒株的HA和NA基因的6:2反向遗传学毒株。该毒株是卵适应性的，并是常规(卵来源)的失活H5N1疫苗的基础。将CDC RG Indo毒株在两种不同温度32℃和37℃下在Vero细胞中以0.01至0.0001的感染复数(MOI)传代三次。滴度显示在表4中。初始对数滴度在6.4-6.7(32℃)和5.8-6.8(37℃)的范围内。传代三次后，滴度略高，在32℃下达到7.1-7.2，在37℃下为6.5-7.4。因此，初始滴度低并且传代只略微增加滴度。
新的流感病毒Vietnam/1203/04(H5N1)-HAatt病毒生长至8.71 log10TCID50/ml的平均滴度。A/Indonesia/5/05(H5N1)-HAatt病毒的滴度为8.88TCID50/ml(实施例1和2)。与匹配的卵适应性毒株CDC RG Indo/05/2005相比，新毒株的生长比卵适应性病毒高至少两个对数级。
实施例3
重排病毒的安全性和效能
为了确定重排病毒的安全性和效能，在小鼠和鸡中进行了体内研究。将10-12周龄的Balb/c小鼠(Charles River，Sulzfeld，德国)用表4A和4B中标出的逐渐增加剂量的病毒进行鼻内激惹(临床症状：r，毛皮发皱；h，弓背；m，无光泽(晦暗)；d，死亡；AST＝平均死亡时间)。
在第一个小鼠实验(表5A)中，对小鼠进行为期两周的临床监测。在用病毒RG-attVN1203或6:2 Indonesia重排体激惹后，没有观察到重要临床症状。大部分小鼠完全没有显示临床症状；一些小鼠在第一周毛皮发皱，并在第二周中完全恢复。
在第二个小鼠实验(表5B)中，剂量增加到高达每只动物1x106TCID50，通过鼻内给药。这次，监测生病的可靠指标：体重丧失(WL)。使用基于H5N1的RG病毒时没有观察到WL，所有小鼠存活，表明没有毒力。野生型激惹对照VN1203和IN5/05H5N1野生型毒株，在6至8日内杀死小鼠。
为了检查重排病毒在鸡中的安全性，将7日龄的鸡(Spafas，Hungary)用表5C和5D中标出的逐渐增加剂量的病毒进行激惹。对动物进行为期两周的临床监测。
如表5C中所示，在用剂量为每只动物1x105和1x106TCID50鼻内激惹的所有鸡中，使用基于H5N1的RG病毒时没有观察到重要的临床症状。正如所预期的，从CDC得到的BSL-2对照病毒(CDC RG Indo/05/2005，一种基于PR8的大流行前的种子病毒株)也没有毒力并对鸡无致病性。
为了使用第二种给药途径验证这一结果，通过以每只动物1x106TCID50的剂量肌肉内注射对鸡进行激惹(表5D)。将两种已知对鸡无毒力的对照病毒CDC RG Indo/05/2005和NIBRG-14(基于PR8的重排体，分别具有IN5/05以及VN1194的HA和NA基因)包含在实验中。在激惹后没有观察到体重丧失。所有动物的体重增加都与对照动物——用磷酸盐缓冲盐水(PBS)激惹的鸡相当。在同样的实验中，使用高致病性H5N1野生型病毒IN5/05对鸡进行鼻内激惹。在激惹后两天内，所有鸡都在激惹后特急性死亡(表5D)。
这些体内实验证实了HA基因中多碱性氨基酸切割位点的修饰使H5N1病毒强烈减毒。
实施例4
通过反向遗传学产生具有修饰的切割位点的减毒A/Turkey/Turkey/1/05毒株
病毒株A/turkey/Turkey/1/05(H5N1)是从致死的禽流感病例分离的高致病性毒株。为了将该毒株减毒，消除了HA切割位点处的多碱性氨基酸区段(RRRK(SEQ ID NO：15))。导入了附加的取代(R→T和K→T)以防止多碱性氨基酸的重新形成(Horimoto等，Vaccine.24：3669-76，2006)。该修饰将消除高致病性禽流感病毒的主要致病因素，并将其转变成低致病性表型。
细胞培养和病毒繁殖按照上述进行。构建了在HA蛋白中带有修饰的切割位点的A/Turkey/Turkey/1/05(H5N1)样的病毒。在Geneart AG(Regensburg，德国)，根据GenBank发表的序列(登记号：HA为DQ407519，NA为EF619973，M为EF541453，NP为AY818138，NS为EF541456，PA为AY818132，PB1为AY818129，PB2为AY818126)，合成了对应于A/turkey/Turkey/1/05的HA和NA和对应于A/Vietnam/1203/04的PB2、PB1、PA、NP、M和NS区段的cDNA。
因为A/Vietnam/1203/04区段的病毒非编码区(NCR)仅仅部分可得到，因此将源自于相应的A/Hong Kong/213/03区段的NCR添加到A/Indonesia/5/05和Vietnam/1203/2004的编码序列中(A/Hong Kong/213/03HA的登记号：AB212054；NA：AB212056；M：AB212057；NP：AB212055；NS：AB212058；PA：AB212053；PB1：AB212052；PB2：AB212050)。将高致病性毒株A/Turkey/Turkey/1/05的HA多碱性氨基酸切割位点用在低致病性H5毒株中发现的胰蛋白酶依赖性序列TETR/GLF(参见SEQ ID NO：19)替换(图3)。HA基因的修饰包括移除HA切割位点处的碱性氨基酸段，并将邻近的碱性氨基酸R和K取代成T以便防止可能返回到野生型表型，取代如下：NSPQRERRRKKRGLFGAI(SEQ ID NO：18)→NSPQTETRGLFGAI(SEQ ID NO：19)。图3显示了A/Turkey/Turkey/1/05的HA切割位点的修饰和病毒基因的核苷酸序列。源自于A/HongKong/213/03的NCR被下划线。
通过PCR获得基因组片段的cDNA拷贝，并使用PCR产物转染Vero细胞。将转染的Vero细胞接种在6孔板中含血清的转染培养基(DMEM/F12+2mM L-谷氨酰胺+10％FCS)中。将细胞在37℃温育。转染后6小时，将培养基更换为增补有4mM L-谷氨酰胺、1μg/ml胰蛋白酶和0.25μg/ml两性霉素B的无血清OPTI-PRO培养基。24小时后，向上清液加入另外的含10μg胰蛋白酶的无血清培养基。72小时后收获上清液，并用于在新鲜Vero细胞上再进行两次传代(盲传)。这次传代的温育一直持续到发生100％的细胞病变效应(CPE)，然后收获上清液。得到的病毒被命名为A/turkey/Turkey/1/05(H5N1)-HAatt或RG-attVN1203/TT/1/05。
按照上面描述产生A/turkey/Turkey/1/05病毒储用物。在Vero细胞上产生的A/turkey/Turkey/1/05(H5N1)-HAatt病毒储用物的感染滴度，在Vero细胞上使用TCID50测定法通过滴定来估算。执行了两次独立的滴定。结果显示在表6中。
表6、RG-attVN1203/TT/1/05病毒储用物的感染滴度
实验 感染滴度，log10TCID50/ml
1 8.83
2 8.85
为了证实被拯救的病毒与克隆序列的同一性，验证了HA和NA基因的序列。在任何被测序的基因中没有发现变化。
这些结果证实，包含来自于A/Vietnam/1203/2004(H5N1)流感毒株的内部基因(骨架)以及来自于不同H5N1流感毒株(A/turkey/Turkey/1/05)的减毒HA和野生型NA基因的重排病毒，适应于在细胞培养物中生长。
实施例5
通过反向遗传学产生具有修饰的切割位点的减毒A/Anhui/01/05毒株
病毒株A/Anhui/01/05(H5N1)是从中国的致死人类流感病例分离的高致病性毒株。为了将该毒株减毒，消除了HA切割位点处的多碱性氨基酸段(RRRK(SEQ ID NO：15))。此外，导入了附加的取代(L→Q、R→T和K→T)以防止多碱性氨基酸的重新形成(Horimoto等，Vaccine.24：3669-76，2006)。该修饰将消除高致病性禽流感病毒的主要致病因素，并将其转变成低致病性表型。
细胞培养和病毒繁殖按照上述进行。构建了在HA蛋白中带有修饰的切割位点的A/Anhui/01/05(H5N1)样的病毒。在Geneart AG(Regensburg，德国)，根据GenBank发表的序列(登记号：HA为DQ371928，NA为EU128239，M为EF541453，NP为AY818138，NS为EF541456，PA为AY818132，PB1为AY818129，PB2为AY818126)，合成了对应于A/Anhui/01/05的HA和NA以及对应于A/Vietnam/1203/04的PB2、PB1、PA、NP、M和NS区段的cDNA。
因为A/Vietnam/1203/04区段的病毒非编码区(NCR)仅仅部分可得到，因此将源自于相应的A/Hong Kong/213/03区段的NCR添加到A/Indonesia5/05和Vietnam/1203/2004的编码序列中(A/Hong Kong/213/03HA的登记号：AB212054；NA：AB212056；M：AB212057；NP：AB212055；NS：AB212058；PA：AB212053；PB1：AB212052；PB2：AB212050)。将高致病性毒株A/Anhui/01/05的HA多碱性氨基酸切割位点用在低致病性H5毒株中发现的胰蛋白酶依赖性序列TETR/GLF替换(图4)。HA基因的修饰包括移除HA切割位点处的碱性氨基酸段，并将邻近的碱性氨基酸L取代成Q并将R和K取代成T，以便防止可能返回到野生型表型，取代如下：NSPLRERRRKKRGLFGAI(SEQ ID NO：20)→NSPQTETRGLFGAI(SEQ ID NO：19)。图4显示了A/Anhui/1/05HA切割位点的修饰和病毒基因的核苷酸序列。源自于A/Hong Kong/213/03的NCR被下划线。
通过PCR获得基因组片段的cDNA拷贝，并使用PCR产物转染Vero细胞。将转染的Vero细胞接种在6孔板中含血清的转染培养基(DMEM/F12+2mM L-谷氨酰胺+10％FCS)中。将细胞在37℃温育。转染后6小时，将培养基更换为增补有4mM L-谷氨酰胺、1μg/ml胰蛋白酶和0.25μg/ml两性霉素的无血清OPTI-PRO培养基。24小时后，向上清液加入另外的含10μg胰蛋白酶的无血清培养基。72小时后收获上清液，并用于在新鲜Vero细胞上再进行两次传代。这次传代的温育一直持续到发生100％的细胞病变效应(CPE)，然后收获上清液。得到的病毒被命名为A/Anhui/01/05(H5N1)-HAatt或RG-attVN1203/AH/1/05。
按照上面描述产生A/Anhui/01/05病毒储用物。在Vero细胞上产生的RG-attVN1203/AH/1/05病毒储用物的感染滴度，在Vero细胞上使用TCID50测定法通过滴定来估算。执行了两次独立的滴定。结果显示在表7中。
表7、RG-attVN1203/AH/1/05病毒储用物的感染滴度
实验 感染滴度，log10TCID50/ml
1 8.75
2 8.50
为了证实被拯救病毒与克隆序列的同一性，验证了HA和NA基因的序列。在任何被测序的基因中没有发现变化。
这些结果证实，包含来自于A/Vietnam/1203/2004(H5N1)流感毒株的内部基因(骨架)以及来自于不同H5N1流感毒株(A/Anhui/1/05)的减毒HA和野生型NA基因的重排病毒，适应于在细胞培养物中生长。
实施例6
重排病毒疫苗的体内给药
为了确定表达H5N1内部基因以及HA和NA基因的重组重排病毒(完整病毒)的体内效能，使用本技术领域公知的技术将病毒给药于受试动物。例如Kistner等(Vaccine.25：6028-36，2007)描述了包含完整的、失活的H5N1病毒株A/Vietnam/1203/2004的病毒疫苗向受试小鼠的给药，并评估了用活病毒重新激惹后疫苗保护小鼠免于感染的能力。
此外，Ehrlich等(N Engl J Med.358：2573-84，2008)描述了在人类患者中进行的临床试验，其包含给药针对大流行的H5N1流感毒株的疫苗。向受试者给药两剂包含失活的完整A/Vietnam/1203/2004的疫苗(相隔21天)，每剂含有3.75μg、7.5μg、15μg或30μg血凝素抗原和明矾佐剂，或不含佐剂的7.5μg或15μg HA抗原。在基线和第21和42日进行血清学分析。Ehrlich证实了疫苗在宿主受试者中引发免疫应答，并且宿主保护免于几种不同病毒株的感染。
本发明的重排病毒、抗原性组合物或疫苗使用上面描述的技术或使用本技术领域已知的其他技术给药。
本技术领域的专业人员可以预计到对上面的说明性实施例中提出的本发明能够进行大量修改和改变。因此，本发明只应该受到所附的权利要求书中出现的限制。

Claims (16)

1.包含重排甲型流感病毒的疫苗，所述病毒包含：(i)编码PB1的多核苷酸，编码PA的多核苷酸，编码PB2的多核苷酸，编码M的多核苷酸，编码NP的多核苷酸，编码NS的多核苷酸，内部基因PB1、PA、PB2、M、NP和NS的多核苷酸源自于第一种H5N1流感病毒，以及(ii)编码表面蛋白HA的多核苷酸和编码表面蛋白NA的多核苷酸，HA和NA中的每个来自于第二种H5N1流感病毒，
所述多核苷酸可操作地连接，以允许重排的多核苷酸包装在病毒粒子中，其中所述HA基因通过从RERRRKKR(SEQ ID NO:13)→TETR(SEQ ID NO:14)的突变在多碱性切割位点被修饰以产生减毒病毒。
2.权利要求1的疫苗，其中所述内部基因源自于选自下列的H5N1毒株：A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005、A/Anhui/1/05、A/Cambodia/R0405050/2007、A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04、A/chicken/Vietnam/C58/04、A/quail/Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-样、Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/Salatiga/BBVet-I/05、Dk/VNM/S654/05和A/Muscovy Duck/Vietnam/453/2004。
3.权利要求1的疫苗，所述HA和NA基因源自于选自下列的H5N1毒株：A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005、A/Anhui/1/05、A/Cambodia/R0405050/2007、A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04、A/chicken/Vietnam/C58/04、A/quail/Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-样、Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/Salatiga/BBVet-I/05、Dk/VNM/S654/05和A/Muscovy Duck/Vietnam/453/2004。
4.权利要求1的疫苗，其中内部基因区段与HA和NA基因源自于相同病毒株。
5.权利要求1的疫苗，其中内部基因区段与HA和NA基因源自于不同病毒株。
6.权利要求1的疫苗，其中HA和NA基因来自于H5N1毒株A/Vietnam/1203/2004或来自于H5N1毒株A/Indonesia/5/05。
7.权利要求1的疫苗，其还包含佐剂。
8.权利要求1的疫苗，其中疫苗是灭活疫苗。
9.权利要求1的疫苗，其包含的HA含量为1μg至100μg HA。
10.权利要求1到9任一项的疫苗，用于以有效保护对象免于至少一种H5N1流感病毒株的感染的量在对象中引发针对至少一种大流行流感病毒株的免疫应答。
11.权利要求1到9任一项的疫苗，用于预防对象被流感病毒感染。
12.权利要求1到9任一项的疫苗，用于预防对象被H5N1流感病毒感染。
13.权利要求12的疫苗，其中疫苗包含的HA含量为1μg至100μgHA。
14.权利要求13的疫苗，其中疫苗包含的HA含量为1μg至30μgHA。
15.权利要求13的疫苗，其中疫苗包含1μg至15μg HA。
16.权利要求1的疫苗，其中疫苗包含的HA含量为10ng至1μg HA单位。
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