CN104073513B - 甲型流感病毒疫苗哺乳动物细胞适应株的获得方法和适应位点 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及甲型流感病毒疫苗哺乳动物细胞适应株的获得方法和适应位点。本发明人通过将现有的甲型流感疫苗骨架毒株在哺乳动物细胞上进行连续传代,得到了哺乳动物细胞适应毒株,该适应毒株内部病毒基因编码的病毒蛋白上的四个氨基酸位点发生了突变,贡献了适应毒株骨架的适应性。该适应毒株在活体包括鸡胚和小鼠上的致病力没有增强,却大大提高了其对哺乳动物细胞的适应性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和免疫学领域;更具体地,本发明涉及甲型流感病毒疫苗哺乳动物细胞适应株的获得方法和适应位点。
背景技术
流感是人类历史上最严重的传染病之一,其主要病原体是流感病毒。流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),根据其内部核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的抗原性不同,分为A\B\C(甲\乙\丙)三型。其中,A型(甲型)是致人类和各种动物流感的主型,它的宿主范围广泛(包括野生鸟类、家禽、各种哺乳动物以及人类),变异很快(能够改变抗原性以逃避宿主免疫系统的攻击,或者改变自身的药物靶点特征以获得抗药性)。这些特点决定了甲型流感病毒能够在人畜间广泛传播,难以控制。除了每年造成季节性流行(epidemic),还不定期造成大流行(pandemic),给人类社会带来巨大损失。据世界卫生组织(WHO)预测,全球每年平均有1/3的儿童和1/10的成人会感染流感。
甲型流感病毒是一种有包膜的单股负链RNA(-ssRNA)病毒,基因组由8条单股负链RNA组成,编码至少10种蛋白质,这10个病毒蛋白包括HA,NA,PA,PB1,PB2,NP,M1,M2,NS1和NS2。其中血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是主要的表面抗原蛋白,HA主要负责使病毒有效入侵细胞,NA主要负责切断出芽的新生病毒颗粒与细胞表面的连接使其顺利释放。PA,PB1,PB2组成RNA聚合酶复合体(RdRp),负责病毒基因组的复制和转录。核蛋白(NP)与病毒基因组RNA结合,是构成病毒核糖核蛋白复合体(vRNP)的主要成分。基质蛋白(M1)位于病毒包膜和vRNP之间,负责形成病毒蛋白衣壳。M2形成质子通道,在病毒入侵细胞时,调节内涵体PH值,促进HA的变构和vRNP的释放。NS1是一个多功能非结构蛋白,在抵抗宿主免疫反应(抗干扰素)等方面有重要作用。NS2又名核转运蛋白NEP,可引导vRNP出核。
抗击流感最有效的手段是接种流感疫苗。传统的流感疫苗采用鸡胚生产,技术已经相当成熟,而且所得疫苗安全、有效。但是,鸡胚生产疫苗有一些难以克服的缺点,比如:过程繁琐;需要大量的SPF鸡胚,这在流感大流行时难以保证供应;在表面抗原上容易发生突变,可能造成疫苗毒抗原性改变;含有卵清蛋白致敏原等。发展哺乳动物二倍体传代细胞培养病毒来生产流感疫苗的技术,可以很好的解决以上问题,也是改进流感疫苗生产现状的重要发展方向。
用于流感病毒疫苗生产研究的细胞系主要有MDCK、Vero、PER.C6等,并已有产品上市。但其中仍有不少问题亟待研究和解决,如:(1)细胞生产疫苗的产量有待提高,包括更加适合在细胞中复制的流感病毒株的开发,更加适宜的细胞培养条件和病毒收获条件的摸索等;(2)病毒在细胞中传代的抗原稳定性评价;(3)细胞生产疫苗的安全性评价;(4)其它可用于流感疫苗生产的细胞系开发;等等。
目前流感疫苗的通用骨架毒株是PR8毒株(A/PR/8/34),它是鸡胚适应株,在鸡胚中复制效率很高,能使与之重配得到的疫苗毒株获得在鸡胚中的高产特性。但PR8并不适合在哺乳动物细胞中扩增,因此有必要针对哺乳动物细胞生产平台开发新的骨架毒株,甚至针对每一种不同的培养细胞开发其相应的最适病毒株,以达到最佳的生产效果。因此,本领域需要开发更适应以哺乳动物细胞作为生产细胞的高产疫苗株。
发明内容
本发明的目的在于提供甲型流感病毒疫苗哺乳动物细胞适应株的获得方法和适应位点
在本发明的第一方面,提供一种制备重组甲型流感病毒株的方法,所述方法包括:
(1)提供病毒拯救系统,其包含流感病毒拯救所需的流感病毒拯救质粒,能完成流感病毒拯救;所述的流感病毒拯救质粒中,
RNA多聚酶PB1的编码基因是突变型基因,其编码突变型RNA多聚酶PB1,氨基酸序列第621位由Q突变为K或者R
RNA多聚酶PA的编码基因是突变型基因,其编码突变型RNA多聚酶PA,氨基酸序列第237位由E突变为K或者R;
核外壳核蛋白NP的编码基因是突变型基因,其编码突变型核外壳核蛋白NP,氨基酸序列第377位由S突变为N;和/或
非结构蛋白NS1的编码基因是突变型基因,其编码突变型非结构蛋白NS1,氨基酸序列第165位由S突变为Y;
(2)将步骤(1)的病毒拯救系统中流感病毒拯救质粒转染病毒包装细胞,培养经转染的病毒包装细胞,获得重组流感病毒株,其是哺乳动物细胞适应性的流感病毒株。
在一个优选例中,突变型RNA多聚酶PB1基因以来源于PR8病毒的RNA多聚酶PB1基因进行突变;突变型RNA多聚酶PA基因以来源于PR8病毒的RNA多聚酶PA基因进行突变;突变型核外壳核蛋白NP基因以来源于PR8病毒的核外壳核蛋白NP基因进行突变;和/或突变型非结构蛋白NS1基因以来源于PR8病毒的非结构蛋白NS1基因进行突变。
在另一优选例中,所述的病毒拯救质粒是pHW系列质粒;较佳地,所述病毒拯救系统包括8个pHW2000质粒,各自独立地在polI和polII双重启动子之间装载下述8条病毒基因序列(segment):
病毒Segment1,其含有RNA多聚酶PB2编码基因,藉由双重启动子能同时转录RNA多聚酶PB2的mRNA及病毒RNA(vRNA),
病毒Segment2,其含有RNA多聚酶PB1编码基因,藉由双重启动子能同时转录RNA多聚酶PB1的mRNA及病毒RNA(vRNA),
病毒Segment3,其含有RNA多聚酶PA编码基因,藉由双重启动子能同时转录RNA多聚酶PA的mRNA及病毒RNA(vRNA),
病毒Segment4,其含有血凝素HA的编码基因,藉由双重启动子能同时转录血凝素HA的mRNA及病毒RNA(vRNA),
病毒Segment5,其含有核外壳核蛋白NP编码基因,藉由双重启动子能同时转录核外壳核蛋白NP的mRNA及病毒RNA(vRNA),
病毒Segment6,其含有神经酰胺酶NA编码基因,藉由双重启动子能同时转录神经酰胺酶NA的mRNA及病毒RNA(vRNA),
病毒Segment7,其含有基质蛋白M1编码基因+基质蛋白M2编码基因,藉由双重启动子能同时转录基质蛋白(M1+M2)的mRNA及病毒RNA(vRNA),
病毒Segment8,其含有非结构蛋白NS1编码基因+核转运蛋白NEP(NS2)编码基因,藉由双重启动子能同时转录NS1和NEP蛋白的mRNA及病毒RNA(vRNA)。
在另一优选例中,所述突变型RNA多聚酶PB1的氨基酸序列,对应于如SEQID NO:8中第1-757位所示的氨基酸序列,第621位由Q突变为K或者R;
所述的突变型流感病毒RNA多聚酶PA的氨基酸序列,对应于如SEQ ID NO:7中第1-716位所示的氨基酸序列,第237位由E突变为K或者R;
所述的突变型流感病毒核外壳核蛋白NP的氨基酸序列,对应于如SEQ ID NO:11中第1-498位所示的氨基酸序列,第377位由S突变为N;和/或
所述的突变型流感病毒非结构蛋白NS1的氨基酸序列,对应于如SEQ ID NO:3中第1-230位所示的氨基酸序列,第165位由S突变为Y。
在另一优选例中,所述的血凝素HA、神经酰胺酶NA、基质蛋白M1、基质蛋白M2、RNA多聚酶PB2、核转运蛋白NS2的编码基因可以是野生型蛋白的编码基因,或是突变型蛋白的编码基因。较佳地,这些蛋白来源于PR8病毒。
在另一优选例中,所述的血凝素HA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第1-565位所示;所述的神经酰胺酶NA的氨基酸序列如SEQ ID NO:2中第1-454位所示;所述的基质蛋白M1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5中第1-252位所示;所述的基质蛋白M2的氨基酸序列如SEQID NO:6中第1-97位所示;所述的RNA多聚酶PB2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10中第1-759位所示;或所述的核转运蛋白NS2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4中第1-121位所示。
在另一优选例中,所述的病毒包装细胞是哺乳动物细胞;较佳地,所述的病毒包装细胞包括但不限于:293T细胞,Vero细胞,MDCK细胞,COS-1细胞或PER.C6细胞。
在本发明的另一方面,提供一种用于制备重组甲型流感病毒株的试剂盒,所述试剂盒中包括:病毒拯救系统,其包含甲型流感病毒拯救所需的流感病毒拯救质粒,能实现甲型流感病毒拯救;所述的流感病毒拯救质粒中,
RNA多聚酶PB1的编码基因是突变型基因,其编码突变型RNA多聚酶PB1,氨基酸序列第621位由Q突变为K或者R;
RNA多聚酶PA的编码基因是突变型基因,其编码突变型RNA多聚酶PA,氨基酸序列第237位由E突变为K或者R;
核外壳核蛋白NP的编码基因是突变型基因,其编码突变型核外壳核蛋白NP,氨基酸序列第377位由S突变为N;和/或
非结构蛋白NS1的编码基因是突变型基因,其编码突变型非结构蛋白NS1,氨基酸序列第165位由S突变为Y。
在一个优选例中,所述的试剂盒还包括:病毒包装细胞。
在另一优选例中,所述的病毒包装细胞是哺乳动物细胞;较佳地,所述的病毒包装细胞包括(但不限于):Vero细胞,293T细胞,MDCK细胞,COS-1细胞,PER.C6细胞。
在另一优选例中,所述的试剂盒中还包括:基因转染试剂,病毒包装细胞的培养基等。
在本发明的另一方面,提供所述的试剂盒的用途,用于制备重组甲型流感病毒株,其是哺乳动物细胞适应性的甲型流感病毒株。
在本发明的另一方面,提供一种突变型甲型流感病毒核外壳核蛋白(NP),该蛋白的氨基酸序列对应于如SEQ ID NO:11中第1-498位所示的野生型核外壳核蛋白(NP)氨基酸序列,第377位由S突变为N。
在本发明的另一方面,提供一种突变型甲型流感病毒非结构蛋白NS1蛋白,该蛋白的氨基酸序列对应于如SEQ ID NO:3中第1-230位所示的野生型非结构蛋白NS1氨基酸序列,第165位由S突变为Y。
在本发明的另一方面,提供一种突变型甲型流感病毒RNA多聚酶PA蛋白,该蛋白的氨基酸序列对应于如SEQ ID NO:7中第1-716位所示的野生型RNA多聚酶PA蛋白氨基酸序列,第237位由E突变为K或者R。
在本发明的另一方面,提供一种突变型甲型流感病毒RNA多聚酶PB1蛋白,该蛋白的氨基酸序列对应于如SEQ ID NO:8中第1-757位所示的野生型RNA多聚酶PB1蛋白氨基酸序列,第621位由Q突变为K或者R。
在本发明的另一方面,提供一种多核苷酸,其编码前面任一所述的蛋白。
在本发明的另一方面,提供前面任一所述的蛋白或其编码基因的用途,用于制备重组甲型流感病毒株,其是哺乳动物细胞适应性的甲型流感病毒株。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1:PR8-p20比PR8在Vero细胞上生长速度明显变快。A、空斑实验结果,B、生长曲线。
图2:内部病毒基因足以支持PR8-p20的快速生长特性。A、空斑实验结果,B、生长曲线。
图3:内部病毒基因中,NP、PB1、PA、NS对PR8-p20骨架在Vero细胞上的快速生长特性都有贡献。A、C空斑实验结果,B、D生长曲线。
图4:PR8-4mut在Vero细胞上具有与PR8-p20骨架相当的生长速度。
图5:高产毒株没有提高病毒在小鼠器官中的复制能力。
图6:高产毒株没有改变病毒的胰酶依赖性。
图7:高产PR8-4mut骨架能够提高禽病毒(H7N1,H9N2)疫苗株在Vero细胞上的生长速度。A、空斑实验结果,B、C生长曲线。
图8:高产骨架PR8-4mut能够一定程度的提高病毒(PR8,H7N1,H9N2)在MDCK细胞(A、空斑实验结果,B、生长曲线)和鸡胚(C、生长曲线)上的生长速度。
图9、进一步的氨基酸性质相似或相反的突变对于病毒生长特性的改变情况分析。
图10、高产毒株PR8-4mut在Vero细胞中的稳定性分析的测序结果。
具体实施方式
本发明涉及甲型流感病毒(Influenza A virus)疫苗株在哺乳动物细胞(如Vero细胞)中作适应性传代的方法和决定其获得适应性的病毒蛋白氨基酸位点。本发明人通过将现有的流感疫苗骨架毒株PR8毒株在Vero细胞上进行连续传代,得到了哺乳动物细胞株适应毒株,该适应毒株编码的内部病毒蛋白上的四个氨基酸位点:NP S377N,PB1Q621R(或Q621K),PA E237K(或E237R),NS1S165Y,贡献了适应毒株的适应性。以含有上述四个突变位点的毒株作为疫苗骨架株可以得到哺乳动物细胞高产的疫苗种子株。该适应毒株在活体包括鸡胚和小鼠上的致病力没有增强,却大大提高了其对哺乳动物细胞的适应性。
病毒蛋白及编码基因
本发明涉及贡献了流感病毒在哺乳动物细胞中的生长适应性的四个突变型病毒蛋白,即突变型NP蛋白,突变型PB1蛋白,突变型NS1蛋白,突变型PA蛋白。较佳地,上述突变型蛋白是在来源于PR8病毒的野生型蛋白基础上进行突变的。
作为本发明的优选方式,所述的突变型NP蛋白,其氨基酸序列对应于如SEQID NO:11中第1-498位所示的野生型NP蛋白的氨基酸序列,第377位由S突变为N。
作为本发明的优选方式,所述的突变型PB1蛋白,其氨基酸序列对应于如SEQIDNO:8中第1-757位所示的野生型PB1蛋白的氨基酸序列,第621位由Q突变为K或者R。
作为本发明的优选方式,所述的突变型NS1蛋白,其氨基酸序列对应于如SEQIDNO:3中第1-230位所示的野生型NS1蛋白的氨基酸序列,第165位由S突变为Y。
作为本发明的优选方式,所述的突变型PA蛋白,其氨基酸序列对应于如SEQID NO:7中第1-716位所示的野生型PA蛋白的氨基酸序列,第237位由E突变为K或者R。
本发明还包括上述各突变型病毒蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的突变型病毒蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。但是,所述的片段、衍生物和类似物中,对应于NP的第377位(N),PB1的第621位(K或R),PA的第237位(K或R),NS1的第165位(Y)的氨基酸是保守的。
在本发明中,术语“突变型病毒蛋白”还包括具有与上述突变型NP、PB1、NS1或PA蛋白相同功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-20个,最佳地1-10个,还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。但是,这些变异形式中,对应于NP的第377位(N),PB1的第621位(K或R),PA的第237位(K或R),NS1的第165位(Y)的氨基酸是保守的。
深入的机制研究表明,各突变型病毒蛋白四个氨基酸位点是通过提升病毒聚合酶在被感染的哺乳动物细胞(如Vero细胞)中的活力赋予PR8-p20骨架在该细胞中更好的适应性。
此外,为了实现病毒的拯救,还需要其它多种蛋白,包括血凝素HA、神经酰胺酶NA、基质蛋白M1、基质蛋白M2、RNA多聚酶PB2、核转运蛋白NS2,这些蛋白对于病毒的哺乳动物细胞适应性没有太大的影响,它们可以是野生型蛋白,或是突变型蛋白;可以是来自PR8病毒的或其它病毒的。较佳地,所述的血凝素HA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第1-565位所示;所述的神经酰胺酶NA的氨基酸序列如SEQ ID NO:2中第1-454位所示;所述的基质蛋白M1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5中第1-252位所示;所述的基质蛋白M2的氨基酸序列如SEQIDNO:6中第1-97位所示;所述的RNA多聚酶PB2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10中第1-759位所示;或所述的核转运蛋白NS2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4中第1-121位所示。
本发明还包括上述病毒蛋白HA、NA、M1、M2、PB2、NS2的片段、衍生物和类似物。所述的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中,还包括上述病毒蛋白HA、NA、M1、M2、PB2、NS2的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-20个,最佳地1-10个,还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
本发明还提供了编码本发明突变型NP蛋白,突变型PB1蛋白,突变型NS1蛋白,突变型PA蛋白的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。术语“编码多肽(蛋白)的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明的编码突变型NP蛋白,突变型PB1蛋白,突变型NS1蛋白,突变型PA蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
重组的病毒拯救系统
本发明还涉及重组甲型病毒拯救系统,该系统包含甲型流感病毒拯救所需的流感病毒拯救质粒,能实现甲型流感病毒拯救。对于甲型流感病毒拯救系统,本领域技术人员是了解的,其包括了一系列病毒拯救质粒,所述病毒拯救质粒包含了可以实现流感病毒拯救的所有的元件(含病毒蛋白编码序列以及非编码序列),在转染细胞后可获得病毒蛋白相应的mRNA以及病毒RNA(vRNA),从而获得重组病毒。
目前,已经有一些商品化的流感病毒拯救质粒,例如pHW2000质粒,其含有polI和polII双重启动子,可以同时实现vRNA转录和mRNA表达。一个完整的病毒拯救系统,通常包括多个病毒拯救质粒,每一质粒上含有至少一种Segment,所述Segment包含至少一种蛋白编码基因,以及用于同时转录出病毒mRNA及病毒RNA(vRNA)的元件。病毒拯救技术目前已经成熟地被应用,例如可参考Erich Hoffmann等,Vaccine20(2002)3165-3170或Hoffmann,E.等,2000.Proc Natl Acad Sci U S A97:6108-6113。
作为本发明的优选方式,所述的病毒拯救质粒是polI-polII转录/表达载体,较佳地是pHW2000质粒。病毒拯救技术(Virus Rescue)是一种本领域熟知的技术因此本领域技术人员熟悉哪些病毒拯救质粒是可用的。因此,尽管优选pHW2000质粒,但其它与具有类似元件及类似功能的病毒拯救质粒也可应用于本发明中,例如pHH21。
作为本发明的优选方式,病毒拯救系统包含有8种病毒拯救质粒,分别装载所述的Segment1~Segment8。
当将各病毒拯救质粒转染病毒包装细胞,培养经转染的病毒包装细胞,可获得重组流感病毒株。
试剂盒
本发明还包括用于制备重组流感病毒株的试剂盒,所述试剂盒中包括:病毒拯救系统,其包含甲型流感病毒拯救所需的流感病毒拯救质粒,能实现甲型流感病毒拯救;所述的流感病毒拯救质粒中,RNA多聚酶PB1的编码基因是突变型基因,其编码突变型RNA多聚酶PB1,氨基酸序列第621位由Q突变为K或者R;RNA多聚酶PA的编码基因是突变型基因,其编码突变型RNA多聚酶PA,氨基酸序列第237位由E突变为K或者R;核外壳核蛋白NP的编码基因是突变型基因,其编码突变型核外壳核蛋白NP,氨基酸序列第377位由S突变为N;非结构蛋白NS1的编码基因是突变型基因,其编码突变型非结构蛋白NS1,氨基酸序列第165位由S突变为Y。
作为本发明的优选方式,所述的试剂盒中,病毒拯救质粒是pHW系列质粒;更佳地,所述pHW系列质粒为pHW2000质粒,包括8个pHW2000质粒,分别装载所述的Segment1~Segment8。
本领域技术人员在获得了所述的试剂盒后,可方便地通过病毒拯救技术,来制备获得重组流感病毒株,该重组流感病毒株是哺乳动物细胞适应性的。
作为本发明的优选方式,所述的试剂盒还包括:病毒包装细胞,作为所述的病毒拯救质粒的受体细胞。较佳地,所述的病毒包装细胞是哺乳动物细胞,例如但不限于Vero细胞,293T细胞,MDCK细胞,COS-1细胞,PER.C6细胞等。最佳地,所述的细胞是Vero细胞。
作为本发明的优选方式,所述的试剂盒还包括其它应用于进行病毒拯救的试剂以及周边试剂,例如但不限于基因转染试剂,PCR扩增试剂,质粒抽提试剂,病毒包装细胞的培养基等。更佳地,所述的试剂盒中还可包括说明使用方法和注意点的使用说明书。
本发明的主要优点在于:
本发明通过一系列病毒重组和增殖实验确定,内部病毒基因编码的病毒蛋白上的四个氨基酸位点:NP S377N,PB1Q621R(或K),PA E237K(或R),NS1S165Y,贡献了流感病毒适应株的在哺乳动物细胞生长适应性。这四个点突变不仅能提高PR8病毒的生长速度,也能提高其它亚型病毒与PR8骨架重组所得疫苗毒株的生长速度。这种生长速度的提升不仅局限于Vero细胞,在MDCK细胞等其它流感病毒培养介质中也有一定的提高。
通过小鼠和鸡胚致病力实验证明,本发明涉及的四个点突变不会增加病毒对小鼠或鸡胚的致死能力,也不会使病毒获得对哺乳动物神经毒性或者系统性感染能力。并且,改良病毒的抗原性和胰酶依赖性等指标没有发生改变。
本发明提供了一种高产、安全的哺乳动物细胞(如Vero细胞)适应的改良甲型流感疫苗株,对流感疫苗研究和生产具有重要价值。
本发明涉及甲型流感病毒(Influenza A virus)疫苗株在Vero细胞中作适应性传代的方法和决定其获得适应性的四个病毒氨基酸位点。细胞介质培养流感病毒获得疫苗用毒株是流感疫苗生产的必然趋势,Vero细胞因其安全性和可靠性被WHO推荐为流感疫苗生产的备选细胞株,但是大多数流感病毒在该细胞中的扩增能力都有限,因此提高流感疫苗毒株在哺乳动物细胞培养体系中,特别是Vero细胞中的生长速度,将在流感病毒疫苗生产中起到重要作作用。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
I.材料和方法
反向遗传学获得PR8病毒的方法
以八质粒反向遗传学拯救流感病毒的方法(Hoffmann,E.等,2000.A DNAtransfection system for generation of influenza A virus from eightplasmids.Proc Natl Acad Sci U S A97:6108-6113)拯救PR8病毒。简要地说,提供分别包含8条PR8病毒基因的反向遗传学表达质粒pHW2000(获自圣犹达儿童研究医院,田纳西大学,美国),即质粒pHW2000-PR8-HA(其中HA编码的多肽序列如SEQ ID NO:1),pHW2000-PR8-NA(其中NA编码的多肽序列如SEQ ID NO:2),pHW2000-PR8-NS(其中NS1编码的多肽序列如SEQ ID NO:3,NS2编码的多肽序列如SEQ ID NO:4),pHW2000-PR8-M(其中M1编码的多肽序列如SEQ ID NO:5、M2编码的多肽序列如SEQ ID NO:6),pHW2000-PR8-NP(其中NP编码的多肽序列如SEQ ID NO:11),pHW2000-PR8-PB1(其中PB1编码的多肽序列如SEQ ID NO:8,PB1-F2编码的多肽序列如SEQ ID NO:9),pHW2000-PR8-PB2(其中PB2编码的多肽序列如SEQ IDNO:10),pHW2000-PR8-PA(其中PA编码的多肽序列如SEQID NO:7),各病毒基因插入pHW2000的BsmBI位点。8种质粒以等量混合,每种质粒1ug,以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染在6cm培养皿中长至约90%单层的293T细胞(购自ATCC)。转染48小时后收取上清,感染MDCK细胞(购自ATCC),感染后48小时收取上清,在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化,得到的纯化病毒即为PR8病毒。病毒扩增后,进一步鉴定基因型,确定拯救过程中没有多余突变。
Vero细胞上连续传代的方法
Vero细胞(购自ATCC)在6cm培养皿长至约90%单层后将培液换成InfectionMedium(DMEM+0.2%BSA+1μg/ml TPCK-trypsin),PR8病毒以MOI=0.001感染该细胞。3天后,取出被感染的Vero细胞上清,记为第一代(P1),以1:1000的比例加入新的Vero细胞中,继续以Infection Medium培养3天,其上清记为P2。以此类推,连续传代至第10代(P10)和第20代(P20)的病毒收获冻存于-80℃。Vero细胞需要每24h补充加入1μg/ml TPCK-trypsin。
病毒空斑纯化、扩增和基因型鉴定
分别将病毒按10倍稀释度以PBS溶液做梯度稀释,稀释液加入6孔板中长至100%的MDCK单层细胞,37℃感染1h,随后每孔加入3ml的overlay培养基(1.5ml2×DMEM+1.5ml1.8%Agar+1μg/ml TPCK trypsin),待overlay培养基凝固后,在37℃、5%CO2的培养箱中培养48-72小时至形成肉眼可见的空斑。用枪头挑取单个病毒空斑至1ml PBS中,4℃放置4小时。将此含有单克隆病毒的PBS同上按10倍稀释度做稀释,重复一轮空斑纯化,两轮空斑纯化后的病毒于75cm2细胞培养瓶中单层MDCK细胞以Infection Medium扩增。
收获的病毒以RNeasy RNA抽提试剂盒(Qiagen,Chatsworth,CA)抽提病毒RNA,方法见试剂盒说明书(Cat No.52904),以M-MLV反转录酶(Invitrogen)和流感病毒基因组特异性引物Uni12(5’-AGCAAAAGCAGG-3’[SEQ ID NO:20])(Hoffmann,E.,J.Stech,Y.Guan,R.G.Webster,and D.R.Perez.2001.Universal primer set for the full-lengthamplification of all influenza A viruses.Arch Virol146:2275-89.)反转录,所得病毒cDNA使用含有BsmBI(Bm)或BsaI(Ba)或AarI(Aar)位点的流感病毒片段特异性通用引物进行PCR获得8条病毒基因(Hoffmann,E.,J.Stech,Y.Guan,R.G.Webster,andD.R.Perez.2001.Universal primer set for the full-length amplification of allinfluenza A viruses.Arch Virol146:2275-89),克隆至pHW2000载体,测序确定病毒基因序列。
流感病毒片段特异性通用引物序列如下:
用于扩增PB2的引物:
Ba-PB2-F:TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTC(SEQ ID NO:21);
Ba-PB2-R:ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT(SEQ ID NO:22);
用于扩增PB1的引物:
Aar-PB1-F:TATTCACCTGCTTTAGGGAGCGAAAGCAGGCA(SEQ ID NO:23);
Aar-PB1-R:ATATCACCTGCTTTGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT(SEQ IDNO:24);
用于扩增PA的引物:
Bm-PA-F:TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTAC(SEQ ID NO:25);
Bm-PA-R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT(SEQ ID NO:26);
用于扩增HA的引物:
Bm-HA-F:TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGG(SEQ ID NO:27);
Bm-HA-R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT(SEQ ID NO:28);
用于扩增NP的引物:
Ba-NP-F:TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGTA(SEQ ID NO:29);
Ba-NP-R:ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT(SEQ IDNO:30);
用于扩增NA的引物:
Ba-NA-F:TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGAGT(SEQ ID NO:31);
Ba-NA-R:ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT(SEQ IDNO:32);
用于扩增M的引物:
Bm-M-F:TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTAG(SEQ ID NO:33);
Bm-M-R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT(SEQ IDNO:34);
用于扩增NS的引物:
Bm-NS-F:TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGTG(SEQ ID NO:35);
Bm-NS-R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT(SEQ ID NO:36)。
RT-PCR
将提取的RNA中加入2μl5μg/ml的Uni12引物,混匀后70℃水浴5分钟。后将此混合物加入逆转录反应体系(M-MLV5×Buffer8μl,dNTP10mM2μl,RNase40U/μl1μl,M-MLV200U/μl2μl),37℃水浴1-2小时,95℃10分钟,得到cDNA产物。
PCR
将cDNA产物加入PCR反应体系(ddH2O36μl,10×PCR Buffer5μl,dNTP Mixture[2.5mM]4.0μl,primers[20μM]1.0μl/1.0μl,viral cDNA[100μg/ml]3.0μl,Fusion[FINNZYMES,Cat No.F530L]0.3μl)。按上述体系进行反应,先94℃变性2min,再按以下参数反应33个循环:94℃变性1min,55℃退火30sec,72℃延伸1min,最后72℃延伸7min。将PCR产物上样于DNA琼脂糖凝胶于紫外灯下割胶目的片段,使用胶回收试剂盒(AXYGEN,AxyPrepDNA Gel Extraction Kit,Cat No.AP-GX-250)得到病毒基因。
第20代病毒基因型鉴定
用RNeasy RNA抽提试剂盒抽提第20代病毒的RNA,然后用M-MLV反转录酶(Invitrogen)和Uni12引物(5’-AGCAAAAGCAGG-3’)进行RT-PCR反应,得到病毒cDNA;所得病毒cDNA使用含有BsmBI(Bm)或BsaI(Ba)或AarI(Aar)位点的流感病毒片段特异性通用引物以Fusion(FINNZYMES,Cat No.F530L)高保真DNA聚合酶进行PCR获得8条病毒基因,用BsmBI(Bm)或BsaI(Ba)或AarI(Aar)(NEB)酶切DNA产物后,用T4DNA连接酶(TAKARA)将酶切后产物连接至pHW2000载体(获自德国马尔堡菲利普斯大学),再直接转化感受态细胞(DH-5α),得到阳性克隆。对于每条病毒基因,挑取4-10个阳性克隆进行全长测序,测序结果总结在表1。
反向遗传学拯救PR8-p20病毒
反向遗传学方法同前所述。从第20代病毒基因鉴定时得到的4-10个阳性克隆中挑选包含所有有意突变、并能够代表绝大多数病毒基因型的克隆,记为pHW2000-PR8-p20-HA,pHW2000-PR8-p20-NA,pHW2000-PR8-p20-NS,pHW2000-PR8-p20-M,pHW2000-PR8-p20-NP,pHW2000-PR8-p20-PB1,pHW2000-PR8-p20-PB2,pHW2000-PR8-p20-PA(表2)。以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即,PR8-p20的基因HA、NA、NP、M、NS、PA、PB1、PB2)于6cm培养皿中长至约90%单层的293T细胞。转染48小时后收取上清,感染MDCK细胞,感染后48小时收取上清,在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化,测序确定得到的纯化病毒即为PR8-p20。病毒扩增后,进一步鉴定基因型,确定拯救过程中没有多余突变。
反向遗传学拯救PR8-p20HA/NA病毒的方法
反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-PR8-p20-HA,pHW2000-PR8-p20-NA,pHW2000-PR8-NS,pHW2000-PR8-M,pHW2000-PR8-NP,pHW2000-PR8-PB1,pHW2000-PR8-PB2,pHW2000-PR8-PA为转染质粒组合(也即,PR8-p20的基因HA和NA,以及PR8的基因NP、M、NS、PA、PB1、PB2),以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因于6cm培养皿中长至约90%单层的293T细胞。转染48小时后收取上清,感染MDCK细胞,感染后48小时收取上清,在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化,测序确定得到的纯化病毒即为PR8-p20HA/NA。病毒扩增后,进一步鉴定基因型,确定拯救过程中没有多余突变。
反向遗传学拯救PR8-p20骨架病毒的方法
反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-PR8-HA,pHW2000-PR8-NA,pHW2000-PR8-p20-NS,pHW2000-PR8-p20-M,pHW2000-PR8-p20-NP,pHW2000-PR8-p20-PB1,pHW2000-PR8-p20-PB2,pHW2000-PR8-p20-PA为转染质粒组合,以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即,PR8的基因HA和NA,PR8-p20的基因NP、M、NS、PA、PB1、PB2)于6cm培养皿中长至约90%单层的293T细胞。转染48小时后收取上清,感染MDCK细胞,感染后48小时收取上清,在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化,测序确定得到的纯化病毒即为PR8-p20骨架。病毒扩增后,进一步鉴定基因型,确定拯救过程中没有多余突变。
反向遗传学拯救PR8-p20NS病毒
反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-PR8-p20-NS,pHW2000-PR8-HA,pHW2000-PR8-NA,pHW2000-PR8-M,pHW2000-PR8-NP,pHW2000-PR8-PB1,pHW2000-PR8-PB2,pHW2000-PR8-PA为转染质粒组合,以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即,PR8-p20的基因NS,以及PR8的基因NP、HA、NA、M、PA、PB1、PB2)于6cm培养皿中长至约90%单层的293T细胞。转染48小时后收取上清,感染MDCK细胞,感染后48小时收取上清,在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化,测序确定得到的纯化病毒即为PR8-p20NS。病毒扩增后,进一步鉴定基因型,确定拯救过程中没有多余突变。
反向遗传学拯救PR8-p20NP病毒
反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-PR8-p20-NP,pHW2000-PR8-HA,pHW2000-PR8-NA,pHW2000-PR8-NS,pHW2000-PR8-M,pHW2000-PR8-PB1,pHW2000-PR8-PB2,pHW2000-PR8-PA为转染质粒组合,以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即,PR8-p20的基因NP,以及PR8的基因NS、HA、NA、M、PA、PB1、PB2)于6cm培养皿中长至约90%单层的293T细胞。转染48小时后收取上清,感染MDCK细胞,感染后48小时收取上清,在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化,测序确定得到的纯化病毒即为PR8-p20NP。病毒扩增后,进一步鉴定基因型,确定拯救过程中没有多余突变。
反向遗传学拯救PR8-p20PA病毒
反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-PR8-p20-PA,pHW2000-PR8-HA,pHW2000-PR8-NA,pHW2000-PR8-NS,pHW2000-PR8-M,pHW2000-PR8-NP,pHW2000-PR8-PB1,pHW2000-PR8-PB2为转染质粒组合,以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即,PR8-p20的基因PA,以及PR8的基因NP、HA、NA、M、NS、PB1、PB2)于6cm培养皿中长至约90%单层的293T细胞。转染48小时后收取上清,感染MDCK细胞,感染后48小时收取上清,在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化,测序确定得到的纯化病毒即为PR8-p20PA。病毒扩增后,进一步鉴定基因型,确定拯救过程中没有多余突变。
反向遗传学拯救PR8-p20PB1病毒
反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-PR8-p20-PB1,pHW2000-PR8-HA,pHW2000-PR8-NA,pHW2000-PR8-NS,pHW2000-PR8-M,pHW2000-PR8-NP,pHW2000-PR8-PB2,pHW2000-PR8-PA为转染质粒组合,以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即,PR8-p20的基因PB1,以及PR8的基因NP、HA、NA、M、NS、PA、PB2)于6cm培养皿中长至约90%单层的293T细胞。转染48小时后收取上清,感染MDCK细胞,感染后48小时收取上清,在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化,测序确定得到的纯化病毒即为PR8-p20PB1。病毒扩增后,进一步鉴定基因型,确定拯救过程中没有多余突变。
反向遗传学拯救PR8-p20PB2病毒
反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-PR8-p20-PB2,pHW2000-PR8-HA,pHW2000-PR8-NA,pHW2000-PR8-NS,pHW2000-PR8-M,pHW2000-PR8-NP,pHW2000-PR8-PB2,pHW2000-PR8-PA为转染质粒组合,以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即,PR8-p20的基因PB2,以及PR8的基因NP、HA、NA、M、NS、PA、PB1)于6cm培养皿中长至约90%单层的293T细胞。转染48小时后收取上清,感染MDCK细胞,感染后48小时收取上清,在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化,测序确定得到的纯化病毒即为PR8-p20PB2。病毒扩增后,进一步鉴定基因型,确定拯救过程中没有多余突变。
反向遗传学拯救PR8-NP N309H和PR8-NP S377N病毒
首先构建包含单个点突变S377N或者N309H的pHW2000-NP质粒。根据产品说明书(Cat No200518)利用QuickChange试剂盒(Stratagene)构建突变。简要的说,先设计一对退火温度在78℃左右的包含突变位点的引物(列在下方),然后直接使用此引物,以质粒pHW2000-PR8-NP作为模版进行PCR,所得到的产物用DpnI(NEB)酶切1小时,将PCR产物直接传化感受态细胞(DH-5α),所鉴定的阳性克隆既是含有突变后的质粒,即为pHW2000-PR8-NP-N309H,pHW2000-PR8-NP-S377N。突变引物:
NP N309H:
正向:TTTCAGACTGCTTCAAcACAGCCAAGTGTA(SEQ ID NO:37);
反向:TACACTTGGCTGTGTTGAAGCAGTCTGAAA(SEQ ID NO:38);
NP S377N:
正向:AGACTATGGAATCAAaTACACTTGAACTGAG(SEQ ID NO:39);
反向:CTCAGTTCAAGTGTATTTGATTCCATAGTCT(SEQ ID NO:40)。
反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-PR8-NP-N309H,pHW2000-PR8-HA,pHW2000-PR8-NA,pHW2000-PR8-NS,pHW2000-PR8-M,pHW2000-PR8-PB1,pHW2000-PR8-PB2,pHW2000-PR8-PA为转染质粒组合,以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即,PR8的基因NP、HA、NA、M、NS、PA、PB1、PB2,且其中NP基因编码的NP蛋白第309位发生由N至H的突变(N309H))于6cm培养皿中长至约90%单层的293T细胞。转染48小时后收取上清,感染MDCK细胞,感染后48小时收取上清,在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化,测序确定得到的纯化病毒即为PR8-NP N309H。病毒扩增后,进一步鉴定基因型,确定拯救过程中没有多余突变。
反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-PR8-NP-S377N,pHW2000-PR8-HA,pHW2000-PR8-NA,pHW2000-PR8-NS,pHW2000-PR8-M,pHW2000-PR8-PB1,pHW2000-PR8-PB2,pHW2000-PR8-PA为转染质粒组合,以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即,PR8的基因NP、HA、NA、M、NS、PA、PB1、PB2,且其中NP基因编码的NP蛋白第377位发生由S至N的突变(S377N)),在6cm培养皿中长至约90%单层的293T细胞。转染48小时后收取上清,感染MDCK细胞,感染后48小时收取上清,在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化,测序确定得到的纯化病毒即为PR8-NP S377N。病毒扩增后,进一步鉴定基因型,确定拯救过程中没有多余突变。
反向遗传学拯救PR8-4mut病毒
反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-PR8-NP-S377N,pHW2000-PR8-p20-NS,pHW2000-PR8-p20-PB1,pHW2000-PR8-p20-PA,pHW2000-PR8-HA,pHW2000-PR8-NA,pHW2000-PR8-M,pHW2000-PR8-PB2为转染质粒组合,以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即,PR8的NP基因且该NP基因编码的NP蛋白第377位发生由S至N的突变(S377N)、HA、NA、M、PB2,PR8-p20的NS、PB1、PA)于6cm培养皿中长至约90%单层的293T细胞。转染48小时后收取上清,感染MDCK细胞,感染后48小时收取上清,在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化,测序确定得到的纯化病毒即为PR8-4mut。病毒扩增后,进一步鉴定基因型,确定拯救过程中没有多余突变。
反向遗传学拯救PR8-4mut-H7N1病毒
首先,A/turkey/Italy/1265/1999(H7N1)(获自德国马尔堡菲利普斯大学)的HA(核苷酸序列如SEQ ID NO:16中所示的核苷酸序列为模板以Bm-HA-F和Bm-HA-R为引物获得该基因)、NA(核苷酸序列如SEQ ID NO:17中所示的核苷酸序列为模板以Ba-NA-F和Ba-NA-R为引物获得该基因)基因以酶切位点为BsmBI或BsaI的流感病毒片段特异性通用引物(已列在前文)克隆至pHW2000载体,即为pHW2000-H7N1-HA,pHW2000-H7N1-NA。
反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-H7N1-HA,pHW2000-H7N1-NA,pHW2000-PR8-NP-S377N,pHW2000-PR8-p20-NS,pHW2000-PR8-p20-PB1,pHW2000-PR8-p20-PA,pHW2000-PR8-M,pHW2000-PR8-PB2为转染质粒组合,以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即,H7N1的基因HA、NA,PR8的NP基因且该NP基因编码的NP蛋白第377位发生由S至N的突变(S377N)、M、PB2,以及PR8-p20的基因NS、PB1、PA)于6cm培养皿中长至约90%单层的293T细胞。转染48小时后收取上清,感染MDCK细胞,感染后48小时收取上清,在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化,测序确定得到的纯化病毒即为PR8-4mut-H7N1。病毒扩增后,进一步鉴定基因型,确定拯救过程中没有多余突变。
反向遗传学拯救PR8-4mut-H9N2病毒
首先,A/chicken/Jiangsu/7/2002(H9N2)(获自上海生物制品所)的HA(核苷酸序列如SEQ ID NO:18中所示的核苷酸序列为模板以Bm-HA-F:和Bm-HA-R:为引物获得该基因),NA(核苷酸序列如SEQ ID NO:19中所示的核苷酸序列为模板以Ba-NA-F:和Ba-NA-R:为引物获得该基因)基因以酶切位点为BsmBI或BsaI的流感病毒片段特异性通用引物(已列在前文)克隆至pHW2000载体,即为pHW2000-H9N2-HA,pHW2000-H9N2-NA。
反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-H9N2-HA,pHW2000-H9N2-NA,pHW2000-PR8-NP-S377N,pHW2000-PR8-p20-NS,pHW2000-PR8-p20-PB1,pHW2000-PR8-p20-PA,pHW2000-PR8-M,pHW2000-PR8-PB2为转染质粒组合,以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即,H9N2的基因HA、NA、PR8的NP基因且该NP基因编码的NP蛋白第377位发生由S至N的突变(S377N)、M、PB2,以及PR8-p20的基因NS、PB1、PA)于6cm培养皿中长至约90%单层的293T细胞。转染48小时后收取上清,感染MDCK细胞,感染后48小时收取上清,在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化,测序确定得到的纯化病毒即为PR8-4mut-H7N1。病毒扩增后,进一步鉴定基因型,确定拯救过程中没有多余突变。
空斑免疫染色
病毒空斑免疫染色法依据文献(Matrosovich,M.等,New low-viscosity overlaymedium for viral plaque assays.Virol J3:63)操作。简要地说,Vero或者MDCK细胞在12孔板中培养至100%单层,吸出培养液,PBS洗一遍,将病毒按10倍稀释度做梯度稀释,每孔加入400μl病毒稀释液37℃感染30分钟。30分钟后,吸出病毒感染液,每孔加入2ml Overlay培养液(1:1体积比的2×DMEM[Gibco]:2.4%Avicel[FMC BioPolymer],以及终浓度1μg/mlTPCK-trypsin[Sigma]和50unit/ml青霉素[Invitrogen],50μg/ml链霉素[Invitrogen]),37℃、5%CO2的培养箱中培养48-72小时。取出12孔板,吸出Overlay培养液,PBS洗两遍,加入含有4%多聚甲醛的PBS溶液固定1小时后,吸出固定液,PBS洗三遍,每次5分钟。随后加入穿膜液(含有0.3%Tritian X-100的PBS),室温放置30分钟。吸出穿膜液,PBS洗三遍,每次5分钟,然后加入带有辣根过氧化物酶直标的抗NP蛋白的多抗(中国科学院上海生命科学研究院抗体中心提供),室温放置1小时。吸出抗体后用含有0.05%Tween-20的PBS洗三次,每次5分钟。最后加入True Blue底物(KPL)进行显色,空斑外围被感染的细胞为蓝色,拍照后用Photoshop软件将图片颜色调整为黑白两色。
病毒滴定
以空斑免疫染色方法,计下空斑数目在10左右的孔中的空斑数目,根据该孔所对应的稀释浓度和感染量,计算得到每ml病毒液含有可形成空斑的病毒量(pfu/ml)。
病毒在细胞中的生长曲线
细胞在6cm培养皿中长至100%单层,以MOI=0.001接种病毒,37℃感染1小时,吸出感染液,加入4ml Infection Medium(DMEM[Gibco]+0.2%BSA+1μg/mlTPCK-trypsin[Sigma]),于37℃、5%CO2的培养箱中培养。在感染后2,24,48,72,96小时各收取含有病毒的细胞上清40μl置入-80℃冰箱中冻存。Vero细胞需要每24h补充加入1μg/ml TPCK-trypsin。病毒滴度在MDCK细胞上滴定,结果按时间绘制成曲线。
血凝抑制实验
小鼠血清取自PR8病毒免疫过的小鼠或者空白小鼠。0.1ml血清加0.4ml受体破坏酶(RDE,购自中国疾控中心),37℃过夜。56℃灭活30分钟,再加0.5ml PBS至终浓度为10-1稀释度。处理好的血清在96孔板中2倍梯度稀释,稀释度从2-1至2-10。病毒定量按照以下方法进行:病毒用1%的鸡红细胞按照标准步骤做HA滴定。能引起完全血凝的最高稀释度为滴定终点,此稀释度为1HA单位/50μl。此稀释度往前数3个稀释度即为4HA单位/25μl。每孔加入25μl包含4HA单位的指定病毒与稀释好的血清混合,37℃孵育1小时使其充分相互作用,每孔加入50μl1%鸡红细胞,室温静置30分钟。血清的血凝抑制滴度是能够抑制红细胞凝集的最高稀释度的倒数(Kendal A,P.M.,&Skehel J.1982.Concepts and procedures forlaboratory-based influenza surveillance..Geneva:World Health Organization.)。
鸡胚致死实验
10日龄SPF级别鸡胚(购自山东SPF实验种鸡场),照蛋确定鸡胚活力,将100μl10倍梯度稀释的病毒,106PFU/胚到102PFU/胚,接种至鸡胚尿囊腔,观察鸡胚存活至接种后48小时。ELD50按照Reed&Muench方法计算(Matsuoka,Y.等,2009.The mouse model forinfluenza.Curr Protoc Microbiol Chapter15:Unit15G3)。
小鼠实验
病毒的小鼠半数致死量(MLD50)按照以下方法进行测定。6-8周龄SPF级别BALB/c雌性小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司),每5只为一组,乙醚麻醉,再将10倍梯度稀释的病毒液50μl(含有1×104到1×101病毒)通过鼻腔接种滴入小鼠肺部,每天观察小鼠体重变化至感染后第14天。在此14天内,若当小鼠出现明显的病症,比如竖毛和蜷缩,体重下降又超过25%时,即判定小鼠死亡,并因人道主义因素对小鼠实行安乐死(先用乙醚麻醉小鼠后颈部脱臼致死)。MLD50按照Reed&Muench方法计算(Matsuoka,Y.,E.W.Lamirande,andK.Subbarao.2009.The mouse model for influenza.Curr Protoc MicrobiolChapter15:Unit15G3.)。
小鼠体内的病毒滴度按照以下方法进行测定。6-8周龄BALB/c雌性小鼠,每3只为一组,用含有1×105病毒的病毒液50μl通过鼻腔接种滴入小鼠肺部,分别于感染后第三天和第六天进行取样检测。将小鼠用颈部脱臼法处死后,解剖小鼠并取出肺、脑、脾脏,放入2ml离心管中,再置入-80℃冰箱冻存。滴定当日,按组织重量培养液1:10的比例加入DMEM培养液(含有50unit/ml青霉素[Invitrogen],50μg/ml链霉素[Invitrogen]),1mm研磨珠,再在研磨器中研磨1分钟,冰浴,最后梯度稀释病毒,并在MDCK细胞上进行滴定。
病毒在鸡胚中的生长曲线
10日龄SPF级别鸡胚(购自山东SPF实验种鸡场),以1000pfu/胚将病毒接种至鸡胚尿囊腔中,37℃鸡胚培养箱中培养,在接种后12,24,36,48,72和96小时分别取出相应鸡胚,收获尿囊液-80℃冻存,尿囊液中的病毒滴度在MDCK细胞上滴定,结果按时间绘制成曲线。每个时间点每个病毒的数据至少包含4只鸡胚。
II.实施例
实施例1、PR8在Vero细胞中连续传代得到生长速度大大加快的适应株PR8-p20
PR8在Vero细胞中生长速度较慢,感染后48h只能形成很小的空斑(图1A)。在1μg/μl TPCK-trypsin存在条件下,以MOI=0.001接种,24h之后,病毒滴度只有104.5PFU/ml,至少需要48h病毒滴度才能达到峰值约106.5PFU/ml(图1B)。这样的生长速度难以满足疫苗生产需求。
因此,本发明人通过在Vero细胞上连续传代的方法,得到生长速度提高的PR8病毒Vero适应株。在Vero细胞上传10代后,PR8所形成的空斑明显变大。传20代后,PR8可以形成更大的空斑。将传代20代以后的毒株,抽取病毒RNA,反转录得到病毒cDNA,克隆至反向遗传学表达载体pHW2000中,进行病毒基因型鉴定,鉴定到的各基因的突变位点见表1。随后,以克隆在反向遗传学表达载体pHW2000中的、包含所有有意突变、并能够代表第20代单克隆病毒中的绝大多数病毒基因型的病毒基因,利用反向遗传学方法拯救第20代适应株,命名为PR8-p20,见表2。
PR8-p20感染Vero48h后,就可以形成大而清晰的空斑(图1A)。在1μg/μlTPCK-trypsin存在条件下,以MOI=0.001接种,24h之后病毒滴度达到107.5PFU/ml,48h之后病毒滴度可以达到峰值约108PFU/ml(图1B)。
以上数据表明,PR8-p20在Vero细胞上获得了适应性,生长速度和峰值滴度均大幅提高。
表1、PR8病毒、第20代细胞上清中的病毒混和物和反向遗传学重组得到的PR8-p20的全基因组测序比较
*含有突变的克隆数/挑取的总克隆数
+含有此突变,-不含有此突变
表2、拯救PR8-p20的克隆与PR8相比所包含的点突变
实施例2、内部病毒基因足以支持PR8-p20的快速生长特性
为了找出使PR8-p20获得适应性的突变位点,本发明人对PR8和PR8-p20进行了全基因组测序,发现共有13个氨基酸位点突变,分布在HA,NA,NS1,NP,PA,PB1和PB2七个蛋白上(表1)。考虑到需要获得高产PR8骨架,因此本发明人考察了到底是外部还是内部病毒基因贡献了PR8-p20的快速生长特性。
本发明人构建了两株重组病毒,一株病毒含有PR8-p20的外部基因HANA,而内部6条基因(NP、M、NS、PA、PB1、PB2)来自PR8,命名为PR8-p20HA/NA。
另一株病毒HA和NA来自PR8,而内部6条基因(NP、M、NS、PA、PB1、PB2)来自PR8-p20,命名为PR8-p20骨架。
空斑实验表明(图2A),PR8-p20HA/NA和PR8-p20骨架都可以形成比PR8大而且清晰的空斑。生长曲线实验(图2B)同样显示PR8-p20HA/NA和PR8-p20骨架都比PR8生长速度更快并能达到更高的峰值病毒滴度。但是不论从空斑形态和生长曲线都可以看出,PR8-p20骨架的特性相比较于PR8-p20HA/NA更接近PR8-p20。
以上数据说明,PR8-p20的内部骨架基因(NP、M、NS、PA、PB1、PB2)足够支持其快速生长的特性。
实施例3、聚合酶和NS1蛋白上的四个点突变决定了PR8-p20骨架的快速生长特性
为了进一步确定对PR8-p20骨架快速生长特性有贡献的点突变,本发明人针对携带突变的五条基因,分别构建了单基因重组病毒,命名为PR8-p20NS,PR8-p20NP,PR8-p20PA,PR8-p20PB1和PR8-p20PB2;以及单点突变病毒PR8-NP S377N和PR8-NP N309H。
通过在Vero细胞上的空斑(图3A)和生长曲线实验(图3B)评价这些病毒的生长特性。结果表明,PR8-p20NP和PR8-p20PB1能够形成比PR8明显更大、更清晰的空斑,生长速度也明显加快。PR8-p20NS和PR8-p20PA的生长速度比PR8略有加快。而PR8-p20PB2的生长速度比PR8没有提高。因为PB1、PA、NS三条基因上各只含有一个有义点突变(氨基酸突变位点为:PB1Q621R,PA E237K和NS1S165Y),以上数据说明了这三个点突变的贡献。
在NP上有两个点突变N309H和S377N,通过构建单点突变病毒PR8-NPS377N和PR8-NP N309H并在Vero细胞评价其生长特性(图3C,D),本发明人进一步区分了这两个点突变的贡献。PR8-NP S377N显示出更快的生长速度,而PR8-NP N309H没有这种作用。
本发明人又将以上有贡献的四个点突变联合起来,构建了含有这四个点突变的重组病毒,命名为PR8-4mut。实验表明,PR8-4mut在Vero细胞上具有与PR8-p20骨架相当的生长速度(图4A,B)。
以上结果说明,NP S377N,PB1Q621R,PA E237K和NS1S165Y四个点突变贡献了PR8-p20骨架的快速生长特性,将这四个点突变引入到PR8,可以得到与PR8-p20骨架生长速度相当的病毒PR8-4mut。
实施例4、高产PR8-p20和PR8-4mut毒株没有提高病毒对鸡胚和小鼠的致病力
在哺乳动物细胞培养体系中,PR8高产株(PR8-p20,PR8-4mut)具有比PR8野生型病毒更快的生长速度,本发明人需要衡量它对哺乳动物和禽类的致病力是否也相应提高,这对疫苗安全生产具有重要意义。
为了衡量PR8高产株(PR8-p20,PR8-4mut)对鸡胚的致死力是否有变化,本发明人测定了PR8,PR8-p20和PR8-4mut三株病毒的鸡胚半数致死量(ELD50),结果表明三株病毒的ELD50没有显著差异(表3),这说明PR8高产株不会提高病毒对鸡胚的致病力。本发明人用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠测定了PR8,PR8-p20和PR8-4mut三株病毒的小鼠半数致死量(MLD50)(表3)。结果表明,三株病毒的MLD50总体差异不大。
表3、三株病毒的抗原性,ELD50,MLD50数据未有显著差别
为了进一步确定病毒在小鼠各器官中的复制能力,本发明人用固定量病毒(105pfu)感染小鼠,3天、6天后取肺、脑、脾,研磨匀浆,在MDCK细胞上滴定其病毒含量(图5)。结果表明,三株病毒在感染后3天、6天在小鼠肺中的病毒滴度相当,而在脑和脾中均未检测到病毒存在,说明PR8高产株没有获得神经毒性或者系统性感染能力。以上结果表明,PR8高产株不会提高病毒的致病力,这对疫苗生产安全是一个有力的保证。
实施例5、高产PR8骨架没有改变病毒的胰酶依赖性和抗原性
流感病毒是否依赖外部添加的Trypsin而形成空斑的能力是衡量病毒毒力的重要指标,不依赖Trypsin的病毒对哺乳动物具有潜在的系统性感染能力。
空斑实验结果表明,PR8高产株(PR8-p20,PR8-4mut)依然需要依赖外加Trypsin形成空斑(图6),这进一步说明其致病力没有提高。
PR8作为疫苗骨架毒株,其安全性已经得到证实。本发明人通过血凝抑制实验(HI)测定了PR8高产株的抗原性,结果表明PR8高产株的抗原性与PR8野生型没有显著区别(表3),这也说明PR8高产株不会对已经对PR8野生型具有潜在免疫的人群产生新的威胁。
实施例6、以高产PR8骨架重组得到的禽流感病毒疫苗株能够在Vero上的快速生长
为了确定Vero细胞高产PR8骨架是否具有广泛适应性,本发明人把两株其它亚型的HA、NA基因(A/turkey/Italy/1265/1999(H7N1),A/Guangzhou/333/99(H9N2))分别装载到含有以上四个点突变的PR8骨架(PR8-4mut)上,PR8-4mut-H7N1和PR-4mut-H9N2病毒,并在Vero细胞上检测其生长特性(图7)。
结果表明,装载到PR8-4mut骨架上的病毒具有比装载到PR8骨架上的病毒更快的生长速度,能形成更大更清晰的空斑。
以上结果说明,以高产PR8骨架重组得到的禽流感病毒疫苗株能够在Vero上的快速生长。
实施例7、高产PR8骨架株可以一定程度上增强病毒在MDCK和鸡胚上的生长
现有的流感疫苗厂商也有在继续使用鸡胚和使用MDCK细胞作为培养介质,为了验证本发明人研发的Vero细胞适应病毒株是否具有广谱的适应功效,本发明人同时比较了原始毒株和高产毒株在MDCK和鸡胚中的生长情况。
结果表明(图8),高产毒株PR8-4mut在MDCK和鸡胚中的生长速度有显著的提升,但是相比较于在Vero细胞中的提升幅度,在MDCK和鸡胚中的提升作用相对较低。这说明,本发明人得到的Vero细胞高产病毒株具有较强的Vero细胞适应性,但也具有可应用于其它培养介质的潜力。
实施例8、高产突变位点的氨基酸性质研究
为了研究决定高产毒株PR8-4mut突变位点的四个氨基酸性质,本发明人分别对四个氨基酸进行了多种突变分析,其中将NP蛋白的N377变成A377或者T377,将PB1蛋白的R621变成A621或者K621,将PA蛋白的K237变成A237,R237或者H237,将NS1蛋白Y165变成A165或者F165。与前述同样的方法,构建在PR8-4mut基础上还含有任一上述氨基酸替换的重组病毒,获得PR8-4mut-NPA377、PR8-4mut-NP T377,PR8-4mut-PB1K621、PR8-4mut-PB1A621,PR8-4mut-PAR237、PR8-4mut-PA H237、PR8-4mut-NS1A165、PR8-4mut-NS1F165。将所构建的含有所述突变的重组病毒在Vero细胞上进行空斑比较,结果表明,氨基酸性质相似的突变如PB1K621和PA R237可以维持和PR8-4mut中PB1R621,PA K237相似的高生长特性(图9)。
上述结果说明,本发明人所得到的适应性高产毒株PR8-4mut携带的突变位点是特异性的,当突变为其他氨基酸时,可能会不同程度的削弱其高产特性,但较为相似的氨基酸突变,如K和R的替换,会保持其高产特性。
实施例9、高产毒株PR8-4mut在Vero细胞中的稳定性较高
在疫苗生产过程中,疫苗株的稳定性是保持高产特性的重要考量标准。本发明人在Vero细胞中检测了所述的高产毒株PR8-4mut的稳定性。在Vero细胞中连续传代3代,每代培养48小时。
结果显示,该病毒在Vero细胞上已经达到了最佳的适应性,继续传代培养后未发生其它突变,其原有的与高产特性有关的突变位点保持不变(图10)。
结论
本发明通过将PR8毒株在Vero细胞上连续传代的方法,找到了提高病毒在哺乳动物细胞如Vero细胞培养体系中生长速度的四个氨基酸位点突变,即:NPS377N,PB1Q621R,PAE237K,NS1S165Y。这四个点突变可以大大提高PR8毒株及其以PR8为骨架的其它亚型疫苗毒株在哺乳动物细胞培养体系(包括Vero细胞和MDCK细胞)中的产量,而不会提高其对哺乳动物和鸡胚的致病能力。本发明提供了一种高产、安全的,以哺乳动物细胞为培养介质的,适应性改良疫苗病毒株,对疫苗研究和生产具有重要价值。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (6)
1.一种制备重组甲型流感病毒株的方法,所述方法包括:
(1)提供病毒拯救系统,其包含流感病毒拯救所需的流感病毒拯救质粒,能完成流感病毒拯救;所述的流感病毒拯救质粒中,
RNA多聚酶PB1的编码基因是突变型基因,其编码突变型RNA多聚酶PB1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:8中第1-757位且第621位由Q突变为K或者R;
RNA多聚酶PA的编码基因是突变型基因,其编码突变型RNA多聚酶PA,其氨基酸序列如SEQ ID NO:7中第1-716位且第237位由E突变为K或者R;
核外壳核蛋白NP的编码基因是突变型基因,其编码突变型核外壳核蛋白NP,其氨基酸序列如SEQ ID NO:11中第1-498位且第377位由S突变为N;和
非结构蛋白NS1的编码基因是突变型基因,其编码突变型非结构蛋白NS1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:3中第1-230位且第165位由S突变为Y;
(2)将步骤(1)的病毒拯救系统中流感病毒拯救质粒转染病毒包装细胞,培养经转染的病毒包装细胞,获得重组甲型流感病毒株,其是哺乳动物细胞适应性的甲型流感病毒株;所述的病毒包装细胞选自:Vero细胞,MDCK细胞。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,突变型RNA多聚酶PB1基因以来源于PR8病毒的RNA多聚酶PB1基因进行突变;
突变型RNA多聚酶PA基因以来源于PR8病毒的RNA多聚酶PA基因进行突变;
突变型核外壳核蛋白NP基因以来源于PR8病毒的核外壳核蛋白NP基因进行突变;和
突变型非结构蛋白NS1基因以来源于PR8病毒的非结构蛋白NS1基因进行突变。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的病毒拯救质粒是pHW系列质粒;所述病毒拯救系统包括8个pHW2000质粒,各自独立地在polI和polII双重启动子之间装载下述8条病毒基因序列:
病毒Segment1,其含有RNA多聚酶PB2编码基因,藉由双重启动子能同时转录RNA多聚酶PB2的mRNA及病毒RNA,
病毒Segment2,其含有RNA多聚酶PB1编码基因,藉由双重启动子能同时转录RNA多聚酶PB1的mRNA及病毒RNA,
病毒Segment3,其含有RNA多聚酶PA编码基因,藉由双重启动子能同时转录RNA多聚酶PA的mRNA及病毒RNA,
病毒Segment4,其含有血凝素HA的编码基因,藉由双重启动子能同时转录血凝素HA的mRNA及病毒RNA,
病毒Segment5,其含有核外壳核蛋白NP编码基因,藉由双重启动子能同时转录核外壳核蛋白NP的mRNA及病毒RNA,
病毒Segment6,其含有神经酰胺酶NA编码基因,藉由双重启动子能同时转录神经酰胺酶NA的mRNA及病毒RNA,
病毒Segment7,其含有基质蛋白M1编码基因+基质蛋白M2编码基因,藉由双重启动子能同时转录基质蛋白的mRNA及病毒RNA,
病毒Segment8,其含有非结构蛋白NS1编码基因+核转运蛋白NEP编码基因,藉由双重启动子能同时转录NS1和NEP蛋白的mRNA及病毒RNA。
4.一种用于制备重组甲型流感病毒株的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括:病毒拯救系统,其包含甲型流感病毒拯救所需的流感病毒拯救质粒,能实现甲型流感病毒拯救;所述的流感病毒拯救质粒中,
RNA多聚酶PB1的编码基因是突变型基因,其编码突变型RNA多聚酶PB1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:8中第1-757位且第621位由Q突变为K或者R;
RNA多聚酶PA的编码基因是突变型基因,其编码突变型RNA多聚酶PA,其氨基酸序列如SEQ ID NO:7中第1-716位且第237位由E突变为K或者R;
核外壳核蛋白NP的编码基因是突变型基因,其编码突变型核外壳核蛋白NP,其氨基酸序列如SEQ ID NO:11中第1-498位且第377位由S突变为N;
非结构蛋白NS1的编码基因是突变型基因,其编码突变型非结构蛋白NS1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:3中第1-230位且第165位由S突变为Y。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包括:病毒包装细胞;所述的病毒包装细胞选自:Vero细胞,MDCK细胞。
6.权利要求4-5任一所述的试剂盒的用途,其特征在于,用于制备重组甲型流感病毒株,其是哺乳动物细胞适应性的甲型流感病毒株,所述的哺乳动物细胞选自:Vero细胞,MDCK细胞。
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Legal Events
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Granted publication date: 20180420 Termination date: 20200325 |