CN108602858A - 嵌合rsv、免疫原性组合物以及使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)、活减毒疫苗和免疫原性组合物、以及使用方法。在某些实施方案中，所述嵌合呼吸道合胞病毒具有编码RSV F蛋白的突变的基因模式，所述蛋白具有位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K、和/或位置371处的Y。

Description

嵌合RSV、免疫原性组合物以及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年10月29日提交的美国临时申请号62/247,962和2016年5月11日提交的美国临时申请号62/334,547的优先权。这些申请各自的内容特此出于所有目的以引用的方式整体并入。

经由办公室电子提交系统(EFS-WEB)以文本文件形式提交的材料的参考引用

与本申请相结合的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且特此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是15198PCT_ST25.txt。文本文件是49KB，在2016年10月26日创建，并且经由EFS-Web电子提交。

背景

人类呼吸道合胞病毒(RSV)引起呼吸道感染。它是在婴儿和儿童期间住院就诊的主要原因。帕利珠单抗是结合RSV融合蛋白(RSV F)的人源化单克隆抗体(IgG)，其被FDA批准用于预防某些高风险婴儿中由RSV引起的严重下呼吸道疾病。帕利珠单抗作为以每月剂量施用的嵌合抗体具有有限的功效并且有时引起过敏反应。因此，需要确定用于RSV的改进的治疗和预防方法。

疫苗通常是活病毒株的杀灭(灭活)或弱化(减毒)形式。Kim等人报告了福尔马林灭活的RSV疫苗的施用并不足够有效。Am J Epidemiol 89，422-434(1969)。减毒RSV疫苗候选物面临严重的安全性障碍，并且足够减毒和免疫原性的小儿科RSV肝减毒疫苗(LAV)病毒株的开发是难懂的。参见Collins等人。理解和控制呼吸道合胞病毒方面的进展：在所有这些年后仍十分狂热。Virus Res 162，80-99(2011)。

Karron等人报告了RSV，其中RNA合成因子M2-2的大部分开放阅读框(ORF)缺失，产生在儿童中具有改进的抗体应答的减毒RSV疫苗。Sci Transl Med 7，312ra175(2015)。Meng等人报告了通过病毒基因进行靶向密码子去优化来对呼吸道合胞病毒进行的减毒和免疫原性。MBio 5，e01704-01714(2014)。还参见美国公布申请号2016/0030549。Hotard等人报告了人类RSV融合蛋白中调节融合物活性和发病机理的残基，2015，J Virol 89：512-522。Rostad等人报告了由低融合F蛋白减毒的重组呼吸道合胞病毒疫苗候选物是免疫原性的并且防御棉鼠中的攻击。J Virol，2016，90(16)：7508-7518。

本文引用的参考文献不是对现有技术的承认。

概述

本公开涉及嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)、活减毒疫苗和免疫原性组合物、以及使用方法。在某些实施方案中，嵌合RSV具有编码RSV F蛋白的突变的基因模式，所述蛋白质具有位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K、和/或位置371处的Y。在某些实施方案中，RSVF蛋白具有在位置557处的V或者所述F蛋白被突变使得位置557为V。

在某些实施方案中，位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K、以及位置371处的Y并不处于RSV F蛋白中，其中天然存在的RSV F蛋白具有氨基酸的该特定模式，即突变体RSV F蛋白包含至少一个氨基酸取代，使得突变的RSF F蛋白当与天然存在的序列相比时具有在位置79、191、357或371处的至少一个修饰，以提供具有位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K以及位置371处的Y的氨基酸的RSV F蛋白模式。

在某些实施方案中，突变的RSV F蛋白来源于除RSV品系19诸如B亚型RSV病毒株，例如“布宜诺斯艾利斯(Buenos Aires)”(BAF)病毒株中可见的F蛋白之外的RSV F蛋白。在某些实施方案中，RSV F蛋白不含有SEQ ID NO：3或4、或者与SEQ ID NO：3或4不具有实质同一性。在某些实施方案中，突变的RSV F与SEQ ID NO：1具有超过85％或90％同一性，但与SEQ ID NO：4具有小于95％、96％、97％、98％或99％同一性。在某些实施方案中，突变的RSVF与SEQ ID NO：1具有超过85％同一性，但与SEQ ID NO：4具有小于99％同一性。

在某些实施方案中，突变的RSV F蛋白具有(SEQ ID NO：1)MELLIHRSSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLMKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSRVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADKCKVQSNRVFCDTMYSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITAIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFS，或其变体。

在某些实施方案中，本公开涵盖一种嵌合RSV F蛋白，其缺乏跨膜结构域或者具有氨基酸1-524，例如(SEQ ID NO：13)MELLIHRSSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLMKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSRVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADKCKVQSNRVFCDTMYSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTN。

在某些实施方案中，变体与SEQ ID NO：1具有大于95％、98％或99％序列同一性或相似性。在某些实施方案中，变体是一个、两个、三个或更多个氨基酸取代、缺失或插入，条件是没有位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K、或位置371处的Y的任何取代。在某些实施方案中，取代是保守性取代。

在某些实施方案中，RSV F变体具有位置11处的V、具有位置20处的F、具有位置23处的A、具有位置45处的F、具有位置102处的T或V、具有位置103处的V、具有位置119处的V、具有位置121处的A、具有位置123处的R、具有位置104处的S、具有位置129处的T、具有位置173处的A、具有位置242处的R、具有位置276处的N、具有位置518处的A、具有位置529处的V、具有位置554处的T、或其组合。

在某些实施方案中，本文所公开的RSV F蛋白序列的变体具有一个、两个、三个或更多个氨基酸取代、缺失或插入，条件是没有位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K、或位置371处的Y的任何取代。在某些实施方案中，取代是保守性取代。

在某些实施方案中，变体是一个或两个、更多个氨基酸取代、缺失或插入，条件是所述取代不是位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K、位置371处的Y、或位置557处的Y的任何取代。在某些实施方案中，取代是保守性取代。

在某些实施方案中，变体是一个、两个或三个氨基酸取代、缺失或插入，条件是所述取代不是位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K、或位置371处的Y的任何取代。在某些实施方案中，取代是保守性取代。

在某些实施方案中，变体是一个、两个或三个氨基酸取代、缺失或插入，条件是所述取代不是位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K、位置371处的Y、或位置557处的Y的任何取代。在某些实施方案中，取代是保守性取代。

在某些实施方案中，变体不含有超过4、5、6、7、8、9、10或20个氨基酸取代、缺失或插入，条件是所述取代不是位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K、以及位置371处的Y的任何取代。在某些实施方案中，取代是保守性取代。

在某些实施方案中，变体不含有超过4、5、6、7、8、9、10或20个氨基酸取代、缺失或插入，条件是所述取代不是位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K、位置371处的Y、以及位置557处的V的任何取代。在某些实施方案中，取代是保守性取代。

在某些实施方案中，嵌合RSV具有编码RSV NS1、NS2和G蛋白的基因，其被密码子去优化，使得NS1、NS2和G的表达率在Vero细胞中与野生型A2病毒相比减少超过一半。

在某些实施方案中，哺乳动物细胞中G的表达率在Vero细胞中与野生型A2病毒相比减小超过三分之一(1/3)、四分之一(1/4)、五分之一(1/5)、或十分之一(1/10)。

在某些实施方案中，NS1的表达率在Vero细胞中与野生型品系A2病毒相比减小超过三分之一(1/3)、四分之一(1/4)、五分之一(1/5)、或十分之一(1/10)。

在某些实施方案中，NS2的表达率在Vero细胞中与野生型品系A2病毒相比减小超过三分之一(1/3)、四分之一(1/4)、五分之一(1/5)、或十分之一(1/10)。

在某些实施方案中，编码SH蛋白的基因是缺失或改变的，使得表达截短的蛋白质或不表达蛋白质。在某些实施方案中，编码M2-2的基因是缺失或改变的，使得表达截短的蛋白质或不表达蛋白质。

在某些实施方案中，编码F蛋白的基因是突变的，使得位置557不是V或者I处于位置557中。

在某些实施方案中，本公开涵盖包含本文所公开的RSV F蛋白，例如SEQ ID NO：1、13以及变体的融合蛋白。

在某些实施方案中，本公开涉及包含本文公开的嵌合RSV的疫苗和免疫原性组合物。在某些实施方案中，组合物还包含佐剂和/或药学上可接受的载剂。在某些实施方案中，佐剂是铝凝胶、铝盐或单磷酰脂质A。

在某些实施方案中，佐剂是水包油乳液。在某些实施方案中，水包油乳液还包含α-生育酚、角鲨烯、和/或表面活性剂。

在某些实施方案中，本公开涉及用于针对呼吸道合胞病毒疫苗接种或免疫接种受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文公开的嵌合RSV或包含它的免疫原性组合物。在某些实施方案中，所述有效量在受试者中产生保护性免疫应答。

在某些实施方案中，受试者是怀孕妈妈或2、3或4岁以下的儿童。在某些实施方案中，受试者具有减弱的免疫系统、超过60或65岁或者定期施用化学疗法或免疫抑制药物。

在某些实施方案中，本公开涉及编码本文所公开的RSV F蛋白的核酸。在某些实施方案中，核酸包含

SEQ ID NO：14

或具有大于50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、或99％序列一致性的变体。

在某些实施方案中，本公开涉及包含编码本文所公开的RSV F蛋白的核酸的载体。在某些实施方案中，载体选自质粒或细菌人工染色体。

在某些实施方案中，嵌合RSV包含SEQ ID NO：15

或具有大于50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、或99％序列一致性的变体。

在某些实施方案中，嵌合RSV包括对人类受试者有感染性的那些和对人类受试者不具有感染性的那些。

在某些实施方案中，本公开涉及一种包含本文所公开的突变的RSV F蛋白的颗粒、RSV颗粒或病毒样颗粒。在某些实施方案中，所述颗粒包含活的和感染性的减毒RSV基因组或反基因组。在某些实施方案中，所述颗粒包含灭活RSV基因组或反基因组，例如不具有核酸或具有不能够表达一种、两种、三种或更多种或任何RSV蛋白的核酸。在某些实施方案中，颗粒使用一种方法诸如加热或甲醛来杀灭。在某些实施方案中，所述颗粒通过表达病毒结构性蛋白质和本文所公开的突变的RSV F蛋白来重构。

附图简述

图1示出具有I557 V突变的F蛋白(Query)(SEQ ID NO：3)与典型野生型RSV病毒株品系19序列(Sbjct)(SEQ ID NO：4)的RSV序列比较。

图2示出RSV疫苗候选物OE4。具有密码子去优化的NS1和NS2(dNS1/dNS2)的RSV是遗传上稳定的并且使RSV减毒同时保留像野生型病毒A2一样的免疫原性。OE4也具有G蛋白的密码子去优化、SH蛋白的缺失，并且表达RSV品系19F蛋白。

图3示出Vero细胞裂解物的蛋白质印迹，其指示当RSV感染Vero细胞时密码子去优化的RSV G、NS1、NS2基因的减少的蛋白质表达。

图4示出指示嵌合RSV表达的数据，品系19F(A2品系19F)表现出与病毒株A2的RSVF相比的融合前F偏置。

图5A示出F蛋白的序列，当与布宜诺斯艾利斯进化枝(BAF)的低融合RSVB亚型病毒株的共有序列(Sbjct)(SEQ ID NO：2)相比时，其具有在位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K和位置371处的Y的取代，表示为DB1 QUAD(Query)(SEQ ID NO：1)。

图5B示出DB1 QUAD F蛋白(Query)(SEQ ID NO：1)与典型野生型RSV病毒株品系19序列(Sbjct)(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列比较。存在519/573(91％)的同一性和548/573(95％)的相似性.

图6A示出关于在7天之后某些RSV构建体的热稳定性的数据，所述构建体包括含有SEQ ID NO：2的共有F蛋白的DB1。

图6B示出关于在7天之后某些RSV构建体的热稳定性的数据，所述构建体包括含有对应于品系19的F蛋白中可见的某些位置的F蛋白氨基酸的DB1构建体。DB1 QUAD是指具有SEQ ID NO：1的F蛋白，包括位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K、以及位置371处的Y、以及位置557处的V的氨基酸模式。

图6C示出指示某些疫苗候选物的融合前F与总F(融合前和融合后F)的比率的数据。

图7A示出关于在BALB/c小鼠中疫苗构建体减毒性的数据，这指示当与A2-品系19F相比时DB1 QUAD减毒更大。

图7B示出关于在BALB/c小鼠中疫苗构建体针对不同RSV病毒株的免疫原性的数据，这指示DB1 QUAD增加针对RSV B的免疫原性。

详细描述

在更详细描述本公开之前，应了解本公开不限于所述特定实施方案，并且因此所述实施方案当然可变化。也应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图限制，因为本公开的范围将仅受限于随附权利要求书。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。虽然在实践或检测本公开时也可以使用与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。

在本说明书中引用的所有公布和专利都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已具体地和个别地指示将各个别公布或专利以引用的方式并入一般，并且以引用的方式并入本文来公开和描述与所述公布引用的内容相关的方法和/或材料。引用任何出版物都是因为它的公开内容在提交日期之前，而不应解释为认可本公开由于先前公开而无权先于所述出版物。此外，提供的公开日期可不同于可能需要独立确认的实际公开日期。

如将为本领域技术人员在阅读本公开后显而易知，本文描述和说明的各个别实施方案具有离散组成部分和特征，其可易于与任何其它若干实施方案的特征分开或组合而不脱离本公开的范围或精神。任何叙述的方法都可以叙述的事件的顺序或以在逻辑上可能的任何其它顺序执行。

除非另外指示，否则本公开的实施方案将采用属于本领域的技能的免疫学、医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药学、生物学等。这些技术在文献中被充分解释。

必须注意，除非本文另外清楚指示，否则如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括多个提及物。在本说明书中以及在随后权利要求中，将提及除非相反意图是明显的，否则将被定义来具有以下含义的许多术语。

在描述各种实施方案之前，提供以下定义并且除非另外指示，否则应使用所述定义。

术语“蛋白质”和“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸的化合物并且可互换使用。

术语“部分”当参考蛋白质使用(如在“给定的蛋白质的部分”中)时是指该蛋白质的片段。所述片段的尺寸范围可以是四个氨基酸残基至整个氨基酸序列减去一个氨基酸。

术语“嵌合呼吸道合胞病毒”或“嵌合RSV”是指含有足够RSV基因以允许基因组或反基因组在宿主细胞(例如Vero细胞)中复制的核酸，并且核酸序列被改变以包含至少一个在结构上与天然RSV病毒株不相同的核酸区段，即在RSV病毒株天然存在于整个RSV基因组上时。嵌合呼吸道合胞病毒包含RSV基因，其中密码子被改变以不同于天然存在的那些，即使RSV产生与天然表达的那些相同的氨基酸序列的多肽。不同的RSV病毒株将具有不同的核苷酸序列并且表达具有不同氨基酸序列且具有类似功能的蛋白质。因此，嵌合RSV包含RSV基因，其中来自一种病毒株的一种或多种基因被替代性或第二种病毒株中的基因置换，使得整个RSV基因组的氨基酸序列不同于自然界中可见的RSV。在某些实施方案中，嵌合RSV包括那些病毒株，其中核酸在起始翻译密码子之后缺失，以便截短蛋白质表达，条件是基因组的此类截短模式不可见于天然存在的RSV中。在某些实施方案中，嵌合RSV包括对人类受试者有感染性的那些并且可以在人类受试者中复制。

术语“融合物”当参考多肽使用时是指从不同来源获得使得它们并未一起存在于自然环境中的两个或更多个编码序列的表达产物，所述编码序列已克隆到一起并且在翻译之后用作单一多肽序列。融合多肽也称为“杂交体”多肽。编码序列包括从相同或不同生物体物种获得的那些。

然而，这种类型的融合蛋白与所公开的疫苗中的RSV融合蛋白不相同。RSV融合蛋白(F)是引起病毒体膜融合至靶细胞膜的主要表面糖蛋白。融合蛋白存在于亚稳融合前构象中，所述构象随后进行主要再折叠成稳定融合后形式，所述融合后形式接近病毒体并且靶向细胞膜并能够融合。F蛋白在RSV病毒株内是高度保守的并且是强效RSV免疫原。在人类中自然感染之后，大部分抗RSV中和抗体针对F蛋白，确切地说针对F的融合前构象。

术语“同源物”或“同源的”当参考多肽使用时是指两种多肽之间的高序列同一性程度，或者是指三维结构之间的高相似性程度，或者是指活性位点与作用机制之间的高相似性程度。在一个优选的实施方案中，同源物与参考序列具有大于60％序列同一性，以及更优选地大于75％序列同一性，以及还更优选地大于90％序列同一性。

在应用于多肽时，术语“实质同一性”意指当诸如通过使用默认间隙权重的程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时，两个肽序列共享至少80％序列同一性、优选地至少90％序列同一性、更优选地至少95％序列同一性或更大(例如99％序列同一性)。优选地，不相同的残基位置相差了保守氨基酸取代。

术语“变体”和“突变体”当参考多肽使用时是指与另一种通常相关的多肽的不同之处在于一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可以具有“保守性”改变，其中取代的氨基酸具有类似的结构或化学特性。一种类型的保守氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酰胺。更少见地，变体可具有“非保守性”改变(例如用色氨酸替换甘氨酸)。类似的微小变化也可包括氨基酸缺失或插入(换言之，添加)或两者。确定在不消除生物活性的情况下哪些和多少氨基酸残基可以被取代、插入或缺失的指导可以使用本领域已熟知的计算机程序例如DNAStar软件发现。变体可以在功能测定中测试。优选的变体具有小于10％、以及优选地小于5％、以及还更优选地小于2％改变(无论是取代、缺失等)。

术语“基因”是指核酸(例如，DNA或RNA)序列，其包含产生RNA、或多肽、或前体(例如，胰岛素原)所需要的编码序列。功能性多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要多肽的所需活性或功能性质(例如，酶活性、配体结合、信号转导等)得到保留即可。术语“部分”当参考基因使用时是指该基因的片段。所述片段的尺寸范围可以是几个核苷酸至整个基因序列减去一个核苷酸。因此“包含基因的至少一部分的核苷酸”可包括基因的片段或整个基因。

术语“基因”也涵盖结构基因的编码区以及与编码区相邻位于5′和3′末端上、在任一个末端上达约1kb的距离的序列，以使得基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5′端并存在于mRNA上的序列被称为5′非翻译序列。位于编码区的3′端或下游并存在于mRNA上的序列称为3′非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有以被称为“内含子”或“插入区域”或“插入序列”的非编码序列来间断的编码区域。内含子是转录至核RNA(mRNA)中的基因节段；内含子可含有调控元件如增强子。内含子从核或原始转录物中去除或“剪除”；因此，内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。mRNA在翻译期间起作用以指定新生多肽中的氨基酸的序列或顺序。

除了含有内含子以外，基因的基因组形式还可包括位于RNA转录物上存在的5′和3′末端序列上的序列。这些序列被称为“侧接”序列或区域(这些侧接序列位于存在于mRNA转录物上的非翻译序列5′或3′)。5′侧接区域可含有控制或影响基因转录的调控序列诸如启动子和增强子。3′侧接区域可含有引导转录终止、转录后裂解和多聚腺苷酸化的序列。

术语“异源基因”是指天然环境中不存在的因子的基因(即已通过人工改变)。例如，异源基因包括从一种物种引入到另一种物种的基因。异源基因还包括生物体中原生的已以一些方式改变(例如，突变的、添加到多个拷贝中、连接至非天然启动子或增强子序列等)的基因。异源基因与内源性植物细胞的区别在于，异源基因序列通常连接至包含调节元件的核苷酸序列，所述调节元件诸如未发现与由异源基因编码的蛋白质的基因天然地缔合或与染色体中的植物基因序列缔合、或与自然界中未发现的染色体部分(例如，在所述基因未正常表达的基因座中表达的基因)缔合的启动子。

术语“多肽”是指包含两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、优选地超过三个以及通常超过十个的分子。确切尺寸取决于许多因素，进而取决于寡核苷酸的最终功能或用途。多核苷酸可以许多方式生成，所述方式包括化学合成、DNA复制、逆转录、或其组合。术语“寡核苷酸”大体上是指长度通常小于30个核苷酸的短长度的单链多核苷酸链，尽管它也可与术语“多核苷酸”可互换使用。

术语“核酸”是指如以上所述的核苷酸聚合物或多核苷酸。所述术语用于指示单一分子或分子的集合。核酸可以是单链或双链的，并且可以包含如以下所述的编码区和具有不同控制元件的区域。

术语“具有编码基因的核苷酸序列的多核苷酸”或“具有编码基因的核苷酸序列的多核苷酸”或“编码指定多肽的核酸序列”是指包含基因编码区的核酸序列或换言之编码基因产物的核酸序列。编码区可以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸、多核苷酸或核酸可以是单链的(即，有义链)或双链的。如果需要允许适当开始转录和/或正确加工初始RNA转录物，则适合的控制元件诸如增强/启动子、剪接接点、聚腺苷酸化信号、等可以与基因的编码区紧密接近。可替代地，本公开的表达载体中所利用的编码区可以含有内源性增强子/启动子、剪接接点、插入序列、聚腺苷酸化信号等、或者两个内源性和外源性控制元件的组合。

术语“重组”当参考核酸分子使用时是指包含借助于分子生物学技术连接在一起的核酸区段的核酸分子。术语“重组”当参考蛋白质或多肽使用时是指使用重组核酸分子表达的蛋白质分子。

术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可为“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则匹配。或者，在核酸之间可存在“完全”或“总体”互补性。在核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交的效率和强度具有明显影响。这在扩增反应以及取决于核酸之间的结合的检测方法中特别重要。

术语“同源性”当结合核酸使用时是指互补性程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。“序列同一性”是指两种或更多种核酸或蛋白质之间的相关性程度，并且以相对于总比较长度的百分比给出。同一性计算考虑到相同的或相应较大序列中相同的相对位置中的那些核苷酸或氨基酸残基。同一性计算可以通过计算机程序诸如“GAP”(GeneticsComputer Group，Madison，Wis.)和“ALIGN”(DNAStar，Madison，Wis.)中含有的算法进行。部分互补序列是至少部分抑制完全互补序列(或与其竞争)与靶标核酸杂交的部分互补序列，使用功能术语“基本上同源”来提及。完全互补核酸序列与靶序列的杂交的抑制可在低严格性条件下使用杂交测定(DNA印迹或RNA印迹、溶液杂交等)检查。大致上同源的序列或探针将竞争并且抑制在低严格性条件下与靶标完全同源的序列的结合(即杂交)。这并不是说低严格性条件使得允许非特异性结合，因为低严格性条件要求两个序列彼此结合必须是特异性(即，选择性)相互作用。非特异性结合的不存在可以通过使用甚至缺乏部分互补程度(例如小于约30％同一性)的第二目标来测试；在非特异性结合不存在下，探针将不会与第二非互补性靶标杂交。

使用以下术语描述两个或更多个多核苷酸之间的序列关系：“参考序列”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”以及“实质同一性”。“参考序列”是用作序列比较的基础的已定义序列；参考序列可以是较大序列的子集，例如在序列表中给出的全长cDNA序列的区段，或者可以包含完整基因序列。大体上，参考序列长度是至少20个核苷酸，频繁地长度是至少25个核苷酸，以及通常长度是至少50个核苷酸。由于两个多核苷酸各自可(1)包含在两个多核苷酸序列之间类似的序列(即，完全多核苷酸序列的一部分)，并且(2)还可包含在两个多核苷酸之间有差异的序列，两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”上比较两个多核苷酸的序列以鉴别并比较序列相似性的局部区域来进行。如本文所用，“比较窗口”是指至少20个连续核苷酸位置的概念性区段，其中多核苷酸序列可以与至少20个连续核苷酸的参考序列相比较并且其中在比较窗口中多核苷酸序列的部分可以包含与参考序列(不包含添加或缺失)相比20％或更小的添加或缺失(即空位)，以用于最佳比对两个序列。用于比对比较窗口的序列最佳比对可以通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981))、通过Needleman和Wunsch的同源比对算法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970))、通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.)85：2444(1988))、通过计算实施这些算法(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics软件包发布版7.0，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)、或通过检查来进行，并且选择通过不同方法生成的最佳比对(即，在比较窗口上得到最高同源性百分比)。术语“序列同一性”意指两个多核苷酸序列中比较窗口上是相同的(即，在核苷酸至核苷酸的基础上)。

在某些实施方案中，术语“序列同一性百分比”通过以下进行计算：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列、确定两个序列中出现相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)的位置数以得到匹配位置数、用匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即窗口尺寸)、以及将结果乘以100而得到序列同一性百分比。

在某些实施方案中，序列“同一性”是指在两个比对序列之间的序列比对中使用相同位置数除以更大最短序列或排除突出部的等效位置数来计算的精确匹配的氨基酸数(表示为百分比)，其中内部间隙计算为等效位置。例如，多肽GGGGGG和GGGGT具有5分之4或80％的序列同一性。例如，多肽GGGPPP和GGGAPPP具有7分之6或85％的序列同一性。在某些实施方案中，在本文中表示的序列同一性的任何表述可以被序列相似性取代。“相似性”百分比用于定量两个比对序列之间的相似性。此方法与确定同一性相同，除了某些氨基酸不必具有匹配。如果氨基酸根据以下氨基酸组处于具有类似特性的组中，则氨基酸被分类为匹配：芳族-F Y W；疏水性-A V I L；带正电荷：R K H；带负电荷-D E；极性-S T N Q。

如本文所用，术语“实质同一性”表示多核苷酸序列的特征，其中多核苷酸包含在至少20个核苷酸位置的比较窗口上、频繁地在至少25-50个核苷酸的窗口上与参考序列相比具有至少85％序列同一性、优选地至少90％至95％序列同一性、更通常地至少99％序列同一性的序列，其中序列同一性百分比通过比较参考序列与多核苷酸序列来计算，所述多核苷酸序列可包含在比较窗口上参考序列的总计20％或更少的缺失或添加。参考序列可以是较大序列的子集，例如本公开中要求保护的组合物的全长序列的区段。

当参考双链核酸序列诸如cDNA或基因组克隆使用时，术语“基本上同源”是指任何探针可在如以上所述的低严格性条件至高严格性条件下与双链核酸序列的一条链或两条链杂交。

当参考单链核酸序列使用时，术语“基本上同源”是指任何探针可在如以上所述的低严格性条件至高严格性条件下与单链核酸模板序列(即，是单链核酸模板序列的互补序列)杂交。

术语“处于可操作的组合中”、“处于可操作的顺序”以及“可操作地连接”是指核酸序列的连接处于这种方式，所述方式使得产生能够指导给定基因的转录和/或所希望的蛋白质分子的合成的核酸分子。所述术语还指氨基酸序列的连接处于这种方式，所述方式使得产生功能性蛋白质。

术语“调节元件”是指控制核酸序列表达的一些方面的遗传元件。例如，启动子时促进可操作地连接的编码区的转录起始。其他调节元件是剪接信号、聚腺苷酸化信号、终止信号等。

真核生物中的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由与涉及转录的细胞蛋白质特异性相互作用的短DNA序列阵列组成(Maniatis等人，Science236：1237，1987)。启动子和增强子元件已从多种真核生物来源中分离，包括酵母、昆虫、哺乳动物以及植物细胞中的基因。启动子和增强子元件也已从病毒中分离并且可见于原核生物钟。特定启动子和增强子的选择取决于用于表达目标蛋白质的细胞类型。一些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其它真核启动子和增强子在有限的细胞类型子集中有功能(综述参见Voss等人，Trends Biochem.Sci.，11：287，1986；以及Maniatis等人，同上1987)。

如本文所用，术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”是指位于DNA聚合物的蛋白质编码区的5′端(即在其之前)的DNA序列。自然界中已知的大部分启动子的位置在转录区之前。启动子用作开关，活化基因的表达。如果基因被活化，则认为它被转录或参与转录。转录涉及由基因合成mRNA。因此，启动子充当转录调节元件并且还提供用于开始将基因转录成mRNA的位点。

启动子可以是组织特异性的或细胞特异性的。术语“组织特异性”当应用于启动子时是指启动子能够引导目标核苷酸序列选择性表达到特定类型的组织(例如种子)中，而相同目标核苷酸序列在不同类型的组织(例如叶子)中的表达相对不存在。启动子的组织特异性可以通过例如将报告基因可操作地连接至启动子序列以生成报告构建体、将所述报告构建体引入到植物基因组中以使得报告构建体整合到所得转基因植物的每个组织中、以及检测报告基因(例如检测由报告基因编码的mRNA、蛋白质、蛋白质的活性)在不同转基因植物组织中的表达来评价。检测到在一种或多种组织中的报告基因表达水平相对于其他组织中的报告基因表达水平更大，显示启动子对于其中检测到更大表达水平的组织具有特异性。术语“细胞类型特异性”当应用于启动子时是指启动子能够引导目标核苷酸序列在特定类型的细胞中选择性表达，而相同目标核苷酸序列在相同组织内的不同类型的细胞中的表达相对不存在。术语“细胞类型特异性”当应用于启动子时也意指启动子能够促进目标核苷酸序列在单一组织内的一个区域中选择性表达。启动子的细胞类型特异性可以使用本领域已熟知的方法，例如免疫组织化学染色来评定。简言之，将组织切片嵌入在石蜡中，并且将石蜡切片与对由目标核苷酸序列编码的多肽产物有特异性的第一抗体反应，所述目标核苷酸序列的表达由启动子控制。允许对第一抗体有特异性的标记的(例如过氧化物酶缀合的)第二抗体结合至切片的组织并且通过显微镜法检测特异性结合(例如，使用抗生物素蛋白/生物素)。

启动子可以是组成型或可调节型。术语“组成型”当参考启动子使用时意指所述启动子能够在刺激(例如热休克、化学品、光等)不存在下引导可操作连接的核酸序列转录。通常，组成型启动子能够在基本上任何细胞和任何组织中引导转基因的表达。

相比之下，“可调节型”或“诱导型”启动子是能够在刺激(例如热休克、化学品、光等)存在下引导可操作连接的核酸序列的转录水平，所述转录水平不同于在所述刺激不存在下可操作连接的核酸序列的转录水平。

增强子和/或启动子可以是“内源的”或“外源的”或“异源的”。“内源”增强子或启动子是与基因组中给定的基因天然地连接的增强子或启动子。“外源”或“异源”增强子或启动子是借助于遗传操纵(即分子生物学技术)与基因并列设置使得基因的转录由连接的增强子或启动子引导。例如，与第一基因可操作地组合的内源启动子可以分离，去除，并与第二基因可操作地组合设置，从而使其成为与所述第二基因可操作地组合的“异源启动子”。涵盖多种此类组合(例如，第一基因和第二基因可以来自相同物种或来自不同物种)。

真核细胞中重组DNA序列的有效表达通常需要表达引导所得转录物有效终止和聚腺苷酸化的信号。转录终止信号通常可见于聚腺苷酸化信号的下游并且长度是几百个核苷酸。如本文所用，术语“poly(A)位点”或“poly(A)序列”表示引导新生RNA转录物的终止和聚腺苷酸化二者的DNA序列。重组转录物的有效聚腺苷酸化是希望的，因为缺乏poly(A)尾部的转录物是不稳定的并且快速降解。表达载体中所利用的poly(A)信号可以是“异源的”或“内源的”。内源性poly(A)信号天然地存在于基因组中给定基因的编码区的3′端。异源poly(A)信号是已与一个基因分离并且定位在另一个基因的3′的信号。常规使用的异源poly(A)信号是SV40 poly(A)信号。SV40 poly(A)信号被包含在237bp BamHI/BclI限制性片段上并且引导终止和聚腺苷酸化。

术语“载体”是指将DNA区段从一个细胞转移至另一个细胞的核酸分子。术语“载体(vehicle)”有时与“载体(vector)”可互换使用。

术语“表达载体”或“表达盒”是指含有所需编码序列以及用于在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列的适当核酸序列的重组核酸。用于在原核生物中表达的核酸序列包括启动子、操纵子(任选的)、以及核糖体结合位点、通常连同其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止信号和聚腺苷酸化信号。

术语“宿主细胞”是指能够复制和/或转录和/或翻译异源基因的任何细胞。因此，“细胞”指不论是体外还是体内的任何真核或原核细胞(例如，诸如大肠杆菌的细菌细胞、酵母菌、哺乳动物细胞、禽类细胞、植物细胞、鱼类细胞，以及昆虫细胞)。例如，宿主细胞可以位于转基因动物中。

“选择性标记”是引入到重组载体中的核酸，其编码赋予适用于人工选择或识别的性状(报告基因)的多肽，例如β-内酰胺酶赋予抗生素抗性，所述核酸允许表达β-内酰胺酶的生物体存活于生长培养基中存在的抗生素。另一个实例是胸苷激酶，其使得宿主对更昔洛韦选择敏感。所述选择性标记可以是允许基于预期颜色的存在或不存在来区分需要和不需要的细胞的可筛选标记。例如，lac-z-基因产生β-半乳糖苷酶，其在X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)存在赋予蓝色。如果重组插入灭活lac-z-基因，那么所得集落是无色的。可存在一种或多种选择性标记，例如可以补充表达生物体合成其生长(营养缺陷型)所需要的特定化合物的无能力的酶以及能够将一种化合物转化成对于生长有毒的化合物的标记。乳清苷-5′磷酸盐脱羧酶URA3是尿嘧啶生物合成所需要的并且可以补充对于尿嘧啶为营养缺陷型的ura3突变体。URA3也将5-氟乳清酸转化成有毒的化合物5-氟尿嘧啶。另外涵盖的选择性标记包括赋予抗菌抗性或表达荧光蛋白的任何基因。实例包括但不限于以下基因：ampr、camr、tetr、blasticidinr、neor、hygr、abxr、新霉素磷酸转移酶II型基因(nptII)、p-葡糖苷酸酶(gus)、绿荧光蛋白(gfp)、egfp、yfp、mCherry、p-半乳糖苷酶(lacZ)、lacZa、lacZAM15、氯霉素乙酰转移酶(cat)、碱性磷酸酶(phoA)、细菌荧光素酶(luxAB)、双丙氨磷抗性基因(bar)、磷酸甘露糖异构酶(pmi)、木糖异构酶(xylA)、阿拉伯糖醇脱氢酶(atlD)、UDP-葡萄糖：半乳糖-1-磷酸盐尿苷酰转移酶I(galT)、邻氨基苯甲酸合成酶的反馈不敏感α亚基(OASA1D)、2-脱氧基葡萄糖(2-DOGR)、苄腺嘌呤-N-3-葡糖苷酸、大肠杆菌苏氨酸脱氨酶、谷氨酸酯1-半醛转氨酶(GSA-AT)、D-氨基酸氧化酶(DAAO)、耐盐基因(rstB)、铁氧化还原蛋白样蛋白(pflp)、海藻糖-6-P合酶基因(AtTPS1)、赖氨酸消旋酶(lyr)、二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、色氨酸合成酶β1(AtTSB1)、脱卤酶(dhlA)、甘露糖-6-磷酸还原酶基因(M6PR)、潮霉素磷酸转移酶(HPT)、以及D-丝氨酸解氨酶(dsdA)。

“标记”是指直接或间接缀合至另一个分子诸如抗体或蛋白质以促进该分子的检测的可检测化合物或组合物。标记的特定非限制性实例包括荧光标签、酶键合以及放射性同位素。在一个实例中，“标记受体”是指在受体中并入异源多肽。标记包括并入放射性标记的氨基酸或者将生物素基部分共价连接至可由标记抗生物素蛋白(例如含有可由光学或比色方法检测的荧光标记或酶活性的链霉抗生物素蛋白)检测的多肽。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域中已知的并且可使用。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如³⁵S或¹³¹I)、荧光标记(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基、由二次报告分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位点、金属结合域、表位标签)或磁性剂诸如钆螯合物。在一些实施方案中，标记由各种长度的间隔臂连接以降低潜在位阻。

在某些实施方案中，本公开涉及包含本文所公开的序列或其融合物的重组多肽，其中氨基酸序列的氨基末端或碳末端任选地连接至异源氨基酸序列、标记或报告分子。

在某些实施方案中，本公开涉及包含编码本文所公开的多肽或其融合蛋白的核酸的重组载体。

在某些实施方案中，重组载体任选地包含哺乳动物、人类、昆虫、病毒、细菌、细菌质粒、酵母相关复制起点或基因诸如基因或逆转录病毒基因或慢病毒LTR、TAR、RRE、PE、SLIP、CRS、以及INS核苷酸区段或选自tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、以及vpx的基因或选自gag、pol和env的结构基因。

在某些实施方案中，重组载体任选地包含基因载体元件(核酸)诸如选择性标记区、lac操纵子、CMV启动子、杂交肉鸡B-肌动蛋白/CMV增强子(CAG)启动子、tac启动子、T7RNA聚合酶启动子、SP6RNA聚合酶启动子、SV40启动子、内部核糖体进入位点(IRES)序列、顺式作用土拨鼠调节后调节元件(WPRE)、支架附着区(SAR)、末端反向重复(ITR)、FLAG标签编码、c-myc标签编码区、金属亲和性标签编码区、链霉亲和素结合肽标签编码区、polyHis标签编码区、HA标签编码区、MBP标签编码区、GST标签编码区、聚腺苷酸化编码区、SV40聚腺苷酸化信号、SV40复制起点、Col E1复制起点、f1起点、pBR322起点、或pUC起点、TEV蛋白酶识别位点、loxP位点、Cre重组酶编码区、或多个克隆位点诸如在小于50或60个核苷酸的连续区段内具有5、6或7个或更多个限制性位点或在小于20或30个核苷酸的连续区段内具有3或4个或更多个限制性位点。

术语“报告基因”是指编码可以测定的蛋白质的基因。报告基因的实例包括但不限于修饰的katushka、mkate和mkate2(参见例如，Merzlyak等人，Nat.Methods，2007，4，555-557以及Shcherbo等人，Biochem.J.，2008，418，567-574)、荧光素酶(参见例如，deWet等人，Mol.Cell.Biol.7：725(1987)以及美国专利号6,074,859；5,976,796；5,674,713；以及5,618,682；所有这些文献均以引用方式并入本文中)、绿荧光蛋白(例如，GenBank登录号U43284；许多GFP变体可商购ClonTech Laboratories，Palo Alto，Calif.)、氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、以及辣根过氧化物酶。

术语“野生型”当参考基因使用时是指具有从天然存在的来源分离的基因的特征的基因。术语“野生型”当参考基因产物使用时是指具有从天然存在的来源分离的基因产物的特征的基因产物。如本文所用的术语“天然存在的”当应用于对象时是指对象可见于自然界中的事实。例如，可从自然中的来源分离并且不通过人在实验室中有意修饰的存在于生物(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列为天然存在的。野生型基因是在群体中最经常观察到的基因，因此任意指定成基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰”或“突变体”当参考基因或基因产物使用时分别是指与野生型基因或基因产物相比，展示序列和或功能性质变化(即，改变特性)的基因或基因产物。应注意天然存在的突变体可予以分离；这些突变体通过以下事实来识别：与野生型基因或基因产物相比，其具有改变的特性。

术语“反义”或“反基因组”是指核苷酸残基序列处于相对于有义链中的核苷酸残基序列的反向5′至3′取向中。DNA双链体的“有义链”是指在DNA双链体中在天然状态下由细胞转录成“有义mRNA”的链。因此，“反义”序列是具有与DNA双链体中的非编码链相同的序列的序列。

术语“分离”是指一种生物材料诸如病毒、核酸或蛋白质，所述生物材料基本上不含有通常在天然存在的环境中伴随它或与它相互作用的组分。分离的材料任选地包括其自然环境例如细胞中不存在的材料。例如，如果材料处于其自然环境诸如细胞中，则所述材料已置于细胞中对于该环境中可见的材料非原生的位置处(例如基因组或遗传元件)。例如，如果天然存在的核酸(例如编码区、启动子、增强子等)通过非天然存在的方式引入到对于该核酸非原生的基因组基因座(例如载体，诸如质粒或病毒载体、或扩增子)中，则所述核酸是分离的。此类核酸也称为“异源”核酸。例如，分离的核酸是处于除野生型病毒的天然环境(例如感染个体的鼻咽)之外的环境(例如细胞培养系统或从细胞培养物中纯化)中。

RSV的“免疫有效量”是足以增强个体(例如，人类)针对随后对RSV暴露的自身免疫应答的量。诱导的免疫力水平可以例如通过测量中和分泌和/或血清抗体，例如通过噬斑中和作用、补体结合、酶联免疫吸附、或微量中和测定来监测。

针对RSV的“保护性免疫应答”是指由个体(例如人类)表现出的免疫应答，当个体随后暴露于野生型RSV和/或感染所述野生型RSV时预防严重下呼吸道疾病(例如，肺炎和/或毛细支气管炎)。

嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)

天然存在的RSV颗粒通常含有螺旋核衣壳内由基质蛋白围绕的病毒基因组和含有糖蛋白的包膜。人类野生型RSV的基因组编码蛋白质NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2-1、M2-2以及L。G、F和SH是糖蛋白。RSV聚合酶活性由大蛋白(L)和磷蛋白(P)组成。病毒M2-1蛋白在转录期间使用并且可能是转录酶复合物的组分。病毒N蛋白用于在复制期间衣壳包装新生的RNA。

基因组在宿主细胞的细胞质中转录和复制。宿主细胞转录通常引起十个甲基化和聚腺苷酸化mRNA的合成。反基因组是在复制期间产生的基因组的正义RNA补体，其进而用作基因组合成的模板。病毒基因由保守性基因起始(GS)和基因终止(GE)序列侧接。在基因组的3′和5′端是前导和尾段核苷酸。野生型前导序列含有3’端的启动子。当病毒聚合酶达到GE信号时，聚合酶聚腺苷酸化并且释放mRNA并在下一个GS信号处重新开始RNA合成。据信L-P复合物负责启动子识别、RNA合成、mRNA 5′端加帽和甲基化以及其3′端的聚腺苷酸化。据信聚合酶有时与基因在接点处解离。因为聚合酶在基因组的3′端处开始转录，这导致表达的梯度，其中在基因组3′端处的基因比在5′端处的那些基因更频繁地转录。

为了复制基因组，聚合酶不响应于顺式作用的GE和GS信号并且生成基因组的正义RNA补体反基因组。在反基因组的3′端处是尾段的补体，其含有启动子。聚合酶使用此启动子生成基因组有义RNA。与作为裸RNA释放的mRNA不同，反基因组和基因组RNA在它们合成时用病毒核蛋白(N)衣壳包装。

在翻译病毒mRNA之后，产生全长(+)反基因组RNA作为(-)RNA基因组的复制模板。感染性重组RSV(rRSV)颗粒可以从转染的质粒回收。RSV N、P、L和M2-1蛋白的共表达以及全长反基因组RNA足以进行RSV复制。参见Collins等人，Proc Natl Acad Sci U S A.，1995，92(25)：11563-11567以及美国专利号6,790,449。

在某些实施方案中，本公开涉及RSV F多肽的某些希望的序列以及编码所述多肽的重组核酸。在某些实施方案中，本公开涵盖包含编码这些多肽的核酸的重组载体以及包含所述载体的细胞。在某些实施方案中，所述载体包含选择性标记或报告基因。

用于保存RSV的常见载体包括质粒和细菌人工染色体(BAC)。通常，细菌人工染色体包含一种或多种选自由因子F的oriS、repE、parA和parB基因组成的组的基因，其与选择性标记可操作地组合，例如提供抗生素抗性的基因。核酸序列可以任选地突变的病毒的基因组或反基因组序列，例如任选地突变的RSV病毒株。

在大肠杆菌细菌中培养RSV可以通过利用细菌人工染色体(BAC)来实现。用于保存和遗传工程化RSV的BAC载体已报告于Stobart等人，Methods Mol Biol.，2016，1442：141-53以及美国专利申请公布号2012/0264217中。所公开的BAC含有呼吸道合胞病毒(RSV)病毒株A2除F基因之外的完全反基因组序列，其为RSV病毒株品系19的反基因组序列。连同辅助质粒，其可用于反向遗传学系统中以用于回收感染性病毒。质粒上的反基因组序列可以被突变，之后回收病毒以生成具有所需突变的病毒。

在某些实施方案中，本公开涉及生成呼吸道合胞病毒(RSV)颗粒的方法，其包括将具有BAC基因和RSV反基因组的载体插入到分离的真核细胞中并且在使RSV病毒体形成的条件下将一种或多种选自由以下组成的组的载体插入到细胞中：编码RSV的N蛋白的载体、编码RSV的P蛋白的载体、编码RSV的L蛋白的载体、以及编码RSV的M2-1蛋白的载体。将载体插入到细胞中可以通过在使载体进入细胞的条件下物理地注射、电穿孔、或混合细胞和载体来进行。

涵盖嵌合RSV包含某些突变、缺失或变体组合，诸如RSV的冷传代(cp)非温度敏感性(ts)衍生物cpRSV，诸如rA2cp248/404/1030ΔSH。rA2cp248/404ΔSH含有4个独立的减毒遗传元件：cp，其基于在一起赋予cpRSV非-ts减毒表型的N和L蛋白以及F糖蛋白中的5个错义突变；ts248，其为L蛋白中的错义突变；ts404，其为M2基于的基因起始转录信号中的核苷酸取代；以及ΔSH，其为SH基因的完全缺失。rA2cp248/404/1030ΔSH含有5个独立的减毒遗传元件：存在于rA2cp248/404ΔSH和ts1030中的那些、L蛋白中的另一个错义突变。参见Karron等人，J Infect Dis.，2005，191(7)：1093-1104，所述文献以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，涵盖RSV反基因组可含有非必需基因(例如，SH、NS1、NS2、以及M2-2基因)中的缺失或突变或其组合。

由于遗传密码子的冗余，个别氨基酸由多个密码子序列编码，所述密码子有时称为同义密码子。在不同物种中，更多或更少频率地使用同义密码子，有时称为密码子偏好性。在将同义密码子低度代表到基因编码序列中的遗传工程已显示引起蛋白质翻译速率降低而不会改变蛋白质的氨基酸序列。Mueller等人报告通过密码子偏好性的改变进行的病毒减毒。参见Science，2008，320：1784。还参见WO/2008121992、WO/2006042156、Burns等人，J Virology，2006，80(7)：3259以及Mueller等人，J Virology，2006，80(19)：9687。

RSV中密码子去优化的使用报告于Meng等人，MBio 5，e01704-01714(2014)以及美国专利申请公布号2016/0030549中。在某些实施方案中，本公开涉及分离的核酸、具有密码子去优化的重组呼吸道合胞病毒(RSV)、由其产生的疫苗、以及与其相关的疫苗接种方法。在某些实施方案中，密码子去优化是处于非结构性基因NS1和NS2中以及任选地处于基因L中。在其他实施方案中，基因SH是缺失的。在其他实施方案中，基因F的缺失的，例如具有位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K、以及位置371处的Y、以及位置557处的V的氨基酸模式的RSV F蛋白。

在某些实施方案中，本公开涉及分离的核酸，其编码野生型人类RSV或变体的去优化的基因NS1和/或NS2以及任选地基因G以及任选地基因L，其中所述核苷酸被取代使得产生Gly的密码子是GGT，产生Asp的密码子是GAT，产生Glu的密码子是GAA，产生His的密码子是CAT，产生Ile的密码子是ATA，产生Lys的密码子是AAA，产生Leu的密码子是CTA，产生Asn的密码子是AAT，产生Gln的密码子是CAA，产生Val的密码子是GTA，或者产生Tyr的密码子是TAT，或者其组合。在某些实施方案中，分离的核酸中的基因还包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有个别密码子的组合。在某些实施方案中，分离的核酸中的基因包含至少20、30、40、或50或更多个密码子。

在某些实施方案中，本公开涉及如本文所公开的分离的核酸，其中所述核苷酸被取代，使得产生Ala的密码子是GCG，产生Cys的密码子是TGT，产生Phe的密码子是TTT，产生Pro的密码子是CCG，产生Arg的密码子是CGT，产生Ser的密码子是TCG，或者产生Thr的密码子是ACG，或者其组合。在某些实施方案中，含有核酸的基因还包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个或所有个别密码子的组合。在某些实施方案中，分离的核酸中的基因还包含至少20、30、40、或50或更多个密码子。

Glenn等人报告了在健康育龄女性中呼吸道合胞病毒重组融合(F)纳米颗粒疫苗的随机化、盲试的、受控的、剂量范围的研究。J Infect Dis.2016，213(3)：411-22。在某些实施方案中，本公开涉及含有本文报告的突变的F蛋白的病毒颗粒和病毒样颗粒(VLP)。病毒颗粒通常用作灭活疫苗(或杀灭疫苗)。RSV可以在培养中生长并且然后使用一种方法诸如加热或甲醛杀灭。活减毒疫苗通常变弱，使得复制和/或感染速率减慢。

在某些实施方案中，本公开涵盖一种嵌合RSV颗粒作为整体病毒疫苗，例如暴露于加热、化学品或辐射使得RSV的基因组是非复制性的或非感染性的整个病毒颗粒。在某些实施方案中，本公开涵盖一种裂解病毒疫苗中的嵌合RSV颗粒，所述裂解病毒疫苗通过使用洗涤剂破坏病毒并且通过将如本文所公开的突变的F蛋白作为抗原净化来产生，以刺激免疫系统以产生对病毒的应答。

VLP高度类似于成熟病毒体，但是它们并不含有病毒基因组物质(即，病毒基因组RNA)。因此，VLP在自然界中是非复制性的。另外，VLP可以在VLP的表面上表达蛋白质。此外，由于VLP类似于完整病毒体并且是多价微粒结构，所以VLP可以有效于诱导表面蛋白质的中和抗体。VLP可以重复施用。

在某些实施方案中，本公开涵盖包含表面上的本文公开的突变的F蛋白以及流感病毒基质(M1)蛋白核心的VLP。Quan等人报告产生由流感病毒基质(M1)蛋白核心和表面上的RSV-F构成的病毒样颗粒(VLP)的方法J Infect Dis.2011，204(7)：987-995。可以生成表达RSV F和流感M1的重组杆状病毒(rBV)并且将它们转染到昆虫细胞中以用于生产。

使用方法

在某些实施方案中，本公开涉及包含免疫有效量的嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)、RSV多肽、RSV颗粒、RSV病毒样颗粒、和/或本文所公开的核酸的免疫原性组合物。在某些实施方案中，本公开涉及用于刺激个体的免疫系统以产生针对RSV的保护性免疫应答的方法。在某些实施方案中，免疫有效量的本文所公开的嵌合RSV、多肽和/或核酸以生理上可接受的载剂施用至个体。

在某些实施方案中，本公开涉及包含本文所公开的核酸的药物和疫苗产品以用于本文所公开的用途。

在某些实施方案中，本公开涉及本文所公开的核酸或载体用于制造用于本文所公开的用途的药物的用途。

本公开还提供分析其他类型的减毒突变并将它们并入到嵌合RSV中以用于疫苗或其他用途的能力。例如，小鼠的肺炎病毒的组织培养采用的非致病性病毒株(RSV的鼠类配对物)缺乏G蛋白的细胞质尾部(Randhawa等人，Virology 207：240-245(1995))。通过模拟，RSV糖蛋白、F、G和SH中每一种的细胞质和结构域可以被缺失或修饰以实现减毒。

用于本公开的感染性RSV中的其他突变包括在RSV微基因组的突变分析期间识别的顺式作用信号中的突变。例如，前导和尾段以及侧接序列的插入和缺失分析鉴定病毒启动子和转录信号并且提供一系列与RNA复制或转录的不同减少程度相关的突变。这些顺式作用信号的饱和诱变(由此每个位置进而被修饰至每个核苷酸替代物)也已鉴定减少(或在一种情况下增加)RNA复制或转录的许多突变。任何这些突变可以插入到如本文所述的完全反基因组或基因组中。其他突变涉及用来自反基因组的对应物置换基因组的3′端，这与RNA复制和转录中的改变相关。另外，基因间区(Collins等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4594-4598(1986)，所述文献以引用的方式并入本文)可以缩短或加长或序列内容发生改变，并且天然存在的基因重叠(Collins等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5134-5138(1987)，所述文献以引用的方式并入本文)可以通过本文所述的方法去除或改变成不同的基因间区。

对于疫苗用途，根据本公开产生的病毒可以直接用于疫苗制剂中，或者按需要使用技术人员已熟知的冻干方案冻干。冻干病毒通常将维持在约4℃下。当准备好使用时，在稳定溶液例如盐水或包含SPG、Mg和HEPES、具有或不具有佐剂的溶液中重构冻干病毒，如下文进一步描述的。

通常，本公开的RSV疫苗包含作为活性成分的免疫有效量的如本文所述地产生的RSV。修饰的病毒可以使用生理上可接受的载剂和/或佐剂引入到受试者中。有用的载剂是本领域中已熟知的并且包括例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。可将所得水溶液包装用于原样使用，或冻干，在施用之前，将冻干的制剂与无菌水性载体组合，如以上所提及的。当需要接近生理条件时，组合物可以含有药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。可接受的佐剂包括不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、或矾，它们是本领域已熟知的材料。

在用如本文所述的RSV组合物免疫接种后，通过气溶胶、液滴、局部或其他路径，受试者的免疫系统通过产生对RSV病毒蛋白例如F糖蛋白有特异性的抗体来响应于疫苗。由于疫苗接种，受试者变得对RSV感染至少部分或完全免疫，或者抵抗发展的中度或严重RSV感染，特别是下呼吸道的感染。

施用疫苗的受试者可以是容易被RSV或紧密相关病毒感染的任何哺乳动物并且所述受试者能够生成针对疫苗接种的病毒株的抗原的保护性免疫应答。因此，适合受试者包括人类、非人灵长类、牛、马、猪、绵羊、山羊、兔(lagamorph)、啮齿类动物等。因此，本公开提供用于形成用于多种人类和兽医用途的疫苗的方法。

含有本公开的RSV的疫苗组合物施用至容易RSV感染或另外处于RSV感染的风险下的受试者以增强受试者自身免疫应答能力。将此量定义为“免疫有效剂量”。在此使用中，精确量再次取决于受试者的健康状态和体重、施用模式、制剂性质。疫苗制剂应提供足以有效保护受试者患者使其免于严重或威胁生命的RSV感染的量的本公开的修饰的RSV。

根据本公开产生的RSV可以与其他亚型或病毒株的病毒组合以实现针对多种RSV亚型或病毒株的保护性，或者这些病毒株的保护性表位可以被工程化到如本文所述的一种病毒中。通常，不同病毒将混合并且同时施用，但是也可以单独施用。例如，由于两种RSV亚型的F糖蛋白的不同之处在于氨基酸序列的仅约11％，此相似性是如用RSV或F抗原免疫的和用异源病毒株攻击的动物中观察到的交叉保护性免疫应答的基础。因此，用一种病毒株进行免疫接种可以防御相同或不同亚型的不同病毒株。

在一些情况下，可能希望将本公开的RSV疫苗与诱导针对其他试剂、特别是其他儿童病毒的保护性应答的疫苗组合。例如，本公开的RSV疫苗可以与副流感病毒疫苗同时施用，诸如Clements等人，J.Clin.Microbiol.29：1175-1182(1991)中所述的，所述文献以引用方式并入本文中。在本公开的另一方面，RSV可以通过将编码保护性抗原的序列并入到用于产生如本文所述的感染性RSV的RSV基因组或反基因组来用作用于其他呼吸道病原体诸如副流感病毒的保护性抗原的载体。

可以进行本公开的疫苗组合物的单次或多次施用。在新生儿和婴儿中，可能需要连续施用以引发足够水平的免疫力。施用可以按需要在生命第一个月内、约两个月大之前开始，通常不迟于六个月大，并且在整个儿童期以一定间隔开始，诸如在两个月、六个月、一年以及两年内，以维持针对天然(野生型)RSV感染的足够水平的保护。类似地，特别容易重复或严重RSV感染的成人，例如像健康护理工人、每日护理工人、年幼儿童的家庭成员、老人(超过55、60或65岁)、或具有受损的心肺功能的个体，可能需要多次接种以建立和/或维持保护性免疫应答。诱导的免疫力水平可以通过测量中和分泌和血清抗体的量来监测，并且按需要调节剂量或重复疫苗接种，以维持所需水平的保护。另外，不同疫苗病毒可以对于不同接受者组是有利的。例如，表达T细胞表位中富含的另外的蛋白质的工程化RSV病毒株可能对成年人特别有利，而非对婴儿有利。

在本公开的另一方面，将RSV用作用于呼吸道瞬时基因疗法的载体。根据此实施方案，重组RSV基因组或反基因组并入能够编码目标基因产物的序列。目标基因产物处于与控制RSV表达的启动子相同或不同的启动子的控制下。通过共表达重组RSV基因组或反基因组与N、P、L和M2-1蛋白并含有编码目标基因产物的序列来产生的感染性RSV被施用至患者。施用通常通过气溶胶、喷雾器、或其他局部应用来对待治疗的患者的呼吸道进行。重组RSV以足以引起治疗或预防水平的所需基因产物表达的量施用。在此方法中施用的代表性基因产物的实例包括编码的那些，例如特别适用于瞬时表达的那些，例如白介素-2、白介素-4、γ干扰素、GM-CSF、G-CSF、促红细胞生成素、以及其他细胞因子、葡糖脑苷脂酶、苯丙氨酸羟化酶、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、细胞毒素、肿瘤抑制基因、反义RNA、以及疫苗抗原。

在某些实施方案中，本公开涉及包含免疫有效量的本发明的重组RSV(例如，减毒活重组RSV或灭活的不复制的RSV)、免疫有效量的本文所公开的多肽、和/或免疫有效量的本文所公开的核酸的免疫原性组合物(例如疫苗)。

在某些实施方案中，本公开涉及用于刺激个体的免疫系统以产生针对RSV的保护性免疫应答的方法。在所述方法中，向个体施用在生理上可接受的载剂中的免疫有效量的本文所公开的重组RSV、免疫有效量的本文所公开的多肽和/或免疫有效量的本文所公开的核酸。

通常，载剂或赋形剂是药学上可接受的载剂或附加险，诸如无菌水、水性盐水溶液、含水缓冲盐水溶液、水性右旋糖溶液、水性甘油溶液、乙醇、或其组合。根据本领域已建立的方案实现确保无菌性、pH、等渗性和稳定性的此类溶液的制剂。通常，选择载剂或赋形剂以使过敏和其他不希望的作用最小化并且适应具体施用路径，例如皮下、肌内、鼻内、口服、局部等。所得水溶液可以例如被包装以按原样使用或者冻干，冻干制剂在施用之前与无菌溶液组合

在某些实施方案中，以足以刺激对一种或多种RSV病毒株有特异性的免疫应答的量施用RSV(或RSV组分)(例如，施用免疫有效量的RSV或RSV组分)。优选地，施用RSV引发保护性免疫应答。用于引发保护性抗病毒免疫应答的、可适于产生针对RSV的保护性免疫应答的剂量和方法为本领域技术人员已知的。参见例如，美国专利号5,922,326；Wright等人(1982)Infect.Immun.37：397-400；Kim等人(1973)Pediatrics 52：56-63；以及Wright等人(1976)J.Pediatr.88：931-936。例如，病毒可以每个施用的剂量约10³-10⁶pfu(噬斑形成单位)(例如，每个施用的剂量10⁴-10⁵pfu)范围提供。通常，剂量将基于例如年龄、身体状况、体重、性别、饮食、施用模式和时间、以及其他临床因素。疫苗制剂可以例如通过使用针和注射器或无针注射装置皮下或肌内注射来全身性施用。优选地，例如通过滴剂、气溶胶(例如，大颗粒气溶胶(大于约10微米))或喷雾剂将疫苗制剂施用到上呼吸道鼻内。虽然任何以上递送路径引起保护性全身性免疫应答，但是鼻内施用赋予在病毒进入部位引起粘膜免疫力的增加的益处。对于鼻内施用，减毒活病毒疫苗通常是优选的，例如减毒的适冷性和/或温度敏感性重组RSV，例如嵌合重组RSV。作为减毒活病毒疫苗的替代方案或除所述减毒活病毒疫苗之外，可以使用例如杀灭的病毒疫苗、核酸疫苗和/或多肽亚基疫苗，如Walsh等人(1987)J.Infect.Dis.155：1198-1204以及Murphy等人(1990)Vaccine 8：497-502所提出的。

在某些实施方案中，减毒重组RSV用于疫苗中并且是足够减毒的，使得感染症状或至少严重感染症状将不会出现在大部分用减毒RSV免疫(或另外感染)的个体中-在其中病毒组分(例如本文中的核酸或多肽)用作疫苗或免疫原性组分的实施方案中。然而，毒力通常充分消除，使得轻度或严重下呼吸道感染通常不会发生在疫苗接种或偶然的受试者。

虽然使用单一剂量刺激保护性免疫应答是优选的，但是可通过相同或不同路径施用另外的剂量，以实现所需预防性作用。在新生儿和婴儿中，例如可能需要多次施用以引发足够水平的免疫力。施用可以按需要在整个儿童期以一定间隔继续，以维持针对野生型RSV感染的足够水平的保护。类似地，特别容易重复或严重RSV感染的成人，例如像健康护理工人、每日护理工人、年幼儿童的家庭成员、老人、以及具有受损的心肺功能的个体，可能需要多次接种以建立和/或维持保护性免疫应答。诱导的免疫力水平可以例如通过测量病毒中和分泌和血清抗体的量来监测，并且按需要调节剂量或重复疫苗接种，以引发和维持所需水平的保护。

可替代地，免疫应答可以通过用病毒离体或体内靶向树突细胞来刺激。例如，增殖的树突细胞暴露于足够量的病毒中并且持续足够时间段，以允许树突细胞捕获RSV抗原。然后将细胞转移至待通过标准静脉内移植方法疫苗接种的受试者中。

任选地，用于施用RSV的制剂也含有用于增强对RSV抗原的免疫应答的一种或多种佐剂。涵盖的佐剂包括铝盐诸如和涵盖的佐剂包括水包油溶液，其中油用作水相中的溶质并且形成分离的液滴，通过乳化剂稳定。在某些实施方案中，乳液含有角鲨烯或α-生育酚(生育酚E)和另外的乳化剂诸如作为表面活性剂的脱水山梨糖醇三油酸酯和聚山梨酸酯-80(PS80)。在某些实施方案中，乳液含有吡喃葡糖基脂质A(GLA)。GLA可以用单独的嵌合RSV颗粒或RSV F蛋白或在角鲨烯基水包油稳定乳液(SE)中配制。Iyer等人报告使用呼吸道合胞病毒融合蛋白(RSV-F)的不同颗粒尺寸的水包油佐剂。Hum Vaccin Immunother，2015，11(7)：1853-1864

适合的佐剂包括例如：完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂草苷、矿物凝胶(诸如氢氧化铝)、表面活性剂物质(诸如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳液)、卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌、以及合成的佐剂QS-21。

如果需要，可以进行RSV的预防性疫苗施用结合一种或多种免疫刺激分子的施用。免疫刺激分子包括具有免疫刺激、免疫增强和促炎性活性的不同细胞因子、淋巴因子和趋化因子，诸如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如，粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF))；以及其他免疫刺激分子，诸如巨噬细胞炎性因子、Flt3配体、B7.1；B7.2等。免疫刺激分子可以与RSV相同的制剂施用，或者可以单独施用。可以施用蛋白质或编码蛋白质的表达载体以产生免疫调节作用。

尽管用特定亚型的特定病毒株的减毒RSV疫苗接种个体可以诱导针对不同病毒株和/或亚型的RSV的交叉保护，但是如果需要的话可以通过用来自至少两种病毒株的减毒RSV疫苗接种个体来增强交叉保护性，例如每种病毒株表示不同的亚型。类似地，减毒RSV疫苗可以任选地与诱导针对其他感染剂的保护性免疫应答的疫苗组合。

嵌合RSV病毒的组装和回收

以下重组病毒：A2、A2-品系19F、A2-品系19F(M79I)、A2-品系19F(R191K)、A2-品系19F(K357T)、A2-品系19F(Y371N)、A2-品系19F(I557V)、A2-品系19F(K357T/Y371N)、以及A2-mKate2-2-20F/G可以如以下所述地制备：

Hotard等人.Identification of residues in the human respiratorysyncytial virus fusion protein that modulate fusion activity andpathogenesis.J Virol 89，512-522(2015)。

Meng等人.Respiratory Syncytial Virus Attachment GlycoproteinContribution to Infection Depends on the Specific Fusion Protein.Journal ofvirology 90，245-253(2015)

Hotard等人.A stabilized respiratory syncytial virus reverse geneticssystem amenable to recombination-mediated mutagenesis.Virology 434，129-136(2012)。

通过修饰含有A2-mKate2-品系19F(I557V)的公布的BAC来生成OE4的细菌人工染色体(BAC)构建体。远红外荧光报告蛋白单体Katushka 2(mKate2，K)的基因是处于RSV反基因组cDNA的第一基因位置中。在此位置中包含mKate2不会在体外或小鼠内减毒RSV。通过重组介导的诱变(重组工程)进行SH的缺失(ΔSH)。使用以下寡核苷酸(Integrated DNATechnologies/IDT)PCR-扩增galK盒，使得扩增子末端与靶位点同源以用galK替换SH：dSH50f(SEQ ID NO：5)5’-AGATCTAGTACTCAAATAAGTTAATAAAAAATATACACATGGACGTCCATCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA-3’)，其中加下划线部分表示紧接在BAC中的SH基因起始上游的50nt，以及dSH50r(SEQ ID NO：6)5’-GTCTTAGCGGTGCGTTGGTCCTTGTTTTTGGACATGTTTGCATTTGCCCCTCAGCACTGTCCTGCTCCTT-3’)，其中加下划线部分表示以BAC中的G基因起始开始的50nt的补体。引物的未加下划线部分对galK盒有特异性，如37所述。大肠杆菌中的重组能够用galK盒替换SH，其从基因起始开始至SH-G基因间区。将以下互补寡核苷酸退火并用于在第二重组工程步骤中去除galK盒：dSH100f(SEQ ID NO：7)5’-AGATCTAGTACTCAAATAAGTTAATAAAAAATATACACATGGACGTCCATGGGGCAAATGCAAACATGTCCAAAAACAAGGACCAACGCACCGCTAAGAC-3’)和dSH100r(SEQ ID NO：8)5’-GTCTTAGCGGTGCGTTGGTCCTTGTTTTTGGACATGTTTGCATTTGCCCCATGGACGTCCATGTGTATATTTTTTATTAACTTATTTGAGTACTAGATCT-3’)。通过测序确认SH的精确缺失，产生A2-K-ΔSH-品系19F(I557V)BAC。

从用于回收A2-dNSh的BAC消化人类密码子去优化NS1和NS2编码区(dNSh)并且将其连接到A2-K-ΔSH-品系19F(I557V)BAC中，从而产生A2-K-dNSh-ΔSH-品系19F(I557V)。此构建体用于回收OE4+野生型A2 G(称为OE4+wtG)。通过基于对A2的RSV G序列的人类密码子使用偏好最少频率使用的所有密码子的计算机取代进行G的密码子去优化。引入点突变(M48I)以消融G的分泌形式。通过GenScript合成密码子去优化的G(dG)的编码区并且通过限制性消化并连接到A2-K-dNSh-ΔSH-品系19F(I557V)BAC中来克隆，从而产生A2-K-dNSh-ΔSH-dG-品系19F(I557V)，产生OE4的回收性BAC。

通过借由以上所述的方法将布宜诺斯艾利斯共有F(BAF)基因序列克隆到OE4+wtGBAC中来生成用于回收BAF的BAC。通过将品系19F残基K357和Y371引入到BAF编码序列中来生成BAF-357/371。通过重组工程生成用于回收A2-ΔM2-2的BAC。已对M2-2的ΔM2-238234nt(从第7个密码子至终止密码子)进行缺失。使用以下寡核苷酸PRC-扩增galK盒以用于第一重组工程步骤：delM2-1-f(SEQ ID NO：9)5’-TTAGTGATACAAATGACCATGCCAAAAATAATGATACTACCTGACAAATACCTGTTGACAATTAATCATCGGCA-3’)和delM2-2-r(SEQ ID NO：10)5’-ATTGTTTGAATTAATAATGTAACGATGTGGTGAGTGTTAGAATTGAGTGTTCAGCACTGTCCTGCTCCTT-3’)。将以下互补寡核苷酸退火并用于第二重组工程步骤：M22_100f(SEQ ID NO：11)5’-TTAGTGATACAAATGACCATGCCAAAAATAATGATACTACCTGACAAATAACACTCAATTCTAACACTCACCACATCGTTACATTATTAATTCAAACAAT-3’)，以及M22_100r(SEQ ID NO：12)5’-ATTGTTTGAATTAATAATGTAACGATGTGGTGAGTGTTAGAATTGAGTGTTATTTGTCAGGTAGTATCATTATTTTTGGCATGGTCATTTGTATCACTAA-3’)。通过测序确认靶向234nt的精确缺失。

在BSR-T7/5细胞中回收重组病毒，并且在Vero细胞中繁殖病毒原液。

通过首先使以下A和B病毒株(GeneArt，Invitrogen)的F和G基因的cDNA合成来生成用于定量在棉鼠抗血清中的RSV nAb滴度的RSV病毒株组：RSVA/1998/12-21(JX069802)、Riyadh A/91/2009(JF714706/JF714710)；以及RSV B病毒株NH1276(JQ680988/JQ736678)、9320(AY353550)和TX11-56(JQ680989JQ736679)。通过限制性消化和连接将G和F基因区段克隆到A2-KBAC中，并且通过转染到BSR-T7/5细胞中，随后原液在HEp-2细胞中繁殖来回收报告基因病毒。

通过将RSV反基因组BAC与表达RSV N、P、M2-1或L蛋白的人类密码子优化的辅助质粒共转染到BSR T7/5细胞中来回收重组病毒。随后使疫苗病毒株的母株和工作病毒原液繁殖并且在Vero细胞中收获。

前-F抗原ELISA

将病毒等分试样解冻并在MEM中稀释以产生高滴度原液悬浮液。将100μL每种病毒原液悬浮液添加到高结合Costar测定板(Corning)的三次重复系列孔中。将平板盖上并且在室温下孵育过夜。次日，从板中去除病毒悬浮液并且将板用每孔150μL PBS-Tween(PBST，PBS中的0.05％Tween20)洗涤一次，接着每孔添加150μL 5％BSA(在PBS中)，以用于封闭。将板在室温下孵育2h。通过U蛋白表达(U-Protein Express)在HEK293-X2FreeStyle细胞中使用人类密码子优化的VH和VL序列来生成前-F(Pre-F)特异性mAb MPE839。通过NancyUlbrandt(MedImmune/AZ)提供结合前-F和后-F(post-F)的莫维珠单抗mAb。通过将抗体以PBS稀释至1μg/mL之后通过以1％BSA系列稀释进一步稀释1∶10,000至1∶320,000来制备MPE8和莫维珠单抗抗体。在封闭之后，将板用每孔150μL的PBST再次稀释一次，之后将100μL稀释的第一抗体应用于所述孔。将板在室温下孵育2h，之后取出并用每孔150μL的PBST洗涤三次。在洗涤之后，应用100μL于1％BSA中1∶10,000稀释的抗人类-HRP抗体并且将板在室温下孵育一小时。然后取出板并用150μL PBST洗涤3次，之后将100μL预先混合的反应性底物试剂混合物(R&D Systems)应用于催化比色反应。将板覆盖并孵育大约10分钟，之后通过添加100μL 0.2N硫酸来淬灭反应。在ELISA板读取器上在450nm下读取板。所收集吸光度读取从背景中减去并且绘制成曲线。将MPE8(前-F)的曲线下面积与莫维珠单抗(前-F和后-F，总F)的比率用于测定归一化至总F的前-F水平。

在Vero中生长

BEAS-2B、NHBE和HAE细胞。从6孔板中的70％汇合Vero或BEAS-2B细胞抽出培养基，并且将MOI为0.01的0.5mL病毒添加到重复孔中，以获取每种病毒株的每个时间点。将板在室温下摇动1h。在感染之后，将病毒小心抽出并且将单层用1mL PBS洗涤两次，之后添加2mL预先升温的完全E-MEM(Vero)或RPMI(BEAS-2B)。将板在37℃和5％CO2下孵育几个时间进程的持续时间。在感染后1、12、24、36、48、72、以及96h获得时间点。在每个时间点，将单层丢弃到上清液中，简短涡旋，并在液氮中快速冷冻，之后保存在-80℃下。来自两种供体的NHBE细胞在ALI下分化并且将单层用PBS洗涤，之后用MOI为2.6的100μL病毒向顶地感染。使病毒在37℃下孵育2h，之后移除，并且用PBS进行3次随后的洗涤。在指定时间点，将150μL不具有诱导剂的分化培养基在顶部表面上在37℃下孵育10min，之后收获并转移到微量离心管中。重复所述过程，以产生总计300μL合并的顶端洗液，将其在液氮中冷冻并保存在-80℃下以用于随后滴定。类似于NHBE感染，来自两种供体的HAE细胞在ALI下分化，将顶部表面用PBS洗涤，并且用6.7的初始MOI感染。在37℃下孵育2h之后，抽出病毒接种物，将顶部层用PBS洗涤3次并且将培养物在37℃下孵育。对于每个指定的时间点，将顶部层在37℃下用425μL培养基洗涤30min并且将悬浮液保存在-80℃下。如以上所述的，对HEp-2或Vero细胞进行FFU滴定的所有分析。

病毒载量、中和滴度和小鼠中的保护性

对于病毒载量的测定，在镇静作用下用100μL无血清MEM中的病毒i.n.感染7周大的雌性BALB/c小鼠(Charles River)。在第2、4、6和8天，使小鼠安乐死并且收获左肺以用于病毒FFU滴度测定。低于检测限的滴度被指定为等于检测限一半的值。对于血清nAb滴度的测定和攻击研究，用100μL无血清MEM中的病毒i.n.感染7周大的雌性BALB/c小鼠(Jackson)。在第35、70和100天，给小鼠服镇静剂并且通过下颌下静脉出血来获得血清样品。将血清保存在-80℃下，直到通过FFU微量中和测定来定量。中和滴度通过将热灭活(56℃，30min)血清在37℃下共孵育1h来确定，所述血清已用50-100FFU病毒连续稀释两倍。然后在2900x g下在4℃下将血清病毒混合物旋转接种到96孔板中的HEp-2单层上持续30min，之后与完全MEM中的0.75％甲基纤维素叠层。2天后计数每个孔的FFU，并且通过非线性回归分析来测定EC50滴度。为了在疫苗接种之后攻击小鼠，在接种后第102天给小鼠服镇静剂并且用105PFU A2-品系19F i.n.感染小鼠。在4天之后，通过对HEp-2细胞进行噬斑测定来测定左肺上的病毒载量。

具有增强的热稳定性和免疫原性的活减毒RSV疫苗

像其他副粘病毒融合肽一样，RSV融合糖蛋白(RSV F)是介导病毒包膜和靶细胞的融合的I型整合膜蛋白。RSV F最初在病毒体膜中组装为亚稳融合前构象中的三聚物。触发引起F主要再折叠成融合后形式，其接近于病毒和靶膜并介导融合。由于前-F和后-F二者存在于制备的病毒原液中的RSV病毒体上，使用基于ELISA的方法评价RSV原液中的前-F抗原的相对量。在原型A2病毒株的背景下表达病毒株品系19的F蛋白的病毒株A2-品系19F表现出比病毒株A2显著更高的与前-F特异性mAb的相对结合。用A2-品系19F鼻内(i.n.)接种BALB/c小鼠引起比A2更高的nAb滴度。

存在品系19F所特有的五种氨基酸残基：M79、R191、K357、Y371、以及I557。对在每个这些位置处含有A2残基的A2-品系19F突变体上进行的前-F抗原ELISA显示残基K357和Y371对于品系19F前-F抗原水平是重要的。

RSV被认为是不耐热性病毒，并且高温可引发过渡到RSV后-F构象。具有增强的前-F水平的RSV应更耐受温度灭活。RSV A2-品系19F感染性随着时间在4℃和37℃下比A2更具热稳定性，所述A2是部分通过品系19F的K357和Y371残基介导的表型。将K357和Y371引入到遗传趋异的疫苗病毒株DB1的F中，所述疫苗病毒株表达抗原B亚型“布宜诺斯艾利斯”(BAF)进化枝的共有F基因。先前描述DB1的生成，所述DB1还含有具有基因型RSV-A2-dNS1-dNS2-ΔSH-BAF的密码子去优化非结构性蛋白质基因和缺失的SH基因。DB1表达低水平的前-F抗原并且是热不稳定的；然而，并入K357和Y371残基以生成DB1-357/371增强了MPE8结合并且部分恢复热稳定性。这些数据表明残基357和371不仅控制MPE8结合即前-F抗原水平的相关性，而且控制病毒对病毒原液中的热灭活的抗性。

RSV LAV(称为OE4)通过将品系19F并入多组分疫苗中来生成。对NS1和NS2基因进行密码子去优化，所述基因编码RSV的两种非结构性蛋白质，所述蛋白质通过靶向干扰素途径并抑制细胞凋亡来抑制宿主先天性免疫力。对NS1和NS2基因进行的密码子去优化是遗传上稳定的并且减少了NS1和NS2蛋白质表达，从而在小鼠中产生具有轻微增强的免疫原性的病毒减毒。小疏水性(SH)蛋白质基因被缺失，其目标在于通过改变其与病毒前导序列的接近性来增加下游病毒基因(包括F)转录。SH的缺失在小鼠和黑猩猩中也是轻度减毒的，但是在先前研究中在儿童中没有赋予疫苗候选物明显减毒。RSV连接(G)糖蛋白基因被密码子去优化，并且G的分泌形式通过点突变来消融。RSV表达G的膜结合形式(G_m)和分泌形式(G_s)，所述形式不是永生化细胞系中病毒复制所需要的。RSV G能够引发保护性中和抗体。然而，G的保守性小于F并且通过趋化因子模拟来抑制先天性免疫应答。G_s充当抗原假目标并且可以通过与C型凝集素相互作用来改变树突细胞信号传导和活化。OE4疫苗候选物的所得基因型是RSV-A2-dNS1-dNS2-ΔSH-dG_m-Gs_空-品系19F。使用蛋白质印迹，确定OE4与亲本A2相比具有增加的NS1、NS2和G的表达水平。OE4具有比A2-品系19F更高的F表达水平，这可能是归因于SH的缺失。

分析OE的MPE8和D25结合，并且测量在4℃和37℃下的疫苗热稳定性。类似A2-品系19F，OE4表现出通过抗体结合产生的高相对前-F抗原水平和与品系19F蛋白的表达一致的热稳定性。通过来自在4℃下孵育的病毒原液的OE4和A2随着时间的MPE8结合来定量所测量的前-F稳定性。在两种病毒中在8天的时间段内相对前-F抗原水平降低。因此，A2和OE4感染性的热稳定性的动力学并不与前-F抗原水平的减少相关。然而，OE4与A2相比在每个时间点维持前-F抗原水平的大于两倍的水平，并且前-F最小阈值可足以维持感染性。

为了评定病毒体的总体结合和糖蛋白到RSV A2和OE4中的并入，对从BEAS-2B细胞出芽的病毒进行薄剖面透射电镜(TEM)、天然免疫-TEM和低温电子断层扫描术(低温-ET)。BEAS-2B是永生性人类支气管上皮细胞系。病毒感染的细胞和释放的病毒体在最少样品加工之后进行分析以使病毒体的天然结构的保留最大化。首先，使用优先结合前-F(MPE8)、后-F(131-2A)、总F(莫维珠单抗)、或G(131-2G)的mAb进行天然免疫金标记以及薄剖面TEM。对每种病毒和免疫标记定量每个膜长度的金颗粒密度。OE4病毒颗粒可能由于SH缺失而表现出比A2大的并入的前-F和总F的密度。在A2和OE4颗粒的表面上检测到的后-F的量不存在显著差异。OE4颗粒上的G蛋白密度显著减少，如G基因的密码子去优化情况下预期的。

OE4疫苗候选物在体外通过测量永生化细胞和原生人类气管上皮细胞中的减毒水平来表征。在用于病毒原液生成的Vero细胞中，OE4生长至稍微低于亲本未减毒A2-品系19F的滴度。在BEAS-2B细胞中OE4相对于野生型更减毒。然后评价原生人类气道上皮细胞中的OE4生长，所述细胞为用于接近血清阴性儿童中的RSV LAV减毒的已建立的系统。实现两种模型NHBE-ALI和HAE-ALI并且发现OE4在两种模型中显著减毒并且在通过培养进行的扩展中表现出缺陷。在OE4中G的密码子去优化显著促成与NHBE-ALI中表达野生型G的OE4(OE4+wtG)相比的减毒水平，这可能是由于G在原生细胞中的先前所述的附着作用。在BALB/c小鼠中，OE4是适度减毒的并且发出等同于A2-品系19F和大于A2的nAb滴度。在i.n.接种之后，在第102天用A2-品系19F攻击小鼠，并且OE4-疫苗接种的小鼠完全防御所述攻击。

在临床测试之前在棉鼠中评价OE4。在棉鼠中，OE4是上呼吸道和下呼吸道中高度减毒并且OE4针对表示RSV多样性的一系列RSV病毒株诱导相对高的血清nAb水平。OE4-疫苗接种的棉鼠完全防御RSV攻击，不仅在肺中，而且在上呼吸道中。尽管高度减毒，但是OE4还建立有效粘膜免疫力。

由另一种RSV疫苗候选物福尔马林灭活的RSV的失败突出强调的主要问题是在自然感染时对于疾病的疫苗增强的初免的可能性。尽管RSV LAV候选物未显示引起增强的疾病，但在棉鼠中评价由OE4采用的新型疫苗接种策略是否在攻击时引起对于增强的疾病的初免。RSV攻击与空白相比在用OE4感染之后不会引起疾病增强。向相比之下，福尔马林灭活的RSV与OE4和空白相比不会引起与高细支气管周浸润和肺泡炎相关的疾病增强。

由低融合F蛋白减毒的嵌合呼吸道合胞病毒疫苗候选物是免疫原性的并且防御棉鼠中的攻击

布宜诺斯艾利斯F蛋白(BAF)当单独表达时与A2F和品系19F蛋白相比促融合性差。实施反向遗传学以设计LAV，其组合非结构性蛋白质NS1和NS2的基因的密码子去优化(dNS)；小疏水性蛋白质(ΔSH)基因的缺失；以及用布宜诺斯艾利斯进化枝(BAF)的低融合RSVB亚型F共有序列替换野生型融合物(F)蛋白质基因。此疫苗候选物RSV-A2-dNS-ΔSH-BAF(称为“DB1”)在原生人类气道上皮细胞和棉鼠的上气道和下气道的两种模型中得到减毒。DB1在棉鼠中也有高免疫原性并且针对一系列不同的重组RSV病毒株广泛引起中和抗体。当疫苗接种的棉鼠用野生型RSV A攻击时，与未疫苗接种动物相比DB1的病毒滴度在上气道和下气道中分别减少3.8log₁₀总PFU和2.7log₁₀PFU/g组织(P＜0.0001)。DB1因此是减毒的、高免疫原性的以及防御在棉鼠中RSV攻击的。DB1是第一RSV LAV以作为策略并入低融合F蛋白以减毒病毒复制并保存免疫原性。

在棉鼠上气道和下气道中DB1是大于10倍减毒的，还引发广泛nAb对一系列不同RSV A和B重组病毒株的高滴度。DB1还在棉鼠鼻腔冲洗样本中生成RSV-特异性IgA抗体形式的粘膜免疫力。当疫苗接种的小鼠用RSV攻击时，在鼻腔冲洗和肺灌洗样本二者中DB1使攻击病毒株滴度减少＞99％。因此，DB1是减毒的、高免疫原性的以及有效于防御在棉鼠中的RSV攻击。

Claims (19)

1.一种免疫原性组合物，其包含具有突变的基因的活减毒嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)，所述突变的基因编码具有位置79处的M、位置191处的R、位置357处的K、以及位置371处的Y的RSV F蛋白，条件是所述RSV F蛋白不具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。

2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，所述RSV F蛋白具有在位置557处的V，或者F蛋白被突变使得位置557为V。

3.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述RSV F蛋白具有SEQ ID NO：1或13。

4.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中编码RSV NS1、NS2和G蛋白的所述基因被密码子去优化，使得NS1、NS2和G的表达率在Vero细胞中与野生型A2病毒相比减少超过一半。

5.如权利要求4所述的免疫原性组合物，其中在哺乳动物细胞中G的表达率在Vero细胞中与所述野生型A2病毒相比减少超过十分之一(1/10)。

6.如权利要求4所述的免疫原性组合物，其中NS1的表达率在Vero细胞中与所述野生型A2病毒相比减少超过四分之一(1/4)。

7.如权利要求4所述的免疫原性组合物，其中NS2的表达率在Vero细胞中与所述野生型A2病毒相比减少超过四分之一(1/4)。

8.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中编码所述SH蛋白的所述基因是缺失或截短的。

9.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中编码F蛋白的所述基因是突变的，使得位置557不是V或者I处于位置557中。

10.如权利要求1-19所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂和/或其他药学上可接受的载剂。

11.如权利要求10所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂是铝凝胶、铝盐或单磷酰脂质A。

12.如权利要求10所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂是任选地包含α-生育酚、角鲨烯和/或表面活性剂的水包油乳液。

13.一种用于针对呼吸道合胞病毒免疫受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-14所述的免疫原性组合物。

14.一种核酸，其编码RSV F蛋白，使得位置79是I，位置191是K，位置357是T，并且位置371是N。

15.如权利要求15所述的核酸，其包含SEQ ID NO：14或变体。

16.一种载体，其包含如权利要求16所述的核酸。

17.如权利要求17所述的载体，其选自质粒或细菌人工染色体。

18.一种分离的重组颗粒，其包含RSV F蛋白，使得位置79是M，位置191是R，位置357是K，并且位置371是Y。

19.如权利要求19所述的分离的重组颗粒，其包含活减毒RSV基因组或反基因组。