CN1981043B

CN1981043B - 用于表达黄病毒科蛋白的重组慢病毒载体及其作为疫苗的应用

Info

Publication number: CN1981043B
Application number: CN200580015744XA
Authority: CN
Inventors: 菲利普·德普雷斯; 皮埃尔·沙尔诺; 弗雷德里克·坦吉; 马里-帕斯卡莱·弗伦凯尔
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 2004-05-17
Filing date: 2005-05-16
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2025-05-16
Also published as: CA2564934A1; BRPI0510016B8; MXPA06013388A; JP2008508863A; CN1981043A; EP2371966B1; EP1751291B1; BRPI0510016A; US20090214589A1; US20110206710A1; CA2564934C; US8716013B2; FR2870126A1; FR2870126B1; BRPI0510016B1; EP2371966A1; WO2005111221A1; EP1751291A1

Abstract

包含编码黄病毒科病毒的至少一种蛋白质或所述蛋白质至少8个氨基酸长的免疫原性肽的多核苷酸片段的重组慢病毒载体，用于制备药用组合物以预防和/或治疗敏感物种中黄病毒科感染的用途。

Description

用于表达黄病毒科蛋白的重组慢病毒载体及其作为疫苗的应用

技术领域

本发明涉及用于表达黄病毒科(Flaviviridae)蛋白质的重组慢病毒载体以及它作为疫苗在预防和/或治疗敏感物种(宿主或贮主)中受黄病毒科病毒感染中的应用。

背景技术

黄病毒科被划分成三个属：黄病毒属、瘟病毒属和丙肝病毒或丙型肝炎病毒属；黄病毒科是人和牲畜健康的重要问题，因为大量人畜疾病是由黄病毒科所诱发的。具体而言，例如，有70种以上的黄病毒，其中至少50％是人或牲畜疾病的病因。

黄病毒科是小的有包膜病毒。它们的基因组是正极性单链RNA分子，根据黄病毒科类型长度为9.5kb至12.5kb，含有单个开放阅读框，在其旁侧是5’和3’末端两个短的非编码区。此开放阅读框被翻译成多蛋白，它是在其N末端部分中结构蛋白和在其C末端部分非结构(NS)蛋白的前体。

更明确的说：

-就黄病毒属而言，它的基因组是正极性的单链RNA分子，长度大约为10-12k碱基。基因组RNA与数拷贝的衣壳蛋白C结合以形成核衣壳；它被由来源于内质网(ER)膜的脂双层组成的病毒包膜包围，包膜中锚定了包膜蛋白E和膜蛋白M。黄病毒基因组RNA包含约10500个核苷酸的单个开放阅读框，其旁侧是5’和3’末端的两个短的非编码区。基因组被翻译成大约3400个氨基酸的多蛋白，它是在其N末端部分中三种结构蛋白质C、prM(M的细胞内前体)和E、以及在其C末端部分中至少5种非结构(NS)蛋白NS1至NS5的前体。因此观察到以下结构：

C-prM/M-E-NS1-NS2A/2B-NS3-NS4A/4B-NS5；

-就瘟病毒属而言，基因组RNA大于12k碱基，并且包含单个开放阅读框，被翻译成大约3900个氨基酸的多蛋白，它是11至13种瘟病毒蛋白的前体，其中4种是结构蛋白质：观察到以下结构：N^pro-C^ems-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A/4B-NS5A/5B，以及

-就丙型肝炎病毒属而言，基因组RNA含有大约9.5k碱基，并且包含单个开放阅读框，被翻译成大约3000个氨基酸的多蛋白，它是在其N末端部分中三种结构蛋白质C、E1和E2、以及在其C末端中至少7种非结构(NS)蛋白NS1至NS5的前体。观察到的结构如下：C-E1-E2-NS1-NS2-NS3-NS4A/4B-NS5A/5B。

许多严重的人和动物疾病是由此科病毒诱导的；根据感染的病毒，通常观察到的各种症状有发热(周期性或非周期性)、出血热、腹泻、脑炎、肝炎或脓毒性休克。更确切的说，讨论的各种病毒如下：

-黄病毒属：黄病毒中大部分通过蚊(库蚊属、伊蚊属、按蚊属或曼蚊属)或蜱传播给脊椎动物宿主：(i)通过蚊子传播的病毒：登革热病毒(1型至4型)、黄热病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)、西尼罗病毒(WNV)、墨累山谷脑炎病毒(Murray Valley encephalitis virus，MVEV)、圣路易脑炎病毒(SLEV)和(ii)由蜱传播的病毒：蜱媒脑炎病毒(TBEV)、科萨努尔森林病病毒、鄂木斯克出血热病毒和跳跃病病毒。

-瘟病毒属：边界病病毒(BDV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和典型猪瘟病毒(CSFV)或猪霍乱病毒。

-丙肝病毒属：丙型肝炎病毒和庚型肝炎病毒。

候鸟可以是某些这类病毒的贮主，尤其是西尼罗病毒，它还被注意到的是跨越了马和人之间的物种屏障。

迄今为止研究者已提出了一定数目的疫苗策略(Gould EA：Flavivirus Infectionsin Humans，Encyclopaedia of Life Sciences，2001；Pugazchev KV et al.，Internat.J.Parasitol，2003，33，567-582；Putnak R et al.，Advances in Virus Research 2003，61，445-468；Smith DB，Hepatitis C virus，Encyclopaedia of Life Sciences，2001)并且涉及：

-含有减毒活病毒或已灭活病毒的疫苗(Pugachev KV等，2003，同上；Gould EA，2001，同上；Brinton MA，Annu.Rev.Microbiol.，2002，56，371-402；Hamers C.等，Vet.Rec.，2003，153，8，236-240；Kovacs F.等，Vet.Microbiol.，2003，96，2，117-131)；

-含有病毒亚基的疫苗；

-含有一个或多个病毒来源抗原的疫苗(Wang T等，J.Immunol.，2001，167，5273-5277)；

-含有嵌合病毒的疫苗(Pugachev KV等，2003，同上)；或

-DNA疫苗(Putnak R等，2003，同上；Turell MJ等，Emerging InfectiousDiseases，2003，9，9，1077-1081；Davis BS等，J.Virol.，2001，4040-4047；Pan CH等，J.Virol.，2001，75，23，11457-11463)；这些疫苗使用了各种各样的载体。具体而言，上文提及的Putnak R等人在2003年提出为了进行最适表达，应选择最适当的调控元件(启动子和增强子)；至少就黄病毒而言，推荐使用含CMV启动子(例如，pcDNA3质粒，Invitrogen)或RSV启动子并共表达prM和E基因以及任选的至少一种非结构蛋白质的质粒载体。

例如，对于最近才在北半球、尤其是美国出现的WNV，目前提议用于抗击西尼罗病毒感染的各种疫苗策略有如下几种：

-在小鼠脑中生产的日本脑炎病毒，用甲醛溶液灭活(JE-Aventis-Pasteur；Monath等，Curr.Drug Targets Infect.Disord.，2001，1，37-50)；对于它能保护人或马抵抗西尼罗病毒感染的交叉保护作用仍未得到证实并且是有争议的(Monath，AM；Trop.Med.Hyg.，2002，66，113-114)。此外，小鼠的研究显示交叉免疫可能在西尼罗病毒感染期间诱导脑发炎；

-甲醛灭活的西尼罗病毒(国际专利申请WO 03/061555)；这种被提议用于免疫马的疫苗已被发现在马中无任何致病效果并且有效抵抗西尼罗病毒的感染；不过，由于体液应答的量较低，需要进行数次注射以及之后每年增强免疫；

-来自黄热病毒减毒株的嵌合病毒(17D株；ChimeriVax^TM-WN)；更确切的说，所述-西尼罗嵌合病毒在减毒病毒YV 17D中包含了New York 1999株WNV的prM-E盒(国际专利申请WO 03/059384和Pletnev AG等，PNAS，2002，99，5，3036-3041；Monath TP等，Curr.Drug Targets Disord.，2001，1，1，37-50)；西尼罗病毒的prM和E基因被插入黄热病毒或登革热病毒中，因此其可用作载体。编码核衣壳蛋白和非结构蛋白的基因以及来源于17D或DEN4毒株的非翻译末端区被用于重组嵌合病毒的复制。嵌合病毒在宿主内象17D或DEN4病毒一样进行复制，但特异性针对西尼罗病毒免疫(Monath等，Curr.Drug Targets Infect.Disord.，同上)。用嵌合病毒进行感染刺激了免疫应答的各条途径。此外，嵌合病毒颗粒包含完整的E蛋白，它具有冗余的中和表位。因此，嵌合病毒在宿主中复制诱导预防病毒早期传播的高滴度中和抗体，而细胞毒性T免疫性则除去了已经成功感染细胞的病毒。感染后记忆应答是快速的并且比疫苗后应答更强，它也有助于抵抗西尼罗病毒感染。已显示用17D毒株预免疫不抑制嵌合病毒的感染，而相反的提高特异性抗体的生产。还已经显示，在小鼠和非人灵长类动物中，ChimeriVax^TM-JE嵌合疫苗的神经毒性较17D毒株更低。此外，在体内和细胞培养中重复传代期间嵌合病毒基因组是稳定的。ChimeriVax^TM-WN嵌合病毒来自已证实对人无害且有效的疫苗株，因为该疫苗株是65年前为人免疫接种所研发的并且已经用于数百万个体(Monath等，Curr.Drug Targets Infect.Disord.，同上)；然而使用嵌合的减毒活病毒产生了安全性问题，不同物种之间的非同源重组是可能的，就象天然存在的重组黄病毒所证明的那样(Seligman SJ和Gould EA，Lancet，2004，363，2073-2075)。

-裸DNA(Davis等，J.Virol.，2001，75：4040-4047；Turell等，Emerg.Infect.Diseases，2003，9，1077-1081和国际专利申请WO 03/061555)；使用的裸DNA载体是含巨细胞病毒早期启动子、来源于日本脑炎病毒编码信号肽的序列、以及编码西尼罗病毒prM和E蛋白的序列的载体pCBWN。已显示简单肌肉内注射此质粒在小鼠和马中诱导针对西尼罗病毒感染的保护性免疫；

-重组蛋白E(Wang等，J.Immunol.，2001，167，5273-5277)；以融合蛋白形式在大肠杆菌中表达并通过亲和层析纯化的完整E蛋白或缺失C末端区(残基E1至E409)的E蛋白在小鼠中诱导抗E蛋白的中和抗体。缺失C末端区域的可溶性E蛋白在小鼠中诱导完全的保护作用，但用完整的E蛋白只观察到部分的保护作用。

即使目前提议的大部分疫苗总体上是有效的，也仍然存在对新的预防性手段的需求，尤其是在有关黄病毒科的DNA疫苗领域；具体而言，确实需要有载体可用于人类医学和兽医学中预防由这些病毒诱发的疾病以及根除贮主中的这些病毒。

事实上，对于丙肝病毒属，例如更具体地对于丙型肝炎，针对保护患者免于丙型肝炎而进行的试验失败了，因为痘苗病毒被用于表达HCV病毒蛋白；现在，此病毒引起剪接，导致病毒蛋白被截短从而使保护有效性降低(Dumonceaux J等，J.Virol.，2003，77，24，13418-13424)。

此外，仍需要有只需不多次(一次或最多两次)注射的疫苗，以便方便它们的使用，尤其是在较难建立被遵守的免疫计划的国家。

发明内容

令人惊奇的是，发明人已表明用于表达黄病毒科病毒的至少一种免疫原性蛋白的重组慢病毒载体有效的令其有可能在被免疫个体(人或动物)中诱发强免疫应答，尤其是能保护所述个体抵抗此病毒的感染。

所述重组慢病毒载体能诱发抗高剂量西尼罗病毒攻击的非常早期的、长期持续的、完全保护性免疫应答。

发明人提供了第一个证据证明慢病毒载体是诱发抗病原体的体液保护性应答的有效工具。这拓宽了慢病毒载体作为抗诸如黄病毒科病毒等的疫苗接种工具的适用性，其中中和性体液应答是此免疫系统的一个活跃分支。

因此，本发明的一个主题是含有编码黄病毒科病毒至少一种蛋白质或所述蛋白质中至少8个氨基酸的免疫原性肽的多核苷酸片段的重组慢病毒载体，制备免疫原性组合物的用途，用于预防和/或治疗黄病毒科病毒对敏感物种的感染。

这样的载体具有一定的优势并且尤其适于上述需要：

-它具有增加的免疫原能力；因此，单次施用于敏感物种就有效。此载体的有效性同时与以下方面有关：(i)它对抗原呈递细胞或APC如树突细胞等的趋向性，尤其是当它被皮下注射时；(ii)这些载体所携带的感兴趣序列在细胞基因组中稳定整合，使得抗原可以在体内、尤其是树突细胞内长期持续表达，以及(iii)它刺激树突细胞依赖型免疫应答的能力。由此，抗原在树突细胞中表达的持续时间就长于通常用脉冲处理的树突细胞所获得的时间，这有利地使得有可能免于重复施用所述载体，

-它是非复制型的；因此，它很少有或不具有对敏感物种的致病能力并且无传染能力，即，没有在周围环境中传播的危险，

-它是非致瘤性的，它导致感兴趣序列稳定整合于宿主细胞的基因组中而不引起任何致肿瘤作用，

-它表现出无物种限制并且具有扩展的细胞趋向性，尤其是由于这种事实：它可能产生具有其它病毒的包膜蛋白的假型，所述包膜蛋白诸如水泡性口炎病毒(VSV)的、弹状病毒科病毒如狂犬病毒的糖蛋白G、以及埃博拉病毒的糖蛋白G；从而，它能有效的在任何敏感物种中用于预防和/或治疗性免疫，并且

-它使得应用时有可能不必使用佐剂。

定义

-多核苷酸片段：术语“多核苷酸片段或多核苷酸”意指至少24个碱基或碱基对的DNA或RNA片段，优选长度为24至5000个碱基或碱基对，尤其是cDNA或cDNA片段。

-免疫原性片段：能在对黄病毒科感染敏感的物种内诱发特异性体液和/或细胞应答的肽片段。

-编码至少一种黄病毒科蛋白或所述蛋白的至少8个氨基酸长的免疫原性肽的多核苷酸片段：以上定义的多核苷酸编码黄病毒科的一种或多种结构或非结构蛋白和/或一种或多种免疫原性片段。黄病毒科多蛋白的开放阅读框(ORF)和所述ORF中包括的各种黄病毒科蛋白质的编码序列是本领域技术人员所已知的并且可通过数据库或参考文献获得，尤其是NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的数据库或者文献，例如Virus Taxonomy.Classification and nomenclature of viruses.Sixth report of theInternational Committee on taxonomy of viruses(F.A.Murphy 等，Archives of VirologySupplement 10，1995，Springer Verlag，Vienna，New York)。本发明包括任何黄病毒科的编码序列以及所述编码序列中一或多个核苷酸突变(插入、缺失、替换)或所述开放阅读框移动一或两个核苷酸(ORF+1和ORF+2)而产生的变体，只要所述突变基本上不改变所述蛋白质或所述片段的抗原性和/或免疫原性即可。本发明尤其包括由于核苷酸突变(插入、缺失、替换)来自以上序列的多核苷酸变体，只要被修饰的核酸片段在高严谨性杂交条件下保持与衍生它们的修饰多核苷酸特异性杂交的能力。

-高严谨性杂交条件：就本发明的目的而言，表述“高严谨性杂交条件”意指选定的温度和离子强度条件，使其有可能维持互补性多核苷酸之间的特异性和选择性杂交。举例说来，用于定义以上多核苷酸目的的高严谨性条件有利地如下：分两步进行DNA-DNA或DNA-RNA杂交：(1)在含5×SSC(1×SSC对应0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠的溶液)、50％甲酰胺、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、10×Denhardt’s、5％硫酸葡聚糖和1％鲑精DNA的磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7.5)中42℃预杂交3小时；(2)42℃杂交20小时，随后在2×SSC+2％SDS中20℃20分钟洗涤两次，在0.1×SSC+0.1％SDS中20℃20分钟漂洗1次。最后在0.1×SSC+0.1％SDS中60℃洗涤30分钟。

-敏感物种：表述“对黄病毒科感染敏感的物种”意指能发生被黄病毒科所诱发的病理状态的宿主物种，诸如人或非人哺乳动物，以及负责病毒传播但不呈现症状的贮主物种，诸如尤其是鸟或爬行动物(鳄鱼)。

-重组慢病毒载体：术语“重组慢病毒载体”意指对应慢病毒载体重组基因组的分离核酸分子，尤其包括质粒(载体质粒)，也意指包含所述重组基因组的重组慢病毒颗粒(载体颗粒)，它们在合适的细胞体系中产生，任选的具有其它病毒包膜蛋白的假型，诸如水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病毒和埃博拉病毒的糖蛋白G。

根据本发明，所述慢病毒载体选自以下来源：HIV(人免疫缺陷性病毒)，例如HIV-1或HIV-2；CAEV(羊关节炎脑炎病毒)、EIAV(马传染性贫血病毒)、VMV(绵羊脱髓鞘性脑白质炎/羊肺腺瘤病病毒)、SIV(猴免疫缺陷病毒)或FIV(猫免疫缺陷病毒)。本发明还包括来源于至少两种不同慢病毒的嵌合慢病毒。慢病毒载体的选择尤其依赖于敏感物种；例如，来源于HIV的载体有利地用于人免疫接种中。

慢病毒载体是本领域技术人员所已知的；它们由重组核苷酸序列(重组慢病毒基因组)组成，其中包含：(i)置于转录和表达调控信号控制下的感兴趣序列(在本发明情况下是黄病毒科的编码序列)，以及(ii)衣壳包装、逆转录和病毒整合所必要和充分的慢病毒来源的调控序列，以及任选地针对Rev蛋白的调控序列(RRE或rev应答元件)。特别可提及的是由Poznansky等人(J.Virol.，1991，65，532-536)和Naldini等人(Science，1996，272，263-267)所述的来自HIV的慢病毒载体、或者由Poeschla等人(Nature Medicine，1998，4，354-357)所述的来自FIV的慢病毒载体，还可提及的的是来源于以上病毒的最小载体，如国际专利申请WO 99/32646和WO98/17815中所述。

根据本发明，所述的慢病毒载体是在适当的细胞体系中能表达上文所定义的编码序列的载体；所述的载体含有表达盒，其中包括合适的转录调控元件(启动子、增强子、Kozak共有序列、多聚腺苷酸化信号，等等)，如上定义的编码序列被插入在其控制下；所述的感兴趣编码序列包含细胞运输所需要的信号，例如用于在内质网内转位的信号，特别来源于在所述黄病毒科多蛋白中所述编码序列之前的ORF。例如，以黄病毒科为例，当所述编码序列是E蛋白或所述蛋白质的片段的编码序列时，所述信号序列有利地来自M蛋白前体(prM)。有利的是，所述表达盒包含诸如巨细胞病毒(CMV)早期启动子等的普遍存在的强启动子或诸如延伸因子1α(EF1α)或磷酸甘油酸(PGK)启动子等无增强子的启动子。

此外，所述的载体还可以包含自杀基因，诸如1型疱疹胸苷激酶(HSV1-TK)等，以便通过用适当药物处理除去被转导的细胞，例如对于HSV1-TK用无环鸟苷。

本发明包括简单表达载体和可以同时表达来自同一启动子或不同启动子的数个编码序列的多重表达载体，所述的启动子位于所述载体的同一区域或不同区域。

根据所述用途的优选实施方案，所述的重组慢病毒载体是三重型的。

三重型的载体具体描述于Zennou等，Cell，2000，101，173-185以及国际专利申请WO 99/55892、WO 01/27304和WO 01/27300。

所述三重型载体的特征在于它们含有能在病毒逆转录期间形成三重结构(或DNA三聚体)的DNA区域。此三重DNA区由用于中央起始的顺式活性区、或聚嘌呤束(tract)(cPPT)、以及用于终止的顺式活性区(CTS)，所述区域使得有可能起始其合成由位于慢病毒基因组中央的PTT区域启动的+链的转录、并中断其合成开始于慢病毒LTR上游3’PPT位点的+链的转录。慢病毒载体中此三重DNA区的存在通过刺激载体的核输入速率而显著改进有丝分裂或非有丝分裂细胞中的基因转导。

根据所述用途的另一优选实施方案，所述的重组慢病毒载体包含3’LTR，其中启动子和活化子已从U3区被删除；此删除提供了额外的安全特性。

根据所述用途的另一优选实施方案，所述的重组慢病毒载体是具有另一种病毒的至少一种包膜蛋白的假型，优选水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白G；VSV糖蛋白G有利地使得它有可能获得高滴度的载体颗粒并产生具有广泛细胞趋向性的载体颗粒，尤其能在有感染风险的任何脊椎动物物种中转导抗原呈递细胞，如树突细胞，所述动物包括马、家禽和动物园动物。

根据本发明，如上文所指出，所述黄病毒科选自黄病毒属、瘟病毒属或丙型肝炎病毒属。

根据所述用途的另一优选实施方案，所述的黄病毒科选自西尼罗病毒、登革热病毒、黄热病毒和丙型肝炎病毒。

根据本发明，所述的多核苷酸，尤其是黄病毒科的cDNA或cDNA片段，编码：(i)一种或多种不同的结构蛋白(C、prM、M、E、E1、E2)，和/或(ii)一种或多种不同的非结构(NS)蛋白，和/或(iii)所述蛋白质的一个或多个不同的免疫原性片段，所述蛋白质或其片段来源于相同黄病毒科(单价疫苗)或来源于不同的黄病毒科和/或来源于同一黄病毒科的不同血清型或不同类型，用于制备多价疫苗。

所述cDNA还可通过开放阅读框中一或两个核苷酸的移动(核糖体移码)来源于黄病毒科的编码序列。这样的cDNA是本领域技术人员所已知的，尤其是对于丙型肝炎病毒的C蛋白而言(Xu等，EMBO，2001，20，3840-3848；Roussel等，J.Gen.Virol.，2003，84，1751-1759；Vassilaki等，J.Biol.Chem.，2003，278，40503-40513；国际专利申请WO 99/63941)。

根据所述用途的另一优选实施方案，所述的多核苷酸是与表1所列NCBI数据库中的登录号相对应的黄病毒科编码序列的片段：

表1：黄病毒科的编码序列

黄病毒科	NCBI登记号	序列描述
黄病毒科	NCBI登记号	序列描述	黄病毒属	M23027	1型登革热病毒的多蛋白的5’cDNA序列
黄病毒属	M19197	2型登革热病毒基因组的DNA等价物	黄病毒属	M23027	1型登革热病毒的多蛋白的5’cDNA序列
黄病毒属	M19197	2型登革热病毒基因组的DNA等价物	黄病毒属	M93130	3型登革热病毒基因组的DNA等价物
黄病毒属	M14931	4型登革热病毒基因组的DNA等价物	黄病毒属	M93130	3型登革热病毒基因组的DNA等价物
黄病毒属	M14931	4型登革热病毒基因组的DNA等价物	黄病毒属	M12294	西尼罗病毒基因组的DNA等价物
黄病毒属	AF481864	西尼罗病毒IS-98-ST1株基因组的DNA等价物	黄病毒属	M12294	西尼罗病毒基因组的DNA等价物
黄病毒属	AF481864	西尼罗病毒IS-98-ST1株基因组的DNA等价物	黄病毒属	M18370	日本脑炎病毒基因组的DNA等价物
黄病毒属	X03700	黄热病毒(疫苗株17D)的多蛋白的cDNA	黄病毒属	M18370	日本脑炎病毒基因组的DNA等价物
黄病毒属	X03700	黄热病毒(疫苗株17D)的多蛋白的cDNA	黄病毒属	U27495	蜱媒脑炎病毒复合物(TBE复合物)的Neudoerfl病毒的基因组的DNA等价物
黄病毒属	M73835	Langat病毒(TBE复合物)的结构蛋白的cDNA	黄病毒属	U27495	蜱媒脑炎病毒复合物(TBE复合物)的Neudoerfl病毒的基因组的DNA等价物
黄病毒属	M73835	Langat病毒(TBE复合物)的结构蛋白的cDNA	瘟病毒属	M31182	BVD病毒基因组的DNA等价物
瘟病毒属	M31768	CSF病毒(猪霍乱病毒)Brescia株基因组的DNA等价物	瘟病毒属	M31182	BVD病毒基因组的DNA等价物
瘟病毒属	M31768	CSF病毒(猪霍乱病毒)Brescia株基因组的DNA等价物	瘟病毒属	J04358	CSF病毒(猪霍乱病毒)Alfort株基因组的DNA等价物
丙型肝炎病毒属	M62321	1型丙型肝炎病毒(HCV-1)多蛋白质的cDNA	瘟病毒属	J04358	CSF病毒(猪霍乱病毒)Alfort株基因组的DNA等价物
丙型肝炎病毒属	M62321	1型丙型肝炎病毒(HCV-1)多蛋白质的cDNA	丙型肝炎病毒属	D90208	丙型肝炎病毒多蛋白质的cDNA
丙型肝炎病毒属	M58335	丙型肝炎病毒多蛋白质的完整cDNA	丙型肝炎病毒属	D90208	丙型肝炎病毒多蛋白质的cDNA

各种黄病毒科蛋白质编码序列的位置被指示于与表1列出登记号相应的序列中，其对应所述多蛋白质的cDNA或黄病毒科基因组的DNA等价物。

根据所述用途的另一优选实施方案，所述的多核苷酸片段选自：

a)编码西尼罗病毒或登革热病毒的E蛋白、和任选地prM或M蛋白、和/或C蛋白、和/或非结构蛋白的cDNA，以及编码以上蛋白质的至少8个氨基酸长的一种或多种免疫原性肽的cDNA，

b)编码丙型肝炎病毒的E1或E2蛋白或E1/E2异二聚体、和/或根据0、+1或+2阅读框的C蛋白、和/或NS3蛋白的cDNA，以及编码以上蛋白质的至少8个氨基酸的一种或多种免疫原性肽的cDNA，和

c)编码登革热病毒E蛋白的一种或多种不同结构域III(第295至394位)的cDNA，分别对应四种类型登革热病毒(1型至4型或DEN-1至DEN-4)之一种，优选编码四种结构域III(DEN-1至DEN-4)的cDNA，其序列由附录中所附的序列表中的SEQ ID NOs.1-4代表。

根据所述用途的有利条件，所述的按照+1或+2阅读框编码C蛋白的cDNA选自序列SEQ ID NOs.5至14。

根据本发明，所述的膜蛋白(prM或M)和/或包膜蛋白(E、E1、E2)用如上所述的重组慢病毒载体表达，或者以膜形式定位于细胞表面的质膜内，或者以分泌形式，即从细胞输出至细胞外培养基中。

此外，当黄病毒prM和E蛋白同时在转导了重组载体(体外或体内)的细胞中表达时，它们组装成病毒假颗粒(或病毒样颗粒，VLP)分泌到胞外培养基中。这样的颗粒特别具有免疫原性并诱导产生中和抗体。

编码所述膜形式的cDNA包含编码成熟蛋白质的序列，前面是编码在内质网中转位的信号肽的序列，该序列包括在其5’末端的翻译起始密码子(ATG)。对于黄病毒属，所述的信号序列优选来自M蛋白前体(prM)。编码所述分泌形式的cDNA包含编码截短的成熟蛋白质的序列，其中的膜锚定区已被删除并且前面是如上所述的信号肽。

例如，对于西尼罗病毒：

-成熟E蛋白对应多蛋白质序列第291至791位，参考Genbank序列AAL87234；相应的核苷酸序列位于西尼罗病毒基因组序列的第967至2469位，参考Genbank序列AF481864；

-膜锚定区已从中被删除的截短的成熟E蛋白特别对应西尼罗病毒多蛋白序列的第291至732位，参考Genbank序列AAL87234；相应的核苷酸序列位于西尼罗病毒基因组的第967至2292位，参考Genbank序列AF481864；

-来源于M蛋白前体的内部信号肽对应多蛋白质序列的第275至290位，参考Genbank序列AAL87234；相应的核苷酸序列位于西尼罗病毒基因组序列的第919至966位，参考Genbank序列AF481864。

因此，编码西尼罗病毒的膜形式E蛋白、分泌形式E蛋白以及prM和E蛋白的cDNA分别对应如上定义的所述病毒基因组序列中的第919至2469、919至2292和399至2469位。

本发明还有一个主题是包含编码黄病毒科的至少一种结构蛋白或所述蛋白质至少8个氨基酸长的免疫原性肽的多核苷酸的重组慢病毒载体；此外，正如上文中所指出的在利用这样的载体时，所述的载体优选还包含编码一种或多种非结构蛋白质和/或所述蛋白质的一种或多种免疫原性片段的cDNA。所述的多核苷酸片段特别选自如上所指出的序列中。优选的，所述的重组慢病毒载体是三重型载体。此外，所述的重组慢病毒载体优选能包含其中启动子和激活子已从U3区被删除的3’LTR。优选它是具有另一病毒的至少一种包膜蛋白的假型，优选水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白G。

根据所述载体的优选实施方案，它包含编码西尼罗病毒或登革热病毒的至少一种E蛋白、和任选地prM或M蛋白、和/或C蛋白、和/或非结构蛋白的cDNA，或者编码以上蛋白质的至少8个氨基酸长的一种或多种免疫原性肽的cDNA。

根据所述载体的另一优选实施方案，它包含编码丙型肝炎病毒的E1或E2蛋白或E1/E2异二聚体、和/或根据0、+1或+2阅读框的C蛋白、以及任选地NS3蛋白的cDNA，或者编码以上蛋白质至少8个氨基酸长的一种或多种免疫原性肽的cDNA。

根据所述载体的有利条件，所述的根据+1或+2阅读框编码C蛋白的cDNA选自SEQ ID NOs.5至14的序列。

根据所述载体的另一优选实施方案，它包含编码登革热病毒E蛋白的结构域III(第295至394位)或数种不同结构域III的cDNA，分别对应四种类型登革热病毒(1至4型或DEN-1至DEN-4)之一，优选它包含编码四种结构域III(DEN-1至DEN-4)的cDNA，其序列由附录序列表中的SEQ ID NOs.1-4代表。

根据所述载体的另一优选实施方案，它是被称为pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)的载体质粒，包含编码西尼罗病毒IS-98-ST1株分泌形式E蛋白的cDNA，该载体包含在微生物中，该微生物于2003年8月27日保藏于国家微生物培养物保藏中心(theCollection Nationale de Cultures de Microorganismes[National Collection ofCultures of Microorganisms]，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15)，保藏号为I-3076。

本发明包含如上所述的载体质粒以及来源于以上载体颗粒的载体颗粒，尤其是具有另一种病毒的至少一种包膜蛋白的假型载体颗粒，诸如特别是水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白G。

可用常规方法并根据标准方案制备上述重组慢病毒载体，这些方法本身是已知的，所述标准方案例如描述于Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL，2000，Wiley and son Inc.，Library of Congress，USA)。

更确切的说，可用特异于黄病毒科基因组的引物通过PCR或RT-PCR扩增由黄病毒科基因组RNA或mRNA或者来源于它们的cDNA或DNA片段组成的基质，或者通过用限制性酶消化黄病毒科cDNA，或者通过完全或部分的化学合成获得所述的多核苷酸片段。

将由此获得的多核苷酸片段克隆入含慢病毒载体基因组的载体质粒中，以便产生重组载体质粒。

用如上定义的重组载体质粒、反式提供病毒颗粒的结构蛋白和酶的衣壳包装质粒、以及任选地用于表达诸如VSV等病毒的包膜糖蛋白以便产生假型颗粒的质粒共转染细胞，来产生重组慢病毒载体的颗粒(载体颗粒)。

本发明的另一主题是免疫原性组合物，其特征在于它包含至少一种如上所述的重组载体。

根据所述组合物的优选实施方案，它包含药用可接受的赋形剂以及任选的载体物质(carrier substance)。

所述的药用可接受赋形剂和载体物质是常规所用的此类物质。

载体物质优选自单层脂质体、多层脂质体、皂角苷胶团或含糖或含金的固态微球。

根据所述组合物的另一优选实施方案，它包含所述重组慢病毒载体的颗粒(载体颗粒)，优选具有另一病毒包膜蛋白的假型，优选具有水泡性口炎病毒糖蛋白G。

根据所述组合物的另一优选实施方案，它包含如上所述三重型重组慢病毒载体。

根据所述组合物的有利条件，它包含对应所述三重型重组慢病毒载体重组基因组的分离核酸分子，该核酸分子包含：(i)用于衣壳包装、逆转录和整合的调控序列以及用于中央起始(或聚嘌呤束cPPT)和终止(CTS)慢病毒起点的顺式作用序列，和任选地Rev蛋白的调控序列(RRE或Rev响应元件)以及(ii)编码黄病毒科蛋白或如上定义所述蛋白质的至少8个氨基酸长的免疫原性肽的多核苷酸。

根据本发明，所述三重型载体包含表达盒，其中包括合适的转录调控元件(启动子、增强子、Kozak共有序列、多聚腺苷酸化信号，等等)，如上定义的编码序列被插入在其控制下，且所述感兴趣编码序列任选地包含细胞运输所需要的信号。

根据本发明的免疫原性或疫苗组合物可一般性施用(口服、肌肉内、皮下、腹膜内或静脉内)、局部施用(鼻施用，其它粘膜途径)或经这些途径的组合施用于如上定义的敏感物种(人或非人哺乳动物宿主，或贮主(鸟、爬行动物))。

为了靶向诸如树突细胞等的抗原呈递细胞，以便延长抗原在这些细胞中的表达，优选地皮下施用这些组合物。

作为替代，利用根据本发明的免疫原性或疫苗组合物修饰宿主物种的自体细胞，尤其是诸如树突细胞等的抗原呈递细胞。然后将修饰过的细胞再次施加于宿主；这种用途尤其有利于治疗人或非人宿主哺乳动物内的黄病毒科感染。

载体的剂量根据施用途径不同而变化，也根据待治疗物种(人或动物)及其重量而变化。

本发明的另一主题是用如上定义重组载体修饰的细胞。优选地，所述细胞是用所述重组载体稳定修饰的真核细胞；这样的稳定表达黄病毒科的至少一种蛋白质或一种抗原性肽的细胞可用于：

-生产所述重组慢病毒载体的颗粒(载体颗粒)，

-生产黄病毒科重组病毒蛋白质、所述蛋白质的免疫原性片段、以及黄病毒科病毒类型的病毒假颗粒(VLP或病毒样颗粒)，其来源于黄病毒科的包膜蛋白和/或膜蛋白，尤其是来自黄病毒prM和E蛋白；假颗粒优选通过免疫捕获受感染个体生物液中存在的特异性免疫球蛋白而用作诊断黄病毒科感染的试剂，

-筛选抗病毒化合物，以及

-用作诊断试剂。

根据本发明，根据以下步骤有可能产生黄病毒科的病毒蛋白质和/或所述蛋白质的免疫原性片段或者病毒假颗粒：

a)培养如上定义的已修饰细胞，培养条件允许表达由所述重组慢病毒载体编码的黄病毒科的一种或多种病毒蛋白质和/或所述蛋白质的一种或多种免疫原性片段，和

b)用任何合适方法从a)的培养上清或所述细胞中分离所述的蛋白质、蛋白质片段或假颗粒。

根据此方法，可通过常规技术从被如上定义重组载体修饰的细胞的培养上清或裂解物中纯化病毒蛋白质或片段，所用的常规技术诸如：

.亲和层析：然后将标签如编码多组氨酸尾的核苷酸序列引入载体中，并用镍凝胶(琼脂糖等)柱纯化所述蛋白质；

.免疫亲和层析：感兴趣病毒序列在C末端或N末端与编码肽表位的核苷酸序列融合，所述序列还包含适于用诸如凝血酶等酶切割的位点，以便随后将表位序列从蛋白质中分离；有用的表位是，例如，C9表位(TETSQVAPA)(Mirzabekov T.等，J.Biol.Chem.，1999，274，28745-28750)或myc表位。将表达的蛋白质用已连接特异于所述表位的抗体(1D14针对C9表位或9^E10针对myc表位)的亲和柱纯化并通过用凝血酶切割分离感兴趣蛋白质；

.用诸如聚乙二醇等沉淀剂沉淀，然后离心回收沉淀中的蛋白质。

根据此方法，通过常规技术从用如上定义重组载体修饰的细胞的培养上清中纯化黄病毒科病毒类型的颗粒，所用的常规技术诸如：

.用诸如聚乙二醇等沉淀剂沉淀，然后离心回收沉淀中的假颗粒，和

.连续或不连续梯度离心，尤其是用蔗糖梯度。

本发明的另一主题是筛选抗病毒化合物的方法，其特征在于，它包括：

-将用上述重组载体修饰，尤其是用包含编码诸如NS3(解螺旋酶或蛋白酶)或NS5(聚合酶)等黄病毒科非结构蛋白的cDNA的载体修饰的真核细胞与待测试库中的各种化合物接触，和

-在存在或缺乏所述化合物的条件下用任何合适的方法测量所述蛋白质的活性(解螺旋酶、蛋白酶、聚合酶)，和

-选择能调节(激活或抑制)所述活性的化合物。

用本领域技术人员已知的常规方法评估此活性，例如尤其是以下文献中所述的方法：Borowski等，Acta Biochimica Polonica，2002，49，597-614；Steffens等，J.Gen.Virol.，1999，80，2583-2590；Ryan等，J.Gen.Virol.，1998，79，947-959；Bretner等，Antivir.Chem.Chemother.，2004，15，35-42。

优选的，对特异性靶组织，尤其是树突细胞、神经元细胞或肝细胞进行筛选。

本发明的另一主题是用来自敏感物种个体的生物液样品诊断黄病毒科感染的方法，其特征在于至少包括以下步骤：

a)使所述的生物样品与表达至少一种以上定义黄病毒科抗原(C、E、E1、E2、prM、M、NS(尤其是NS1))的已修饰真核细胞接触，任选已透化的，

b)用任何合适的方法显示(a)中所形成的抗原-抗体复合物，例如用EIA、ELISA或RIA或者通过免疫荧光。

本发明的另一主题是适于用来自敏感物种个体的生物学液体样品诊断黄病毒科感染的方法，其特征在于至少包含以下步骤：

a)使所述的生物学样品接触用如上所述表达至少一种膜蛋白和/或包膜蛋白的慢病毒载体修饰的细胞培养物上清产生的病毒假颗粒，并

b)用任何合适的方法使(a)中所形成的抗原-抗体复合物显色，例如用EIA、ELISA或RIA或者通过免疫荧光。

本发明的另一主题是用于实施如上定义方法的试剂盒，其特征在于它至少包含如上定义的已修饰细胞。

本发明的另一主题是抗黄病毒科的免疫方法，其特征在于，它包括单次施加如上定义的重组载体，优选皮下注射。

附图说明

除了提供以上之外，本发明还包含提供其它，这将从以下有关制备根据本发明的重组载体的实施例和利用所述载体进行免疫接种的用途的实施例和衍生的修饰细胞用于生产蛋白质的用途的实施例以及有关附图中出现，其中：

-图1是对应序列SEQ ID NO.15的载体质粒pTRHΔU3CMV-sE(WNV)的示意图，其中含有编码西尼罗病毒的截短E蛋白(E1-411)(SEQ ID NO.17)的cDNA(SEQ ID NO.16)。

-图2描述用ELISA或中和测试分析用单次腹膜内注射1μg TRIPΔU3CMV-sE(WNV)载体颗粒免疫的小鼠的血清。

-图3代表感染西尼罗病毒的VERO细胞的裂解物的免疫沉淀，用来自用1μgTRIPΔU3CMV-sE(WNV)载体颗粒免疫小鼠的血清与对照血清相比较。

泳道1至10：感染了西尼罗病毒的VERO细胞的裂解物与以下血清沉淀：

-泳道1：用TRIPΔU3CMV-GFP载体免疫后14天的血清，

-泳道2：用TRIPΔU3CMV-GFP载体免疫后23天的血清，

-泳道3：多克隆抗西尼罗病毒(IS-98-ST1株)腹水，

-泳道4：非免疫血清，

-泳道5：用TRIPΔU3CMV-sE(WNV)载体免疫后14天的血清，

-泳道6：用TRIPΔU3CMV-sE(WNV)载体免疫后23天的血清，

-泳道7：来自用TRIPΔU3CMV-sE(WNV)载体免疫14天的小鼠的攻击后22天(10LD₅₀的IS-98-ST1株)的血清，

-泳道8：来自用TRIPΔU3CMV-sE(WNV)载体免疫14天的小鼠的攻击后30天(10LD₅₀的IS-98-ST1株)的血清，

-泳道9：来自用TRIPΔU3CMV-sE(WNV)载体免疫30天的小鼠的攻击后22天(100LD₅₀的IS-98-ST1株)的血清，

-泳道10：用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒免疫的小鼠的血清。

泳道11和12：未感染的VERO细胞的裂解物用以下血清沉淀：

-泳道11：多克隆抗西尼罗病毒(IS-98-ST1株)腹水，

-泳道12：来自用TRIPΔU3CMV-sE(WNV)载体免疫30天的小鼠的攻击后22天(IS-98-ST1株的100LD₅₀)的血清。

-图4代表腹膜内免疫小鼠并随后经相同途径攻击的小鼠的存活曲线，或者在免疫2周后用10LD₅₀的IS-98-ST1株攻击(A)，或者在免疫4周后用100LD₅₀的IS-98-ST1株攻击(B)。●：用DPBS接种的对照小鼠。▲：用1μg TRIPΔU3CMV-EGFP载体颗粒免疫的对照小鼠。■：用1μg TRIPΔU3CMV-sE(WNV)载体颗粒免疫的小鼠。

-图5表示从用表达西尼罗病毒prM和E蛋白的重组慢病毒载体转导的真核细胞上清中纯化病毒假颗粒。

-图6表示在接种TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)的129只小鼠血清中检测抗WNV-sE抗体。将来自WNV感染的Vero细胞的放射性标记裂解物用来自慢病毒载体接种的129只小鼠的合并免疫血清进行免疫沉淀。(A)WNV攻击前血清。(B)攻击后血清。HMAF＝超免疫小鼠腹水液。对照血清＝未免疫血清。MV抗血清＝麻疹病毒的抗血清。TRIP/WNsE＝TRIPΔU3.CMVsE(WNV)。TRIP/GFP＝TRIPΔU3.CMV-GFP。

-图7表示用流式细胞仪分析热处理对重组慢病毒载体转导效率的影响。将293T细胞与已在70℃热灭活10分钟(加热的TRIP/GFP)或未灭活(TRIP/GFP)的TRIPΔU3.CMV-GFP载体颗粒一起保温。未感染的293T细胞(伪)用作对照。在48小时的时候，测量GFP荧光强度；指出GFP阳性细胞的百分率。

具体实施方式

实施例1：TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)重组载体的制备

1)pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体质粒的构建

用聚合酶链式反应(PCR)扩增代表西尼罗病毒IS-98-ST1株基因组第967至2292位核苷酸序列(专利申请FR 01 04599和Genbank登记号AF481864的序列)并且对应多蛋白第291至732位氨基酸(申请FR 01 04599和Genbank登记号AAL87234)的cDNA，所用的正义引物为：

5’-TATCGTACGATGAGAGTTGTGTTTGTCGTGCTA-3’(SEQ ID NO.18)，含有下划线标示的BsiW I位点；反义引物为：

5’-ATAGCGCGCTTAGACAGCCCTTCCCAACTGA-3’(SEQ ID NO.19)，含有下划线标示的BssH II位点。此cDNA对应附录序列表中的序列SEQ ID NO.16，边界是5’位置的BsiW I位点和3’位置的BssH II位点。SEQ ID NO.16的序列从5’至3’依次包含：ATG，编码来源于M蛋白前体的信号肽的序列(prM 151-166)和编码截短的E蛋白的序列(E 1-441)，膜锚定区已从中被删除。它编码分泌到胞外介质中的E蛋白(sE蛋白)；来源于prM蛋白的信号肽用于E蛋白在内质网中的转位以及在分泌泡中运输到质膜上，在那里它们被释放入胞外介质中。

消化慢病毒载体质粒pTRIPΔU3.CMV-EGFP(专利申请WO 01/27302)以切除EGFP基因，然后将线性化质粒与含BsiW I和BssH II位点的连接子连接，从而得到被称为pTRIPΔU3.CMV-BsiW I-BssH II的质粒。将以上获得cDNA的1.4kb长的BsiWI-BssH II片段，包括sE蛋白构建体在内，克隆入质粒

pTRIPΔU3.CMV-BsiW I-BssH II的相同位点中，得到被称为pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)或pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)的重组慢病毒载体质粒(图1和SEQ ID NO.15)。用pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体质粒转化的大肠杆菌细菌的培养物于2003年8月27日以编号I-3076保藏于国家微生物培养物保藏中心(the CollectionNationale de Cultures de Microorganismes[National Collection of Cultures ofMicroorganisms]，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15)。

通过限制性酶切以及测序对应sE蛋白构建体的插入片段证实

pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)重组载体质粒的正确性。

1.4kb长的BsiW I-BssH II插入片段对应附录序列表中的核苷酸序列SEQ IDNO.16；它编码被称为sE的分泌E蛋白，对应附录中序列表内的氨基酸序列SEQ IDNO.17。

2)具有水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)假型的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体的病毒颗粒的制备

在添加10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s改进Eagle培养基(DMEM)Glutamax(GIBCO)中培养人成纤维细胞293T(ATCC)。具有水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)假型的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体的病毒颗粒也被称为TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒，是通过磷酸钙共转染293T细胞系产生的，用于共转染的质粒是以上定义的pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体质粒、反式提供病毒颗粒结构蛋白和酶的衣壳包装质粒(pCMVΔR8.2：Naldini等，Science，1996，272，263-267；pCMVΔR8.91或p8.7：Zufferey等，Nat.Biotechnol.，1997，15，871-877)和用于表达VSV病毒包膜糖蛋白的质粒(pHCMV-G：Yee等，P.N.A.S.，1994，91，9564-9568)，如描述于Zennou等，Cell.，2000，101，173-185。

3)用重组TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体表达分泌形式的WNVE糖蛋白(WNV-sE)

通过间接免疫荧光检测慢病毒载体转导的293T细胞中WNV-sE的表达。简而言之，用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体转导培养于8室Glass-Labteks(NUNC)上的人293T细胞。48小时后，用PBS配制的3％多聚甲醛(PFA)固定20分钟并用配制于PBS中的0.1％ Triton X-100透化4分钟。将细胞与1∶100稀释于PBS中的抗WNV HMAF一起保温1小时。用溶于PBS的0.2％BSA封闭后，将细胞进一步与1∶500稀释于PBS 0.2％BSA中的Cy3-偶联的抗小鼠IgG抗体(AMERSHAMPHARMACIA)一起保温。用DAPI显现细胞核。用具ApoTome系统的Zeiss Axioplan显微镜观察玻片。

转导后48小时，高比率的细胞被免疫染色。免疫染色模式表明WNV-sE通过分泌途径迁移。

4)重组TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体的滴定

4.1)材料和方法

a)通过ELISA进行p24抗原滴定

用商业HIV-1 p24 ELISA试剂盒(PERKIN ELMER LIFESCIENCES)进行浓缩载体颗粒的p24抗原含量的定量。

b)定量PCR

引物和探针由PROLIGO合成。为了检测慢病毒载体中U5-R序列，使用如下的引物和探针(Brussel A和Sonigo P，J.Virol.，2003，77，10119-10124)(SEQ ID NO：20 to 27)：

-探针(3’荧光素(PITC)或被磷酸化(P))

LTR-FL：5’-CACAACAGACGGGCACACACTACTTGA-FITC-3’

LTR-LC：5’-RED640-CACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGC-P-3’

-引物

AA55M：5’-GCTAGAGATTTTCCACACTGACTAA-3’

M667：5’-GGCTAACTAGGGAACCCACTG-3’.

为检测CD3，所用的引物和探针序列如下：

-探针

CD3-P1：5’-GGCTGAAGGTTAGGGATACCAATATTCCTGTCTC-FITC-3’，

CD3-P2：5’RED705-CTAGTGATGGGCTCTTCCCTTGAGCCCTTC-P-3’

-引物

CD3-in-F：5’-GGCTATCATTCTTCTTCAAGGTA-3’

CD3-in-R：5’-CCTCTCTTCAGCCATTTAAGTA-3’.

在转导后48小时用

DNA Blood Mini试剂盒(QIAGEN)从大约3x10⁶个慢病毒载体转导的293T细胞中分离基因组DNA。为了进行实时PCR分析，将5μLDNA与15μL PCR预混液混合，其由1X Jumpstart^TM Taq ReadyMix^TM(SIGMA)、1.9mM MgCl₂、1.5μM正向和反向引物(AA55M/M667或CD3-in-F/CD3-in-R)、200nM探针(LTR-FL/LTR-LC或CD3-P1/CD3-P2)和1.5单位的Taq DNA聚合酶(Invitrogen)组成。用95℃3分钟一个循环，然后40个循环的95℃5秒、55℃15秒和72℃10秒进行扩增。考虑到载体贮液的可能质粒污染，总是平行检测用热灭活(70℃10分钟)载体转导的293T细胞的DNA。用来自未转导细胞的5μL基因组DNA作为阴性对照。各DNA样品均为双份检测，然后报告平均值。10倍系列稀释的已知浓度质粒pTripCD3，其含相关序列U5-R和CD3，与DNA样品一起平行扩增生成标准曲线。

通过对293T细胞数标准化U5-R拷贝数来计算每个细胞的总载体拷贝数，正如用相同基因组DNA样品上CD3分子的拷贝数进行定量，然后扣除获自用热灭活载体转导的细胞的拷贝数。

4.2)结果

首先用抗p24 HIV-1衣壳蛋白的商品化ELISA检测评估此实验所用载体贮液中物理颗粒的数目。测定浓度是每微升58 ng p24。

用定量PCR实验、基于载体DNA向靶细胞转移计算载体贮液的实际滴度。对载体特异性序列(U5)和细胞基因座(CD3)二者的定量给出了每个细胞的平均DNA载体拷贝数。这使得在用限定浓度的载体颗粒转导后可以计算载体制备物的滴度。在本研究中所用TRIPΔU3.CMV-sE载体贮液在人293T细胞中被滴定为每毫升5.2x10⁷个转导单位(TU)。换言之，1ng来自此TRIPΔU3.CMV-sE载体制备物的p24抗原可转导900个人293T细胞。

为了简单起见，以下部分中使用的载体颗粒的量将表示为p24抗原的ng数。

实施例2：在BALB/c小鼠中TRIPΔU3.CMV-sE载体致免疫能力的分析

1)材料和方法

1.1)免疫/疫苗接种方案

用如实施例1所述制备的含1μg TRIPΔU3.CMV-sE载体颗粒的0.1mlDulbecco’s PBS(DPBS)腹膜内注射接种6周大的BALB/c小鼠(2组，每组6只小鼠；Janvier breeding colony)。对动物进行单次疫苗注射。

对照组是在相同条件下用与TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒相似方式制备的1μg TRIPΔU3.CMV-GFP载体颗粒(2组，每组3只小鼠)或者只用DPBS缓冲液(2组，每组3只小鼠)进行接种。

在注射疫苗14天(D₁₄)和23天(D23)后取小鼠血清并在测量抗体应答前将其在56℃热灭活30分钟。

1.2)西尼罗病毒株、纯化和滴定

所用的西尼罗病毒株是IS-98-ST1株，描述于专利申请FR 01 04599；它在伊蚊细胞(AP61系)上生产并根据文献Desprès等，Virol.，1993，196，209-219所述的方案纯化。更确切的说，以0.4的感染复数用西尼罗病毒IS-98-ST1株感染AP61细胞。感染三天后，用PEG 6000(7％)沉淀培养物上清中存在的病毒颗粒，然后用不连续30-60％蔗糖梯度和线性10-50％蔗糖梯度进行纯化。由此获得的病毒粒子保存于-80℃的蔗糖(30％)中。

通过病灶免疫测试(Focus ImmunoAssay，FIA)在AP61细胞上滴定西尼罗病毒，而感染性滴度表示为病灶形成单位(FFU_AP61/ml)，根据上述文献中Desprès等人所述的方案进行。

纯化后病毒制剂的感染滴度大约为10¹⁰FFU_AP61/ml。

1.3)抗-WNV的超免疫腹水

通过用WNV IS-98-ST1株重复免疫以及随后用肉瘤180接种成年小鼠获得抗WNV超免疫小鼠腹水(HMAF)。如前文所述用10³FFU的IS-98-ST1免疫成年WNV-抗性BALB/c-MBT同系小鼠获得小鼠多克隆抗WNV抗体(Mashimo等，PNAS，2002，99，11311-11316)。在初次免疫一个月后收集WNV-免疫血清。

1.4)ELISA

根据文献Mashimo等，PNAS，2002，99，11311-11316中所述方案用1.2段落中所述的蔗糖梯度纯化的WN IS-98-ST1病毒颗粒作为抗原(每个96孔微量滴定板为10⁶FFU_AP61)通过ELISA检测抗E总抗体滴度。将1∶4000稀释的偶联过氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白(H+L)(JACKSON IMMUNO RESEARCH)、1∶20,000稀释的偶联过氧化物酶的抗小鼠IgM(μ-链特异性)(SIGMA)或者1∶20,000稀释的偶联过氧化物酶的抗小鼠IgG(γ-链特异性)(Sigma)用作二级抗体。如上定义，按照对应光密度(OD)值至少是对照动物血清两倍的血清最终稀释度来测定滴度。也可用已描述的亚型特异性ELISA检测抗-E IgG和IgM抗体(Despres P等，J.Infect.Dis.，2005，191，207-214)。

1.5)免疫沉淀(RIP测试)

实验方案如Desprès等人所述(J.Virol.，1995，69，7345-7348)。更确切的说，用西尼罗病毒IS-98-ST1株以感染复数5FFU_AP61/细胞感染VERO细胞。感染后20小时，用Tran³⁵Slabel(ICN；100μCi/ml)标记所述细胞蛋白质3小时。用冷PBS洗涤3次后，将细胞在RIPA缓冲液(50mM Tris-Cl，pH 8.0，150mM NaCl，10mMEDTA，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸钠，1％Triton X-100，补充25μg/ml aprotinin)(SIGMA)中+4℃放置10分钟。然后将细胞裂解物在+4℃10,000rpm离心5分钟使其澄清。然后将裂解物与1∶100最终稀释度的待测血清在蛋白A Sepharose存在下一起保温。然后在非还原条件下用SDS-15％PAGE胶分析免疫沉淀产物并通过放射自显影法显影。

1.6)中和试验

被免疫小鼠血清对于西尼罗病毒IS-98-ST1株的中和活性通过在VERO细胞(ATCC)上病毒复制灶的减少来检测。更确切的说，将56℃灭活30分钟的血清的系列稀释液(0.1ml)与西尼罗病毒IS-98-ST1株接种物(0.1ml中有100FFU_AP61)一起保温。然后用混合物在37℃感染VERO细胞(12孔板的每个孔中有1.5×10⁵个细胞)2小时，感染两天后计算病毒复制灶。血清的中和性抗体滴度，称为TNRF90(病毒复制灶减少90％的中和试验)，是通过中和每孔中所接种100FFU病毒的至少90的血清的最终稀释度来测定的。

2)结果

2.1)有关西尼罗病毒的来自被免疫动物的血清反应性的ELISA分析

用纯化的西尼罗病毒作为抗原，通过注射TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒后14天和23天所采集血清经ELISA检测证实抗西尼罗病毒E蛋白的抗体的生产。

图2给出的结果显示，在注射疫苗后14天和23天，用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒免疫的小鼠血清的特异性抗体滴度分别是1/10000和1/20000。

2.2)用免疫沉淀分析被免疫动物血清的特异性

通过免疫沉淀证实用TRIPΔU3.CMV-sE载体免疫的动物的血清的特异性。来自用TRIPΔU3.CMV-sE载体免疫小鼠的血清与西尼罗病毒的包膜蛋白E反应；疫苗接种后第23天的反应性比第14天的反应性更强(图3)。

2.3)有关西尼罗病毒的免疫动物血清的中和活性分析

通过测量VERO细胞上病毒复制灶的减少(TNRF90)从实验上证实单次注射TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒免疫小鼠血清对于西尼罗病毒的中和活性。注射疫苗后第14天和第23天的滴度分别是10和20(图2)。

实施例3：BALB/c小鼠中TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体保护能力的分析

在WNV相关性脑炎的小鼠模型中测试用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒免疫小鼠后产生的抗E蛋白抗体的保护作用(Deubel等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，2001，951，195-206；Mashimo等，2002，前已引用；国际专利申请WO 02/081511；Ceccaldi等，FEMS Microbiol.Lett.，2004，233，1-6)。因此，通过腹膜内注射10LD₅₀(使50％的小鼠致死的剂量)或100LD₅₀的高神经侵入性和神经毒性的西尼罗病毒IS-98-ST1株攻击免疫小鼠。

更确切的说，使用了两种攻击方案：(i)第一组按实施例2中所述免疫的6只小鼠在注射疫苗15天后接受10LD₅₀的IS-98-ST1株病毒；(ii)第二组按实施例2中所述免疫的6只小鼠在注射疫苗30天后(D30)接受100LD₅₀的IS-98-ST1株病毒。攻击病毒稀释于补充0.2％牛血清白蛋白(Sigma)的DPBS(pH 7.5)中；1LD₅₀相当于10FFU_AP61/ml。

第一组小鼠的存活曲线(图4A)显示用DPBS或用TRIPΔU3.CMV-EGFP载体接种的所有对照小鼠在接种攻击剂量病毒后13天死亡。另一方面，用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体免疫的6只小鼠可以抗致死剂量并且未显示出发病。

攻击后22天，通过ELISA发现抗性小鼠具有的抗西尼罗病毒抗体效价(1.7±0.1，稀释度1∶10⁴)高于攻击前获得的值。在攻击1个月后，来自被攻击小鼠的血清与西尼罗病毒的E蛋白强烈反应(图3)，且中和抗体效价为100。

第二组小鼠的存活曲线(图4B)显示用DPBS或TRIPΔU3.CMV-EGFPs载体(DPBS)接种的对照小鼠在接种攻击剂量病毒后9天内死亡。另一方面，用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体免疫的6只小鼠可抗致死剂量并且未显示出发病。与第一组的小鼠一样，在攻击1个月后，来自攻击免疫小鼠的血清与西尼罗病毒的E蛋白强反应(图3)，且中和抗体效价为100。

此外，对于西尼罗病毒的非结构蛋白(图3)，被攻击小鼠缺乏抗体反应性，表明TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体所诱导的保护性免疫足以防止攻击病毒的感染。

结果显示，在成年小鼠中单次注射小量TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒在免疫两周后诱导产生中和抗体并且使其具有抵抗外周接种西尼罗病毒的致死攻击的保护性免疫力。

实施例4：用TRIPΔU3.CMV-prM-E(WNV)重组载体制备病毒假颗粒

1)TRIPΔU3.CMV-prM-E(WNV)载体的制备

如实施例1所述构建三重型重组HIV载体，其中含有编码西尼罗病毒IS-98-ST1株的prM和E蛋白的cDNA，这对应其基因组序列的第399至2469位(专利申请FR 01 04599和Genbank AF481864)。如实施例1所述获得用TRIPΔU3.CMV-prM-E(WNV)重组载体转导的稳定细胞系。

2)病毒假颗粒或VLP的制备

收获用TRIPΔU3.CMV-prM-E(WNV)载体转导的细胞培养上清并用PEG 6000(Fluka，7％W/V)在4℃温和搅拌沉淀4至5小时。所获得的沉淀在4℃以9000rpm离心30分钟，将含VLP的沉淀收集于4ml TNE(20mM Tris-HCl，pH 8.0；150mMNaCl；2mM EDTA)中并铺在不连续蔗糖梯度(溶于1×TNE的20％-60％蔗糖)。将所述梯度液在39000rpm离心2小时并收获20-60％界面的乳白色条带，铺在线性梯度(溶于1×TNE中的11-55％蔗糖)上并在35000rpm离心16小时。收集梯度组分(11组0.5ml组分)并随后用抗WNV免疫血清(1∶20)通过ELISA进行分析，通过SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯蓝染色进行分析，以及用抗WNV免疫血清通过Western印迹进行分析。如图5所示，ELISA的结果表明在所述梯度的组分6至10存在纯化的VLP。

实施例5：在129小鼠中分析TRIPΔU3.CMV-sE载体的致免疫能力和保护能力

1)材料和方法

1.1)免疫/疫苗接种方案

用如实施例1所述制备的不同剂量TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒经腹膜内注射接种6至8周大的129小鼠(6组，每组6只小鼠)，所述载体颗粒稀释于补充0.2％牛血清白蛋白(BSA)的0.1ml Dulbecco’s PBS(DPBS；pH 7.5)中。

对动物进行单次疫苗注射。

对照组是在同样条件下用以与TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒相似方式制备的500ng p24抗原当量的TRIPΔU3.CMV-GFP载体颗粒(1组6只小鼠)或者只用DPBS缓冲液(1组6只小鼠)进行接种。

在免疫后6、13、20或27天(D₆，D₁₃，D₂₀，D₂₇)从小鼠眼窝周围放血并如实施例2所述在测量抗WNV总抗体，IgG和IgM，以及体外中和活性之前将合并血清在56℃热灭活30分钟。

通过腹膜内注射接种如实施例2所述制备的神经毒性WNV株IS-98-ST1进行WNV攻击。随后在免疫后第7天或第14天腹膜内注射1000LD₅₀(腹膜内注射LD₅₀＝10FFU)的WNV株IS-98-ST1对动物进行攻击。在长达21天的时间内每日监测被攻击小鼠的发病或死亡迹象。

1.2)流式细胞仪测试

用已在70℃热灭活10分钟或未处理(阳性对照)的TRIPΔU3.CMV-GFP载体颗粒转导培养于25cm2瓶的293T细胞。48小时后，将细胞分离、洗涤并用2％PFA固定。用FACSscan检测GFP荧光强度并用CellQuest软件进行分析。

2)结果

为了考虑个体间免疫应答的变异性，选择比BALB/c纯系性更低的129小鼠用于评估由表达WNV-sE的慢病毒载体诱导的体液免疫反应。

2.1)腹膜内注射TRIPΔU3.CMV-sE载体颗粒后的强抗体应答

在用相当于500ng p24抗原的单剂量TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒免疫的129成年小鼠中，早在免疫后6天时就可检测到抗WNV的总抗体，尽管存在的浓度较低。相比较而言，在TRIPΔU3.CMV-GFP免疫小鼠的血清中则未检测到抗WNV抗体。正如在此时间点所预期的，体液应答对应于IgM而非IgG抗体。总抗体应答在第13天增加10倍达到平台期，然后随时间维持。在这些稍后的时间点(第13、20、27天)，IgM抗体消失，被IgG所取代(表2)。

表2.小鼠对TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)疫苗接种的抗体应答

免疫载体<sup>a</sup>，放血日	WNV抗体效价<sup>b</sup>	WNV IgM抗体效价<sup>b</sup>	WNV IgG抗体效价<sup>b</sup>	Anti-WNVFRNT90<sup>c</sup>
免疫载体<sup>a</sup>，放血日	WNV抗体效价<sup>b</sup>	WNV IgM抗体效价<sup>b</sup>	WNV IgG抗体效价<sup>b</sup>	Anti-WNVFRNT90<sup>c</sup>	TRIPΔU3.CMV-GFP第27天	＜100	＜100	＜100	＜10
TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)第6天第13天第20天第27天	3000300003000030000	300＜100＜100＜100	＜100100010001000	10101020	TRIPΔU3.CMV-GFP第27天	＜100	＜100	＜100	＜10

a.用相当于500ng p24抗原量的慢病毒载体颗粒腹膜内接种成年129小鼠组

b.用ELISA对合并的热灭活血清进行测定

c.FRNT：感染灶减少中和试验：将WNV的FFU数减少至少90％的最高血清稀释度。

RIP测试证明这些抗体与来自感染IS-98-ST1的Vero细胞裂解物的WNV E-糖蛋白有反应性(图6A)。感染灶减少中和试验(FRNT)显示来自TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)免疫小鼠的血清早在免疫后6天时就含有可检测水平的WNV中和抗体(表2)。这些数据合起来表明在用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒免疫的小鼠中发生了早期的和特异性抗WNV抗体免疫应答。

2.2)TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)疫苗接种赋予小鼠抗高剂量WNV攻击的早期保护作用

用相当于500ng p24抗原的单次剂量TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒免疫的小鼠早在免疫后7天时就能完全保护小鼠对抗高病毒剂量攻击，因为在该组中未观察到发病或死亡(表3)。

表3：TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)抗WNV感染的快速保护作用

免疫载体<sup>a</sup>，攻击日	保护作用<sup>b</sup>(存活数/被感染数)	攻击后WNV抗体效价<sup>c</sup>
免疫载体<sup>a</sup>，攻击日	保护作用<sup>b</sup>(存活数/被感染数)	攻击后WNV抗体效价<sup>c</sup>	DPBS第7天第14天	0/20/2	NDND
TRIPΔU3.CMV-GFP第7天第14天	0/20/2	NDND	DPBS第7天第14天	0/20/2	NDND
TRIPΔU3.CMV-GFP第7天第14天	0/20/2	NDND	TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)第7天第14天	6/66/6	200000300000

a.用相当于500ng p24抗原的单次剂量慢病毒载体颗粒或用DPBS腹膜内接种成年129小鼠组。

b.在攻击日，用1,000个腹膜内LD50的WNV株IS-98-ST1腹膜内接种小鼠。记录21天中的存活。

c.用ELISA对合并的热灭活血清进行测定。

ND：未检测。

选择的病毒攻击中所用感染性病毒剂量相当于蚊子叮咬所能传播的最大病毒接种量。据估计此剂量相当于10,000个体外FFU(Despres等，J.Infect.Dis.，2005，191，207-214；Mashimo等，2002，前已引用)，它自身相当于经腹膜内途径的1000个体内LD₅₀。

用对照载体TRIPΔU3.CMV-GFP或用DPBS免疫的所有小鼠在攻击后11天内全部死亡(表3)。有趣的是，抗WNV总抗体在攻击后提高了10倍，表明TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)免疫小鼠中发生了有效的二次应答(表3)。在BALB/c小鼠中也获得了相同的结果。这些结果表明TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)疫苗接种使小鼠具有抗高WNV攻击的非常迅速且完全的保护性免疫应答。这在疾病爆发急需保护敏感物种的情况下可具有重要的价值。

2.3)慢病毒载体疫苗所赋予的免疫是杀灭性的。

为了确定在已接种疫苗的动物内在攻击时是否会发生WNV初次感染，换言之，所产生的免疫应答是否赋予个体杀灭性(sterilizing)保护性免疫，对在WNV攻击之前和之后21天收集的免疫小鼠的合并血清进行RIP测试。在用相当于500ng p24抗原的单次剂量TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒免疫后第13、20和27天获得的血清能与WNV的E蛋白反应。不过，在免疫后第6天获得的血清则不与此蛋白反应(图6A)。由于RIP测试不能检测IgM，这与ELISA的结果是一致的，后者显示在免疫后第6天只有抗WNV的IgM而无IgG存在。来自TRIPΔU3.CMV-GFP免疫小鼠的血清则不与WNV E蛋白反应。

有趣的是，在来自TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)免疫小鼠的攻击后血清中未检测到除WNV E之外抗其它任何病毒蛋白质的抗体(图6B)。这种抗WNV非结构蛋白抗体的缺失强烈表明在所有的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)接种小鼠中未发生病毒复制。因此，TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)接种赋予小鼠完全杀灭性免疫力。

如果该疫苗用于鸟类免疫，这一点就可能具有重要的优势。实际上，尽管马、人和其它哺乳动物被认为是WNV感染的死端宿主，但已知鸟类是扩增宿主并且参与流行病的维持(Dauphin等，Comp.Immunol.Microbiol.Infect.Dis.，2004，27，343-355)。

2.4)单次免疫TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)所提供的保护作用是长期持续的。

为了确定用基于TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)慢病毒载体的疫苗单次免疫是否具有引起抗WNV的长期保护性免疫的潜能，在注射TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)疫苗3个月后，通过ELISA和FRNT检测来自129免疫小鼠的合并血清。

用相当于500ng p24抗原的单次剂量TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒免疫小鼠的抗体水平在注射3个月后仍然相当高(1∶30,000)并且中和抗体是持久的(表4)。

表4：通过TRIP/s_EWNV获得的抗WNV感染的长期保护作用

免疫载体<sup>a</sup>	WNV抗体效价<sup>b</sup>(攻击前)	抗WNVFRNT90<sup>c</sup>(攻击前)	保护作用<sup>d</sup>存活数/被感染数	WNV抗体效价<sup>b</sup>(攻击后)	抗WNVFRNT90<sup>c</sup>(攻击后)
免疫载体<sup>a</sup>	WNV抗体效价<sup>b</sup>(攻击前)	抗WNVFRNT90<sup>c</sup>(攻击前)	保护作用<sup>d</sup>存活数/被感染数	WNV抗体效价<sup>b</sup>(攻击后)	抗WNVFRNT90<sup>c</sup>(攻击后)	TRIPΔU3.CMV-GFP	＜100	＜10	0/3	ND	ND
TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)	30000	20	13/13	500000	400	TRIPΔU3.CMV-GFP	＜100	＜10	0/3	ND	ND

a)相当于500ng p24抗原的ng

b)用ELISA对合并的热灭活血清进行测定

c)FRNT：感染灶减少中和试验：使WNV的FFU数减少至少90％的最高血清稀释度。

d)免疫后3个月，用1000LD₅₀的WNV株IS-98-ST1腹膜内接种小鼠。记录21天中的生存。

在用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)免疫并随后腹膜内注射1000 LD₅₀剂量IS-98-ST1 WNV进行攻击的小鼠内即未观察到发病也未观察到死亡，而所有的对照小鼠都死亡(表4)。攻击后总抗体效价以及中和抗体都有所增加，表明用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)免疫的小鼠早在三个月前已建立了有效的二次应答(表4)。这表明用编码WNV-sE的慢病毒载体进行单次免疫足以在小鼠内提供长期持续的保护性免疫。

2.5)单次小剂量的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)足以提供完全和快速的保护。

为了计算获得完全的保护性免疫所需的载体最小剂量，用逐渐降低剂量的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)腹膜内注射免疫几组129小鼠，用500ng剂量的TRIPΔU3.CMV-GFP载体颗粒免疫小鼠作为对照。7天后，用1000LD₅₀ IS-98-ST1攻击所有小鼠。正如所预期的，接受对照载体的所有小鼠在攻击的11-13天内死亡。结果表明完全保护小鼠所需的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)最小剂量是相当于50ngp24抗原的载体颗粒量(表5)。

表5：TRIP/sE_WNV对抗WNV感染的剂量依赖性保护

免疫载体<sup>a</sup>，剂量(p24的ng)	保护<sup>b</sup>存活数/受感染数	攻击后WNV抗体效价<sup>c</sup>
免疫载体<sup>a</sup>，剂量(p24的ng)	保护<sup>b</sup>存活数/受感染数	攻击后WNV抗体效价<sup>c</sup>	TRIPΔU3.CMV-GFP500	0/6	ND
热灭活的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)<sup>d</sup>50	0/6	ND	TRIPΔU3.CMV-GFP500	0/6	ND
热灭活的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)<sup>d</sup>50	0/6	ND	TRIPΔU3.CMV-sE (WNV)500150501551,5	6/66/612/125/62/511/12	200000300000300000300000200000ND

a)用单次剂量的慢病毒载体颗粒接种成年129小鼠组。

b)初次免疫后一周用1,000个腹膜内LD50的WNV株IS-98-ST1腹膜内接种小鼠。记录21天中存活。

c)通过ELISA对合并的热灭活血清进行测定。

d)慢病毒载体颗粒在70℃热灭活10分钟。

较低剂量只提供部分保护，由此可计算50％的保护剂量是相当于6.2ng p24抗原的载体颗粒。应注意的是，这些剂量保护实验是在最严谨的攻击条件下进行的，在接种后第7天早期攻击并且是高病毒攻击接种量(1000LD₅₀)。由于在第7天和第15天之间总抗体浓度增加了10倍，所以如果在仅一周后计算，50％保护剂量就可能甚至低于6.2ng。来自接受了相当于50ng p24的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒的小鼠的免疫血清没有可检测到的抗WNV抗体。假定这样低的TRIPΔU3.CMV-sE剂量可以在初次免疫一周后使小鼠完全被保护，那么可以预期基于慢病毒载体的疫苗必须产生启动抗WNV的先天免疫的信号。

此外，重要的是要注意完全保护性免疫所需的剂量可能由于所用的模型而被低估了。实际上，资料已显示与包括人细胞在内的其它哺乳动物细胞相比，小鼠细胞对于慢病毒载体转导具有较低的允许度(Giannini等，Hepatology，2003，38，114-122；Nguyen等，Mol.Ther.，2002，6，199-209).鸟类细胞显示出比小鼠细胞更好的转导允许度，使得我们可以预计在家禽内微小的慢病毒载体疫苗剂量就有效。

为了确定获得的保护性是特别由于实际的载体介导的WNV-sE抗原表达造成的而非由于残余WNV-sE蛋白或污染载体贮液的载体质粒DNA造成的，因此，用热灭活的(70℃10分钟)TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)载体颗粒免疫小鼠，热灭活是终止转导的一种处理方法(图7)。用WNV攻击后，所有注射了热灭活TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)的小鼠死亡(表5)。因此不可能是游离的裸DNA在保护中起作用。

此外，凭借用于使载体颗粒假型化的VSV-G衣壳普遍存在的向性，慢病毒载体疫苗理论上可以不经修饰用于任何有感染危险的脊椎动物物种，包括人和动物，如马、家禽和动物园哺乳动物。

这些结果证明，微小剂量的载体颗粒足以在小鼠内获得快速和完全的保护性免疫。这使得该候选疫苗大大节省成本，并且可以在家禽养殖场或马场中建立大规模接种疫苗的方案。

序列表

<110>巴斯德研究所

国家科学研究中心

菲利普·德普雷斯

皮埃尔·沙尔诺

弗雷德里克·坦吉

马里-帕斯卡莱·弗伦凯尔

<120>用于表达黄病毒科蛋白的重组慢病毒载体及其作为疫苗的应用

<130>226PCT112

<160>27

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>100

<212>PRT

<213>黄病毒属(Flavivirus sp.)

<400>1

Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys

1 5 10 15

Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr

20 25 30

Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu

35 40 45

Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val

50 55 60

Thr Asp Lys Glu Lys Pro Ile Asn Ile Glu Thr Glu Pro Pro Phe Gly

65 70 75 80

Glu Ser Tyr Ile Ile Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser

85 90 95

Trp Phe Lys Arg

100

<210>2

<211>100

<212>PRT

<213>黄病毒属(Flavivirus sp.)

<400>2

Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys

1 5 10 15

Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr

20 25 30

Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Thr Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu

35 40 45

Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Thr Thr Val Asn Pro Ile Val

50 55 60

Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly

65 70 75 80

Asp Ser Tyr Ile Ile Gly Val Gly Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asp

85 90 95

Trp Phe Lys Lys

100

<210>3

<211>100

<212>PRT

<213>黄病毒属(Flavivirus sp.)

<400>3

Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys

1 5 10 15

Glu Ser Glu Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Val Lys Val Glu Tyr

20 25 30

Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly

35 40 45

Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val

50 55 60

Thr Lys Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly

65 70 75 80

Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn

85 90 95

Trp Tyr Arg Lys

100

<210>4

<211>99

<212>PRT

<213>黄病毒属(Flavivirus sp.)

<400>4

Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys

1 5 10 15

Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr

20 25 30

Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn

35 40 45

Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu

50 55 60

Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Arg Pro Leu Gly Asp

65 70 75 80

Ser Tyr Ile Val Ile Val Gly Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp

85 90 95

Phe Arg Lys

<210>5

<211>98

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>5

Ala Gln Ile Leu Asn Leu Lys Glu Lys Pro Asn Val Thr Pro Thr Ala

1 5 10 15

Ala His Arg Thr Leu Ser Ser Arg Val Ala Val Arg Ser Leu Ala Glu

20 25 30

Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Asp Trp Val Cys Ala Arg Leu

35 40 45

Gly Arg Leu Pro Ser Gly Arg Ser Leu Val Glu Gly Ala Ser Leu Ser

50 55 60

Pro Arg Ile Ala Gly Pro Arg Ala Gly Pro Gly Leu Ser Pro Gly Thr

65 70 75 80

Leu Gly Pro Ser Met Ala Met Arg Val Ala Gly Gly Gln Asp Gly Ser

85 90 95

Cys Pro

<210>6

<211>98

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>6

Ala Arg Ile Leu Asn Leu Lys Glu Lys Pro Asn Val Thr Pro Thr Val

1 5 10 15

Ala His Arg Thr Ser Ser Ser Arg Val Ala Val Arg Ser Leu Val Glu

20 25 30

Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp Trp Val Cys Ala Arg Arg

35 40 45

Gly Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn Leu Glu Val Asp Val Ser Leu Ser

50 55 60

Pro Arg His Val Gly Pro Arg Ala Gly Pro Gly Leu Ser Pro Gly Thr

65 70 75 80

Leu Gly Pro Ser Met Ala Met Arg Val Ala Gly Gly Arg Asp Gly Ser

85 90 95

Cys Leu

<210>7

<211>98

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>7

Ala His Phe Leu Asn Leu Lys Glu Lys Pro Lys Glu Thr Pro Ser Val

1 5 10 15

Ala His Arg Thr Ser Ser Ser Arg Val Ala Asp Arg Ser Leu Val Glu

20 25 30

Tyr Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala His Asp Trp Val Cys Ala Arg Arg

35 40 45

Val Lys Leu Leu Asn Gly His Ser Leu Ala Asp Asp Asp Ser Leu Ser

50 55 60

Pro Arg Arg Val Gly Ala Lys Ala Gly Pro Gly Leu Ser Pro Gly Thr

65 70 75 80

Leu Gly Pro Ser Met Val Thr Arg Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gly Ser

85 90 95

Cys Pro

<210>8

<211>98

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>8

Ala Gln Ile Leu Asn Leu Lys Glu Lys Pro Lys Glu Thr Gln Thr Ala

1 5 10 15

Ala His Arg Thr Leu Ser Ser Arg Val Ala Val Arg Ser Leu Ala Glu

20 25 30

Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Gly Trp Val Cys Ala Arg Gln

35 40 45

Gly Arg Leu Leu Ser Asp Pro Ser Arg Val Asp Asp Ala Ser Pro Ser

50 55 60

Arg Lys Ile Gly Ala Pro Pro Ala Ser Pro Gly Glu Ser Gln Asp Ile

65 70 75 80

Leu Gly Pro Cys Thr Glu Thr Arg Val Ala Ala Gly Arg Val Gly Ser

85 90 95

Cys Pro

<210>9

<211>98

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>9

Ala Arg Ile Leu Asn Leu Lys Glu Lys Pro Asn Val Thr Pro Thr Ala

1 5 10 15

Ala His Arg Thr Leu Ser Ser Arg Val Ala Ala Arg Ser Leu Ala Glu

20 25 30

Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Glu Trp Val Cys Ala Arg Arg

35 40 45

Gly Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn Leu Ala Gly Gly Val Ser Leu Phe

50 55 60

Pro Arg Pro Ala Asp Pro Arg Glu Gly Pro Gly Arg Ser Pro Gly Thr

65 70 75 80

Leu Gly Pro Ser Met Ala Thr Arg Ala Val Gly Gly Arg Asp Pro Ser

85 90 95

Cys Pro

<210>10

<211>98

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>10

Ala Gln Ile Leu Asn Leu Lys Glu Lys Pro Lys Glu Thr Pro Thr Val

1 5 10 15

Ala His Lys Thr Leu Ser Phe Arg Ala Ala Ala Arg Ser Leu Ala Glu

20 25 30

Tyr Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Gly Trp Val Cys Ala Arg Gln

35 40 45

Gly Arg Leu Arg Ser Gly Pro Ser His Val Glu Gly Ala Ser Pro Ser

50 55 60

Leu Arg Ile Gly Ala Pro Leu Ala Asn Pro Gly Glu Asn Gln Asp Thr

65 70 75 80

Pro Gly Pro Tyr Thr Gly Met Arg Asp Ser Ala Gly Gln Asp Arg Ser

85 90 95

Cys Pro

<210>11

<211>98

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>11

Ala Gln Ile Gln Asn Pro Lys Asp Lys Pro Lys Glu Thr Pro Thr Val

1 5 10 15

Ala His Arg Thr Ser Ser Ser Arg Ala Val Val Arg Ser Trp Val Glu

20 25 30

Tyr Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp Trp Val Cys Ala Arg Leu

35 40 45

Gly Arg Leu Pro Asn Gly Pro Ser Pro Glu Ala Gly Val Ser Pro Phe

50 55 60

Gln Arg Leu Ala Ala Arg Arg Ala Val Pro Gly Val Ser Leu Gly Thr

65 70 75 80

His Gly Pro Cys Met Gly Met Arg Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Ser

85 90 95

Cys Pro

<210>12

<211>98

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>12

Ala Arg Tle Leu Asn Leu Lys Glu Lys Pro Asn Val Thr Pro Thr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Trp Thr Leu Ser Ser Arg Val Val Ala Arg Ser Leu Ala Glu

20 25 30

Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Asp Trp Val Cys Ala Arg Leu

35 40 45

Gly Arg Leu Arg Ser Gly Arg Asn Leu Val Glu Asp Ala Asn Leu Ser

50 55 60

Pro Arg Arg Val Asp Pro Arg Glu Gly Pro Gly His Asn Gln Asp Ile

65 70 75 80

His Gly Leu Phe Thr Val Met Arg Val Val Gly Gly Gln Asp Gly Ser

85 90 95

Cys Pro

<210>13

<211>98

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>13

Ala Gln Ile Leu Asn Leu Lys Glu Lys Pro Asn Val Thr Pro Thr Ala

1 5 10 15

Ala His Arg Thr Ser Ser Ser Arg Ala Val Val Arg Ser Leu Val Glu

20 25 30

Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Gly Trp Val Cys Ala Arg Leu

35 40 45

Gly Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn Leu Val Glu Gly Asp Asn Leu Ser

50 55 60

Pro Arg Phe Ala Gly Pro Arg Ala Gly Pro Gly Leu Ser Pro Gly Thr

65 70 75 80

Leu Gly Pro Ser Met Ala Met Arg Val Trp Gly Gly Gln Asp Gly Ser

85 90 95

Cys His

<210>14

<211>160

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>14

Ala Arg Ile Leu Asn Leu Lys Lys Lys Thr Asn Val Thr Pro Thr Val

1 5 10 15

Ala His Arg Thr Ser Ser Ser Arg Val Ala Val Arg Ser Leu Val Glu

20 25 30

Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp Trp Val Cys Ala Arg Arg

35 40 45

Glu Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn Leu Glu Val Asp Val Ser Leu Ser

50 55 60

Pro Arg Leu Val Gly Pro Arg Ala Gly Pro Gly Leu Ser Pro Gly Thr

65 70 75 80

Leu Gly Pro Ser Met Ala Met Arg Ala Ala Gly Gly Arg Asp Gly Ser

85 90 95

Cys Leu Pro Val Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Pro Gln Thr Pro Gly

100 105 110

Val Gly Arg Ala Ile Trp Val Arg Ser Ser Ile Pro Leu Arg Ala Ala

115 120 125

Ser Pro Thr Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Ser Ser Ala Pro Leu Leu Glu

130 135 140

Ala Leu Pro Gly Pro Trp Arg Met Ala Ser Gly Phe Trp Lys Thr Ala

145 150 155 160

<210>15

<211>4555

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒

<400>15

tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac 120

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agagaagtta gaagaagcca 180

acaaaggaga gaacaccagc ttgttacaac ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240

agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac ggtggcccga 300

gagctgcatc cggagtactt caagaactgc tgatatcgag cttgctacaa gggactttcc 360

gctgggggac tttccaggga ggcgtggcct gggcgggact ggggagtggc gagccctcag 420

atcctgcata taagcagctg ctttttgcct gtactgggtc tctctggtta gaccagatct 480

gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc 540

cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc 600

tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtgg cgcccgaaca gggacttgaa 660

agcgaaaggg aaaccagagg agctctctcg acgcaggact cggcttgctg aagcgcggaa 720

ttccgcgcca cggcaagagg cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact 780

agcggaggct agaaggagag agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt 840

agatcgcgat gggaaaaaat tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa 900

catatagtat gggcaagcag ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa 960

acatcagaag gctgtagaca aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca 1020

gaagaactta gatcattata taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata 1080

gagataaaag acaccaagga agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag 1140

accaccgcac agcaagcggc cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa 1200

ttggagaagt gaattatata aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc 1260

caccaaggca aagagaagag tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt 1320

gttccttggg ttcttgggag cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac 1380

ggtacaggcc agacaattat tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc 1440

tattgaggcg caacagcatc tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc 1500

aagaatcctg gctgtggaaa gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg 1560

ctctggaaaa ctcatttgca ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc 1620

tctggaacag atttggaatc acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta 1680

cacaagctta atacactcct taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca 1740

agaattattg gaattagata aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg 1800

gctgtggtat ataaaattat tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt 1860

ttttgctgta ctttctatag tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca 1920

gacccacctc ccaaccccga ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg 1980

agagagagac agagacagat ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcgccgaat 2040

tcacaaatgg cagtattcat ccacaatttt aaaagaaaag gggggattgg ggggtacagt 2100

gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac aaactaaaga attacaaaaa 2160

caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg acagcagaga tccactttgg 2220

ggcgataagc ttgggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 2280

cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 2340

tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 2400

tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 2460

ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 2520

acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg 2580

gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 2640

tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga 2700

cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga 2760

accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccgac 2820

tctagaggac gtacgatgag agttgtgttt gtcgtgctat tgcttttggt ggccccagct 2880

tacagcttca actgccttgg aatgagcaac agagacttct tggaaggagt gtctggagca 2940

acatgggtgg atttggttct cgaaggcgac agctgcgtga ctatcatgtc taaggacaag 3000

cctaccatcg atgtgaagat gatgaatatg gaggcggtca acctggcaga ggtccgcagt 3060

tattgctatt tggctaccgt cagcgatctc tccaccaaag ctgcgtgccc gaccatggga 3120

gaagctcaca atgacaaacg tgctgaccca gcttttgtgt gcagacaagg agtggtggac 3180

aggggctggg gcaacggctg cggattattt ggcaaaggaa gcattgacac atgcgccaaa 3240

tttgcctgct ctaccaaggc aataggaaga accatcttga aagagaatat caagtacgaa 3300

gtggccattt ttgtccatgg accaactact gtggagtcgc acggaaacta ctccacacag 3360

gttggagcca ctcaggcagg gagattcagc atcactcctg cggcgccttc atacacacta 3420

aagcttggag aatatggaga ggtgacagtg gactgtgaac cacggtcagg gattgacacc 3480

aatgcatact acgtgatgac tgttggaaca aagacgttct tggtccatcg tgagtggttc 3540

atggacctca acctcccttg gagcagtgct ggaagtactg tgtggaggaa cagagagacg 3600

ttaatggagt ttgaggaacc acacgccacg aagcagtctg tgatagcatt gggctcacaa 3660

gagggagctc tgcatcaagc tttggctgga gccattcctg tggaattttc aagcaacact 3720

gtcaagttga cgtcgggtca tttgaagtgt agagtgaaga tggaaaaatt gcagttgaag 3780

ggaacaacct atggcgtctg ttcaaaggct ttcaagtttc ttgggactcc cgcagacaca 3840

ggtcacggca ctgtggtgtt ggaattgcag tacactggca cggatggacc ttgcaaagtt 3900

cctatctcgt cagtggcttc attgaacgac ctaacgccag tgggcagatt ggtcactgtc 3960

aacccttttg tttcagtggc cacggccaac gctaaggtcc tgattgaatt ggaaccaccc 4020

tttggagact catacatagt ggtgggcaga ggagaacaac agatcaatca ccattggcac 4080

aagtctggaa gcagcattgg caaagccttt acaaccaccc tcaaaggagc gcagagacta 4140

gccgctctag gagacacagc ttgggacttt ggatcagttg gaggggtgtt cacctcagtt 4200

gggaaggctg tctaatgcgc gcggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag 4260

atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa 4320

gacaagatcg tcgagagatg ctgcatataa gcagctgctt tttgcttgta ctgggtctct 4380

ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 4440

gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 4500

tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagt 4555

<210>16

<211>1393

<212>DNA

<213>黄病毒属(Flavivirus sp.)

<220>

<221>CDS

<222>(7)..(1386)

<400>16

cgtacg atg aga gtt gtg ttt gtc gtg cta ttg ctt ttg gtg gcc cca 48

Met Arg Val Val Phe Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro

1 5 10

gct tac agc ttc aac tgc ctt gga atg agc aac aga gac ttc ttg gaa 96

Ala Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu

15 20 25 30

gga gtg tct gga gca aca tgg gtg gat ttg gtt ctc gaa ggc gac agc 144

Gly Val Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser

35 40 45

tgc gtg act atc atg tct aag gac aag cct acc atc gat gtg aag atg 192

Cys Val Thr Ile Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met

50 55 60

atg aat atg gag gcg gtc aac ctg gca gag gtc cgc agt tat tgc tat 240

Met Asn Met Glu Ala Val Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr

65 70 75

ttg gct acc gtc agc gat ctc tcc acc aaa gct gcg tgc ccg acc atg 288

Leu Ala Thr Val Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met

80 85 90

gga gaa gct cac aat gac aaa cgt gct gac cca gct ttt gtg tgc aga 336

Gly Glu Ala His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg

95 100 105 110

caa gga gtg gtg gac agg ggc tgg ggc aac ggc tgc gga tta ttt ggc 384

Gln Gly Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly

115 120 125

aaa gga agc att gac aca tgc gcc aaa ttt gcc tgc tct acc aag gca 432

Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala

130 135 140

ata gga aga acc atc ttg aaa gag aat atc aag tac gaa gtg gcc att 480

Ile Gly Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile

145 150 155

ttt gtc cat gga cca act act gtg gag tcg cac gga aac tac tcc aca 528

Phe Val His Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr

160 165 170

cag gtt gga gcc act cag gca ggg aga ttc agc atc act cct gcg gcg 576

Gln Val Gly Ala Thr Gln Ala Gly Arg Phe Ser Ile Thr Pro Ala Ala

175 180 185 190

cct tca tac aca cta aag ctt gga gaa tat gga gag gtg aca gtg gac 624

Pro Ser Tyr Thr Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp

195 200 205

tgt gaa cca cgg tca ggg att gac acc aat gca tac tac gtg atg act 672

Cys Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr

210 215 220

gtt gga aca aag acg ttc ttg gtc cat cgt gag tgg ttc atg gac ctc 720

Val Gly Thr Lys Thr Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu

225 230 235

aac ctc cct tgg agc agt gct gga agt act gtg tgg agg aac aga gag 768

Asn Leu Pro Trp Ser Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu

240 245 250

acg tta atg gag ttt gag gaa cca cac gcc acg aag cag tct gtg ata 816

Thr Leu Met Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile

255 260 265 270

gca ttg ggc tca caa gag gga gct ctg cat caa gct ttg gct gga gcc 864

Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala

275 280 285

att cct gtg gaa ttt tca agc aac act gtc aag ttg acg tcg ggt cat 912

Ile Pro Val Glu Phe Ser Ser Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His

290 295 300

ttg aag tgt aga gtg aag atg gaa aaa ttg cag ttg aag gga aca acc 960

Leu Lys Cys Arg Val Lys Met Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr

305 310 315

tat ggc gtc tgt tca aag gct ttc aag ttt ctt ggg act ccc gca gac 1008

Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp

320 325 330

aca ggt cac ggc act gtg gtg ttg gaa ttg cag tac act ggc acg gat 1056

Thr Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp

335 340 345 350

gga cct tgc aaa gtt cct atc tcg tca gtg gct tca ttg aac gac cta 1104

Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu

355 360 365

acg cca gtg ggc aga ttg gtc act gtc aac cct ttt gtt tca gtg gc 1152

Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala

370 375 380

acg gcc aac gct aag gtc ctg att gaa ttg gaa cca ccc ttt gga gac 1200

Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp

385 390 395

tca tac ata gtg gtg ggc aga gga gaa caa cag atc aat cac cat tgg 1248

Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp

400 405 410

cac aag tct gga agc agc att ggc aaa gcc ttt aca acc acc ctc aaa 1296

His Lys Ser Gly Ser Ser Ile Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys

415 420 425 430

gga gcg cag aga cta gcc gct cta gga gac aca gct tgg gac ttt gga 1344

Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly

435 440 445

tca gtt gga ggg gtg ttc acc tca gtt ggg aag gct gtc taa tgcgcgc 1393

Ser Val Gly Gly Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Ala Val

450 455

<210>17

<211>459

<212>PRT

<213>黄病毒属(Flavivirus sp.)

<400>17

Met Arg Val Val Phe Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr

1 5 10 15

Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly Val

20 25 30

Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Val

35 40 45

Thr Ile Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met Asn

50 55 60

Met Glu Ala Val Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu Ala

65 70 75 80

Thr Val Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met Gly Glu

85 90 95

Ala His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln Gly

100 105 110

Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly

115 120 125

Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile Gly

130 135 140

Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val

145 150 155 160

His Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln Val

165 170 175

Gly Ala Thr Gln Ala Gly Arg Phe Ser Ile Thr Pro Ala Ala Pro Ser

180 185 190

Tyr Thr Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys Glu

195 200 205

Pro Arg Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val Gly

210 215 220

Thr Lys Thr Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Asn Leu

225 230 235 240

Pro Trp Ser Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu Thr Leu

245 250 255

Met Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile Ala Leu

260 265 270

Gly Ser Gln Glu Gly Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Pro

275 280 285

Val Glu Phe Ser Ser Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys

290 295 300

Cys Arg Val Lys Met Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly

305 310 315 320

Val Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly

325 330 335

His Gly Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro

340 345 350

Cys Lys Val Pro Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro

355 360 365

Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala

370 375 380

Asn Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr

385 390 395 400

Ile Val Val Gly Arg Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys

405 410 415

Ser Gly Ser Ser Ile Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly Ala

420 425 430

Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val

435 440 445

Gly Gly Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Ala Val

450 455

<210>18

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

tatcgtacga tgagagttgt gtttgtcgtg cta 33

<210>19

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

atagcgcgct tagacagccc ttcccaactg a 31

<210>20

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LTR-FL探针

<400>20

cacaacagac gggcacacac tacttga 27

<210>21

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LTR-LC探针

<400>21

cactcaaggc aagctttatt gaggc 25

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AA55M引物

<400>22

gctagagatt ttccacactg actaa 25

<210>23

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>M667引物

<400>23

ggctaactag ggaacccact g 21

<210>24

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CD3-P1探针

<400>24

ggctgaaggt tagggatacc aatattcctg tctc 34

<210>25

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CD3-P2探针

<400>25

ctagtgatgg gctcttccct tgagcccttc 30

<210>26

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CD3-in-F引物

<400>26

ggctatcatt cttcttcaag gta 23

<210>27

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CD3-in-R引物

<400>27

cctctcttca gccatttaag ta 22

Claims

1.包含多核苷酸片段的重组慢病毒载体的用途，所述多核苷酸片段编码黄病毒属病毒至少一种蛋白质或编码所述蛋白质的至少8个氨基酸长的免疫原性肽，用于制备预防和/或治疗敏感物种中黄病毒属病毒感染的免疫原性组合物。

2.根据权利要求1的用途，其特征在于所述重组慢病毒载体是三重型的。

3.根据权利要求1或2的用途，其特征在于所述重组慢病毒载体包含其中启动子和激活子已从U3区被删除的3’LTR。

4.根据权利要求1或2的用途，其特征在于所述重组慢病毒载体被用另一种病毒的至少一种包膜蛋白质假型化。

5.根据权利要求4的用途，其特征在于所述包膜蛋白质是水泡性口炎病毒糖蛋白G。

6.根据权利要求1或2的用途，其特征在于所述多核苷酸片段编码黄病毒属病毒的至少一种结构蛋白质或所述蛋白质的至少8个氨基酸长的免疫原性肽。

7.根据权利要求6的用途，其特征在于所述结构蛋白质是膜蛋白或包膜蛋白。

8.根据权利要求1或2的用途，其特征在于所述多核苷酸片段编码黄病毒属病毒的至少一种非结构蛋白质或所述蛋白质的至少8个氨基酸长的免疫原性肽。

9.根据权利要求1或2的用途，其特征在于所述多核苷酸片段既编码黄病毒属病毒的至少一种结构蛋白质或所述蛋白质的至少8个氨基酸长的免疫原性肽，也编码同一黄病毒属病毒的至少一种非结构蛋白质或所述蛋白质的至少8个氨基酸长的片段。

10.权利要求1或2的用途，其特征在于所述免疫原性肽由多种黄病毒属病毒的免疫原性片段的组合和/或同一黄病毒属病毒不同血清型的组合组成。

11.根据权利要求1或2的用途，其特征在于所述黄病毒属病毒选自西尼罗病毒、登革热病毒和黄热病毒。

12.根据权利要求1或2的用途，其特征在于所述多核苷酸片段选自：

一编码西尼罗病毒或登革热病毒的E蛋白、和任选地prM或M蛋白、和/或C蛋白、和/或非结构蛋白的cDNA，以及编码以上蛋白质的至少8个氨基酸长的一种或多种免疫原性肽的cDNA，

一编码登革热病毒E蛋白的一种或多种不同结构域III的cDNA，分别对应于四种类型登革热病毒中的一种，所述结构域III对应于所述E蛋白的第295至394位氨基酸。

13.根据权利要求12的用途，其特征在于所述编码登革热病毒E蛋白结构域III的cDNA编码所述四种结构域III，其序列由附录所附序列表中的SEQ ID NOs.1-4代表。

14.根据权利要求1或2的用途，其特征在于所述多核苷酸是黄病毒属病毒编码序列的片段，其对应选自以下的NCBI数据库中登记号：M23027，M19197，M93130，M14931，M12294，AF481864，M18370，X03700，U27495，M73835。

15.如权利要求1至6和8至14中任一项所定义的重组慢病毒载体，如权利要求6中所定义，该载体包含编码至少一种结构蛋白或其片段、以及任选地非结构蛋白或其片段的多核苷酸。

16.根据权利要求15的重组载体，其特征在于它是三重型的。

17.根据权利要求15或16的重组慢病毒载体，其特征在于它包含选自以下的cDNA：

-编码西尼罗病毒或登革热病毒的E蛋白、和任选地prM或M蛋白、和/或C蛋白、和/或非结构蛋白的cDNA，以及编码以上蛋白质的至少8个氨基酸长的一种或多种免疫原性肽的cDNA，和

一编码登革热病毒E蛋白的结构域III或几种不同结构域III的cDNA，每种分别对应于四种类型登革热病毒中的一种，所述结构域III对应于所述E蛋白的第295至394位氨基酸。

18.根据权利要求17的重组慢病毒载体，其特征在于所述编码登革热病毒E蛋白结构域III的cDNA编码四种结构域III，其序列由SEQ ID NOs.1-4代表。

19.根据权利要求17的重组慢病毒载体，其特征在于它包含编码登革热病毒或西尼罗病毒的E蛋白和prM蛋白的cDNA。

20.根据权利要求17的重组慢病毒载体，其特征在于它包含编码西尼罗病毒IS-98-ST1株的分泌形式E蛋白的cDNA，该载体包含于微生物中，该微生物于2003年8月27日保藏于国家微生物培养物保藏中心(the Collection Nationale de Culturesde Microorganismes[National Collection of Cultures of Microorganisms])，25rue duDocteur Roux，75724 Paris Cedex 15，保藏号为I-3076。

21.根据权利要求15或16的重组慢病毒载体，其特征在于所述多核苷酸片段处于CMV启动子的控制下。

22.免疫原性组合物，其特征在于它包含如权利要求1至21中所定义的至少一种重组慢病毒载体。

23.根据权利要求22的组合物，其特征在于它包含药用可接受赋形剂和任选地载体物质。

24.根据权利要求22或23的组合物，其特征在于所述重组慢病毒载体是三重型的。

25.根据权利要求22或23的组合物，其特征在于它包含用另一种病毒的包膜蛋白假型化的所述重组慢病毒载体的病毒颗粒。

26.根据权利要求25的组合物，其特征在于所述包膜蛋白是水泡性口炎病毒糖蛋白G。

27.根据权利要求24的组合物，其特征在于它包含对应所述三重型慢病毒载体的重组基因组的分离核酸分子，所述核酸分子包含：(i)用于衣壳包装、逆转录和整合的调控序列以及用于慢病毒原点的中央起始和终止的顺式作用序列以及任选地Rev蛋白的调控序列，以及(ii)编码如上在权利要求1和6至14中任一项所定义的黄病毒属病毒蛋白质或所述蛋白质至少8个氨基酸长的免疫原性肽的多核苷酸片段。

28.细胞，用如权利要求1至21所定义的重组慢病毒载体修饰的。

29.根据权利要求28的细胞，其特征在于它们是真核细胞。

30.用于生产黄病毒属病毒的病毒蛋白质和/或所述蛋白质的免疫原性片段或者病毒假颗粒的方法，其特征在于它至少包括以下步骤：

a)培养根据权利要求28或29的修饰细胞，其培养条件允许由所述重组慢病毒载体编码的黄病毒属病毒的一种或多种病毒蛋白质和/或所述蛋白质的一种或多种免疫原性片段的表达，和

b)从a)中细胞中或培养上清中分离所述蛋白质、蛋白质片段或病毒假颗粒。

31.筛选抗病毒化合物的方法，其特征在于，它包括：

一使根据权利要求28或29的被修饰真核细胞与待测试库的各种化合物接触，

一在所述化合物存在或缺失的条件下测量所述蛋白质的活性，和

一选择能调节所述活性的化合物。

32.根据权利要求31的方法，其特征在于所述真核细胞被包含编码黄病毒属病毒非结构蛋白质的cDNA的载体所修饰。

33.根据权利要求32的方法，其特征在于所述cDNA编码NS3或NS5。

34.根据权利要求31或32的方法，其特征在于所述真核细胞选自树突细胞、神经元细胞和肝细胞。

35.用于实施根据权利要求30至34的方法的试剂盒，其特征在于它至少包含根据权利要求28或29的修饰细胞。

36.用于诊断来自个体的生物学样品中黄病毒属病毒感染的试剂盒，其特征在于它包含：

a)如权利要求28或29中定义的表达至少一种黄病毒属病毒抗原的修饰真核细胞，

b)如权利要求7、9至12、14至17和19至21中任一项所定义的表达至少一种膜蛋白和/或包膜蛋白的慢病毒载体修饰过的细胞的培养上清产生的病毒假颗粒，和

c)显示通过将所述生物学样品与所述病毒假颗粒相接触而形成的抗原一抗体复合物的工具。

37.根据权利要求36的试剂盒，其特征在于a)中所述的修饰真核细胞被透化。

38.如权利要求28或29定义的表达至少一种黄病毒属病毒抗原的修饰真核细胞在制备用于通过检测抗原一抗体复合物来诊断敏感物种个体中黄病毒属病毒感染的试剂盒中的用途，所述抗原一抗体复合物是通过将来自所述个体的生物样品与如权利要求7、9至12、14至17和19至21中任一项所定义的表达至少一种膜蛋白和/或包膜蛋白的慢病毒载体修饰过的细胞的培养上清所产生的病毒假颗粒相接触而形成的。