ES2210273T5 - Virus con arn de cadena negativa no segmentado recombinante infeccioso. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA GENERACION DE VIRUS DE ARN DE CORDON NEGATIVO NO SEGMENTADO DE DUPLICACION INFECCIOSA, ENTERAMENTE A PARTIR DE ADNC. ESTE PROCESO OFRECE LA POSIBILIDAD DE INTRODUCIR MUTACIONES EN EL GENOMA DEL VIRUS MEDIANTE TECNICAS DE ADN RECOMBINANTE.
Description
Virus con ARN de cadena negativa no segmentado
recombinante infeccioso.
La presente invención se refiere a un mutante
del virus de la rabia replicativo infeccioso manipulado
genéticamente, así como a un procedimiento para la preparación de
dicho mutante.
El virus de la rabia (RV) es un ejemplo de virus
no segmentado con ARN de cadena negativa de la familia
Rhabdoviridae. Otras especies que pertenecen a esta familia
son el virus de la estomatitis vesicular (VSV), el virus de la
necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), el virus de la septicemia
hemorrágica vírica (VHS, virus de Egtved), el virus de la fiebre
efímera bovina (BEFV) y el virus puro de sonchus amarilla
(SYNV).
Junto a la familia de las Rhabdoviridae
también los virus que pertenecen a las Paramyxoviridae (p.
ej.: sandai-virus (SV), virus paragripal (PIV),
virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) de tipo 2 y 3, virus de
las paperas (MUV), virus del sarampión (MEV) y el virus del moquillo
canino (CDV) y a las Filoviridae y varios virus no asignados
a una familia (p. ej.: virus de la enfermedad de Borna; BDV) poseen
un genoma de ARN de cadena negativa, no segmentado.
La organización genómica en conjunto en los
virus de ARN con cadena negativa, no segmentada de varias familias
es comparable. Especialmente entre los paramyxoviridae y los
rhabdoviridae, existen únicamente diferencias menores en la
organización genómica en conjunto (Tordo et al., Seminars
in Virology 3: 341-357, 1992).
RV puede infectar a todos los animales de sangre
caliente, y en casi todos los casos después del establecimiento de
los síntomas la infección acaba en muerte. La rabia canina todavía
es importante en muchas partes del mundo: los perros infectados
producen la mayor parte de los 75.000 casos de rabia humana
estimados que ocurren cada año en todo el mundo. En muchos países
de Europa y en los Estados Unidos y Canadá, la rabia de la fauna
salvaje ha aumentado en importancia.
Las características clínicas de la rabia son
similares en la mayoría de las especies, pero existe gran variación
entre los individuos. Tras la mordedura de un animal rabioso el
periodo de incubación está comprendido normalmente entre 14 y 90
días, pero puede ser considerablemente más prolongado, y se han
documentado periodos de incubación de más de un año. Se reconocen
dos formas clínicas de la enfermedad, la violenta y la muda o
paralítica. En la forma violenta, el animal se vuelve inquieto,
nervioso, agresivo y con frecuencia peligroso a medida que pierde
cualquier temor al hombre y muerde a cualquiera que capta su
atención. El animal con frecuencia no puede tragar, la que da lugar
al sinónimo "hidrofobia" para la enfermedad. Existe con
frecuencia salivación excesiva, respuestas exageradas a la luz y al
sonido e hiperestesia. A medida que evoluciona la encefalitis, la
furia deja paso a la parálisis y el animal manifiesta las mismas
características clínicas que se aprecian en la forma muda de la
enfermedad. Por último, existen con frecuencia ataques convulsivos,
coma y paro respiratorio, en la muerte que tiene lugar 2 a 7 días
después de los síntomas clínicos.
El virus de la rabia se introduce en el cuerpo
por la mordedura u ocasionalmente por el arañazo de un animal
rabioso o cuando la saliva cargada de virus de un animal rabioso se
introduce en una herida abierta. La replicación vírica en la zona
de la mordedura, en el músculo, es seguida por la invasión de las
terminaciones nerviosas periféricas y el movimiento central del
genoma vírico en el citoplasma de los axones del sistema nervioso
central. La penetración vírica en la médula espinal y a continuación
en el cerebro (particularmente en el sistema límbico) se asocia con
los síntomas clínicos de la disfunción neuronal. Normalmente, casi a
la vez que la infección del sistema nervioso central produce la
furia, los viriones también se deshacen del extremo apical de las
células secretoras de mucosidades en las glándulas salivales y se
liberan en grandes concentraciones en la saliva.
A lo largo del transcurso de la rabia, las
respuestas inflamatoria del huésped e inmunitaria específica se
estimulan sólo mínimamente; las razones más probables para esto son
porque la infección es no citopática en el músculo y en las células
nerviosas y porque la infección se concentra en gran parte en el
medio inmunológicamente secuestrado del sistema nervioso.
Los viriones de RV como todos los Rhabdovirus se
componen de dos componentes estructurales principales: una
nucleocápside o núcleo de ribonucleoproteína (RNP) y una envoltura
en forma de membrana bicapa que rodea el núcleo de la RNP. El
componente infeccioso de todos los Rhabdovirus es el núcleo de la
RNP. El ARN genómico es de sentido negativo y por eso no puede
servir como mensajero sino que necesita su propia
ARN-polimerasa endógena para la transcripción del
ARNm. El genoma del ARN está encapsulado por la proteína de la
nucleocápside (N) en combinación con dos proteínas secundarias, a
saber la ARN-polimerasa dependiente del ARN (L) y la
fosfoproteína (P) para formar el núcleo de la RNP. El componente de
la membrana contiene dos proteínas: una glucoproteína de
transmembrana (G) y una proteína de matriz (M) situada en la parte
interna de la membrana. La G-proteína es
responsable de la unión celular y de la fusión de la membrana en el
RV y además es el objetivo principal del sistema inmunitario del
huésped.
Durante la transcripción, el genoma dirige la
síntesis secuencial de un ARN principal corto y cinco ARNm
monocistrónicos, encapsulados y poliadenilados. Durante la
replicación, las señales de terminación e inicio de transcripción
condicional entre los cistrones son ignoradas por la polimerasa
vírica. Tanto para la reacción con la transcriptasa como con la
polimerasa se necesita la presencia de la N-proteína
acomplejada con el genoma del ARN así como las L- y
P-proteínas. Se ha determinado el orden del gen en
el genoma del RV y es
3'-líder-N-P-M-G-L-5'
tal como se muestra en la Fig. 1. Cada uno de los ARNm de los RV se
traduce inmediatamente después de la transcripción. Dos sucesos
tienen lugar sucesivamente durante la replicación: en primer lugar
la producción de un ARN completo encapsulado de cadena positiva
complementario del genoma, seguido por la producción de un ARN
completo de cadena negativa que está también encapsulado por las
proteínas N, L y P. Por último, los núcleos de RNP se asocian con
la M-proteína y con la G-proteína
durante el proceso de montaje e injerto que conduce a la liberación
de viriones del RV completamente formados e infecciosos.
El ARN del RV genómico de 11,9 kb contiene cinco
marcos de lectura abiertos (ORF) que codifican las proteínas N, P,
M, G y L, además de la presencia de una zona pseudogénica (\Psi)
entre los genes G y L (Fig. 1).
Las vacunas actuales para los virus con ARN con
cadena negativa no segmentada comprenden vacunas de virus
inactivados o vacunas de virus vivos modificados que comprenden una
cepa de virus atenuada cuya patogenicidad disminuye por múltiples
pasos en el cultivo celular. Las vacunas de la rabia químicamente
inactivadas son p. ej.: Ravibac, Behringwerke (hombre), HDC,
Rhone-Poulenc (hombre), Bayovac-LT,
Bayer (vet), Madivac, Hoechst (vet), Epivax-LT,
Pitman Moore, Rabisin, Rhone-Merieux. Ejemplos de RV
de dichos virus atenuados son las cepas de vacunas SAD B19 y ERA.
Las vacunas inactivadas producen en general sólo un bajo nivel de
inmunidad, necesitando repetidas inmunizaciones. Además, la
neutralización que produce determinantes antigénicos de los
patógenos se puede llegar a alterar mediante el tratamiento de
inactivación, disminuyendo la potencia protectora de la vacuna.
En general, se prefieren las vacunas de virus
vivos atenuados porque provocan una respuesta inmunitaria basada
con frecuencia tanto en reacciones humorales como celulares. Sin
embargo, se pueden introducir mutaciones incontroladas por paso al
genoma vírico, produciendo una población de partículas heterogéneas
de virus con respecto a las propiedades de virulencia e
inmunización. En la atenuación durante el paso al cultivo celular
puede existir también un problema con estas vacunas. Se debe
conseguir un delicado equilibrio entre asegurar que la vacuna no
sea virulenta a la vez que se confirma que todavía es protectora.
Además es bien sabido que dichas vacunas tradicionales de virus
vivos atenuados pueden volver a ser virulentas produciendo brotes
epidémicos en animales inoculados y la posible propagación del
patógeno a otros animales.
Por otra parte, un problema con las vacunas
víricas vivas combinadas es la influencia mutua de los componentes
antigénicos que producen una disminución de la potencia de uno o más
de los componentes constituyentes.
Además, con las vacunas RV atenuadas o
inactivadas vivas administradas no es posible determinar si un
animal específico es un portador de un virus de campo RV o si el
animal había sido vacunado. Por consiguiente puede resultar
importante tener la capacidad de distinguir entre los animales
vacunados con una vacuna RV y los animales infectados con un virus
de campo RV con el fin de que sea capaz de tomar las medidas
apropiadas para reducir la propagación de un virus virulento de
campo. La introducción por ejemplo de un marcador identificable
serológicamente se puede conseguir introduciendo una mutación en un
gen que codifica una (gluco-) proteína de RV que normalmente da
lugar a la producción de anticuerpos en un huésped animal
infectado.
Se desea introducir una mutación en el genoma
del ARN del RV de una forma controlada de modo que el RV mutante
resultante esté atenuado o comprenda una secuencia de ácido nucleico
heteróloga que codifique epítopos de proteínas extrañas, p. ej.:
proteínas con marcador inmunológico o antígenos de patógenos. Las
técnicas de ADN recombinante ya se utilizan ampliamente con este
fin en virus de ADN y virus de ARN con cadena positiva. Ejemplos de
virus con ADN recombinante: virus de Aujeszky (PRV); adenovirus;
virus de vacunas. Ejemplos de virus con ARN recombinante con cadena
positiva: Alfavirus (Sindbis V., virus del bosque Semliki: H.V.
Huang, C.M. Rice, C. Xiong, S. Schlesinger (1989) virus con ARN
como vectores de expresión génica. Virus Genes 3,
85-91). Picornavirus (virus de la polio, virus de la
hepatitis A, virus de enfermedades del pie y de la boca: J.W.
Almond y K.L.Burke (1990). Poliovirus como vector para la
presentación de antígenos extraños. Semin. Virol. 1,
11-20). La manipulación genética dirigida de los
genomas de virus con ARN depende de la capacidad para producir ARN
recombinantes que sean aceptados como plantilla por las
ARN-polimerasas dependientes del ARN. Las
transcripciones generadas por muchas ARN-polimerasas
dependientes del ADN (p. ej.: T7 ARN-polimerasa o
la ARN-polimerasa II celular) y que simulan los
genomas víricos son reconocidas por las polimerasas de muchos virus
con ARN con cadena positiva. Esto permitió la recuperación de virus
infecciosos o replicones a partir de transcripciones de ADNc y la
aplicación de la tecnología del ADN recombinante para manipular
estos genomas de una manera específica para el punto. Como los ARN
correspondientes a los genomas de los virus con ARN con cadena
positiva pueden funcionar como ARNm para la traducción de las
polimerasas víricas, se puede iniciar un ciclo infeccioso por
introducción de análogos del genoma en una célula. La plantilla de
las polimerasas de los virus con ARN de cadena negativa, sin
embargo, es exclusivamente el complejo de RNP. Por otra parte, y a
diferencia de los virus con ARN con cadena positiva, su ARN genómico
o antigenómico puede que no funcione como ARNm y por eso todas las
proteínas víricas implicadas en la replicación y transcripción de
los ARN artificiales han de ser provistas en trans.
Un sistema apropiado para la encapsulación de
análogos de ARN genómico de virus con ARN con cadena negativa con
genoma segmentado para proporcionar la plantilla apropiada ha
sido descrito recientemente por Palese P. et al.,
(documento WO 91/03552). Las transcripciones de ARN
de los segmentos del genoma del virus de la gripe fueron
encapsuladas mediante proteínas purificadas in vitro que se
pueden utilizar para transfectar células junto con un virus
cooperador. Sin embargo, se observó que este planteamiento no tenía
éxito con el RV, virus con genoma no segmentado. Los genomas de VSV
y RV de modelo corto que carecen de la mayor parte del genoma del
ARN que comprende los genes que codifican las proteínas víricas
podrían ser encapsulados y expresados por proteínas codificadas por
plásmidos (Pattnaik, A.K. et al., Cell
69, 1011-1020, 1992, Conzelmann, K.K. y M.
Schnell, J. Virology 68, 713-719,
1994). Este planteamiento implicaba la expresión conjunta tanto de
los análogos del genoma que comprenden opcionalmente inserciones
del gen indicador como determinadas proteínas víricas procedentes de
plásmidos transfectados para producir partículas defectuosas de
virus. Ballart et al., describió un procedimiento para
obtener virus infeccioso de sarampión, así como un virus con ARN de
cadena negativa no segmentado, procedente del ADNc clonado (The
EMBO Journal, 9: 379-384 (1990)). Una solicitud
de patente europea que se refiere a este procedimiento fue
presentada con el autor como uno de los inventores.
Sin embargo, tanto el documento como la
solicitud fueron retirados, ya que investigaciones posteriores
dieron a conocer que todos los virus recombinantes supuestos no
eran totalmente recombinantes, sino meros virus de la descendencia
de la cepa de la vacuna utilizada inicialmente.
Por lo tanto se debe concluir, que los intentos
para obtener virus con ARN recombinante con cadena negativa, con un
genoma largo no segmentado que necesita manipulación de los genomas
completos, han fracasado hasta ahora.
La presente invención proporciona un mutante del
virus de la rabia por replicación, infeccioso manipulado
genéticamente, obtenido por técnicas de ADN recombinante, que
comprende una inserción o deleción en un ORF, en la zona
pseudogénica o en la zona no codificante del genoma del RV.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un mutante del virus de la rabia replicativo infeccioso
manipulado genéticamente que comprende una inserción y/o una
deleción en un marco de lectura abierto, una zona pseudogénica o
una zona intergénica del genoma del virus, caracterizado porque el
mutante del virus es portador de una secuencia de ácido nucleico
heteróloga que codifica un epítopo o polipéptido de un virus o
microorganismo patógeno.
Las formas de realización particulares de los
virus de la rabia replicativos infecciosos manipulados genéticamente
de la presente invención están definidos en las reivindicaciones 2
a 6 y 8 a 13.
Como se explicó anteriormente, existe una gran
homología en la organización genómica entre las familias de virus
con ARN con cadena negativa no segmentada. Cuando la función de las
proteínas codificadas en el proceso de replicación, el montaje, la
unión celular o la fusión celular sea comparable, estas proteínas se
denominarán además "análogos". Puede ser que la función de, p.
ej., dos proteínas de una familia, esté unida en una proteína en
otra familia. Este es el caso, p. ej., con las proteínas F y HN de
los paramyxoviridae, que juntas tienen la misma función que
la glucoproteína G de los Rhabdoviridae. En este caso, las
dos proteínas de una familia se considerarán análogas de una
proteína de la otra familia.
Se puede introducir la inserción y la deleción
de uno o más restos de ácido nucleico en el genoma del RV
incorporando las mutaciones apropiadas en el correspondiente ORF
vírico, en la zona pseudogénica o en la zona no codificante. Se
comprende que esta alteración sea un cambio de la información
genética en el ORF del RV o en el pseudogén de un RV paterno,
obteniendo de este modo el mutante del RV por inserción o deleción
según la invención.
Una mutación, en la que uno o más nucleótidos se
reemplazan por otros nucleótidos, denominada reemplazamiento por
sustitución se considera que es el resultado de una acción combinada
de inserción o deleción. Esta clase de mutación se considera
también que se debe incluir en la terminología: deleción y(/o)
inserción.
Está claro que cualquier mutación como la
definida en la presente memoria comprende una alteración de las
secuencias apropiadas del RV de modo que la mutación resultante del
RV es todavía infecciosa y replicativa, es decir el mutación de RV
es capaz de infectar células susceptibles y su genoma del ARN
mutación es capaz de replicación y transcripción autónomamente, es
decir no se necesita la expresión conjunta de las proteínas N, P y
L de RV.
No se ha dicho, que también están comprendidos
en la presente invención los RV mutantes capaces de una sola sesión
de infección, seguida de replicación (Véase más adelante).
La organización genómica de diferentes capas de
RV es idéntica. Se ha determinado la secuencia del nucleótido y el
análisis de la secuencia deducida de aminoácidos de la cepa SAD B19
de la vacuna y la cepa PV virulenta (Conzelmann et al.,
Virology 175, 485-499, 1990 y Tordo
et al., Nucleic Acids Res. 14,
2671-2683, 1986; Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83, 3914-3918, 1986; Virology
165, 565-567, 1988). En Conzelmann et
al., 1990 (supra) se determina que el genoma vírico de la
cepa SAD B19 comprende 11.928 nucleótidos y que la secuencia
deducida de aminoácidos de las cinco proteínas víricas N, P, M, G y
L son muy similares a las de la cepa PV patógena. Se ha determinado
la situación de los respectivos ORF, de la zona pseudogénica y de
las zonas intergénicas no codificantes en el RV en la presente
memoria: la zona de codificación de los genes N, P, M, G y L de RV
corresponde a las posiciones 71-1423,
1514-2407, 2496-3104,
3317-4891, 5414-11797,
respectivamente. La zona pseudogénica (\Psi) corresponde a la
posición 4961-5359, mientras que las zonas
intergénicas que separan los cinco cistrones y que están flanqueadas
por secuencias no codificantes que contienen el inicio y la
terminación transcripcional y las señales de poliadenilación
corresponden a las posiciones 1483-1484;
2476-2480; 3285-3289;
5360-5383. Aunque la numeración y la secuencia de
nucleótidos de los ORF, de la zona pseudogénica y de las zonas no
codificantes de la cepa del RV paterno utilizadas en la presente
memoria para introducir una mutación no es necesariamente la misma
que la de la capa SAD B19 o PV, las caracterizaciones mencionadas
anteriormente de estas zonas definen exactamente su localización en
el genoma de cualquier cepa de RV.
Un procedimiento para obtener un RV atenuado a
partir de una cepa de RV paterno virulento consiste en introducir
la inserción y/o la deleción en un ORF que codifica una proteína
vírica, de modo que, por ejemplo, la actividad de la proteína
vírica para la unión a la célula huésped y la fusión de la membrana
estén modificadas, p. ej.: reducida. Es sabido que RV que cambia en
la secuencia de aminoácidos de la glucoproteína G de transmembrana
tiene efectos significativos sobre la patogenicidad del RV. Además,
con respecto a la atenuación también los cambios en la proteína de
matriz (M) pueden influir en la conformación de la proteína G
produzcan una atenuación del virus. Por consiguiente, en la
presente memoria son especialmente preferidos los RV mutantes que
comprenden una deleción o inserción en el ORF que codifica la
proteína G ó M.
Asimismo están comprendidos en la presente
invención los mutantes del virus de la rabia replicativos
infecciosos, capaces únicamente de una sola ronda de infección,
seguida de replicación. La ventaja de los mismos se explica a
continuación:
Aunque generalmente hablando las vacuna vivas
recombinantes se ha demostrado que son satisfactorias y eficaces,
existe un riesgo de que los virus de la vacuna se propaguen a otros
animales que son más susceptibles al virus.
Por consiguiente, existe una fuerte desgana
tanto en los campos político como ético y en parte científico, para
permitir la utilización de virus recombinantes en este campo.
En particular, para los estudios de evaluación
de riesgos por las autoridades de la administración con respecto a
los virus de vacunas modificados genéticamente, especialmente a los
virus vivos que expresan genes extraños, el aspecto del posible
desprendimiento de estos virus en el entorno es un aspecto muy
importante.
Por lo tanto, se puede apreciar que las vacunas
del virus de la rabia que presentan todas las ventajas de las
vacunas de virus vivos pero que se limitan a los animales vacunados
y no se desprenden, son muy deseables.
Dichos virus se pueden preparar p. ej.: por
mutación del gen M, que codifica la M(atriz-)proteína. La
M-proteína desempeña un papel principal en el
montaje del virus, en tanto que influye en la incorporación y
conformación de la glucoproteína G.
Cuando se desarrollan los mutantes M^{(-)},
que carecen de proteína M funcional, en células manipuladas que
producen la M-proteína en trans, se preparan las
partículas de virus intacto, que se comportan como el virus natural
en cuanto a lo que se refiere a su carácter infeccioso hacia su
huésped natural. Sin embargo, una vez han infectado una célula
huésped, no existe la posibilidad de formar nuevos virus
infecciosos, ya que carecen de la información genética para
sintetizar la M-proteína.
Por lo tanto, quedan confinados en el huésped.
Las ventajas de dichos virus se discutirán a continuación.
Por lo tanto, en una forma de realización
preferida la presente invención se refiere a una inserción y/o
deleción en marco de lectura abierto que codifica la proteína de
matriz M, de modo que proporcione una proteína de matriz M no
funcional, o incluso en ausencia de la proteína de matriz M. Los
mutantes de virus M^{(-)} con proteína de matriz M no funcional o
ausente se han de desarrollar en células que proporcionen una
proteína de matriz M análoga en trans, para complementar
fenotípicamente el virus.
Por otra parte, dichos virus se pueden preparar
p. ej.: por mutación del gen G. La G-proteína
desempeña un papel importante al principio de la infección, en el
proceso de ataque celular y de fusión de la membrana, tal como se
mencionó anteriormente.
Es posible mutar el gen G por inserción y/o
deleción (o incluso por deleción de todo el gen G) en tal medida
que el mutante del virus G resultante no sea ya capaz de infectar
con éxito otras células, debido a la muy alterada (o incluso
ausente) glucoproteína G. Dichos mutantes se denominarán además
mutantes G-minus (G-).
La clase de mutaciones del gen G es por lo tanto
más severa que las mutaciones descritas anteriormente, que conducen
únicamente a una virulencia disminuida: en realidad los mutantes G
no son infecciosos, ya que carecen de la glucoproteína G
funcional.
Si dichos virus G-mutantes se
desarrollan en células huésped recombinantes complementando la
G-proteína, se excretan los virus descendientes que
son fenotípicamente G-positivos, pero
genotípicamente G-negativos,.
Estos virus presentan una ventaja importante
sobre los virus G-positivos: por una parte, son
capaces de infectar células huésped no complementarias, ya que
poseen la proteína G en su membrana. En las células infectadas, los
virus G mutantes se replican como virus naturales. Esto tiene la
ventaja de que el genoma vírico en su conjunto, incluyendo los
genes heterólogos clonados en el virus recombinante, está
multiplicado, y los productos del genoma codificados se expresarán
y procesarán como en el virus natural.
Por otra parte sin embargo, ningún virus
descendiente se puede preparar en el huésped, ya que las células
huésped normales no sintetizan la proteína G y el propio virus
mutante es genotípicamente G-negativo.
Por lo tanto, los animales infectados con
mutante del virus G^{-} no desprenden virus infeccioso al medio.
Esto hace a los mutantes G^{-} (así como a los mutantes M^{(-)}
descritos anteriormente) muy seguros como bases para vacunas.
Por otra parte, mutantes G^{-} según la
invención se pueden complementar fenotípicamente mediante otras
glucoproteínas que no sean de la rabia, conocidas porque desempañan
un papel en la unión celular.
Ya que la(s) glucoproteína(s) que
sobresalen de la membrana vírica al medio son conocidas por
determinar la especificidad celular, es posible por lo tanto
dirigir el mutante del virus de la rabia a otras células específicas
aparte de las células huésped naturales de la rabia, seleccionando
la glucoproteína complementaria correcta.
Estas glucoproteínas se denominan además
"análogos de glucoproteína G", para indicar que están
implicadas en la unión específica a la célula, como la
glucoproteína G.
Debe observarse que, en algunos virus, los
"análogos de glucoproteína G" que determinan la especificidad
celular no son glucoproteínas sino proteínas no glucosiladas. Está
claro, que estas proteínas están también comprendidas dentro del
alcance de la invención.
Por consiguiente, en otra forma de realización
preferida de la presente invención, la inserción y/o deleción en un
marco de lectura abierto que codifica la glucoproteína G es de tal
forma que produce una glucoproteína G funcional, o incluso en
ausencia de glucoproteína G. Los mutantes de virus G^{(-)} con o
sin glucoproteína G funcional se han de desarrollar en células que
proporcionen un análogo de glucoproteína G en trans, para
complementar fenotípicamente el virus.
En una forma de realización aún más preferida de
la presente invención, el análogo de glucoproteína utilizado para
la complementación es la propia glucoproteína G del virus de la
rabia.
\vskip1.000000\baselineskip
Los virus de la rabia recombinantes infecciosos
con un análogo de glucoproteína G presentan varias ventajas
importantes:
- a)
- pueden dirigirse específicamente a determinadas células, órganos o huésped, dependiendo del objetivo del análogo de glucoproteína G que se seleccione.
Esto implica que, p. ej., se puedan dirigir al
aparato respiratorio o el aparato digestivo. De este modo, p. ej.,
se pueden obtener respuestas de las mucosas en una zona
predeterminada.
Como alternativa, se pueden dirigir a células
específicas del sistema inmunitario.
- b)
- pueden ser portadores además de información genética extraña que codifican epítopos de patógenos no de la rabia como se explicó anteriormente.
Como alternativa, pueden ser portadores además
de información genética que codifican sustancias tóxicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Una aplicación muy importante de los virus según
la invención se obtiene con los virus que tienen tanto un análogo
de glucoproteína G según a) como información genética extraña según
b).
Se pueden obtener virus de la rabia
recombinantes infecciosos según la presente invención, que se
dirijan a un tipo específico de célula, atacado normalmente por un
virus no de la rabia, mientras que a la vez transporten un
determinante inmunoprotector de este virus no de la rabia.
Tal virus produce inmunidad en el huésped frente
al virus no de la rabia, mientras que a la vez es completamente
seguro, debido a la falta de información genética para el análogo de
glucoproteína G.
Otra importante forma de realización de la
presente invención consiste en virus según la presente invención
que se dirigen p. ej.: a células CD-4, que
representan las células objetivo del VIH, por complementación
genotípica con gp120 de VIH y que codifican facultativamente una
proteína citotóxica.
Dichos virus pueden atacar selectivamente
células CD-4 y una vez dentro de éstas células, las
destruirán.
Como alternativa, los virus de la rabia
recombinantes infecciosos según la presente invención pueden
proporcionar vacunas muy seguras contra virus virulentos/patógenos
los cuales en este momento no existen en vacunas vivas seguras:
virus de la rabia recombinantes infecciosos dirigidos contra p. ej.:
células objetivo naturales del virus respiratorio sincitial bovino
(BRSV) por complementación con el análogo de la glucoproteína G del
BRSV y que expresan a epítopos inmunoprotectores de BRSV, dan una
vacuna muy segura contra la enfermedad.
Las vacunas del virus paragripal se han
enfrentado hasta ahora a los mismos problemas que las vacunas BRSV.
Por lo tanto, el virus de la rabia recombinante infeccioso con
análogo de glucoproteína G paragripal proporciona una vacuna buena
y segura contra esta enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Otras vacunas veterinarias importantes basadas
en el virus de la rabia recombinante infeccioso se preparan por
introducción en el virus de la rabia recombinante de determinantes
inmunogénicos de:
- i)
- los torovirus; torovirus equino, bovino y porcino,
- ii)
- los coronavirus; coronavirus bovino, canino, porcino y felino, especialmente las espinas proteicas de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
Por consiguiente, la mayor parte de las formas
de realización preferidas de la presente invención se refieren a
mutantes de glucoproteína G^{(-)} de virus de la rabia
recombinante infeccioso, complementado con un análogo de
glucoproteína G y que lleva una secuencia heteróloga de ácido
nucleico que codifica un epítopo o polipéptido de un virus o
microorganismo patógeno.
Por otra parte, la atenuación del RV se puede
obtener alterando la actividad enzimática de la RV replicasa o
transcriptasa con el fin de que el enzima sea menos activo, dando
como resultado de este modo la producción de viriones menos
infecciosos en el momento de la infección de un animal huésped. Como
las proteínas N, P y L están implicadas en la actividad de la RV
polimerasa, los mutantes de RV que presentan una inserción o
deleción en el ORF que codifica las proteínas N, P o L forman parte
asimismo de la invención.
Los mutantes por deleción y/o inserción de RV
según la invención se pueden utilizar asimismo para vacunar un
huésped para que sea capaz de discriminar (serológicamente) entre un
huésped al que se administra una vacuna que comprende dicho mutante
de RV y un huésped infectado con un RV parental. En esta forma de
realización de la invención la inserción en el mutante por
inserción de RV puede codificar un epítopo heterólogo que sea capaz
de producir una respuesta inmunitaria específica para no RV en un
huésped inoculado o puede codificar una proteína con actividad
enzimática, tal como CAT o lacZ (Conzelmann y Schnell, 1994,
supra). Una zona preferida para la incorporación de dichas
inserciones es la zona pseudogénica del RV. Como se demuestra en
los Ejemplos se pueden llevar a cabo inserciones y deleciones en
esta zona sin perturbar las funciones esenciales de RV tales como
las necesarias para la infección o replicación. El mutante por
deleción del RV puede carecer de un epítopo de una proteína del RV
frente a la que aumenta normalmente la respuesta inmunitaria por
vacunaciones, en particular se sigue con este fin un mutante de RV
que comprende una deleción en el ORF que codifica la proteína G. En
el caso de un mutante por inserción de RV la inserción comprende una
secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno con marcador
serológico o un epítopo del mismo.
En una forma de realización adicional de la
invención, se proporciona un mutante de RV que es capaz de expresar
uno o más epítopos o polipéptidos heterólogos diferentes de un
patógeno específico. Dicho mutante se puede utilizar para vacunar
animales, tanto animales domésticos como no domésticos, contra la
rabia salvaje y dicho patógeno.
La vacunación con dicha vacuna de vector viva es
seguida preferentemente por la replicación del mutante RV en el
huésped inoculado, expresando in vivo el epítopo heterólogo o
polipéptido junto con los polipéptidos del RV. Los polipéptidos
expresados en el huésped inoculado producirán a continuación la
respuesta inmunitaria tanto contra el RV como contra el patógeno
específico. Si el polipéptido heterólogo procedente del patógeno
específico puede estimular una respuesta inmunitaria protectora,
entonces el animal inoculado con el mutante del RV según la
invención será inmune a la infección posterior por este patógeno así
como a la infección por RV. De este modo, una secuencia heteróloga
de ácido nucleico incorporada en una zona adecuada del genoma del
RV puede ser expresada in vivo continuamente, proporcionando
una inmunidad sólida, segura y a largo plazo al patógeno.
En particular, la presente invención proporciona
un vector del RV que comprende una inserción de una secuencia de
ácido nucleico que codifica un epítopo o polipéptido de un patógeno
específico, en el que la inserción se realiza en la zona
pseudogénica.
Si se desea, parte o toda la zona pseudogénica
se puede eliminar en el vector del RV descrito anteriormente.
Preferentemente se contemplan las secuencias de
ácido nucleico que codifican un epítopo o polipéptido de parvovirus
canino, coronavirus canino y del virus de la fiebre porcina clásica
(CSFV) para su incorporación en una zona adecuada del genoma del
RV.
La posibilidad de manipular el genoma del ARN
con cadena negativa, no segmentado del RV en el nivel del ADN
mediante técnicas de ADN recombinante no fue posible hasta ahora,
porque no se podían generar virus replicativos infecciosos. Sin
embargo, en la presente memoria se proporciona un procedimiento que
permite la modificación genética de una mutación en una zona de
codificación o en una zona sin codificación del genoma vírico al
nivel del ADN mediante técnicas de ADN recombinante seguidas de la
generación de un RV replicativo infeccioso que protege la mutación
en su genoma.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Este procedimiento según la invención es como en
la reivindicación 15.
Normalmente, el ADNc del genoma del virus de la
rabia se modifica mediante la incorporación de una mutación en el
genoma.
El procedimiento sin embargo se puede utilizar
también para purificar, p. ej.: grupos de RV contaminados. En este
caso, se utilizará el ADNc original no mutado.
En vista del hecho de que la eficacia del
rescate de un modelo mini-genoma de RV que comprende
inserciones heterólogas con el plásmido que codifica la proteína es
extremadamente baja y además se correlaciona con la longitud de la
inserción (Conzelmann y Schnell, 1994, supra) no habría que
esperar que el inicio de una infección productiva a partir del ARN
genómico completo transfectado se consiga por
co-transfección con los plásmidos que codifican las
proteínas N, P y L del RV. Esto es más a medida que se producen
grandes cantidades de los ARN específicos de N, P y L de sentido
positivo a partir de los plásmidos que codifican la proteína
transfectada que es de esperar se hibriden con transcripciones del
ARN genómico de cadena negativa expresadas simultáneamente. La
posible hibridación, sin embargo, que podría afectar a más de la
mitad del genoma se sospechó que interfería en la etapa de
encapsulación crucial. Además, la traducción del ARNm con N, P y L
puede estar afectada. De hecho se observó que con el protocolo de
transfección estándar no se podía obtener ninguno de los virus
infecciosos. Sin embargo, como se demostró en los ejemplos la
aplicación de un protocolo de transfección alternativo en
combinación con la utilización de un genoma de ADNc del RV que
genera transcripciones de ARN antigenómico de cadena positiva, dio
lugar a un RV replicativo modificado genéticamente.
El procedimiento mencionado anteriormente
permite la incorporación in vitro de una mutación en el
genoma de un RV paterno mediante técnicas de ADN recombinante
seguida de la generación de un mutante del RV replicativo
infeccioso que protege dicha mutación. La mutación incluye pero no
se limita a una inserción, delección o sustitución de restos de
ácido nucleico en un ORF que codifica una proteína del RV, una zona
no codificante, p. ej.: la zona pseudogénica o una secuencia con
señal transcripcional del genoma paterno del RV.
La modificación genética de una mutación en una
zona intergénica no codificante puede influir en la transcripción
de un gen vírico específico, tal como en la transcripción del ARNm y
en la traducción posterior de la proteína, tal como las proteínas M
y G o una proteína implicada en la actividad de la polimerasa, tal
como las proteínas N, P o L, se reduce produciendo un mutante del
virus que pone de relieve las características atenuadas debido a
que la capacidad del mutante de producir virus descendientes
(infecciosos) se reduce. En particular la sustitución de uno o más
restos de ácido nucleico en esta zona intergénica y/o en las
secuencias con señal transcripcional puede influir en la eficacia
de la transcripción.
Además, la sustitución de uno o más restos de
ácido nucleico en una zona del genoma de un RV virulento que está
implicado en la virulencia, tal como el ORF que codifica la proteína
G, mediante la aplicación de un procedimiento descrito en la
presente memoria es parte de la invención.
Dicha mutación puede producir el intercambio de
un solo aminoácido en la proteína G de una cepa virulenta de RV
dando como resultado una pérdida (parcial) de patogenicidad, p. ej.:
sustitución de Arg (333) por Ile, Glu o Gln, o Leu (132) por Phe o
Trp.
En el procedimiento según la invención la
molécula de ADN que contiene la información genética del RV
comprende preferentemente un plásmido provisto de activador de
transcripción apropiado y secuencias reconocibles de terminador por
una polimerasa expresada conjuntamente por las células huésped
transfectadas.
Un procedimiento preferido según la invención
comprende la utilización de células huésped transfectadas con ADN
de RV, siendo dichas células capaces de expresar la
ARN-polimerasa dependiente de T7 ADN, expresada por
ejemplo citoplásmicamente en virus recombinante de vacuna. En este
caso los plásmidos que contienen ADSN de RV están provistos de las
secuencias del promotor T7 y del terminador (Conzelmann y Schnell,
1994, supra).
Para la preparación de una vacuna viva el
mutante del RV recombinante según la presente invención se puede
desarrollar en un cultivo celular procedente, por ejemplo, de
células BHK o diploides humanas.
Los virus cultivados de este modo se pueden
recoger recolectando los fluidos y/o las células del cultivo de
células de tejido. La vacuna viva se puede preparar en forma de
suspensión o se puede liofilizar.
Además de una cantidad inmunológicamente eficaz
del RV recombinante la vacuna puede contener un excipiente o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
Ejemplos de excipientes o diluyentes
farmacéuticamente aceptables útiles en la presente invención
comprenden los estabilizantes tales como SPGA, carbohidratos (p.
ej.: sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano),
proteínas tales como suero bovino o leche descremada y tampones (p.
ej.: tampón de fosfato).
Opcionalmente, se pueden añadir a la vacuna uno
o más compuestos con actividad adyuvante. Los adyuvantes adecuados
son por ejemplo el hidróxido fosfato u óxido de aluminio, las
emulsiones de aceite (p. ej.: de Bayol F® o Marcol 52®, saponinas o
solubilizado de vitamina E.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La dosis útil que se ha de administrar variará
dependiendo del tipo de mamífero que se ha de vacunar, de la edad,
peso y modo de administración.
Las dosis pueden oscilar entre amplios
intervalos: p. ej.: 10^{2} a 10^{7} pfu/animal serían dosis
adecuadas.
Una dosis específica puede ser por ejemplo
aproximadamente 10^{6} pfu/animal.
Se puede utilizar asimismo un mutante de RV
según la invención para preparar una vacuna inactivada.
Para la administración a animales, el mutante
del RV según la presente invención se puede administrar entre otras
por vía intranasal, intradérmica, subcutánea o intramuscular.
La vacuna de RV según la invención se puede
administrar a perros, pero también a los principales vectores, es
decir, mapaches, mofetas y zorros. Además, también se contempla la
vacunación de jabalíes salvajes con un vector de RV vivo capaz de
expresar un gen heterólogo de un patógeno porcino tal como el virus
de la fiebre porcina clásico.
\vskip1.000000\baselineskip
La clonación del ADNc que abarca el genoma
completo de la cepa SAD B19 del RV se describió anteriormente
(Conzelmann et al., 1990, supra; GenBank número de
registro M31046). La numeración de los nucleótidos de RV y de los
aminoácidos utilizados en la presente memoria corresponde a la de
Conzelmann et al., 1990 (supra). Como bases para el
montaje de un clon de ADN completo de SAD B19 se utilizó la
secuencia del mini-genoma del RV contenida en el
plásmido pSDI-1 de transcripción (Conzelmann y
Schnell, 1994, supra) (Fig. 2). pSDI-1
contiene los terminales 3' y 5' genómicos de SAD B19 (nucleótidos
SAD B19 1 a 68 y 11760 a 11928, respectivamente) insertados entre
un activador de T7 ARN-polimerasa y la secuencia del
ribozima antigenoma del virus delta de la hepatitis (HDV). Para
generar un plásmido que produzca transcripciones de
SDI-1 con cadenas positivas (pSDI-1
plus) las secuencias de RV contenidas en pSDI-1 se
amplificaron en primer lugar por PCR utilizando un cebador de 11
bases (5'-ACGCTTAACAA-3') que debido
a la complementariedad de los terminales del genoma del RV
corresponde a los terminales 5' de ambos ARN víricos de sentido
negativo. Después de la ligadura parcial posterior de un EcoRI
sintético/adaptador romo (T7/3) que contiene una secuencia de
activador T7 seguida de tres restos G (subrayados)
(5'-AATTCCTGCAGTAATACGACTCACTATAGGG-3') a la
secuencia de RV amplificada, se clonaron los productos de ligadura
en las zonas EcoRI/SmaI del pX8dT. Este plásmido es un derivado de
pBluescriptII (Stratagene) del que se eliminó un fragmento
BssHII/ClaI de la zona de clonación múltiple que contiene el
activador T7 original. Contiene la secuencia de 84 bases del
ribozima antigenómico HDV en la zona SmaI seguido inmediatamente
por una secuencia del terminador de transcripción T7 clonada en la
zona BamHI. Las construcciones que contenía un activador T7
corriente arriba de la secuencia del RV más transcrita se
identificaron por análisis de restricción y secuenciado. El
fragmento MunI-Bg1II de pSDI-1
(nucleótidos de SAD B19 40 a 68) se reemplazaron a continuación por
1 kb de una construcción de ADNc MunI/Bg1II montada en pBluescriptII
de tres fragmentos de diferentes clones de ADNc SAD B19
(MunI-SphI (nucleótidos de SAD B19 40 a 482 de
pZAD1-9); SphI-AatII (4041 a 4273 de
pSAD13) y AatII-Bg1II (11472 a 11759 de pSAD85))
dando como resultado pSDI-1170. Por inserción de un
fragmento de SphI montado en los clones pSAD25 y pSAD13 vía NcoI
(nucleótidos de SAD B19 482 a 4041) y un fragmento de AatII montado
en los clones pSAD49 y pSAD85 vía XhoI (nucleótidos de SAD B19 4273
a 11472) en las únicas zonas SphI y AatII de
pSDI-1170, se completó el clon pSAD L16 completo
básico final. Utilizando el plásmido circular, se realizaron
transcripciones in vitro y se analizaron los productos en
geles de agarosa desnaturalizada. La presencia de transcripciones
de ARN que migran conjuntamente con 12 kb del ARN genómico del RV
indicaron que la T7 polimerasa transcribe el ARN antigenoma
completo.
\vskip1.000000\baselineskip
La transfección conjunta del plásmido pSAD L16 y
de los plásmidos que codifican las proteínas N, P y L de RV se
realizó tal como se describió en Conzelmann y Schnell, 1994,
(supra).
Se realizaron experimentos de transcripción tal
como se describió anteriormente. Se cultivaron células BRS, clon de
BHK-21 toda la noche en placas de 3,2 cm de diámetro
en medio Eagle complementado con suero de ternero al 10% hasta una
confluencia del 80% y se infectaron en un m.o.i. de 5 con el virus
de la vacuna recombinante vTF7-3 (Fours et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,
8122-8126, 1986). Se lavaron dos veces las células
que hacen de puente una hora con medio de cultivo sin suero de
ternero y se transfectaron con una mezcla de plásmido que contiene
5 \mug de pT7T-N, 2,5 \mug de
pT7T-P y 2,5 \mug de pT7T-L y con
2 \mug de plásmido pSAD-L16 utilizando el kit de
transfección de mamíferos (Stratagene; protocolo CaPO_{4}) según
las instrucciones del proveedor. Se eliminó el precipitado 4 h
después de la transfección y se lavaron y se incubaron las células
en medio Eagle conteniendo suero de ternero al 10%. Se comprobó por
fluorescencia indirecta la posible encapsulación de las
transcripciones de t7 ARN-polimerasa derivada del
pSAD L16 y la expresión resultante de las proteínas de RV
procedentes de las nucleocápsides. Se utilizó un anticuerpo
monoclonal dirigido contra la proteína G de RV, que podría
expresarse únicamente en el genoma del RV recombinante, para
identificar los cultivos. Un día después de la transfección estaban
presentes células coloreadas, lo que demuestra la expresión de los
genes del genoma del RV. Sin embargo, sólo se observaron células
positivas individuales en una serie de 20 experimentos de
transfección. En estos experimentos se obtuvieron focos celulares no
fluorescentes que indican la presencia de virus infecciosos.
Además, a partir de los cultivos celulares que se inocularon con el
sobrenadante completo de las células transfectadas se podrían
recuperar virus no infecciosos dos días después. Por consiguiente,
para aislar un supuesto número muy bajo de virus infecciosos
generados en las células transfectadas, se modificó el
procedimiento experimental. Para el aislamiento de las células de
los virus transfectantes y de los sobrenadantes se recogieron 2
días después de la transfección. Se pusieron en suspensión las
células en el sobrenadante rascando con una espátula de goma. Se
sometió la suspensión a tres ciclos de congelación y
descongelación (-70ºC/37ºC, 5 min cada uno). El residuo celular y el
exceso de virus de vacunas que forma agregados en estas condiciones
se sedimentó durante 10 min de centrifugación a 10.000 g en una
microcentrífuga. Se utilizó el sobrenadante completo para inocular
una placa de cultivo con una monocapa confluente de células. Después
de la incubación durante 2h se sustituyó el sobrenadante por 2 ml
de medio de cultivo reciente. Se observó un efecto citipatógeno
(cpe) producido por el virus de la vacuna uno o dos días después de
la inyección. Se observaron como promedio solamente diez placas
después de la centrifugación a 10.000 g. La infección por RV de las
células, que no produce cpe detectable se demostró dos días después
de la infección por tinción por inmunofluorescencia directa de la
monocapa completa con un conjugado anti-N
(Centocore). En dos de los 20 experimentos se observaron focos
fluorescentes y los sobrenadantes respectivos contenían RV
infeccioso (SAD L16) que se supuso que representa virus
transfectante generado a partir de las transcripciones del ADNc.
Se utilizó la mitad de los sobrenadantes
procedentes de los cultivos en los que se observaron focos para el
segundo paso después de la centrifugación a 10.000 g. Para el paso
posterior (cada 2 días) se utilizaron alícuotas decrecientes de los
sobrenadantes según el grado de infección por RV. Para deshacerse
completamente de los virus de vacuna, los sobrenadantes de los
cultivos con infección aproximada de todas las células (tercer paso)
se centrifugaron dos veces durante 10 min a 14.000 g en una
microcentrífuga. Se filtró a continuación el sobrenadante final
utilizando una unidad con filtro estéril MILLEX-VV
de 0,1 \mum (Millipore Products, Bedford, MA 01730) y a
continuación se utilizó para producir soluciones madre de alta
valoración de los RV recombinantes.
Se utilizó el protocolo último de transfección y
aislamiento en los Ejemplos siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron manipulaciones del \Psi en el
sub-clon pPsiX8, que contiene un fragmento
XhoI-ScaI de 2,8 kb de pSAD L16 que representa los
nucleótidos 3823 a 6668 de SAD B19. Se aislaron a continuación los
fragmentos de StuI de los plásmidos pPsiX8 modificados y se
utilizaron para reemplazar el fragmento (posición de SAD B19 4014 a
6364) correspondiente del clon pSAD L16 completo (Fig. 1). La
inserción de los 4 nucleótidos en el \Psi y la generación de una
nueva zona de NheI se consiguió mediante la digestión de pPsiX8 con
HindIII, relleno de las extensiones con enzima de Klenow y
religadura. El clon pSAD U2 completo final se distingue del SAD L16
por la duplicación de los nucleótidos 5338 a 5341.
La generación de virus infecciosos se demostró
después de la transferencia de extractos de las células
transfectadas junto con el sobrenadante a células frescas. En cada
una de las series se observó formación de focos en un experimento.
Se pasaron los virus transfectantes (SAD U2-13 y SAD
U2-32 clones) por transferencia de los sobrenadantes
a las células frescas dos veces más produciendo casi el 100% de
infección de las células. Para demostrar la inserción en el genoma
del virus SAD U2, se aisló ARN completo de las células infectadas
con SAD U2-13 y transcriptasa
inversa-PCR (RT-PCR) de la \Psi.
Con los cebadores G3P y L4M (Fig. 1), que son específicos de los
genes G y L, respectivamente, se obtuvieron fragmentos de ADN de
aproximadamente 730 bp a partir de los genomas de los virus
transfectantes SAD U2 y SAD L16 y de SAD B19 del RV normal. Sin
embargo, la digestión posterior con HindIII se observó solamente en
el ADN por PCR obtenido a partir de SAD B19 y SAD L16, pero no para
el de SAD U2. A la inversa, únicamente SAD U2 procedente del ADN se
digirió con NheI dando lugar a dos fragmentos de aproximadamente
530 y 200 bp, respectivamente (Fig. 3). El secuenciado RT directo
del ARN genómico del virus SAD U2 transfectante confimó además la
presencia de la inserción esperada de 4 restos y la zona prevista,
mientras que el resto de la secuencia determinada correspondía a la
del genoma de SAD B19 original. De este modo, estaba claro que el
virus SAD U2 representaba un virus transfectante cuyo genoma se
originaba a partir de ADNc modigicado genéticamente.
La introdución de cuatro nucleótidos adicionales
cerca del terminal de la \Psi de RV no afectó la viabilidad del
virus SAD U2 transfectante ni interfirió con la terminación de la
transcripción correcta del ARNm de G.
\vskip1.000000\baselineskip
Por doble digestión con StyI y HindIII, relleno
con Klenow y religadura, se eliminaron 396 bases (nucleótidos 4942
a 5337 de SAD B19), la construcción final fue pSAD W9. Para la
construcción de pSAD V*, se aisló a partir de pSAD13 un fragmento
de 180 bp de BgIII-AsuII incluyendo la zona límite
del cistrón SAD B19 N/P (Conzelmann et al., 1990,
supra). El fragmento contenía 97 nucleótidos de la zona de
codificación N, la zona 3' no codificante completa y el límite del
cistrón N/P constituido por la señal de terminación/poliadenilación
transcripcional de N, la zona intergénica y los primeros 16
nucleótidos del cistrón P incluyendo la señal de inicio
transcripcional. Se subclonó en primer lugar el fragmento de cADN en
la zona EcoRI de pBluescript después del relleno con enzima de
Klenow (pNigP-180) de los terminales 3' recesivos.
Después de la escisión con HindIII/XbaI a partir de pNigP y la
generación de terminales romas el fragmento de 230 bp obtenido que
contenía la inserción de RV flanqueada por 16 y 34 bp de secuencias
procedentes del vector, respectivamente, se clonó en la StyI
rellena de pPsiX8. La construcción completa final (pSAD V*) poseía
de este modo una inserción de 234 bp comparada con pSAD L16.
Como anteriormente, se utilizaron pSAD V* y pSAD
W9 para transfectar veinte placas de cultivo cada una. En tres
cultivos transfectados con SAD V* y en uno con SAD W9, se indicó el
rescate por el aislamiento posterior del virus viable. Después de
cinco pasos sucesivos el ARN de las células infectadas y el
sobrenadante se aisló y analizó por RT-PCR
utilizando los mismos cebadores que en los experimentos anteriores.
En comparación con el virus SAD B19 normal, un fragmento de ADN
ampliado de aproximadamente 0,9 kb resultó del ARN de las células
infectadas con SAD V* mostrando de este modo que las secuencias
adicionales estaban presentes en la zona \Psi de este virus
transfectante (Fig. 4). En cambio, a partir del ARN de las células
infectadas con SAD W9, se obtuvo un fragmento de ADN de sólo 0,3
kb; este tamaño era de esperar según la deleción realizada en la
copia del genoma del ADNc. El secuenciado de los productos de la
PCR confirmó además que las secuencias de ADNc originales
modificadas genéticamente se rescataron dentro de los genomas de los
virus transfectantes SAD V* y SAD W9. Por consiguiente, ni la
presencia de secuencias adicionales, incluyendo 50 nucleótidos
procedentes del vector, entre el marco de lectura abierto de G y la
\Psi ni la deleción de la \Psi completa interfirió con la
infectividad y la propagación de los virus de la rabia
transfectantes. Las alteraciones modificadas genéticamente en los
genomas de SAD V* y SAD W9 se diseñaron de forma que produjeran
cambios fenotípicos en el modelo de transcripción y se investigó si
esto afectaba las características de crecimiento de los respectivos
virus transfectantes. Sin embargo, la propagación en el cultivo
celular así como las valoraciones finales de los virus infecciosos
SAD V* y SAD W9 fueron similares a las del RV del SAD B19 normal.
Tres días después de la infección de las células con un m.o.i. de
0,01, se alcanzaron valoraciones de 10^{8} unidades formadoras de
foco (ffu) en los sobrenadantes para SAD B19, SAD V* y SAD W9
demostrando que la \Psi de RV no es esencial para la propagación
en el cultivo celular.
Utilizando una sonda específica de \Psi, no se
detectó ninguna hibridación con ARN en las células infectadas con
el virus SAD W9 con \Psi eliminada. Aunque los ARN genómicos de
los demás virus y los ARNm de G de SAD B19 y SAD L16 fueron
reconocidos por esta sonda, el ARNm de G de SAD V* no reaccionó. En
cambio, apareció una banda ténue de ARN que correspondía en tamaño
al nuevo \Psi-ARNm de más que se predijo por la
presencia de la señal de inicio transcripcional del gen P de más
precediendo las secuencias \Psi de SAD V*. A diferencia de lo los
RV que ocurren de manera natural, el virus transfectante SAD V*
representa un RV cuyo genoma se compone de seis cistrones
funcionales.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de ADNc de 230 bp que contiene el
límite del cistrón N/P flanqueado por zonas de restricción múltiple
descrito en el Ejemplo 3 se introdujo en el punto BstXI de la zona
pseudogénica del pSAD L16 del ADNc completo (posición 4995 del SAD
B19) después de la generación de terminales romos con el enzima de
Klenow. Se utilizó pSAD V del ADNc resultante como base para la
introducción del gen bacteriano de
cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT). Para obtener
pSAD XCAT, un fragmento de ADN de 0,8 kb de pCM7 (Pharmacia) que
contiene la zona de codificación CAT completa se clonó en el punto
AsuII de pSAD V contenido en el límite del cistrón N/P corriente
arriba de la secuencia del pseudogén. Para la construcción de pSAD
VCAT, se eliminó el ADNc entre el punto AsuII y el punto HindIII
situado cerca del extremo de la secuencia del pseudogén (posición
5337 del SAD B19) y se sustituyó por el ADN del pCM7 con HindIII
que codifica a CAT después de la generación del terminal romo con
enzima de Klenow. Por consiguiente, la transcripción del SAD XCAT
del RV recombinante daría lugar a un ARNm del CAT que posee la
secuencia del pseudogén en forma de zona 3' no traducida, mientras
que SAD VCAT transcribiría un ARNm de CAT que carece de la
secuencia del pseudogén.
Se rescataron los virus de la rabia
recombinantes después de la transfección de los plásmidos que
codifican las proteínas N, P y L de RV y pSAD-XCAT
y pSAD-VCAT, respectivamente, tal como se describe
en el Ejemplo 1. Después de la eliminación del virus de vacuna, se
analizó el modelo de transcripción de los RV recombinantes por
hibridación de Northern. Ambos virus transcribieron los ARN de CAT
de las dimensiones y la composición esperados (Fig. 5). Se
determinó la expresión de la enzima CAT en las células infectadas
con los dos virus, respectivamente, mediante análisis estándar de
CAT (Conzelmann y Schnell, 1994, supra). Se observó que
ambos expresaban CAT eficazmente. Los pasos sucesivos en las células
del cultivo celular demostraron que las secuencias extrañas
introducidas son genéticamente estables. Incluso después de 40 pasos
ambos virus expresaron a CAT eficazmente (Fig. 6). Se realizaron
experimentos adicionales para examinar la expresión y el
comportamiento de los virus recombinantes en animales infectados.
Se inyectó por vía intracerebral a ratones de seis semanas (en
grupos de cinco) con 10^{4} ffu de SAD VCAT, SAD XCAT y la
secuencia normal SAD L16 de RV, respectivamente. Siete días después
de la infección todos los animales presentaban síntomas típicos de
la rabia y murieron de rabia a la semana siguiente. La actividad de
CAT se demostró en los cerebros de los ratones infectados con SAD
VCAT y SAD XCAT, respectivamente. Ambos virus se podrían volver a
aislar en los cerebros de ratones y expresarse en cultivos
celulares de CAT. De este modo, se puede introducir un gen extraño
en el genoma del RV infeccioso y expresarse de forma estable y
también puede servir como marcador para diferenciar los virus
recombinantes.
\vskip1.000000\baselineskip
El genoma del virus de la fiebre porcina clásica
(CSFV) codifica tres glucoproteínas estructurales (E0, E1 y E2). En
animales infectados por CSFV anticuerpos neutralizantes se dirigen
contra E2, mientras que E0 provoca una respuesta inmunitaria
celular, abarcando el ADNc la zona de codificación de la proteína E2
y de la proteína E0 de la cepa Alfort del CSFV respectivamente, se
utilizaron para reemplazar la zona del pseudogén entre los puntos
AsuII y HindIII del pSAD V como se describe en el Ejemplo 4. Los
virus recombinantes (SAD-VE0 y
SAD-VE2, respectivamente) se recuperaron en
experimentos de transfección como se detalla en el Ejemplo 1. En las
células infectadas los virus expresaron la proteína CSFV E0 y la
proteína CSFV E2, respectivamente (Fig. 7).
Se utilizaron los virus recombinantes SAD VE0 y
SAD VE2 para inmunizar cerdos por vía oral. Cebos estándar para
zorro que se utilizan normalmente para inmunización oral de zorros
con la cepa SAD B19 de RV atenuado se cargaron con 107 pfu de SAD
VE0, SAD-VE2 y SAD B19, respectivamente. Se alimentó
con dos cebos de cada preparación a cada dos cerdos (cerdo nº 1 y
nº 2: SAD VE0, nº 3 y nº 4: SAD B19, nº 5 y nº 6: SAD VE2). Cuatro
semanas después de la inmunización, la presencia de anticuerpos
neutralizantes contra RV y CSFV tal como se analizó. Con la
excepción del nº 5, todos los cerdos poseían anticuerpos
neutralizantes de RV (valoración >250) confirmando la absorción
de los cebos de la vacuna. Por lo tanto el cerdo 5 no se consideró
más. El cerdo nº 6 desarrolló anticuerpos neutralizantes de CSFV a
un valor >16. Como era de esperar, los cerdos nº 1 a 4 no
desarrollaron anticuerpos neutralizantes de CSFV. Se realizó una
prueba de provocación con 10^{7} pfu de la cepa Alfort de CSFV 5
semanas después de la inmunización. Se controló el número de
leucocitos de los cerdos y la temperatura corporal después de la
prueba de provocación y se presenta en las Figuras 8 y 9,
respectivamente. Todos los cerdos desarrollaron fiebre, pero los
cerdos nº 1 y nº 2 así como el nº 6 se recuperaron más rápidamente.
El animal de referencia nº 4 murió 15 días después de la prueba de
provocación con síntomas típicos de CSFV, el nº 3 de referencia se
sacrificó el día 21. La presencia de anticuerpos neutralizantes de
CSFV en el cerdo alimentado con SAD VE2 y la protección parcial de
los cerdos que recibieron bien SAD VE0 o SAD VE2 demuestra que
tanto las respuestas inmunitarias humorales como celulares contra
dos
virus heterólogos pueden ser provocadas por vacunas vivas de RV recombinante después de la aplicación por vía oral.
virus heterólogos pueden ser provocadas por vacunas vivas de RV recombinante después de la aplicación por vía oral.
\vskip1.000000\baselineskip
Para generar un virus que se propaga con menos
eficacia que el virus normal SAD B19, se preparó un recombinante
que posee una proteína G mutada.
Con este objeto, se eliminó la secuencia que
codifica los últimos 46 aminoácidos de la proteína G. En primer
lugar, la proteína G que codifica el plásmido,
pT7T-G (Conzelmann y Schnell, 1994, supra) se
digirió con AflIII (posición 4752 de la secuencia SAD B19) y EcoRV
(el punto último está presente en el punto de clonación múltiple
del plásmido) y se generaron terminales romas mediante enzima de
Klenow. La ligadura de los terminales AflIII y EcoRV resultante
produjo la generación de un codón de terminación de traducción en la
secuencia AflIII anterior. Se utilizó un fragmento
PpuMI-SmaI de 0,3 kb ADN que contiene la zona
modificada para sustituir el fragmento 4469 a 4995
PpuMI-BstXI auténtico de pSAD L16. Esta manipulación
produjo la deleción de los nucleótidos 4753 a 4995 de SAD B19 que
codifican los 46 aa carboxiterminales de la cola citoplásmica de la
proteína G y parte de la secuencia del pseudogén. Un resultado
adicional es la introducción de los 18 nucleótidos procedentes del
vector inmediatamente corriente arriba del nuevo codón de
terminación para la traducción de G.
El RV recombinante (SAD DCD) se recuperó tal
como se describe en el Ejemplo 1. Como era de esperar, en las
células infectadas con SAD DCD se expresó una proteína G truncada
(Fig. 10). En comparación con el virus SAD L16 con secuencia
patrón, se obtuvieron valoraciones 100 veces más bajas con el virus
SAD DCD después de la infección de las células a un m.o.i. de 1.
Además, se observó una cantidad reducida de propagación en los
cultivos celulares (Fig. 11), indicando que el truncamiento de la
proteína G produjo el montaje reducido de los viriones o la
infectividad celular reducida de los viriones. Para analizar el
comportamiento de SAD DCD en animales infectados, se inyectó a
cinco ratones por vía intracerebral con 10^{5} ffu de SAD DCD y a
5 ratones con con la misma dosis de SAD L16.
\vskip1.000000\baselineskip
Para eliminar la zona de codificación de la
proteína completa G del genoma del RV, se utilizó el clon pSAD UE
completo (Ejemplo 2). Este clon se diferencia del pSAD L16 por la
presencia de un punto NheI único dentro de la zona 3' no traducida
del gen G (posición 5339 de SAD B19). Mediante digestión parcial de
pSAD U2 con PflMI (posición 3176 de SAD) y digestión completa con
NheI, relleno posterior con enzima de Klenow y religadura, se
eliminó un fragmento de ADNc que comprende los nucleótidos 3177 a
5339 de SAD B19. Se utilizó el clon pSAD dG resultante en los
experimentos de transfección para recuperar el virus recombinante.
Además de los plásmidos que codifican las proteínas N, P y L, sin
embargo, un plásmido que codifica la proteína G se transfectó
conjuntamente con pSAD dG para complementar la falta de G en el
genoma vírico. El virus resultante SAD dG se pasó de nuevo a las
células transfectadas con el plásmido que codifica a G y se infectó
con el virus vTF-7-3 de vacuna para
proporcionar la proteína G.
Las transcripciones por ARN de SAD dGse
analizaron mediante experimentos de transferencia de Northern.
Después de la hibridación con una sonda específica N, se observó
que el genoma de SAD dG era considerablemente más pequeño que el
genoma wt del virus de la rabia que refleja la delección del ADNc de
2,1 kb. Una sonda que abarca la zona de codificación de G completa,
sin embargo, fracasó para hibridarse con los ARN de SAD dG
demostrando la falta de secuencias de codificación de G (Fig. 12).
La identidad de la deleción se confirmó además mediante
RT-PCR y secuenciado.
SAD dG complementado fenotípicamente fue capaz
de infectar células BRS no complementarias, para replicar su genoma
y expresar los genes codificados por el genoma. Sin embargo, no fue
capaz de producir viriones infecciosos y de este modo, la infección
no se podía propagar a otras células (Fig. 13) o transferirse por
paso de los sobrenadantes del cultivo a otros cultivos
celulares.
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar que las proteínas de superficie
heterólogas se pueden incorporar funcionalmente en el desarrollo de
un virus recombinante, el SAD dG del mutante G se complementó con
glucoproteína víricas recombinantes tal como se describe en el
Ejemplo 7 para el virus G de la rabia. Se generaron partículas
infecciosas de pseudotipo que contenían las espinas proteicas del
virus Mokola, otro miembro del género Lyssavirus, el virus
rhabdovirus de la estomatitis vesicular (VSV; serotipo Nueva
Jersey, género vesiculovirus) y del virus retrovirus de la
inmunodeficiencia humana (VIH-1, cepa
NL-43).
La expresión de plásmidos transfectados del
Mokola auténtico y de la proteína VGV-G y la
infección de las células con SAD dG produjo la formación de virus
de pseudotipo infeccioso. Comparado con el virus G de la rabia y el
virus G de Mokola íntimamente relacionado, se observó sin embargo
una valoración reducida con VSV-G (10^{4}/ml en
comparación con 10^{6}/ml). Después de la sustitución de la
secuencia citoplásmica y de dominio de transmembrana de
VSV-G por los correspondientes dominios de la
proteína G del virus de la rabia se generaron, sin embargo,
10^{6} partículas infecciosas lo que sugiere que el dominio
citoplásmico de la G del RV está dirigiendo la proteína dentro de
la envoltura vírica.
La generación de partículas con pseudotipo
espinas gp160 (gp 120/40) de VIH no se observó. En cambio, la
expresión de una proteína híbrida compuesta del dominio ecto- y de
transmembrana del gp del VIH fusionado al dominio del citoplasma de
la G del RV produjo la formación de pseudotipos de RV(VIH).
Esto confirmó que el dominio del citoplasma de la proteína G es
responsable de la incorporación eficaz de espinas proteicas en la
envoltura de los rhabdovirus. Las partículas con pseudotipo
RV(VIH) infectaron con éxito las células Vero que expresan
la proteína de superficie CD4 humana (células T4^{+}) pero no las
células de referencia que expresan a CD8 (células T8') (las células
se obtuvieron a partir del AIDS Research and Reference Reagent
Programme). Los virus con pseudotipo poseen por lo tanto los
límites del huésped y la especificidad de la célula del VIH.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
1
Organización de la zona (\Psi) pseudogénica
del RV y construcción de los genomas del RV recombinante (dibujado
a escala). Los números indican las posiciones del nucleótido en la
secuencia del antigenoma de SAD B19. En la parte superior, se
muestra el genoma completo del RV con sus cinco marcos de lectura
abiertos. Las mutaciones se realizaron en pPsiX8 que contiene parte
del genoma (3823 a 6668) y se reintrodujeron en el clon pSAD L16
completo por intercambio del fragmento StuI
(4014-6364). En el dibujo con detalle, las zonas de
codificación están representadas por cajas grises, las secuencias
sin codificar como líneas. Las secuencias con señal transcripcional
funcional están indicadas por una barra rellena
((terminación/poliadenilación) y una punta de flecha (inicio de
transcripción del ARNm). La secuencia señalizadora no funcional que
define el inicio de la zona \Psi se presenta mediante la barra
abierta. Las flechas indican la posición de los cebadores G3P y L4M
del oligonucleótido utilizados para el análisis de la zona \Psi
por RT-PCR. En SAD U2, el relleno de las extensiones
de HindIII produjo la inserción de 4 nucleótidos y la generación de
un punto NheI único. En SAD V*, un fragmento de ADNc que contiene
el límite del cistrón N/P del RV (nucleótidos 1323 a 1502 del SAD
B19) se insertó en le punto StyI; SAD W9 posee una delección del
fragmento StyI/HindIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
2
Esquema simplificado para la construcción de los
plásmidos de transcripción que contienen el ADNc del RV completo.
Los números se refieren a las posiciones del nucleótido de la
secuencia del antigenoma SAD B19 RV (Conzelmann et al.,
1990). El plásmido pSDI-1 plus que sirve como base
para la reconstrucción del ADN genómico del RV completo es una
contrapartida de pDSI-1 (Conzelmann y Schnell, 1994)
que contiene el minigenoma SDI-1 RV que comprende
los nucleótidos 1 a 68 y 11760 a 11928 del terminal en dirección
opuesta con respecto al iniciador de T7
ARN-polimerasa (T7) y la secuencia del ribozima
antigenómico del virus delta de la hepatitis (HDV). El fragmento
MunI-BgIII de pSDI-1 plus se
sustituyó por una construcción de ADNc de 1 kb que se montó en tres
clones SAD B19 ADNc tal como se indica. La inserción de un fragmento
de SphI de 3,6 kb y de AatII de 7,2 kb que se montaron en dos
clones de ADNc cada uno produjeron el plásmido pSAD L16 final que
contiene el ADNc del SAD B19 completo. La transcripción de este
plásmido por la T7 ARN-polimerasa debería dar ARN
(antigenómico) de cadena positiva que posee tres restos G no
víricos de más en el terminal 5' y un claro 3' después de la
autolisis del ribozima. (T7) iniciador T7; (T7T) terminador de la
transcripción de T7; (HDV) secuencia de ribozima antigenómica de
HDV.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
3
Demostración de la identificación genética en el
genoma del virus transfectante SAD U2.
Se aisló ARN total de las células infectadas con
SAD B19 de RV (B19) y virus transfectantes SAD L16 (L16) y SAD U2
(U2) 2 días después de la infección y se utilizó para la
amplificación por RT-PCR de las respectivas zonas
\Psi con cebadores GP3 y LM4. Se separó el ADN amplificado en gel
de agarosa al 1% directamente y después de la digestión con HIndIII
y NheI, respectivamente. Un punto de restricción NheI está presente
solamente en el ADN procedente del marcador SAD U2.M,ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
4
Análisis por PCR de los genomas de SAB B19
(B19), SAD V* (V*) y SAD W9 (W9). Se realizó la
RT-PCR tal como se describe en la Fig. 3 con
cebadores GP3 y LM4. Se separaron los productos de amplificación en
gel de agarosa al 1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
5
Demostración de los ARNm de CAT transcritos por
RVS recombinante.
Una transferencia de Northern del ARN total de
las células infectadas con SAD L16 (L16), SAD XCAT (X6) y SAD VCAT
(VC18), se hibridó con sondas específicas para el gen G (G),
pseudogén-(Y) y gen de CAT, respectivamente. En el lado izquierdo
se indican los genomas víricos (v) y los ARNm particulares. Aunque
XCAT de SAD transcribe un ARNm que contiene tanto a CAT como las
secuencias del pseudogén ("CATY"), VCAT de SAD carece de
secuencias de pseudogén y transcribe un ARNm ("CAT") que posee
únicamente secuencias CAT. El tamaño de los marcadores de ARN se
dan en kb.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
6
Actividad en CAT de SAD XCAT y de SAD VCAT
después de múltiples pasos en el cultivo celular. Se infectaron
células con virus procedentes de determinados pasos (número de pasos
indicado) y se analizó la actividad en CAT en cantidades iguales de
extractos celulares, dos días después de la infección. En la entrada
"-" se analizaron los extractos de las células infectados con
SAD L16.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
7
Expresión de las proteínas E0 y E2 mediante RV
recombinantes.
Se infectaron células con SAD VE0 (cepas 1, 2 y
3) y SAD VE2 (cepas a, b, c), respectivamente. Dos días después de
la infección, se separaron los extractos celulares en geles de PAA
en condiciones reductoras y se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa. Después de la incubación con anticuerpos monoclonales
dirigida contra las proteínas E0 y E2 del CSFV, respectivamente, y
posteriormente con un anticuerpo secundario acoplado a la fosfatasa
alcalina, se visualizaron las proteínas mediante adición de
sustrato y exposición a película de rayos-X. Como
referencia, se utilizaron proteínas E0 y E2 expresadas y
purificadas de baculovirus (B). Además, los extractos de células
infectadas con CSFV (V) sirvieron para comparación.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
8
Leucocitos de cerdos inmunizados con SAD VE0 (nº
1 y 2), SAD VE2 (nº 6) y SAD B19 de virus de la rabia normal (nº 3
y 4) y se sometieron a una prueba de provocación con CSFV. Las
cantidades de leucocitos se dan en porcentaje de números absolutos
presentes antes de la prueba de provocación (día 0). (nº 1, día 10
p. ch.): no realizada, valor estimado.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
9
Temperatura del cuerpo de los cerdos después de
la prueba de provocación del CSFV (día 0).
- a.
- Animales inmunizados con SAD VE0 (nº 1 y 2) desarrollaron fiebre hasta el día 11 (nº 1) o no (nº 2). Ambos animales de control inmunizados con SAD B19 (nº 3 y nº 4) presentaron fiebre alta durante un periodo prolongado. El nº 4 murió el día 15 después de la prueba de provocación de fiebre porcina clásica, debido a síntomas graves, el nº 4 se sacrificó 21 días después de la prueba de provocación.
- b.
- El animal inmunizado con SAD VE2 desarrolló fiebre leve solamente los días 6 a 8. Las referencias son las mismas que en a).
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
10
Expresión de una proteína G truncada en células
infectadas con SAD DCD.
Se infectaron células BSR a un m.o.i de 1 con
SAD DCD o SAD L16 y a las 16 h después de la inyección marcadas con
50 \muCi de [^{35}S]metionina durante 3 h. Se incubaron
extractos celulares con un MAb de G anti-rabia y
alícuotas de muestras inmunoprecipitadas se digirieron ambas con
PNGasa F (+PF) para demostrar que los ejes principales o simulados
de la proteína tratados (-) para demostrar las proteínas
glucosiladas. +TM: se incubaron células infectadas en presencia de
2 \mug/ml de tunicanicina durante 90 min antes del marcaje y
durante las 3 h del periodo de marcaje. Se separaron las proteínas
en SDS-PAGE al 10% y se visualizaron por
autorradiografía. Los extractos celulares se analizaron como
anteriormente. L16, virus de SAD L16; \DeltaCD, mutante del virus
SAD DCD. M: marcadores del tamaño de las proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
11
Propagación de SAD L16 y SAD DCD en el cultivo
celular.
Se infectaron células de cultivo a un m.o.i de
0,05 con SAD L16 (L16) y SAD DCD (DCD), respectivamente y se
analizaron por inmunofluorescencia directa con un conjugado
(Centocor®), en los periodos después de la inyección indicados,
dirigido contra una proteína N del virus de la rabia. Se observa una
propagación más lenta de la infección de las células vecinas en las
células infectadas con SAD DCD.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
12
Análisis de los ARN específicos de SAD dG
(Ejemplo 7) y SAD dCD (Ejemplo 6).
Todo el ARN de las células BSR infectadas con
SAD L16 (Ejemplo 1), SAD dCD (\DeltaCD) y el virus SAD dG
(\DeltaG) complementado fenotípicamente a m.o.i.s. de 1 se
aislaron 2 días después de la infección y se analizaron por
hibridación de Northern. Tal como se demostró por hibridación con
una sonda específica del gen N (A), el genoma de SAD dG es
considerablemente más pequeño que el genoma del virus de la rabia
normal (v), reflejando la deleción de 2,1 kb del gen G. Una sonda
que abarca la proteína G completa que codifica la secuencia no
consigue hibridarse con los ARN de SAD dG. La deleción pequeña del
dominio citoplásmico que codifica la zona en el genoma SAD dCD se
demuestra por la aparición de un ARNm de G (G) que es más corto que
el ARNm de G del virus de la rabia normal.
v: ARN genómico; N, G: ARNm monocistrónicos;
N+P, M+G, G+L: ARNm bicistrónico.
\newpage
Fig.
13
Falta de propagación de SAD dG mutante
G^{-}.
Se infectaron células de BSR con SAD dG
complementado fenotípicamente y se analizaron 36 horas después de
la transfección por microscopía de inmunofluorescencia. En (A) se
muestra la expresión de la proteína N por incubación de las células
con un anticuerpo acoplado a FITC dirigido contra la proteína N
(Centocore). Solamente se infectaron células individuales, no se
observa propagación de virus a las células vecinas. (B): control
con un anticuerpo específico G.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
14
Composición de la glucoproteína VIH/RV híbrida
funcional utilizada para la generación de viriones con pseudotipo
RV(HIV). Se sustituyó el dominio citoplásmico gP160
HIV-NL43 completo excepto para tres aminoácidos
corriente abajo directamente del dominio de transmembrana por el
dominio citoplásmico RV-G completo. "p"
representa un resto de prolina no presente en las proteínas
paternas. Las secuencia de los dominios citoplásmico y de
transmembrana están separadas por una barra oblicua (/).
Claims (17)
1. Mutante del virus de la rabia replicativo
infeccioso manipulado genéticamente que comprende una inserción o
deleción en un marco de lectura abierto, una zona pseudogénica o una
zona intergénica del genoma del virus.
2. Mutante del virus de la rabia según la
reivindicación 1, caracterizado porque el mutante del virus
comprende una inserción o deleción en una zona pseudogénica.
3. Mutante del virus de la rabia según la
reivindicación 1, caracterizado porque el mutante del virus
comprende una inserción o deleción en un marco de lectura
abierto.
4. Mutante del virus de la rabia según la
reivindicación 3, caracterizado porque el mutante del virus
comprende una inserción o deleción en el marco de lectura abierto
que codifica a la proteína matriz dando como resultado la ausencia
de una proteína matriz funcional, estando dicho mutante
complementado fenotípicamente con la proteína matriz.
5. Mutante del virus de la rabia según la
reivindicación 3, caracterizado porque el mutante del virus
comprende una inserción o deleción en el marco de lectura abierto
que codifica a la glucoproteína G.
6. Mutante del virus de la rabia según las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque lleva una
secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica a un epítopo o
polipéptido de un virus o microorganismo patógeno.
7. Mutante del virus de la rabia replicativo
infeccioso manipulado genéticamente que comprende una inserción y/o
una deleción en un marco de lectura abierto, una zona pseudogénica o
una zona intergénica del genoma del virus, caracterizado
porque el mutante del virus es portador de una secuencia de ácido
nucleico heteróloga que codifica a un epítopo o polipéptido de un
virus o microorganismo patógeno.
8. Mutante del virus de la rabia según la
reivindicación 7, caracterizado porque el mutante del virus
comprende una inserción y/o deleción en una zona pseudogénica.
9. Mutante del virus de la rabia según la
reivindicación 7, caracterizado porque el mutante del virus
comprende una inserción y/o deleción en un marco de lectura
abierto.
10. Mutante del virus de la rabia según la
reivindicación 9, caracterizado porque el mutante del virus
comprende una inserción y/o deleción en el marco de lectura abierto
que codifica a la proteína matriz resultando en la ausencia de una
proteína matriz funcional, estando dicho mutante complementado
fenotípicamente con la proteína matriz.
11. Mutante del virus de la rabia según la
reivindicación 9, caracterizado porque el mutante del virus
comprende una inserción y/o deleción en el marco de lectura abierto
que codifica a la glucoproteína G.
12. Mutante del virus de la rabia según las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la inserción
y/o deleción produce la ausencia de una glucoproteína G funcional,
estando dicho mutante complementado fenotípicamente con una
glucoproteína implicada en la unión celular y en la fusión de la
membrana.
13. Mutante del virus de la rabia según la
reivindicación 12, caracterizado porque la glucoproteína
implicada en la unión celular y en la fusión de la membrana es la
glucoproteína G de la rabia.
14. Vacuna para la prevención de la infección
producida por un virus de la rabia en un mamífero,
caracterizada porque la vacuna comprende un mutante de virus
de la rabia según las reivindicaciones 1 a 13 y un excipiente o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
15. Procedimiento para la preparación de un
virus de la rabia replicativo infeccioso manipulado genéticamente
que comprende una inserción y/o deleción en un marco de lectura
abierto, una zona pseudogénica o una zona intergénica del genoma
del virus, comprendiendo dicho procedimiento las etapas
siguientes:
- a)
- introducir en una célula huésped
- 1)
- una o más moléculas de ADN que codifican las proteínas N, P y L del virus o los análogos de las mismas; y
- 2)
- una molécula de ADN que comprende el ADNc de un genoma del virus de la rabia que comprende una inserción y/o una deleción en un marco de lectura abierto, una zona pseudogénica o una zona intergénica del genoma del virus, en el que la molécula de ADN comprende las secuencias del iniciador y del terminador de transcripción apropiadas reconocibles por una polimerasa expresada junto con la célula huésped, en la que las transcripciones del genoma del ADNc del virus de la rabia son ARN antigenómicos con cadena positiva y en el que las transcripciones presentan terminales 3' claros, y
- b)
- aislamiento de los virus producidos por las células.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque el ADNc del genoma del virus de la rabia
se modifica por la incorporación de una mutación.
17. Procedimiento según las reivindicaciones 15
a 16, caracterizado porque la RNA-polimerasa
es T7 RNA-polimerasa, expresada preferentemente a
partir de un virus de vacuna recombinante.
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